CULTURA CELULAR Biologia Celular e Molecular - 1 ano 2004/2005 Orientadora: Prof Doutora Delminda Neves Diana Gonalves; Filipa Fernandes; Hugo Oliveira; Ilidia Carmesim; Liliana Teixeira

ndiceO que ?HistriaClassificaoHeterocarionHibridomaLinhagem de clulasPreparaoVantagensDesvantagensLimitaesExemploRefernciasAgradecimentos

O que ?Conjunto de tcnicas que permitem cultivar ou manter clulas isoladas fora do organismo onde existem, mantendo as caractersticas prprias;

- Podem fazer-se culturas a partir tecidos humanos, animais e vegetais;

A cultura de tecidos implica a prvia desagregao (mecnica ou enzimtica) do tecido original e em que as clulas so cultivadas numa camada aderente, num substrato slido ou em suspenso em meio de cultura.

- Os tecidos humanos podem ser obtidos nas cirurgias, bipsias e autpsias, ou retiradas de fetos ou placentas; - Os tecidos animais podem ser recolhidos nos matadouros ou em animais de laboratrio abatidos humanamente.Mantendo as caracterstica que possuem no tecido e organismo

Factos marcantes no desenvolvimento da cultura de tecidos e cultura de clulas

1885 ROUX clulas embrionrias de pinto podem ser mantidas vivas em soluo salina (fora do corpo do animal.1907HARRISON controvrsia da neurobiologia ,cada fibra nervosa produto de uma nica clula nervosa e no a fuso de muitas.1910 ROUS induz um tumor usando um extracto filtrado de clulas de tumor de galinha, mostrando mais tarde conter um vrus de RNA (vrus de sarcoma de Rous).1913 CARREL clulas podem crescer por perodos longos em cultura, desde que sejam alimentadas regularmente, sob condies asspticas.1948 EARLE isola um nica clula da linhagem das clulas L e mostra que elas formam clones de clulas em cultura de tecidos.1952 GEY linhagem contnua de clulas derivadas de um carcinoma cervical humano, que mais tarde se tornou bastante conhecida como linhagem de clulas HeLa.

Factos marcantes no desenvolvimento da cultura de tecidos e cultura de clulas

1954 LEVI-MONTALCINI factor de crescimento do nervo (NGF) estimula o crescimento dos axnios em cultura de tecidos.1956 PUCK seleccionou mutantes com requerimentos de crescimento, alterados a partir de cultura de clulas HeLa.1958 TEMIN e RUBIN ensaio quantitativo para infeco de clulas de pinto em cultura, purificando o vrus do sarcoma de Rous.1961 HAYFLICK e MOORHEAD fibroblastos humanos morrem aps um nmero finito de divises em cultura.1964 LITTLEFIELD meio HAT para o crescimento selectivo de clulas somticas hbridas. Juntamente com a tcnica de fuso das clulas, tornando acessvel a gentica de clulas somticas.

KATO e TAKEUCHI planta completa de cenoura, em cultura de tecidos, a partir de uma nica clula da raiz da cenoura.

Factos marcantes no desenvolvimento da cultura de tecidos e cultura de clulas

1965 HAM meio definido, sem soro, capaz de suportar o crescimento clonal de certas clulas de mamferos.

HARRIS E WATKINS primeiros heterocarions de clulas de mamferos,pela fuso de clulas humanas e de camundongo, induzida por vrus.1968 AUGUSTI-TOCCO e SATO adaptam um tumor de clula nervosa de camundongo (neuroblastoma) cultura de tecidos e isolam clones que so electricamente excitveis e que estendem os prolongamentos nervosos.1975 KOHLER e MILSTEIN 1 linhagem de clulas de hibridoma secretoras de anticorpos monoclonais.1976 SATO 1 srie de trabalhos mostrando que diferentes linhagens de clulas necessitavam de diferentes misturas de hormonas e de factores de crescimento para crescerem em meio sem soro.

Factos marcantes no desenvolvimento da cultura de tecidos e cultura de clulas

1977 WIGLER e AXEL mtodo eficiente para introduzir genes de cpia nica de mamferos em clulas cultivadas, adaptando um mtodo anterior desenvolvido por Graham e Van der EB.1986 MARTIN e EVANS isolam e cultivam clulas embrionrias totipotenciais do rato estaminais.1998 TOMSON e GEARHART isolam clulas embrionrias humano.

HistriaPrimeiras culturas foram feitas a partir de fragmentos de tecidos colocados em cogulos de plasma.

Grande avano (1940):

| | crescimento de linhagens celulares a partir de clulas isoladas que aderiam superfcie de placas de cultura

Mas

As clulas eram cultivadas em meios indefinidos: combinao de soro e extractos embrionrios.

HistriaEm 1952:

Crescimento de clulas num meio contendo:

- Plasma de galinha - Extracto de embrio bovino - Soro de cordo umbilical

Mas

O meio era complexo e indefinido tornando impossvel analisar as necessidades especficas para o crescimento de clulas animais.

HistriaHARRY EAGLE

Realizou uma anlise sistemtica dos nutrientes necessrios ao crescimento de clulas animais em cultura;

Estudou o crescimento de duas linhagens de clulas:

-- clulas HeLa -- clulas L

O meio em que cultivou estas clulas continha:

-- Mistura de sais -- Carbohidratos -- Aminocidos -- Vitaminas suplementadas com soro de protenasFig.1- Harry Eagle

Clulas L linhagem de clulas de fibroblasto de rato

HistriaVARIANDO ESTES COMPOSTOS

Eagle determinou os necessrios para o crescimento celular:

-- Sais -- Glicose -- 13 a.a. -- Vitaminas -- Juntamente com soro de protenas

Actualmente ainda usado o meio desenvolvido por Eagle como meio bsico para cultura de clulas animais.

O seu uso permitiu aos cientistas cultivar uma ampla variedade de clulas sob condies experimentais definidas.

Classificao Cultura celular

Mtodo cada vez mais utilizado que consiste em cultivar clulas isoladas fora do organismo onde existe.

H dois tipos de cultura celular:

Cultura primria: cultura preparada directamente de tecidos de um organismo, com ou sem passo inicial de fraccionamento das clulas.

Cultura secundria: as clulas cultivadas foram retiradas de uma cultura primria, elas podem ser repetidamente subcultivadas desta forma, por semanas ou meses.

As clulas apresentam as propriedades associadas sua origem com por exemplo clulas nervosas estabelecem sinapse com outras, clulas derivadas do musculo esqueltico contraem espontaneamente na placa de cultura Citar exemplos:clulas derivadas do msculo esqueltico embrionrio fundem-se para formar fibras musculares gigantes, que contraem espontaneamente na placa de cultura; clulas nervosas lanam axnios que so electricamente excitveis e fazem sinapse com outra clula nervosa;clulas epiteliais que formam extensas lminas com muitas das propriedades de um epitlio intacto.Dadas as condies apropriadas a maior parte das clulas animais e vegetais podero viver, multiplicar-se at mesmo expressar propriedades diferenciadas numa placa de cultura de tecidos. As clulas podem ser observadas num microscpio ou analisadas bioquimicamente e os efeitos da adio ou remoo de molculas especficas, tais como hormonas ou factores d crescimento, podem ser exploradosClulas da pele humana, por exemplo, duram por vrios meses em cultura, dividindo-se apenas 50 a 100 vezes antes de morrerem. Tem sido sugerido que este limite de tempo de vida est relacionado com o limite de tempo de vida do animal do qual a clula se derivou.

Heterocarion possvel fundir uma clula com outra para formar uma clula combinada, com dois ncleos separados;

Fig. 2 - Heterocario

HibridomaFig. 3 Hibridoma

Propriedades semelhantes podem ser experimentalmente induzidas em clulas normais, transformando-as com um vrus indutor de tumor ou com uma substncia qumica.

Linhagem de clulas

As clulas podem proliferar indefinidamente e podero ser propagadas como uma linhagem de clulas;

| | | | podem ser preparadas a partir de clulas cancergenas

Linhagem de clulas preparadas a partir de clulas cancergenas diferem de vrias formas das preparadas a partir de clulas normais.Por exemplo, as linhagens de clulas cancergenas frequentemente crescem sem se fixarem a uma superfcie, proliferam em densidades muito mais altas em placas de cultura.

Linhagem de clulas

Tanto as linhagens de clulas transformadas quanto as de clulas no-transformadas so extremamente teis na pesquisa celular, como fonte de grandes quantidades de clulas de um tipo uniforme;

As linhagens de clulas transformadas podem frequentemente causar tumores, se injectadas num animal susceptvel;

Porm

Clulas de um mesmo tecido podem diferir entre si.

Linhagem de clulas

Assim

A uniformidade gentica de uma linhagem de clulas pode ser melhorada pela clonagem celular, em que uma nica clula isolada e prolifera-se para formar posteriormente uma colnia;

Podem ser armazenadas em azoto (N) lquido a - 196C, por um perodo muito longo e continuarem viveis, quando descongeladas.

Uma das utilidades mais importantes de clonagem celular o isolamento de linhagens de clulas mutantes com defeitos em genes especficos. O estudo de clulas defectivas em uma determinada protena revela, frequentemente, um pouco da funo desta protena nas clulas normais.

Exemplos de cultura de clulas Fig. 4 Clulas em cultura

A- fibroblastos em culturaB- mioblastos

PreparaoA- Isolamento

De forma a preservar mais informaes sobre cada tipo individual de clulas, os bilogos desenvolveram meios de dissociar as clulas dos tecidos e separar os vrios tipos;Fig. 5 - Centrifugadora

Imagem da centrifugadora

IsolamentoO primeiro passo consiste em romper a matriz extracelular e as junes intercelulares que mantm as clulas juntas;

As clulas de tecidos fetal ou neonatal so as melhores produes de clulas dissociveis viveis;

| |Atravs de tratamento: -- dissociao mecnica-- enzimas proteolticas - (tripsina e colagenase) -- agentes - (cido etilenodiaminotetractico, EDTA)

que se ligam ou quelam o Ca2+ que necessrio para adeso entre clulas

IsolamentoClulas grandes so separadas das clulas pequenas e clulas densas de clulas no densas por centrifugao fraccionada;

Fig.6 - Centrifugao fraccionada

Mecanismos para separar os diferentes tipos de clulas presentes numa suspenso celular.Diferenas das propriedades fsikas

IsolamentoAnticorpos que se ligam especificamente superfcie de apenas um tipo de clula num tecido podem ser acopladas a vrias matrizes como:

-- colagnio; -- steres de polissacardeos ou plstico ; | | |para formar uma superfcie de afinidade, qual somente as clulas reconhecidas pelo anticorpo, se aderem.

Certas clulas podem aderir frequentemente a vidro ou a plstico, o que permite a separao destas das clulas que se aderem menos a estes materiais;

IsolamentoMarcao especfica das clulas com anticorpos acoplados a um corante fluorescente, em seguida, a separao destas clulas marcadas das no marcadas num separador de clulas activado por fluorescncia;

Fig. 7 Citometria de fluxo

Quando uma populao uniforme de clulas obtida por um destes mtodos, esta pode ser directamente usada por anlise bioqumica; O tecido pode, ento ser dissociado em clulas individuais viveis, atravs de uma agitao branda;

Preparao B- Cultivo em placas de cultura

Geralmente as culturas so feitas a partir de suspenso de clulas dissociadas de tecidos.

Fig.8 - Microdisseco

imagem

Placa de culturaAo contrrio das bactrias, a maior parte das clulas de tecidos no esto adaptadas para viverem em suspenso e necessitam de uma superfcie slida para crescerem e dividirem-se, que agora usualmente a superfcie plstica de uma placa de cultura de tecidos;

Certas culturas celulares incluem:

Factores de crescimento + Transferrina | | | |estimulam a proliferao celular transporta ferro para a clula

Por foto da placaTais clulas apresentam frequentemente muitas propriedades diferenciadas apropriadas sua origem:ex.: fibroblastos que continuam a segregar colagnio;

Composio de um Meio Tpico Adequado para o Cultivo de Clulas de MamferosFig.9 Tabela de componentes de um meio tpico Algumas clulas no crescem nem se diferenciam se a placa no estiver coberta com componentes especficos da matriz extracelular

AminocidosVitaminasSaisOutrosProtenas (necessrias em meios sem soro, quimicamente definidos)ArgininaCistinaGlutaminaHistidinaIsoleucinaLeucinaLisinaMetioninaFenilalaninaTreoninaTriptofanoTirosinaValinaBiotinaColinaFolatoNicotinamidaPantotenatoPiridoxalTiaminaRiboflavinaNaClKClNaH2PO4NaHCO3CaCl2MgCl2GlicosePenicilinaEstreptomicinaVermelho de fenolSoroInsulinaTransferrinaFactores especficos de crescimento

Tabela..dos requerimentos

Vantagens da Cultura Celular

Possibilidade de estudar fenmenos,inacessveis em tecidos intactos;

Controlo das condies ambientais (pH, temperatura, concentrao de O2 e CO2, etc);

Obteno de clulas com boa homogeneidade e bem caracterizadas;

Economia de reagentes, tempo, etc.

Conhecimento de comportamento e funo de uma populao isolada de clulas;

Desvantagens da Cultura Celular

Gasto elevado de material;

Condio de crescimento da cultura;

Instabilidade de cultura celular;

Perda de caractersticas;

Dificuldade de extrapolao para o modelo de organismo intacto.

LimitaesNecessidade de operadores experientes (com conhecimentos da tcnica em condies asspticas, etc);

Perda de caractersticas fenotpicas;

Necessidade do uso de marcadores devido perda de caractersticas fenotpicas;

Instabilidade das clulas (sobretudo em linhas celulares imortais).

Aplicaes gerais da cultura celular

Produo de vacinas anti-virais;

Compreenso de fenmenos de neoplasia;

Estudo da Imunologia;

Ensaios de frmacos e cosmticos in vitro;

Exemplo

As clulas para anlise cromossmica devem ter crescimento e diviso rpida em cultura.

As clulas mais acessveis so os leuccitos, especificamente linfcitos T.

O procedimento seguinte, mostra como preparar, a curto prazo, uma cultura destas clulas adequadas para anlise:

Exemplo

Obtm-se uma amostra de sangue perifrico e acrescenta-se heparina para evitar coagulao;

A amostra de seguida centrifugada a uma velocidade que permita aos leuccitos sedimentarem-se como uma camada distinta;

Os leuccitos so colhidos, colocados em meio de cultura tecidual e estimulados a dividirem-se pelo acrscimo de um agente mitognico (estimulante da mitose), a fito-hemaglutinina.

Exemplo

A cultura incubada cerca de 72 horas, at que as clulas estejam a multiplicar-se rapidamente;

Acrescenta-se, ento, uma soluo diluda de colchicina, para impedir a concluso da diviso celular, inibindo a formao de fusos e retardando a separao dos centrmeros. Em consequncia, as clulas paradas na metfase acumulam-se na cultura;

Em seguida, adiciona-se uma soluo hipotnica para causar tumefaco nas clulas, alisando-as e libertando os cromossomas, mas mantendo os centrmeros intactos;

Os cromossomas so fixados, espalhados em lminas e corados por uma de vrias tcnicas e prontos para anlises.

Laboratrio do Servio de Biologia Celular e Molecular da FMUPFig.10 e 11 Cmara de fluxo laminar

Microscpio invertido Perguntar legendas

Laboratrio do servio de Biologia Celular e Molecular da FMUP Fig.12 e 13 Estufa de CO2

Laboratrio do servio de Biologia Celular e Molecular da FMUP Fig. 13 - CentrfugaFig. 14 Microscpio Invertido

Referncias

Alberts, B; Bray, D; Lewis, J; Raff, M; Roberts, K; Watson, JD (1997). Biologia Molecular da Clula. 3a ed. Porto Alegre/RS: Editora Artes Mdicas.Tom Strachan, Andrew P. Read Human: Molecular Genetics;BIOS Scientific Publishers Limited; 1996; USADebergh, P.C.; Read, P.E. (1991) Micropropagation in: Debergh, P.C. & Zimmerman, R.H. (eds). Micropropagation: Technology and Application. London, Kluwer Acad. Publishers;Geoffrey M Cooper: The Cell, a molecular approach; second edition;Site: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books

AgradecimentosEste trabalho foi possvel com a ajuda de

Prof Doutora Delminda Neves ;

Servio de Biologia Celular e Molecular da FMUP

E obrigado a TODOS!!!

- Os tecidos humanos podem ser obtidos nas cirurgias, bipsias e autpsias, ou retiradas de fetos ou placentas; - Os tecidos animais podem ser recolhidos nos matadouros ou em animais de laboratrio abatidos humanamente.Mantendo as caracterstica que possuem no tecido e organismo

Clulas L linhagem de clulas de fibroblasto de rato

As clulas apresentam as propriedades associadas sua origem com por exemplo clulas nervosas estabelecem sinapse com outras, clulas derivadas do musculo esqueltico contraem espontaneamente na placa de cultura Citar exemplos:clulas derivadas do msculo esqueltico embrionrio fundem-se para formar fibras musculares gigantes, que contraem espontaneamente na placa de cultura; clulas nervosas lanam axnios que so electricamente excitveis e fazem sinapse com outra clula nervosa;clulas epiteliais que formam extensas lminas com muitas das propriedades de um epitlio intacto.Dadas as condies apropriadas a maior parte das clulas animais e vegetais podero viver, multiplicar-se at mesmo expressar propriedades diferenciadas numa placa de cultura de tecidos. As clulas podem ser observadas num microscpio ou analisadas bioquimicamente e os efeitos da adio ou remoo de molculas especficas, tais como hormonas ou factores d crescimento, podem ser exploradosClulas da pele humana, por exemplo, duram por vrios meses em cultura, dividindo-se apenas 50 a 100 vezes antes de morrerem. Tem sido sugerido que este limite de tempo de vida est relacionado com o limite de tempo de vida do animal do qual a clula se derivou.Propriedades semelhantes podem ser experimentalmente induzidas em clulas normais, transformando-as com um vrus indutor de tumor ou com uma substncia qumica. Linhagem de clulas preparadas a partir de clulas cancergenas diferem de vrias formas das preparadas a partir de clulas normais.Por exemplo, as linhagens de clulas cancergenas frequentemente crescem sem se fixarem a uma superfcie, proliferam em densidades muito mais altas em placas de cultura.

Uma das utilidades mais importantes de clonagem celular o isolamento de linhagens de clulas mutantes com defeitos em genes especficos. O estudo de clulas defectivas em uma determinada protena revela, frequentemente, um pouco da funo desta protena nas clulas normais.A- fibroblastos em culturaB- mioblastosImagem da centrifugadoraque se ligam ou quelam o Ca2+ que necessrio para adeso entre clulas

Mecanismos para separar os diferentes tipos de clulas presentes numa suspenso celular.Diferenas das propriedades fsikasCertas clulas podem aderir frequentemente a vidro ou a plstico, o que permite a separao destas das clulas que se aderem menos a estes materiais;Quando uma populao uniforme de clulas obtida por um destes mtodos, esta pode ser directamente usada por anlise bioqumica; O tecido pode, ento ser dissociado em clulas individuais viveis, atravs de uma agitao branda;imagemPor foto da placaTais clulas apresentam frequentemente muitas propriedades diferenciadas apropriadas sua origem:ex.: fibroblastos que continuam a segregar colagnio; Tabela..dos requerimentos

Microscpio invertido Perguntar legendas