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Biologia EstruturalTécnicas de Cristalização de Macromoléculas Biológicas

Prof. Dr. Walter Filgueira de Azevedo Jr.

wfdaj.sites.uol.com.br © 2006 Dr. Walter F. de Azevedo Jr.

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Diagrama de Fases

Para cristalizarmos uma macromolécula biológica é necessário trazê-la a um estado de supersaturação. Consideremos uma proteína dissolvida em um tampão. Nessa situação, para que a proteína seja levada a formar cristais, é necessário que as moléculas da proteína dissolvidas na solução, sejam trazidas a uma situação onde as moléculas estejam próximas umas das outras. Para levar a proteína a essa situação podemos aumentar sua concentração (eixo vertical), ou aumentar a concentração do sal presente na solução da proteína. O diagrama ao lado ilustra as diferentes regiões de solubilidade da proteína.

© 2006 Dr. Walter F. de Azevedo Jr.


O processo de cristalização da proteína normalmente deve ser lento, ou seja, considerando-se a proteína inicialmente numa região abaixo da curva de solubilidade, devemos aumentar a concentração salina, ou da proteína, de modo a trazê-la na região de supersaturação, de forma lenta. Na região de supersaturação teremos as moléculas da proteína próximas umas das outras, o que, em casos favoráveis, promoverá o aparecimento dos primeiros núcleos cristalinos. Esse microcristais servirão de base para o crescimento de cristais maiores, adequados para experimentos de difração de raios X.

Diagrama de Fases



Para cristalizarmos proteínas normalmente usamos o método de difusão de vapor. Uma gota de proteína é colocada sobre uma lamínula. Nessa gota adicionamos uma solução contendo sal, ou outro agente precipitante, como Polietileno glicol (PEG). Colocamos essa lamínula sobre um poço, onde temos a solução do precipitante. Ao fecharmos esse sistema ocorrerá difusão de moléculas de água da gota para o poço, levando a proteína, em casos favoráveis, a um estado de supersaturação, que pode levar à formação dos primeiros núcleos cristalinos.

Diagrama de Fases


Salting-in

O aumento da solubilidade de uma macromolécula biológica a baixa concentração salina (<0,5M) é chamada salting-in. Este fenômeno é explicado pelas interações eletrostáticas não específicas entre a macromolécula carregada e as espécies iônicas do sal. Segundo a teoria de Debye-Hückel para soluções iônicas, um aumento na força iônica reduz a atividade dos íons em solução e aumenta a solubilidade do composto iônico. Uma forma alternativa de se tratar este fenômeno é considerar o salting-in como o resultado da competição entre grupos carregados na superfície da macromolécula e os íons em solução. Na ausência de íons de solvente a macromolécula precipita devido à atração de eletrostática entre cargas opostas em diferentes partes da macromolécula. Se os íons são adicionados à solução eles blindam os grupos carregados na macromolécula e aumentam a sua solubilidade.


Salting-in


Fenômeno de salting-in. a) Macromolécula biológica sem a presença de íons dissolvidos na solução. A atração eletrostática entre os grupos carregados em duas os mais macromoléculas causa a aglomeração e precipitação. b) Íons blindam a interação eletrostática entre as macromoléculas, aumentando a solubilidade.


Salting-out


Outra forma de precipitar uma macromolécula é pela adição de sal (salting-out), este serve para imobilizar as moléculas de água, desta forma aumentando a concentração efetiva da macromolécula, ou seja, diminuindo a sua solubilidade. No fenômeno de salting-out a solubilidade da macromolécula biológica é governada principalmente por efeitos hidrofóbicos.



Montagem de Gotas de Cristalização

Seqüência de eventos para a montagem de uma gota de cristalização: a) Coloca-se 1-2µl da solução da macromolécula biológica sobre a lamínula de vidro. b) Adiciona-se 1-2µl da solução do reservatório à gota com a solução da macromolécula biológica. c) Ao final temos uma gota (2+2) com a solução de macromolécula biológica mais a solução do reservátorio.



Na cristalização de proteína podemos variar a forma de acomodar a gota de cristalização, como na figura acima. Tal variação permite modificações nas condições de difusão do vapor de água da gota para o poço, que pode favorecer o aparecimento de cristais de proteína.

Montagem de Gotas de Cristalização


Com o aumento do número de macromoléculas biológicas cristalizadas com sucesso, tornou-se óbvio que muitas das condições de cristalização se assemelhavam, ou seja, havia uma concentração de resultados positivos de cristalização de macromoléculas biológicas usando-se número limitado de precipitantes, tampões e aditivos. Isto levou à proposição de diversos métodos de cristalização (Carter & Carter, 1979), onde um número limitado de condições de cristalização eram tentados, usando-se pequenas quantidades da macromolécula biológica, geralmente por volta de poucos miligramas. A partir da observação dos resultados preliminares destes experimentos era possível determinar que tampão, aditivo e agente precipitante seriam os mais favoráveis e a partir daí proceder-se a sucessivos melhoramentos até se conseguir cristais adequados, ou ainda, em casos favoráveis, obter-se cristais adequados já na primeira tentativa com as condições padrões. Dentro deste raciocínio a Dra. Jaru Jancarick da UC Berkeleley propôs o método da matriz esparsa ( Jancarick & Kim, 1991) onde diversas condições diferentes são tentadas para se cristalizar a macromolécula biológica.

Jancarik, J, & Kim, S. -H. (1991) J. Appl. Crystallogr. 24, 409-411.

Método da Matriz Esparsa




Parâmetros da matriz de cristalização (Jancarik & Kim, 1991)

Agentes precipitantesNão-Voláteis Sais Voláteis MisturaMPD Tartarato de Na,K 2-Propanol Sulfato de NH4 + PEGPEG 400 Fosfato de NH4 2-Propanol + PEGPEG 4000 Sulfato de NH4

PEG 8000 Acetato de NaSulfato de LiFormiato de NaFosfato de Na,KCitrato de NaFormiato de Mg

Faixa de pH: 4,6; 5,6; 6,5; 7,5 e 8,5

Aditivos: Cloreto de Ca, Citrato de Na, Cloreto de Mg, Acetato de NH4, Sulfato de NH4, Acetato de Mg, Acetato de Zn e Acetato de Ca.




Por tentativa e erro a matriz multimensional foi simplificada eliminando-se as condições que podem ser parcialmente representadas por resultados de outras condições, a proposta original apresenta 58 condições. Comercialmente a empresa Hampton Research, (USA) simplificou o método original, e disponibiliza um kit com 50 condições de cristalização. Comercialmente há outros kits usando-se como princípio a variação de pH, força iônica e agentes precipitantes.

Fonte: http://www.hamptonresearch.com/products/ProductDetails.aspx?cid=1&sid=17&pid=1


Kits da Hampton Research


Fonte: http://www.hamptonresearch.com/products/ProductDetails.aspx?cid=1&sid=17&pid=1

Crystal Screen I (1-25)



Crystal Screen I (26-50)

Crystal Screen II (1-25)


Crystal Screen II (26-50)



Placas Linbro

Um dos sistema usados para cristalização de proteínas é a placa linbro, mostrada acima. Essa placa apresenta 24 poços, que permite testarmos diversas condições de cristalização. As lamínulas são colocadas sobre cada um dos poços, e vedadas com graxa de vácuo.Fonte: http://www.hamptonresearch.com


Matriz Esparsa (Passo a Passo)Passo 1) Se a macromolécula biológica tiver de ser transportada mantenha-a em gelo (sem congelá-la) e adicione glicerol até 50% em volume e armazene-a em - 20oC. Use o necessário para o experimento de cristalização inicial, geralmente entre 1 e 2 mg é o suficiente, e coloque o restante de volta a -20oC. A fim de eliminar o glicerol da solução estoque, toma-se o volume desejado da macromolécula biológica em glicerol e adiciona-se um volume igual do tampão, então dialisa-se contra o tampão.

Passo 2) concentre a proteína no mesmo tampão e acrescente DTT, ou EDTA se necessário. Se existe NaCl no tampão é melhor eliminá-lo, desde que o NaCl não seja necessário para a solubilidade da macromolécula biológica.

Passo 3) Faça o fatorial à 4oC e a temperatura ambiente, se houver material suficiente.

Passo 4) Examine a gotas imediatamente após montado o experimento de cristalização e anote: a) o número das gotas com precipitado.b) há presença de “sujeiras”.c) há presença de microcristais.



Matriz Esparsa (Passo a Passo)

Fonte: http://www.hamptonresearch.com

Passo 5) Confira as gotas diariamente por uma semana, fazendo as mesmas anotações do passo 4. E verifique também o surgimento de algum bom cristal. É importante verificar como a macromolécula biológica se comporta com o tempo em cada gota de cristalização.

Passo 6) Supondo que pequenos cristais se formaram em uma ou mais gotas do experimento inicial de cristalização, deve-se concentrar esforços nos melhores cristais e tentar a melhoria das condições de cristalização dos mesmos. Os procedimentos para a melhoria das condições de cristalização serão mostrados a seguir.



Cristais de Proteínas

0,5mm 0,5mm 0,5mm

0,5mm0,5mm0,5mm


Montagem de Cristais


Criocristalografia



Criocristalografia

Fonte: http://www.hamptonresearch.com

Sistema Criogênico


Protocolo de Cristalização de PNP Humana

Equipamentos e reagentes:

- Placa Linbro;- PNP (De Azevedo et al., 2003) a 12mg/mL em tampão fosfato de potássio a 10 mM, pH 7,1 (solução A);- 40 % de sulfato de amônio em tampão citrato de sódio a 0,05 M, pH 5,3 (solução B);- Microfiltro de 0,22 μm;- Graxa de vácuo;- Lamínulas.



Método:1. Prepare a soluções estoques de 40 % de sulfato de amônio em tampão citrato de sódio a 0,05 M, pH 5,3 e PNP a 12mg/mL em tampão fosfato de potássio a 10 mM, pH 7,1. Filtre a solução com um microfiltro de 0,22 μm;2. Prepare uma placa Linbro;3. Abasteça os reservatórios da fileira A da placa Linbro com solução B variando de 15-40 % em passos de 5 %;4. Em uma lamínula, misture 1 μL da solução A com 1 μL do reservatório. Rápido e em série engraxe a borda dos reservatórios e cubra com a lamínula;5. Abasteça os reservatórios da fileira B com solução B variando de 19-29 % em passos de 2%;6. Abasteça os reservatórios da fileira C com solução B variando de 15-20 % em passo de 1 %;7. Use a fileira D para duplicar ou testar parâmetros particulares (por exemplo, volume da gota para observar se a influência nos efeitos cinéticos ou no crescimento);8. Mantenha os experimentos a 18 ºC;9. Observe os experimentos no dia seguinte;




Resultados.Os cristais da PNP humana apareceram após 24 horas e apresentam dimensões aproximadas de 0,5 x 0,5 x 0,6 mm.


Protocolo de Cristalização da Lisozima


Equipamentos e reagentes:

- Placa Linbro;- lisozima 40mg/mL em acetato a 50 mM, pH 4,5;- NaCl 3 M ;- Microfiltro de 0,22 μm;- Graxa de vácuo;- Lamínula.



Método:1. Prepare as soluções estoques de NaCl a 3 M e lisozima a 40 mg/mL (2,74 mM) em acetato a 50 mM, pH 4,5. Filtre todas as soluções com um microfiltro de 0,22 μm;2. Prepare uma placa Linbro;3. Abasteça os reservatórios da fileira A com soluções de NaCl variando de 0,5-1,5M em passos de 0,2 M;4. Em uma lamínula, misture 4 μL da solução estoque com 4 μL do reservatório. Rápido e em série, engraxe a borda dos reservatórios e cubra com a lamínula;5. Abasteça os reservatórios da fileira B com solução de NaCl variando de 0,8-1,8 M em passos de 0,2 M. Repita o experimento na fileira B depois de diluir a solução estoque de proteína à metade para obter uma nova concentração de 20 mg/mL (1,37 mM);6. Abasteça os reservatórios da fileira C com soluções de NaCl variando de 1,5-2,5 M em passo de 0,2 M. Repita o experimento depois de diluir a solução estoque de proteína pela metade;7. Use a fileira D para duplicar ou testar parâmetros particulares (por exemplo, volume da gota para observar se há influência nos efeitos cinéticos ou no crescimento);8. Mantenha os experimentos a 18 ºC;9. Observe os experimentos durante 2 dias; © 2006 Dr. Walter F. de Azevedo Jr.


Resultados:Os cristais de lisozima apareceram após 24 horas e apresentam dimensões aproximadas de 0,5x0,5x0,5mm.


Protocolo de Otimização de Cristais

A grande maioria dos experimentos de cristalização de proteínas normalmente termina em insucesso. Os números variam, mas de uma forma geral aceita-se que para uma proteína qualquer a taxa de sucesso varia entre 10 e 20 %. Contudo, mas as que conseguimos cristalizar normalmente não é na primeira tentativa, assim um processo crucial na cristalização de uma proteína é a otimização. Normalmente ao usarmos os screens temos resultados como precipitado, ou gotas claras, ou ainda microcristais. Em cada uma dessas situações temos estratégias que podem levar à formação de cristais adequados para os experimentos de difração de raios X. Cristais adequados devem ter ase seguintes características:1) Boas dimensões, normalmente maiores que 0,2 mm.2) Arestas bem definida.3) Relativa rigidez.4) Facilidade de manuseio.

Mesmo satisfazendo às essas condições o cristal pode não difratar. O teste final é quando expomos o cristal ao feixe de raios X e vemos um padrão claro e com centenas de pontos de difração.




Consideremos o seguinte cenário onde temos pequenos cristais obtidos nos experimentos iniciais, com ou sem precipitado amorfo acompanhando-os. Para a melhoria dos cristais e eliminação do precipitado amorfo seguimos os seguintes passos:

Passo 1) Abaixe a concentração da macromolécula e tente as mesmas condições em que obteve os primeiros cristais. Tente varias concentrações, por exemplo, se os primeiros cristais foram conseguidos com a concentração de 10mg/ml tente 9, 8, 7, 6 e 5 mg/ml.

Espere por uma semana e se não houver melhora nos cristais,

Passo 2) Mantenha a concentração da macromolécula biológica constante e abaixea concentração do agente precipitante.




Espere por uma semana e se não houver melhora nos cristais,

Passo 3) Adicione 0,2M NaCl ao reservatório. Se a gota de cristalização ficar completamente “clara” (sem precipitado ou cristais) após uma semana, aumente a concentração do precipitante em incrementos de 5% a cada 3 dias. Se a gota continuar sem cristais ou precipitado 0,2M de NaCl foi demasiado, tente novamente com 20mM NaCl o mesmo procedimento. A eliminação do precipitado, se presente, é importante visto que o mesmo age como sítio de nucleação e complica a manipulação futura do cristal. Se não houve melhoria nos cristais pode-se tentar microssemeadura (microseeding) caso tal tentativa não funcione pode-se tentar variar a temperatura, caso o experimento foi realizado a 4oC, deve-se tentar em temperatura ambiente e vice-versa.


Cristalização Coleta de dados

LNLS Difração de raios X

Resolução da estrutura

cristalográficaAnálise


Caracterização de Cristais


Uma etapa inicial importante na elucidação da estrutura tridimensional de proteínas, por meio de cristalografia por difração de raios X é determinação do conteúdo da cela unitária. Uma vez tenhamos determinado os parâmetros da cela unitária: a, b, c, alfa, beta e gama, temos que determinar quantas moléculas temos na unidade assimétrica. Para isto precisamos além dos parâmetros da cela unitária o peso molecular da proteína cristalizada. O método proposto por Matthews (1968) permite calcular o número de moléculas por unidade assimétrica. Matthews determinou que para cristais de proteínas a relação entre volume da cela unitária (Vcell) e o peso molecular da proteína cristalizada fica na faixa de 1,7 a 3,5 Å3/Da, com a maioria dos valores em torno de 2,15 Å3/Da, este valor é chamado volume de Matthews (VM)

VM = Vcell

Z.MW

Onde Z é o número de moléculas na cela unitária, MW o peso molecular da proteína cristalizada e Vcell o volume cela unitária, que para uma cela unitária qualquer é dada por:

Vcell = a.b.c [1 + 2 cos α cos β cos γ - cos2α - cos2β - cos2γ]1/2




A fração de volume ocupada por proteína (Vprotein) é dada por:

Vprotein = 1,23/VM

E a fração de volume de solvente no cristal é dada por:

Vsolvent = 1 – 1,23/VM

Vprotein pode ser determinado por:

Vprotein = (Volume específico da proteína em cm3/g) VM


Artigos de cristalização


Principais seções de um artigo de cristalização de proteínas:

3) Clonagem, expressão e purificação da proteína4) Cristalização5) Coleta de dados de difração de raios X6) Outros (Teste de atividade, sequenciamento, solução da estrutura e refinamento cristalográfico parcial.


Artigos de cristalização(cristalização)


The purifed MtCS was concentrated and dialyzed against 50 mM Tris±HCl buffer pH 7.8 (Hampton Research, USA). The final protein concentration was about 10 mg.ml-1. Crystallization was performed by the hanging-drop vapour-diffusion and sparse-matrix methods (Jancarik & Kim, 1991) using tissue-culture multiwell plates with covers (Linbro, ICN Biomedicals, Inc, USA) at a temperature of 293 K. Each hanging drop was prepared by mixing 1 ml each of protein solution and reservoir solution and was placed over 700 µl reservoir solution. Initial conditions were screened using Crystal Screen I and II kits (Hampton Research, USA).

Hexagonal crystals of MtCS. Approximate dimensionsare 0.30 0.25 0.25 mm.



A data set was collected at a wavelength of 1.427 Åusing a synchrotron-radiation source (Station PCr, LNLS, Campinas- Brazil). The data set was collected from a single MtCS crystal using a MAR CCD image-plate system. The crystal was looped out from the drop and flash-cooled. The PEG 400 present in the crystallization conditions served as a cryoprotectant, X-ray diffraction data were collected at a temperature of 100 K under a cold nitrogen stream generated and maintained with an Oxford Cryosystem. The crystal was rotated through a total of 160o, with a 1o

oscillation range per frame, a crystal-to-detector distance of 130 mm and an exposure time of 60 s. Data were processed on a Silicon Graphics Octane2 computer using the programs MOSFLM (Leslie, 1990) and SCALA (CCP4, 1994).

Artigos de cristalização (dados de difração)

A typical diffraction pattern of the MtCS crystal with 1° oscillation range. The crystal diffracts to 2.8 Å resolution.


Summary of data-collection statistics for CRL.X-ray wavelength (A ° ) 1.427Space group P6422 or P6222Unit-cell parameters (Å ) a = 129.74, b = 129.74,

c = 156.77Highest resolution shell (Å) 2.94–2.8Asymmetric unit content 2 moleculesTotal reflections measured 92610Number of independent reflection 19341Completeness (%) 97.9 (97.9)Rmerge (%) 5.6 (16.5)


Values in parentheses are for the highest resolution shell (2.94–2.8 Å).




Aplicações.

3) Determinação do conteúdo da unidade assimétrica da corismato sintase de Mycobacterium tuberculosis (Dias et al., 2004). A partir dos dados de difração de raios X foi determinado que os parâmetros da cela unitária.

a = 129,74 Åb = 129,74 Åc = 156,77 ÅGrupo espacial: P6422 ou P6222

MW = 41.800 kDa

Para cela hexagonal: Vcell = a.b.c.sen (γ)

Vcell = 129,74. 129,74 . 156,77. sen(120o) = 2.285.290,31 Å3




Para determinarmos o conteúdo da unidade assimétrica calcularemos o volumede Matthews para diferentes possibilidades de unidade assimétrica e verificaremos qual valor fica mais próximo da faixa de 1,7 a 3,5 Å, como segue:

VM = Vcell

Z.MW

Z VM(Å3/Da)2 54,676 9,114 4,5618 3,0424 2,2830 1,82




Os valores dentro das caixas estão dentro da faixa prevista por Matthews, contudosabemos que o grupo espacial é hexagonal primitivo, o que significa quetemos 6 unidades assimétricas, assim teremos um número de moléculas múltiplode 6, ou seja, 12, 18, 24, 30.., sendo o valor mais provável 24. Assim temos:

Vprotein = 1,23/VM = 0,5395 e Vsolvent = 0,4605

Z VM(Å3/Da)2 54,676 9,114 4,5618 3,0424 2,2830 1,82


Artigos de cristalização (purificação)


C. roseum seeds were ground to a fine powder in a coffee mill. The powder was stirred with 0.15 M NaCl [1:10(w:v)] at room temperature for 4 h and then centrifuged at 10 000g for 20 min at 278 K. The resultant supernatant was applied onto a Sepharose-4B-mannose column (0.5 10 cm) equilibrated with 0.15 M NaCl containing 5 mMCaCl2 and 5 mMMnCl2. After removing unbound material, the lectin was eluted with 0.1 M glycine, 0.15 M NaCl pH 2.6. Purified CRL was monitored by SDS–PAGE as described by Laemmli (1970) and was used to perform further characterization. N-terminal sequence analysis was performed using an Applied Biosystems pulsed-liquid phase 477A protein sequencer with a 120A PTH aminoacid analyzer, following the method described by the manufacturer.

Fonte: Cavada BS, Marinho ES, Souza EP, Benevides RG, Delatorre P, Souza LA, Nascimento KS, Sampaio AH, Moreno FB,

Rustiguel JK, Canduri F, de Azevedo WF Jr, Debray H. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commun. 1(62), 235-237, 2006


Artigos de cristalização (purificação)





Artigos de cristalização(cristalização)


The lyophilized purified CRL was dissolved to a concentration of 12 mg ml-1 in 20 mM Tris–HCl pH 8.0 containing 0.5 mM CaCl2 and MnCl2 and used for crystallization trials. Crystallization screening by the hanging-drop vapour-diffusion method was performed in Linbro plates at 293 K using Hampton Research Crystal Screens I and II, SaltRx, Index and PEG/Ion Screens (Hampton Research, Aliso Viejo, CA, USA). The drops were composed of equal volumes (2 ml) of protein solution and reservoir solution and were equilibrated against 500 ml reservoir solution. An example of a crystal of CRL isshown in Fig. 1(a).





A crystal was transferred to a cryoprotectant solution consisting of 30% glycerol in the crystallization reservoir solution. Data were collected at 1.42 A ° wavelength at a synchrotron-radiation source (beamline MX1, CPr station, Laborato´ rio Nacional de LuzSíncrotron–LNLS, Campinas, Brazil) using a MAR Research CCD imaging plate at a crystal-to-detector distance of 70 mm. A set of 100 1°oscillation images was recorded (an image is shown in Fig. 1b). Diffraction data were indexed, integrated and scaled using MOSFLM and SCALA (Collaborative Computational Project, Number 4, 1994).





Summary of data-collection statistics for CRL.X-ray wavelength (A ° ) 1.427Space group P212121

Unit-cell parameters (A° ) a = 67.82, b = 103.14, c = 122.09Resolution limits (A ° ) 34.92–1.77Asymmetric unit content 4 moleculesTotal reflections measured 286361Unique reflections measured 80568Completeness (%) 97.00 (97.0)Rmerge (%) 5.4 (32.5)


Values in parentheses are for the highest resolution shell (1.87–1.77 A ° ).







Aplicações.

3) Determinação do conteúdo da unidade assimétrica da Lectina de Cymbosema roseum seeds (Cavada et al., 2006). A partir dos dados de difração de raios X foi determinado que os parâmetros da cela unitária.

a = 67,82 Åb = 103,14 Åc = 122,09 ÅGrupo espacial: P212121

MW = 25kDa

Vcell = 67,82 . 103,14 . 122,09 = 854.014,03 Å3

Referência:Cavada BS, Marinho ES, Souza EP, Benevides RG, Delatorre P, Souza LA, Nascimento KS, Sampaio AH, Moreno FB,






VM = Vcell

Z.MW

Z VM(Å3/Da)2 34,143 17,074 11,385 8,536 6,837 5,698 4,889 4,27

Z VM(Å3/Da)9 3,7910 3,4111 3,1012 2,8513 2,6314 2,4415 2,2816 2,14

Z VM(Å3/Da)17 2,0118 1,9019 1,8020 1,7121 1,6322 1,5523 1,4924 1,42




Os valores dentro das caixas estão dentro da faixa prevista por Matthews, contudosabemos que o grupo espacial é ortorrômbico primitivo, o que significa quetemos 4 unidades assimétricas, assim teremos um número de moléculas múltiplode 4, ou seja, 12, 16 ou 20, sendo o valor mais provável 16. Assim temos:


Z VM(Å3/Da)2 34,143 17,074 11,385 8,536 6,837 5,698 4,889 4,27

Z VM(Å3/Da)9 3,7910 3,4111 3,1012 2,8513 2,6314 2,4415 2,2816 2,14

Z VM(Å3/Da)17 2,0118 1,9019 1,8020 1,7121 1,6322 1,5523 1,4924 1,42


Artigos de cristalização(clonagem, expressão)


The pheA gene (Rv3838c) encoding prephenate dehydratase from M. tuberculosis was amplified by the polymerase chain reaction (PCR) from genomic DNA. The forward (50-TGCATATGGTGCGTATCGCTTACCTCGGTCC- 30) and reverse (50-ACAAGCTTTCATGCTTGCGCCCCCTGGTCG- 30) synthetic oligonucleotide primers were based on the amino-terminal coding and carboxyterminal non-coding strands of the pheA gene (Cole et al., 1998) containing 50 NdeI and 30 HindIII restriction sites, respectively. The PCR product was cloned into pET-23a(+) expression vector (Novagen) and the recombinant plasmid was sequenced to confirm the identity of the cloned DNA fragment and to ensure that no mutations had been introduced by the PCR amplification step. ...

Fonte: Vivan AL, Dias MVB, Schneider CZ, de Azevedo Jr. WF, Basso LA, Santos DS. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst

Commun. F62, 357-360, 2006


Artigos de cristalização(purificação)


The supernatant was loaded onto a Q-Sepharose Fast Flow (2.6 8.2 cm) anion-exchange column (GE Healthcare) and fractionated using a 0.0–0.5 M NaCl linear gradient. The fractions were pooled and ammonium sulfate was added to a final concentration of 0.6 M; the mixture was then loaded onto a HiLoad 16/10 Phenyl Sepharose HP hydrophobic interaction column (GE Healthcare). The active fractions were loaded onto a Mono Q HR 16/10 anion-exchange column (GE Healthcare) and eluted using a 0.0–0.5 M NaCl linear gradient.


Commun. F62, 357-360, 2006


Artigos de cristalização(clonagem, expressão)


Crystallization trials were initially performed by the hanging-drop vapour-diffusion method at 292 K. Hampton Crystal Screen and Crystal Screen 2 kits (Hampton Research) were used to determine the initial crystallization conditions. Hanging drops were prepared by mixing 1 ml of a solution containing 10 mg ml1 recombinant protein in 50 mM Tris–HCl pH 7.8 and 1 ml reservoir solution. Crystals were obtained with a reservoir solution containing 0.1 M HEPES pH 7.5, 28%(v/v) PEG 400, 0.2 M calcium chloride.


Commun. F62, 357-360, 2006


Artigos de cristalização(dados de difração)


The data set for recombinant M. tuberculosis prephenate dehydratase was collected at a wavelength of 1.438 Å using a synchrotronradiation source (Station MX1, LNLS, Campinas) and a MAR CCD detector. The crystal was flash-frozen at 100 K in liquid nitrogen. The oscillation range used was 0.8, the crystal-to-detector distance was 150 mm and the exposure time was 90 s. The crystal diffracted to 3.2 Å resolution. All data were processed and scaled using the programs MOSFLM and SCALA from the CCP4 program suite (Collaborative Computational Project, Number 4, 1994).


Commun. F62, 357-360, 2006


Artigos de cristalização(dados de difração)


Summary of data-collection statistics for M. tuberculosis prephenate dehydratase.

X-ray wavelength (A ° ) 1.438Temperature (K) 100Resolution range (A° ) 65.94–3.20 (3.37–3.20)Total/unique reflections 71611/23215Space group I222 or I212121Matthews coefficient (Å3 Da-1) 2.7Unit-cell parameters

a (Å) 98.26b (Å ) 133.22c (Å ) 225.01

Mosaicity () 0.43Data completeness (%) 94.4 (97.2)Average I/(I) 5.7 (1.5)Multiplicity 3.1 (3.0)Rmerge(%) 0.120 (0.434)




Aplicações.

3) Determinação do conteúdo da unidade assimétrica da Lectina de Cymbosema roseum seeds (Cavada et al., 2006). A partir dos dados de difração de raios X foi determinado que os parâmetros da cela unitária.

a = 98,26 Åb = 133,22 Åc = 225,01 ÅGrupo espacial: I222 ou I212121

MW = 33,6 kDa

Vcell = 98,26 . 133,22 . 225,01 = 2.945.425,3 Å3


Commun. F62, 357-360, 2006





VM = Vcell

Z.MW

Z VM(Å3/Da)2 87,668 10,9616 5,4824 3,6532 2,7440 2,1948 1,83




Os valores dentro das caixas estão dentro da faixa prevista por Matthews, contudosabemos que o grupo espacial é ortorrômbico com centragem I, o que significa quetemos 16 unidades assimétricas, assim teremos um número de moléculas múltiplode 16, ou seja, 16, 32, 48…, sendo o valor mais provável 32. Assim temos:


Z VM(Å3/Da)2 87,668 10,9616 5,4832 2,7448 1,83


Drenth, J. (1994). Principles of Protein X-ray Crystallography. New York: Springer-Verlag.

Referências


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