DANIEL HENRIQUE BÜCKER - ICB - UFMG
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA GERAL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA DISSERTAÇÃO DE MESTRADO Detecção de Corynebacterium pseudotuberculosis em amostras clínicas de animais assintomáticos utilizando a técnica de PCR em tempo real DANIEL HENRIQUE BÜCKER ORIENTADOR: Prof. Dr. Vasco Ariston de Carvalho Azevedo CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Anderson Miyoshi BELO HORIZONTE Dezembro - 2009
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA GERAL PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Detecção de Corynebacterium pseudotuberculosis
em amostras clínicas de animais assintomáticos
utilizando a técnica de PCR em tempo real
DANIEL HENRIQUE BÜCKER
ORIENTADOR: Prof. Dr. Vasco Ariston de Carvalho Azevedo
CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Anderson Miyoshi
BELO HORIZONTE Dezembro - 2009
DANIEL HENRIQUE BÜCKER
Detecção de Corynebacterium pseudotuberculosis
em amostras clínicas de animais assintomáticos
utilizando a técnica de PCR em tempo real
ORIENTADOR: Prof. Dr. Vasco Ariston de Carvalho Azevedo
CO-ORIENTADOR: Prof. Dr. Anderson Miyoshi
Universidade Federal de Minas Gerais
Instituto de Ciências Biológicas
Belo Horizonte - MG
Dezembro - 2009
Dissertação apresentada como requisito parcial para a obtenção do grau de Mestre pelo programa de Pós-Graduação em Genética, Departamento de Biologia Geral, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Minas Gerais.
Dedico esse trabalho a todos os que, apesar das inúmeras dificuldades, continuam lutando bravamente pelo desenvolvimento científico em nosso país.
AGRADECIMENTOS
A Deus, minha fonte de sustento e inspiração;
Aos meus orientadores, por acreditarem no meu potencial, e pelo investimento;
À minha mãe, Isolde Bücker, e meu pai, Gustavo Henrique Bücker (in
memorian) pelo incansável incentivo à progressão na vida acadêmica e por
nunca desistirem de mim.
À Gizelli, pelo carinho, apoio e incentivo durante o período de desenvolvimento
desse trabalho;
Aos colegas do LGCM, especialmente ao Thiago e à Marcília, pelo valioso
auxílio na fase final do trabalho;
À professora Juliana Calábria, por gentilmente ceder o aparelho de real-time
PCR;
Aos colegas do Laboratório de Microbiologia do Departamento de Engenharia
Sanitária e Ambiental;
Às agências de fomento CNPq, FAPEMIG e CAPES;
Aos colegas do Hospital das Clínicas, pelo apoio e incentivo;
E a todos os familiares e amigos, por suportaram minha ausência e também
minha falta de paciência.
SUMÁRIO LISTA DE ABREVIAÇÕES E SIGLAS ...............................................................I LISTA DE FIGURAS .........................................................................................III LISTA DE TABELAS ........................................................................................VI RESUMO...........................................................................................................VII ABSTRACT .....................................................................................................VIII 1. APRESENTAÇÃO .......................................................................................... 1
1.1. Colaboradores ............................................................................................. 2
1.2. Introdução geral ........................................................................................... 2
1.3. Estrutura do manuscrito ............................................................................... 4
2. REVISÃO DE LITERATURA .......................................................................... 6
2.1. Corynebacterium pseudotuberculosis .......................................................... 7
2.2. Linfadenite Caseosa .................................................................................... 8
2.2.1. Aspectos gerais da doença ...................................................................... 8
2.2.2. Diagnóstico ............................................................................................. 10
2.2.2.1. Diagnóstico microbiológico .................................................................. 10
2.2.2.2. Diagnóstico sorológico ......................................................................... 11
2.2.2.3. Diagnóstico molecular ......................................................................... 12
2.3. PCR em tempo Real (qPCR) ..................................................................... 13
3. OBJETIVOS ................................................................................................. 18
3.1. Objetivo Geral ............................................................................................ 19
3.2. Objetivos Específicos ................................................................................ 19
4. MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................ 20
4.1. Equipamentos utilizados ............................................................................ 21
4.2. Reagentes e kits de biologia molecular ..................................................... 21
4.3. Soluções e meios de cultura ...................................................................... 22
4.4. Material Biológico ...................................................................................... 24
4.4.1. Linhagens bacterianas ............................................................................ 24
4.4.2. Amostras clínicas .................................................................................... 25
4.5. Manipulação do DNA ................................................................................. 25
4.6. Resolução eletroforética ............................................................................ 26
4.7. Padronização do ensaio de PCR em tempo real ....................................... 26
4.7.1. Desenho de iniciadores e condições de PCR ......................................... 26
4.7.2. Clonagem dos produtos de PCR amplificados para realização da curva
de calibração .................................................................................................... 28
4.7.2.1. Extração de DNA genômico................................................................. 28
4.7.2.2. Amplificação dos produtos para clonagem .......................................... 29
4.7.2.3. Purificação dos amplicons ................................................................... 29
4.7.2.4. Clonagem dos produtos de amplificação ............................................. 29
4.7.2.5. Transformação bacteriana ................................................................... 30
4.7.2.5.1. Preparo de E. coli eletrocompetente ................................................. 30
4.7.2.5.2. Transformação de E. coli .................................................................. 31
4.7.3. Extração do DNA plasmidiano de E. coli em pequena escala ................ 31
4.8. Testes de eficiência de iniciadores ............................................................ 31
4.8.1. Diluições seriadas ................................................................................... 31
4.8.2. Parâmetros do PCR em tempo real ........................................................ 32
4.8.3. Cálculo da eficiência de amplificação dos iniciadores ............................ 33
4.9. Realizações das misturas artificiais ........................................................... 33
4.9.1. Cultivo e diluições de C. pseudotuberculosis ......................................... 34
4.9.2. Misturas artificiais ................................................................................... 35
4.10. Técnicas de extração de DNA testadas ................................................... 36
4.10.1. PK-Sarcosil / Fenol-Clorofórmio ........................................................... 36
4.10.2. Pre-Cellys / Fenol-Clorofórmio.............................................................. 37
4.10.3. Kit Nucleo Spin Tissue® (Machery-Nagel) ............................................ 37
4.10.4. Kit Nucleo Spin Plasma® (Machery-Nagel) ........................................... 38
4.11. PCR em tempo real das extrações de misturas artificiais ........................ 38
4.11.1. PCR das extrações de misturas artificiais para escolha do método de
extração ............................................................................................................ 38
4.11.2. PCR em tempo real para misturas artificiais ......................................... 38
4.12. Ensaio sorológico das amostras clínicas ................................................. 38
4.12.1. Coleta de amostras e conservação ...................................................... 39
4.12.2. ELISA Indireto ....................................................................................... 39
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES.................................................................. 41
5.1. Desenho e teste de iniciadores.................................................................. 42
5.2. Clonagem dos alvos dos genes 12S e PLD .............................................. 44
5.3. Teste de eficiência de amplificação dos iniciadores .................................. 45
5.4. Misturas artificiais ...................................................................................... 48
5.5. PCR das extrações de misturas artificiais para escolha do método de
extração ............................................................................................................ 48
5.6. PCR em tempo real das misturas artificiais ............................................... 50
5.7. ELISA indireto ............................................................................................ 53
6. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS ............................................................. 61
6.1. Conclusões ................................................................................................ 62
6.2. Perspectivas .............................................................................................. 62
7. REFERÊNCIAS.............................................................................................63
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
BHI Brain Heart Infusion – Infusão Cérebro Coração
°C Graus Celsius
CT Threshold Cycle
CP Crosspoint
DNA Ácido Desoxirribonucléico
dNTPs Desoxirribonucleotídeos trifosfato
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay
fg Fentograma
g Grama
Kb Mil pares de base
L Litro
LC Linfadenite caseosa
mg Miligrama
Min Minutos
mL Mililitro
mM Milimolar
M Molar
N Normalidade
ng Nanograma
nm Nanômetro
DO600 Densidade ótica em comprimento de onda de 600 nanômetros
O.N. “overnight” – durante a noite
ORF Open read frame
PCR Reação em cadeia da polimerase
pb Pares de bases
pg Picograma
pH Potencial hidrogeniônico
pmoles Picomoles
PLD Fosfolipase D
qPCR PCR em tempo real
q.s.p. Quantidade suficiente para
s Segundos
rpm Rotações por minuto
I
Taq Themus aquaticus
U Unidade
UFC Unidades Formadoras de Colônia
µFD Capacitância por unidade
µg Micrograma
µL Microlitro
µM Micromolar
vol Volume
V Volts
II
Lista de Figuras Figura 1: Representação esquemática da atividade do fluoróforo SYBR Green durante
a PCR em tempo real. A parte 1 mostra a fase de desnaturação do DNA molde, na
presença dos iniciadores e fluoróforos. Na parte 2 está representada a fase de
extensão da reação, com os fluoróforos se associando à dupla fita recém sintetizada,
com subseqüente emissão de fluorescência.................................................................13
Figura 2: Representação esquemática da atividade na DNA polimerase no sistema
TaqMan. A esfera verde representa o fluoróforo e a esfera vermelha representa o
quencher (inibidor de fluorescência), aderidos à sonda hibridizada no meio da região
alvo do DNA estudado. A letra h representa a fluorescência emitida quando a enzima
exerce sua ação de 5’-exonuclease, afastando assim o fluoróforo do quencher..........14
Figura 3: Gráfico gerado pela detecção da emissão de fuorescência pela formação de
amplicons na presença do fluoróforo SYBR® Green. O CT, ponto a partir do qual o
equipamento considera que houve de fato amplificação, está indicado na figura, e está
representado por uma linha laranja...............................................................................15
Figura 4: Esquema de diluição do cultivo de C. pseudotuberculosis linhagem 1002
para a realização de misturas artificiais........................................................................35
Figura 5: PCR com dois pares diferentes de iniciadores para o pld e o 12SrRNA
utilizando a temperatura de anelamento de 58 ºC, em gel de agarose a 2%. 1 - Padrão
de peso molecular: 1kb plus DNA ladder (Invitrogen); 2 - Padrão de peso molecular:
Generuller 1kb plus (Fermentas); 3 – 12SrRNA (274 pb) Iniciadores multiplex; 4 – pld
(203 pb), iniciadores multiplex; 5 - 12SrRNA (200 pb), iniciadores novos; 6 – pld (70
pb), iniciadores novos; 7 – Controle negativo para 12SrRNA e pld , iniciadores
multiplex; 8 – Controle negativo para 12SrRNA e pld,, iniciadores novos .................... 42
Figura 6: PCR para o pld e o 12SrRNA utilizando a temperatura de anelamento de 60
ºC, em gel de agarose a 2%. 1 - Padrão de peso molecular: Generuller 1kb plus
(Fermentas); 2 – 12SrRNA (200 pb), iniciadores novos; 3 – pld (70 pb), iniciadores
novos; 4 - Controle negativo para 12SrRNA e pld,, iniciadores novos .......................... 43
Figura 7: PCR do produto de extração plasmidial para o fragmento de 70 pb do gene
pld para confirmação dos clones. 1 - Padrão de peso molecular: Generuller 1kb plus
III
(Fermentas); 2 - Clone 3; 3 - Clone 4; 4 - Clone 5; 5 - Clone 6; 6 – Controle positivo
(DNA genômico de C. pseudotubersulosis linhagem 1002); 7 – Controle negativo ...... 44
Figura 8: PCR do produto de extração plasmidial para o fragmento de 200 pb do gene
12SrRNA pld para confirmação dos clones. 1 - Padrão de peso molecular: 1 kb plus
DNA ladder (Invitrogen); 2 - Clone 1; 3 - Clone 2; 4 - Clone 3; 5 - Clone 4; 6 – Clone 6;
7 – Clone 7; 8 - Clone 8; 9 – Clone 15; 10 – Clone 16; 11 – Controle positivo (DNA
genômico de C. hircus); 12 – Controle negativo .................................................................. 45
Figura 9: Curva de eficiência de amplificação para os iniciadores do gene 12SrRNA . 46
Figura 10: Curva de eficiência de amplificação para os iniciadores do gene pld ........... 47
Figura 11: PCR dos genes pld e 12SrRNA para escolha do método de extração a ser
utilizado. 1 - Padrão de peso molecular: Generuller 1kb plus (Fermentas); 2 – Kit MN /
Soro / 10-5 pld; 3 - Kit MN / Soro / 10-6 pld; 4 - Kit MN / Sangue total / 10-5 pld; 5 - Kit
MN / Sangue total / 10-6 pld; 6 – PK Sarcosil/ Fenol-Clorofórmio / Soro / 10-5 pld; 7 –
PK Sarcosil/ Fenol-Clorofórmio / Soro / 10-6 pld; 8 – PK Sarcosil/ Fenol-Clorofórmio /
Sangue total / 10-5 pld; 9 – PK Sarcosil/ Fenol-Clorofórmio / Sangue total / 10-6 pld; 10
– Precellys/Fenol-Clorofórmio / Soro / 10-5 pld; 11 – Precellys/Fenol-Clorofórmio / Soro
/ 10-6 pld; 12 - Precellys/Fenol-Clorofórmio / Sangue total / 10-5 pld; 13 –
Precellys/Fenol-Clorofórmio / Sangue total / 10-6 pld; 14 – Controles positivo (DNA
genômico de C. pseudotubersulosis linhagem 1002); 15 – Controle negativo pld; 16 -
Padrão de peso molecular: 1 kb plus DNA ladder (Invitrogen); 17 – Kit MN / Soro / 10-5
12SrRNA; 18 – Kit MN / Soro / 10-6 12SrRNA; 19 – Kit MN / Sangue total / 10-5
12SrRNA; 20 – Kit MN / Sangue total / 10-6 12SrRNA; 21– PK Sarcosil/ Fenol-
Clorofórmio / Soro / 10-5 12SrRNA; 22– PK Sarcosil/ Fenol-Clorofórmio / Soro / 10-6
12SrRNA; 23– PK Sarcosil/ Fenol-Clorofórmio / Sangue total / 10-5 12SrRNA; 24– PK
Sarcosil/ Fenol-Clorofórmio / Sangue total / 10-6 12SrRNA; 25 – Precellys/Fenol-
Clorofórmio / Soro / 10-5 12SrRNA; 26 – Precellys/Fenol-Clorofórmio / Soro / 10-6
12SrRNA; 27 – Precellys/Fenol-Clorofórmio / Sangue total / 10-5 12SrRNA; 28 –
Precellys/Fenol-Clorofórmio / Sangue total / 10-6 12SrRNA; 29 – Controle positivo
(DNA genômico de C. hircus); 30 – Controle negativo 12SrRNA ..................................... 49
Figura 12: Gráfico da amplificação do gene 12SrRNA das misturas artificiais com soro
e sangue total. 1 - 12SrRNA::TOPO: CT médio=17,2; 2- MAs de Sangue total com as
IV
diluição de cultura a 10-5 e a 10-6: CT médio=23,7; 3 - MAs de Soro com as diluição de
cultura a 10-5 e a 10-6 : CT médio=29,1 .................................................................................. 51
Figura 13: Gráfico da amplificação do gene pld das misturas artificiais com soro e
sangue total. 1 - pld::TOPO a 10 ng/µL. CT médio=15,1; 2- MAs de Soro com as
diluições de cultura a 10-5 e a 10-6 CT médio=26,7; 3 - MAs de Sangue total com as
diluições de cultura a 10-5 e a 10-6 CT médio=25,9 .............................................................. 51
V
Lista de Tabelas Tabela 1. Linhagens bacterianas e plasmídeos utilizados neste trabalho ........ 25
Tabela 2: Iniciadores utilizados nesse trabalho ................................................ 27
Tabela 3: Ciclos de temperatura utilizados nos testes dos iniciadores ............. 27
Tabela 4: Concentrações dos reagentes utilizados nas reações de PCR ........ 28
Tabela 5: Reação de ligação dos insertos ao
vetor...................................................................................................................29
Tabela 6: Concentrações dos componentes da reação de PCR em tempo real.32
Tabela 7: Ciclo de temperaturas utilizadas no PCR em tempo real ................. 33
Tabela 8: Diluições a partir da D.O.600nm=0,2 adicionadas às Mas ................... 48
Tabela 9: Resultados de PCR em tempo real comparado com ELISA para as
amostra clínicas testadas, com os resultados que foram confirmados
destacados.........................................................................................................52
Tabela 10: Resultado de ELISA para 10 ovinos da Propriedade I .................... 53
Tabela 11: Resultado de ELISA para 26 ovinos da Propriedade II ................... 53
Tabela 12: Resultado de ELISA para 24 ovinos da Propriedade III .................. 54
Tabela 13: Resultado de ELISA para 58 ovinos da Propriedade IV ................. 55
Tabela 14: Resultado final para todos os ovinos testados, com porcentagem de
positivos ............................................................................................................ 56
Tabela 15: Resultado de ELISA para 48 caprinos da Propriedade VI .............. 56
Tabela 16: Resultado de ELISA para 17 caprinos da Propriedade VIII ............ 58
Tabela 17: Resultado de ELISA para 22 caprinos da Propriedade IX .............. 58
Tabela 18: Resultado final para todos os caprinos testados, com porcentagem
de positivos........................................................................................................59
RESUMO
Corynebacterium pseudotuberculosis é uma bactéria Gram-positiva,
patógeno intracelular facultativo, agente etiológico da Linfadenite Caseosa
(LC). Esta enfermidade que afeta principalmente pequenos ruminantes causa
grandes perdas econômicas à ovinocaprinocultura brasileira. Apesar da
prevalência mundial da LC e das intensas pesquisas em torno deste
microorganismo, ainda não existem métodos diagnósticos totalmente eficazes
contra esta doença, principalmente em sua fase subclínica. Com o objetivo de
facilitar a detecção de C. pseudotuberculosis na fase subclínica da doença, foi
proposto neste presente trabalho o desenvolvimento de um teste diagnóstico
capaz de detectar através de PCR em tempo real a presença deste patógeno a
partir do DNA extraído de amostras de sangue total e/ou soro de caprinos e
ovinos. Através da realização de testes utilizando sangue e soro artificialmente
infectados com a bactéria a baixas concentrações, foi possível determinar que
o melhor método de extração de DNA para padronização deste teste foi o de
lise celular mecânica utilizando microesferas de sílica, seguida de purificação
utilizando a técnica de fenol-clorofórmio. Foi estabelecida uma técnica de PCR
em tempo real capaz de detectar DNA bacteriano a partir da concentração de
10 fg/µL. Amostras clínicas de 87 caprinos e 118 ovinos de propriedades rurais
do município de Araçatuba – SP foram testadas por ELISA para servirem de
referência para futuros testes da técnica padronizada. Foram encontrados 7% e
13%, de ovinos e caprinos, respectivamente, soro positivos para LC através do
ensaio de ELISA. Todas as amostras clínicas testadas por PCR em tempo real
tiveram resultado positivo. Por esta razão, a técnica de PCR em tempo real
necessita de ajustes em sua padronização para que os resultados corroborem
com os dados do ELISA. De posse destes dados preliminares, temos a
perspectiva de validar o teste padronizado neste trabalho, potencialmente mais
sensível e específico que os testes atualmente disponíveis.
VI
VII
ABSTRACT
Corynebacterium pseudotuberculosis is a Gram-positive bacteria,
intracellular facultative pathogen, the aethiological agent of Caseous
Lymphadenitis (CL). This disease, which mainly affects small ruminants, is the
cause of great economical losses to Brazilian sheep and goat husbandries.
Despite the worldwide prevalence of CL, and intensive research focusing this
microorganism, until the present moment there are no diagnostic methods with
complete efficacy for this disease, specially on its subclinical phase. With the
goal permits the detection of C. pseudotuberculosis on the subclinical phase of
the disease, work purposes the development of a diagnostic test able to detect
using real-time PCR the presence of this pathogen from DNA extracted of
samples of whole blood and/or serum of sheep and goats. Performing tests
using whole blood and serum artificially infected with bacteria at low
concentrations, it was possible to determine that the Best DNA extraction
method de DNA for the standardization of this test was using mechanical lysis
using silica beads, followed by purification using phenol-chloroform. It was
standardized a real-time PCR technique able to detect bacterial DNA from a
lower detection limit of 10 fg/µL. Clinical samples of 87 goats and 118 sheep
from farms belonging to Araçatuba – SP were tested by ELISA to serve as a
reference fou future tests of the standardizes technique. 7% of all sheep and
13% of all goats tested were ELISA positive for CL. All the samples tested for
real-time PCR were positive. For that reason, the Real-time PCR technique
needs some standardization adjusts for their results to confirm the ELISA data.
Based on these preliminary data, our perspective is to validate the test
standardized at this work, potentially more sensible and specific than the tests
avaliable at the moment.
VIII
1. APRESENTAÇÃO
2
1.1. Colaboradores
Este trabalho de tese foi realizado no Laboratório de Genética Celular e
Molecular (LGCM) do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de
Minas Gerais (UFMG); e contou com as seguintes colaborações:
• Profª Dra. Juliana Calábria do Laboratório de Microbiologia do Departamento
de Engenharia Sanitária e Ambiental da Universidade Federal de Minas Gerais
(UFMG);
• Criadores de caprinos e ovinos de Araçatuba – São Paulo, que forneceram o
sangue dos animais.
O mesmo teve o apoio financeiro das seguintes instituições: Fundação de
Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG); Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq); Financiadora de Estudos e Projetos
(MCT- FINEP).
1.2. Introdução geral
Corynebacterium pseudotuberculosis é uma actinobactéria Gram-
positiva, parasita intracelular facultativa, causadora da linfadenite caseosa (LC)
em pequenos ruminantes. Esta enfermidade crônica contagiosa pode se
apresentar sob duas formas principais: uma forma externa, caracterizada pelo
desenvolvimento de abscessos encapsulados em linfonodos superficiais; e
uma forma interna, em que os abscessos acometem linfonodos viscerais em
órgãos internos (Dorella et al., 2006).
Enfermidade de abrangência mundial, a LC se destaca em países que
apresentam grandes rebanhos de caprinos e ovinos, tais como países da
Europa (Inglaterra, França, Holanda e Espanha) (Baird & Fontaine, 2007;
Ruiz et al., 2007), Austrália, Nova Zelândia, África do Sul, Estados Unidos,
Canadá e Brasil (Williamson, 2001; Arsenault et al., 2003; Paton et al., 2003;
Dorella et al., 2006). O Brasil é detentor de 3% do rebanho mundial de
caprinos e ovinos (EMBRAPA Semi-Árido, 2008). Onde, a região Nordeste é a
3
mais acometida, haja vista a intensa criação destes animais (Alves & Pinheiro,
1997; Ribeiro et al., 2001). Entretanto, estudos epidemiológicos recentes
mostram alta incidência da doença também na região Sudeste. A prevalência
da LC em Minas Gerais, estado onde a ovinocultura tem apresentado grande
crescimento, é de aproximadamente 75,8% entre ovinos (Guimarães et al.,
2009) e 78,9% entre caprinos (Seyffert et al., 2009). Consequentemente, os
danos causados pela LC têm apresentado relevante impacto na
ovinocaprinocultura brasileira pelas perdas econômicas acarretadas (Arsenault
et al., 2003; Paule, 2003).
A inviabilidade do uso de antibióticos (Alves & Pinheiro, 1997;
Piontikowski & Shivvers, 1998; Williamson, 2001), a ineficiência de meios
profiláticos (vacinas) (Paton et al., 2003; Dorella et al., 2006), assim como a
inexistência de métodos de diagnósticos completamente satisfatório para a LC,
fazem desta doença um importante alvo de intensas pesquisas (Dercksen et
al., 2000; Menzies et al., 2004; Dorella et al., 2006).
Devido à necessidade de diferenciar C. pseudotuberculosis de outros
agentes patogênicos envolvidos com a sintomatologia de LC, como
Arcanobacterium pyogenes e Pasteurella multocida, o isolamento dessa
bactéria diretamente do material purulento de linfonodos permanece como um
dos procedimentos mais fidedignos de diagnóstico (Ribeiro et al., 2001).
Pacheco et al., 2007 desenvolveram uma reação de PCR Multiplex
(mPCR) para detecção mais rápida e eficiente de C. pseudotuberculosis em
amostras clínicas de animais portadores de LC. Através da utilização desta
mPCR, associado a um método de extração de DNA bacteriano diretamente de
material caseoso, foi detectada C. pseudotuberculosis muito mais rapidamente
e de maneira mais específica que quando utilizando cultura bacteriológica e
identificação bioquímica de isolados, que é atualmente o padrão-ouro para o
diagnóstico da LC.
Até o presente momento, os ensaios diagnósticos desenvolvidos
possuem limitação quanto à detecção da enfermidade em animais sem
sintomatologia aparente (Dercksen et al., 2000; Williamson, 2001; Menzies
et al., 2004; Dorella et al., 2006; Baird & Fontaine, 2007; Pacheco et al.,
2007). Portanto, testes rápidos, confiáveis e acurados necessitam ser
4
desenvolvidos para a detecção de C. pseudotuberculosis em casos subclínicos
e/ou exclusivamente viscerais de LC.
Dados da literatura têm revelado que a amplificação de sequências
específicas de DNA bacteriano em amostras de sangue têm sido bem
sucedidas em casos de brucelose assintomática (Elfaki et al., 2005) e
candidíase sistêmica (Bougnoux et al., 1999). Além disso, este é um material
de fácil obtenção, desde que sua coleta seja realizada por pessoal
devidamente treinado. Entretanto, este fluido biológico se apresenta como uma
boa opção de matriz para extração de DNA para o diagnóstico molecular
subclínico. Uma vez definido o material biológico a ser utilizado, é necessário
determinar qual a melhor técnica para a extração de DNA desse material. Para
isso são necessários testes em que determine o método de extração mais
eficaz, e que seja o mais isento possível de inibidores que possam interferir em
uma reação de PCR.
Se diagnosticada em fase subclínica, a LC pode ser controlada, pois os
animais infectados podem ser isolados do rebanho ou abatidos antes que se
desenvolvam os abscessos e por conseqüência ocorra à disseminação da
doença. Neste contexto, a proposta deste trabalho foi desenvolver um teste
diagnóstico para a LC capaz de detectar através de PCR em tempo real a
presença de C. pseudotuberculosis a partir do DNA extraído de amostras de
sangue total e/ou soro de caprinos e ovinos em fase subclínica da doença.
1.3. Estrutura do manuscrito
O presente trabalho tem início com uma revisão de literatura sobre C.
pseudotuberculosis, abordando as principais questões relacionadas à
microbiologia e virulência, linfadenite caseosa, focando as técnicas de
diagnósticos utilizadas, e por fim o método de PCR em tempo real.
Em seguida, são apresentados os objetivos gerais e específicos do
trabalho, os quais se relacionam com o desenvolvimento de um teste
5
diagnóstico para a linfadenite caseosa capaz de detectar a presença do
patógeno C. pseudotuberculosis em amostras provenientes de caprinos e
ovinos em fase subclínica da doença.
Uma seção detalhada sobre os materiais e métodos utilizados durante o
trabalho foi incluída, para facilitar a compreensão do andamento do mesmo,
bem como beneficiar outras pesquisas quanto à execução de protocolos
padronizados.
Os resultados e discussões são apresentados sob a forma de tópicos.
Posteriormente, são apresentadas as considerações finais e perspectivas do
trabalho. Por fim, encontram-se as referências utilizadas neste manuscrito.
6
2. REVISÃO DE LITERATURA
7
2.1. Corynebacterium pseudotuberculosis
C. pseudotuberculosis é uma actinobactéria, Gram-positiva, pertencente
ao grupo CMN (Corynebacterium – Mycobacterium – Nocardia), os quais
apresentam muitas características em comum, tais como: de conterem ácido
micólico na parede celular e apresentarem alto conteúdo GC (Paule et al.,
2004; Baird & Fontaine, 2007). Anaeróbio facultativo de crescimento favorável
à 37ºC em ambiente com pH 7,0 - 7,2 (Selim, 2001), é um patógeno imóvel
que não forma cápsula, não esporula, porém, apresenta fímbrias; tem
crescimento espaçado em meio ágar e se organiza em colônias opacas de
crescimento concêntrico e coloração creme-alaranjado. O crescimento em meio
líquido desenvolve-se como depósitos granulares (Merchant & Packer, 1967;
Buxton & Fraser, 1977; Muckle & Gyles, 1982; Dorella et al., 2006).
Pleomórfico, com dimensões que variam entre 0,5-0,6 µm de diâmetro e 1,0-
3,0 µm de comprimento, fermenta carboidratos sem produção de gás
(Williamson, 2001; Costa, 2002). Não fermenta amido ou trealose, e a
capacidade de reduzir nitrato em nitrito permite a diferenciação de dois
biovares genotipicamente distintos: o biovar equi, isolado de eqüinos e bovinos,
é redutor de nitrato, enquanto o biovar ovis, isolado de caprinos e ovinos, não
possui esta habilidade (Songer et al., 1988).
A virulência do patógeno costuma ser atribuída a dois fatores principais:
ao ácido micólico e à fosfolipase D. O primeiro é um lipídeo de superfície
citotóxico, comum aos outros gêneros do grupo CMN, que facilita tanto a
sobrevivência intracelular, quanto a sobrevivência fora do hospedeiro (Spier et
al., 2004). Experimentalmente, a inoculação de bactérias no solo demonstrou
que é possível recuperar bactérias viáveis até oito meses após a contaminação
do mesmo. Esta capacidade de persistir no meio ambiente, em condições
inóspitas foi atribuída ao ácido micólico (Brown & Olander, 1987). O segundo
fator de virulência é a fosfolipase D (PLD), uma esfingomielinase que no
hospedeiro é uma toxina dermonecrótica. Esta enzima, também produzida por
C. ulcerans, é a responsável pela hemólise em ágar-sangue. Além de ser
responsável pelos abscessos supurativos característicos da LC, a PLD tem um
papel fundamental na permeabilização do sistema vascular, possibilitando a
8
disseminação da bactéria pelo organismo do hospedeiro (Baird & Fontaine,
2007; Lipsky et al., 1982).
C. pseudotuberculosis é capaz de infectar outros animais, além de
caprinos e ovinos. Em cavalos, é o agente etiológico da linfangite ulcerativa,
dentre outras patologias, causando sérias perdas econômicas aos criadores
(Spier et al., 2004). Há também relatos de infecção em bovinos (Shpiegl et al.,
1993), lhamas, alpacas (Braga, 2007) e camelos (Tejedor-Junco et al., 2008),
além da espécie humana (Peel et al., 1997). Os casos de infecções em
humanos são geralmente ocupacionais, e freqüentemente caracterizados pela
formação de abscessos nos linfonodos, embora outros quadros - como
pneumonia - tenham sido relatados (Lipsky et al., 1982). Esta bactéria, no
entanto, já esteve associada à ocorrência de pelo menos 25 casos de infecção
humana até o ano de 2005, indicando a existência de um elevado potencial
zoonótico (Liu et al., 2005).
Os padrões de susceptibilidade de C. pseudotuberculosis a agentes
antimicrobianos in vitro são muito variados, dependendo da origem do isolado.
Geralmente é susceptível a ampicilina, clorafenicol, lincomicina, gentamicina,
tetraciclina, penicilina G e sulfametoxazol-trimetropim (Muckle & Gyles, 1982).
A concentração inibitória mínima (CIM) para todos os isolados é similar para os
vários agentes antimicrobianos, porém a resistência a antibióticos difere
quando as condições infecciosas em a bactéria se encontra (Fernández et al.,
2001). Entretanto, C. pseudotuberculosis é altamente resistente a qualquer
droga quando há formação de biofilme (Olson et al., 2002).
2.2. Linfadenite Caseosa
2.2.1. Aspectos gerais da doença Linfadenite caseosa (LC) é uma doença infecto-contagiosa crônica que
acomete caprinos e ovinos em decorrência da infecção pela bactéria C.
pseudotuberculosis. Dentre as enfermidades causadas por este patógeno,
como hepatite, mastite, artrite, pneumonia e orquite, a LC se destaca pela
formação de abscessos externos e internos em animais infectados (Fontaine &
9
Baird, 2008; Tejedor-Junco et al., 2008). Os abscessos externos acometem
os linfonodos parotídicos e sub-mandibulares, pré-escapulares e da região
posterior. Os abscessos internos ocorrem em linfonodos torácicos
(mediastínicos), pulmonares (bronquiais) e intestinais (mesentéricos), além de
afetarem o parênquima de diversos órgãos.
A LC causa grandes perdas econômicas aos criadores de caprinos e
ovinos ao ocasionar, dentre outros problemas, a condenação de carcaças e
pele, além da inutilização da carne e do leite para consumo (Baird & Fontaine,
2007). Os casos são geralmente diagnosticados através de exame de toque
dos abscessos externos, uma vez que os internos só são detectados no exame
post-mortem (Gouveia, 1986).
A enfermidade tem distribuição mundial, presente em países com
criações de caprinos e ovinos, como Austrália, Nova Zelândia, África do Sul,
Estados Unidos, Canadá, Brasil, Argentina, Chile, Uruguai, França, Itália, Grã-
Bretanha, União Soviética, Sudão e Israel (Costa, 2002; Shiegl et al., 1993).
Há evidências de que a transmissão da doença ocorra através da pele
lesionada por tosquia, castração ou pela secção do cordão umbilical dos
neonatos (Baird & Fontaine, 2007), tendo como fonte de infecção as
descargas oro-nasais de animais com pneumonia e as secreções de linfonodos
abscedados (Gouveia, 1986; Ribeiro, 2001). A cronicidade da LC torna os
animais infectados, reservatórios constantes dentro de um rebanho. Além
disso, como o período de incubação do patógeno dura de dois a seis meses
(Gouveia, 1986), um animal assintomático, considerado aparentemente
saudável pode ser introduzido em um rebanho, difundindo assim a doença para
novas áreas.
Até o presente momento, não existe um tratamento completamente
eficaz no combate à LC. No entanto, o controle é feito isolando o animal
afetado para a remoção cirúrgica das lesões externas, associada à
antibioticoterapia. Apesar da sensibilidade deste patógeno a vários antibióticos
in vitro, a LC é clinicamente refratária. Mesmo quando há desaparecimento dos
abscessos (cura clínica), não há garantia de que o animal esteja livre de
recidivas. Uma das razões apontadas para essa resistência é o fato de o
parasitismo ser intracelular em algumas fases do ciclo, além da estrutura do
abscesso impedir a penetração de drogas (Baird & Fontaine, 2007; Senturk &
10
Temizel, 2006).
Vários grupos de pesquisa vêm tentando desenvolver vacinas contra a
LC, porém ainda não há níveis de proteção eficazes, e nenhuma vacina
comercialmente disponível apresenta níveis satisfatórios de proteção (Dorella
et al., 2006).
De acordo com o último censo do IBGE, em 2006 o Brasil possuía
13.856.747 cabeças de ovinos e 7.109.052 de caprinos, sendo que a região
Nordeste detém a maior parte desse montante, com 91% dos rebanhos
caprinos e 56% dos ovinos, seguida da Região Sul com 29% dos rebanhos de
ovinos (IBGE, 2006). A ovinocaprinocultura apresenta-se em franco
crescimento na região Sudeste do país, e no estado de Minas Gerais
destacam-se as regiões Norte e Triângulo, e mais recentemente a Noroeste e a
Central (Faria et al., 2004).
Esse crescimento vem acompanhado de doenças que diminuem a
produtividade dos rebanhos, como a LC. Estima-se sua prevalência clínica
nacional em 30% (Ribeiro et al., 2001). Na região Norte do estado de Minas
Gerais, 84,3% dos produtores relata problemas com a patologia, e estudos
recentes realizados em 200 propriedades rurais de todo o estado revelaram
uma soroprevalência da LC de 70% em ovinos e 80% em caprinos (Azevedo
et al., 2008).
2.2.2. Diagnóstico
2.2.2.1. Diagnóstico microbiológico
Há dois métodos principais de diagnóstico microbiológico: o teste de
CAMP e a caracterização bioquímica (Baird & Fontaine, 2007). Para o teste
de CAMP, os microrganismos isolados de material drenado de abscessos são
incubados em ágar-sangue com Rhodococcus equi e Staphylococcus aureus.
R. equi e C. pseudotuberculosis interagem formando hemólise sinergística no
ágar-sangue, devido a uma interação entre a PLD e Fosfolipase C de R. equi
(Fraser, 1961). Já a interação com S. aureus causa inibição da hemólise por
11
ação da beta-lisina produzida por esse microrganismo (Soucek et al., 1962).
Esse teste, porém, tem a limitação de não diferenciar C. pseudotuberculosis de
C. ulcerans, que também produz a PLD (Barksdale et al.,1981).
A caracterização bioquímica pode ser feita usando meios de cultura
indicadores da atividade enzimática da bactéria. Cada espécie possui um perfil
bioquímico característico, portanto compara-se o perfil encontrado com uma
tabela onde estão citadas as características de cada espécie. Com o intuito de
facilitar esse trabalho, a galeria API Coryne (bioMérieux, Inc.) utiliza 21
substratos aos quais se adiciona a bactéria em teste. Após 24 horas de
incubação, o padrão de coloração obtido é inserido em um programa, cujo
algoritmo transforma esse padrão de coloração em um índice (Analytical Profile
Intex - API), calculando a probabilidade de a bactéria em teste se encaixar no
perfil de cada espécio do gênero Corynebacterium (Baird & Fontaine, 2007).
Embora o isolamento e a caracterização de C. pseudotuberculosis
continuem sendo “padrão-ouro” para o diagnóstico da LC, esses métodos
muitas vezes se tornam inviáveis, pois muitos animais possuem apenas
abscessos internos, ou abscessos externos já supurados e fibrosados,
contendo poucas bactérias viáveis. Além disso, a punção do abscesso também
implica em risco de contaminação de outros animais (Baird & Fontaine, 2007).
2.2.2.2. Diagnóstico sorológico
Pelas razões supracitadas, diversos grupos vêm tentando criar testes
sorológicos para o diagnóstico da LC. Porém, a maioria dos testes falha em
atingir níveis adequados de sensibilidade e/ou especificidade (Baird &
Fontaine, 2007). Em 2003, Carminati e colaboradores padronizaram um
teste de ELISA com 93,5% de sensibilidade e 100% de especificidade, porém,
todos os animais positivos apresentavam lesões caseosas com bactérias
viáveis, e isso limita, portanto, o teste à fase clínica da infecção. Outro
problema com testes sorológicos, é que estes são dependentes da resposta
imune do hospedeiro ao patógeno, e isso implica em um período de “janela
imunológica”, ou seja, a fase em que o animal já foi infectado, e que ainda não
12
houve a produção de anticorpos pelo sistema imunológico. No caso de uma
doença infecto-contagiosa como a LC, o atraso no diagnóstico pode implicar
em comprometimento de outros animais do rebanho e na impossibilidade de
realizar um tratamento eficaz do animal acometido.
2.2.2.3. Diagnóstico molecular
A demanda por um teste capaz de identificar C. pseudotuberculosis em
um determinado hospedeiro na fase subclínica da infecção tem levado diversos
pesquisadores a tentar criar um método molecular de diagnóstico. Em 2002,
Çetinkaya et al. desenvolveram uma reação de PCR para amplificação da
região genômica codificadora do gene 16S rRNA com o intuito de criar um teste
tanto sensível quanto específico. Apesar de ter obtido sucesso com a
identificação de C. pseudotuberculosis, houve reação cruzada com linhagens
de C. ulcerans (Çetinkaya et al., 2002). Outra limitação é que esse método
não exclui o cultivo bacteriano do material extraído dos abscessos, e isso
implica em demora no diagnóstico, além de restringir o mesmo à fase clínica da
LC.
Em 2007, Pacheco et al., desenvolveram um ensaio de PCR multiplex
direcionado para a amplificação de três regiões de DNA na mesma reação: o
gene rpoB (responsável pela síntese da subunidade β da RNA polimerase), o
16S rRNA e o gene pld. Os dois primeiros são utilizados em estudos
taxonômicos dentro da família Corynebacteria (Dorella et al., 2006). O pld
também está presente em C. ulcerans e Arcanobacterium haemolyticum.
Porém, o desenho de iniciadores específicos para o pld de C.
pseudotuberculosis permitiu a amplificação diferencial apenas nesta espécie.
Os iniciadores desenhados tiveram a adição continham de dois nucleotídeos ao
iniciador anti-senso desenhados inicialmente, tornou-o específico para C.
pseudotuberculosis. Este ensaio foi capaz de detectar o patógeno diretamente
de amostras clínicas (aspirado dos abscessos), sem a necessidade de cultivar
os microrganismos, no entanto o limite de detecção
13
foi de 103 U.F.C., limitando o teste a amostras em fase clínica da infecção
(Pacheco et al., 2007).
Portanto, permanece a demanda por um teste laboratorial para a
detecção de C. pseudotuberculosis em casos subclínicos e/ou exclusivamente
viscerais de LC. Isso possibilitaria o isolamento e tratamento dos animais
infectados, evitando a disseminação da LC dentro do rebanho, e assim
contribuindo para o controle da doença.
2.3. PCR em tempo Real (qPCR)
A PCR em Tempo Real (ou quantitative PCR; qPCR) é uma técnica
relativamente nova e que vem sendo cada vez mais usada em diagnóstico
molecular microbiológico (Claas et al., 2007), pois além de ser mais rápida que
a PCR convencional, torna possível quantificar o DNA presente na amostra,
desde que utilizados calibradores apropriados (Muska et al., 2007). A técnica
apresenta ainda maior sensibilidade que a PCR convencional, uma vez que
permite a detecção de fragmentos amplificados (amplicons) de menor peso
molecular (Mackay et al., 2007). Isso se deve ao fato de que a presença do
amplicon é detectada durante, e não depois de concluída a reação.
Uma das formas de detecção é o uso de fluoróforos de associação ao
DNA, ou seja, substâncias químicas capazes de emitir fluorescência ao se
associar ao DNA de dupla fita, desde que submetido a luz de comprimento de
onda adequado. A substância mais utilizada é o SYBR Green I, dentre outros,
como SYBR Gold, BEBO e LCGreen (Mackay et al., 2007).
Figura 1: Representação esquemática da atividade do fluoróforo SYBR Green
durante a PCR em tempo real. A parte 1 mostra a fase de desnaturação do DNA
molde, na presença dos iniciadores e fluoróforos. Na parte 2 está representada a fase
de extensão da reação, com os fluoróforos se associando à dupla fita recém
sintetizada, com subseqüente emissão de fluorescência.
2 1
14
Detecções por fluorescência são também utilizadas por marcação com
sondas, utilizando um fluoróforo em uma extremidade e um inibidor de
florescência (ou quencher) na outra. Estas sondas são complementares a uma
sequência do DNA - alvo, e hibridizam simultaneamente aos iniciadores.
Quando a DNA polimerase faz a síntese, sua atividade de exonuclease a
5’ cliva a sonda, afastando assim o fluoróforo do quencher, permitindo então
que o primeiro emita fluorescência. Um exemplo desse sistema é o TaqMan,
um dos mais utilizados para criar reações mais específicas (Mackay et al.,
2007).
Figura 2: Representação esquemática da atividade na DNA polimerase no
sistema TaqMan. A esfera verde representa o fluoróforo e a esfera vermelha
representa o quencher (inibidor de fluorescência), aderidos à sonda hibridizada no
meio da região alvo do DNA estudado. A letra h representa a fluorescência emitida
quando a enzima exerce sua ação de 5’-exonuclease, afastando assim o fluoróforo do
quencher.
A fluorescência emitida é então detectada por sensores ajustados para
uma determinada faixa de comprimento de onda que abrange a emitida pelo
fluoróforo utilizada. Antes de iniciada a reação, o equipamento realiza a
medição da fluorescência basal, ou seja, a emissão de fluorescência pelos
componentes. Com base nessa medida é calculado um limiar, que equivale a
10 desvios-padrão da medida da fluorescência basal. Quando a fluorescência
emitida pelo acúmulo de amplicons ultrapassa esse limiar, o equipamento
registra em qual ciclo da reação isso ocorreu. Esse é o chamado CT (Threshold
Cycle) ou CP (Crosspoint), ou seja, o ciclo da reação no qual a fluorescência
ultrapassou o limite pré-determinado. Considera-se que, quanto menor é o CT,
maior é a quantidade inicial de DNA-alvo na amostra (Mackay et al., 2007).
15
Figura 3: Gráfico gerado pela detecção da emissão de fuorescência pela
formação de amplicons na presença do fluoróforo SYBR® Green. O CT, ponto a
partir do qual o equipamento considera que houve de fato amplificação, está indicado
na figura, e está representado por uma linha laranja.
Há duas maneiras de quantificar o DNA presente na amostra: a
quantificação absoluta e a quantificação relativa. A quantificação relativa é
muito usada em estudos de expressão gênica. Nesses estudos utilizam-se
iniciadores tanto para o gene cuja expressão se deseja avaliar, quanto para um
gene que reconhecidamente não altera sua expressão independentemente do
tratamento estabelecido. O RNA extraído é submetido a uma PCR de
Transcrição Reversa (RT-PCR) e em seguida é realizado um PCR a partir do
cDNA sintetizado. Os valores de CT são então comparados e o resultado é
relatado comparativamente; exemplificando seria: o gene x é expresso duas
vezes mais que o gene y no tratamento aplicado (Muska et al., 2007).
Já a quantificação absoluta é feita comparando o valor do CT obtido na
reação teste com uma curva de calibração obtida a partir dos CTs de reações
realizadas com diluições seriadas do gene alvo em concentrações conhecidas.
A curva de calibração, portanto, torna possível determinar a quantidade de
DNA na amostra analisada (Mackay et al., 2007).
Quando se utiliza sistemas de associação ao DNA, é possível ainda
realizar um controle para verificar se os amplicons gerados são realmente os
esperados, para evitar que amplificações inespecíficas sejam consideradas
como resultados. Esse controle é chamado curva de dissociação. Ao final da
reação adiciona-se um passo de elevação da temperatura (geralmente em
torno de 60 para 95o C) para que todos os amplicons gerados se dissociem,
CT
16
liberando os fluoróforos aderidos, promovendo a queda da fluorescência
emitida. Então a temperatura retorna ao valor inicial, e a fluorescência emitida
pela reassociação das duplas-fitas é medida. Esse ciclo repete-se mais uma
vez e é feita uma nova medição. De acordo com o tamanho do amplicon e seu
conteúdo G-C, haverá um pico de emissão de fluorescência provocado pela
variação de temperatura. Se houver na reação apenas um tipo de amplicon, o
pico da curva de dissociação será único, em uma determinada temperatura.
Por outro lado, se houver amplificações inespecíficas, haverá diferentes picos
de fluorescência ocorrendo em diferentes temperaturas. Isso porque as
temperaturas em que ocorrerá a dissociação e a reassociação dos amplicons
gerados depende tanto do peso molecular quanto do conteúdo G-C desses
amplicons (Fan et al., 2007; Ong et al., 2007).
Em 2004, Spier e colaboradores utilizaram a PCR em Tempo Real
(TaqMan) do gene pld para demonstrar que C. pseudotuberculosis utiliza
moscas como vetores em infecções de eqüinos no norte da Califórnia.
Portanto, o gene pld é um bom alvo de PCR para a diferenciação de C.
pseudotuberculosis de outras espécies da mesma família, especialmente C.
ulcerans, seja pelo uso de sondas específicas, como é o caso do sistema
TaqMan, ou pelo desenho de iniciadores que amplifiquem diferencialmente o
pld de uma das espécies.
Apesar de não serem conhecidos todos os detalhes do ciclo de C.
peudotuberculosis no organismo do hospedeiro, é provável que ocorra
bacteremia suficiente para a detecção por PCR em Tempo Real, pois a
disseminação da bactéria pode partir dos linfonodos externos afetados para os
órgãos internos (Gouveia, 1986) e, apesar de não se saber exatamente por
qual via ocorre essa disseminação, é possível que ela ocorra por via linfática ou
sanguínea.
O diagnóstico subclínico da LC é atualmente um dos maiores desafios
no controle da doença. Uma vez que todos os métodos diagnósticos existentes
atualmente dependem da presença de células viáveis de C. pseudotuberculosis
ou de resposta humoral contra este patógeno, o diagnóstico será sempre
tardio. Após o desenvolvimento de lesões (internas ou externas) a transmissão
pode já ter sido estabelecida, e torna-se difícil avaliar o nível de
17
comprometimento do rebanho. Outro problema é o tratamento, que após a
manifestação clínica da doença, não possui eficácia suficiente para evitar as
perdas econômicas causadas pelo desenvolvimento de lesões (Ribeiro et al.,
2001). Se diagnosticada em fase subclínica, a LC pode ser tratada em caso de
animais de alto valor zootécnico. No caso de outros animais, esses podem ser
isolados do rebanho ou abatidos antes que se desenvolvam os abscessos e
por conseqüência ocorra à disseminação da doença.
Portanto, esse trabalho se propõe a criar e padronizar um método
diagnóstico para LC em fase subclínica, em caprinos e ovinos, utilizando a
técnica de qPCR.
18
3. OBJETIVOS
19
3.1. Objetivo Geral
Desenvolver um teste diagnóstico para a linfadenite caseosa capaz de
detectar a presença do patógeno C. pseudotuberculosis em amostras
provenientes de caprinos e ovinos em fase subclínica da doença.
3.2. Objetivos Específicos
3.1.1. Selecionar a melhor metodologia de extração de DNA total de
sangue total e soro sanguíneo de caprinos e ovinos;
3.1.2. Desenvolver e padronizar uma reação de PCR em tempo real
capaz de detectar a presença de C. pseudotuberculosis a partir
do DNA extraído de amostras de sangue total e/ou soro de
caprinos e ovinos.
20
4. MATERIAIS E MÉTODOS
21
4.1. Equipamentos utilizados § Agitador magnético de soluções (TradeLab)
§ Aparato para eletroforese Horizon® 58 (Gibco BRL)
§ Balança eletrônica (Marte)
§ Banho-maria (Precision)
§ Capela química (Permution)
§ Centrífuga 5417C (Eppendorf)
§ Centrífuga refrigerada MR 23i (Jouan)
§ Espectrofotômetro (Bio-Rad)
§ Estufa incubadora (Nova Ética)
§ Fluxo laminar (Veco)
§ Forno Microondas (CCE)
§ Freezer -20ºC (Electrolux)
§ Freezer -80ºC (Sanyo)
§ Micropipetas Pipetman® (Gilson)
§ pHMETRO (Digimed)
§ Shaker incubador (Nova Ética)
§ Termociclador PTC-100 (MJ Research, Inc.)
§ Termociclador para PCR em tempo real 7500 HT (Applied Biossystems)
§ Transluminador e equipamento de fotodocumentação
§ Vortex
4.2. Reagentes e kits de biologia molecular § 1 kb Plus DNA LadderTM (Invitrogen)
§ Acetato de sódio PA (Synth)
§ Ácido Bórico PA (Cirq)
§ Ágar bacteriológico (bioBRÁS)
§ Agarose padrão (Agargen)
§ Água destilada esterilizada em autoclave
§ Água mili-Q esterilizada em autoclave
§ Álcool etílico (Merck)
§ Ampicilina (Sigma)
22
§ Azul de Bromofenol (Synth)
§ Brain Heart Infusion (Oxoid)
§ Brometo de Etídio (Eurobio)
§ Cloreto de sódio PA (Cirq)
§ EDTA PA (Ácido etilenodiaminotetraacético, Synth)
§ Etanol (Synth)
§ Extrato de levedura (Biobrás)
§ Fosfato de sódio dibásico PA (VETEC)
§ Glicerina (Synth)
§ Glicogênio (Gibco)
§ Lisozima (USB)
§ NaOH (Synth)
§ Peptona (OXOID)
§ Platinum® Taq DNA Polymerase System (Invitrogen)
§ Power SYBR® Green PCR Master Mix (Applied Biosystems)
§ RNase A (20 mg/mL, Invitrogen)
§ Sarcozil (Sigma)
§ Tris-base (Invitrogen)
§ TOPO TA Cloning ® (Invitrogen)
§ UltraPure™ Buffer-Saturated Phenol (Invitrogen)
§ Wizard® Genomic DNA Purification Kit (Promega)
§ Wizard® Plus Maxipreps DNA Purification System (Promega)
§ X-Gal (USB)
4.3. Soluções e meios de cultura
§ Acetato de Sódio (3M): Dissolver 40,82 g de acetato de sódio em q.s.p.
100 ml de água destilada. Estocar a temperatura ambiente.
§ Brometo de Etídio: Estocar a 5 mg/mL. Utilizar a 0,1-0,5 µg/mL.
Conservar ao abrigo da luz.
23
§ Glicerol (80%): Adicionar 80 mL de glicerol a 20 mL de água destilada.
Autoclavar por 20 minutos a 120 ºC.
§ Glicogênio (20 mg/ml): Adicionar 100 mg de glicogênio a 5 mL de água
destilada. Filtrar a mistura em filtro de 0,45 µm.
§ PBS 10X: Solução A (Fosfato de sódio 0,5 M): Dissolver 12 g de fosfato de
sódio em q.p.p. 500 mL de água destilada. Solução B (Fosfato dissódico
0,5M): Dissolver 35,49 g de fosfato dissódico em q.s.p. 500 mL de água
destilada. Adicionar a solução A, a solução B até a mistura atingir o pH 7,4.
Verificar o volume final, e para cada 100 mL adicionar 9 g de cloreto de
sódio. Armazenar em geladeira.
§ PBS: diluir 100 mL de PBS 10X em 900 mL de água destilada.
§ PBS com Tween 0,05% (v/v): diluir 100 mL de PBS 10X em 900 mL de
água destilada e acrescentar 0,5 mL de Tween 20.
§ Sarcosil (30%): Dissolver 30 g de sódio-N-lauroilsarcosina em q.s.p. 100
mL de água destilada. Estocar a 4ºC.
§ Tampão citrato para ELISA: Dissolver 7,1 g de fosfato dissódico anidro e
5,19 g de ácido cítrico anidro em q.s.p. 1000 mL de água destilada. Ajustar
o pH para 5,0.
§ Tampão de Amostra (5X): Glicerol a 50%; Azul de bromofenol a 0,20%; e
solvente TBE a 2,5X. Estocar a 4ºC.
§ TBE 5X (4 litros): Misturar: 216 g deTris-base; 110 g de ácido bórico; 80
mL de EDTA (0,5 M; pH 8,0) em q.s.p. 4.000 mL de água destilada;
homogeneizar e ajustar o pH (entre 8,0 e 8,5).
24
§ Tris-EDTA-lisozima (Solução II – Extração de DNA genômico):
Misturar: 1 mL de Tris-HCl (1M; pH 7,0); 2 mL de EDTA (0,5M; pH 8,0); 6
mL de NaCl (5M); e 1 g de lisozima; em q.s.p. 100 mL de água destilada.
[Concentrações finais: Tris-HCl (10mM); EDTA (10mM); NaCl (300mM);
lisozima (10 mg/mL)].
§ Caldo Infuso Cérebro-Coração (Brain Heart Infusion) e placas de BHI
ágar: 37 g de BHI sólido são adicionados em q.s.p. 1L de água destilada;
após homogeneizar, o pH da mistura é ajustado para 7,4, e o meio é então
autoclavado por 20 minutos a 120ºC. Este meio é acrescido de ágar
bacteriológico na concentração final de 1,5% para cultura em meio sólido.
§ Caldo LB (Luria-Bertani) e LB-Ágar suplementado com ampicilina e X-
Gal: Dissolver 10g de Triptona, 5 g de Cloreto de Sódio e 5 g de Extrato de
Levedura em q.s.p. 1L de água destilada; após homogeneizar, o pH da
mistura é ajustado para 7,4, e o meio é então autoclavado por 20 minutos a
120ºC. Este meio é acrescido de ágar bacteriológico na concentração final
de 1,5% para cultura em meio sólido. Para preparo de placas para seleção
azul e branca (mutantes defectivos ou não para o gene da beta-
galactosidase), prepara-se o meio LB-ágar, e após retirá-lo da autoclave,
aguarda-se o resfriamento até uma temperatura suportável ao toque. Então
se adiciona a cada litro de meio 1200 µL de X-Gal a 40mg/mL e 1000 µL
de ampicilina a 100 mg/mL.
4.4. Material Biológico
4.4.1. Linhagens bacterianas As linhagens bacterianas e os plasmídeos utilizados neste trabalho de
dissertação estão listados na Tabela 1. Os meios de cultivo utilizados foram o
LB para E. coli e o BHI para C. pseudotuberculosis. Estes meios foram
suplementados com 1,5% de ágar bacteriológico para cultura em meio sólido.
Ambas as culturas foram crescidas a 37°C sob agitação. O cultivo de E. coli foi
25
realizado em 18 horas e de C. pseudotuberculosis em 72 horas. Quando
necessário, os meios de cultura foram suplementados com ampicilina
(100µg/mL). A concentração destes foi utilizada de acordo com as
recomendações do fabricante do vetor.
Tabela 1. Linhagens bacterianas e plasmídeos utilizados neste trabalho.
Espécie Linhagem / Genótipo Fonte Escherichia coli TOP10/ hsdR; mcrA; lacZ_M15; endA1; recA1 Invitrogen Corynebacterium pseudotuberculosis a
Linhagem 1002 UFBA
Plasmídeos Características Fonte pCR®2.1-TOPO® Vetor de clonagem/Amr-Kmr/pUC ORI Invitrogen pCR®2.1-TOPO®:pld Vetor de clonagem pCR®2.1-TOPO®
contendo o fragmento da ORF pld (70 pb) de C. pseudotuberculosis
Este trabalho
pCR®2.1-TOPO®:12s rRNA
Vetor de clonagem pCR®2.1-TOPO®
contendo o fragmento da ORF 12SrRNA (200 pb) de Capra hircus
Este trabalho
a: linhagem atenuada de C. pseudotuberculosis biovar ovis pertencente à coleção de microorganismos do Instituto de Ciências da Saúde da Universidade Federal da Bahia (UFBA), Brasil. Amr: resistência à ampicilina; Kmr: resistência à canamicina.
4.4.2. Amostras clínicas O sangue total utilizado neste estudo foi obtido de 7 propriedades rurais
localizadas no município de Araçatuba – SP, dos quais 87 amostras de
caprinos e 118 de ovinos foram coletadas. Este sangue foi coletado em sistema
Vacutainer e conservado a -20°C.
4.5. Manipulação do DNA
Todos os protocolos de manipulação de DNA, de qualquer origem, foram
realizados de acordo com métodos pré-estabelecidos (Sambrook et al., 1989),
com modificações quando necessárias. A qualidade do material obtido após a
manipulação do DNA, incluindo sua concentração e pureza, foi estimada após
26
leitura espectrofotométrica nos comprimentos de onda de 260 e 280nm, além
de resolução eletroforética em gel de agarose. Todo o DNA obtido nesse
trabalho foi conservado a -20°C.
4.6. Resolução eletroforética Para a avaliação da qualidade do DNA (genômico ou plasmidial) através
de resolução eletroforética, os mesmos formam acrescidos de 1:5 do volume
de tampão de amostra (item 4.3.1) e fracionados em gel de agarose de 1 a 2%
em tampão TBE 1X (item 4.3.1), contendo brometo de etídio (0,5 µg/mL). As
corridas foram realizadas a 100 V durante um período de tempo relativo à
dimensão do gel. O DNA foi visualizado e o gel fotografado sobre um
transluminador de luz ultravioleta (320 nm) através do sistema de
documentação fotográfica Multidoc-it Digital Imaging System (UVP). O tamanho
dos fragmentos foi estimado comparando-se ao marcador de peso molecular
usado 1 Kb DNA Ladder e/ou 1 Kb Plus DNA Ladder (Invitrogen).
4.7. Padronização do ensaio de PCR em tempo real
4.7.1. Desenho de iniciadores e condições de PCR Os iniciadores foram primeiramente testados usando PCR convencional,
para posteriormente iniciar os testes em PCR em tempo real. Os iniciadores
foram desenhados utilizando o software Primer-Blast do NCBI
(www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/); exceto o iniciador anti-senso para o
gene pld, que foi o mesmo utilizado por Pacheco et al. 2007. Para o iniciador
senso do gene pld de C. pseudotuberculosis foi utilizado como molde a
sequência do gene depositada no GenBank (número de acesso L16587) e para
o gene mitocondrial 12SrRNA de Capra hircus e Ovis aries, foram utilizadas as
sequências depositadas no mesmo banco de dados (números de acesso
AJ490504 e AJ490503, respectivamente). Os iniciadores utilizados para PCR
multiplex (Pacheco et al., 2007) que possuem como alvo os mesmos genes,
27
foram utilizados na fase de testes dos iniciadores desenhados, como parâmetro
de comparação. As sequências obtidas encontram-se na tabela a seguir:
Tabela 2: Iniciadores utilizados nesse trabalho.
Iniciador Sequência Gene-alvo Amplicon (pb) Fonte
PLDF2 5’- GGGTTCGAGTTCTCTATGGG -3’ pld 70
Esse trabalho
PLDR2 5’- ATCAGCGGTGATTGTCTTCCAGG -3’ pld Pacheco et al., 2006
12SrRNAF2
5’- CGAAACTCAAAGGACTTGGC -3’
12SrRNA 200
Esse trabalho
12SrRNAR2
5’- TTCCATTCCATGGGTTACAC -3’
12SrRNA Esse trabalho
PLDF 5’- ATAAGCGTAAGCAGGGAGCA-3’ pld 203
Pacheco et al., 2006
PLDR2 5’- ATCAGCGGTGATTGTCTTCCAGG -3’ pld Pacheco et al., 2006
12SrRNAF
5’- CCAGCCACCGCGGTCATACG-3’
12SrRNA 274
Pacheco et al., 2006
12SrRNAR
5’- TGAGTTTCGGGCTGTTGCCG-3’
12SrRNA Pacheco et al., 2006
Estes iniciadores foram testados utilizando amostras de DNA genômico
extraído de amostras de cultura de C. pseudotuberculosis da linhagem 1002, e
de sangue total de C. hircus pelo método Precellys / Fenol-Clorofórmio. Foram
testadas duas temperaturas de anelamento diferentes. Os ciclos de
temperatura testados estão listados na tabela a seguir:
Tabela 3: Ciclos de temperatura utilizados nos testes dos iniciadores.
Etapa da reação
de PCR
Subetapa da
reação de qPCR Temperatura Tempo
Desnaturação
inicial - 95 ºC 2 min
Estágio cíclico
(29 repetições)
Desnaturação 95 ºC 1 min
Anelamento 58 / 60 ºC1 40 s
Extensão 72 ºC 40 s
Extensão final - 72 ºC 7 min
1 – Temperaturas de anelamento testadas para os iniciadores.
28
Tabela 4: Concentrações dos reagentes utilizados nas reações de PCR.
Reagente Concentração
do estoque
Concentração
de trabalho
Concentração
final na reação
Volume por
reação
Tampão Taq DNA
polymerase
(phoneutria)
10 X 10 X 1X 2,0 µL
Taq DNA polimerase 5 U/ µL 5 U/ µL 0,1 U/ µL 0,4 µL
Iniciador senso 100 pmol/ µL 100 pmol/ µL 1 pmol/ µL 0,2 µL
Iniciador anti-senso 100 pmol/ µL 100 pmol/ µL 1 pmol/ µL 0,2 µL
Amostra de DNA Resultante das
extrações
Resultante das
extrações
-
1,0 µL
dNTPs 10 mM 10 mM 0,2 mM 0,4 µL
MgCl2 50 mM 50 mM 2,5 mM 1 µL
Água milliQ - - - 14,8 µL
4.7.2. Clonagem dos produtos de PCR amplificados para realização
da curva de calibração
4.7.2.1. Extração de DNA genômico Para a extração de DNA genômico de C. pseutoduberculosis, uma
amostra da linhagem 1002 congelada foi retirada com auxílio de uma alça
descartável estéril, e inoculada 15 ml em caldo BHI em um tubo Falcon de 50
ml de capacidade. Esse tubo foi incubado a 37ºC sob agitação de 150 rpm por
48 horas, e após esse período foi centrifugado por 20 min a 5000 rpm. O
sobrenadante foi então descartado, e o depósito ressuspendido em 1 ml de
solução II de extração. Esse material foi então transferido para um tubo de
precellys e este foi submetido a 2 pulsos de 15 s a 6500 rpm, com um intervalo
de 30 s entre esses pulsos. Após esse processo, foi realizada a purificação do
DNA conforme citado no item 4.10.2.
Para extração do DNA genômico de C. hircus, procedeu-se exatamente
como consta no item 4.10.2.
29
4.7.2.2. Amplificação dos produtos para clonagem O DNA extraído foi submetido à reação de PCR para amplificação dos
fragmentos dos genes pld de C. pseudotuberculosis (70 pb) e 12SrRNA
mitocondrial de C. hircus (200 pb). A amplificação ocorreu nas condições
descritas na seção 4.7.1.
4.7.2.3. Purificação dos amplicons
Após a resolução eletroforética, todo o volume da reação foi aplicado em
gel de agarose de 1% e os amplicons correspondentes aos fragmentos dos
genes pld de C. pseudotuberculosis (70 pb) e 12SrRNA mitocondrial de C.
hircus (200 pb) foram recuperados e purificados do gel de acordo com o
protocolo do kit comercial illustra™ GFX™ PCR DNA and Gel Band Purification
Kit (GE-Healthcare).
4.7.2.4. Clonagem dos produtos de amplificação
Os fragmentos assim amplificados foram clonados no sistema TOPO T-
A®, de acordo com as instruções do fabricante. As reações de ligação dos
produtos de PCR no vetor foram realizadas utilizando os componentes e suas
respectivas quantidades mostradas na tabela a seguir:
Tabela 5: Reação de ligação dos insertos ao vetor.
Componente Volume
Produto de PCR 4,0 µL
Solução salina
(fornecida) diluída 1:4 1,0 µL
Vetor TOPO 1,0 µL
30
Após a adição desses componentes, o material foi incubado à
temperatura ambiente por 30 minutos e imediatamente se procedeu à
transformação de células de E. coli eletrocompetentes.
4.7.2.5. Transformação bacteriana
4.7.2.5.1. Preparo de E. coli eletrocompetente Uma colônia de E. coli foi inoculada em 5 mL de meio LB e incubada a
37°C durante 18 horas sob agitação de 150 rpm. Uma alíquota (5 mL) desta
cultura foi então inoculada em 200 mL de LB e incubada a 37°C sob agitação
até atingir absorbância (OD600nm) de 0,3. Uma vez alcançado este valor, a
cultura foi dividida em 5 tubos de 50 mL com volumes iguais e deixadas no gelo
por 30 min. Depois deste período foram realizadas três centrifugações de
5.000 rpm durante 20 min a 4°C, em que o sobrenadante foi descartado e o
precipitado ressuspendido em solução de glicerol 10% estéril no volume de 40,
30 e 10 mL, respectivamente. Após a última lavagem, as bactérias foram
ressuspendidas em 1 mL de solução glicerol 10%. Esse 1 mL foi dividido em
alíquotas de 100 µL que foram estocadas a -80°C. As cinco linhagens foram
preparadas em dias diferentes.
Para análise da eficiência de transformação, uma alíquota com células
eletrocompetentes estocadas foi colocada no gelo durante 5 minutos. Em
seguida adicionou-se 10 ng/µL do plasmídeo pUC18 (controle positivo). Como
controle negativo, foi utilizado apenas uma alíquota de células, às quais
nenhum DNA foi adicionado. Ambas as amostras foram transferidas para
cubetas de eletroporação, previamente resfriadas e foram submetidas a um
pulso de 2.5 V, capacitância 25 µFD e resistência de 200 OHMS utilizando um
eletroporador CelljecTUno (Thermo Electro Corporation). Imediatamente após o
pulso, foi adicionado 1 mL de meio LB às células e estas foram incubadas à
37º C por uma hora. Diluições de 10-1, 10-2, 10-3 foram semeadas em meio LB
ágar suplementado com ampicilina (100 µg/ml) e incubadas a 37°C durante 18
horas. A eficiência de transformação obtida foi de ∼ 8 x 107 UFC por
micrograma de DNA.
31
4.7.2.5.2. Transformação de E. coli
Os produtos de ligação (inserto e vetor TOPO) foram utilizados para
transformar células eletrocompetentes de E. coli preparadas de acordo com o
protocolo descrito no item 4.7.4.1. A transformação foi conduzida por
eletroporação seguindo os mesmos parâmetros descritos no item 4.7.4.1. Para
tanto, uma alíquota de 5 µL do produto de ligação foi adicionado a 100 µL de
células eletrocompetentes e incubado no gelo por 10 minutos. No tratamento
“controle negativo”, 1 µL de água estéril foram adicionados às células no lugar
dos plasmídeos. Imediatamente após o pulso, foi adicionado a cada cubeta 900
µL de meio LB, sem antibiótico, para cada alíquota de células transformadas e
estas foram incubadas a 37°C por 1 h. Diluições de 10-4, 10-5 e 10-6 foram
semeadas em meio LB ágar suplementado com ampicilina (100µg/mL) e X-Gal
(µg/mL) 64 incubadas a 37°C durante 18 h. Após este período as placas foram
avaliadas quanto à presença de colônias recombinantes.
4.7.3. Extração do DNA plasmidiano de E. coli em pequena escala
Clones selecionados aleatoriamente foram inoculados em 5,0 mL de
meio LB suplementado com 100µg/mL de ampicilina. As culturas foram
mantidas a 37°C por aproximadamente 18 horas sob agitação de 150 rpm. Foi
feito uma cultura estoque em glicerol (1 mL da cultura + 1mL de glicerol 80%)
de cada clone e estes foram armazenados a -80°C. Em seguida, foi realizada a
extração dos plasmídeos (minipreparação) utilizando o Kit comercial WizardTM
Plus Minipreps DNA Purification System (Promega) segundo as
recomendações do fabricante.
4.8. Testes de eficiência de iniciadores
4.8.1. Diluições seriadas
O material obtido a partir da extração de DNA plasmidial dos clones teve
sua concentração determinada em espectrofotômetro no comprimento de onda
de 260 nm. A concentração inicial foi ajustada para 10 ng/µL, e a partir desse
32
tubo, foram realizadas diluições seriadas de 10 em 10, até a concentração de
10 fg/µL. Estas amostras foram usadas em reações de PCR em tempo real,
para testar a eficiência de amplificação dos primers.
4.8.2. Parâmetros do PCR em tempo real
A reação de PCR em tempo real foi realizada de acordo com as
concentrações e ciclo de temperatura a seguir.
Tabela 6: Concentrações dos componentes da reação de PCR em tempo
real.
Reagente Concentração
do estoque
Concentração
de trabalho
Concentração
final na reação
Volume por
reação
Master Mix (Applied
Biosystems) 2X 2X 1X 10 µL
Iniciador senso 100 pmol/ µL 2,5 pmol/ µL 0,125 pmol/ µL 1,0 µL
Iniciador anti-senso 100 pmol/ µL 2,5 pmol/ µL 0,125 pmol/ µL 1,0 µL
Amostra de DNA
De acordo
com a diluição
utilizada
De acordo com
a diluição
utilizada
-
1,0 µL (ausente
para N.T.C.1)
H2O mili-Q estéril - - - q.s.p. 20 µL
1. Reações N.T.C. foram realizadas para verificação de ausência de amplificação quando a
amostra de DNA é substituída por água Mili-Q estéril.
33
Tabela 7: Ciclo de temperaturas utilizadas no PCR em tempo real.
Etapa da reação
de qPCR
Subetapa da
reação de qPCR Temperatura Tempo
Desnaturação
inicial - 95 ºC 2 min
Estágio cíclico
(40 repetições) Desnaturação 95 ºC 1 min
Anelamento e
extensão de
iniciadores
60 ºC 1 min e 20 s
Análise de
dissociação
contínua1
Desnaturação 95 ºC 15 s
Renaturação 60 ºC 1 min
Desnaturação 95ºC 30 s
4.8.3. Cálculo da eficiência de amplificação dos iniciadores
Basicamente, as reações foram realizadas como descrito no ítem 4.8.2,
sendo preparadas 5 réplicas para cada uma das cinco diluições das amostras
de DNA. Os Cts obtidos para cada gene foram submetidos à regressão linear,
sendo calculados os coeficientes de correlação entre os pontos e a reta plotada
para validação da regressão, com o emprego do software GraphPad Prism v
5.0. A partir dos Cts obtidos também foi possível calcular (com uso da equação
ENx = Nx / N0,x) os valores de eficiência de amplificação para cada par de
iniciadores utilizados (Rasmussen, 2001).
4.9. Realizações das misturas artificiais
Para que fosse possível determinar qual o melhor método de extração
de DNA das amostras clínicas, foi necessário simular, in vitro, uma situação de
bacteremia discreta. Em outras palavras, amostras com a presença de
bactérias em quantidades inferior a 50 UFC/mL. Um método capaz de extrair
34
tanto DNA bacteriano quanto do hospedeiro, permite que ocorra amplificação
tanto da região alvo (bacteriana) quanto do hospedeiro (controle endógeno de
amplificação), podendo assim ser considerado um bom método de extração.
Para alcançar este objetivo, foram selecionadas amostras provenientes
de animais saudáveis, confirmadas por um teste negativo para ELISA. O local
escolhido para coleta de sangue destes animais foi a Fazenda da Escola de
Veterinária da UFMG, no município de Pedro Leopoldo – MG. Às amostras
foram adicionadas a culturas de C. pseudotuberculosis que continham valores
conhecidos de UFC. As extrações foram, portanto, testadas a partir destas,
assim chamadas, misturas artificiais (MAs).
4.9.1. Cultivo e diluições de C. pseudotuberculosis Experimentos realizados por nossa equipe demonstram que o número
de UFC de C. pseudotuberculosis em cultura na D.O.600nm=0,2, apresenta entre
3,0 a 4,0 x 107 UFC por mL (Pacheco et al., 2009). Portanto, decidiu-se por
realizar as diluições a partir dessa D.O.
Foi retirado um tubo da bacterioteca contendo a cepa 1002 selvagem de
Corynebacterium pseudotuberculosis congelada em glicerol a 80%. Após
descongelamento da amostra, foram retirados 10 µL utilizando uma alça
descartável estéril, e o material foi esgotado em uma placa de petri contendo
meio BHI-ágar. Esta placa foi incubada em estufa a 37°C por 72 horas. Após
esse tempo de crescimento, foi retirada uma colônia isolada e inoculada em um
tubo cônico de 50 mL de capacidade contendo 15 mL de caldo BHI com Tween
80 (0,05%), e submetido à agitação de 150 rpm, à temperatura de 37º C em um
agitador por 48 horas (pré - inóculo). Após esse período de crescimento, 4 mL
do pré-inóculo foram inoculados em 250 mL de caldo BHI em um frasco de 500
mL de capacidade (inóculo), e este foi submetido às mesmas condições de
cultivo do pré-inóculo.
O frasco foi retirado do agitador a cada 30 minutos, sendo aberto em
uma capela de fluxo laminar para a retirada de 1 mL da cultura para medida de
D.O. a 600 nm (zerando o espectrofotômetro com caldo BHI estéril). Ao atingir
a D.O. 0,2, o frasco foi retirado do agitador e colocado no gelo para interrupção
do crescimento bacteriano.
35
Os 100 µL de cultura destinados ao plaqueamento foram submetidos a
diluições seriadas em 4 tubos cônicos (eppendorf) com 900 µL de caldo BHI,
até atingir a diluição 10-6. Da diluição de 10-5 e 10-6 foram retirados 200 µL, 100
para cada placa de BHI-ágar. Após o plaqueamento, as placas foram
incubadas em estufa a 37º C por 72 horas e o número de colônias
determinado, calculando-se a média aritmética simples das duas placas e
multiplicando os resultados, respectivamente, por 106 e 107 para converter o
resultado em UFC/mL. O esquema descrito está representado na figura abaixo.
Figura 4: Esquema de diluição do cultivo de C. pseudotuberculosis linhagem
1002 para a realização de misturas artificiais.
4.9.2. Misturas artificiais As misturas artificiais foram realizadas utilizando amostras de sangue
total e soro. O crescimento e diluições foram realizados conforme citado no
ítem 4.9.1. Foram adicionados 100 µL para cada 1 mL de sangue total e de
soro. Também foram plaqueadas em triplicata, cada uma destas diluições (100
µL para cada placa), e as colônias foram contadas após 72 h de incubação a
37ºC. As misturas artificiais foram congeladas a -20ºC até o momento do uso.
Diluição de 4 ml do pré-inóculo em 250 ml e caldo BHI
36
4.10. Técnicas de extração de DNA testadas
A partir das misturas artificiais, quatro técnicas diferentes foram testadas
para a extração de DNA.
4.10.1. PK-Sarcosil / Fenol-Clorofórmio
As amostras foram descongeladas em banho-maria à temperatura
ambiente. Foi transferido 1 mL para um tubo eppendorf de 1,5 mL, e este foi
centrifugado a 5000 rpm por 10 minutos, retirando o sobrenadante. O depósito
for ressuspendido em 1 mL de solução II, e incubado em banho-maria a 37ºC
por 1 hora. Então, adicionou-se 20 µL de proteinase K (20 mg/mL), incubando-
se em banho-maria a 56ºC por 2 horas. Após a incubação, o material foi
separado em 2 a 3 alíquotas de aproximadamente 500 µL e acrescentou-se 25
µL de sarcosil a 30% a cada alíquota. O material foi então homogeneizar por
inversão durante 15 minutos e incubado em banho-maria a 65ºC por 5 minutos.
Os tubos foram então incubados a -20 ºC (choque-térmico) por 5 minutos
(freezer). Adicionou-se 1,0 mL de fenol (25): clorofórmio (24): álcool isoamílico
(1) a esse material. Homogeneizou-se em vórtex e centrifugou-se a 13.000 rpm
por 7 minutos. A fase superior foi retirada e transferida para um tubo eppendorf
novo. A esse material foi adicionado 1,0 mL da solução de fenol (25):
clorofórmio (24): álcool isoamílico (1), e o mesmo foi homogeneizado em vórtex
e centrifugado a 13.000 rpm por 7 minutos; retirou-se a fase superior e esta foi
transferida para um tubo eppendorf novo. Etanol absoluto foi adicionado em
quantidade equivalente a duas vezes o volume do material transferido no passo
anterior. Acrescentou-se ainda acetato de sódio a 3M em quantidade
equivalente a 10%, e glicogênio em quantidade equivalente a 1% do volume
transferido no passo anterior. Essa mistura foi incubada a -20ºC overnight.
Após esse período, centrifugou-se o material a 13.000 rpm por 10 minutos e o
depósito foi lavado com 1,0 mL de etanol a 70% gelado. Então o material foi
centrifugado a 13.000 rpm por 20 minutos, e o sobrenadante descartado
invertendo-o sobre um papel absorvente, e posteriormente foi realizada a
secagem em tubo aberto a 60ºC (estufa de secagem) por aproximadamente 1
hora. O material foi então ressuspendido em 30 µL de água milliQ estéril.
37
4.10.2. Pre-Cellys / Fenol-Clorofórmio Adicionou-de 500 µL de PBS 1X a 500 µL de amostra (sangue total ou
soro) em um tubo de Precellys. Esse tubo foi submetido a dois pulsos de a
6500 rpm por 15 segundos, com intervalo de 30 segundos entre eles, no
equipamento Precellys. Após esse processo, adicionou-se 1000 µL de
Fenol:Clorofórmio:Álcool Isoamílico, e esse material foi homogeneizado no
vórtex por 30 segundos. Então o material foi centrifugado por 15 minutos a
13000 rpm, e o sobrenadante foi transferido para um tubo novo. A esse tubo
foram adicionados mais 1000 µL de Fenol:Clorofórmio:Álcool Isoamílico. Após
homogeneizar em vórtex por 5 segundos, esse tubo foi submetido à
centrifugação de 13000 rpm por 15 segundos e a fase superior foi transferida
para um tubo novo. A esse material adicionou-se 1 mL de clorofórmio, e após
homogeneizar em vórtex, centrifugou-se novamente o material a 13000 rpm por
10 minutos, e a fase superior foi transferida para um novo tubo. A seguir, foi
adicionado o dobro do volume desse material transferido de álcool absoluto, 10
% do volume de Acetato de Sódio a 1 M, e 1 % do volume de Glicogênio a 20
mg/mL. Essa mistura foi estocada em freezer a - 20ºC overnight para promover
a precipitação do DNA. Após esse período, a mistura foi centrifugada a 13000
rpm por 10 minutos e o sobrenadante foi desprezado. A seguir, adicionou-se 1
mL de álcool 70% gelado, e após rápida homogeneização em vórtex,
centrifugou-de o material por 20 minutos a 13000 rpm. Então desprezou-de o
sobrenadante e o pellet foi incubado a 60ºC por 40 minutos para evaporação
do álcool. Após a secagem, o material foi ressuspendido em 30 µL de água
milliQ estéril e estocado em freezer a – 20ºC.
4.10.3. Kit Nucleo Spin Tissue® (Machery-Nagel) A extração foi realizada conforme recomendações do fabricante. As
amostras (MAs) de sangue total foram descongeladas em banho-maria à
temperatura ambiente e homogeneizadas em vortex e foi utilizado 1 mL de
amostra para a extração.
38
4.10.4. Kit Nucleo Spin Plasma® (Machery-Nagel) A extração foi realizada conforme recomendações do fabricante. As
amostras (MAs) de soro foram descongeladas em banho-maria à temperatura
ambiente e homogeneizadas em vortex e foi utilizado 1 mL de amostra para a
extração.
4.11. PCR em tempo real das extrações de misturas artificiais
4.11.1. PCR das extrações de misturas artificiais para escolha do
método de extração
As reações foram realizadas sob as mesmas condições utilizadas para o
teste dos iniciadores (ítem 4.7.1), utilizando como molde o DNA extraído das
misturas artificiais pelos diferentes métodos testados.
4.11.2. PCR em tempo real para misturas artificiais
As reações foram realizadas sob as mesmas condições utilizadas para o
teste de eficiência de amplificação dos iniciadores (ítem 4.8.2), utilizando como
molde o DNA obtido das misturas artificiais pelo método de extração de DNA
escolhido.
4.12. Ensaio sorológico das amostras clínicas
Foram testadas por ELISA indireto todas as amostras coletadas, sendo
87 amostras de caprinos e 267 amostras de ovinos. Como controles positivo e
39
negativo, foram utilizados soros coletados em 2007 para um trabalho
epidemiológico, e com os maiores e menores valores de absorbância para
ELISA, respectivamente. Os testes ELISA foram processados como descrito a
seguir:
4.12.1. Coleta de amostras e conservação
As amostras biológicas foram coletadas por uma veterinária auxiliada
por técnicos em zootecnia, em propriedades rurais de criação de caprinos e
ovinos no município de Araçatuba, estado de São Paulo. Os proprietários foram
devidamente informados a respeito dos objetivos aos quais se destinavam as
amostras coletadas, e assinaram um documento concordando com a coleta de
sangue dos animais. O sangue foi coletado em sistema Vacutainer, sendo 1
tubo contendo EDTA como anticoagulante e 1 tubo sem anticoagulante. As
amostras coletadas em EDTA foram inicialmente refrigeradas em campo, e
posteriormente congeladas a -20ºC em laboratório. As amostras coletadas sem
anticoagulante foram inicialmente refrigeradas em campo e posteriormente
submetidas à centrifugação à temperatura ambiente a 3000 RPM por 5
minutos. O soro (sobrenadante) foi então separado e aliquotado em tubos
cônicos (eppendorf) com capacidade para 1,5 mL cada, e então congelados a -
20ºC. Esse material foi transportado sob refrigeração para Belo Horizonte,
Minas Gerais, onde as amostras foram finalmente processadas.
4.12.2. ELISA Indireto
As placas foram sensibilizadas 100 µL (por poço) de sobrenadante de
cultura de Corynebacterium pseudotuberculosis linhagem MIC-6, a 4ºC por 12
h. Após a sensibilização, placas foram lavadas 3 vezes com PBS 1X com
Tween (PBS-T), invertendo as placas a cada lavagem e pressionando-as sobre
uma superfície de papel-toalha para retirar o excesso. Após esse processo,
foram adicionados 100 µL do soro a ser testado, diluído 1:100 em PBS-T. As
placas foram incubadas a 37ºC por 1 hora. Após a incubação, foram repetidas
as 3 lavagens exatamente como no passo anterior. Foram então acrescentados
40
100 µL do conjugado (anti-ovino ou anti-caprino, dependendo do soro a ser
testado) marcado com peroxidase, diluído 1:4000 em PBS-T. As placas foram
incubadas à temperatura ambiente por 1 hora. Após a incubação, o passo das
3 lavagens com PBS-T foi repetido. Adicionou-se então 75 µL de uma solução
contendo (25 mL de tampão citrato, 5 mg de OPD e 5 de peróxido de
Hidrogênio). As placas foram incubadas no escuro, à temperatura ambiente por
15 minutos. A reação foi interrompida com 25 µL de ácido sulfúrico a 4N. A
leitura da absorbância foi realizada em um comprimento de onda de 492 nm. O
limite de corte é 0,350, portanto valores maiores ou iguais a este foram
considerados soros positivos.
41
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES
42
5.1. Desenho e teste de iniciadores
Os iniciadores desenhados foram comparados com iniciadores pré-
existentes utilizados na reação multiplex, que possuem como alvo os mesmos
genes.
Figura 5: PCR com dois pares diferentes de iniciadores para o pld e o 12SrRNA
utilizando a temperatura de anelamento de 58 ºC, em gel de agarose a 2%. 1 -
Padrão de peso molecular: 1kb plus DNA ladder (Invitrogen); 2 - Padrão de peso
molecular: Generuller 1kb plus (Fermentas); 3 – 12SrRNA (274 pb) Iniciadores
multiplex; 4 – pld (203 pb), iniciadores multiplex; 5 - 12SrRNA (200 pb), iniciadores
novos; 6 – pld (70 pb), iniciadores novos; 7 – Controle negativo para 12SrRNA e pld ,
iniciadores multiplex; 8 – Controle negativo para 12SrRNA e pld,, iniciadores novos.
O padrão de peso molecular Generuller 1kb plus (Fermentas), foi
utilizado por possuir uma banda de 75 pb, para demonstrar com mais precisão
o peso molecular do amplicon do pld. Foram observadas amplificações
inespecíficas, principalmente para os iniciadores novos. Portanto, foi realizada
uma nova reação alterando-se o ciclo de anelamento dos iniciadores de 58
para 60 ºC, com o intuito de aumentar a especificidade da reação.
1 2 3 4 5 6 7 8
75 pb
200 pb
300 pb
43
Figura 6: PCR para o pld e o 12SrRNA utilizando a temperatura de anelamento de
60 ºC, em gel de agarose a 2%. 1 - Padrão de peso molecular: Generuller 1kb plus
(Fermentas); 2 – 12SrRNA (200 pb), iniciadores novos; 3 – pld (70 pb), iniciadores
novos; 4 - Controle negativo para 12SrRNA e pld,, iniciadores novos.
Conforme observado, o aumento da temperatura de anelamento dos
iniciadores aumentou a especificidade da reação. Essa modificação, além de
aumentar essa especificidade, otimizou os iniciadores para uso em PCR em
tempo real. Isto porque utiliza-se um único ciclo de temperatura para
anelamento e extensão no PCR em tempo real, além de a atividade ótima da
Taq DNA polimerase utilizada ser de 60ºC. Portanto, isso aumenta a
probabilidade de os iniciadores funcionarem bem quando forem utilizados nesta
reação.
75 pb
200 pb
44
5.2. Clonagem dos alvos dos genes 12S e PLD
Após a transformação bacteriana e a incubação das placas, 4 possíveis
clones recombinantes para o gene pld e 9 para o gene 12SrRNA foram
selecionados aleatoriamente para extração do DNA plasmidial. Todos os
clones foram confirmados por PCR.
Figura 7: PCR do produto de extração plasmidial para o fragmento de 70 pb do
gene pld para confirmação dos clones. 1 - Padrão de peso molecular: Generuller
1kb plus (Fermentas); 2 - Clone 3; 3 - Clone 4; 4 - Clone 5; 5 - Clone 6; 6 – Controle
positivo (DNA genômico de C. pseudotubersulosis linhagem 1002); 7 – Controle
negativo.
1 2 3 4 5 6 7
75 pb
45
Figura 8: PCR do produto de extração plasmidial para o fragmento de 200 pb do
gene 12SrRNA pld para confirmação dos clones. 1 - Padrão de peso molecular: 1
kb plus DNA ladder (Invitrogen); 2 - Clone 1; 3 - Clone 2; 4 - Clone 3; 5 - Clone 4; 6 –
Clone 6; 7 – Clone 7; 8 - Clone 8; 9 – Clone 15; 10 – Clone 16; 11 – Controle positivo
(DNA genômico de C. hircus); 12 – Controle negativo.
5.3. Teste de eficiência de amplificação dos iniciadores
Para determinação da eficiência de amplificação dos iniciadores
utilizados foi necessária realização de diluições seriadas dos plasmídeos
contendo as regiões relativas aos genes pld e 12SrRNA clonados.
As diluições foram utilizadas como molde para a reação de PCR em
tempo real de acordo com as condições descritas do item 4.9.1. Os CTs obtidos
foram utilizados para calcular a eficiência de amplificação dos iniciadores
(Rasmussen, 2001). Como pode ser observado nas Figuras 5 e 6, foram
calculadas as eficiências de 1,02 para os iniciadores do gene 12SrRNA e de
1,01 para os iniciadores do gene pld.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
200 pb
46
Figura 9: Curva de eficiência de amplificação para os iniciadores do gene
12SrRNA. Tréplicas de diluições seriadas nas concentrações de 10ng, 1ng,
100pg, 10pg e 1pg.
47
Figura 10: Curva de eficiência de amplificação para os iniciadores do
gene pld. Tréplicas de diluições seriadas nas concentrações de 10ng, 1ng,
100pg, 10pg, 1pg, 100fg e 10fg.
48
5.4. Misturas artificiais
O número de UFC contadas após a incubação das diluições de cultura
de C. pseudotuberculosis utilizadas para as misturas artificiais estão expressas
na tabela abaixo:
Tabela 8: Diluições a partir da D.O.600nm=0,2 adicionadas às Mas.
Diluição 10-5 Diluição 10-6
U.F.C./100µL
286 45
199 07
165 21
Média 217 24
5.5. PCR das extrações de misturas artificiais para escolha do método de
extração
O PCR das extrações de misturas artificiais demonstrou que o melhor
método de extração é o Precellys/Fenol-Clorofórmio, como mostra a Figura 7.
Nesta figura é possível observar que, com esse método, houve a formação de
bandas mais bem definidas (portanto com maior especificidade), e mais
intensas (maior concentração). Isso ocorre tanto para o gene pld quanto para o
12SrRNA.
49
Figura 11: PCR dos genes pld e 12SrRNA para escolha do método de extração a
ser utilizado. A área delimitada corresponde ao método de extração escolhido. A
parte superior do gel contém as amplificações utilizando os iniciadores
específicos para o gene. A parte inferior contém as dos iniciadores para o gene
12SrRNA. A técnica de extração de escolha tem seus resultados marcados em
vermelho. 1 - Padrão de peso molecular: Generuller 1kb plus (Fermentas); 2 – Kit MN
/ Soro / 10-5 pld; 3 - Kit MN / Soro / 10-6 pld; 4 - Kit MN / Sangue total / 10-5 pld; 5 - Kit
MN / Sangue total / 10-6 pld; 6 – PK Sarcosil/ Fenol-Clorofórmio / Soro / 10-5 pld; 7 –
PK Sarcosil/ Fenol-Clorofórmio / Soro / 10-6 pld; 8 – PK Sarcosil/ Fenol-Clorofórmio /
Sangue total / 10-5 pld; 9 – PK Sarcosil/ Fenol-Clorofórmio / Sangue total / 10-6 pld; 10
– Precellys/Fenol-Clorofórmio / Soro / 10-5 pld; 11 – Precellys/Fenol-Clorofórmio / Soro
/ 10-6 pld; 12 - Precellys/Fenol-Clorofórmio / Sangue total / 10-5 pld; 13 –
Precellys/Fenol-Clorofórmio / Sangue total / 10-6 pld; 14 – Controle positivo (DNA
genômico de C. pseudotubersulosis linhagem 1002); 15 – Controle negativo pld; 16 -
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30
75 pb
200 pb
50
Padrão de peso molecular: 1 kb plus DNA ladder (Invitrogen); 17 – Kit MN / Soro / 10-5
12SrRNA; 18 – Kit MN / Soro / 10-6 12SrRNA; 19 – Kit MN / Sangue total / 10-5
12SrRNA; 20 – Kit MN / Sangue total / 10-6 12SrRNA; 21– PK Sarcosil/ Fenol-
Clorofórmio / Soro / 10-5 12SrRNA; 22– PK Sarcosil/ Fenol-Clorofórmio / Soro / 10-6
12SrRNA; 23– PK Sarcosil/ Fenol-Clorofórmio / Sangue total / 10-5 12SrRNA; 24– PK
Sarcosil/ Fenol-Clorofórmio / Sangue total / 10-6 12SrRNA; 25 – Precellys/Fenol-
Clorofórmio / Soro / 10-5 12SrRNA; 26 – Precellys/Fenol-Clorofórmio / Soro / 10-6
12SrRNA; 27 – Precellys/Fenol-Clorofórmio / Sangue total / 10-5 12SrRNA; 28 –
Precellys/Fenol-Clorofórmio / Sangue total / 10-6 12SrRNA; 29 – Controle positivo
(DNA genômico de C. hircus); 30 – Controle negativo 12SrRNA.
O método de extração por Precellys/Fenol-Clorofórmio foi o que permitiu
a melhor amplificação, tanto do pld quanto do 12SrRNA. Além disso, é o
método de mais rápida execução. Portanto, esse foi o método escolhido para
uso nas reações de PCR em tempo real.
5.6. PCR em tempo real das misturas artificiais
As reações de PCR em tempo real foram realizadas utilizando como
controle positivo a diluição contendo 1 ng/µL de pld::TOPO (alvo) e do
12SrRNA::TOPO (controle interno de amplificação). De acordo com as Figuras
8 e 9 foi observado que é possível amplificar os genes pld e 12SrRNA a partir
do DNA obtido pela extração do DNA total das MAs.
51
Figura 12: Gráfico da amplificação do gene 12SrRNA das misturas artificiais com
soro e sangue total. 1 - 12SrRNA::TOPO: CT médio=17,2; 2- MAs de Sangue total
com as diluição de cultura a 10-5 e a 10-6: CT médio=23,7; 3 - MAs de Soro com as
diluição de cultura a 10-5 e a 10-6 : CT médio=29,1.
Figura 13: Gráfico da amplificação do gene pld das misturas artificiais com soro
e sangue total. 1 - pld::TOPO a 10 ng/µL. CT médio=15,1; 2- MAs de Soro com as
diluições de cultura a 10-5 e a 10-6 CT médio=26,7; 3 - MAs de Sangue total com as
diluições de cultura a 10-5 e a 10-6 CT médio=25,9.
1 2 3
1 2 3
52
5.7. PCR em tempo real das amostras clínicas A tabela abaixo mostra o resultado do PCR em tempo real para as amostras clínicas testadas comparadas com os resultados do teste de ELISA. Tabela 9: Resultados de PCR em tempo real comparado com ELISA para
as amostra clínicas testadas, com os resultados que foram confirmados
destacados.
Amostra DO ELISA Resultado CT (Real time) Resultado
200 0,614 POSITIVO 32 POSITIVO 201 0,326 NEGATIVO 33 POSITIVO 202 0,609 POSITIVO 31 POSITIVO 204 0,089 NEGATIVO 32 POSITIVO 205 0,119 NEGATIVO 31 POSITIVO 206 0,137 NEGATIVO 31 POSITIVO 207 0,422 POSITIVO 32 POSITIVO 208 0,084 NEGATIVO 33 POSITIVO 209 0,125 NEGATIVO 32 POSITIVO 210 0,122 NEGATIVO 32 POSITIVO 211 0,189 NEGATIVO 33 POSITIVO 212 0,191 NEGATIVO 30 POSITIVO 213 0,183 NEGATIVO 31 POSITIVO 214 0,094 NEGATIVO 34 POSITIVO 216 0,340 NEGATIVO 31 POSITIVO 219 0,927 POSITIVO 32 POSITIVO 220 0,341 NEGATIVO 33 POSITIVO 221 0,200 NEGATIVO 29 POSITIVO 222 0,234 NEGATIVO 33 POSITIVO 223 0,174 NEGATIVO 32 POSITIVO 224 0,162 NEGATIVO 31 POSITIVO 226 0,230 NEGATIVO 30 POSITIVO 227 0,078 NEGATIVO 28 POSITIVO 228 0,082 NEGATIVO 34 POSITIVO 229 0,089 NEGATIVO 30 POSITIVO 230 0,295 NEGATIVO 31 POSITIVO
De acordo com o observado, todas as amostras foram positivas para o teste de PCR em tempo real. Isso pode ter ocorrido por alguma contaminação dos reagentes ou por terem sido utilizados alvos muito estreitos para os iniciadores nessa técnica. Além disso, os testes os controles negativos utilizados utilizaram água no lugar do DNA extraído das amostras. Mostra-se necessária a obtenção de amostras de animais confirmadamente negativos, de preferência provenientes de áreas livres de LC, para serem utilizadas como controle negativo, para verificar se está havendo amplificação inespecífica de
53
DNA proveniente das amostras em si, por haver uma sensibilidade muito alta devido ao baixo peso molecular dos alvos utilizados.
5.8. ELISA indireto
Tabela 10: Resultado de ELISA para 10 ovinos da Propriedade I.
Propriedade I Animal Valores Média Resultado
1 0,186 0,170 0,178 NEGATIVO 2 0,128 0,114 0,121 NEGATIVO 3 0,149 0,103 0,126 NEGATIVO 4 0,113 0,095 0,104 NEGATIVO 5 0,099 0,070 0,085 NEGATIVO 6 0,101 0,136 0,119 NEGATIVO 7 0,144 0,161 0,153 NEGATIVO 8 0,129 0,180 0,155 NEGATIVO 9 0,158 0,219 0,189 NEGATIVO
10 0,109 0,072 0,091 NEGATIVO Total de animais = 10 Resultado Positivo 0 Negativo 10 Porcentagem 0%
Tabela 11: Resultado de ELISA para 26 ovinos da Propriedade II.
Propriedade II Animal Valores Média Resultado
11 0,232 0,167 0,200 NEGATIVO 13 0,076 0,093 0,085 NEGATIVO 14 0,464 0,504 0,484 POSITIVO 15 0,317 0,340 0,329 NEGATIVO 16 0,279 0,286 0,283 NEGATIVO 17 0,179 0,171 0,175 NEGATIVO 19 0,499 0,543 0,521 POSITIVO 20 0,298 0,220 0,259 NEGATIVO 21 0,109 0,138 0,124 NEGATIVO 24 0,172 0,145 0,159 NEGATIVO 25 0,168 0,217 0,193 NEGATIVO 26 0,286 0,374 0,330 NEGATIVO 27 0,294 0,287 0,291 NEGATIVO 28 0,137 0,286 0,212 NEGATIVO 29 0,218 0,255 0,237 NEGATIVO
54
30 0,173 0,189 0,181 NEGATIVO 31 0,372 0,398 0,385 POSITIVO 32 0,130 0,114 0,122 NEGATIVO 33 0,408 0,500 0,454 POSITIVO 34 0,288 0,277 0,283 NEGATIVO 35 0,073 0,146 0,110 NEGATIVO 36 0,240 0,323 0,282 NEGATIVO 37 0,210 0,236 0,223 NEGATIVO 38 0,209 0,293 0,251 NEGATIVO 39 0,063 0,102 0,083 NEGATIVO 40 0,215 0,197 0,206 NEGATIVO
Total de animais = 26 ELISA
Positivo 4 Negativo 22
Porcentagem 18%
Tabela 12: Resultado de ELISA para 24 ovinos da Propriedade III.
Propriedade III Animal Valores Média Resultado
41 0,240 0,192 0,216 NEGATIVO 42 0,339 0,363 0,351 POSITIVO 44 0,251 0,373 0,312 NEGATIVO 45 0,242 0,250 0,246 NEGATIVO 46 0,023 0,025 0,024 NEGATIVO 47 0,189 0,011 0,100 NEGATIVO 48 0,008 0,002 0,005 NEGATIVO 49 0,001 0,004 0,003 NEGATIVO 51 0,005 0,008 0,007 NEGATIVO 52 0,008 0,012 0,010 NEGATIVO 53 0,016 0,015 0,016 NEGATIVO 54 0,027 0,006 0,017 NEGATIVO 55 0,010 0,008 0,009 NEGATIVO 56 0,043 0,039 0,041 NEGATIVO 57 0,005 0,008 0,007 NEGATIVO 58 0,056 0,071 0,064 NEGATIVO 59 0,028 0,022 0,025 NEGATIVO 61 0,008 0,006 0,007 NEGATIVO 62 0,103 0,050 0,077 NEGATIVO 64 0,032 0,015 0,024 NEGATIVO 65 0,016 0,028 0,022 NEGATIVO 66 0,067 0,058 0,063 NEGATIVO 67 0,031 0,029 0,030 NEGATIVO 68 0,105 0,127 0,116 NEGATIVO
55
Total de animais = 24 ELISA Positivo 1 Negativo 23 Porcentagem 4%
Tabela 13: Resultado de ELISA para 58 ovinos da Propriedade IV.
Propriedade IV Animal Valores Média Resultado
74 0,157 0,093 0,125 NEGATIVO 75 0,412 0,363 0,388 POSITIVO 77 0,164 0,137 0,151 NEGATIVO 78 0,061 0,050 0,056 NEGATIVO 79 0,097 0,091 0,094 NEGATIVO 80 0,172 0,174 0,173 NEGATIVO 81 0,055 0,121 0,088 NEGATIVO 83 0,019 0,013 0,016 NEGATIVO 84 0,017 0,022 0,020 NEGATIVO 86 0,026 0,038 0,032 NEGATIVO 87 0,039 0,065 0,052 NEGATIVO 88 0,145 0,161 0,153 NEGATIVO 89 0,040 0,059 0,050 NEGATIVO 90 0,227 0,200 0,214 NEGATIVO 91 0,526 0,572 0,549 POSITIVO 92 0,162 0,162 0,162 NEGATIVO 93 0,057 0,052 0,055 NEGATIVO 94 0,253 0,283 0,268 NEGATIVO 96 0,723 0,571 0,647 POSITIVO 97 0,185 0,185 0,185 NEGATIVO 98 0,084 0,169 0,127 NEGATIVO 99 0,005 0,024 0,015 NEGATIVO
100 0,014 0,173 0,094 NEGATIVO 101 0,027 0,068 0,048 NEGATIVO 102 0,018 0,098 0,058 NEGATIVO 103 0,017 0,150 0,084 NEGATIVO 104 0,026 0,111 0,069 NEGATIVO 105 0,009 0,068 0,039 NEGATIVO 106 0,024 0,029 0,027 NEGATIVO 107 -0,011 0,023 0,006 NEGATIVO 108 0,068 0,053 0,061 NEGATIVO 109 0,216 0,238 0,227 NEGATIVO 110 0,243 0,172 0,208 NEGATIVO
56
111 0,055 0,045 0,050 NEGATIVO 112 0,032 0,033 0,033 NEGATIVO 113 0,056 0,074 0,065 NEGATIVO 114 0,047 0,048 0,048 NEGATIVO 115 0,029 0,028 0,029 NEGATIVO 116 0,117 0,141 0,129 NEGATIVO 117 0,115 0,162 0,139 NEGATIVO 118 0,055 0,043 0,049 NEGATIVO 119 0,076 0,080 0,078 NEGATIVO 120 0,090 0,072 0,081 NEGATIVO 121 0,177 0,158 0,168 NEGATIVO 122 0,043 0,038 0,041 NEGATIVO 123 0,149 0,132 0,141 NEGATIVO 124 0,055 0,057 0,056 NEGATIVO 125 0,032 0,036 0,034 NEGATIVO 126 0,231 0,312 0,272 NEGATIVO 127 0,047 0,069 0,058 NEGATIVO 128 0,107 0,103 0,105 NEGATIVO 129 0,035 0,035 0,035 NEGATIVO 130 0,040 0,034 0,037 NEGATIVO 131 0,041 0,038 0,040 NEGATIVO 132 0,037 0,040 0,039 NEGATIVO 133 0,048 0,037 0,043 NEGATIVO 134 0,040 0,038 0,039 NEGATIVO 135 0,063 0,036 0,050 NEGATIVO
Total de animais = 58 ELISA Positivo 3 Negativo 55 Porcentagem 5%
Tabela 14: Resultado final para todos os ovinos testados, com
porcentagem de positivos.
TOTAL 118 ELISA Positivos 8 Negativos 110 Porcentagem 7%
Tabela 15: Resultado de ELISA para 48 caprinos da Propriedade VI.
Propriedade VI Animal Valores Média Resultado
57
200 0,614 - 0,614 POSITIVO 201 0,326 - 0,326 NEGATIVO 202 0,609 - 0,609 POSITIVO 204 0,089 - 0,089 NEGATIVO 205 0,119 - 0,119 NEGATIVO 206 0,137 - 0,137 NEGATIVO 207 0,410 0,434 0,422 POSITIVO 208 0,077 0,091 0,084 NEGATIVO 209 0,121 0,129 0,125 NEGATIVO 210 0,123 0,120 0,122 NEGATIVO 211 0,176 0,201 0,189 NEGATIVO 212 0,166 0,215 0,191 NEGATIVO 213 0,165 0,201 0,183 NEGATIVO 214 0,092 0,095 0,094 NEGATIVO 216 0,341 0,339 0,340 NEGATIVO 219 0,887 0,967 0,927 POSITIVO 220 0,335 0,346 0,341 NEGATIVO 221 0,209 0,190 0,200 NEGATIVO 222 0,240 0,227 0,234 NEGATIVO 223 0,172 0,176 0,174 NEGATIVO 224 0,165 0,159 0,162 NEGATIVO 226 0,239 0,220 0,230 NEGATIVO 227 0,073 0,083 0,078 NEGATIVO 228 0,084 0,079 0,082 NEGATIVO 229 0,087 0,091 0,089 NEGATIVO 230 0,294 0,296 0,295 NEGATIVO 231 0,116 0,116 0,116 NEGATIVO 232 0,096 0,070 0,083 NEGATIVO 233 1,177 1,131 1,154 POSITIVO 234 0,560 0,520 0,540 POSITIVO 235 0,223 0,203 0,213 NEGATIVO 236 0,123 0,114 0,119 NEGATIVO 239 0,289 0,303 0,296 NEGATIVO 240 0,080 0,082 0,081 NEGATIVO 241 0,101 0,098 0,100 NEGATIVO 242 0,219 0,224 0,222 NEGATIVO 243 0,115 0,115 0,115 NEGATIVO 244 0,073 0,064 0,069 NEGATIVO 245 0,398 0,125 0,262 NEGATIVO 246 0,330 0,302 0,316 NEGATIVO 248 0,121 0,064 0,093 NEGATIVO 249 0,176 0,207 0,192 NEGATIVO 250 0,183 0,200 0,192 NEGATIVO 251 0,080 0,075 0,078 NEGATIVO 252 0,943 0,920 0,932 POSITIVO
58
253 0,150 0,154 0,152 NEGATIVO 254 0,055 0,077 0,066 NEGATIVO 255 0,217 0,127 0,172 NEGATIVO
Total de animais = 48 ELISA Positivo 7 Negativo 41 Porcentagem 17%
Tabela 16: Resultado de ELISA para 17 caprinos da Propriedade VIII.
Propriedade VIII Animal Valores Média Resultado
329 0,79 0,869 0,830 POSITIVO 330 0,432 0,21 0,321 NEGATIVO 331 0,072 0,045 0,059 NEGATIVO 332 0,041 0,072 0,057 NEGATIVO 334 0,181 0,126 0,154 NEGATIVO 335 0,331 0,316 0,324 NEGATIVO 336 0,212 0,197 0,205 NEGATIVO 337 0,223 0,308 0,266 NEGATIVO 338 0,131 0,109 0,120 NEGATIVO 339 0,186 0,214 0,200 NEGATIVO 340 0,677 0,579 0,628 POSITIVO 341 0,161 0,108 0,135 NEGATIVO 342 0,164 0,12 0,142 NEGATIVO 343 0,324 0,349 0,337 NEGATIVO 344 0,231 0,213 0,222 NEGATIVO 345 0,081 0,093 0,087 NEGATIVO 346 0,172 0,104 0,138 NEGATIVO
Total de animais = 17 ELISA Positivo 2 Negativo 15 Porcentagem 13%
Tabela 17: Resultado de ELISA para 22 caprinos da Propriedade IX.
Propriedade IX Animal Valores Média Resultado
347 0,151 0,138 0,145 NEGATIVO 348 0,033 0,024 0,029 NEGATIVO 349 0,079 0,088 0,084 NEGATIVO 350 0,02 0,023 0,022 NEGATIVO 351 0,089 0,121 0,105 NEGATIVO
59
352 0,059 0,071 0,065 NEGATIVO 353 0,087 0,08 0,084 NEGATIVO 354 0,043 0,052 0,048 NEGATIVO 355 0,044 0,051 0,048 NEGATIVO 356 0,245 0,311 0,278 NEGATIVO 357 0,079 0,085 0,082 NEGATIVO 358 0,077 0,03 0,054 NEGATIVO 359 0,098 0,314 0,206 NEGATIVO 360 0,174 0,229 0,202 NEGATIVO 361 0,062 0,053 0,058 NEGATIVO 362 0,401 0,444 0,423 POSITIVO 363 0,369 0,296 0,333 NEGATIVO 364 0,045 0,084 0,065 NEGATIVO 365 0,282 0,251 0,267 NEGATIVO 366 0,058 0,054 0,056 NEGATIVO 367 0,077 0,067 0,072 NEGATIVO 368 0,259 0,342 0,301 NEGATIVO
Total de animais = 22 ELISA Positivo 1 Negativo 21 Porcentagem 5%
Tabela 18: Resultado final para todos os caprinos testados,
com porcentagem de positivos.
TOTAL 87 ELISA Positivos 10 Negativos 77 Porcentagem 13%
Como demonstram os resultados acima, 7 % dos soros de ovinos e 13
% dos soros de caprinos testados, foram positivos para o teste de ELISA para
antígenos secretados por C. pseudotuberculosis. Esses dados corroboram com
um levantamento realizado recentemente no estado de São Paulo (Carmo et
al., 2009), utilizando o mesmo método utilizado nesse trabalho, que mostrou
uma soroprevalência de 18% em ovinos. Essas taxas, no entanto, estão abaixo
dos levantamentos realizados para as região Nordeste (Seyffert et al., 2009),
de 93% e para o estado de Minas Gerais (Guimarães et al., 2009), acima de
70% de soroprevalência. Testes sorológicos como o ELISA dependem da
60
resposta imune do hospedeiro à presença do patógeno, esses dados podem
subestimar o número de animais infectados por C. pseudotuberculosis. O tipo
de placa utilizado também pode interferir no resultado do ELISA, sendo que
algumas marcas dessas placas adsorvem melhor o antígeno utilizado.
61
6. CONCLUSÕES E PERSPECTIVAS
62
6.1. Conclusões
• O método de extração que se apresentou como o mais adequado para
aplicação nos testes de amplificação por PCR em tempo real dos genes
pld e 12SrRNA foi o de lise mecânica por microesferas de sílica, com
purificação por fenol-clorofórmio;
• Padronizou-se uma reação de PCR em tempo real capaz de amplificar
os genes pld e 12SrRNA a partir de amostras de sangue total e soro
contendo células de C. pseudotuberculosis;
• Foi possível amplificar com confiabilidade 10 fg do plasmídeo pld::TOPO
e 1 pg do plasmídeo 12SrRNA::TOPO através da técnica de PCR em
tempo real;
• Houve amplificação em todas as amostras testadas por PCR em tempo
real.
• Encontrou-se 7% de ovinos e 13% de caprinos soropositivos para
Corynebacterium pseudotuberculosis pelo ensaio de ELISA.
6.2. Perspectivas
Repetir os testes de ELISA com diferentes marcas de placa, com o
intuito de confirmar a baixa soroprevalência encontrada.
Repetir os testes com a PCR em tempo real utilizando parâmetros
experimentais diferentes, para que testes por esse método sejam de fato
confirmatórios para os testes ELISA positivos.
Validar o teste para a fase subclínica da Linfadenite Caseosa,
desenvolvido neste trabalho, após a realização de novas padronizações e
adaptações da técnica de real-time PCR utilizada.
63
7. REFERÊNCIAS
64
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