Cromatografia de Interação Hidrofóbica e Cromatografia Por Afinidade
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Bioquímica I
Ano letivo 2013/2014
Ana Isabel Gonçalves; Cristiana Dias; Inês Santos Turma de sexta-feira das 8:00 às 11:00
AMOSTRAS PURAS COM PROPRIEDADES
TÉCNICAS DE SEPARAÇÃO E ANÁLISE
COM BASE NESSAS PROPRIEDADES
• CROMATOGRAFIA DE INTERAÇÃO HIDROFÓBICA
•CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE
CROMATOGRAFIA
Fase estacionária = Matriz
Fase Móvel (Solvente/Eluente)
+
Solução que contém as proteínas
Objetivo:
Recolher a fração apenas com o
analito desejado.
CROMATOGRAFIA
CROMATOGRAFIA DE INTERAÇÃO HIDROFÓBICA
Baseada nas propriedades hidrofóbicas dos componentes que se
pretendem separar.
Interação reversível entre as zonas hidrofóbicas da superfície da
proteína e o ligante hidrofóbico da matriz.
VANTAGENS:
-Separações rápidas;
-Baixa degradações do produto;
-Baixa exigência de solventes;
-Níveis de purificação muito bons.
CROMATOGRAFIA DE INTERAÇÃO HIDROFÓBICA
CIH
Sal
Proteínas adsorvidas na presença de altas
concentrações de sal e eluídas com a redução dessas concentrações de sal.
pH
Ajustar o pH da proteína ao do seu ponto isoelétrico.
Temperatura
+ Energia Cinética + interações hidrofóbicas da proteína com superfície do
adsorvente.
CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE
Propriedades físicas
Interações biológicas específicas
Purificação absoluta
Ligação reversível entre:
-Proteína
-Enzima
-Imunoglobulina
-Recetor membranar
-Nucleótido
-Ácido nucleico
-Fragmento celular
-Célula
-Ligando
-Substrato
-Inibidor
competitivo
reversível
-Modificador
alostérico
CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE
Matriz
Características essenciais:
Grupos químicos adequados e suficientes de modo a que o ligando esteja acoplado e fixo;
Estável durante a ligação da macromolécula de interesse e sua subsequente eluição;
Fraca interação com outras macromoléculas;
Boas propriedades de fluxo.
Exemplos: partículas uniformes, esféricas e rijas ( de celulose, vidro poroso, sílica…)
CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE
Natureza química do ligando determinada pela especificidade biológica do composto a ser
purificado;
Braços espaçadores (seis a dez átomos de carbono ) entre a matriz e o ligando, se este for
demasiado pequeno, para evitar a perda de eficácia por parte deste.
Ligandos
CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE
CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE
Eluição específica:
CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE
Eluição específica e não-específica:
CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE
t
sal/pH