Londrina - PR 2010

Centro de Cincias Agrrias Depto. de Cincia e Tecnologia de Alimentos

Programa de Ps-Graduao em Cincia de Alimentos

Desenvolvimento de ingrediente simbitico por fermentao de soro de

leite e do subproduto da agroindstria de suco de laranja por gros de Kefir e

cultura probitica

Eduardo Vinicius Baptista

Londrina - PR 2010

Centro de Cincias Agrrias Depto. de Cincia e Tecnologia de Alimentos

Programa de Ps-Graduao em Cincia de Alimentos

Desenvolvimento de ingrediente simbitico por fermentao de soro de leite e do

subproduto da agroindstria de suco de laranja por gros de Kefir e cultura probitica

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Cincia de Alimentos, nvel Mestrado, da Universidade Estadual de Londrina, como requisito parcial obteno do ttulo de Mestre em Cincia de Alimentos.

Aluno: Eduardo Vinicius Baptista

Orientadora: Profa. Dra. Sandra Garcia

EDUARDO VINICIUS BAPTISTA

DESENVOLVIMENTO DE INGREDIENTE SIMBITICO POR FERMENTAO DE SORO DE LEITE E DO SUBPRODUTO

DA AGROINDSTRIA DE SUCO DE LARANJA POR GROS DE KEFIR E CULTURA PROBITICA

BANCA EXAMINADORA ________________________________________

Profa. Dra. Sandra Garcia (orientadora) Universidade Estadual de Londrina

________________________________________ Prof.Dr. Ral Jorge Hernan Castro-Gmez

DCTA/CCA/UEL

________________________________________ Prof.Dr. Cludio Takeo Ueno

UTFPR/Londrina Londrina, 27 de agosto de 2010.

minha me, Maria Aparecida, e minha

irm, Rachel Rossine, pela ajuda em

todos os momentos difceis e amor que

tm por mim.

A minha noiva Isabella, por todo o amor,

carinho, dedicao, estmulo, pacincia e

compreenso pelo meu ser.

Seja humilde, pois, at o sol com toda sua

grandeza se pe e deixa a lua brilhar.

No cruze os braos diante de uma

dificuldade, pois o maior homem do mundo

morreu de braos abertos!

Preocupe-se mais com a sua conscincia do

que com sua reputao. Porque sua

conscincia o que voc , e a sua reputao

o que os outros pensam de voc. E o que os

outros pensam, problema deles.

As vezes construmos sonhos em cima de

grandes pessoas... O tempo passa... e

descobrimos que grandes mesmo eram os

sonhos e as pessoas pequenas demais para

torn-los reais!

(Robert Nesta Marley)

Se A o sucesso, ento A igual a X mais Y

mais Z; Onde X = trabalho; Y = lazer; e Z =

manter a boca fechada.

(Albert Einstein)

AGRADECIMENTOS

minha me por sempre me ajudar, em todos os momentos, me

amparando e permitindo que eu finalizasse este projeto.

minha irm, pela sua ajuda e dedicao.

A minha noiva maravilhosa que por todas as vezes esteve ao meu

lado, me ajudando e me aturando com minhas manias.

minha orientadora, Prof. Dra. Sandra Garcia.

SACCO, pela cultura Lyofast MT 036 LV, e Dominic Anfiteatro,

pelos gros de Kefir, que foram fundamentais para a realizao da pesquisa.

A CAPES, pela concesso da bolsa de estudos.

BAPTISTA, EDUARDO VINICIUS. Desenvolvimento de ingrediente simbitico por fermentao de soro de leite e do subproduto da agroindstria de suco de laranja por gros de Kefir e cultura probitica. 2010. 69f. Dissertao de Mestrado em Cincia de Alimentos Universidade Estadual de Londrina, Londrina, 2010.

RESUMO

O mercado para produtos com diferenciado contedo de nutrientes continua a crescer. Neste contexto, este trabalho objetivou desenvolver um ingrediente simbitico a base de subprodutos de agroindstrias. Para isto, foi utilizado soro de leite reconstitudo em 7% (p/v), o qual foi fermentado com 10 e 1% (p/v) das culturas de gros de Kefir e cultura Lyofast MT 036 LV, respectivamente, sob temperatura de 25C por 24 horas. Aps o processo fermentativo, o bagao de laranja, previamente esterilizado por 15 minutos a 121C, foi adicionado ao soro fermentado na proporo 1:1 (p/v) com a finalidade de fornecer fibras e auxiliar o processo de secagem, que foi realizada temperatura de 40C. Anlises de viabilidade celular, pH, umidade, Aw, exopolissacardeos e pectina foram realizadas antes e aps a secagem. As contagens de bactrias lcticas, de Lactococcus spp. e de leveduras foram determinadas utilizando os Agar MRS, M17 e BDA, respectivamente; as anlises de pH, umidade e Aw foram realizadas segundo mtodos oficiais; os percentuais de pectina foram determinados atravs do KIT Pectin Identification Megazyme; e a quantificao de exopolissacardeos como EPS-equivalente. A estabilidade dos microorganismos foi avaliada durante 3 meses de armazenamento. As amostras foram mantidas em saches BOPP metalizado e estocadas sob temperatura de 25C. Durante o armazenamento, anlises microbiolgicas e fsico-qumicas foram realizadas a cada 30 dias. Tanto no ingrediente simbitico fermentado pelos gros de Kefir quanto no fermentado pela cultura Lyofast, a contagem de bactrias lcticas e de Lactococcus spp. foi mantida em 107 UFC/g. A contagem de leveduras no ingrediente simbitico fermentado pela cultura Lyofast foi de 105 UFC/g e no ingrediente simbitico fermentado com o Kefir foi de 107 UFC/g. Foi realizado o teste sensorial de aceitao, no qual 10% (p/p) dos ingredientes simbiticos foram adicionados em uma barra de cereais com formulao caseira. Para as bactrias lcticas, a viabilidade celular encontrada em ambos os ingredientes simbiticos foi similar, atingindo ao final do perodo 7,07 e 7,22 ciclos log/g para Lyofast e Kefir, respectivamente. Para os Lactococcus spp. foram encontrados os valores de 7,8 ciclos log/g para a Lyofast e 7,62 ciclos log/g para o Kefir. No ingrediente simbitico fermentado por gros de kefir as leveduras estavam presentes em nmeros de 7,53 ciclos log/g e no ingrediente simbitico fermentado com a cultura Lyofast 5,53 ciclos log/g. No teste de aceitao foi verificado que as 3 amostras analisadas apresentaram notas semelhantes, sem diferena estatstica a um nvel de 95% de confiana (p=0,05). As barras de cereais adicionadas dos ingredientes simbiticos desenvolvidos foram bem aceitas pelos consumidores com ndices de aceitao de 93% para Lyofast e 91% para Kefir. Os ingredientes simbiticos desenvolvidos no presente trabalho podem ser uma alternativa para a reutilizao dos subprodutos testados e para a diversificao de produtos com propriedades funcionais. Palavras-chave: Probitico. Prebitico. Bagao de laranja. Soro em p. Kefir.

BAPTISTA, EDUARDO VINICIUS. DEVELOPMENT OF SYMBIOTIC INGREDIENT BY FERMENTATION OF WHEY AND BY-PRODUCT OF ORANGE JUICE INDUSTRY BY KEFIR GRAINS AND FREEZE-DRIED PROBIOTIC CULTURE. 2010. 69P. DISSERTAO DE MESTRADO EM CINCIA DE ALIMENTOS UNIVERSIDADE ESTADUAL DE LONDRINA, LONDRINA, 2010.

ABSTRACT

The market for healthy products or with a diversity of nutrients continues to grow. In this context, this study aimed to develop a ingredient symbiotic based on byproducts of agro-industry with a functional potential. For this, milk whey reconstituted at 7 % (w/v) was fermented with 10 and 1 % (w/v) by Kefir grains and Lyofast MT 036 LV, respectively, at a temperature of 25C for 24 hours. After the fermentative process, the Orange peel, sterilized for 15 minutes at 121 C, was added to fermented whey in the ratio 1:1 (w/v) in order to provide fiber and help the drying process, which was performed at a temperature of 40C for 2-3 days. Samples for determination of cell viability, pH, moisture, Aw, exopolysaccharides and pectin were taken before and after drying process. Lactic acid bacteria (LAB), Lactococcus spp. and yeasts counts were determined using MRS Agar, M17 and BDA, respectively; the pH, moisture and Aw were performed according to official methods, the percentage of pectin were determined by Kit Pectin Identification Megazyme, and quantification of exopolysaccharides as EPS-equivalent. The stability of microorganisms presents in the symbiotic ingredients was evaluated during three months of storage. Samples were kept in BOPP metalized sachets and stored at 25C. During storage, microbiological and physical-chemical testes were performed every 30 days. In both symbiotic ingredients fermented by kefir grains as the fermented ingredient by culture Lyofast, LAB counts and Lactococcus spp. were maintained at 107 CFU/g. The yeast count in the symbiotic ingredient fermented by Lyofast culture was 105 CFU/g and for the ingredient fermented with Kefir was 107 CFU/g. Sensory testing was performed for acceptance, in which 10% (w/w) of the ingredient was added to a homemade cereal bar formulation. For LAB, cell viability in both symbiotic ingredients was similar, reaching at the end of the storage period 7,07 and 7,22 log cycles/g for Lyofast and Kefir, respectively. For Lactococcus spp. were found values of 7.8 log cycles/g for Lyofast and 7,62 log cycles/g for Kefir. Yeasts, had a greater survival in the ingredient symbiotic fermented with Kefir grains (7,53 log cycles/g) and lowest for the fermented ingredient increased with the Lyofast culture (5,53 log cycles/g). In acceptance testing, it was found that the three samples analyzed had similar notes, but with a statistical difference at the 95% confidence (p=0,05). Both ingredients symbiotic developed were well accepted by consumers with acceptance rate of 93% and 91% for Lyofast and Kefir respectively. The symbiotic ingredients developed in this study could be an alternative for the reuse of products tested and to the diversification of products with functional properties.

Key-words: Probiotics. Prebiotics. Orange peel. Whey. Kefir

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 - Lista das espcies (por ordem alfabtica) que integram os gneros

Bifidobacterium e Lactobacillus. .............................................................................. 9

Figura 2 - reaes dos ingredientes alimentares probiticos e prebiticos com a

microbiota intestinal, relativo aos seus efeitos sobre a sade. .............................. 16

Figura 3 - Volume anual de soro de leite produzido no mundo (1995-2005). ........... 20

Figura 4 - Processo de preparo do soro fermentado com a cultura Lyofast MT 036

LV. ......................................................................................................................... 25

Figura 5 - Processo de preparo do soro fermentado com a cultura de gros de Kefir.

............................................................................................................................... 26

Figura 6 - Processo de secagem aps adio do soro fermentado ao bagao de

laranja esterilizado. ................................................................................................ 27

Figura 7 - Mdias em log de determinaes realizadas em duplicatas para clulas

viveis de bactrias lcticas aps a fermentao do soro de leite (7% p/v) com a

cultura liofilizada Lyofast MT 036 LV e com os gros de Kefir. .............................. 36

Figura 8 - Mdias em log de determinaes realizadas em duplicatas para as clulas

viveis de Lactococcus spp. aps a fermentao do soro de leite (7% p/v) com a

cultura liofilizada Lyofast MT 036 LV e com os gros de Kefir. .............................. 37

Figura 9 - Mdias em log de determinaes realizadas em duplicatas para as clulas

viveis de leveduras aps a fermentao do soro de leite (7% p/v) com a cultura

liofilizada Lyofast MT 036 LV e com os gros de Kefir. ......................................... 38

Figura 10 - Soro de leite fermentado com as culturas de gros de Kefir (A) e Lyofast

MT 036 LV (B) ) a 25C por 24 horas. ................................................................... 39

Figura 11 - Bagao de laranja esterilizado a 121C por 15 minutos. ........................ 40

Figura 12 - Mdias em log de determinaes realizadas em duplicatas para clulas

viveis de bactrias lcticas ps fermentao do soro de leite e ps adio do

bagao de laranja e secagem. ............................................................................... 41

Figura 13 - Mdias em log de determinaes realizadas em duplicatas para clulas

viveis de Lactococcus spp. ps fermentao do soro de leite e ps adio do

bagao de laranja e secagem. ............................................................................... 42

Figura 14 - Mdias em log de determinaes realizadas em duplicatas de Leveduras

ps fermentao do soro de leite e ps adio do bagao de laranja e secagem. 43

Figura 15 - Ingrediente simbitico desidratado fermentado com gros de Kefir (A) e

com a cultura Lyofast MT 036 LV (B)..................................................................... 45

Figura 16 - Mdia de duas determinaes em log para a viabilidade de bactrias

lcticas durante 3 meses de armazenamento do ingrediente simbitico fermentado

com Kefir e cultura Lyofast MT 036 LV. ................................................................. 46

Figura 17 - Mdia de duas determinaes em log para a viabilidade de Lactococcus

spp. durante 3 meses de armazenamento do ingrediente simbitico fermentado

com Kefir e cultura Lyofast MT 036 LV. ................................................................. 47

Figura 18 - Mdia de duas determinaes em log para a viabilidade de leveduras

durante 3 meses de armazenamento do ingrediente simbitico fermentado com

Kefir e cultura Lyofast MT 036 LV. ......................................................................... 48

LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Composio centesimal do soro de leite integral. .................................... 24

Tabela 2 - Mdia de determinaes realizadas em duplicatas para anlise de pH do

soro de leite fermentado com a cultura liofilizada Lyofast MT 036 LV e com os

gros de Kefir. ....................................................................................................... 39

Tabela 3 - Mdias de determinaes realizadas em duplicatas da concentrao de

exopolissacardeos ps fermentao e ps adio do bagao de laranja e

secagem. ............................................................................................................... 41

Tabela 4 - Mdias de determinaes realizadas em duplicata para o pH das culturas

fermentadas antes e aps a adio do bagao de laranja no processo de

secagem. ............................................................................................................... 43

Tabela 5 - Percentual de pectina do bagao de laranja in natura e aps sua adio

ao soro fermentado com os gros de Kefir e com a cultura Lyofast MT 036 LV para

o processo de secagem. ........................................................................................ 44

Tabela 6 - Mdias de determinaes realizadas em duplicatas para o percentual de

umidade do bagao in natura, do soro fermentado acrescido de bagao de laranja

e do produto final para as diferentes culturas. ....................................................... 44

Tabela 7 - Mdias de determinaes realizadas em duplicatas da concentrao de

exopolissacardeos ps fermentao, ps adio do bagao de laranja e secagem

e durante 3 meses de armazenamento. ................................................................ 48

Tabela 8 - Anlise de bactrias lcticas, Lactococcus spp. e leveduras presente na

poro (10g) fornecida aos consumidores. ............................................................ 49

Tabela 9 - Anlise de microorganismos patognicos e indicadores e respectivos

padres microbiolgicos exigidos pela legislao vigente para Leite de bovinos e

de outros mamferos e derivados em p .............................................................. 50

Tabela 10 - Mdias de aceitao do teste de escala hednica para as amostras 1, 2

e 3. ......................................................................................................................... 51

SUMRIO

1 INTRODUO ..................................................................................................... 5

2 REVISO BIBLIOGRFICA ................................................................................ 7

2.1 Probiticos ........................................................................................................ 7

2.1.1 Kefir ............................................................................................................. 11

2.1.2 Bactrias Lcticas (BAL) ............................................................................. 12

2.1.2.1 Lactococcus lactis spp. ............................................................................... 13

2.1.3 Leveduras ................................................................................................... 14

2.2 Prebiticos ...................................................................................................... 15

2.2.1 Fibras .......................................................................................................... 17

2.2.1.1 Pectina ........................................................................................................ 18

2.3 Soro de leite ................................................................................................... 19

2.4 Bagao de laranja ........................................................................................... 20

3 OBJETIVOS ....................................................................................................... 22

3.1 Objetivo Geral ................................................................................................. 22

3.2 Objetivos Especficos ..................................................................................... 22

4 MATERIAIS E MTODOS ................................................................................. 23

4.1 Materiais ......................................................................................................... 23

4.1.1 Kefir ............................................................................................................. 23

4.1.2 Bagao de laranja ....................................................................................... 24

4.1.3 Soro de Leite em p .................................................................................... 24

4.2 Mtodos .......................................................................................................... 25

4.2.1 Preparo e fermentao das culturas ........................................................... 25

4.2.2 Secagem dos substratos ............................................................................. 26

4.2.3 Viabilidade celular ....................................................................................... 27

4.2.3.1 Contagem de bactrias lcticas .................................................................. 28

4.2.3.2 Contagem de Lactococcus spp. .................................................................. 28

4.2.4 Contagem de Leveduras ............................................................................. 29

4.2.5 Armazenamento .......................................................................................... 29

4.2.6 Determinao de pectina total no bagao de laranja .................................. 30

4.2.7 Quantificao de Exopolissacardeos (EPS) ............................................... 30

4.2.8 Anlises fsico-qumicas .............................................................................. 31

4.2.9 Anlise microbiolgica ................................................................................ 32

4.2.10 Anlise sensorial ......................................................................................... 32

5 RESULTADOS E DISCUSSO ......................................................................... 36

5.1 Fermentao do soro de leite ......................................................................... 36

5.2 Adio do bagao de laranja e sobrevivncia secagem .............................. 39

5.3 Armazenamento ............................................................................................. 46

5.4 Anlises Microbiolgicas ................................................................................ 50

5.5 Anlise sensorial ............................................................................................ 51

6 CONCLUSES .................................................................................................. 54

REFERNCIAS ......................................................................................................... 55

5

1 INTRODUO

Atualmente, com a crescente procura dos consumidores por

melhores condies de vida e sade, a indstria de alimentos tem focado na

produo de novos produtos com caractersticas funcionais. Devido s propriedades

que estes produtos apresentam, como reduo do colesterol, diminuio da

absoro de gorduras, melhora do funcionamento do trato intestinal (OLIVEIRA et

al., 2002), entre outras, os consumidores esto cada vez mais preocupados em

obter informaes sobre os alimentos funcionais, assim como mudar seus hbitos

alimentares. Com isso, o mercado para produtos com apelo saudvel ou com

diferenciado contedo de nutrientes (baixa caloria, enriquecidos com fibras, etc.)

continua a crescer. No contexto de busca de novos produtos funcionais, os

probiticos e prebiticos tm sido estudados como ingredientes em vrios alimentos.

Os probiticos so microorganismos vivos que ao serem

administrados em quantidades adequadas conferem benefcios a sade do

hospedeiro (WORLD HEALTH ORGANIZATION, 2001; SANDERS, 2003), sendo as

bactrias pertencentes aos gneros Lactobacillus e Bifidobacterium as mais

utilizadas como probiticos. Neste aspecto, destaca-se a utilizao dos gros de

Kefir que so constitudos de uma microbiota variada, tendo como principais

constituintes bactrias do gnero lactobacilos e leveduras (Saccharomyces,

Kluyveromyces, Candida e Picchia). Estes grnulos so tradicionalmente utilizados

para produo de leites fermentados de baixo teor alcolico (ANFITEATRO, 2000) e

apresentam algumas culturas com propriedades probiticas.

J os prebiticos so componentes alimentares no digerveis que

afetam beneficamente o hospedeiro, por estimularem seletivamente a proliferao

ou atividade de populaes de bactrias desejveis no clon. Adicionalmente, o

prebitico pode inibir a multiplicao de patgenos, garantindo benefcios adicionais

sade do hospedeiro (SAAD, 2006). Esses componentes atuam mais

freqentemente no intestino grosso, embora tambm possam ter algum impacto

sobre os microrganismos do intestino delgado (GIBSON, ROBERFROID, 1995;

ROBERFROID, 2001; GILLILAND, 2001; MATTILA-SANDHOLM et al., 2002). Dentre

os prebiticos, destacam-se diversos tipos de fibras que podem ser classificadas

como solveis, insolveis ou mistas, podendo ser fermentveis ou no-fermentveis.

6

A nova definio de fibra da dieta sugere a incluso de oligossacardeos e de outros

carboidratos no-digerveis (GIBSON e ROBERFROID, 1995). Dentro do grupo de

fibras solveis e fermentveis encontra-se a pectina, a qual no digerida pela -

amilase e por enzimas hidrolticas, como a sacarase, a maltase e a isomaltase, na

parte superior do trato gastrointestinal (CARABIN, FLAMM, 1999), e pode ser obtida

de diversos extratos vegetais.

O Brasil o maior produtor mundial e maior exportador de suco de

laranja (LOPES et al., 2006). O bagao da laranja um dos resduos que em sua

maioria destinado alimentao animal; porm, grande parte destinada a aterros

e usinas de compostagem, sendo considerado um problema ambiental. Sendo o

bagao da laranja um resduo obtido da extrao industrial de suco e rico em pectina

(BELITZ e GROSCH, 1997; EL NAWAWI e SHEHATA, 1987), uma possvel forma

de reaproveitamento economicamente interessante deste resduo a utilizao da

pectina, um polissacardeo estrutural que utilizado como ingrediente espessante e

estabilizante (BOBBIO e BOBBIO, 1995), alm de apresentar propriedades

prebiticas (FOOKS, FULLER, GIBSON, 1999).

A indstria de queijo tem como subproduto o soro de leite, o qual

corresponde a cerca de 80 % do volume total do leite utilizado na cadeia de

produo do queijo. O soro reutilizado por algumas indstrias para a recuperao

de nutrientes, sntese de enzimas, formulao de alguns produtos lcteos, etc.

(SOORO, 2009). Sendo um subproduto altamente poluente, com uma BOD

demanda bioqumica de oxignio cerca de 175 vezes maior do que a BOD de

efluentes de esgoto (SMITHERS, 2008), sendo assim um subproduto que requer

muita ateno.

Diante de todas as informaes relatadas acima, este trabalho teve

como objetivo a fermentao do soro de leite com gros de Kefir e com uma cultura

liofilizada de microorganismos probiticos e utilizao do bagao de laranja, resduo

da indstria de suco, como aditivo de sabor, aroma e fibras, para a produo de um

novo produto com caractersticas funcionais.

7

2 REVISO BIBLIOGRFICA

2.1 PROBITICOS

Determinados grupos de bactrias, principalmente as lticas, alm

de atuarem favoravelmente no produto alimentcio ao qual foram adicionados, fazem

parte dos microrganismos capazes de exercer efeitos benficos no hospedeiro,

sendo denominados de microrganismos probiticos. Um microrganismo probitico

deve necessariamente sobreviver s condies adversas do estmago e colonizar o

intestino, mesmo que temporariamente, por meio da adeso ao epitlio intestinal

(ZIEMER, GIBSON, 1998) e desta forma realizar diversas funes que proporcionam

benefcios ao hospedeiro.

Em condies normais, inmeras espcies de bactrias esto

presentes no intestino, a maioria delas anaerbias estritas. A microbiota intestinal

exerce influncia considervel sobre uma srie de reaes bioqumicas do

hospedeiro. Paralelamente, quando em equilbrio, a microbiota impede que

microrganismos potencialmente patognicos nela presentes exeram seus efeitos

prejudiciais. Por outro lado, o desequilbrio dessa microbiota pode resultar na

proliferao dos microrganismos patgenos, com conseqente infeco bacteriana

(ZIEMER, GIBSON, 1998).

Segundo Goldin (1998), a palavra probitico foi introduzida por Lilly e

Stillwell, em 1965, para descrever microorganismos que desempenham atividades

benficas. Hoje em dia, podem ser encontradas varias outras definies para estes

microrganismos, sendo a mais aceita atualmente a de que probiticos so

microorganismos vivos que quando administrados em quantidades adequadas

conferem benefcios a sade do hospedeiro (WORLD HEALTH ORGANIZATION,

2001; SANDERS, 2003).

Dentre as diversas espcies pertencentes aos gneros Lactobacillus

e Bifidobacterium (Figura 1), somente algumas so consideradas probiticas, sendo

utilizadas em uma ampla quantidade de produtos com caractersticas funcionais.

Porm no Brasil somente os L. acidophilus, L. casei shirota, L. casei variedade

8

rhamnosus, L. casei variedade defensis, L. paracasei, Lactococcus lactis,

Bifidobacterium bifidum, B. animalis (incluindo a subespcie B. lactis), B. longum, e

Enterococcus faecium so considerados probiticos (ANVISA, 2007).

9

Figura 1 - Lista das espcies (por ordem alfabtica) que integram os gneros Bifidobacterium e Lactobacillus. Fonte: GOMES e MALCATA, 1999.

As espcies probiticas apresentam diversos efeitos biolgicos.

Segundo Fuller (1989), h trs possveis mecanismos de atuao dos probiticos. O

10

primeiro deles refere-se supresso do nmero de clulas viveis de

microorganismos patognicos mediante produo de compostos com atividade

antimicrobiana, a competio por nutrientes e a competio por stios de adeso. O

segundo desses mecanismos seria a alterao do metabolismo microbiano, pelo

aumento ou diminuio da atividade enzimtica. O terceiro seria o estmulo da

imunidade do hospedeiro, por meio do aumento dos nveis de anticorpos e o

aumento da atividade dos macrfagos. De acordo com Naidu e Clemens (2000), o

espectro de atividade dos probiticos pode ser dividido em efeitos nutricionais,

fisiolgicos e antimicrobianos.

Diversos autores vm sugerindo possveis efeitos benficos de

culturas probiticas sobre a sade do hospedeiro. Entre esses efeitos benficos,

merecem destaque o controle das infeces intestinais, o estmulo da motilidade

intestinal, com conseqente alvio da constipao intestinal, a melhor absoro de

determinados nutrientes, a melhor utilizao de lactose e o alvio dos sintomas de

intolerncia a esse acar, a diminuio dos nveis de colesterol, o efeito

anticarcinognico e o estmulo do sistema imunolgico, pelo aumento da produo

de anticorpos e da atividade fagoctica contra patgenos no intestino e em outros

tecidos do hospedeiro, alm da excluso competitiva e da produo de compostos

antimicrobianos (SANDINE et al., 1972; GILLILAND, SPECK, 1977; KIM,

GILLILAND, 1983; FULLER, 1989; GILLILAND, 1989; TEJADA-SIMON et al., 1999;

GOMES, MALCATA, 1999; SHORTT, 1999; SREEKUMAR, HOSONO, 2000;

NAIDU, CLEMENS, 2000).

interessante citar tambm que as bactrias probiticas s

apresentam efeitos benficos no ambiente intestinal quando presentes em um

nmero mnimo. Por exemplo, o nmero de L. rhamnosus para reduzir

significativamente a ocorrncia da chamada diarria dos viajantes de 109 UFC/g

(OKSANEN et al., 1990). Assim, considerando um consumo de produtos probiticos

de 100 g, estes devem conter pelo menos 107 UFC de bactrias probiticas viveis

por grama no momento da compra do produto. Este o nmero recomendvel por

diversos autores (RYBKA, FLEET, 1997; VINDEROLA, RENHEIMER, 2000). Porm,

na legislao brasileira o nmero estaria entre 106-107 clulas viveis por mL ou g

do produto na poro diria (ANVISA, 2007).

11

2.1.1 Kefir

O Kefir derivado da palavra Keif oriunda da Turkia e significa bem-

estar, devido sensao e aos benefcios que ele promove sade humana. Pode

ser produzido com leite fresco e considerado uma cultura starter, sendo utilizado

em diversos processos, como por exemplo, a fabricao de pes. O Kefir apresenta

cerca de 40 componentes aromticos e podem conter at 2% de lcool; entretanto,

apenas 0,05% a 0,1% de lcool produzido realmente em 1 dia de fermentao

com os gros de Kefir. Ele considerado um alimento funcional, devido

capacidade de promover benefcios sade e resistncia a doenas, e tambm por

apresentar componentes nutricionais (ANFITEATRO, 2000),

A origem do Kefir vem das montanhas Caucasianas, possivelmente

no nordeste de Ossetia, onde tribos locais tm preparado esta bebida por cerca de

1000 anos. Estas pessoas so conhecidas pela sua longevidade e boa sade e o

Kefir apontado como um dos maiores contribuintes para isto. O Kefir conhecido

como bebida dos profetas pelas tribos locais e tambm como os gros do profeta

Mohamed (TRUM, 1973).

O Kefir uma suspenso de microrganismos simbiontes formada

por um grande nmero de cepas de bactrias (predominantemente cido lcticas -

BAL) e de leveduras, ambas encapsulados em uma matriz de polissacardeos

secretados pelas BAL (DINIZ et al., 2003).

Os gros de Kefir produzem uma bebida fermentada utilizada no

ocidente por suas propriedades sensoriais, uso tradicional na medicina popular e

tambm devido ao fato de alguns microorganismos presentes no Kefir apresentarem

propriedades probiticas. O produto fermentado resulta em uma soluo cida

contendo compostos aromticos, gs carbnico e etanol. Macroscopicamente, o

Kefir apresenta-se como gros gelatinosos, medindo de 3 a 20 mm de tamanho e

com propriedades sensoriais definidas para cada combinao microbiolgica

(ANFITEATRO, 2000).

12

2.1.2 Bactrias Lcticas (BAL)

As bactrias lcticas (BAL) foram descritas por Orla-Jensen (1919)

para designar um grupo fisiolgico de Gram-positivos que fermentam carboidratos a

cido lctico e tambm a outros compostos como cido actico, lcool e dixido de

carbono. Tem preferncia por condies anaerbias porm so aerotolerantes, no

esporuladas e catalase negativas (VASILJEVIC; SHAH, 2008). Dentre os principais

gneros, destacam-se Lactobacillus, Lactococcus, Enterococcus, Streptococcus e

Pediococcus. Alguns autores sugerem que o gnero Bifidobacterium pertena ao

grupo das bactrias lcticas, entretanto apresentam em seu DNA maiores

quantidades de pares de G+C (guanina-citosina) e assim diferenas filogenticas em

relao aos outros gneros (VASILJEVIC; SHAH, 2008).

Revises taxonmicas destes gneros sugerem que BAL

compreendem: Aerococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Lactobacillus,

Lactococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus,

Vagococcus, Weissella, Lactosphaera e Paralactobacillus (LEISNER et al., 2000).

Amplamente distribudas, BAL tem sido utilizadas em todo o mundo

para melhorar a preservao, caractersticas sensoriais e valor nutricional de uma

ampla variedade de produtos. Isso porque algumas linhagens so capazes de

converter aucares, cidos orgnicos, protenas ou gorduras em componentes de

aroma e sabor e tambm podem contribuir para melhorar a textura e a viscosidade

de produtos fermentados por meio da sntese de exopolissacardeos (RUAS-

MADIEDO; HUGENHOLTZ; ZOON, 2002).

Algumas espcies de bactrias lcticas produzem substncias

antimicrobianas como cido lctico, perxido de hidrognio, dixido de carbono,

diacetil, acetaldedo e bacteriocinas (NAIDU et al., 1999). A ao antagonista de

espcies de BAL contra microorganismos indesejveis em alimentos tem sido

descrita em vrios trabalhos. Muitas BAL isoladas de leite e queijos apresentaram

poder de inibio frente a patgenos e deteriorantes, como Staphylococcus spp.,

Listeria spp., Salmonella spp., Bacillus spp., Pseudomonas spp. e coliformes

(VAUGHAN et al., 1994; BRASHEARS e DURRE, 1999; URAZ et al., 2001;

ALEXANDRE, 2002; CARIDI, 2003).

13

2.1.2.1 Lactococcus lactis

Lactococcus lactis so bactrias gram-positivas, anaerbias

facultativas pertencentes ao grupo das bactrias cido lcticas (BAL), devido a sua

capacidade de converter a lactose presente no substrato em cido lctico via

fermentao. Por isto, estas bactrias so utilizadas em diversos processos

envolvendo alimentos fermentados (vegetais, leite e carne), onde so responsveis

pela preservao e caractersticas sensoriais, assim como pela cor, textura e sabor

(MIYOSHI et al., 2003).

Os Lactococcus lactis so mesfilos, com crescimento timo em

temperatura de 30C , sendo fermentadores microaerfilos (DUWAT et al., 2000).

Estas bactrias so comumente encontradas na natureza, sob a superfcie de

plantas e animais, sendo muito utilizadas na Indstria de Laticnios para a produo

de fermentados, como queijo e manteiga.

Alguns autores consideram determinadas espcies de Lactococcus

spp. probiticas (SANDERS AND HUIS INT VELD, 1999; BLANDINO et al., 2003;

VINDEROLA e REINHEIMER, 2003, citados por ESPINOZA e GALLARDO-

NAVARRO, 2010) . Em um estudo que visava verificar as caractersticas probiticas

dos microorganismos encontrados nos gros de Kefir oriundos da Turkia, atravs da

produo de cido ltico, perxido de hidrognio, atividade antimicrobiana e

produo de diacetil e acetaldedo, Yksekdag, Beytali e Aslim (2004), verificaram

que as linhagens de Lactococcus cremoris e Lactococcus lactis apresentaram

propriedades que podem caracteriz-las como probiticas e de possvel uso na

produo de produtos com alto potencial funcional.

Considerando que os gros de Kefir utilizados no trabalho contm 2

linhagens de Lactococcus lactis, interessante ressaltar a sua importncia na

contribuio das propriedades sensoriais e probiticas do ingrediente simbitico

obtido que poder ser utilizado em diversos tipos de alimentos.

14

2.1.3 Leveduras

Leveduras so fungos unicelulares, que se reproduzem

assexuadamente por brotamento ou gemulao, tem crescimento timo entre 25C e

0C e se desenvolvem bem em pH cido. Elas apresentam alta diversidade

fisiolgica e por isso podem crescer em vrios tipos de habitat (JACQUES e

CASAREGOLA, 2008). Esta diversidade tem sido estudada para o desenvolvimento

de um grande nmero de produtos, para produo de metablitos industriais, e em

vrios processos biotecnolgicos, como a produo de protenas e enzimas.

Algumas espcies de leveduras tambm so usadas como probiticos, como o

caso da Saccharomyces cerevisiae e Saccharomyces boulardii (POSTERATO et al.,

2005).

As leveduras so heterotrficas e para seu crescimento requerem

nutrientes minerais e quantidade significante de carbono. A maioria das leveduras

cresce em uma ampla variao de valores de pH, o que permite a elas, em

particular, colonizarem materiais que j apresentam processo fermentativo por

bactrias (LACHANCE e STARMER, 1998). Leveduras so freqentemente

encontradas em alimentos manufaturados que contm gordura ou grande

quantidade de acar. Em animais elas so encontradas na pele e tambm no trato

gastrointestinal.

Alguns trabalhos citam propriedades probiticas da levedura

Saccharomyces boulardii, onde em infeces experimentais, foram extensivamente

estudadas. Ensaios em humanos, assim como estudos in vitro, mostraram que a S.

boulardii apresenta papel protetor contra alguns patgenos entricos que provocam

diarrias (CZERUCKA e RAMPAL, 2002; MANSOUR-GHANAEI et al., 2003).

Alm da S. boulardii, a S.cerevisiae tambm relatada em alguns

trabalhos como probitica. Em um estudo feito com S.cerevisiae foi relatada a

eficcia da mesma no combate a diarrias em humanos (KOVACS e BERK, 2000).

Na dieta de ruminantes a S. cerevisiae muito utilizada, pois ela estimula a atividade

dos microorganismos benficos do trato gastrointestinal, aumentando desta forma a

digestibilidade de nutrientes e o potencial de produo dos animais (NEWBOLD et

al., 1995; WOHLT et al., 1998).

15

2.2 PREBITICOS

Os prebiticos so ingredientes alimentares no digerveis por

humanos que exercem um efeito benfico no indivduo, estimulando seletivamente o

crescimento e/ou atividade de espcies bacterianas benficas existentes no clon

(Figura 2), melhorando a sade do hospedeiro. Estes ingredientes, normalmente de

natureza glicdica (geralmente oligossacardeos), devem ser indigerveis pelas

enzimas digestivas, alando o intestino grosso intactos, onde sero especificamente

utilizados por grupos de microrganismos com propriedades benficas claramente

identificadas (MACFARLANE E CUMMINGS, 1999; ROBERFROID, 2002). Alm

disso devem induzir efeitos benficos sistmicos ou na luz intestinal do hospedeiro

(MENTEN, 2001).

16

Figura 2 - reaes dos ingredientes alimentares probiticos e prebiticos com a microbiota intestinal, relativo aos seus efeitos sobre a sade. Fonte: SAAD, 2006.

No intestino, as diferentes substncias prebiticas devem ser

preferencialmente fermentadas e promoverem o crescimento de uma ou outra

espcie bacteriana. Sendo assim, a seletividade destes prebiticos poder ser

verificada, no s quanto ao gnero, mas tambm quanto espcie bacteriana. Esta

relao estrutura-funo , no entanto, pouco estudada relativamente aos

prebiticos em geral (RASTALL E MAITIN,2002; RABIU et al., 2001).

Neste contexto, as substncias prebiticas agem de forma a suprir

os nutrientes necessrios para estimular o crescimento de especficas ou diversas

bactrias intestinais benficas, cujos metablitos atuam tambm reduzindo o pH

atravs do aumento da quantidade de cidos orgnicos presentes no ceco. Por outro

lado, atuam bloqueando os stios de aderncia (principalmente a D-manose),

imobilizando e reduzindo a capacidade de fixao de algumas bactrias patognicas

17

na mucosa intestinal. Especula-se tambm, que as substncias prebiticas atuam

estimulando o sistema imune, atravs da reduo indireta da translocao intestinal

por patgenos, que determinariam infeces aps atingirem a corrente sangunea

(SAVAGE et al., 1996).

Dentro do grupo de prebiticos, podem-se destacar a inulina, os

frutooligossacardeos e tambm diversos tipos de fibras que podem ser classificadas

como solveis, insolveis ou mistas, podendo ser fermentveis ou no-fermentveis.

2.2.1 Fibras

Considera-se fibra alimentar o conjunto dos componentes dos

alimentos vegetais que resistem hidrlise pelas enzimas endgenas do tubo

digestivo. Tais resduos alimentares, como no so digeridos, no possuem valor

calrico, passam para as fezes, e so degradados no intestino grosso (POURCHET-

CAMPOS, 1990).

A fibra alimentar poder influenciar vrios aspectos da digesto,

absoro e metabolismo, entre eles:

A diminuio do tempo de trnsito intestinal dos alimentos;

Aumento da velocidade de absoro intestinal da glicose;

Diminuio dos nveis de colesterol sangneo;

Diminuio do contedo de calorias ingeridas.

Essas propriedades, segundo Calixto (1993), fazem das fibras um

adequado regulador intestinal. As fibras so ainda fatores de importncia em

regimes dietticos para a preveno ou tratamento de diabetes e de pessoas com

problemas de hipercolesterolemia ou obesidade. O desenvolvimento de cncer de

clon e outros distrbios gastrointestinais pode estar relacionado com a falta de

fibras na dieta.

18

2.2.1.1 Pectina

A pectina considerada uma fibra solvel e fermentvel, a qual

no digerida pela -amilase e por enzimas hidrolticas, como a sacarase, a

maltase e a isomaltase, na parte superior do trato gastrointestinal (CARABIN,

FLAMM, 1999). Ela est presente na parede celular dos vegetais, em diferentes

formas, conforme o avano da maturao.

As substncias pcticas so encontradas nos frutos em formas

diversas, com uma solubilidade diferente dependendo do estado de maturao, cada

uma delas com funes na determinao da textura (SGARBIERI, 1966; CHITARRA,

1973). As pectinas encontram-se principalmente depositadas na parede celular,

atuando como material de ligao entre as clulas, sendo consideradas fibras com

caractersticas espessante, estabilizante (BOBBIO E BOBBIO, 1995) e

apresentando, em alguns casos, propriedades prebiticas (FOOKS, FULLER,

GIBSON, 1999).

Segundo Whistler e Daniel (1985), as substncias pcticas podem

se apresentar como:

Protopectina: altamente esterificada com metanol; insolvel em gua. Durante

o amadurecimento da fruta, a enzima protopectinase converte a protopectina

em pectina coloidal, ou cidos pectnicos, que so solveis em gua.

Pectina: polissacardeo estrutural encontrado na parede celular de vegetais

com a funo de conferir rigidez. Tambm chamada de cido pectnico, a

pectina menos metilada que a protopectina. Os cidos pectnicos so os

cidos poligalacturnicos coloidais que formam gel em condies especficas.

A ao contnua da pectina-metilesterase sobre o cido pectnico leva a

remoo completa dos grupos metil-ster e formao de cidos pcticos.

cidos pcticos: so cidos poligalacturnicos isentos de grupos metlicos.

So degradados a cido galacturnico pela enzima poligalacturonase.

Segundo Bobbio e Bobbio (1995), a pectina formada por 150 a

1.500 unidades de cido galacturnico unidas por ligaes glicosdicas (1-4) e

apresenta peso molecular entre 100.000 a 200.000 Daltons. A composio e as

19

propriedades da pectina variam de acordo com a fonte, o processo de extrao

empregado e tratamentos posteriores extrao (FENNEMA, 2007).

As cadeias lineares de cido galacturnico possuem grupos

carboxlicos esterificados por radicais metoxil (CH3) em maior ou menor grau. O grau

de metoxilao (DM degree of metoxilation) uma medida da proporo de grupos

carboxlicos que esto presentes na forma esterificada. Por exemplo, uma pectina de

DM igual a 0,7 indica 70% de esterificao (BOBBIO e BOBBIO, 1995).

A proporo de grupos metil-ster decresce conforme o vegetal

amadurece. O grau de esterificao calculado pela razo entre o nmero de

resduos de cido D-galacturnico esterificados e o nmero total de resduos de

cido D-galacturnico multiplicado por 100 (WHISTLER e DANIEL, 1985).

2.3 SORO DE LEITE

O soro do leite um subproduto resultante da fabricao de

queijos, por coagulao da casena, obtido por adio de cido ou de enzima (soro

doce). Possui alto valor nutricional, conferido pela presena de protenas com

elevado teor de aminocidos essenciais, destacando-se os sulfurados (CAPITANI et

al., 2005).

Alm das propriedades nutricionais, as protenas do soro do leite

so muito conhecidas pela versatilidade de suas propriedades funcionais

tecnolgicas como ingredientes em produtos alimentcios, principalmente por sua

elevada solubilidade e capacidade de geleificao. Recentemente, tm sido

atribudas s protenas do soro propriedades funcionais fisiolgicas, capazes de

produzir um importante controle na modulao do metabolismo e nos mecanismos

de defesa dos organismos animal e humano (SGARBIERI & PACHECO, 1999;

MICKE et al., 2002; ROSANELI et al., 2002).

No Brasil, a produo de bebidas lcteas uma das principais

opes de aproveitamento do soro do leite, e as mais comercializadas so as

bebidas fermentadas, com caractersticas sensoriais semelhantes ao iogurte, e

bebidas lcteas no-fermentadas. Contudo, o aproveitamento desse subproduto

ainda baixo variando em torno de 15-20% apenas (SMITHERS, 2008), sendo que

20

a produo anual de soro de leite no mundo aumenta em torno de 1-2% segundo a

figura 3. (FAO, 2006).

Figura 3 - Volume anual de soro de leite produzido no mundo (1995-2005). FONTE: FAO, 2006

2.4 BAGAO DE LARANJA

O bagao da laranja, resduo da produo industrial do suco,

composto por flavedo, albedo, membranas, resduos de polpa e sementes (FOX,

1991; KALE e ADSULE, 1995). O flavedo a casca propriamente dita, que contm

leos essenciais e pigmentos. O albedo a poro branca, fibrosa, de alta

porosidade, aderida internamente ao flavedo, sendo esta camada que contm a

maior concentrao de pectina do total contido no bagao. Membranas presentes no

bagao contm celulose, hemicelulose, lignina, pectina, compostos fenlicos,

flavonides, vitaminas e minerais (FOX, 1991).

Quanto proporo entre a quantidade de laranjas que entram na

planta para extrao de suco e a quantidade de bagao restante dessa extrao, h

variaes de acordo com a variedade e o grau de maturao da fruta, o tipo de

processamento e processos subseqentes extrao de suco.

At 60% em peso da fruta so resduos slidos (casca, partes da

21

polpa e sementes). Proporcionalmente, a laranja contm de 21,5 a 38,1% de casca;

61,9 a 78,6% de polpa e 23,8 a 51,0% de suco. Segundo a Abecitrus (2008), o

bagao corresponde a cerca de 50%, em peso, das laranjas processadas.

Um destino para o bagao de laranja a sua utilizao como

matria prima na produo de leos Essenciais (Dlimoneno) e tambm como Farelo

de casca de laranja para alimentao animal (ABECITRUS, 2008). De acordo com El

Nawawi e Shehata (1987), para destinar os resduos da indstria de suco e obter

maior retorno financeiro na indstria de citrus, os resduos da extrao podem ser

utilizados para a produo de pectina.

A quantidade de pectina em bagao de laranja varivel em

funo da variedade e do grau de maturao da fruta, do tempo decorrente entre a

colheita e a extrao da pectina e do processamento ao qual a fruta submetida. O

teor de pectina decresce em frutos conforme avana o amadurecimento (FONSECA,

2001) e conforme aumenta o tempo entre a colheita da laranja e o processamento

de extrao de pectina.

Em base seca, aproximadamente 30% do bagao de laranja

pectina (EL NAWAWI e SHEHATA, 1987), sendo a extrao da pectina do bagao

de laranja uma outra via de reaproveitamento.

Desta forma, alm de ser uma alternativa de aproveitamento para o

resduo da indstria de suco de laranja, a utilizao da pectina, e desse material

como um todo, uma forma de agregar valor a este subproduto, resultando em

benefcios econmicos e minimizando danos ao meio ambiente.

22

3 OBJETIVOS

3.1 OBJETIVO GERAL

Desenvolver um ingrediente simbitico desidratado, fermentado por

gros de Kefir e cultura probitica, utilizando bagao de laranja e soro de leite.

3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

Verificar se o soro de leite vivel para a fermentao com gros de

Kefir e com uma cultura comercial liofilizada de microorganismos probiticos

(LYOFAST MT 036 LV).

Determinar a viabilidade das bactrias lcticas, Lactococcus spp. e

leveduras presentes nos gros de Kefir e cultura LYOFAST MT 036 LV, aps os

processos de fermentao do soro e aps adio do bagao de laranja no processo

de secagem.

Determinar o percentual de pectina presente no bagao da laranja

antes e aps a secagem.

Quantificar o teor de exopolissacardeos produzidos pelas bactrias

durante os processos de fermentao e secagem, e durante o armazenamento.

Verificar a viabilidade dos microorganismos presentes em ambas

culturas por 3 meses na temperatura de 25C.

Verificar as diferenas sensoriais na barra de cereais adicionada do

ingrediente simbitico.

23

4 MATERIAIS E MTODOS

4.1 MATERIAIS

4.1.1 Kefir

Os gros de Kefir foram obtidos de Dominic Anfiteatro e a cultura

liofilizada LYOFAST MT 036 LV foi fornecida pela empresa SACCO localizada em

Campinas, So Paulo, Brasil. Ambos armazenados em freezer (-10C a -15C).

Microorganismos encontrados na cultura Lyofast MT 036 LV:

Lactococcus lactis ssp. lactis

Lactococcus lactis spp. lactis biovar diacetylactis

Lactobacillus brevis

Leuconostoc

Saccharomyces cerevisiae

Microorganismos encontrados nos gros de Kefir:

Lactobacillus spp; Lactococcus spp ; Leuconostoc spp ; Acetobacter spp ;

Streptococcus spp ;Kluyveromyces spp ; Candida spp ; Sacharomyces spp ;

Torula spp ( ANFITEATRO, 2000).

24

4.1.2 Bagao de laranja

O bagao de laranja utilizado foi fornecido pela COROL Cooperativa

Agroindustrial, localizada em Rolndia, Paran, Brasil e utilizado no mesmo dia em

que foi transportado da Corol ao laboratrio de desenvolvimento do projeto de

pesquisa.

4.1.3 Soro de Leite em p

O Soro de leite em p utilizado no presente trabalho foi cedido pela

empresa Alibra ingredientes Ltda., localizada em Marechal Cndido Rondon,

Paran, Brasil. Armazenado em cmara fria (4C).

A composio nutricional do soro de leite esta expressa na tabela 1.

Tabela 1. Composio centesimal do soro de leite integral.

Componente Soro de Leite integral

Energia, kcal/kg 23 kcal/100g

Matria seca, % 6,40 %

Protena bruta, % 0,73 %

Gordura, % 0,03 %

Lactose, % 5,00 %

Cinzas, % 0,64 %

pH 5,80 %

Fonte: Hauptli et al. 2005.

25

4.2 MTODOS

4.2.1 Preparo e fermentao das culturas

Para ativao da cultura liofilizada LYOFAST MT 036 LV, uma

alada da cultura foi inoculada em 100 ml de soro de leite reconstitudo a 7% (p/v),

previamente pasteurizado sob temperatura de 85C por 15 minutos, e incubado a

25C por 24 horas. Aps este perodo, Erlemeyers contendo 100 ml de soro de leite

reconstitudo a 7% (p/v) tambm pasteurizado foram inoculados com 1% (v/v) da

cultura previamente crescida, e incubados nas mesmas condies que o primeiro

ensaio. Foram realizadas trs repicagens sucessivas da cultura sob as mesmas

condies. De acordo com a figura 4.

Figura 4 - Processo de preparo do soro fermentado com a cultura Lyofast MT 036 LV.

Para ativao dos gros de Kefir, 10% (p/v) dos gros foram

inoculados em 100 ml de soro de leite reconstitudo a 7% (p/v), previamente

26

pasteurizado sob temperatura de 85C por 15 minutos, e incubados a 25C por 24

horas. Aps este perodo, Erlemeyers contendo 100 ml de soro de leite reconstitudo

a 7% (p/v) tambm pasteurizado foram inoculados com 10% (p/v) dos gros

previamente crescidos, e incubados nas mesmas condies que o primeiro ensaio.

Foram realizadas trs repicagens sucessivas dos gros sob as mesmas condies.

De acordo com a figura 5.

Figura 5 - Processo de preparo do soro fermentado com a cultura de gros de Kefir.

Aps a incubao, os gros de Kefir foram separados do soro

fermentado por filtrao em peneira de plstico (sanitizada por imerso em etanol

70%) e posteriormente lavados com gua estril (PIERMARIA et al., 2008), sendo

armazenados a 4C em soro de leite pasteurizado para posterior anlises.

4.2.2 Secagem do bagao de laranja adicionado de soro de leite fermentado

Aps as fermentaes do soro de leite com os gros de Kefir e com

a cultura liofilizada LYOFAST MT 036 LV 25C por 24 horas, o bagao de laranja,

27

esterilizado a 121C por 15 minutos, foi adicionado na proporo de 1:1 ao soro

fermentado, com o intuito de auxiliar o processo de secagem (estufa - SOC.FABBE

LTDA) e agir como aditivo de sabor, aroma e fonte de fibras.

A secagem foi conduzida sob temperatura de 40 C at peso

constante, aproximadamente 2 a 3 dias.

Aps a secagem, o material foi modo (Moinho IKA WORKS, Modelo

A11 Basic). De acordo com a figura 6.

Figura 6 - Processo de secagem aps adio do soro fermentado ao bagao de laranja esterilizado.

4.2.3 Viabilidade celular

28

4.2.3.1 Contagem de bactrias lcticas

As contagens de bactrias lcticas para ambos ingredientes

simbiticos produzidos com a fermentao pelos gros de Kefir e tambm pela

cultura liofilizada foram realizadas aps os processos de fermentao do soro,

secagem e em intervalos de 30 dias durante o perodo de armazenamento. Tambm

foram realizadas determinaes de viabilidade celular na barra de cereais produzida

e adicionada do ingrediente simbitico para a anlise sensorial, com o intuito de

verificar a quantidade de bactrias lcticas na poro fornecida aos consumidores.

A semeadura em placas para contagem das unidades formadoras de

colnia por mL ou g (UFC.mL-1 ou g-1) foi realizada pela tcnica de plaqueamento em

profundidade (Pour Plate), utilizando o meio de cultivo MRS-agar (Man, Rogosa,

Sharpe) para os Lactobacillus. As placas foram incubadas em estufa de cultura

(FANEM LTDA Modelo 002CB) a 37 C por 48 horas (SILVA et al., 2001).

Os experimentos foram conduzidos com duas repeties, sendo

submetidos anlise de varincia a ANOVA e processados no Programa Statistica

6.0. Os grficos foram plotados pelo Programa Microsoft Excel 2007.

4.2.3.2 Contagem de Lactococcus spp.

As contagens de Lactococcus spp. para ambos ingredientes

simbiticos produzidos com a fermentao pelos gros de Kefir e tambm pela

cultura liofilizada foram realizadas aps os processos de fermentao do soro,

secagem e em intervalos de 30 dias durante o perodo de armazenamento. Tambm

foram realizadas determinaes de viabilidade celular na barra de cereais produzida

e adicionada do ingrediente simbitico para a anlise sensorial, com o intuito de

verificar a quantidade de Lactococcus spp. na poro fornecida aos consumidores.

A semeadura em placas para contagem das unidades formadoras

de colnia por mL ou g (UFC.mL-1 ou g-1) foi realizada pela tcnica de plaqueamento

em profundidade (Pour Plate), utilizando o meio de cultivo Agar M17 para o

29

crescimento dos Lactococcus spp. As placas foram incubadas em estufa de cultura

(BOD, Modelo TE 391) a 25 C por 72 horas (SOUZA et al., 2003).

Os experimentos foram conduzidos com duas repeties genunas,

sendo submetidos anlise de varincia a ANOVA e processados no Programa

Statistica 6.0. Os grficos foram plotados pelo Programa Microsoft Excel 2007.

4.2.4 Contagem de Leveduras

As contagens de leveduras para ambos ingredientes simbiticos

produzidos com a fermentao pelos gros de Kefir e tambm pela cultura liofilizada

foram realizadas aps os processos de fermentao do soro, secagem e em

intervalos de 30 dias durante o perodo de armazenamento. Tambm foram

realizadas determinaes de viabilidade celular na barra de cereais produzida e

adicionada do ingrediente simbitico para a anlise sensorial, com o intuito de

verificar a quantidade de leveduras na poro fornecida aos consumidores.

A semeadura em placas para contagem das unidades formadoras de

colnia por mL ou g (UFC.mL-1 ou g-1) foi realizada pela tcnica de plaqueamento em

profundidade (Pour Plate), utilizando o meio de cultivo Agar PDA (gar batata

dextrose Acidificado) e adio de cido tartrico 10% at atingir pH 3,7 - 3,8, para o

crescimento de leveduras. As placas foram incubadas estufa de cultura (BOD,

Modelo TE 391) a 25 C por 72 horas (SILVA et al., 2001).

Os experimentos foram conduzidos com duas repeties genunas,

sendo submetidos anlise de varincia a ANOVA e processados no Programa

Statistica 6.0. Os grficos foram plotados pelo Programa Microsoft Excel 2007.

4.2.5 Armazenamento

A viabilidade das bactrias lcticas totais dos Lactococcus spp. e

das leveduras foi acompanhada durante 3 meses de armazenamento sob

30

temperatura de 25C, nas amostras dos ingredientes simbiticos fermentados com

os gros de Kefir e com a cultura LYOFAST MT 036 LV.

Pores de 20g dos ingredientes simbiticos desidratados foram

embaladas em saches de BOPP (polipropileno bio-orientado) metalizado

hermeticamente selados. Anlises de viabilidade celular foram realizadas a cada 30

dias em duplicata para clculo da mdia de duas repeties dos tratamentos.

Os experimentos foram submetidos anlise de varincia a ANOVA

e processados no Programa Statistic 6.0. Os grficos foram plotados pelo Programa

Microsoft Excel 2007.

4.2.6 Determinao de pectina total no bagao de laranja

A determinao de pectina total no bagao de laranja foi feita com a

utilizao do KIT Pectin Identification (Megazyme), antes e depois dos processos de

fermentao e secagem.

O principio deste kit baseia-se no fato da pectina ser dissolvida em

gua deionizada e ajustada ao pH 12, para a produo de regies poli-

galacturonicas e converso da pectina a pectato. O pectato incubado com a

enzima pectato liase, a qual hidrolisa os cidos poligalacturonicos produzindo

oligossacardeos insaturados que so lidos a 235 nm de absorbncia em

espectrofotmetro UV-vsivel (Cintra 20, Modelo GBC).

4.2.7 Quantificao de Exopolissacardeos (EPS)

A quantificao de EPS foi realizada de acordo com Souza (2004).

Exatamente 10 g do soro no inoculado (padro sem ao de microorganismos) e

tambm do soro fermentado com ambas culturas, foram cuidadosamente pesados

em tubos de centrfuga de 50 ml. Em seguida, foi adicionado 250 L de cido

31

tricloroactico 80 %, as amostras foram agitadas e armazenadas a 4C por 30

minutos para serem posteriormente centrifugadas (Centrfuga Ependorf, modelo -

5804 R) a 4C, 3000 rpm por 10 minutos. O sobrenadante de cada cultura foi

cuidadosamente transferido para outros tubos de centrfuga e os EPS precipitados

pela adio de etanol frio absoluto. Aps nova centrifugao a 13975xg a 4C por 20

minutos, os EPS separados foram dissolvidos em gua destilada.

A concentrao do carboidrato total foi determinada usando-se 1 ml dos

precipitados diludos em gua destilada, seguida da adio de fenol 5% (1 ml) e 5 ml

de cido sulfrico concentrado (10-20 segundos) em tubos de ensaio. Os tubos

foram mantidos em descanso por 10 minutos, posteriormente agitados e colocados

em banho Maria a 25 ou 30C, por 10 a 20 minutos. A leitura foi feita em

espectrofotmetro a 490 nm. As concentraes de carboidratos totais foram

determinadas a partir de uma curva de calibrao da glicose, em concentraes de

10 a 100 g/ml. Os resultados foram expressos como EPS-equivalente (mg/100 g

das amostras) para o soro fermentado com cada cultura. Os valores de EPS foram

calculados pela subtrao da quantidade de EPS do soro fermentado e dos EPS

presentes no soro no inoculado.

4.2.8 Anlises fsico-qumicas

Anlises de pH, atividade de gua (Aw) e umidade foram realizadas

em duplicata em cada amostra (soro fermentado com gros de Kefir e cultura

liofilizada) antes e depois dos processos de fermentao do soro e secagem soro

adicionado do bagao de laranja. O pH e a umidade foram determinados de acordo

com as normas oficiais do Instituto Adolfo Lutz (2005) e a atividade de gua (Aw)

mensurada em aparelho AQUALAB (modelo CX-2), previamente calibrado com gua

destilada.

Os experimentos foram conduzidos com duas repeties, sendo

submetidos anlise de varincia a ANOVA e processados no Programa Statistica

6.0.

32

4.2.9 Anlise microbiolgica ingrediente simbitico e barra de cereais

Para garantir as condies microbiolgicas e a segurana da barra

de cereais a ser oferecida aos provadores, anlises de Coliformes a 45C,

Staphylococcus aureus coagulase positiva e Salmonella spp. foram realizadas

segundo Silva et al. (2001), seguindo as determinaes da resoluo RDC n12,

de 2 de janeiro de 2001 (ANVISA).

4.2.10 Anlise sensorial

Anteriormente realizao dos testes sensoriais, o projeto foi submetido ao

Comit de tica em Pesquisa Envolvendo Seres Humanos da Universidade

Estadual de Londrina/Hospital Regional Norte do Paran, obtendo como parecer

aprovado com protocolo n 0179.0.268.000-08 e Anexo 175/08.

O ingrediente simbitico obtido no estudo foi adicionado a uma formulao de

barra de cereais devido ao fato de ser um ingrediente em p e por no ter sido feita

anlise de solubilidade do mesmo. Sendo um ingrediente com um sabor amargo e

que no seria muito bem aceito se servido diretamente, este foi adicionado a barra

de cereais com o intuito do sabor amargo ser mascarado pelo doce do acar e do

mel presente na mesma.

O produto formulado para a anlise sensorial foi uma barra de cereais, com

formulao caseira, onde se utilizou 4 colheres de sopa de acar, xcara de mel,

1 xcara de flocos de arroz crocantes, xcara de aveia em flocos; xcara de uva

passa e 1 colher de sopa de margarina, segundo o site Tudo Gostoso (2010). Aps

a formulao das barras de cereais, foram adicionados 10% (p/p) do ingrediente

simbitico desenvolvido com a cultura LYOFAST MT 036 LV para confeco da

primeira amostra a ser oferecida aos consumidores e 10% (p/p) do ingrediente

simbitico desenvolvido com a cultura de gros de Kefir para confeco da segunda

amostra. A porcentagem de p utilizado foi calculada em funo do nmero de

microorganismos viveis na barra de cereais (entre 106 e 108 UFC/g).

Paralelamente, foi preparada a terceira amostra, constituda pela formulao original

33

- padro (sem adio do ingrediente simbitico).

A aceitabilidade das amostras formuladas com os ingredientes

simbiticos foi determinada realizando-se o teste de aceitao com 89 provadores

potenciais, no treinados, utilizando escala hednica estruturada de nove pontos e

apresentao seqencial das amostras. A partir dos resultados, foi aplicada anlise

varincia (ANOVA), utilizando-se um intervalo de confiana de 95% e p

34

3- Ocupao 4- Escolaridade

( ) aluno _______________________ ( ) 1grau

( ) funcionrio ( ) 2grau

( ) professor ( ) 3 grau

( ) outro _______________________ ( ) outro

5. Gosta de barrinha de cereais: ( ) Sim ( ) No

6- Freqncia de Consumo de:

Barrinha de cereais:

( ) Nunca

( ) Ocasionalmente - _____ vezes por ano

( ) Moderadamente - _____ vezes por ms

( ) Freqentemente - _____ vezes por semana

Alimentos com alegaes funcionais:

( ) Nunca

( ) Ocasionalmente - ___ vezes por ano

( ) Moderadamente - ___vezes por ms

( ) Freqentemente - ___vezes por semana

Produtos probiticos:

( ) Nunca

( ) Ocasionalmente - ___vezes por ano

( ) Moderadamente - ___vezes por ms

( ) Freqentemente - ___vezes por semana

Produtos que costuma consumir :

Ficha de avaliao para o teste de aceitao global do consumidor.

35

Produto testado: Barrinha de cereais adicionada ou no, dos ingredientes

simbiticos formulado pelo pesquisador.

Nome: __________________________ _ Data: ____________

Por favor, avalie a amostra de barrinha de cereais utilizando a escala abaixo, para

dizer o quanto gostou ou desgostou do produto e, se desejado, faa comentrios

sobre ele.

1- Desgostei muitssimo

2- Desgostei muito

3- Desgostei

4- Desgostei ligeiramente

5- No gostei nem desgostei

6- Gostei ligeiramente

7- Gostei

8- Gostei muito

9- Gostei muitssimo

Cdigo da amostra _________ Nota _________

Cdigo da amostra _________ Nota _________

Cdigo da amostra _________ Nota _________

Voc consumiria este produto? _________________________________

36

5 RESULTADOS E DISCUSSO

5.1 FERMENTAO DO SORO DE LEITE

A Figura 7 mostra as mdias em log de determinaes realizadas em duplicatas

para bactrias lcticas aps a fermentao do soro de leite com a cultura liofilizada

Lyofast MT 036 LV e com os gros de Kefir.

Figura 7 - Mdias em log de determinaes realizadas em duplicatas para clulas viveis de bactrias lcticas aps a fermentao do soro de leite (7% p/v) com a cultura liofilizada Lyofast MT 036 LV e com os gros de Kefir.

De acordo com a Figura 7, possvel verificar que as bactrias lcticas da

cultura liofilizada tiveram um crescimento melhor no soro de leite do que as bactrias

lcticas presentes nos gros de Kefir, apresentando diferena significativa a nvel de

95% de confiana (p=0,05).

A Figura 8 mostra as mdias em log de determinaes realizadas em

duplicatas para os Lactococcus spp. aps a fermentao do soro de leite com a

cultura liofilizada Lyofast MT 036 LV e com os gros de Kefir.

8,86

7,27

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Lyofast Kefir

log

UFC

/ml

37

Figura 8 - Mdias em log de determinaes realizadas em duplicatas para as clulas viveis de Lactococcus spp. aps a fermentao do soro de leite (7% p/v) com a cultura liofilizada Lyofast MT 036 LV e com os gros de Kefir.

De acordo com a Figura 8, possvel verificar que para Lactococcus spp.

houve diferena significativa a nvel de 95% de confiana (p=0,05) entre as culturas

utilizadas, sendo a Lyofast a que apresentou um maior crescimento do Lactococcus

spp.

A Figura 9 mostra as mdias em log de determinaes realizadas em

duplicatas para as leveduras aps a fermentao do soro de leite com a cultura

liofilizada Lyofast MT 036 LV e com os gros de Kefir.

8,928,41

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Lyofast Kefir

log

UF

C/m

l

38

Figura 9 - Mdias em log de determinaes realizadas em duplicatas para as clulas viveis de leveduras aps a fermentao do soro de leite (7% p/v) com a cultura liofilizada Lyofast MT 036 LV e com os gros de Kefir.

De acordo com a Figura 9, possvel verificar que na fermentao do soro de

leite, houve diferena significativa a nvel de 95% de confiana (p=0,05) entre as

culturas utilizadas, sendo possvel verificar uma maior quantidade de leveduras nos

gros de Kefir do que na cultura liofilizada.

Estes resultados esto de acordo com Bissoli (2005), onde citado que o

Kefir apresenta uma contagem total variando em torno de 107 109 UFC/ml quando

fermentado em leite e de 106-108 UFC/ml quando fermentado em soro de leite,

devido a presena de mais nutrientes no leite integral, necessrios ao crescimento

das bactrias e leveduras do Kefir. A fermentao ocorre por ao de bactrias

lticas, leveduras e bactrias produtoras de cido actico e isto provoca uma

diminuio do pH do meio. Os microrganismos utilizados na elaborao dos

ingredientes simbiticos ficam contidos nos gros de Kefir, uma massa de diferentes

bactrias e leveduras embebida em uma matriz complexa de protenas e

carboidratos, a qual recuperada ao final do processo fermentativo (FARNWORTH,

MAINVILLE, 2003). A composio microbiolgica e qumica do Kefir indica que ele

um produto probitico complexo (FARNWORTH, 2005).

A Tabela 2 apresenta os valores de pH para o soro de leite fermentado com

ambas culturas. Nela, possvel observar que houve pouca variao de pH entre as

duas fermentaes, no sendo encontrada diferena significativa a nvel de 95% de

confiana (p=0,05).

5,88

8,6

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

Lyofast Kefir

log

UF

C/m

l

39

Tabela 2 - Mdia de determinaes realizadas em duplicatas para anlise de pH do soro de leite fermentado com a cultura liofilizada Lyofast MT 036 LV e com os gros de Kefir.

Cultura Soro fermentado

Lyofast 4,17 0,01

Kefir 4,23 0,03

Por mais que no tenha sido constatada diferena estatstica, notou-se um pH

menor na fermentao com a cultura Lyofast, possivelmente devido ao fato do maior

crescimento de bactrias lcticas presentes na cultura liofilizada.

A figura 10 mostra os aspectos do soro fermentado com as culturas de gros

de Kefir (A) e Lyofast MT 036 LV (B) a 25C por 24 horas.

Figura 10 - Soro de leite fermentado com as culturas de gros de Kefir (A) e Lyofast MT 036 LV (B) ) a 25C por 24 horas.

5.2 ADIO DO BAGAO DE LARANJA E SOBREVIVNCIA SECAGEM

Aps o processo de fermentao, foi adicionado o bagao de laranja ao soro

fermentado, na proporo de 1:1, funcionando como fonte de fibras, aroma e sabor,

e auxiliando no processo de secagem.

A figura 11 apresenta o aspecto do bagao de laranja (subproduto), aps a

A B

40

esterilizao a 121C por 15 minutos em autoclave, pronto para ser misturado ao

soro de leite fermentado com as culturas de gros de Kefir e Lyofast MT 036 LV.

Figura 11 - Bagao de laranja esterilizado a 121C por 15 minutos.

O bagao de laranja proporciona alto valor de pectina, principal fibra

encontrada no mesmo. Esta, quando ingerida, encontra-se principalmente

depositada na parede celular das clulas intestinais, atuando como material de

ligao entre as clulas e as bactrias presentes no clon (MANDERSON et al.

2005). A pectina considerada uma fibra com caractersticas espessante,

estabilizante (BOBBIO E BOBBIO, 1995) e tambm prebitica (FOOKS, FULLER,

GIBSON, 1999).

A figura 12 relaciona o nmero total de clulas viveis de bactrias lcticas

em log recuperadas aps a secagem nos ingredientes simbiticos fermentados com

Kefir e cultura liofilizada.

41

Figura 12 - Mdias em log de determinaes realizadas em duplicatas para clulas viveis de bactrias lcticas ps fermentao do soro de leite e ps adio do bagao de laranja e secagem.

De acordo com a figura 12, pode-se notar que houve uma diminuio de 0,79

ciclos log com a cultura Lyofast e um aumento de 1,56 ciclos log de bactrias

lcticas no soro fermentado com Kefir. Foi observada diferena estatstica a nvel de

95 % de confiana (p=0,05) entre as culturas. Sendo a cultura de Kefir a que

apresentou maior resistncia ao processo de secagem.

A tabela 3 apresenta as concentraes de exopolissacardeos encontradas

depois dos processos de fermentao do soro de leite e adio do bagao de laranja

secagem.

Tabela 3 - Mdias de determinaes realizadas em duplicatas da concentrao de exopolissacardeos ps fermentao do soro de leite e ps adio do bagao de laranja e secagem.

Cultura Soro fermentado Ps Secagem

Lyofast 19,3 0,1 mg/100g 20,2 0,1 mg/100g

Kefir 24,8 0,2 mg/100g 26,2 0,2 mg/100g

Nota-se pela tabela 3, que houve um aumento na produo de

exopolissacardeos durante o processo de secagem. Estes atuam como protetores

das clulas bacterianas, como pode-se notar nas contagens de clulas viveis de

bactrias acido lcticas e de Lactococcus spp depois do processo de secagem.

8,86

8,07

7,27

8,83

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

ps fermentao ps secagem

log

UF

C/m

l o

u g

Lyofast

Kefir

42

Alguns autores chegam a caracterizar os exopolissacardeos secretados pelo

Kefir, como substrato para microorganismos no intestino de hospedeiros, o que

condiciona a caracterizao dos exopolissacardeos funcionarem como prebiticos

(ASHWELL, 2001). Os exopolissacardeos tambm tm alto valor para a tecnologia

dos alimentos por aumentarem a textura e viscosidade de produtos (BROADBENT et

al., 2003). A produo de exopolissacardeos aumentada conforme a temperatura

de fermentao se altera (ABRAHAM, 1999). Frengova et al. (2002) identificaram

que a presena de leveduras aumenta em quase duas vezes a produo do

quefirano, exopolissacardeo produzido pelas bactrias dos gros Kefir. De acordo

com os autores citados explicam-se os resultados encontrados neste estudo, onde

pode-se verificar que houve um aumento na produo de exopolissacardeos aps o

processo de secagem, sendo a maior quantidade encontrada na fermentao pela

cultura dos gros de Kefir, que apresenta uma maior quantidade de leveduras.

A figura 13 apresenta a viabilidade em log de clulas de Lactococcus spp.

recuperadas aps a secagem.

Figura 13 - Mdias em log de determinaes realizadas em duplicatas para clulas viveis de Lactococcus spp. ps fermentao do soro de leite e ps adio do bagao de laranja e secagem.

De acordo com a figura 13, possvel notar diferena significativa a nvel de

95 % (p=0,05) na recuperao de ambas culturas. A cultura Lyofast apresentou uma

queda de 0,8 ciclos log quando comparada a cultura de Kefir (queda de 0,15 ciclos

log).

8,92

8,128,41 8,26

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

ps fermentao ps secagem

log

UF

C/m

l o

u g

Lyofast

Kefir

43

A figura 14 demonstra a viabilidade em log de clulas de leveduras

recuperadas aps a secagem.

Figura 14 - Mdias em log de determinaes realizadas em duplicatas de Leveduras ps fermentao do soro de leite e ps adio do bagao de laranja e secagem.

De acordo com a figura 14, verifica-se diferena significativa a nvel de 95 %

de confiana (p=0,05) entre as duas culturas aps a secagem, sendo verificado um

aumento de 0,79 ciclos log de clulas viveis de leveduras na cultura Lyofast e uma

queda de 1,38 ciclos log de clulas viveis nos gros de Kefir.

A tabela 4 mostra os valores de pH do bagao in natura, do soro de leite

fermentado e dos ingredientes simbiticos.

Tabela 4 - Mdias de determinaes realizadas em duplicata para o pH das culturas fermentadas no soro de leite antes e aps a adio do bagao de laranja no processo de secagem.

Cultura Bagao

de Laranja

Soro

fermentado

Soro + Bagao

ps secagem

Lyofast 8,0 0,00 4,17 0,01 4,99 0,01

Kefir 8,0 0,00 4,23 0,03 5,07 0,01

Segundo a tabela 4, constata-se um aumento no valor do pH aps a secagem

em ambas culturas. Este aumento devido adio do bagao de laranja que

apresenta um pH de 8,0, relativamente alto em relao ao soro fermentado.

5,88

6,67

8,6

7,22

0

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

ps fermentao ps secagem

log

UF

C/m

l o

u g

Lyofast

Kefir

44

A tabela 5 mostra o percentual de pectina do bagao in natura e aps sua

adio ao soro fermentado para o processo de secagem.

Tabela 5 - Percentual de pectina do bagao de laranja in natura e aps sua adio ao soro fermentado com os gros de Kefir e com a cultura Lyofast MT 036 LV para o processo de secagem.

Cultura Bagao in natura Bagao + soro

ps secagem

Kefir 19,391 % 15,304 %

Lyofast 19,391 % 16,621 %

Observando a tabela 5, possvel notar que houve um consumo da pectina

nas duas culturas, possivelmente devido a sua utilizao pelas bactrias presentes,

que a aproveitaram como substrato.

A utilizao da pectina por microorganismos, foi observado por Sunvold et al.

(1995), que observaram variaes significativas na produo de cidos graxos

volteis, quando a pectina foi utilizada como substrato de fermentao por diferentes

inculos fecais (gato, co, cavalo, humano e suno), sugerindo que as populaes

microbianas das diversas espcies animais diferem no s em composio, como

tambm, apresentam peculiaridades quanto s rotas metablicas para a

fermentao de um mesmo substrato. Neste estudo, eles constataram que, quando

utilizada a pectina, os microorganismos fermentadores produziram quantidades

significativamente variveis de acetato, propionato, butirato e lactato em comparao

com a fermentao realizada sem o uso da pectina.

A tabela 6 apresenta os valores de umidade do bagao in natura, do soro

fermentado acrescido de bagao de laranja e aps o processo de secagem

(ingredientes simbiticos).

45

Tabela 6 - Mdias de determinaes realizadas em duplicatas para o percentual de umidade do bagao in natura, do soro de leite fermentado acrescido de bagao de laranja e do ingrediente simbitico para as diferentes culturas.

Cultura Bagao in natura Soro fermentado

+ bagao

Ps Secagem

Lyofast 69,74 0,05 % 91,53 0,04 % 4,67 0,01 %

Kefir 69,73 0,05 % 92,24 0,03 % 4,79 0,00 %

possvel notar que o valor da umidade e da Aw dos ingredientes simbiticos

baixo (aw = 0,411) que favorece a vida de prateleira dos ingredientes simbiticos,

pois a atividade de gua baixa funciona como uma barreira para o

aparecimento/contaminao de bactrias patognicas e deteriorantes.

A atividade de gua (aw) baseia-se na quantidade de gua livre, que no se

encontra comprometida com as molculas constituintes do produto e que est

disponvel para as reaes fsicas, qumicas e biolgicas (WELTI e VERGARA,

1997). No caso de um substrato que apresente baixa atividade de gua, h

interrupo do metabolismo dos microorganismos presentes, inibindo o seu

desenvolvimento e/ou reproduo.

Segundo Bell e Labuza (1992), para muitos alimentos o crescimento

microbiano prevenido com aw entre 0,6-0,7. Portanto para o caso dos ingredientes

simbiticos desenvolvidos neste estudo, que apresentaram um valor de aw = 0,411,

o crescimento microbiano praticamente nulo, evitando desta forma o processo de

contaminao e/ou crescimento de patgenos.

A figura 15 mostra os aspectos do ingrediente simbitico desidratado depois

dos processos de fermentao do soro de leite e secagem.

46

Figura 15 - Ingrediente simbitico desidratado fermentado com gros de Kefir (A) e com a cultura Lyofast MT 036 LV (B).

De acordo com a figura 15, possvel observar que os ingredientes simbiticos

apresentaram aparncia similar. Aps a moagem, os ingredientes simbiticos ainda

apresentaram algum aspecto granular, principalmente devido ao fato da pectina ser

muito higroscpica, o que favorece a aglomerao dos gros (EASTWOOD, 1992).

5.3 ARMAZENAMENTO

A viabilidade de clulas de bactrias lcticas, Lactococcus spp. e leveduras

do ingrediente simbitico foi verificada durante 3 meses de armazenamento e os

resultados expressados abaixo.

A figura 16 demonstra a sobrevivncia de bactrias lcticas durante 3 meses

de armazenamento do ingrediente simbitico.

A B

47

Figura 16 - Mdia de duas determinaes em log para a viabilidade de bactrias lcticas durante 3 meses de armazenamento do ingrediente simbitico fermentado com Kefir e cultura Lyofast MT 036 LV.

De acordo com a figura 16, verifica-se que desde o incio do processo

fermentativo, as bactrias lcticas da cultura Lyofast tiveram uma diminuio de 1,79

ciclos log, alcanando ao final do perodo de armazenamento 7,07 ciclos log. J as

bactrias lcticas da cultura de Kefir apresentaram uma sobrevivncia maior, porm

sem diferena estatstica a nvel de 95 % de confiana (p=0,05), tendo uma

diminuio de apenas 0,05 ciclos log, atingindo no final do armazenamento 7,22

ciclos log.

A figura 17 mostra a sobrevivncia de Lactococcus spp. durante 3 meses de

armazenamento do ingrediente simbitico.

0123456789

10

log

UF

C/m

l o

u g

Lyofast

Kefir

48

Figura 17 - Mdia de duas determinaes em log para a viabilidade de Lactococcus spp. durante 3 meses de armazenamento do ingrediente simbitico fermentado com Kefir e cultura Lyofast MT 036 LV.

Na figura 17, observa-se que desde o incio do processo fermentativo, os

Lactococcus spp. da cultura Lyofast tiveram uma diminuio de 1,12 ciclos log,

alcanando ao final do perodo de armazenamento 7,8 ciclos log. J os Lactococcus

spp. da cultura de Kefir apresentaram uma sobrevivncia menor, porm sem

diferena estatstica a nvel de 95 % de confiana (p=0,05), tendo uma diminuio de

0,79 ciclos log, atingindo no final do armazenamento 7,62 ciclos log.

A figura 18 representa a viabilidade das leveduras durante 3 meses de

armazenamento dos ingredientes simbiticos.

0123456789

10

log

UF

C/m

l o

u g

Lyofast

Kefir

49

Figura 18 - Mdia de duas determinaes em log para a viabilidade de leveduras durante 3 meses de armazenamento do ingrediente simbitico fermentado com Kefir e cultura Lyofast MT 036 LV.

Segundo a figura 18, as leveduras da cultura Lyofast tiveram uma diminuio

de 0,35 ciclos log, alcanando ao final do perodo de armazenamento 5,53 ciclos log.

J as leveduras da cultura de Kefir apresentaram uma sobrevivncia menor, com

diferena estatstica a nvel de 95 % de confiana (p=0,05), tendo uma diminuio de

1,07 ciclos log, atingindo no final do armazenamento 7,53 ciclos log.

A tabela 7 mostra os valores de exopolissacardeos encontrados nos

ingredientes simbiticos fermentado com Kefir e Lyofast MT 036 LV ao longo do

tempo de armazenamento.

Tabela 7 - Mdias de determinaes realizadas em duplicatas da concentrao de exopolissacardeos ps fermentao do soro de leite, ps adio do bagao de laranja e secagem e durante 3 meses de armazenamento do ingrediente simbitico.

Cultura Soro

fermentado

Ps

Secagem

1 ms 2 meses 3 meses

Lyofast 21,3 mg/100g 22,7 mg/100g 22,5 mg/100g 22,6 mg/100g 20,9 mg/100g

Kefir 24,8 mg/ 100g 26,2 mg/100g 25,9 mg/100g 25,7 mg/100g 23,4mg/100g

Na tabela 7, pode-se notar que houve um consumo do exopolissacardeo

produzido ps fermentao e secagem durante o processo de armazenamento.

Conforme citado anteriormente, os exopolissacardeos secretados pelos mesmos

0123456789

10

log

UF

C/m

l o

u g

Lyofast

Kefir

50

presentes no Kefir podem agir como substrato para os microorganismos, atuando

neste caso como prebiticos (ASHWELL, 2001).

5.4 CONTAGEM DE BACTRIAS LCTICAS, Lactococcus spp., LEVEDURAS E ANLISES

MICROBIOLGICAS

5.4.1 Contagem de bactrias lcticas, Lactococcus spp. e leveduras na barra

de cereais

Segundo a legislao vigente Anvisa (ANVISA, 2007), para que um produto

contendo microorganismos probiticos possa utilizar a alegao de que contribui

para o equilbrio da flora intestinal, este deve conter de 108-109 UFC na poro

diria do produto.

Aps a adio dos ingredientes simbiticos desidratados obtidos no trabalho

s barras de cereais correspondente as amostras (Lyofast amostra 1 e Kefir

amostra 2), foram realizadas as contagens de clulas viveis de bactrias lcticas,

Lactococcus spp. e leveduras de modo a garantir que a barra de cereais

apresentasse a quantidade necessria de probiticos na poro fornecida aos

consumidores (10g).

A tabela 8 representa os resultados obtidos para as anlises em questo.

Tabela 8 - Anlise de bactrias lcticas, Lactococcus spp. e leveduras presente na poro de barra de cereais (10g) fornecida aos consumidores.

Microorganismos Lyofast (amostra 1) Kefir (amostra 2)

Bactrias Lcticas 3,6 x 107 UFC/g 7,2 x 107 UFC/g

Lactococcus spp. 5,4 x 107 UFC/g 6,42 x 107 UFC/g

Leveduras 1,7x 107 UFC/g 2,3 x 106 UFC/g

Segundo a tabela 8 pode-se comprovar que o consumo de 10 g da barra de

cereais seria o ideal para corresponder necessidade diria de microorganismos

probiticos segundo a legislao vigente.

51

5.4.2 Anlise microbiolgica para microorganismos indicadores e patognicos

na barra de cereais

Para garantir a qualidade e segurana da barra de cereais utilizada na anlise

s