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Identificación del gen espumante FPG1 de Saccharomyces cerevisiae y su
importancia en la elaboración del vino
Lucía Blasco OteroGrupo de Biotecnología
Universidad de Santiago de Compostela
15 géneros levaduras: Brettanomyces y su equivalentesexual Dekkera, Candida, Cryptococcus, Debaryomyces,Hanseniaspora y su equivalente sexual Kloeckera,Kluyveromyces, Metschnikowia, Pichia, Rhodotorula,Saccharomyces, Saccharomycodes, Schizosaccharomycesy Zygosaccharomcyes
Saccharomyces cerevisiae
Gran eficiencia fermentativa Pie de cubaCultivos de levaduras, generalmente S. cerevisiae, que han sidoseleccionados por sus características y que permiten controlarlas fermentaciones y las características finales del producto.Selección y Mejora Genética
Fermentación del vino
Espuma
Carácter organoléptico importante en vinos espumosos Perjudicial: superproducción en fases tempranas de fermentación• Pérdida de mosto.• Reducción de la capacidad del tanque de fermentación.• Ralentización o detención total de la fermentación por pérdida
de azúcares.• Pérdida de higiene.• Compromete las operaciones de mantenimiento del tanque.
Solución:• Añadir antiespumantes.• Disminuir los niveles de O2 en los cultivos de levadura.• Uso de presión• Uso de levaduras no espumantes.
EspumaProteínas espumantes en el vino
Glicoproteínas dominantes en la espumaNaturaleza hidrofóbica
Formación y estabilización de la espuma
EspumaProteínas espumantes en el vino
Invertasa vacuolar de la uva
Enzima responsable de la conversión de la sacarosa en glucosa y fructosa.Muy abundante, 9 % - 14 % contenido proteico total . N-glicoproteína, 65 KDa, pI 3.9, hidrofóbica.
Manoproteínas de las levaduras
Pared celular glucanasasFermentación
Envejecimiento vinos espumosos por autolisis
EspumaGenes espumantes de levaduras
FRO1, FRO2 (Thornton, 1978)
AWA1 (Shimoi et al., 2002)
Objetivos
•Identificación del gen responsable de la producción de espuma en una cepa vínica de Saccharomyces cerevisiae
• Obtención de una cepa de Saccharomyces cerevisiae no productora de espuma
Selección de cepas espumantes de S. cerevisiae
Cepa silvestre 145 de S. cerevisiae
36 cepas
Altura (cm)
Número de cepas
0-1 101-2 192-3 63-4 34+ 1145A211
Estudio y análisis del gen responsable del carácter espumante en la cepa vínica 145A211 de S. cerevisiae
Identificación y secuenciación del gen FPG1
2313 pb
FPG1 (Foam Promoting Gene)
Análisis de la secuencia de la proteína Fpg1p
770 aa, 72512.22 Da, pI 4.23
Análisis de homología
Análisis de homología
Localización cromosómica del gen FPG1
SC22 ∆ho SCH2 (fpg1::FPG1-loxPKanMXloxP)
SCH2 X CSH84L (cyh2 (VII), ade2 (XV))
VII
FPG1-loxPKanMXloxP
Localización cromosómica del gen FPG1
SCH2 X CSH84L (cyh2 (VII))CSH88L (leu1 (VII))
VII, -119 cM
Marcador Numero de ascas cMPD NPD T
KanMX-cyh2 11 3 26 55
KanMX-leu1 2 10 24 -
Estudio y análisis del gen responsable del carácter espumante en la cepa vínica 145A211 de S. cerevisiae
Delección del gen FPG1
145A211 DHA6C (fpg1::FPG1-loxPKanMXloxP/fpg1::FPG1-loxPKanMXloxP)
DHA2-16 fpg1∆
Fenotipo
A) Crecimiento a distintas temperaturas: 15ºC (a); 23ºC (b); 30ºC (c); 37ºC (d). B) Crecimiento en presencia de sorbitol. C) Crecimiento en presencia de CalcofluorWhite.
Fenotipo
Fenotipo
Fermentaciones
Cepa Vfi Vft Vfm Pf145A211 0,042 0,012 0,027 1,19DHA2-16 0,05 0,013 0,032 1,37
Fermentaciones
Cepa Vfi Vft Vfm Pf145A211 0,042 0,012 0,027 1,19DHA2-16 0,05 0,013 0,032 1,37
Extracción e identificación de Fpg1p
A) Proteína extraída con liticasa desde la pared celular (67 kDa). B) Proteína extraída por el método post-alcali (67KDa). C) Proteína glicosilada precipitada por el método de KDS-Acetona desde el sobrenadante de la fermentación (100 KDa). a: cepa 145A211; b: cepa DHA2-16.
Estudio de la implicación de la proteína Fpg1p en el fenotipo espumante
A)145A211 vs DHA2-16. B) MI2B-pYES2 vs MI2B-pYES2FPG1. C) Recuperación del fenotipo espumante: DHA2-16 ura- pYES2-FPG1 vs 145A211, DHA2-16.
• Búsqueda del gen FPG1 en distintas cepas vínicas
• Uso de la proteína Fpg1p en vinos espumosos
Futuro