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TESTES FUNCIONAISTESTES FUNCIONAIS

Deborah M.SpaineReprodução Humana- UNIFESP

2012

Testes FuncionaisTestes Funcionais

� Os testes funcionais não são

necessariamente realizados na rotina

laboratorial mas são úteis em certos casos

diagnósticos ou para fins de pesquisa.

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Testes funcionaisTestes funcionais

� Estresse oxidativo

� Integridade de membrana citoplasmática

� Integridade e reatividade do acrossoma

� Atividade mitocondrial

� Condensação da cromatina

� Fragmentação do DNA

� Testes interação espermatozóide x oócito

� Testes ligação zona pelúcida humana

� Teste penetração oócito hamster

Estresse Estresse oxidativooxidativo

Produção de EROs

Capacidade antioxidante

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Estresse Estresse oxidativooxidativo

Produção de EROs

Capacidade antioxidante

� Espermatozóides amorfos, mortos

� Leucócitos

� Íons metálicos

� Hipertermia testicular (varicocele)

Estresse Estresse oxidativooxidativo

Produção de EROs

Capacidade antioxidante

� Enzimático (SOD, GPx, catalase)

� Não-enzimático (Vitaminas C e E, ácido úrico)

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EROsEROs (espécies reativas de oxigênio)(espécies reativas de oxigênio)

� São metabólitos do oxigênio: ânion superóxido,

peróxido de hidrogênio,radicais hidroxil e

hidroperoxil e óxido nítrico

� Peroxidação de ácidos graxos poliinsaturados

� Fragmentação de DNA

� Lesão do axonema

� Redução do potencial eletrolítico mitocondrial

Detecção das Detecção das EROsEROs

� Antioxidantes enzimáticos:

◦ Catalase

◦ Glutationa peroxidase (GPx)

◦ Superóxido dismutase (SOD)

� EROs

� Peroxidação lipídica:

◦ MDA (TBARS)

◦ 8-isoprostano

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Testes funcionaisTestes funcionais

� Estresse oxidativo

� Integridade de membrana citoplasmática

� Integridade e reatividade do acrossoma

� Atividade mitocondrial

� Condensação da cromatina

� Fragmentação do DNA

� Testes interação espermatozóide x oócito

� Testes ligação zona pelúcida humana

� Teste penetração oócito hamster

Integridade de membrana plasmáticaIntegridade de membrana plasmática

� Permeabilidade seletiva

� Potencial eletrolítico

� Ácidos graxos poliinsaturados – lesão de

membrana – perda de permeabilidade

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Avaliação da integridade de Avaliação da integridade de membrana plasmáticamembrana plasmática

� Teste de expansão hipoosmótico

� Eosina-nigrosina

� Iodeto de propídeo / SYBR 14

� Monoazida de etídeo

Campo claro

Epifluorescênciaou

Citometria

TESTE HIPOOSMÓTICO (HOS)

� Considerado como teste de vitalidade

� Avaliar capacidade spm. sofrerem edema de cauda qdo.em contato solução hipoosmótica

� Entrada de líquido para o interior da célula com a finalidade de se estabelecer o equilíbrio osmótico. Como resposta, a membrana dos espermatozóides incha-se formando espaços líquidos na cauda

� A presença de inchaço indica que o transporte de fluidos através da membrana ocorreu normalmente, considerando a membrana íntegra do ponto de vista funcional

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TESTE HIPOOSMÓTICO (HOS)� Solução de 150 mOsm/L: citrato de sódio, frutose e água purificada

� Incubar a 37ºC por 30 minutos

� Leitura 400x entre lâmina-lamínula(200 spm)

� % spm. cauda inchada

� Valor de referência: 58% spm.cauda inchada

Iodeto de Iodeto de propídeopropídeo / SYBR 14/ SYBR 14

� Iodeto de propídeo – não penetra íntegro

� SYBR 14 – penetra apenas íntegro

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Testes funcionaisTestes funcionais

� Estresse oxidativo

� Integridade de membrana citoplasmática

� Integridade e reatividade do acrossoma

� Atividade mitocondrial

� Condensação da cromatina

� Fragmentação do DNA

� Testes interação espermatozóide x oócito

� Testes ligação zona pelúcida humana

� Teste penetração oócito hamster

Integridade e reatividade de acrossoma

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Reação Reação do do acrossomaacrossoma

� Permitir penetração na zona pelúcida

� Ocorre na ZP após “binding”

� Depende de influxo de cálcio

Integridade Integridade do do acrossomaacrossoma

� Corantes para acrossoma

� Lectinas(glicoproteínas)de ligação x acrossoma:

◦ membrana interna

◦ membrana externa

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LecitinasLecitinas

� PSA – membrana acrossomal interna

� PNA – membrana acrossomal externa

Íntegro

Danificado

Testes funcionaisTestes funcionais

� Estresse oxidativo

� Integridade de membrana citoplasmática

� Integridade e reatividade do acrossoma

� Atividade mitocondrial

� Condensação da cromatina

� Fragmentação do DNA

� Testes interação espermatozóide x oócito

� Testes ligação zona pelúcida humana

� Teste penetração oócito hamster

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Atividade mitocondrialAtividade mitocondrial

� Motilidade:

◦ consumo de ATP

◦ Integridade de proteínas do axonema

� Fonte de ATP:

◦ Atividade mitocondrial (fosforilação oxidativa)

◦ Glicólise anaeróbica

Proteínas do Proteínas do axonemaaxonema

� Imunohistoquímica

� 1D SDS-PAGE –Western blotting

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Atividade mitocondrialAtividade mitocondrial

� Potencial de membrana

mitocondrial

� Geração de ATP

� Perda de potencial – causada

pelo excesso de EROs

Atividade mitocondrialAtividade mitocondrial

� 3,3’ diaminobenzidina (DAB)

� Sondas fluorescentes

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DABDAB

DABDAB

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Testes funcionaisTestes funcionais

� Estresse oxidativo

� Integridade de membrana citoplasmática

� Integridade e reatividade do acrossoma

� Atividade mitocondrial

� Condensação da cromatina

� Fragmentação do DNA

� Testes interação espermatozóide x oócito

� Testes ligação zona pelúcida humana

� Teste penetração oócito hamster

Compactação da cromatinaCompactação da cromatina

� Espermiogênese

� Maturação final

� Alongamento das

espermátides

� Histonas – Protaminas

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Compactação da cromatinaCompactação da cromatina

� Humanos

� P1 : P2 → fragmentação de DNA

� Determinação:

◦ 1D SDS-PAGE - Western blotting

Compactação da cromatinaCompactação da cromatina

� Substituição de histona por protamina –estresse torsional

� Topoisomerase II:

◦ Endonuclease

◦ Ligase

� Alteração na função da Topo II:

◦Quebra randômica do DNA

◦ Endogenous nicks

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Testes funcionaisTestes funcionais

� Estresse oxidativo

� Integridade de membrana citoplasmática

� Integridade e reatividade do acrossoma

� Atividade mitocondrial

� Condensação da cromatina

� Fragmentação do DNA

� Testes interação espermatozóide x oócito

� Testes ligação zona pelúcida humana

� Teste penetração oócito hamster

Fragmentação de DNAFragmentação de DNA

� Origem da fragmentação

• Compactação da cromatina

• Apoptose

• Espécies reativas de oxigênio (EROs)

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ConsequênciasConsequências da Fragmentação de DNAda Fragmentação de DNA

� Impacto na fertilidade

• Diminuição de taxa de fertilização?• Diminuição no desenvolvimento embrionário• Diminuição na taxa de gravidez

� Efeito pro-mutagênico

• “as 3 opções do oócito”• Microdeleções no cromossomo Y

MicrodeleçõesMicrodeleções no Cromossomo Yno Cromossomo Y

� 10 a 15% dos homens inférteis

� Ocorrem no braço longo (Yq)

� Azoospermia factor (AZF)

AZFa ���� ausência completa de cel. germinativasAZFb ���� parada de maturaçãoAZFc ���� oligozoospermia grave até azoospermia

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Detecção da Fragmentação de DNADetecção da Fragmentação de DNA

� TUNEL

� Ensaio Cometa

� Laranja de Acridina

� SCSA

Ensaio CometaEnsaio Cometa

� Princípio

• Eletroforese � tamanho de fragmentos

• pH alcalino � > 13.0

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Ensaio CometaEnsaio Cometa

Ensaio CometaEnsaio Cometa

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ENSAIO COMETAENSAIO COMETA

CASACASA

((ComputerComputer AssistedAssisted

SpermSperm AnalysisAnalysis))

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HistóricoHistórico� Lord Rothschild - década de 40 – fotografias –

movimento e velocidade deslocamento

� 1978 – Expert Vision/Cell Track desenvolvido Motion

Analysis Corporation

� 1985 – motilidade – Cell Soft pela Cryo Resources

� 1986 – HTM 2000 pela Hamilton Thorne -análise espermática

� 1992 – HTM IVOS Sperm Analysis – computador +

microscópio – movimentos espermáticos - % móveis e

progressivos – média velocidade

AplicaçõesAplicações

� Experimentais

� Pesquisa diluidores seminais

� Crioprotetores

� Processamento

� Qualidade seminal

� Fertilidade

� Reprodução

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Influência da AnáliseInfluência da Análise

� Experiência do observador – velocidade e alterações

� Identificação da amostra – 1º passo

� Temperatura da Análise – 37˚C

� Efeito da diluição e diluidores

� Efeito do tempo da colheita e sua análise – velocidade (2 horas)

� Efeito da freqüência de aquisição imagens - 30 à 60 imagens/seg

� Métodos de processamento – congelamento, descongelamento,

diluição

Combinação de Hardware e SoftwareCombinação de Hardware e Software

�� Hamilton Thorne IvosHamilton Thorne Ivos

� Hardware: sistema óptico,

iluminação, digitalização, computador

� Software: motilidade, vitabilidade e morfologia

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Parâmetros analisadosParâmetros analisados

� motilidade total

� spm. móveis

� spm.progressivos

� % spm.móveis

� % spm.progressivos

� rápidos, médios, lentos e imóveis

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FuncionamentoFuncionamento

� Visualiza e digitaliza sucessivas imagens

(60 quadros por segundo)

� Processa e analisa imagens

� Fornece informações precisas e relevantes

sobre a cinética e contagem dos spm.

Variáveis Analisadas Variáveis Analisadas MotilidadeMotilidade

� VAP: velocidade média do percurso (µm/s)

� VSL: velocidade retilínea (µm/s)

� VCL: velocidade curvilínea (µm/s)

� ALH: amplitude do deslocamento lateral da

cabeça (µm)

� BCF: freqüência de batimento cruzado (Hz)

� STR: retilinearidade ( VSL/VAP, %)

� LIN: linearidade (VSL/VCL, %)

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IdentIdent

� Corante Hoechst 33342

� Análise da motilidade e concentração sem

interferência de detritos

Corante Hoechst 33342

Análise da motilidade e concentração sem interferência de detritos

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ViadentViadent

� Corante Hoechst 33258

� Análise da motilidade, concentração e

viabilidade

� Contagem:

- Móveis e concentração: iluminação padrão

- Viáveis: iluminação fluorescente

Corante Hoechst 33258

Análise da motilidade, concentração e viabilidade

Contagem: Móveis e concentração: iluminação padrãoViáveis: iluminação fluorescente

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TESTE HEMIZONA(HZA)TESTE HEMIZONA(HZA)

Avalia ligação spm. X ZP

Resultado: índice HZA = % spm ligados