DANIEL DE SOUZA CRUZ MORAIS AVALIAÇÃO DAS … · uma refeição reconfortante em dias de muito...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE

CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA

DANIEL DE SOUZA CRUZ MORAIS

AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTIOXIDANTES E

CITOTÓXICAS DE EXTRATOS RICOS EM

POLISSACARÍDEOS EXTRAÍDOS DAS HASTES DE

MANDACARU (CEREUS JAMACARU DE CANDOLLE,

CACTACEAE)

NATAL

2013

DANIEL DE SOUZA CRUZ MORAIS

AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTIOXIDANTES E

CITOTÓXICAS DE EXTRATOS RICOS EM

POLISSACARÍDEOS EXTRAÍDOS DAS HASTES DE

MANDACARU (CEREUS JAMACARU DE CANDOLLE,

CACTACEAE)

Dissertação apresentada ao

Departamento de Bioquímica da

Universidade Federal do Rio Grande

do Norte como requisito parcial para

obtenção do título de Mestre em

Bioquímica.

Orientador: Hugo Alexandre de

Oliveira Rocha.

NATAL

2013

Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de Biociências

Morais, Daniel de Souza Cruz.

Avaliação das atividades antioxidantes e citotóxicas de extratos ricos em

polissacarídeos extraídos das hastes de Mandacaru (Cereus jamacaru de candolle,

cactaceae). / Daniel de Souza Cruz Morais. – Natal, RN, 2013.

65 f.: il.

Orientador: Prof. Dr. Hugo Alexandre de Oliveira Rocha.

Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte.

Centro de Biociências. Departamento de Bioquímica.

1.

1. Cereus jamacaru – Dissertação. 2. Citotóxico – Dissertação. 3. Doença renal –

Dissertação. I. Rocha, Hugo Alexandre de Oliveira. II. Universidade Federal do Rio Grande

do Norte. III. Título.

RN/UF/BSE-CB CDU 582.661.56

Dedico esta obra

À minha família, que sempre me deu todo o apoio necessário para

superar os obstáculos passados durante o período em que fiz o

mestrado. Sem vocês, a passagem por esta etapa teria sido mais difícil.

Dedico esta obra

Ao professor Hugo Alexandre de Oliveira Rocha, pela imensa paciência,

serenidade e cumplicidade nestes anos em que estive sob sua orientação.

Sem seus ensinamentos, esta dissertação nunca teria se concretizado.

AGRADECIMENTOS

Ao meu pai, Álvaro Navarro, por todo o apoio intelectual dado por toda a

minha vida. Seus ensinamentos sempre me inspiraram a alçar voos cada

vez mais altos e a seguir meus sonhos, agora alcançados com esta obra

À minha mãe, Rita de Cácia, por todo o amor e carinho dedicado e que,

mesmo à milhares de quilômetros de distância, me fez seguir em frente

nesta jornada.

Aos meus irmãos, Thiago e Camilla, por sempre acreditarem na minha

capacidade de perseverar e me apoiarem nos momentos mais difíceis

desta caminhada.

À Lenice e Marcos Vinícius, minha segunda família aqui em Natal, por

sempre me auxiliarem no que fosse preciso, seja através de um afago ou

uma refeição reconfortante em dias de muito trabalho.

Aos meus irmãos paternos, Walkíria, Fabíola e Tadeu, torcerem para que

eu obtivesse sucesso na vida.

À toda a minha família, que sorriu e sofreu comigo nesses últimos anos.

A etapa que se finaliza agora só mostra o quanto sou feliz por ter uma

base familiar tão sólida. Meus sinceros agradecimentos à todos!

AGRADECIMENTOS

Ao meu orientador, Hugo Rocha, por sempre acreditar na resolução deste trabalho. Seus ensinamentos passados durante todos os anos de

convívio serão de extrema importância na minha carreira profissional. A amizade, descontração e cumplicidade nestes mesmos anos tornaram

minha estadia no laboratório muito agradável e prazerosa.

À Marcia Pedrini, minha orientadora no início do mestrado, pela orientação e amizade dedicada nestes anos.

Aos meus amigos de Engenharia Química, Graciana Dantas, Sirtys Lessa,

Márcio Dadox e Andréa Almeida pela ótima companhia no laboratório e fora dele. Vocês são muito especiais para mim.

À Aída dos Santos (in memoriam) por compartilhar todas as alegrias e tristezas da pós graduação. Saudades imensas de nossas conversas e

refeições (sem glúten). Sinto muito sua falta!

Aos meus colegas de BIOPOL, Sara, Gabriel, Cinthia, Raniere, Monique, Artur, Leandro, Jaílma, Mariana, Moacir, Fernanda, Rafael, Maxsuell, Ivan, Rony, Fernando, Letícia, Ana Karina, Joanna, Álvaro, Dayanne, Almino,

Pablo, Marília, Íngrid e Duda, pela feliz convivência no laboratório.

À Karoline Melo, pela valiosa ajuda dada na última etapa do mestrado. Sem o seu auxílio este trabalho não seria concretizado.

Aos colegas de turma de mestrado, especialmente Joyce e Paulo, por

todo o apoio dado durantes esses anos. Sucesso para todos!

À Luciana Rabelo e Ruth Medeiros, pela amizade desde o começo da graduação de biologia e apoio tanto dentro quanto fora do DBQ.

Aos meus amigos, Tiara, Tanágara, Emanuell, Pablo, Françoise, Tieme, Patricia (Tita), Mariana (Maricota), Gentil, Paulo Sarkis e João Marcelo

pelo apoio incondicional, pelas cervejas bebidas e por me aguentarem em todos os momentos desta caminhada.

Aos professores, equipe administrativa e ASG´s do DBQ, por manterem o departamento funcionando de forma exemplar, facilitando assim a vida de

todos aqui dentro.

À banca de qualificação composta Paula, Valéria e Luciana Guimarães, pelas valiosas sugestões que contribuíram para o enriquecimento deste

trabalho.

À CAPES e CNPQ, pelo financiamento que permitiu o desenvolvimento deste trabalho

RESUMO

A utilização de plantas medicinais para a cura e tratamento de diversas

afecções é uma prática comum no mundo e também no Brasil. Em várias

regiões do Nordeste brasileiro o cacto Cereus jamacaru, mais conhecido como

mandacaru, é utilizado popularmente no tratamento de várias doenças,

incluindo aquelas relacionadas com problemas cardíacos, respiratórios, úlceras

gástricas, escorbuto, e problemas renais. Contudo, há uma escassez na

literatura científica que comprove cientificamente a aplicação popular do

mandacaru. Assim como outras plantas, Cereus jamacaru sintetiza várias

moléculas potencialmente bioativas, como polissacarídeos. Neste trabalho, três

extratos aquosos ricos em polissacarídeos, MCA80, MPM e MCP60, foram

obtidos dessa planta e analisados quimicamente, bem como, foi avaliado os

seus potencias como agentes antioxidantes e citotóxicos. Os dados mostraram

que todos os extratos são constituídos principalmente de polissacarídeos

(89,42 a 95,76%), porém foram detectados contaminantes proteicos (>2 %) e

fenólicos (3 a 8,87%). Todos os extratos são ricos em galactose, glicose e

manose. Além disso, de MCA80 e MCP60 apresentam ácido glucurônico em

sua composição. Os extratos apresentaram capacidade antioxidante total

variando de 55,21 a 68,13 equivalentes de ácido ascórbico (EAA). Porém não

apresentaram atividade sequestradora de íon superóxido. Por outro lado, eles

apresentaram atividade redutora e quelação cúprica de forma dose-

dependente. Nenhum dos extratos inibiu a redução do MTT na presença das

células tumorais de próstata (PC-3). Por outro lado, as células HEK, HeLa e

786 tiveram seu poder redutor de MTT inibido em diferentes níveis na presença

dos extratos. MCP60 foi o extrato mais efetivo, impedindo a redução do MTT

em cerca de 80% na presença das células 786. Ensaios de fragmentação

nuclear mostraram que esse extrato induz morte celular. Os dados indicaram

que mandacaru sintetiza polissacarídeos bioativos com potencial como agentes

antioxidantes e antitumorais. Em estudos futuros pretende-se purificar esses

polissacarídeos e caracterizar seus mecanismos de ação antioxidante e

antitumoral.

Palavras chave: Cereus jamacaru, citotóxico, doenças renais.

ABSTRACT

The use of medicinal plants to cure and treat various diseases is a common

practice in the world and in Brazil. In several regions of the Brazil´s Northeast,

the cactus Cereus jamacaru, known as mandacaru, is used popularly as a

treatment to many diseases, including those related to heart respiratory

diseases, gastric ulcers, scurvy, and kidney diseases. However, there is a

scarcity in the scientific literature that proves scientifically the popular

application of this cactus. Like other plants, Cereus jamacaru synthesizes

several potentially bioactive molecules, like as polysaccharides. In this work,

three polysaccharides-rich aqueous extracts, MCA80, MPM and MCP60, were

obtained from this plant and analyzed chemically, as well as their cytotoxic and

antioxidant potential. The data showed that all extracts consist mainly of

polysaccharides (89.42 to 95.76%), but also protein (> 2%) and phenolic (3 to

8.87%) contaminants were detected. All extracts are rich in galactose, glucose

and mannose. In addition, glucuronic acid was found in MCA80 and MCP60.

The extracts showed total antioxidant capacity ranged from 55.21 to 68.13 of

ascorbic acid equivalents (AAE). Besides, they exhibited reducer power and

cupric chelation in a dose-dependent manner. None of the extracts inhibited the

MTT reduction in the presence of prostate tumor cells (PC-3). However, MCP60

was the most effective extract by preventing the reduction of MTT by about 80%

in the presence of cells 786. Nuclear fragmentation tests showed that this

extract induces cell death. The data indicated that mandacaru synthesizes

bioactive polysaccharides with potential as antioxidant and antitumor agents.

For future studies, it is intended to purify and characterize these

polysaccharides and its antioxidant and antitumor mechanisms.

Keywords: Cereus jamacaru, citotoxic, kidney diseases.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Distribuição geográfica da família Cactaceae..................................... 16

Figura 1- Morfologia da haste (A) flor (B) e fruto (C) de Cereus

jamacaru.................................................................................................... 19

Figura 3 - Visão da planta Cereus jamacaru DE CANDOLLE............................. 30

Figura 4: Esquema de obtenção dos extratos aquosos de C.

jamacaru............................................................................................................... 35

Figura 5- Capacidade antioxidante total de extratos aquosos de C.

jamacaru............................................................................................................... 45

Figura 6 - Quelação de cobre de extratos de C. jamacaru.................................. 46

Figura 7- Poder redutor dos extratos aquosos de C. jamacaru........................... 47

Figura 8- Inibição da redução do MTT utilizando o extrato aquoso de C.

jamacaru MCA80 frente a diversas linhagens celulares....................................... 49


jamacaru MPM frente a diversas linhagens celulares.......................................... 50


jamacaru MCP60 frente a diversas linhagens celulares....................................... 53

Figura 11- Imagens de microscopia de fluorescência das células 786 coradas

com DAPI.............................................................................................................. 51

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Antioxidantes endógenos e exógenos............................................. 22

Tabela 2- Composição química dos extratos aquosos MCA80, MPM e MCP60 de hastes de C. jamacaru.......................................................................................................... 42

Tabela 3- Relações molares de monossacarídeos do cacto Cereus jamacaru.......................................................................................................... 43

Tabela 4- Atividade sequestradora de ânion superóxido dos extratos aquosos MCA80, MCP60 e MPM DE C. jamacaru.......................................... 48

LISTA DE ABREVIATURAS / SIGLAS

ANOVA Análise de variância

Arab Arabinose

BHA Butil-hidroxianisola

BHT Butil-hidroxitolueno

BIOPOL Laboratório de biotecnologia de polímeros naturais

CAT Capacidade antioxidante total

CLAE Cromatografia liquida de alta eficiência

DAPI 4',6-diamidino-2-phenylindole

DMEM Dubelco´s Modified Eagle Medium

EDTA Etilenodiaminotetracético

ERO Espécies reativas do oxigênio

Fuc Fucose

Gal Galactose

Ac. Glu. Ácido glucurônico

Gli Glicose

Man Manose

MCA80 Extrato de mandacaru na condição aquosa a 80 °C

MCP60 Extrato de mandacaru na condição proteolítica a 60 °C

MPM Extrato de mandacaru precipitado em metanol

MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)

NBT Nitroblue tetrazolium

OMS Organização mundial de saúde

PBS Tampão fosfato salino

Xil Xilose

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO..................................................................................... 16

1.1 CONSIDERAÇÕES BOTÂNICAS..................................................... 16

1.1.1 Família Cactaceae...................................................................... 16

1.1.2 Mandacarú.................................................................................. 17

1.2 CONSIDERAÇÕES ETNOFARMACOLÓGICAS E FITOQUIMICAS................................................................................. 20

1.3 ANTIOXIDANTES.............................................................................. 21

1.3.1 Polissacarídeos Antioxidantes............................................. 23

1.4 ATIVIDADE ANTITUMORAL............................................................. 25

1.4.1 Polissacarídeos antitumorais............................................... 25

2. OBJETIVOS........................................................................................ 28

2.1 GERAL............................................................................................... 28

2.2 ESPECÍFICOS................................................................................... 28

3. MATERIAIS E MÉTODOS 29

3.1 MATERIAIS........................................................................................ 29

3.1.1 Materiais Biológicos 29

3.1.1.1 Cacto C. jamacaru.................................................................... 29

3.1.1.2 Linhagens celulares e manutenção das cultura de célula.............................................................................................. 30

3.1.2 Outros materiais..................................................................... 31

3.1.3 Equipamentos......................................................................... 32

3.2 MÉTODOS........................................................................................ 33

3.2.1 Obtenção de extratos aquosos de C. jamacaru.................. 33

3.2.2 Caracterização Química......................................................... 35

3.2.2.1 Dosagem de açúcares totais........................................ 35

3.2.2.2 Dosagem de proteínas................................................. 35

3.2.2.3 Compostos fenólicos totais........................................... 35

3.2.2.4 Determinação da composição monossacarídica.......... 35

3.2.3 Atividade antioxidante........................................................... 36

3.2.3.1 Capacidade antioxidante total...................................... 36

3.2.3.2 Quelação de cobre....................................................... 36

3.2.3.3 Poder redutor................................................................ 37

3.2.3.4 Sequestro do radical superóxido (O2-•)......................... 39

3.2.4 Atividade citotóxica............................................................... 39

3.2.5 Fragmentação nuclear........................................................... 40

3.2.6 Análise estatística.................................................................. 41

4. RESULTADOS..................................................................................... 42

4.1 DETERMINAÇÃO DOS COMPONENTES QUÍMICOS DOS EXTRATOS AQUOSOS DE C. JAMACARU..................................... 42

4.2 DETERMINAÇÃO DOS CONSTITUINTES MONOSSACARÍDEOS DOS EXTRATOS AQUOSOS DE C. JAMACARU....................................................................................... 43

4.3 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE........................................................... 44

4.3.1 Capacidade Antioxidante Total............................................. 44

4.3.2 Quelação De Cobre................................................................ 45

4.3.3 Poder Redutor........................................................................ 46

4.3.4 Sequestro de íons superóxido.............................................. 47

4.4 EFEITO DOS EXTRATOS FRENTE A REDUÇÃO DO MTT PELAS LINHAGENS CELULARES EM CONDIÇÕES DE CULTURA.......................................................................................... 48

4.4.1 Efeito do extrato aquoso de C. jamacaru MCA80 frente a redução do MTT pelas linhagens celulares em condições de cultura............................................................................................ 49

4.4.2 Efeito do extrato aquoso de C. jamacaru MPM frente a redução do MTT pelas linhagens celulares em condições de cultura. ............................................................................................ 50

4.4.3 Efeito do extrato aquoso de C. jamacaru MCP60 frente a redução do MTT pelas linhagens celulares em condições de cultura. ............................................................................................ 51

4.5 FRAGMENTAÇÃO NUCLEAR........................................................... 52

5. DISCUSSÃO........................................................................................ 54

6. CONCLUSÕES..................................................................................... 59

REFERÊNCIAS.................................................................................... 60

INTRODUÇÃO 16

1. INTRODUÇÃO

1.1 CONSIDERAÇÕES BOTÂNICAS

1.1.1 Família Cactaceae

A família Cactaceae apresenta aproximadamente 125 gêneros e 1.900

espécies (ARECES, 2004). É formada por plantas dicotiledôneas, suculentas de

diversos hábitos, podendo ser trepadeiras, epífitas, árvores, arbustos ou geófitas;

suas hastes podem ser colunares, roliças, globulares, em forma de costeletas, asas,

achatadas, com poucas ou nenhuma folhas e com espinhos (BARTHLOTT e HUNT,

1993). Os representantes da família Cactaceae, mais conhecidos como cactos,

habitam as regiões mais diversas, de planícies costeiras a regiões montanhosas de

alta altitude. Com apenas uma exceção da espécie Rhipsalis bacífera, presente na

África, a família Cactaceae é nativa das Américas, ocorrendo desde a patagônia até

as regiões da Columbia Britânica e Alberta, no oeste canadense (ANDERSON,

2001; COTA SANCHES et al, 2010), como observado na Figura 1.

Figura 1- Distribuição geográfica da família Cactaceae. Fonte:

http://www.thecompositaehut.com/www_tch/images/webcurso_spv/mapas/cactaceae.jpg. Acesso:

09/02/13

INTRODUÇÃO 17

De acordo com Britton e Rose (1919), a família Cactaceae está subdividida

em três grupos subfamiliares: Cactideae, Opuntoideae e Pereskioidadeae (Barthlott

e Hunt, 1993). Em 2001, foi proposta a criação de uma nova subfamília,

Maihuenioideae, a qual foi incluso o gênero Maihiuenia (Weber), antes pertencente à

subfamília Pereskioidadeae (Anderson, 2001).

Das quatro subfamílias de Cactaceae, três (Pereskioideae, Opuntioideae e

Cactoideae) possuem representantes no Brasil (TAYLOR E ZAPPI, 2004),

totalizando 160 espécies, pertencentes a 32 gêneros (BARROSO ET AL. 1978).

Destes, 80 espécies de 18 gêneros estão localizadas na região Nordeste brasileira

(BARBOSA ET. AL, 1996).

Algumas plantas da família Cactaceae possuem interesse econômico e social

em diversos países. Antes mesmo do descobrimento das Américas pelos europeus,

o peiote (Lophophora williamsii) já era utilizado por Ameríndios em rituais religiosos

devido às suas propriedades alucinógenas (BYE, 1979; SCHULTES, 1981).

Diversos cactos fornecem água e são usados como forrageiras para gado e outros

animais, tais como Opuntia spp. (RUSSEL, 1987), Cereus spp., Melocactus spp. e

Pilocereus spp. (FABREGUES, 1966). Além das hastes, os frutos de Cactaceae são

consumidos tanto por humanos quanto por outros animais, podendo ser citados; o

figo-da-índia, de Opuntia fícus (CORTÁZAR, 1992) e o koubo, de Cereus peruvianus

(MIZRAHI, 1999).

1.1.2 Mandacaru

O gênero Cereus sp., pertencente à subfamília Cactoídadeae e ao grupo

Cereoideae, compreende plantas tipo árvore ou arbusto com cladódios (talos)

INTRODUÇÃO 18

eretos. Sua etimologia vem da palavra grega Keros, que significa tocha, remetendo

ao formato de candelabro característico das primeiras espécies descritas. O gênero

foi caracterizado inicialmente por Hermann, em 1698, e depois por Miller, em 1754, e

inclui 900 espécies descritas (SHEINVAR, 1985). Em 1909, Riccobono dividiu o

gênero e criou a denominação Piptanthocereus, atualmente com 24 espécies

(BRITTON e ROSE, 1920).

O cacto Cereus jamacaru, conhecido popularmente por mandacaru,

mandacaru-de-boi, nhamandacaru, manacaru, cardeiro, cardeiro-rajado, facheiro,

tunaé e arumbeva (SCHEINVAR, 1985) é uma planta típica da Caatinga e possui

duas subespécies: Calcirupicola, que ocorre somente no estado de Minas Gerais e

Jamacaru, que está distribuída por todo o Brasil (Anderson, 2001; Meiado, 2010).

Possui os seguintes sinônimos científicos: Cactus jamacaru Kosteletzky, Cereus

laetevirens Salm-Dick, Cereus glaucus Salm-Dyck, Cereus lividus Pfeiffer, Cereus

horribarbis Otto in Salm-Dick, Cereus cauchinii Rebut in Schumann, Piptanthocereus

jamacaru glaucus Riccobono, Piptanthocereus jamacaru Riccobono e

Piptanthocereus jamacaru cyaneus Riccobono (BRITTON; ROSE, 1920).

A espécie pode chegar a 10 metros de altura, possui tronco lenhoso e hastes

eretas de números variáveis, formando um topo compacto. As hastes juvenis são de

coloração azulada e possuem de 4 a 5 costelas de ápices obtusos e sulcos

profundos. Possuem auréolas circulares com distância de 2 a 5 cm entre si. Os

espinhos são radiais, variando de 9 a 30 cm de comprimento, tendo a coloração

avermelhada ou marrom. As flores são de coloração branca, noturnas, solitárias,

localizadas nas porções laterais e/ou subapicais, possuindo de 20 a 30 cm de

comprimento. Os frutos são elipsoides, de coloração laranja ou vermelho-claro,

INTRODUÇÃO 19

polpa branca, comestíveis. A Figura 2 ilustra os caracteres morfológicos acima

listados. (BARBOSA ET AL, 2007; BRITTON e ROSE, 1919; LIMA, 1996;

SCHEINVAR, 1985;)

Figura 2- Morfologia da haste (A) flor (B) e fruto (C) de Cereus jamacaru. Fonte: A:http://community.fortunecity.ws/greenfield/swallowtail/785/cereus_jamacaru.jpg; Acesso em: 11/02/2013. B:http:// farm1staticflickr.com/112/312974980_8ff095baa9_z.jpg. Acesso em: 13/02/2013 e C:http://www.jardimdesuculentas.net76.net/apostila/apostilaimages/cactceas-e-suclentas_img_19b.jpg. Acesso em: 11/02/2013

Na região semiárida do Brasil, em períodos de seca prolongada, os espinhos

são queimados e as hastes são utilizadas como alimentação para bovinos, caprinos

e ovinos. (BRITTON e ROSE, 1919; MEDEIROS, SATHLER e GÓIS, 1994). Outras

partes do mandacaru também são aproveitadas, como os frutos que servem de

alimentos para pássaros e animais silvestres da caatinga (CAVALCANTI &

RESENDE,2007). A sua polpa, de acordo com Pimentel Gomes (2007) é doce e

comestível, e a semelhança de outras cactáceas, pode ser utilizada na alimentação

humana (SALEMA, 1966; ALBUQUERQUE & ANDRADE, 2002; SILVA ET AL.,

2005).

INTRODUÇÃO 20

1.2 CONSIDERAÇÕES ETNOFARMACOLOGICAS E FITOQUíMICAS

Relatos populares e estudos de etnofarmcologia e etnobotânica têm

mostrado inúmeros usos de extratos aquosos de mandacaru. Seu caule e raiz,

utilizados como infusos ou decocos, são apontados como diuréticos e melhoram

males cardíacos e renais. As cascas do caule raspadas e maceradas em água,

também são utilizadas para distúrbios renais e no controle do colesterol

(ALBUQUERQUE E ANDRADE, 2002). A planta também é utilizada no combate ao

escorbuto e nas afecções do aparelho respiratório, tais como bronquites, eliminação

de secreções e tosses (SHEINVAR, 1985). Há ainda relatos da utilização desta

planta no tratamento de problemas com sífilis, diabetes, cálculos vesiculares, dores

na coluna, problemas uretrais, como antiinflamatório e no controle de albuminúria

(ALBUQUERQUE, 2007; GUEDES, 2009).

Vem somar a estes estudos etnofarmacológicos obtidos com animais. Como

por exemplo, estudos feitos em 2011 com ovelhas mostraram que quando estes

animais eram alimentados com fragmentos de caule de mandacaru (64,6 g/kg de

animal) diariamente por seis semanas e, ao final do experimento, os animais

apresentaram uma redução de 65 % do número de ovos de helmintos (Haemonchus

contortus e Trichostrongylus colubriformis) em suas fezes, evidenciando assim uma

atividade antiparasitária do mandacaru (VALTA et al., 2011).

Já estudos in vitro mostraram que extratos etanólicos de hastes de

mandacaru possuem atividade antibacteriana frente diversas espécies, e as mais

afetadas foram Streptococcus epidermidis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas

aeruginosa e Escherichia coli (DAVET et al., 2009). Estudos fitoquímicos mostraram

que em C. jamacaru foram encontrados alcaloides como a tiramina (BRHUN e

INTRODUÇÃO 21

LINDGREN, 1976), kaempferol (BURRET et al., 1982), hordeína, N-metiltiramina e

esteróis como o β-sitosterol, (DAVET et al., 2009). Em extratos etanólicos de hastes

de mandacaru foram identificados também ácido acético, cânfora, cisteína e

geranilacetona (SCHWARZ et al., 2010).

As sementes de mandacaru também são fontes de compostos bioativos.

Óleos de semente de mandacaru são ricos em ácidos graxos insaturados,

principalmente de ácido oléico (30,2%) e o ácido linoléico (43,4%), pode-se também

citar os óleos saturados: palmítico e esteárico (MAYWORM ET AL., 1996).

1.3 ANTIOXIDANTES

O termo antioxidante pode servir para qualquer substância cuja presença,

mesmo em baixas concentrações, retarde ou iniba a oxidação de um substrato,

evitando o dano causado por radicais livres. Em células, o conjunto de antioxidantes

é denominado de sistema de defesa antioxidante, e nele são encontrados

antioxidantes enzimáticos e não-enzimáticos, que juntos atuam para impedir o início

do dano oxidativo e/ou controlar a sua propagação (FERREIRA, MATSUBARA,

1997).

Devido à oxidação de um substrato ser provocada por um radical em uma

reação em cadeia que inclui três etapas (iniciação, propagação e terminação), a

ação dos antioxidantes é avaliada através de vários mecanismos. Por exemplo, os

antioxidantes podem inibir as enzimas pró-oxidantes que geram radicais (como

inibidor de enzima, visando o início da reação em cadeia), a quelação de íons de

metais de transição que catalisam a geração de radicais (como quelantes de metais,

visando o início da reação em cadeia) ou neutralizar os radicais (como

sequestradores de radicais livres, visando à propagação da reação em cadeia). Os

INTRODUÇÃO 22

dois primeiros tipos de antioxidantes impedem a formação de radicais e, assim,

reduzem o perigo dos radicais indiretamente. Esses são chamados de antioxidantes

preventivos. O terceiro tipo de antioxidantes elimina os radicais diretamente e são,

portanto, referidos como antioxidantes bloqueadores da cadeia (iniciação,

propagação e terminação) (ZHANG, 2006). A Tabela 1 sumariza exemplos de

alguns tipos de antioxidantes, que podem ser tanto de origem endógena

(sintetizados internamente) como exógena (ingeridas).

Tabela 1. Antioxidantes endógenos e exógenos.

Tipos de antioxidante

Antioxidantes Bloqueadores de cadeia

Não enzimáticos

Albumina, bilirrubina e ácido úrico

Vitamina C, vitamina E, carotenos, ácido lipóico,

Coenzima Q10, glutationa, flavonóides

Enzimáticos

Superóxido dismutase, catalase, glutationa peroxidase

Antioxidantes preventivos

Metalotionina, transferina,

Ceruplasmina, mioglobina, ferritina,

Selênio, flavonóides

EDTA (ácido etilenodiamino tetra-acético)

DTPA (Ácido Dietilenotriaminopentacético)

Fonte: Adaptada de SOMOGY et al., 2007

INTRODUÇÃO 23

Com o avanço do conhecimento relacionado ao papel dos antioxidantes nos

organismos, descobriu-se que estão relacionados com uma grande variedade de

doenças comuns relacionadas com a idade e condições degenerativas, como

doenças cardiovasculares, condições inflamatórias e doenças neurodegenerativas,

inclusive Alzheimer, além de mutações e câncer (ZHANG, 2006). Na tentativa de

melhorar a eficácia terapêutica de doenças dessa natureza, a busca de

antioxidantes exógenos de fontes naturais cresceu demasiadamente nos últimos

anos, o que é percebido pelo número de publicações relacionadas a antioxidantes e

estresse oxidativo que tem se multiplicado rapidamente (CHEN, 2009). Outro motivo

que também estimula a busca por antioxidantes naturais é o fato de que

antioxidantes sintéticos como o BHA (butil-hidroxianisola) e BHT (butil-

hidroxitolueno) utilizados nos gêneros alimentícios, são suspeitos de ter elevada

citotoxicidade (VALENTÃO, 2002).

Isto fez com que a busca se intensificasse cada vez mais no intuito de se

identificar antioxidantes exógenos naturais não-tóxicos. Os principais alvos são

antioxidantes naturais multipotentes, ou seja, aqueles que agem por mais de um

mecanismo antioxidante. Já há relatos que a utilização destes antioxidantes em

casos de isquemias cardíacas melhoraram o quadro geral dos pacientes (CHUN-

HUI, 2007). Nos últimos anos, crescentes evidências destacam que alguns

polissacarídeos isolados de plantas, macroalgas e fungos tiveram atividades

antioxidantes e apresentaram baixa ou quase nula citotoxicidade (LIU, 1997; COSTA

et al., 2010; COSTA et al., 2011).

1.3.1 Polissacarídeos Antioxidantes

INTRODUÇÃO 24

No mecanismo de antioxidantes, a capacidade de uma molécula de doar

átomos de hidrogênio aos radicais e a propensão de doação de hidrogênio é o fator

crítico que influencia a atividade contra os danos causados pelos radicais livres

(CETKOVIC, 2004). Os polissacarídeos são moléculas altamente hidratadas e os

grupos hidroxila podem servir como doadores e aceptores de hidrogênio. Em

contrapartida, os grupos hidroxila são também sítios ativos para o sequestro de

radicais através da doação de átomos de hidrogênio (ALIMI et al, 2011). Estas

características fazem dos polissacarídeos moléculas antioxidantes multipotentes.

Porém há outras características que fazem com que alguns polissacarídeos sejam

melhores antioxidantes do que outros. Características químico-estruturais, como tipo

de açúcar, peso molecular, arranjo estrutural da cadeia polissacarídica e a presença

de grupamentos químicos ligados ao polímero, como grupamentos sulfato,

carboxílico ou metil estão intimamente relacionadas com a atividade antioxidante de

polissacarídeos (CHEN, 2008).

Diversos relatos na literatura mostram polissacarídeos, obtidos das mais

variadas fontes, como animais, fungos, algas e plantas, com atividade antioxidante

que agem por mecanismos diferentes. XIE et al., em um trabalho publicado em

2001, mostraram que a ação sequestradora de radical hidroxila da quitosana,

polissacarídeo aminado obtido de crustáceos, pode inibir a peroxidação lipídica de

fosfatidilcolina e linolato lisossomal (XIE et al., 2001). DORE et al. em 2007,

mostraram que β-glucanas extraídas do fungo Geastrum saccatum apresentaram

significativo potencial antioxidante por sequestrar radicais superóxido e radicais

hidroxilas em testes “in vitro” (DORE et al, 2007). COSTA et al. em 2010 relataram a

atividade antioxidante de polissacarídeos sulfatados extraídos de várias algas

INTRODUÇÃO 25

marinhas, pela capacidade desses compostos em doar elétrons em testes “in vitro”.

(COSTA, 2010). Já polissacarídeos sulfatados extraídos da planta Aloe barbadensis,

apresentam a capacidade de sequestrar radicais superóxidos, como é relatado por

CHUN-HUI et al. 2007, apresentando assim um potencial antioxidante (CHUN-HUI et

al., 2007). Mais recentemente, Silveira et al (2012) mostram que xilanas extraídas de

sabugo de milho possuem baixa capacidade doadora de elétrons e sequestradora

de radicais, por outro lado, possuem alta atividade quelante de ferro (~100%) em

concentrações de 1mg/mL.

1.4. ATIVIDADE ANTITUMORAL.

Com os avanços da medicina moderna a expectativa de vida da população

mundial aumenta a cada ano. Mas esse aumento no tempo de vida aliado aos

constantes estresses causados pela rotina da vida moderna, como por exemplos a

poluição ambiental e também a alimentação desregulada, além do aumento do

tabagismo elevam a incidência de câncer em todo o mundo. O câncer deverá

superar as doenças cardiovasculares como primeira causa de mortalidade no mundo

em breve, revela estudo do Centro Internacional de Pesquisas contra o Câncer da

OMS (Organização Mundial de Saúde) (WHO, 2013).

Nesse contexto, há uma busca mundial, principalmente nos países

desenvolvidos, por novos compostos, sejam de origem natural ou sintética, com

potencial anticancerígeno. Diversos trabalhos na literatura nacional e internacional

mostram polissacarídeos extraídos de fontes naturais com grande potencial

antitumoral (COSTA, 2011; ATHUKORALA et al., 2006).

1.4.1. Polissacarídeos antitumorais

INTRODUÇÃO 26

Os polissacarídeos podem agir diretamente sobre o metabolismo celular

inibindo ou reduzindo a taxa de proliferação celular, ou ainda induzindo a morte

celular. Além disso, alguns podem, indiretamente, apresentar atividade antitumoral

“in vivo” por serem antiangiogênicas e inibirem a proliferação de células endoteliais e

musculares ou antimetastáticas e/ou antiadesivas (ROCHA, 2001). Contudo, o

conhecimento de todo o mecanismo pelo qual os polissacarídeos exercem efeitos

antineoplásicos ainda é pouco entendido (ATHUKORALA et al., 2006).

Assim como em outras atividades, algumas características estruturais devem

ser observadas para que polissacarídeos possam desempenhar atividade

antitumoral, como a massa molecular, tamanho das ramificações, tipos de ligações

glicosídicas e de monossacarídeos, padrões de substituições de grupos carregados

negativamente, como por exemplo, o grupamento sulfato. A importância dessas

características fica ainda mais evidente quando se encontram trabalhos como o de

POMIN et al. (2010). Estes autores promoveram a hidrólise química de uma

galactana sulfatada e obtiveram cinco oligossacarídeos sulfatados de diferentes

massas moleculares que variavam de 9.3 a 650 kDa. Quando estes foram testados

quanto a sua capacidade antitumoral “in vivo” frente às linhagens de sarcoma S-180

e hepatoma H-22, os oligossacarídeos com massas moleculares de até 15 kDa

foram os que apresentaram as maiores taxas de inibição tumorais, de

aproximadamente 70% (POMIN, 2010). HAROUN-BOUHEDJA et al. (2000)

demonstraram que polissacarídeos sulfatados de Ascophyllum nodosum, mesmo

após dessulfatação parcial, não perderam em muito a sua atividade tumoral frente a

células tumorais de mama (MCF-7).

INTRODUÇÃO 27

Além disso, vários trabalhos relatam que a presença de cargas não é uma

característica essencial para um polissacarídeo apresentar atividade antitumoral,

uma vez que alguns polissacarídeos não apresentaram efeito frente algumas

linhagens de células tumorais, apesar de serem sulfatadas (DESLANDES et al,

2000). Por outro lado, polissacarídeos neutros de diversas fontes apresentam

atividade antitumoral, como observado com polissacarídeos extraídos da planta

Salicornia herbacea que inibiram a proliferação e estimularam a apoptose de células

de câncer de cólon de maneira dose-dependente. Análises por citometria de fluxo

mostraram que esses polissacarídeos aumentaram o número de células apoptóticas

em 90%, em comparação com o controle negativo, sem polissacarídeo (13,51%)

(RYU, 2009).

Como dito anteriormente, o mandacaru é uma planta comum na caatinga

nordestina e é utilizada amplamente pela população local em diversas atividades

humanas, inclusive como alimento de animais e como remédio popular para o

tratamento de várias afecções. Contudo, pouco ainda é conhecido sobre esta planta.

E muito menos se sabe sobre o potencial das substâncias que são produzidas por

esta planta, inclusive polissacarídeos. O grupo em que se insere esta dissertação,

está localizado no nordeste e há mais de 20 anos vem se dedicando ao estudo de

polissacarídeos de várias fontes. Portanto já detém experiência para produzir

conhecimento também sobre os polissacarídeos sintetizados pelo mandacaru, tanto

com relação a sua estrutura química como em relação às suas potencialidades

farmacológicas, neste caso, suas atividades antioxidante e antitumoral.

OBJETIVOS 28

2. OBJETIVOS

2.1 Geral

Obter extratos ricos em polissacarídeos de hastes de Cereus jamacaru e

avalia-los com relação a suas atividades antioxidante e citotóxica.

2.2. Específicos

Obter de extratos ricos em polissacarídeos de hastes de Cereus

jamacaru;

Determinar o teor de açúcares, proteínas e compostos fenólicos dos

extratos obtidos;

Avaliar o potencial antioxidante dos extratos obtidos tendo como base os

seguintes testes: Capacidade antioxidante total (CAT), Sequestro de radical

superóxido, Poder redutor e Quelação de cobre;

Avaliar a citotoxicidade dos extratos frente a diferentes linhagens

celulares: linhagem tumorais: humana de cólon de útero (HeLa), de próstata

(PC-3), e renal (786-0) e linhagem normal renal (HEK-293).

MATERIAIS E MÉTODOS 29

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1 MATERIAIS

3.1.1 Materiais Biológicos

3.1.1.1 Cacto C. jamacaru:

FILO: Magnoliophyta

CLASSE: Magnoliopsida

SUBCLASSE: Caryophyllales

FAMILIA: Cactaceae

GÊNERO: Cereus

ESPÉCIE: Cereus jamacaru DE CANDOLLE

Para este estudo, foi escolhido o cacto denominado Cereus jamacaru

(Figura 03). A planta foi coletada no município de Nísia Floresta, distrito de

Pium- RN- Brasil (5°58.27´S/35°9.615´W). As hastes de mandacaru foram

cortadas com auxílio de um facão, colocadas em sacos de polietileno e

levadas, no mesmo dia da coleta ao Laboratório de Biotecnologia de Polímeros

Naturais – BIOPOL, localizado no Departamento de Bioquímica/CB-UFRN. No

laboratório, as hastes foram lavadas em água corrente para retirada de detritos

e restos de folhas de outras plantas. Um exemplar de C. jamacaru foi


identificado pelo professor Jomar Gomes Jardim e depositado no Herbário da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte sob número de identificação

UFRN 14075.

Figura 3 - Visão da planta Cereus jamacaru DE CANDOLLE. Fonte: Autor

3.1.1.2 Linhagens celulares e manutenção das culturas de células

As linhagens tumorais humanas de cólon de útero (HeLa), de câncer de

próstata (PC-3) e a linhagem normal renal (HEK-293) foram mantidas em meio

DMEM. Já a linhagem tumoral humana renal (786-0) foi mantida em meio

RPMI-1640. Todas as linhagens celulares foram cultivadas a 37 °C em

incubadora umidificada em atmosfera de 5% de CO2; Todos os meios foram

suplementados com 10% de soro fetal bovino e os antibióticos


penicilina/streptomicina (1000 U E 1O mg para cada meio litro de meio de

cultura, respectivamente). As células HeLa (ATCC CCL-2) foram doadas pela

Profa. Dra. Silvia Regina (Depto. Biologia Celular e Genética – UFRN); 786-0

(ATCC CRL-1932) foram doadas pelo Prof. Dr. Edvaldo da Silva Trindade

(Depto. Biologia Celular, UFPR), PC-3 (ATCC CRL-1435 ) foram doadas pela

Profa. Dra. Helena B. Nader (Depto de Bioquímica, UNIFESP) e HEK-293

(ATCC CRL-1573) foram doadas pela Profa Aurigena Antunes de Araújo (Depto

Farmacologia – UFRN).

3.1.2 Outros materiais

Acetato de sódio trihidratado (3 H2O) e ácido acético da VETEC

(São Paulo, SP, Brasil).

Ácido ascórbico, albumina, glicose, nitroblue tetrazolium (NBT),

ferrozina, violeta de pirocatecol, sulfato de cobre II pentahidratado

e riboflavina da Sigma-Aldrich Brasil (São Paulo, SP, Brasil);

Ácido Gálico da CAQ Casa de Química Ind. E Com. (Diadema,

SP, Brasil);

Ácido sulfúrico, álcool etílico, álcool metílico, coomasie brilliant

blue R 250, fosfato de sódio dibásico, fosfato de sódio

monobásico, hidróxido de sódio, peróxido de hidrogênio e sulfato

de ferro heptahidratado da CRQ (Diadema, SP, Brasil);

DAPI (4´,6´-diamidino-2-phenylindole) foram adquiridos da

Invitrogen (Carlsbad, CA, USA);

DMEM (Dubelco´s Modified Eagle Medium e RPMI 1640 foram

adquiridos da da Cultilab (Campinas, SP, Brasil);


Fenol e molibdato de amônio da Reagen Quimibrás Industrias

Químicas (Rio de Janeiro, RJ, Brasil);

Membrana de PVDF da Millipore Corp. (Bedford, MA, USA);

Reagente de Bradford da Bio-Rad (NY, EUA);

Reagente Folin-Ciocalteau e Cloreto de Ferro da Merck (São

Paulo, SP).

3.1.3 Equipamentos

Além dos equipamentos laboratoriais usuais, foram utilizados:

- Incubadora de CO2 LaboVen - Modelo L212

Agitador orbital modelo 255-B da FANEM Ltda (São Paulo, SP,

Brasil);

Balança analítica e de precisão da TECNAL (Piracicaba, SP,

Brasil);

Bancada de Fluxo Laminar Pachane Pa300 (Piracicaba, SP,

Brasil;

Banhos e estufas de temperatura controlável da FANEM Ltda

(São Paulo, SP, Brasil);

Centrífuga refrigerada CR21 da Hitachi Koki Co. Ltda. (Tóquio,

Japão);

Espectrofotômetro Femto 700 plus da Femton Ind. Com.

Instrumentos Ltda (São Paulo, Sp, Brasil);

Espectrofotômetro Hitachi U-2000 (Tóquio, Japão);

Medidor de pH PHTEK, modelo Meter PHS 3B (Tóquio, Japão);


Microscópio de fluorescência OLYMPUS BX41

Microscópio NIKON CFI60, Spectrum – Spectrum Bioengenharia

médica hospitalar LTDA.

Purificador de água Milli-Q® Water System Millipore Corp.

(Bedford, MA, USA);

3.2 MÉTODOS

3.2.1 Obtenção de extratos aquosos de C. jamacaru

Com auxílio de uma faca, os espinhos foram retirados e as hastes foram

cortadas em partes de aproximadamente 1 cm³. Após o corte, o mandacaru foi

triturado em liquidificador com 0,25M de NaCl, posto para macerar por 24 h e

filtrado posteriormente. Após a maceração duas porções foram obtidas: a parte

líquida, que foi precipitado em 2 volumes de metanol PA por 18 horas e depois

centrifugado (4 C, 9000g, 20 min) e seco em dessecador, resultando em um

extrato denominado mandacaru precipitado em metanol (MPM); e a parte

sólida, que foi seca em estufa aerada a 40 °C por 15 horas. Este material seco

foi dividido em duas porções iguais, ressuspendidas em NaCl 0,25M e cada

porção foi submetida a um tratamento diferente: 1) Extração proteolítica

(Enzima proteolítica denominada prozima, 15,5 mg/mL, pH 8,0) a 60 °C e; 2)

Extração a 80 °C. Todos os dois tratamentos foram mantidos em banhos-

marias com suas respectivas temperaturas mantidas por 18 horas. Depois as


porções liquidas foram filtradas, precipitadas em 2 V de metanol PA,

centrifugadas (4 C, 9000g, 20 min) e secas em dessecador. O pó seco foi

chamado de mandacaru na condição proteolítica a 60 °C (MCP60) e

mandacaru na condição aquosa a 80 °C (MCA80), respectivamente. Na Figura

04 observa-se de forma esquemática as etapas de obtenção dos materiais.


Figura 4: Esquema de obtenção dos extratos aquosos de C. jamacaru

3.2.2 Caracterização Química


3.2.2.1 Dosagem de açúcares totais

Para verificação da quantidade de açúcares nos extratos aquosos, foi

realizada o método fenol/ácido sulfúrico, utilizando a glicose como padrão e

leitura à 490 nm, como descrito por DUBOIS et al (1956).

3.2.2.2 Dosagem de proteínas

A quantificação de proteína de cada extrato foi determinada com o

método de Bradford, utilizando o reagente Comassie Blue fornecido pela

empresa Bio-Rad. As instruções para quantificação foram seguidas de acordo

com o manual de instruções fornecido pelo fabricante. Como padrão de leitura,

foi utilizada a albumina. A leitura foi realizada a 595nm.

3.2.2.3 Compostos fenólicos totais

Os compostos foram quantitativamente avaliados pelo método colorimétrico

de Folin-Ciocalteau e as leituras realizadas a 765nm. O ácido gálico foi

utilizado como padrão de leitura (COSTA, et al., 2010) resultado foi expresso

em equivalentes de ácido gálico, que é definido como a razão mg de ácido

gálico/g de amostra.

3.2.2.4 Determinação da composição monossacarídica


Os extratos de C. jamacaru foram hidrolisados com de HCl 2M por 2

horas a temperatura de 100 °C. Após hidrólise, foram secos (três vezes) à

pressão reduzida, na presença de pastilhas de NaOH. Os monossacarídeos

dos extratos foram determinados através de cromatografia líquida de alta

performance (CLAE) utilizando-se a coluna LiChroCART® 250-4

LiChrosphere® 100 NH2 (10μm), tendo como fase móvel acetronitrila:água

(80:20) em um fluxo de 1mL/min a 40 °C. Utilizaram-se os seguintes padrões:

galactose, glicose xilose, arabinose, fucose e ácido glucurônico.

3.2.3 Atividade antioxidante in vitro

3.2.3.1 Capacidade antioxidante total

O ensaio é baseado na redução do Mo+6 a MO+5 pela amostra teste, com

formação final de um complexo esverdeado fosfato/molibdênio +5 em pH ácido.

As amostras (1 mg/mL) foram adicionadas em uma solução reagente (28 mM

de fosfato de sódio, 0,6M de ácido sulfúrico, 4 mM de molibdato de amônia). A

solução foi mantida a 100 °C por 90 minutos e depois resfriada. A leitura foi

feita a 695 nM (PRIETO; PINEDA; AGUILAR. 1999). Como padrão de leitura, o

foi utilizado o ácido ascórbico. O resultado foi expresso em equivalentes de

ácido ascórbico (mg de ácido ascórbico/g de amostra).

3.2.3.2 Quelação de cobre


A habilidade de quelar o íon cobre dos extratos foi determinada pelo

método descrito por Anton (1960). O violeta de pirocatecol, reagente utilizado

neste ensaio, tem a capacidade de associar com alguns cátions como alumínio,

cobre, bismuto e tório. Na presença de agentes quelantes esta associação não

é formada, resultando na diminuição da coloração. Tal diminuição permite,

assim, estimar a atividade quelante do íon cobre dos extratos de Cereus

jamacaru. O teste é realizado em microplaca de 96 poços que conterá uma

mistura de reação contendo diferentes concentrações das amostras (0,1 – 2,00

mg/mL), violeta de Pirocatecol (4 mM) e sulfato de cobre II pentahidratado (5

H2O) (50 µg/mL). Todos os poços foram homogeneizados com um auxílio de

uma micropipeta e a absorbância da solução foi medida a 632 nm. A

habilidade, das amostras, em quelar o íon cobre foi calculada usando a

equação abaixo:

Absorbância do branco – Absorbância da amostra x 100

Absorbância do branco

3.2.3.3 Poder redutor

O poder redutor foi quantificado de acordo com metodologia descrita por

ATHUKORALA; KIM; JEON (2006) e WANG ET AL. (2008). 4 mL das amostras

teste em diferentes concentrações (0,10-1,00 mg/mL) foram misturadas em

tampão fosfato (0,2M, pH 6,6) e ferricianeto de potássio (1%) e incubados por

20 min a 50 °C. A reação foi interrompida pela adição de TCA (ácido


tricloroacético) a 10%. Posteriormente, foi misturada água destilada e cloreto

de ferro (0,1%). As amostras foram lidas a 700 nm.

3.2.3.4 Sequestro do radical superóxido (O2-•)

Este método baseia-se na capacidade da amostra teste (frações

polissacarídicas) em inibir a redução fotoquímica do nitroblue tetrazolium (NBT)

em um sistema riboflavina-luz-NBT (CÂMARA et al, 2011). 3 mL da solução

reagente contendo: tampão fosfato (50 mM, pH 7,8), metionina (13 mM),

riboflavina (2 μM), EDTA (100 μM), NBT (75 μM) e 1 mL de solução contendo

as frações polissacarídicas em diferentes concentrações (10-2000 µg/mL),

foram incubadas sob iluminação com lâmpada fluorescente por 10 min. A

produção do azul de formazan foi monitorada pelo aumento da absorbância a

560 nm.

3.2.4. Atividade citotóxica

Para analisar o efeito dos extratos sobre a capacidade redutora do 3-

(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium brometo (MTT) pelo metabolismo

celular, as células foram tratadas com diferentes concentrações dos extratos e

avaliadas pelo método proposto por Mosmann (1983). Este método é baseado

na redução do MTT a cristais de formazan pelas células vivas.

Aproximadamente 5 x 103 células foram colocadas em placa estéril de 96

poços para um volume final de 100 μL de meio DMEM 10% de soro fetal


bovino. Posteriormente, as células foram incubadas com diferentes

concentrações do polissacarídeo (0,5; 1,0; 2,0 mg/mL). Após 24 horas, MTT (5

mg/mL) foi adicionado ás células, e incubados por mais 4 horas. Após este

período, o meio foi aspirado, e adicionou-se 100 μL de HCl 0,04 N em álcool

isopropílico para dissolver os cristais de formazan formados e precipitados. A

quantificação da absorbância foi feita em leitor de placa de 96 poços em

comprimento de onda de 562 nm. O ensaio foi realizado em quintuplicata. O

cálculo de inibição da proliferação celular foi realizado em comparação com o

controle contendo células não tratadas com o extrato.

3.2.5 Fragmentação nuclear

As células (3,5x104 em aproximadamente 40 µL) foram plaqueadas

sobre lamínulas circulares de 12 mm colocadas em placas de 24 poços. Após

45 minutos a 37 C, adicionou-se meio com soro fetal bovino (SFB) (10%) para

completar um volume final de 1 mL. Após 24h, o meio foi removido e as células

foram carenciadas por 24h com meio sem soro. Posteriormente, o meio foi

aspirado e as células foram estimuladas a sair de G0 pelo acréscimo de meio

com SFB 10% na ausência (controle) e na presença de MCP60 (0,5 mg/mL).

As células foram expostas a MCP60 por 24h e então foram lavadas com PBS

gelado e em seguida fixadas com paraformaldeído 4% a temperatura ambiente

por 30 minutos. Após lavagem duas vezes com PBS, as células foram

mantidas em solução de PBS contendo 0,1% de Triton X-100 a temperatura

ambiente por 30 minutos. Posteriormente, as células foram subsequentemente


incubadas com DAPI (1 µg/mL) a temperatura ambiente por 30 minutos,

lavadas em seguida com PBS e examinadas por microscopia de fluorescência.

3.2.6. Análise estatística

Todos os dados dos experimentos realizados foram expressos como

média ± desvio padrão (n=3). Para testar diferenças entre os extratos aquosos,

foi utilizado o teste de análise paramétrica de análise de variância (ANOVA). O

teste de Student–Newman–Keuls (Nível de significância de p<0,05) foi aplicado

para se comprovar algumas similaridades encontradas pela ANOVA. Utilizou-

se o software GraphPad Instat 5.0 (GraphPad Software, San Diego, California,

USA)

RESULTADOS 42

4. RESULTADOS:

4.1 DETERMINAÇÃO DOS COMPONENTES QUÍMICOS DOS EXTRATOS

AQUOSOS DE C. JAMACARU.

Os extratos aquosos das hastes de C. jamacaru foram submetidos à

análise química para a determinação do conteúdo de proteínas, açúcares totais

e compostos fenólicos totais. As quantidades obtidas foram somadas e

consideradas como 100%, como mostrado na Tabela 2. Os extratos aquosos

MCA80, MPM e MCP60 apresentaram baixos teores de proteína (< 2%). Em

relação ao conteúdo percentual de açúcares totais, o extrato MCA80 e MPM

não apresentaram diferença entre o teor de açúcar, já MCP60 teve quantidades

significativamente menores de açúcar do que as demais extratos (p<0,05). Por

outro lado, aqueles extratos que apresentaram maiores quantidades açúcar

possuem menores quantidades de compostos fenólicos. Assim, MCP60

apresentou significativamente as maiores quantidades de compostos fenólicos

(p<0,05), seguido por MPM e MCA80.

Tabela 2- Composição química dos extratos aquosos MCA80, MPM e MCP60 de hastes de C. jamacaru.

Extratos Aquosos

Proteínas (%)

Açúcares totais (%)

Fenólicos totais (EAG)*

MCA80 0,054 ± 0,004ª 95,76 ± 2,81ª 3.63 ± 0,030ª

MPM 1,71 ± 0,015b 93,29 ± 0,17a 4,98 ± 0,043b

MCP60 1,78 ± 0,016b 89,41 ± 2,66b 8,87 ± 0,092c

O conteúdo de fenólicos totais é expresso em Equivalentes de Ácido Gálico (EAG). Os valores são expressos como média ± desvio padrão (n=3). a,b,c Letras distintas indicam diferença significativa (p<0,05) entre os extratos.

RESULTADOS 43

4.2 DETERMINAÇÃO DOS CONSTITUINTES MONOSSACARÍDICOS DOS

EXTRATOS AQUOSOS DE C. JAMACARU

Após hidrólise dos extratos aquosos estes foram submetidos a

determinação dos seus constituintes monossacarídicos. Após esta etapa, foi

feita uma razão molar desses monossacarídeos, utilizando a galactose como

açúcar de referência, pois se encontrava em maior quantidade, e preparou-se a

Tabela 3. Como pode ser observado nesta Tabela todas os extratos

apresentam galactose, manose e glicose. Porém a proporção de glicose nos

extratos é diferente. MCP60 apresenta 1,5 mais glicose do que MCA80, que

por sua vez possui o dobro de glicose do que MPM. Outra diferença entre os

extratos é a presença de ácido glucurônico. Este monossacarídeo foi

encontrado em MCA80 e em MCP60 em quantidade quantificável, enquanto

que em MPM foram detectados traços deste elemento.

Tabela 3- Relações molares de monossacarídeos do cacto Cereus jamacaru

Extratos Aquosos

Relações Molares1

Gal Gli Xil Man Fuc Ac. Glu

Ara

MCA80 1,0 1,0 n.d. 1,0 n.d. 0,5 n.d.

MPM 1,0 0,5 n.d. 1,0 n.d. - n.d.

MCP60 1,0 2,5 n.d. 1,0 n.d. 0,5 n.d.

1 relação molar do açúcar, tendo a galactose como referência; n.d. não detectado; “-“ traços.

RESULTADOS 44

Gal- Galactose, Gli - Glicose, Xil - Xilose, Man- Manose, Fuc– Fucose, Ac. Glu.- Ácido

glucurônico e Ara- Arabinose

4.3 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

Existem diversos métodos para a determinação das atividades

antioxidantes. Por isso, a atividade antioxidante in vitro dos extratos aquosos

de C. jamacaru foi avaliada por diferentes ensaios: capacidade antioxidante

total (CAT), poder redutor, quelação cúprica e sequestro do radical superóxido.

4.3.1 Capacidade Antioxidante Total

O teste de capacidade antioxidante total (CAT) tem como finalidade a

avaliação da habilidade de uma amostra de doar elétrons, neutralizando assim

compostos com radicais livres, tais como as EROs. Os resultados são

apresentados na forma de equivalentes de ácido ascórbico (EAA), ou seja, mg

de ácido ascórbico/ g de extrato.

Neste teste, como mostrado na Figura 5, todos os extratos tiveram

atividade detectável; O extrato MCP60 apresentou a capacidade antioxidante

total significantemente maior (p< 0,05) que os demais extratos, apresentando

68,13 EAA, enquanto que os extratos MCA80 e MPM não apresentaram

diferença significativa nas suas atividades, com valores de 55,21 e 54,82 de

EAA, respectivamente.

RESULTADOS 45

Figura 5- Capacidade antioxidante total de extratos aquosos de C. jamacaru. Resultados expressos em equivalentes de ácido ascórbico. Os valores são expressos como média ± desvio padrão (n=3). a,b Letras distintas indicam diferença significativa (p<0,05) entre os extratos.

4.3.2 Quelação de Cobre

O efeito quelante, sobre íons de cobre, exibido por diferentes

concentrações de extratos obtido de C. jamacaru está exposto na Figura 7.

Todos os extratos testados exibiram atividade semelhante em relação à

quelação de cobre. A quelação cúprica teve um aumento percentual

significante até a concentração de 0,5 mg/mL, e na concentração máxima (2,0

mg/mL), observou-se um leve decréscimo de atividade. A exceção foi

encontrada no extrato MCP60, que teve um aumento de atividade até a

concentração de 0,25 mg/mL e decréscimo a partir da concentração 1,0

mg/mL.

RESULTADOS 46

Figura 6- Quelação de cobre de extratos de C. jamacaru. a,b,c,d,e,f Diferentes letras indicam

diferenças significativas entre as diferentes concentrações do mesmo extrato. x,y,z Diferentes

letras indicam diferenças significativas entre a mesma concentração em diferentes extratos.

4.3.3 Poder Redutor

O ensaio do poder redutor também tem como objetivo avaliar a

capacidade de uma amostra de doar elétrons. Entretanto, as condições de

reação química são diferentes do CAT, o que afeta a capacidade da amostra

de atuar como um agente redutor. O resultado deste ensaio é expresso em

atividade redutora equivalente ao ácido ascórbico na concentração de 0,1

mg/mL.

Todos os extratos apresentaram poder redutor. Contudo, eles

apresentaram esta atividade num perfil diferente como visto na Figura 6.

MCP60 apresentou um efeito dose dependente que ficou bem mais evidente a

RESULTADOS 47

partir de 0,5 mg/mL. Vale também salientar que este extrato, assim como no

CAT, apresentou maior atividade antioxidante. Contudo, MPM, diferente do que

foi visto no CAT, também apresentou a mesma potência de atividade redutora

que MCP60 na maior concentração avaliada (1,0 mg/mL). O extrato MCA80

possuiu o menor poder redutor chegando a sua atividade a não ultrapassar o

valor de com valor de 22,38 EAA.

Figura 7- Poder redutor dos extratos aquosos de C. jamacaru. Poder redutor expresso em poder redutor equivalente à 0,1 mg/mL de ácido ascórbico. Os valores são expressos como média ± desvio padrão (n=3). a,b,c Letras distintas indicam diferença significativa (p<0,05) entre as diferentes concentrações do mesmo extrato. x,y,z indicam diferença significativa entre a mesma concentração dos diferentes extratos de C. jamacaru.

4.3.4 Sequestro de íons superóxido

Os resultados de atividade sequestradora de ânions superóxido estão

expostos na Tabela 4. Apenas o extrato MCP60 na concentração de 0,5 mg/mL

apresentou atividade sequestradora.

Entretanto, tal atividade é considerada baixa se levarmos em

consideração o padrão de ácido gálico em todas as concentrações testadas.

RESULTADOS 48

Tabela 4- Atividade sequestradora de ânion superóxido dos extratos aquosos MCA80, MCP60 e MPM DE C. jamacaru.

Extratos Aquosos

Concentração (mg/mL)

Sequestro

(%)

MCA80

0,05 nd 0,1 nd

0,25 nd 0,5 nd

MPM

0,05 nd 0,1 nd

0,25 nd 0,5 nd

MCP60

0,05 nd 0,1 nd

0,25 Nd 0,5 9,35 ± 0,13ª

Ácido Gálico

0,05 57,73 ± 0,59a

0,1 66,34± 1,83b

0,2 78,50 ± 0,06c

0,4 86,35 ± 2,06d

0,6 90,17± 0,16e

Valores expressos como a média ± desvio padrão (n=3). a,b,c,d,e Letras indicam diferença

significativa (p<0,05) entre as concentrações do mesmo extrato/padrão.

4.4 EFEITO DOS EXTRATOS FRENTE A REDUÇÃO DO MTT PELAS

LINHAGENS CELULARES EM CONDIÇÕES DE CULTURA.

Com o objetivo de avaliar o efeito dos extratos sob o metabolismo de

células normais e tumorais do trato urogenital humano, as células foram

cultivadas na presença dos extratos de C. jamacaru através do ensaio clássico

de redução do MTT.

RESULTADOS 49

4.4.1 Efeito do extrato aquoso de C. jamacaru MCA80 frente a redução do

MTT pelas linhagens celulares em condições de cultura.

O extrato MCA80 não foi capaz de atuar sobre a redução do MTT

quando as células PC-3 foram utilizadas no teste (Figura 8). Por outro lado,

este extrato inibiu a redução do MTT na presença das outras três linhagens

celulares avaliadas (HEK-293, HeLa e 786), Porém o seu perfil de atuação foi

diferente com cada célula. Quando HEK e HeLa foram utilizadas nos teste,

MCA80 só conseguiu atuar de forma significante na concentração mais elevada

(2 mg/mL). Além disso, a inibição da redução do MTT foi bem mais afetada

quando HEK (~30%) foi utilizada do que quando HeLa (~20%) usada com

redutora de MTT. Com a relação a inibição da redução do MTT na presença

das células 786, observa-se que esta já ocorre numa concentração de 1 mg/mL

e aumenta para próximo de 40% com 2 mg/mL do extrato.

Figura 8- Inibição da redução do MTT utilizando o extrato aquoso de C. jamacaru MCA80

frente a diversas linhagens celulares. Os valores são expressos como a média ± desvio

padrão (n=3). a,b,c Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0,05) entre diferentes

concentrações da mesma linhagem celular; x,y,z Letras distintas indicam diferença significativa

(p < 0,05) entre as linhagens celulares de mesma concentração.

.

RESULTADOS 50

4.4.2 Efeito do extrato aquoso de C. jamacaru MPM na redução do MTT

pelas linhagens celulares em condições de cultura.

MPM foi extrato que menos afetou a redução do MTT pelas células.

Além disso, ele não consegui influenciar, mesmo na maior dose, a redução do

MTT quando na linhagem celular PC-3. Foram utilizadas (Figura 9). Já quando

as linhagens tumorais HEK-293, HeLa e 786, o MPM conseguiu diminuir a

redução do MTT em até cerca de 30 % (Figura 9). Porém, quando as duas

linhagens foram avaliadas como redutoras de MTT na presença de MPM numa

concentração menor (1 mg/mL), ele foi bem mais efetivo como inibidor na

presenças das células 786.

Figura 9- Inibição da redução do MTT utilizando o extrato aquoso de C. jamacaru MPM

frente a diversas linhagens celulares. Os valores são expressos como a média ± desvio

padrão (n=3). a,b,c Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0,05) entre diferentes

concentrações da mesma linhagem celular; x,y,z Letras distintas indicam diferença significativa

(p < 0,05) entre as linhagens celulares de mesma concentração.

RESULTADOS 51

4.4.3 Efeito do extrato aquoso de C. jamacaru MCP60 na redução do MTT

pelas linhagens celulares em condições de cultura.

O extrato MCP60 foi o que mais influenciou na redução do MTT na

presença das células (Figura 10). Porém, ele foi incapaz de influenciar a

redução do MTT quando as células PC-3 foram utilizadas no teste. Quando as

células HEK foram avaliadas, MPM só afetou a redução do MTT na maior

concentração utilizada (2 mg/mL). Porém, quando HeLa e 786 foram testadas,

MPM já promoveu a redução do MTT na menor concentração testada, este

efeito foi dose dependente, e foi mais efetivo com as células 786, cuja inibição

foi de cerca de 80% na concentração de 2 mg/mL Vale a pena ressaltar que o

extrato, na concentração de 1,0 mg/mL, foi capaz de afetar a redução do MTT

em células tumorais 786, sem afetar as células normais HEK-293

Figura 10- Inibição da redução do MTT utilizando o extrato aquoso de C. jamacaru

MCP60 frente a diversas linhagens celulares. Os valores são expressos como a média ±

desvio padrão (n=3). a,b,c Letras distintas indicam diferença significativa (p < 0,05) entre

RESULTADOS 52

diferentes concentrações da mesma linhagem celular; x,y,z Letras distintas indicam diferença

significativa (p < 0,05) entre as linhagens celulares de mesma concentração.

4.5 FRAGMENTAÇÃO NUCLEAR

Dentre as células avaliadas, as células tumorais 786 foram as células

mais afetadas no ensaio de redução do MTT na presença do extrato MCP60.

Isto pode ser um indicio que esse extrato possa induzir morte celular a essas

células. Um dos critérios clássicos para se identificar morte celular é a

fragmentação nuclear. Portanto, essas células foram incubadas na presença do

extrato MCP60 para se avaliar se havia a presença de fragmentos nucleares.

As células foram incubadas em lamínulas na ausência e na presença de

MCP60 (2,0 mg/mL) por 24 h, fixadas em paraformaldeído, coradas com DAPI,

um marcador nuclear, e visualizadas em um microscópio de fluorescência. De

acordo com a Figura 11A, pode observar-se que as células 786 controle

apresentam núcleo intacto, arredondado e sem fragmentação nuclear

significante. Já as células 786 submetidas à tratamento com MCP60 (2,0

mg/mL) por 24 horas (Figura 11B) apresentaram fragmentação celular

significante (indicadas pelas setas brancas da Figura 10B), indicando que o

extrato induz a morte das células 786.

RESULTADOS 53

Figura 11- Imagens de microscopia de fluorescência das células 786 coradas com DAPI.

Fotografias obtidas em microscópio de fluorescência. As setas brancas evidenciam

fragmentação nuclear e condensação de cromatina. A- Células 786 sem tratamento e coradas

com DAPI após 24 h. B- Células 786 incubadas com MCP60 e coradas com DAPI após 24 h.

Em ambas as fotografias, a ampliação foi de 40x.

DISCUSSÃO 54

5. DISCUSSÃO

Os dados obtidos das análises químicas, dos testes antioxidante e com

as células confirmam que foi possível obter diferentes populações de

polissacarídeos de mandacaru com cada metodologia utilizada. Acredita-se

que um dos principais motivos deste fato ter ocorrido é que polissacarídeos,

diferente de proteínas e ácidos nucléicos, não são sintetizados a partir de um

molde. Sua síntese é influenciada por vários fatores como concentração de

enzimas e de substratos, o que faz com que o organismo em questão produza

diferentes polissacarídeos, que podem ser estruturalmente muito parecidos,

porém apresentarem propriedades farmacológicas/biológicas distintas.

Portanto, cada metodologia, como dito anteriormente, extraiu polissacarídeos

que apresentavam características distintas e que se refletiram nos testes

farmacológicos.

Utilizaram-se três formas de obter extratos aquosos ricos em

polissacarídeos do mandacaru. No método, aqui denominado de MPM, a

extração do polissacarídeo foi baseada na capacidade desses se solubilizarem

em água. Do resíduo sólido resultante desse primeiro método de extração,

obteve-se ainda dois extratos ricos em polissacarídeos; O MCA80 foi utilizado

com o objetivo de permitir a extração dos polissacarídeos solúveis em água

mas que estariam mais presos na estrutura da parede celular, e que portanto,

precisariam de uma energia maior (calor) para serem liberados dessa parede.

Contudo, esse método é incapaz de extrair aqueles polissacarídeos que

estariam ligados covalentemente à proteínas. Portanto, obteve o extrato

MCP60, que foi obtido utilizando-se proteases que degradaram proteínas do

tecido vegetal, permitindo então a solubilização dos polissacarídeos que

estavam ligados covalentemente às proteínas (ROCHA et al, 2005)

Extratos polissacarídicos extraídos de qualquer fonte vegetal podem

apresentar variações de contaminações (proteínas, lipídios, ácidos nucléicos e

compostos fenólicos, por exemplo) dependendo do método de extração

desenvolvido. Como por exemplo, a extração de polissacarídeos de algas

marinhas mostrou uma variação de contaminação proteica de 0,7% a 2,0%

(COSTA et al, 2010). O extrato MCP60 em teoria deveria ter menos proteínas

DISCUSSÃO 55

que os demais, pois foi utilizado um complexo contendo enzimas proteolíticas

para promover a liberação dos polissacarídeos, e estas degradariam as

proteínas solúveis. Contudo, isto não foi o observado, este extrato apresentou

quantidades semelhantes de proteínas que MPM, e estes dois apresentaram

bem mais quantidade de proteínas do que MCA80. É provável que esta maior

quantidade de proteínas detectada seja resíduo das proteases adicionadas no

começo da extração. Corrobora com está hipótese os dados apresentados por

Fidelis (2011), que observou que extratos obtidos a 60 °C sem proteases

apresentavam 60% menos proteínas do que extratos obtidos a 60 °C com

proteases. O extrato MCA80 foi o que apresentou menor quantidade de

compostos fenólicos e de proteínas dentre os três extratos obtidos. Este extrato

foi obtido à temperatura mais elevada que os demais, assim acredita-se que

esta temperatura tenha promovido uma maior degradação dos contaminantes

(proteínas e compostos fenólicos) e, portanto, diminuído a sua quantidade em

relação a aquela encontrada nos demais extratos. Corrobora com esta hipótese

os dados publicados por Hamama e Nawar (1991).

Glicose, manose e galactose foram encontradas em todos os extratos

em proporções semelhantes. Esta composição é diferente daquela encontrada

em extratos aquosos ricos em polissacarídeos obtidos dos cactos Opuntia fícus

indica e Mesembryanthemum crystallinum, estes dois produzem

polissacarídeos ricos em ácidos urônicos, arabinose, xilose, galactose e glicose

(DETERS et al., 2012). Galactose e arabinose também foram encontradas em

grande quantidade em polissacarídeos extraídos do cacto Melocactus

depressus (SILVA, 2002). Em suma, os dados da literatura, incluindo deste

trabalho, mostram que os polissacarídeos sintetizados por espécies diferentes

de cactos são diferentes entre si. Portanto cada polissacarídeo purificado de

um cacto é potencialmente um novo composto com as mais variadas

aplicabilidades.

Vários estudos são dedicados ao estudo de atividades biológicas de

polissacarídeos extraídos de fontes vegetais. Seguindo esta linha de

pensamento, este trabalho avaliou algumas atividades

DISCUSSÃO 56

biológicas/farmacológicas dos extratos ricos em polissacarídeos obtidos de

mandacaru.

O sistema antioxidante natural presente nas células é um importante

controlador para a formação do estresse oxidativo. A elevada formação de

espécies reativas, principalmente as derivadas do oxigênio, desempenha um

papel importante no desenvolvimento de doenças neurodegenerativas e

câncer. Um teste que avalia o potencial antioxidante é conhecido como

“Atividade Antioxidante Total” (CAT). Este método é baseado na redução de

Mo+6 para Mo+5 pelos compostos antioxidantes, e a formação de complexos

verdes com o molibdênio reduzido com uma máxima absorção de 695 nm. O

complexo colorido verde é bastante estável e não é afetado por vários

solventes orgânicos usados para a extração de polissacarídeos

(ATHUKORALA, 2006). Os três extratos apresentaram valores de CAT

superiores a 50 mg de equivalente de ácido ascórbico/g de extrato, dentre eles

o mais potente foi MCP60 (68,13 EAA). Esta atividade foi superior às obtidas

com galactanas sulfatadas extraídas de alga vermelha Gracilaria caudata

(COSTA et al., 2010), e foi maior que as atividade de xiloglucanas de sementes

de tamarindo (CHOI et al, 2009) e de sabugo de milho (MELO-SILVEIRA et al.,

2012). Devido à alta capacidade antioxidante mostrado pelo método de

fosfomolibdênio, os extratos rico em polissacarídeos de mandacaru foram

selecionadas para a análise de detalhes de suas propriedades usando ensaio

de sequestro de radical superóxidos, quelação cúprica e poder redutor.

Contudo os dados aqui apresentados foram semelhantes aos

encontrados para polissacarídeos sulfatados purificadas da alga Laminaria

japonica (WANG, et al., 2008). Os resultados mostram que os polissacarídeos

de mandacaru possuem como principal mecanismo antioxidante doar elétrons

e quelar metais, agindo assim como antioxidantes bloqueadores de cadeia

(ZHANG 2006)

Radicais ânions superóxidos atuam como um oxidante, mas sendo

altamente instáveis, imediatamente são dismutados espontaneamente ou

enzimaticamente no meio intracelular. Embora o superóxido seja um

antioxidante de meia-vida relativamente curta, ele é decomposto na forma

DISCUSSÃO 57

extremamente reativa, a espécie reativa radical hidroxila. Entre as espécies

reativas do oxigênio, o radical hidroxila é o mais quimicamente reativo. Esses

radicais podem, por exemplo, subtrair átomos de hidrogênio de grupos tióis de

moléculas biológicas e formar radicais sulfidrilas, que são capazes de se

combinar com oxigênio para gerar radicais oxisulfidrilas e danificar moléculas

biológicas (SUDHAKAR et al., 2008). Os extratos de mandacaru (0,5 a 2,0

mg/mL) não apresentaram atividade contra o superóxido. Dados similares

foram observados com manogalactoglucanas que não mostraram atividade

sequestradora de radical superóxido em todas as concentrações usadas no

estudo (de 0,05 a 2,0 mg/mL) (TELLES et al., 2011). Por outro lado, fucoidans

(polissacarídeos sulfatados) da alga marinha marrom Laminaria japonica

(ZHAO, 2008) e ulvanas (polissacarídeos sulfatados) da alga verde Ulva

pertusa (QI et al, 2005) têm uma atividade sequestradora de radical superóxido

maior que vitamina C. Estes dois trabalhos têm proposto que a habilidade de

sequestro desse radical depende do conteúdo de sulfato presente na estrutura

dos polissacarídeos, ainda propõem que polissacarídeos altamente sulfatados

têm maior capacidade sequestradora do que os polissacarídeos menos

sulfatados. Além disso, quando quitosanas (amino polissacarídeos) foram

sulfatadas, exibiram maior atividade sequestradora em comparação ao

composto original (YAN-CHUN, 1991). Dessa forma, pode-se atribuir que a

inexistente ação contra os radicais superóxidos dos polissacarídeos

encontrados no mandacaru seja pelo fato da falta de grupamentos iônicos,

como sulfato.

Os resultados aqui relatados foram bastante interessantes, pois indicam

que mandacaru sintetiza polissacarídeos com diferentes mecanismos

antioxidantes. Apesar de sua potência antioxidante não ter sido tão alta em

alguns ensaios, deve ser a somação dos efeitos individuais desses polímeros

que é utilizada como uma estratégia de defesa da planta ao ambiente

semiárido da caatinga. Isto proporcionaria uma defesa mais eficiente frente aos

radicais livres em detrimento da síntese de polissacarídeos com alta atividade

antioxidante, mas que agiram apenas via um mecanismo.

DISCUSSÃO 58

Relatos em trabalhos científicos demonstram, que extratos ricos tanto

em polissacarídeos quanto compostos antioxidantes apresentam atividade

antiproliferativa frente a linhagens tumorais (ATHUKORALA et al, 2006).

Entretanto, os extratos de mandacaru não mostraram qualquer correlação

direta com a atividade antioxidante apresentada por esses polímeros, como é

mostrado também em outros trabalhos para polissacarídeos de outras fontes

vegetais (YUAN et al, 2006; YE et al, 2008).

Os extratos polissacarídicos de mandacaru não afetaram a capacidade

redutora de MTT das células PC-3. Por outro lado eles afetaram principalmente

a capacidade redutora das células tumorais renais 786. O extrato mais efetivo

foi MCP60. O teste de fragmentação nuclear mostrou que MCP60 além de

afetar o metabolismo de células 786, também poderá induzir morte celular.

Outro fato interessante, é que MCP60 na concentração de 1 mg/mL afeta a

capacidade redutora de MTT das células tumorais de rins 786, porém não afeta

a capacidade das células normais de rins, o que dá a este extrato um grande

potencial para ser utilizado contra tumores renais.

Pretende-se no futuro purificar os polissacarídeos encontrados em

MCP60 e identificar aquele(s) com maior potencial antitumoral, bem como

compreender seu mecanismo de ação.

CONCLUSÕES 59

6- CONCLUSÕES

Os extratos aquosos ricos em polissacarídeos obtidos de mandacaru

são ricos em galactose, manose e glicose e apresentam traços de ácido

glucurônico. Apresentaram atividade antioxidante por serem capazes de doar

elétrons e quelar cobre e possuem atividade citotóxica frente a linhagem celular

tumoral de rim 786 (contra células tumorais de rins.) Neste caso, o extrato

MCP60 foi mais potente, já demonstrando atividade com 0,5 mg/mL, além

disso, ele não apresentou citotoxicidade contra células normais de rins até uma

concentração de 1 mg/mL.

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