Cristina Et Al. - Unknown - No Title

7/25/2019 Cristina Et Al. - Unknown - No Title

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SO CARLOSPROGRAMA DE PS-GRADUAO EM ECOLOGIA E RECURSOS

NATURAIS

APOSTILA

MTODO ESTEREOLGICO

Prof. Dr. Steven F. Perry

ALUNOS:Aurlia de Ftima Mazon

Carla Cristina Cavalcante Cerqueira

Cssio Arilson de Andrade

Eliane A. Santos Monteiro

Fbio de Jesus Castro

Flvia Santanna Rios

Guilherme Henrique Dyonisio Pinheiro

Jesiel Mamedes Silva

Jorge Takasusuki

Marcos Flvio Pdua Ges de Moraes

Marise Margareth Sakuragui

Odila Rigolin de SOscar Tadeu Ferreira da Costa

Roger Nicolas Bulin

Sandro Estevan Moron


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ESTEREOLOGIA

PRNCIPIOS GERAIS

Atravs de uma produtiva cooperao entre gelogos, metalrgicos, anatomistas,bilogos, matemticos e vrios outros profissionais ligados aos aspectos geomtricos dasestruturas, surgiu uma cincia relativamente recente, a Estereologia. Uma melhordescrio do significado deste termo pode ser obtida pelos conceitos a seguir:

WEIBEL: "Estereologia um conjunto de mtodos matemticos que relacionaparmetros tridimensionais que definem a estrutura a partir de medidas bidimensionaisobtidas em cortes da estrutura".

HANS ELIAS (International Society for Stereology): "A estereologia, sensustricto, trata de uma srie de mtodos que permitem a extrapolao datridimensionalidade a partir de seces bidimensionais de um corpo ou de suas projeesnuma determinada superfcie. Desta forma, a estereologia pode tambm ser chamada deextrapolao do espao bidimensional ao tridimensional".

LEWIS WOLPERT: "A estereologia uma ferramenta absolutamente essencialpara todo bilogo que precisam conhecer as unidades de um sistema qualquer, sejam elas,unidades funcionais ou simples estruturas. uma tcnica que permite a obteno dedados sobre um conjunto de objetos "identificveis" de uma estrutura tridimensionalatravs de uma amostra bidimensional. Apresenta como grande virtude um rigorosofundamento matemtico, que aliado a regras particulares de contagem, fornece medidasrealistas e indicadores de preciso do objeto estudado".

Na prtica, os mtodos estereolgicos fornecem uma estimao de volume, reasuperficial, comprimento e quantidade por unidade ou volume de referncia e isto,baseado em valores bidimensionais de "amostras fiis" (unbiased samples). importantesalientar que a estereologia uma cincia de probabilidades e no um mtodo dereconstruo de objetos tridimensionais. O conjunto de tcnicas e mtodos utilizados naestereologia moderna, sero descritos a seguir, atravs de uma srie de exemplosutilizados na pesquisa biolgica.

Exemplo tpico de aplicao: Calculo da rea da superfcie pulmonar deovinos.

Crianas nascidas prematuramente com oito meses de gestao, possuem menoschance de sobrevivncia do que as que nascem prematuramente aos sete meses degestao. Elas morrem por insuficincia pulmonar. Uma razo para isto pode ser que nospulmes de crianas mais desenvolvidas (8 meses) os alvolos so menores e maisdifceis de inflar, que os alvolos grandes observados em crianas menos desenvolvidas(7 meses de gestao). Com a finalidade de testar esta hiptese foram realizados


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experimentos com ovinos. Micrografias foram tiradas dos pulmes de ovinos recm-nascidos por meio de cesariana com 80 e 100% da gestao. Baseado nestas fotografias,podemos determinar a rea da superfcie pulmonar durante a ltimo perodo de gestao.

Este exerccio visa verificar se houve alterao na rea de superfcie pulmonardurante os ltimos 20% do perodo de gestao.

A superfcie expressa como se segue: 1) pelo volume relativo do pulmo; 2)pelo volume relativo ou absoluto da massa corporal.

A rea de superfcie relativa ao volume do pulmo, ser considerada como arelao superfcie por volume (SV). A superfcie absoluta (SL) dada pela equao SL=SV . VL, onde VL o volume do parnquima pulmonar. A rea de superfcie (SM) emrelao a massa corporal (MB) dada por SL/MB.

O "parnquima" pulmonar (+/- 20% do pulmo) constitudo de tecidorespiratrio (paredes alveolares e capilares) e pelo espao ocupado pelo ar. As estruturasde conduo de ar e sangue, assim como o tecido conectivo so definidos como "no

parnquima".

Colocando-se aleatoriamente uma transparncia contendo uma grade de teste (testlines) sobre a fotografia podemos determinar a SV dos pulmes.

1. Coloque sobre a fotografia a grade de teste (Figura 1) .

Figura 1 Fotomicrografia de pulmo de ovino e grade de teste.

Dados:- MB: 4,779 kg- VL: 81.5 cm

3- d : 12,6 . 10-4, corresponde ao comprimento de cada linha teste, considerandoinclusive o aumento da fotografia- PT: 168, corresponde aos pontos iniciais e finais das linhas teste sobre"parnquima"


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2. Calcule o comprimento das linhas teste LT, que caem sobre o parnquima pulmonarda seguinte maneira:

a) Identifique as partes no parnquimticas (ductos de ar, vasos sangneos e tecidoconectivo), marcando as na transparncia.

b) Conte os pontos (iniciais e finais) PT das linhas de teste que caem sobre oparnquima.

c) Calcule o comprimento das linhas de teste LTque incidiram sobre o parnquima

LT= d/2 . PT =

Onde: d corresponde ao comprimento de cada segmento de linha teste em cm. Noesquea de considerar o aumento da fotografia.

3. Conte as interseces (I) das linhas teste com a superfcie pulmonar. Lembre-se queas paredes entre os alvolos possuem duas superfcies de troca gasosa.

I =

4. Calcule a interseco (IL) por unidade (e.g. cm) de comprimento do total de linhasteste (LT).

Onde : I o nmero de interseces e LT representa o comprimento das linhas teste,considerando o aumento da fotografia.

IL= I/LT =

5. Calcule a relao entre a rea de superfcie (SL) e o volume pulmonar (VL) a partir dafrmula:

2 IL= SV= SL/ VL=

6. a) Calcule a rea de superfcie absoluta (SL) para a fotografia a partir da frmula:

SL= SV . VL=

b) Calcule a superfcie do pulmo por unidade de massa corporal (SM)

SM= SL/ MB=

Unidades:MB(kg) ; VL(cm

3); SV(cm-1); SL(m

2); SL/MB(m2/ kg)

OBSERVAO: Aps ter-se estimado a superfcie pulmonar respiratria dos ovinoscom 80 e 100% de gestao, compare os resultados obtidos para averiguar a veracidadeda hiptese testada.

1058,4 . 10-4

50

0,047 . 10-4cm-1

0,094 . 10-4= 940 cm-1

7,66

1,602


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AMOSTRAGEM

Toda anlise cientfica quantitativa requer grande objetividade e rigormetodolgico. Este rigor se estende desde o planejamento do estudo, passando pelaamostragem de unidades fundamentais e suas respectivas sub-unidades at a obtenodos dados e sua anlise.

Nos trabalhos envolvendo microscopia, impossvel se examinar a integralidadedo objeto de interesse, consequentemente, uma amostra descritiva deve ser retirada. Anatureza da amostra de fundamental importncia na determinao da qualidade daestimativa e, portanto, na validade da investigao.

O sistema ou forma de amostragem mais simples, e que se enquadra nosrequerimentos estatsticos necessrios em investigaes cientficas aquele onde oscampos so amostrados sistematicamente e independentemente do contedo e dainfluncia do observador, porm, todos devem estar contidos em uma regio corretamentedefinida. Uma boa amostragem precisa preencher dois requerimentos bsicos: preciso eeficincia.

1. Amostragem randmica uniforme

Amostragem casual necessria porque os objetos biolgicos variam com aposio e orientao espacial. Se o contedo no variar com a posio, o objeto ditoser homogneo. Ex. O crtex cerebral muito homogneo em termos de suacitoarquitetura. Se o contedo no variar com a orientao o objeto dito serisotrpico. O crtex cerebral no isotrpico porque formado por vrias camadas,e entre essas camadas processos celulares esto alinhados paralelo e ortogonalmente sua superfcie apical. Nervos perifricos, pele, trato gastro-intestinal e msculoesqueltico so exemplos de sistemas anisotrpicos.

Embora a combinao de homogeneidade e isotropia seja rara em sistemasbiolgicos, a amostragem casual permite-nos negociar com a realidade prtica eheterogeneidade estrutural e anisotrpica.

O objetivo da amostragem casual simples dada a todas as partes doespecimen a mesma chance de ser selecionada para a anlise. Qualquer falha nesteprocesso invalida qualquer tentativa da amostra selecionada ser representativa.

Uma amostra casual uma amostra imparcial (unbiased) capaz de gerar resultadossatisfatrios. Uma amostra influenciada pode ser precisa (reproduzvel) mas noacurada.


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O procedimento para preparar especimens para microscopia essencialmente hierrquico. Blocos so retirados do especimen principal, seces sofeitas dos blocos, campos das seces so examinados e medidas so feitas noscampos (Figura 2).

Figura 2. Demonstrao de amostragem para microscopia. Para quantificao importante que a seleo dos objetos, blocos, seces, etc., sejam randomicamenteamostrados.

Todo passo introduzir erro na amostragem, o qual adicionado s diferenasnaturais as quais existem entre os organismos. Dessa forma como no temos controlesobre o ltimo, a forma mais efetiva de minimizar diferenas individuais estudar umnmero adequado de organismos.

Em estereologia, a casualidade introduzida de 2 formas: na posio e orientaodos cortes.

2. Amostragem randmica sistemtica

Em uma amostragem casual, a posio de cada item na amostra uma escolhaindependente. Embora imparcial (unbiased), este tipo de amostragem geralmente no omais eficiente, pois algumas reas do especimen podem ser super-amostradas e outras sub-amostradas. Para que todas as reas sejam mais uniformemente amostradas, utiliza-se aamostragem randmica sistemtica. Na amostragem sistemtica, o primeiro item daamostra escolhido randomicamente (atravs de uma tabela de nmeros aleatrios anexo1), mas determina as posies ou orientaes de todos os outros itens.

EXEMPLO: Queremos realizar uma amostragem randmica sistemtica de segmentos deuma linha (comprimento da linha = 1m ou 1000 mm) e queremos amostrar oito segmentosno total, os quais constituem uma frao de 8/1000 da linha total. O espao entre ossegmentos ser 1000/8, o qual 125 mm. Para simplificar vamos arredondar para 120 mm.Para obtermos uma amostragem randmica sistemtica ns precisamos de um nmerorandmico entre 1 e 120. Isto pode ser obtido multiplicando-se um nmero randmico Z,entre 0 e 1, por 120. Por exemplo, se o nmero randmico for 0,392 o primeiro segmento


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seria 120 x 0,392 = 47 ou simplesmente escolha atravs de uma tabela de nmerorandmicos um nmero entre 001 e 120. O outro segmento seria uma distncia sistemticade 120 mm partir dos 47 mm, o qual definiu o primeiro ponto. Assim, a linha seriaamostrada em 47, 167, 287, 407, ...., 887 mm. Estes oito segmentos constituem umaamostragem randmica sistemtica da linha.

1 metro

47 167...... 887

VariaesPodem ocorrer dois tipos de variaes:- Variao Biolgica - os estereologistas assumem uma variao de 15% em

uma populaoEste tipo de variao pode ser reduzido aumentando-se o tamanho da amostra.

- Variao sistemtica - relacionada ao erro humano e estimada em 10%OBS: Recomenda-se uma pausa a cada hora e meia quando se faz estereologia, poisos erros aumentam significativamente aps este perodo.

"O Fractionator"O "fractionator" o sistema de amostragem mais simples utilizado em

estereologia, e talvez por esta razo, o mais preciso. O princpio o seguinte: Retira-seuma frao do objeto, por exemplo, um milsimo. Conta-se todas as partculas presentesnesta frao. Uma estimativa imparcial do nmero total de partculas presentes no objeto,consistir no nmero de partculas contadas multiplicado pela frao, no caso 1000.Entretanto, imprescindvel que a frao obtida seja conhecida e que satisfaa umaprobabilidade randomicamente uniforme, ou seja, que toda parte do objeto tenha tido amesma chance ou probabilidade de ter sido includa na amostragem.

Para ilustrar melhor o princpio, utilizaremos o seguinte exemplo:

As letras presentes em uma folha de jornal representam uma populao departculas. O objetivo estimar o nmero total N de partculas (letras) da folha.

Procedimento:

1. Prepare a folha, retirando figuras e eventuais espaos em branco.2. Corte a folha ao meio e em seguida corte uma das metades em 20-30 pedaos.

- arranje os pedaos por ordem de tamanho como demonstardo abaixo

(oooooooooooooo)


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8

- colete uma amostra retirando um pedao a cada dois (veja setas acima). Estaamostragem sistemtica chamada "fractionator"

(ooooooo) Frao amostrada = 1/23. Sub-amostragem

A. Corte a amostra acima em 20-30 pedaosB. Arranje como feito anteriormenteC. Retire sistematicamente 1/3 dos pedaos

- para iniciar a amostragem, escolha randomicamente com o auxlio de umatabela de nmeros randmicos, um nmero entre 1 e 3

- colete os pedaos e dispense o restante- a frao amostrada agora corresponde a 1/2 x1/3 = 1/6

4. Repita os itens A-C, porm, sub-amostre 1/4 do material

- frao amostrada = 1/4 x 1/6 = 1/24

5. Repita A-C, amostrando 1/5 do material

- frao amostrada = 1/24 x 1/5 = 1/120

6. Conte o nmero de partculas (letras) na amostra. Toda letra que tiver pelo menos suaparte inferior direita representada na amostra ser considerada.

- Nmero de partculas = X

- Estimao do nmero total No= 120 . X

7. Pegue a segunda metade da folha e repita o procedimento

- frao amostrada = 1/120- nmero de partculas = Y- estimao do nmero total Ne= 120 . Y- O nmero total final estimado N :

N = 1/2( No+ Ne)

8. Pode se estimar o coeficiente de variao pela frmula abaixo:

CV = [1/3n (No- Ne/ No+ Ne)2]1/2

onde n corresponde ao nmero de folhas (neste exemplo n =1)

Este mesmo procedimento pode ser aplicado a vrios tipos de objetos de estudo(e.g. rim, bao, fgado, etc...).

Uma caracterstica importante do "fractionator" a no necessidade de medidasdimensionais (aumento do microscpio, espessura da seco, etc.) o que torna a


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estimativa totalmente independente das deformaes que por ventura possam existir ( ex.encolhimento e/ ou inchao).

VOLUME DE REFERNCIA

Para estimar-se o volume de uma determinada estrutura, necessrio conhecerum Volume de Referncia.

O mtodo para estimar o volume de referncia mais comumente usado emestereologia o Mtodo de Cavalieri (Cavalieri, 1635; Gundersen and Jensen, 1987).Outros mtodos que podem ser mais apropriados, incluem simplesmente pesagem eimerso em gua. Se o rgo apresenta consistncia e densidade conhecidas, entodetermina-se o volume diretamente atravs da pesagem. A volumetria usando imerso emgua baseia-se no Princpio de Arquimedes do deslocamento dos fluidos. Contudo, se orgo possuir cavidades que se abrem para o meio externo, como o pulmo, o volume subestimado atravs deste mtodo.

Para a determinao do Volume de Referncia os mtodos mais freqentementeempregados so : Deslocamento de Volume e do Princpio de Cavalieri:

1. DESLOCAMENTO DE VOLUME

Recomenda-se a utilizao de tecidos frescos. Se forem utilizados tecidosfixados, deve-se ter o cuidado de utilizar um fixador que provoque o mnimo de retraono material. Para mamferos, o fixador recomendado Glutaraldedo a 2% em tampolevemente hipertnico, aproximadamente 350 mOsm.

Mtodo:O volume determinado atravs da imerso do corpo em fluido e registro do peso embalana (Fig. 3).

1) Sobre o prato de uma balana, colocar um frasco contendo soluo fisiolgica outampo.

2) Tarar a balana3) Prender o rgo no suporte e mergulhar na soluo, sem que ele toque no fundo ou

nas paredes do frasco.4) A diferena de massa indicada pela balana revela o volume do rgo.

Tampo


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Figura 3. Esquema de utilizao do mtodo de deslocamento de volume.

Ex: Determinar o nmero de clulas de Purkinje no cerebelo.(MB = massa corporal, VCB = vol. cerebelo, VPC = vol. clula de Purkinje)

2. PRINCPIO DE CAVALIERI

Em certos casos no possvel medir o volume de uma estrutura pelo Mtodo doDeslocamento, por exemplo quando o rgo muito pequeno ou quando impossvelseparar a estrutura estudada de outros rgos ou tecidos. Nestes casos, utiliza-se oPrincpio de Cavalieri. Este mtodo possibilita a estimativa de volumes confiveis,

mesmo em rgo com formas irregulares.O matemtico italiano Cavalieri (1598-1647) mostrou que o volume de um

objeto (V) pode ser estimado a partir de seces paralelas separadas por uma distnciaconhecida (t), somando-se as reas de todas as seces transversais do objeto (A) emultiplicando este resultado por t (Gundersen et al., 1988).

A nica condio imposta por este mtodo que o primeiro corte seja randmicono objeto. A estimativa completamente independente da orientao do conjunto decortes e da forma do objeto (Figuras 4A e 4B).

t1 t2..................... t n

Figura 4A.Esquema de utilizao do mtodo de Cavalieri. (t1 = t2= t3......tn )

T = ti_ _

V = t A (V= volume, t = espessura, A = rea)

Figura 4B. Seco transversal do objeto


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Mtodo:

1) Mede-se o comprimento do rgo com uma rgua, na direo perpendicular a que sevai cort-lo.

2) Utilizando-se um Normograma (4C), determinar o nmero de cortes necessrios deacordo com a complexidade do rgo.

3) Calcular a espessura (t) do corte dividindo-se o comprimento do rgo pelo nmerode cortes que sero feitos.

4) Para determinar-se o ponto de incio dos cortes, escolhe-se um nmero menor ouigual a tna tabela de nmeros randmicos (anexo 1), multiplica-se este nmero por te divide-se por 10.

5) Os cortes devem ser virados, de modo que a mesma face de todos os cortes fiquevoltada para cima.

6) O corte que no possuir uma rea de corte na face correspondente aos demais deve ser

descartado.7) Utilizando-se novamente o normograma, determina-se o nmero de pontos que

necessitam ser contados, de acordo com o Coeficiente de Erro (CE) permitido.8) Escolhe-se uma grade isotrpica cujo nmero de pontos coincidentes com todos os

cortes ao mesmo tempo seja semelhante ao nmero de pontos encontrados nonormograma. Mede-se a distncia entre dois pontos na grade (d).

9) Conta-se o nmero total de pontos (P) coincidentes com todos os cortes.10)Calcula-se a rea (A) dos cortes:

A = P x d2

11)Calcula-se o Volume (V) do rgo:

V = t x A


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Figura 4C. Normograma para predizer o nmero de cortes necessrios de acordo com acomplexidade do rgo. Quanto mais complexo o rgo maior nmero de pontos devem

ser utilizados. (Gundersen & Jensen, 1987).


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Exemplo:1) Mediu-se o comprimento de um modelo de um rgo feito com massa plstica,

obtendo-se 46 mmou 4,6 cm.2) Considerando-o como um rgo de baixa complexidade, encontrou-se no

normograma que so necessrios cerca de 5 cortes.3) Calculo-se a espessura de cada corte:

t = comprimento (mm) / node cortes => t = 46/5 t = 9,2 mm ou 0,92 cm4) Escolheu-se um nmero randmico na tabela, obtendo-se 7, o qual foi multiplicado

por tpara obter-se o ponto de incio dos cortes:Ponto de Incio = 7 x 9,2 mm /10

Ponto de Incio = 6,4 mm ou 0,64 cm5) Foram feitos, ento, 5 cortes com espessura de 9,2 mm a partir do ponto de incio.6) Atravs do normograma determinou-se que seriam necessrios de 20 a 30 pontos para

um CE=0,05.7) Uma grade isotrpica, cujo d = 0,6 cm, foi colocada foi colocada sobre os cortes e os

pontos foram contados, obtendo-se P = 208) A rea foi calculada: A = 20 x (0,6)2 => A = 7, 20 cm29) O volume foi calculado: V = 0,92 x 0,72=> V = 6,62 cm3.

Aps a determinao do volume de referncia, pode-se estimar o nmero declulas de Purkinjie, nmero de clulas cloreto, etc. por unidade de volume de referncia,como nos exemplos a seguir:

Exemplo A: Quantas clulas de Purkinje existem no cerebelo de um rato ?

1) Quantas clulas de Purkinje por unidade de peso do animal ?

VCB/MB * VPC/VCB = VPC/MB

onde VCB o Volume do Cerebelo; MB a Massa do Corpo e VPC o volume ocupadopelas clulas de Purkinje.

2) Quantas clulas de Purkinje existem no vermis comparado com a aurcula ?

VPC/VAU * VAU/VCB* VCB/MB = VPCAU/MB

onde VAU o Volume ocupado pela aurcula e VPCAU o Volume ocupado pelas clulasde Purkinje na aurcula.

Exemplo B: Quantas clulas de cloreto existem nas brnquias de um determinado peixe ?

VGI/ MB * VFI + SL/VGI* VFI/ VFI + SL= VFI/MB


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ouVGI/ MB * VFI + SL/VGI* VSL/ VFI + SL= VSL/MB

onde VGI o Volume das Brnquias; MB a Massa do Corpo; VFI o Volume ocupadopelos filamentos branquiais; VSL o volume ocupado pelas lamelas secundarias e VFI + SL o volume ocupado pelos filamentos e lamelas respiratrias simultaneamente.

VOLUMETRIA

MTODO DELESSE:

Teorema de Delesse:

Num plano seccional mdio, a frao de rea de um componente igual afrao de volume que este componente ocupa dentro do todo.

A / AREF = V/ VREF

onde A a rea; AREF a rea de referncia; V o volume e VREF ovolume de referncia.

Exemplo: Medir o Volume de Mitocndrias nos Hepatcitos

VLIV / MB x VHEP/ VLIVx VML/ VHEP = VML/ MB

onde VLIV o volume do fgado; MB a massa do corpo; VHEP o volumeocupado pelos hepatcitos e VML o volume ocupado pelas mitocndrias .

A amostra precisa ser bem representativa do total (uniforme).

A amostra deve ter uma Distribuio UniformeDireo IsotrpicaeDistribuio Randmica

A grade (Test Probe) tambm deve ser Uniforme

IsotrpicaRandmicaem relao amostra.

Exemplo:

Tem-se um cubo de parafina com as seguintes dimenses: 102,29 x 99,70 x81,48 mm. Este cubo contm 50 pequenos cubos pretos, sendo que cada um possuias seguintes dimenses: 1,5 x 1,4 x 1,4 mm. Deseja-se saber qual o volumeocupado pelos 50 cubos pequenos dentro do cubo maior. O volume do cubo maiorser o volume de referncia.


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Volume de Referncia: 102,29 x 99,70 x 81,48

VREF = 830,9 cm3

O cubo grande foi cortado em 7 seces com 1 cm de espessura. O volumedos cubos pretos foi determinado atravs da avaliao da sua rea superficial emcada corte (Figura 6A). Para medir a rea, utilizou-se duas grades (P4 e P5) paraverificar qual a mais eficiente (Figura 6B e 6C). Cada grade possua dois tipos depontos, grossos e finos. Foram contados o nmero total de pontos que incidiamsobre cada corte (Pt) e o nmero de pontos sobre os cortes dos cubos pretos (Pi).

As reas so determinadas pela contagem de pontos e a relao dos pontostestes com os pontos de referncia a mesma da rea teste com a rea de referncia.

Figura 6A. Esquema do cubo de parafina.

Figura 6B. Grade P4 observe que os pontos esto mais espalhados (menornmero de pontos por unidade de rea)


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Figura 6C. Grade P5 Observe que os pontos esto mais concentrados.Maior nmero de pontos por unidade de rea.

Tabela I. Clculos do volume de referncia do cubo de parafina.

Grade P4 Grade P5Grosso Fino Grosso Fino

Corte Face Pi Pt Pi Pt Pi Pt Pi Pt1 A - - - - - - - -

B 1 13.8 28.4 132.2 1.4 6 32 1552 A - - - - - - - -

B 3.5 15 25 128 1 6.3 31.5 1543 A - - - - - - - -

B 1.66 12 18.6 126.6 1.25 6.75 25.75 154.254 A - - - - - - - -

B 3 14 30.7 127.2 1.25 7.5 32 1545 A - - - - - - - -

B 1.25 14 29.5 130 1.25 6.75 33.2 1496 A - - - - - - - -

B 5 14 30 125 2.25 7.5 32.75 157.57 A - - - - - - - -

B 2.8 14 22.8 134 2.25 7.5 30.25 154

X = 2.6 13.8 26.4 129.7 1.52 6.9 31.06 153.96

SD 1.42 0.89 4.5 3.2 0.51 0.61 2.52 2.53XPi/xPt 0.19 0.205 0.22 0.235V CUB 168.7


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Grfico 1Exemplo de Orientao Isotrpica

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

4.5

0

22.

545

67.

590

112.

5

135

157.

5

180

202.

5

225

247.

5

270

292.

5

315

337.

5

ngulos

Nmerode

Interseces

Grfico 2Exemplo de Orientao Anisotrpica

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

0

22.

545

67.

590

112.

5

135

157.

5

180

202.

5

225

247.

5

270

292.

5

315

337.

5

ngulos

Nmerode

Interseces

Diagrama de RoseOrientao Isotrpica

0

1

2

3

4

0

22.5

45

67.5

90

113

135

158

180

203

225

248

270

293

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Diagrama de RoseOrientao Anisotrpica

0

5

10

15

20

0

22.5

45

67.5

90

113

135

158

180

203

225

248

270

293

315

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IUR VUR

Usa-se qualquer tipo de grade Usa-se grade ciclide

Ex.: matriz retangular, expanded circular Merz Grid

Figura 7. Grficos de orientao e diagramas de Rose.

DETERMINAO DA REA SUPERFICIAL: IUR OU VUR?

O conhecimento da rea superficial de uma estrutura um indicador valioso daeficincia desta superfcie em determinado processo fisiolgico. Um dos mais rotineirosexemplos a estimao da superfcie total para trocas gasosas no pulmo de mamferos.

O valor obtido um excelente parmetro para se avaliar a eficincia das trocas gasosasem determinada circunstncia.A estimao da rea superficial exige que sejam adotados mtodos que forneam

algum grau de casualidade (randomness) na orientao das seces obtidas. Esse fatocontrasta com os mtodos para a estimao do volume e nmero de partculas que noexigem este requerimento. Sendo assim, descrevemos abaixo dois mtodos que obedecemtais requerimentos.


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A gerao de seces IUR (isotropic uniform section)

Seces isotrpicas uniformes (isotropia: uma completa direo ao acaso) sonecessrias para um grande nmero de procedimentos estereolgicos. Mattfeldt et al.(1990) descreveu a utilizao do Orientator como um simples e prtico mtodo para seobter seces IUR de qualquer material.

Geralmente, o material includo em alguma substncia que permita a realizaode cortes sem a distoro do mesmo. Arbitrariamente faa um corte em uma dassuperfcies do bloco contendo o material. O bloco colocado no centro de um crculocom eqidistantes divises ao longo de seu permetro (Fig. 8). Um nmero ao acaso entreas divises do crculo ser selecionado e o bloco ser cortado perpendicularmente aoplano do crculo. Em seguida, a superfcie cortada ser voltada para baixo e dispostasobre um outro crculo com divises no-eqidistantes entre si. Um novo nmero aoacaso ser selecionado e indicar a nova direo de corte do bloco. A ltima seo

cortada isotrpica uniforme, IU, isto , esta seo no tem relao com a primeiraseo, assim, ela foi obtida a partir de todas as possveis orientaes com probabilidadeconstante (uniforme).

Por definio, uma seo isotrpica simplesmente um plano que perpendiculara uma orientao isotrpica. Em estruturas que no apresentam um bvio eixo deanisotropia (p/ ex. fgado), as seces IUR podem ser obtidas diretamente por corte dobloco pr-includo seguido de randomizao da orientao do tecido na incluso final emicrotomia. Entretanto, se existir qualquer dvida em relao a anisotropia das estruturasno interior do rgo, sugere-se o uso do orientador.


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Figura 8. O orientator permite a obteno de seces IUR

ANLISE ESTEREOLGICA DE SECES VERTICAIS (VUR verticaluniform sections)

Qualquer seco que seja perpendicular a um plano horizontal de referncia,porm arbitrrio, e que tenha uma posio e uma rotao randmica ao redor de um eixovertical constitui-se em uma seo vertical, VUR (vertical uniform random).

Um mtodo prtico adequado para gerar linhas isotrpicas sobre um materialseccionado verticalmente foi primeiro desenvolvido por Baddeley et al. (1986). Abaixoapresentamos um breve resumo desse mtodo:1. Escolha um plano horizontal como referncia (pode ser a sua mesa de trabalho). Em

seguida, disponha seu material de interesse (um rgo ou parte dele) sobre a mesa. Seo rgo for tubular, corte-o longitudinalmente. A orientao do rgo por sua

escolha mas, no esquea que a base de apio de seu material corresponde ao planohorizontal. Em muitos casos a orientao do rgo facilmente identificvel e a baseplana do rgo pode ser assumida como o plano horizontal de referncia (pele,epitlios planos). Os rgos tubulares (estmago, intestino, etc), quando abertoslongitudinalmente, tambm podem ser assumidos planos e seccionados verticalmentecom sua regio mucosa voltada para cima. Os msculos apresentam planos de seovertical naturais (faixas anisotrpicas).

2. Imagine um eixo vertical passando pelo centro de seu material permitindo livrerotao isotrpica do mesmo sobre o plano horizontal.

3. Seccione o material em intervalos tconhecidos (uniform random position).


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4. As seces obtidas so VUR em relao ao material. V refere-se a orientao, isto, todas as seces devem ser perpendiculares ao plano horizontal. UR refere-se aposio da seo (=corte), isto , os cortes devero ser uniformes (=a probabilidadede uma seo ser obtida a mesma das demais) e randmicos (paralelos ao planovertical).

5. O plano vertical deve ser identificvel em cada seo.6. Use um grade P2 ou P3 sobre os cortes obtidos (Fig. 9). Para cada cruz do grade que

cai sobre as fatias do rgo, completa ou incompletamente, uma amostra de tecidodever ser amostrada, seccionada usando um orientator, processada, incluida emicrotomizada para anlise. Uma seo uniforme ao acaso retirada deste blocorepresentar uma VUR.

Figura 9. Esquema do corte ( esquerda) e da grade utilizada ( direita). A seta indicaum detalhe da grade (como um ponto de referncia).

A idia de seces verticais foi primeiro proposta especificamente para estimarrea de superfcie (Baddeley et al., 1986). Contudo, o mtodo tem se tornado de usogeral e o mtodo de amostragem de muitas investigaes biomdicas. A partir de taisseces uma ampla variedade de parmetros podem ser estimados (Sv, Vv, Nv, Lv,etc.). A menos que haja uma forte razo para usar seces isotrpicas, as seces

verticais devem representar o mtodo de amostragem preferencial. O sistema deanlise (grade) usado do tipo ciclide (Fig. 10).

Figura 10. A figura acima mostra uma seco vertical sobreposta com um sistemade grade ciclide.

+ + +

+ + +


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MEDIDAS DE COMPRIMENTO

Qual o melhor mtodo para medir o comprimento de superfcie?Como definir o ngulo para determinar as medidas na foto?Qual a melhor grade para realizar as medidas e como calibr-la em

relao ao objeto?Utilizaremos as medidas de barreira gua-sangue nas brnquias dos peixes

para elucidar as questes acima.

BARREIRA GUA-SANGUE

Categorias:

1. gua-sangue;2. gua-gua;3. Sangue-gua;4. Sangue-sangue;5. gua- *;6. Sangue- *.

CONSUMO DE OXIGNIO (MO2)

MO2= KO2.S/T . PO2 onde:

KO2 = constante de difuso do O2;S= rea de superfcie das brnquias;T= espessura da barreira.PO2= presso de oxignio

CAPACIDADE DE DIFUSO (DO2)

DO2= MO2/ PO2 relao fisiolgica

DO2= KO2. S/T relao morfolgica

FATOR ANATMICO DE DIFUSO (ADF)

ADF = S/T onde:

S = rea de superfcie das brnquiasT = espessura da barreira


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REA DE SUPERFCIE RESPIRATRIA % (RSA)

- BRNQUIAS RSA = (IWB/ IWB + IWW) . 100

-SANGUE RSA = (IBW/ IBW + IBB) . 100 onde:

I = nmero de interseces

Clculos:

1. Mdia harmnica () para todas as fotomicrografias de uma seco2. Mdia aritmtica das mdias harmnicas para uma dada amostra ou populao

1/ = 1/ti/ N

SUPERFCIE EM RELAO AO VOLUME (SV)

Sv= 2 I/LT

LT= L/PTo. PT onde:

LT= comprimento total

L/PTo = 2d = comprimento de um arco ciclidePT = nmero total de pontos (que caem sobre o arco teste assumindo que o nmero depontos testes igual ao nmero de arcos testes)

Para determinar a superfcie em relao ao volume, conta-se o nmero de interseces(nmero de arcos ciclides) que cortam a superfcie em estudo.

Calibrao da grade = Comprimento de um arco ciclide (Obs. Deve-se calibrar a gradepara cada foto).


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d = 0, 6 cm

Figura 5.Esquema de corte (em massa de modelar) e grade utilizada.

Calibrao da Grade

2d

d


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25

0,5..d

Figura 11. Comprimento de um arco ciclide

Clculo de magnificao: Comprimento da fotografia / aumento do objetoEx. uma foto com 12 cm de comprimento e 2100x de aumento

12/2100 = 57 m57 m 12cm de fotografia

x 1cmx = 4,75 m

1cm de fotografia = 4,75 m

Figura 12. Merz grid

BARREIRA GUA-SANGUE

Escolha um ngulo randomicamente entre 0 e 97 (com o auxlio de uma tabela denmeros aleatrios). Para cada objeto estudado um novo ngulo dever ser escolhido.


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Com o auxlio de uma rgua e mantendo o ngulo escolhido, encontre as intersecesdos arcos ciclides com a barreira a ser medida e determine a distncia (cm ou mm).

Figura 13. Exemplo : Fotomicrografia de lamela secundria.

Clculos:

Comprimento de um arco ciclide 0,53 m

Superfcie em relao ao volume

Lt= 0,53.185 = 98 m

Sv = 2. 12/98 = 0,24 m-1

Tabela II. Clculo da barreira gua-sangue

Distncia da barreira (cm)3,67,54,13,03,06,0

x = 4,25 cm = 2,85m

x3-D =x . 0,5 = 2,12 cm = 1,42m

= 3,7 cm = 2,48 m3-D= 2/3.tn= 2,47 cm = 1,65 m


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4,82,0

= 34Obs: no esquea de transformar os valoresem m, ou seja, multiplicando por 0,53.

Chave para Anlise de Micrografias com Sistema de Teste Ciclide (VUR)

No No SimPossui barra

de dimenso?

Medir ocomprimento dabarra em mm**

Calcule d(m) e comp.barra

Calcule Sv: rea

superfcie porunidade devolume.

Calculecomprimentoarco ciclide(m) Calcule Lt:

comprimento totalLt = L/Pt * PTPT= n. total de pontossobre otecido.L/Pt= arcociclide

Obter mdia dos

Use oaumento damicrografia

Determine o

comprimentoda foto edivida peloaumento dado.

Micrografia


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Esse procedimento comumente usado para a determinao da espessura dabarreira de difuso de gases em rgos respiratrios (p/ ex. brnquias, pulmo, bexiganatatria e etc.).

Exerccio Proposto:

1. Determine a espessura da barreira de difuso ar-sangue na micrografiaeletrnica pulmo de cobra (Figura 14).

Use a tabela de no.ao acaso e

descubra umngulo a ser usado

sobre o grade.

Mantenha sua rgua sempre no mesmo ngulo para fazer

as medidas de espessura da barreira gua-sangue. Faa amedida sempre quando houver uma interseco do arcociclide com a superfcie em contato com a gua.


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Figura 14. Fotomicrografia de pulmo de cobra (2100 x)

Soluo:

a)Calibrao da magnificao:magnificao: 2.100xcomprimento da foto: 9 cm9/2100 = 0,0042 cm ou 4,2 mm

b) comprimento do arco ciclid0,8 x 4,42 = 3,36

c) Comprimento total:No. pontos sobre o tecido na micrografia = 43Lt = L / Pt x PTLt = 3,36 m x 43 = 144,48m

d)rea superficial por volume:No. interseces da sup. em contato com a gua = 8Sv = 2I / Lt

Sv = 2 x 8 / 144,48m = 0,111m-1d)Medidas da distncia ar-sangue:

Distncia ti(cm)

1/ti

1,7 0,5881,3 0,769


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30

0,8 0,1251,8 0,5550,4 2,50,3 3,3330,3 3,333X = 0,842 1/ti/N=

1,761X3-D= 0,421 3-D = 0,378

CONTAGEM DE OBJETOS POR UNIDADE DE VOLUME (NMERO PORVOLUME)

Para estimar o nmero total de objetos (por exemplo, clulas) num determinadovolume , levamos em conta as seguintes caractersticas:

Tabela III.Anlise Estereolgica

PONTOS NMERO DIMENSOlinha Comprimento 1plano rea 2

dissector Volume 3

Tabela IV.Caractersticas geomtricas de objetos 3-D

NOME MEDIDA DIMENSOvolume Volume 3

superfcie rea da superfcie 2curva Comprimento 1

cardinalidade Nmero 0

Sendo a medida o nmero de objetos e, portanto, com dimenso zero, as gradesutilizadas para determinar volume, superfcie, curva, etc. no podem serutilizadas para tal tipo de estimativa. Utiliza-se um disector, com dois planosparalelos de seco e uma distncia h conhecida entre eles, no qual estaro aspartculas ou objetos a serem contados. Este disectorpode ser colocado numestereomicroscpio e atravs do macromtrico altera-se o foco, podendo entoobservar a amostra em profundidade, ou ainda realizando-se cortes verticaisnos dois planos paralelos para que possa ser analisado em microscpio ptico.


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Figura 15. Esquema do dissector.

Para contar o nmero de objetos deve-se ter o cuidado de no contar

duas vezes o mesmo objeto e para tanto, analisamos a posio domesmo no disector, conforme a figura acima. Objetos que possuem umdimetro maior do que a espessura do disector aparecem em ambas asfaces e no devem ser contados. preciso conhecer bem o objeto a sercontado e saber reconhec-lo para efeito de contagem atravs de cortes.

A grade utilizada neste tipo de contagem a seguinte:

Quando os objetos recaem sobre as linhas cheias, eles no so contadose so excludos da amostragem. So as chamadas linhas proibidas.Em seguida comparamos dois cortes consecutivos e verificamos quaisobjetos se repetem e que sero portanto, excludos tambm. Os cortescomparados ficam lado a lado, e usamos o da direita como amostrageme o segundo como look up (Q- direito e Q- esquerdo,respectivamente).

Linhas

proibida


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Figura 16. Esquema do dissector e das linhas de contagem.

Para calcular a estimativa do nmero total preciso saber o volume dodisector, atravs da seguinte frmula:

V(dis)= t . A (fra) onde:

V(dis)= Volume do disectort = espessura do corteA (fra)= rea da grade/ magnificao da microfotografia

E ento temos o nmero total:

N= NV . V(ref)

TIPOS DE ERRO

Quando estruturas laminares no so cortadas perpendicular ao seu plano, aespessura superestimada. Os efeitos so como a seguir:

1. Efeito de inclinao: o comprimento aparente (lapp) aumentado do comprimento real(l0) dependendo do ngulo desvio da perpendicular ():

lapp= l0/ cos


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2. Efeito Holmes: Quando observamos um cortes histolgico no microscpio ptico, ouquando observamos cortes ultrafinos na microscopia eletrnica, estamos vendo asestruturas depois destas serem atravessadas pela luz ou feixe de eltrons,respectivamente. A imagem ento formada pela projeo das estruturas dentro do corteno plano focal do sistema ptico. O nmero de estruturas particuladas visto na imagemno apenas proporcional ao nmero de estruturas, mas tambm espessura do corte. Aisto chamamos de efeito Holmes (Weibel e Elias, 1967).

Portanto a espessura de estruturas opacas superestimada, quando elas no socortadas perpendicularmente por causa da espessura limite da seco.

Esta superestimao (l) independente da espessura da estrutura, masproporcional a espessura da seco (t) e a tangente do ngulo desvio ():

l = t. tan

A espessura de estruturas transparentes (exemplos: espaos interlamelares) reduzido no mesmo valor.

3. A combinao destes dois efeitos fornecem a seguinte frmula de correo paraestruturas opacas:

l0= lapp. cos- t . tan

Exemplo: assumindo que seces histolgicas incluem desvios to grandes quanto ao10% do normal e o ngulo de desvio mdio foi 5, tem-se que para seces de 5 m o l0corrigido :

l0= 0,996. Lapp- 0,44 onde:

l0e lappso em m.

REFERNCIAS

BADDELEY, A. J.; GUNDERSEN, H. J. G. AND CRUZ-ORIVE, L. M. (1986)Estimation of surface area from vertical sections.J. Microsc.142: 259-276.

HOWARD, C. V. AND REED, M. G. (1998) Unbiased Stereology. Three-DimensionalMeasurement in Microscopy. BIOS Scientific Publishers. UK.


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MANDARIM-DE-LACERDA, C.A. (1995) Mtodos quantitativos em Morfologia.EdUERJ, 131.

MAYHEW, T.M.(1991). The new estereological methods for interpreting functionalmorphology from slices of cells and organs. Great Britain, p. 639-665.

MATTFELDT, T.; MALL, G.; GHAREHBAGHI, H. AND MLLER, P. (1990)Estimation of surface area and length with the orientator.J. Microsc.159:301-317.

ANEXO 1 TABELA DE NMEROS RANDMICOS


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