Desenvolvimento de Metodologia para Análise de Interferentes Endócrinos

Região Metropolitana

Bacias Hidrográficas Piracicaba, Capivari e Jundiaí

Interferentes Endócrinos

Objetivo e Justificativa

•Adaptar e desenvolver metodologia analítica para identificar e quantificar Interferentes Endócrinos (IE);

•Cromatografia Líquida de alta resolução acoplado a Espectrometria de Massa EFS-CLAE/EM;

•Dissertação de Mestrado no programa de pós graduação da FT-UNICAMP, sob orientação da professora Dra. Maria Aparecida Carvalho de Medeiros.

Revisão Bibliográfica

Definição de Interferentes Endócrinos

•A agencia de proteção ambiental americana (USEPA) define um IE como “um agente exógeno que interfere com síntese, secreção, transporte, ligação, ação ou eliminação de hormônio natural no corpo que são responsáveis pela manutenção, reprodução, desenvolvimento e/ou comportamento dos organismos”.

Interferentes Endócrinos

Estruturas dos Analitos

Ação dos IEs no organismo

Assim, os IEs podem agir de diversas maneiras:•Biossíntese do hormônio 17β-estradiol derivado do colesterol, desequilibrando a produção de hormônios.

Excreção

Excreção diária (µg) per capita de estrogênios por humano

Categoria Estrona 17 β-Estradiol Estriol 17α-Etinilestradiol

Homens 3,9 1,6 1,5 -

Mulheres

menstruando8 3,5 4,8 -

Mulheres grávidas 600 259 6.000 -

Mulheres sob uso

de anticoncepcional- - - 35

Toxicologia dos Hormônios

A ocorrência de disruptores endócrinos no ambiente, sua persistência e os danos que podem causar, têm contribuído para aumentar a consciência de que os animais, inclusive o Homo sapiens, podem ser adversamente atingidos por diversas patogenias, desordens do trato reprodutivo, redução do número de espermatozóides e redução da fertilidade e, até mesmo, cânceres. (SNYDER et al., 2001).

Toxicologia dos Hormônios

Vários grupos de pesquisas acreditam que grande parte da população masculina sofre com o decréscimo na qualidade do sêmen nas últimas décadas, e que isso parece estar relacionado à presença de estradióis nas águas (DAMSTRA et al., 2002).

Determinação dos hormônios

Os baixos níveis de contaminação e a complexidade das matrizes ambientais exigem o uso de métodos com alta sensibilidade e seletividade para a análise de resíduos de estrógenos (LAFLEUR e SCHUG, 2011).

Metodologia

AmostragemAmostragem FiltraçãoFiltração Ajuste de pHAjuste de pH

Concentração de compostos de

interesse

Concentração de compostos de

interesse

Suspensão com solvente adequado

Suspensão com solvente adequadoSecagemSecagem

eluiçãoeluição

Análise Instrumental

Análise Instrumental

Metodologia

Extração

• Cartucho C18, 500 mg de fase sólida;• Bomba de vácuo .

Metodologia

Condições operacionais do Cromatógrafo Líquido

•Coluna C18 , 150 mm x 2,1 mm, com partículas de 5,0 μm;

•Temperatura da coluna = 20 ºC;

•Volume de injeção = 5 μL;

•Fase móvel A = Metanol grau HPLC;

•Fase móvel B = Água pura degaseificada e filtrada.

•Fase móvel C = Hidróxido de Amônio 0,2%

Metodologia

Condições operacionais do Espectometro de Massa

•Fonte de Ionização = ESI modo negativo;

•Capilar do electrospray = 3,69 kV;

•Extrator = 5 V, Cone = 5 V;

•Temperatura de dessolvatação = 280 ºC;

•Temperatura da Fonte = 150 ºC;

•Fluxo de Nitrogênio na dessolvatação = 600 L/h;

•Fluxo de Nitrogênio no Cone = 120 L/h.

Metodologia

Cromatógrafo Líquido

Metodologia

Gradiente de eluição

Tempo (min) Fase Móvel A

Água (%)

Fase Móvel B

Metanol (%)

Fase Móvel C

NH4OH (%)

0 40 50 10

3 43 47 10

38 49 41 10

38.1 40 50 10

46 40 50 10

Resultados

 Compostos 

Íon

Precursor

(m/z)

Tempo de

Retenção (min)

Coef. Correlação da curva

padrão (50 a 500ppb)

Detector MS Detector FLU

Estriol 287,3 7,576 0,9969 0,9975

Estrona 269,3 28,431 0,9965 Não Calculado

17β-estradiol 271,3 32,518 0,9984 0,9992

17α-Etinilestradiol 295,0 35,687 0,9991 0,9984

Resultados obtidos

Resultados

Cromatogramas dos IEs

Cromatograma de Separação no sistema CLAE-MS da mistura de padrões

Cromatograma de Separação sistema CLAE-FLU da mistura de padrões

Conclusão

• A metodologia estudada no sistema CLAE-MS foi adequada para quantificar os 4 interferentes endócrinos (Estriol, Estrona, 17β-estradiol e 17α-Etinilestradiol) em uma única corrida cromatográfica, com LD que podem chegar a 5ng/L desde que se utilize a técnica de extração SPE (extração em fase sólida).

• Assim, esta metodologia pode ser aplicada nos monitoramentos de qualidade da água dos mananciais superficiais, que abastecem a região metropolitana de Campinas/SP.

Conclusão

• Quanto ao sistema CLAE-FLU, a metodologia desenvolvida permite quantificar 3 interferentes endócrinos (Estriol, 17β-estradiol e 17α-Etinilestradiol) em única corrida cromatográfica, com limites de detecção comparáveis com o detector MS.

Referências Bibliográficas

APHA, AWWA, WPCF; “Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater”, 21st edition, Washington, USA, 2005.

ADAMS, C., FILALI-MEKNASSI, Y., AURIOL, M. “Natural and Synthetic Hormones Degradation by Ozonation”, In: IOA - 17th World Ozone Congress, Strasbourg, 2005.

COLEMAN, H. M., ABDULLAH, M. I., EGGINS, B. R., PALMER, F. L. “Photocatalitic Degradation of 17β-Oestradiol, Oestriol and 17α-Ethynyloestradiol in Water Monitored Using Fluorescence Spectroscopy”, Applied Catalysis B: Environmental, v. 55, pp. 23-30, 2005.Ghiselli G, Jardim WF;. “Interferentes endócrinos no ambiente.” - Química Nova. 2007; 30: 695-706.

TERNES, T. A., STUMPH, M., MUELLER, J., HABERER, K., WILKEN, R. -D., SERVOS, M. “Behavior and Occurrence of Estrogens in Municipal Sewage Treatment Plants – I. Investigations in Germany, Canada and Brazil”, The Science of the Total Environment, v. 225, pp. 81-90, 1999b.

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