CROMATINA

Universidade Federal de Pelotas

CDTec - Graduação em Biotecnologia

Disciplina de Biologia Molecular

Priscila M. M. de Leon Dra., Médica Veterinária

Profa, PNDP Biotecnologia/UFPel

Tamanho Bactéria: 2µm x 1µm DNA circular: 1,6mm

Tamanho Vírus: 0,0008µm x 0,3µm RNA viral: 2µm

Tamanho Célula: 2-10µm Tamanho Núcleo: 6µm diâmetro DNA : 1,8m

MOLÉCULAS DE ÁCIDO NUCLÉICO SÃO MAIS EXTENSAS DO QUE O ESPAÇO A SER PREENCHIDO POR ELAS

E. Coli: 2µm de comprimento e 1µm de diâmetro DNA circular de 1.600µm (1,6mm)

COMPACTAR!!!!!

COMPACTAÇÃO DO MATERIAL GENÉTICO

FORMA ORGANIZADA

VIABILIZA DE PROCESSOS FUNCIONAIS

COMPACTAÇÃO FUNCIONAL

DNA + PROTEÍNAS

CROMATINA

Formado pela interação entre

proteínas e DNA

Arranjo nucleoproteico

organizado e dinâmico

CROMATINA PROCARIÓTICA X

CROMATINA EUCARIÓTICA

• Procariotos: bactérias e arqueas

• Genomas oraganizados em um nucleoide • Cromatina ocupa ¼ do volume celular • Sem envoltório, não tem forma fixa – nucleoides cilíndricos • Volume do nucleoide: 0,5µm³ (1,7 x 0,65µm) Volume DNA genômico livre: 200µm³

COMPACTADO CENTENAS DE VEZES • Bactérias e Arqueas estrutura da cromatina

CROMATINA PROCARIÓTICA

NUCLEOIDE E CROMATINA BACTERIANA

• Forças determinam o dobramento do DNA a cada 150 pb (1º nível de compactação)

• Interações com proteína definem a formação de alças - Domínios Topológicos (10kb)

• A estabilidade da alça é mantida pela interação do DNA com proteínas cromatínicas

• O superenrolamento negativo proporciona um nível adicional de compactação

• Macrodomínios: dezenas a centenas de domínios topológicos – funcionalidade (recombinação e expressão gênica)

DNA em solução DNA na célula

• Estrutura do nucleoide bacteriano é dinâmica e varia conforme o estado fisiológico da célula;

• Fase exponencial de multiplicação: nucleoide com grande número de domínios topológicos e DNA superenrolado negativamente;

• Fase estacionária: nucleoide com numero menor de domínios e estrutura mais relaxada (nemor superenrolamento)

NUCLEOIDE E CROMATINA BACTERIANA

Proteínas associadas ao nucleoide (NAPs): responsável pela estruturação do nucleoide.

Ponte DNA + Proteína + DNA

Grau de compactação resulta do somatório de várias NAPs

6 principais: Dps/MrgA; Fis; IHF; H-NS; HU e SMC/MukB

Fase exponencial de multiplicação

Fase estacionária de multiplicação

Genes altamente transcritos estão próximos

NAP: Proteínas associadas ao nucleoide

Se ligam ao DNA e são responsáveis pela estruturação do nucleoide

• Todas as NAPs compactam o DNA • Grau de compactação é resultado da atividade de várias NAPs • Sobreposição de função das NAPs: estrutura da cromatina é mantida mesmo na ausência de alguma NAP.

A – Dobramento e formação de nodo

B – Dobras induzidas por HU ou IHF

C – Filamentos super-helicoidais formados por HU

D – Interligação de DNA mediada por H-NS

E – Entrelaçamentos de DNA através de SMC/MukB

F – Enrolamento e interligação mediadas pela Lrp

G – Dodecâmenros (esferas) associados em estrutura de 3 camadas

Função: compatação global do nucleoide, formação de determinadas estruturas da cromatina bacteriana, e definição do grau de superenrolamento do DNA.

Compactação da cromatina: Dps, MrgA, Fis, IHF, H-NS, HU e SMC/Mukb Estabilidade das alças: H-NS, Lrp e SMC/Mukb Definição do ápice da alça: Fis, IHF e HU Grau de superenrolamento: SMC/MukB e H/NS

NAPs

• Padrões de expressão diferencial de algumas NAPs, em função do andamento do processo de multiplicação de E. coli: diferentes proteínas dobram e interligam o DNA modulando o nucleoide em cada fase

• Expressão gênica regulada por NAPs, tipos: • Indireta: alteração no grau de supertorção de uma alça afeta positiva ou negativamente a transcrição • Direta: algumas NAPs podem se ligar a regiões reguladores e ativar ou reprimir a transcrição

NUCLEOIDE E CROMATINA DE ARQUEAS

• Material genético organizado em nucleoide

• Cromatina condensada de acordo com o estado fisiológico da célula

• Inclui NAPs exclusivas de Arqueas, proteínas ortólogas de NAPs bacterianas e proteínas eucarióticas

•Principais: Alba e Histonas

PROTEÍNAS ALBA

• Dímeros de Alba associam-se ao DNA cobrindo-o em tandem (A) formando fibras nucleoproteicas helicoidais estendidas (B)

• Quando em concentrações mais elevadas, há a associação de dímeros adjacentes formando uma estrutura altamente ramificada

HISTONAS

• Proteínas básicas com alta afinidade pelo DNA: HMfA e HMfB • Similares às histonas do domínio Eukarya • Formadas por 3 α-hélices separadas por alças curtas (A) • Codificadas por 1 a 6 genes e são estabilizadas formando homo ou heterodímeros (B) • Os dímeros associam-se formando tretâmeros, em torno dos quais o DNA (60 a 90pb) se enrola formando Nucleossomos (C) • Na cromatina, os nucleossomos são encontrados em tandem – fibras compactas – colar de contas

Arqueas (menos compactas) tem mais acesso ao genoma durante a transcrição, o que não ocorre em eucariotos. Com isso responde rápido a mudanças ambientais

Diferenças fisiológicas importantes entre arqueas e eucariotos

Grau de compactação da cromatina é menor que em eucariotos

Arqueas

Nucleossomos mais simples

CROMATINA EUCARIÓTICA

O núcleo de uma célula humana tem 6 mm de diâmetro e a extensão total do DNA dos seus 46 cromossomos soma 1,8 m.

Como é resolvida a discrepância entre estas duas grandezas?

Cromossomo

Cromatina

Célula

Núcleo celular

Histonas

DNA

Nucleotídeos

Ligações Fosfodiéster

• Cada Cromossomo consiste em uma dupla hélice de DNA contínua e única

DNA é associado a proteínas:

Histonas e Não-histonas

Nucleossomo unidade estrutural básica

*Cromossomo 1 – 250 milhões pb 22

Nucleossomo eucariótico é mais complexo que de arquea

Nucleossomo: unidade estrutural básica da cromatina

• 150 a 250 pb associados a um octâmero de histonas (11 a 20 kDa, caráter básico acentuado – 20-30% aa carregados +)

Favorecendo ligação c o DNA

• Histonas Centrais:

2 X (H2A, H2B, H3 e H4)

* Alta conservação

* 100 aa

* Genes

• Histona de Ligação:

H1/H5

*190-250 aa

* mais variáveis

* Cromatina pode ter 2x mais proteína que DNA em eucariotos

Nucleossomo:

• A partir do Nucleossomo a cromatina eucariótica é estruturada em conformação progressivamente mais complexa;

• Organização da Cromatina é dinâmica (estágio do ciclo celular e atividade);

• Tipos de Cromatina:

Eucromatina: menor compactação → Ativa para a Expressão Gênica

Heterocromatina: maior compactação → Inativa

Níveis de organização mais complexo

Cromatina:

Heterocromatinas: regiões condensadas → DNA inativo

- Heterocromatina Facultativa: parte da cromatina que se

apresenta condensada ou descondensada. Sequencias passiveis

de transcrição que podem ser inativadas. Ex: cromossomo X na

fêmea (apenas 1);

- Heterocromatina Constitutiva: sequencias genicas altamente

repetitivas, nunca são transcritas. Ex: centrômeros;

Eucromatinas: regiões distendidas → DNA ativo (expressão de

proteínas e enzimas).

10% cromatina ativa → menos condensada;

90% cromatina inativa → mais condensada

Níveis de organização mais complexo

Níveis de organização mais complexo

• Nucleossomo: unidade estrutural básica da cromatina (DNA em dupla hélice e Histonas). – Forma: cilíndrica achatada, 10 nm x 6 nm

* Constituído por 200 pares de bases (pb) de DNA associado com octâmero de histonas (H2A, H2B, H3 e H4) e uma molécula de H1

* Centro do nucleossomo (octâmero de histonas + 146 pb de DNA)

* DNA de ligação (15 a 80 pb)

• Nucleofilamento ou fibra de 10 nm: 1º nível de compactação da cromatina. – Associação de nucleossomos adjacentes através da interação de H1 (extremidade

amino-terminal a extremidade carboxi-terminal)

– 10% durante a intérfase, permitindo acesso as enzimas de transcrição

– Periodicidade: distribuição regular dos nucleossomos

– Posicionamento em fase dos nucleossomos

• Solenóide ou fibra de 30 nm: 2º nível de compactação da cromatina. – Formada pelo enovelamento da fibra de 10 nm em estrutura helicoidal. Cada volta

contém 6 nucleossomos radiais

– Maioria durante a interfase

Níveis de organização mais complexo

• Particpação de proteínas Não-Histonicas: HMG e SMC

• Processo pouco conhecido

• Alças de Cromatina: – Interfase – alças ancoradas na Matriz Nuclear (estrutura filamentosa que preenche o

núcleo)

– Divisão Celular – alças ancoradas no Esqueleto Metafásico

• Fibra de 300nm: – DNA de 15 a 20 vezes mais compactado que na

fibra de 30nm

• Cromossomo Metafásico – estágio mais condensado

DNA dupla hélice DNA dupla hélice

Histona H1

Nucleossomo: DNA + octâmero de histonas

Solenóide

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Cromossomos condensados são mais facilmente analisados em uma célula em divisão, durante a fase de metáfase ou prometáfase;

• Centrômero – constrição primária entre as cromátides irmãs

• Braço p (petit) – mais curto

• Braço q – mais longo

Cromossomos

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CROMATINA DE ORGANELAS

• Plastídeos e mitocôndrias possuem genomas próprios com DNA circulares pequenos em múltiplas cópias em cada organela; •As múltiplas cópias do genoma estão associados a proteínas que a cromatina organizada em nucleoides;

NUCLEOIDES MITOCONDRIAIS

• O DNA mitocondrial (mtDNA) forma nucleoides (dezenas a centenas) na organela a partir de sua associação com proteínas específicas.

• Cada nucleoide contém cerca de 2 a 10 cópias do mtDNA.

• Grupo HMG: importante componente proteíco na cromatina mitocondrial (TFAM) – formação e estabilidade da cromatina – formam homodímeros que se ligam a cada 35 ou 40pb do DNA – compactação.

• Proteína mtSSB: estabilização da estrutura da alça em D (D-loop) do mtDNA (elemento de fita simples, importante na replicação do DNA)

NUCLEOIDES DE PLASTÍDEOS

• Também associa-se a proteínas para formar nucleoides (diversos) (3 a mais de 10 cópias do genoma). • 2 sistemas na organização de nucleoides plastidiais:

1 - ocorre em espécies de protozoários e algas 2 - eucariotos fotossintetizantes.

1 – Apicoplastos: proteína HU que liga-se ao DNA do plastídeo ocasionando seu dobramento e compactação, sendo essencial na formação de nucleoides plastidiais. 2 – Sem proteína HU. Três proteínas em destaque: • enzima sulfito-redutase: entre outras funções, induz a compactação do DNA de forma reversível • protease CND41: liga-se ao DNA e o compacta, reprimindo a trancrição • proteína PEND: se liga à membrana interna do plastídeo e ao DNA, ancorando os nucleoides em desenvolvimento.