Debora p paula amostragem e rastreabilidade

AMOSTRAGEM E RASTREABILIDADE

Débora Pires Paula

Controle Biológico

Laboratórios de Ecologia e Biossegurança e Bioquímica e Biologia Molecular

[email protected]

AMOSTRAGEM

Estudo de um pequeno grupo de elementos, considerado idôneo, retirado de uma

população que se pretende conhecer, com margem de erro aceitável.

Monitoramento pós-liberação comercial

Amostragem

Segurança alimentar

Fluxo de genes

Organismos não-alvo

Caracterização do OGM

Fiscalização MAPA

Pré-liberação comercial Pós

Critérios ideais para amostragem

- Grupo controle (comparador – isolínea – e linhagens de referência) (EFSA, 2008)

no mesmo estágio fisiológico, idade e condições ambientais.

- Número de repetições (importância do experimento piloto). Determinação do

número ideal baseada no estudo caso-a-caso.

- Réplicas múltiplas temporal e espacial para capturar uma série de interações

entre ambiente vs gene (pressões bióticas e abióticas) (p.18, Codex 2003).

- Reprodutibilidade (importância de aliquotar e preservar amostras).

- Boas Práticas de Laboratório (BPL) (OECD, 1998).

- Análise estatística descritiva e inferencial.

Boas Práticas de Laboratório (BPL) tratam da organização, processo e das condições

sob as quais estudos de laboratório são planejados, executados, monitorados,

registrados e relatados. As BPL têm como intenção promover a qualidade e validação

dos resultados de pesquisa (OECD, 1998).

Exemplo 1:

Milho com alto teor de lisina (LY038), o OGM e seu comparador em cinco locais diferentes

(Reynolds et al., 2004), porém apenas comparou um único ano.

A: Isolínea vs linhagens de referência. A

isolínea é a linhagem mais estreitamente

relacionada ao OGM teste e deve ser

cultivada conjuntamente com o OGM em

vários locais e anos (pS9, EFSA 2008).

B: Os componentes individuais "C", "M" e

"Y“ são também comparados ao OGM e

sua isolínea para determinar se o OGM e

a isolínea estão fora do intervalo do

parâmetro estudado relatado para as

culturas convencionais com um histórico

de uso seguro.

ESTUDO : Comparação do número médio de ovos eclodidos das joaninhas

alimentadas com pulgões, entre plantas que expressam uma proteína X (GM) e que

não a expressam (isolínea ou linhagens de referência)

Deseja-se averiguar se joaninhas são afetadas pela uma proteína exógena X

Exemplo 2 (fictício):

Slide adaptado da aula

“Experimentação e Estatística”,

Dra. Joseane Padilha, Cenargen

Antes de tudo precisamos formular as hipóteses a serem testadas:

M1 = Número médio de ovos eclodidos ao consumir pulgões das plantas GM

M2 = Número médio de ovos eclodidos ao consumir pulgões das plantas não-GM

Hipótese do pesquisador (Hipótese Nula) H0 (Usual testar a igualdade)

H0: M1 = M2

Hipótese alternativa (“contra-hipótese” ) H1

H1: M1 ≠ M2

A média de ovos eclodidos é estatisticamente

equivalente quando as joaninhas se alimentam de pulgões das plantas GM e não-GM

A média de ovos eclodidos é estatisticamente

é diferente quando as joaninhas se alimentam de pulgões das plantas GM e não-GM

Slide adaptado da aula “Experimentação e Estatística”, Dra. Joseane Padilha, Cenargen

Unidade experimental: planta

Do lado direito de uma casa-de-vegetação colocou-se um vaso com a planta (idade = 2 meses)

que expressa a proteína X (T1);

Do lado esquerdo da estufa colocou-se um vaso com a planta (idade = 1 ano)

que não expressa a proteína X (T2);

Em cada planta foram colocadas 2 joaninhas e 2 pulgões;

• 24 horas depois, observou-se em T1 o número de ovos eclodidos pelas joaninhas;

• 48 horas depois, observou-se em T2 o número de ovos eclodidos pelas joaninhas;

P1 P2

Montagem do experimento



Planta 1 Planta 2

Joaninha1 30 60

Joaninha2 100 120

Média 65 90

Desvio 49 42

CV% 76 47

O coeficiente de variação (C.V.) é o desvio padrão expresso como uma

porcentagem média.

%100*

x

sCV

DESVIO PADRÃO

MÉDIA

Baixa dispersão: CV 15%

Média dispersão: CV 15-30%

Alta dispersão: CV 30%

Depende muito

da área pesquisada

Conclusão do pesquisador: O número médio de ovos eclodidos é significativamente

maior para as joaninhas não expostas a proteína.

Posso confiar???

Variabilidade experimental

Quão homogênea

é a amostra

“Erro experimental”

RESULTADO:

Influência da variabilidade experimental no teste

de hipótese

d1

d2

d3

d4

d5

d6

Di Distância de cada ponto em relação a média

Média do Grupo 2

Uso um valor para representar as repetições

de todo o grupo.

Esse ponto deve ser acompanhado de uma medida

que demonstre o quanto ele é confiável.

Esse acompanhante pode ser a média das distâncias di

(d1)2 + (d2)2 +...+(d6)2/(6-1)

uma soma

de quadrados

Slide da aula “Experimentação e Estatística”, Dra. Joseane Padilha, Cenargen

d1

d2

d3 d4

d5

d6 Di Distância de cada ponto em relação a média

Média do Grupo 1

Para comparar esses dois grupos, decompomos a variabilidade em duas partes:

Parte que mede o efeito real

dos grupos

Parte que contém aquilo que não é possível

controlar no experimento

ERRO (RESIDUO)

+

(PARTE 1) (PARTE 2)

PARTE1

PARTE2 Se isso for muito grande, indica que meus tratamentos diferem

PARTE1

PARTE2

Se for pequeno, indica que os tratamentos não diferem

significativamente que a diferença é por conta do acaso.

COM BASE NESSAS OBSERVAÇÕES

REJEITAMOS OU NÃO A HIPÓTESE TESTADA.

SOMA DE QUADRADOS DOS

TRATAMENTOS

SOMA DE QUADRADOS DOS

RESÍDUOS


Se esforços não forem feitos no sentido de controlar ao máximo as possíveis

causas de variabilidade do experimento podemos cometer erros graves, como:

Falar que as joaninhas são afetadas pela

proteína X quando na verdade não são! Falar que as joaninhas

não são afetadas pela

proteína X quando na verdade são!


Em suma....

Podemos controlas as causas de variação de um experimento, através de:

• Repetição de unidades experimentais;

• Uniformidade da amostra;

• Casualização dos indivíduos experimentais aos

tratamentos;

• Uniformidade do meio;

• Uniformidade na aplicação de tratamento.


Número de Repetições

Deve-se saber que esse número depende de vários fatores:

variabilidade do meio em que se realiza o experimento;

número de tratamentos em estudo;

recursos financeiros, físico, humano, etc.

Na Literatura, existem vários métodos para determinar o número ótimo de repetições:

Ensaios de uniformidade;

Métodos de simulação;

Métodos baseados em ensaios anteriores;

Curvas características de operação;

Alguns usam a fórmula:

Tais meios são trabalhosos e nem sempre chegam a resultados satisfatórios.


Uma regra prática, que tem surtido bons resultados na experimentação agrícola e

zootécnica, é a de que os ensaios devem ter, no mínimo, 20 parcelas e/ou 10

graus de liberdade para o resíduo ou erro experimental.

Voltando em nosso exemplo...

Vamos supor que o experimento foi feito em esquema inteiramente casualizado (DIC),

são dois tratamentos, então...

Lembrando que os G.L do resíduo no DIC é kr – k, então:

kr – k ≥ 10

2r ≥ 12

r ≥ 6

Para cada tratamento usar pelo menos 6 plantas.

E o número de Joaninhas e Pulgões????


2

E

ZSn

Então, o tamanho da amostra

irá depender, além da variabilidade dos

dados, do erro que o pesquisador permite

cometer e do grau de confiança adotado.

Podemos usar a ferramenta de amostragem aleatória simples (AAS)

desvio padrão

é o erro permissível Amostragem

Aleatória

Simples

para

a média

(AAS)

valor da variável normal padrão associado

ao grau de confiança adotado

90% = 1.645

95% = 1.96

99% = 2.58


Exemplo de aplicação da AAS

Vamos supor que em experimentos passados detectou-se que em média

as joaninhas apresentaram uma variabilidade em torno de 25 ovos eclodidos.

E que o pesquisador quer ter 90% de confiança que seu erro de estimativa (E) seja

de no máximo 5. Quantas Joaninhas serão necessárias?

Seriam necessárias 70 joaninhas.

705

)25(645.12

n


Outras Técnicas de amostragem

• Vimos que quanto mais heterogênea uma população maior será a exigência

quanto ao tamanho amostral.

Então, se a população for muito heterôgenea, teremos :

SOLUÇÃO:

PODEMOS HOMOGENEIZAR A POPULAÇÃO:

DIVIDIR EM ESTRATOS HOMOGÊNEOS

+ =

AMOSTRAGEM ESTRATIFICADA


População Heterogênea

Divido a população

em estratos homogêneos

Em cada estrato posso fazer uma amostragem aleatória simples (AAS)!

AAS

AAS

AAS

Nossa amostra!!!

+ + = n


Outras técnicas (não muito utilizadas nas Ciências Biológicas) ...

• Amostragem Sistemática

• Amostragem por Conglomerados


Exemplo 3: Caso do algodão Bt Bollgard Evento 531 Monsanto – Março 2005

“(...) Diante do exposto, a Comissão Técnica Nacional de Biossegurança – CTNBio após a

análise de biossegurança do algodão Bollgard evento 531, processo 01200.001471/2003-

01, delibera favoravelmente à sua liberação para plantio comercial e consumo humano e

animal, mediante as condicionantes: (i) a Monsanto do Brasil Ltda., empresa detentora da

tecnologia Bollgard, deverá fornecer as seqüências dos iniciadores (primers) para

detecção de evento específico aos órgãos de registro e fiscalização; (ii) respeitar as

zonas de exclusão para o plantio de algodão geneticamente modificado, conforme

proposto por Barroso e Freire (2004) e definir e limitar a época de plantio do algodão

Bollgard evento 531 nas diferentes regiões produtoras de algodão, principalmente em

localidades com cultivos de algodão safrinha; (iii) deverão ser preconizadas áreas de

refúgio com cultivares não transgênicas de algodão correspondentes a 20% da área a ser

cultivada com o algodão Bollgard evento 531, localizadas a distâncias inferiores a 800 m;

(iv) adotar práticas de manejo conservacionista da cultura do algodoeiro, tais como a

destruição da soqueira, a queima para controle de doenças, a rotação de culturas, o

emprego de culturas armadilhas e o controle biológico. Aos órgãos de fiscalização

competentes cabe garantir o cumprimento das exigências contidas no Parecer Técnico

Prévio Conclusivo, principalmente aquelas relativas às áreas de refúgio e zonas de

exclusão. Não há restrições ao uso do OGM em análise e seus derivados, desde que

obedecidas as exigências contidas no Parecer Técnico Prévio Conclusivo. Assim sendo,

a CTNBio considera que essa atividade não é potencialmente causadora de significativa

degradação do meio ambiente e da saúde humana. (...)”

RASTREABILIDADE

Cadeia logística de informação sobre determinado produto que permite conhecer o histórico de

produção (matérias-prima, local, circunstância, intervenientes), os processos de recepção,

armazenamento, produção e expedição até comercialização (cadeia de distribuição).

Indústria agro-alimentar

Objetivos:

* Informar os consumidores graças à rotulagem de produtos derivados de OGM

* Criar uma rede de segurança baseada na rastreabilidade dos produtos em qualquer

fase da produção e colocação no mercado

A rastreabilidade dos OGM abrange tanto produtos ou elementos de produtos, inclusive

sementes, quanto dos produtos destinados à alimentação humana ou animal

produzidos a partir de OGM.

A rede de segurança permite o controle e verificação das alegações nutricionais feitas

nos rótulos, o acompanhamento dos potenciais efeitos na saúde humana e no ambiente

e a retirada de produtos do mercado, se for verificado um risco imprevisto para a saúde

humana ou para o ambiente.

Rotulagem de OGM no Brasil: Decreto 4680/03, IN 1 e 22, Portaria 2658/03

“Art. 2º - Na comercialização de alimentos e ingredientes alimentares destinados ao

consumo humano ou animal que contenham ou sejam produzidos a partir de OGMs, com

presença acima do limite de 1% do produto, o consumidor deverá ser informado da

natureza transgênica do produto.

(...)

- Os alimentos e ingredientes produzidos a partir de animais alimentados com ração

contendo ingredientes transgênicos deverão ser rotulados (rastreabilidade).”

União Européia

Garante a rastreabilidade e a rotulagem dos organismos geneticamente modificados e dos

produtos produzidos a partir de OGM ao longo de toda a cadeia alimentar.

As regras de rastreabilidade aplicam-se a todos os OGM; consequentemente, os

pedidos de OGM destinados à alimentação humana ou animal (Regulamento

1829/2003/CE) devem respeitá-las, tal como os pedidos de OGM destinados a cultivo

(Directiva 2001/18/CE, parte C).

No caso dos produtos destinados à alimentação humana ou animal, incluindo os

destinados diretamente à transformação, os vestígios de OGM continuarão a ser

isentos da obrigação de rotulagem se não ultrapassarem o limite máximo de 0,9% e

se a sua presença for involuntária e tecnicamente impossível de evitar.

Os Estados-Membros asseguram a aplicação de medidas de inspecção e de controle

dos produtos, incluindo o controle por amostragem e as análises quantitativas e

qualitativas dos alimentos.

http://europa.eu/legislation_summaries/environment/nature_and_biodiversity/l21154_pt.htm












Sites sobre OGM e Biossegurança

Comissão Técnica Nacional de Biossegurança

http://www.ctnbio.gov.br/

Biosafety Clearing House (BCH):

http://bch.cbd.int/

European Food Safety Authority (EFSA):

http://www.efsa.europa.eu/EFSA/efsa_locale-1178620753812_home.htm

Codex Alimentarius:

http://www.codexalimentarius.net/web/index_en.jsp

Biosafety Assessment Tool (BAT):

https://bat.genok.org/bat/











http://bch.cbd.int/

http://bch.cbd.int/




















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