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UNIVERSIDADE DE SO PAULO

FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS

Programa de Ps-Graduao em Frmaco e Medicamentos

rea de Produo e Controle Farmacutico

Desenvolvimento de metodologias indicativas de

estabilidade para medicamentos utilizados como diurticos

Aline de Souza

So Paulo

2015

UNIVERSIDADE DE SO PAULO

FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS

Programa de Ps-Graduao em Frmaco e Medicamentos

rea de Produo e Controle Farmacutico

Desenvolvimento de metodologias indicativas de

estabilidade para medicamentos utilizados como diurticos

Aline de Souza

Verso Original

Dissertao para obteno do grau de MESTRE

Orientadora: Profa. Dra. Erika Rosa Maria Kedor-Hackmann

So Paulo

2015

Aline de Souza

Desenvolvimento de metodologia indicativa de estabilidade

para medicamentos utilizados como diurticos

Comisso Julgadora

da

Dissertao para obteno do grau de Mestre

Profa. Dra. Erika Rosa Maria Kedor-Hackmann

orientador/presidente

1 Examinador

2 Examinador

So Paulo, ______ de _______________ de 2015.

Quem quer passar alm do Bojador

Tem que passar alm da dor

Fernando Pessoa Mar Portugus

Deus que at aqui me ajudou. Me

capacitando e me direcionando

neste projeto

A meus pais por todo apoio e

amor incondicional e por

serem exemplos para

minha vida.

A minha irm, Gabi, por ser

minha amiga e sempre me

encorajar.

Ao meu irmo, Vitor, pelos

momentos alegres e pelo

carinho.

AGRADECIMENTOS

Deus por me guiar e me dar entendimentos para ultrapassar obstculos

meus pais por sempre apoiarem meus sonhos.

meus irmos, Gabi e Vitor, por todo amor, carinho e incentivo

s minhas amigas Aline, Raquel e Priscila pelo incentivo.

Profa. Dra. Erika Rosa Maria Kedor-Hackmann pela orientao,

ensinamentos e constantes incentivos para a realizao deste trabalho

Profa. Maria Segunda Aurora-Prado pela ajuda, convvio e contribuio ao

meu trabalho

Aos atuais e antigos colegas do laboratrio: Laura, Andrea, Claudia, Marcela,

Grazielle, Elenice, Antnio, Adriana, Carol, Isabel , Aline e Vernica obrigada

pela amizade, companhia e auxlio.

Aos professores Humberto Gomes Ferraz e Felipe Rebelo Loureno pela

colaborao em etapas importantes do estudo.

Aos tcnicos de laboratrio Adriana, Leandro e Charles pelas informaes e

auxlio.

Aos professores e funcionrios do Laboratrio de Controle de Qualidade de

Frmacos, Profa. Dra. Maria Ins Rocha Miritello Santoro, Prof Dr Jorge Luiz

Seferin Martins e funcionria ria Raimunda da Silva, muito obrigada.

Ao Departamento de Farmcia da Faculdade de Cincias Farmacuticas da

Universidade de So Paulo, pela oportunidade e realizao deste trabalho.

todos os meus amigos e familiares, muito obrigada.

todas as pessoas que fizeram parte da minha vida e de alguma forma

contriburam para que eu chegasse at aqui, meu eterno agradecimento.

SUMRIO

ABREVIATURAS ............................................................................................. 10

LISTA DE FIGURAS ........................................................................................ 12

LISTA DE TABELAS ....................................................................................... 19

RESUMO.......................................................................................................... 21

1. INTRODUO ......................................................................................... 24

2. JUSTIFICATIVA ...................................................................................... 25

3. REVISO DA BIBLIOGRAFIA ................................................................ 26

3.1 MTODOS INDICATIVOS DE ESTABILIDADE: .................................................... 26

3.1.1 Gerao da Amostra ................................................................................ 26

3.1.1.1 Hidrlise ............................................................................................... 28

3.1.1.2 Oxidao .............................................................................................. 28

3.1.1.3. Degradao Trmica ........................................................................... 29

3.1.1.4. Degradao por fotlise ...................................................................... 29

3.1.2. Desenvolvimento de metodologia .......................................................... 30

3.1.3. Validao de metodologia ...................................................................... 31

3.2 DIURTICOS. .............................................................................................. 32

3.2.1 Classificao dos diurticos .................................................................... 34

3.2.1.1 Inibidores da Anidrase Carbnica ........................................................ 34

3.2.1.2 Diurticos Osmticos ............................................................................ 35

3.2.1.3 Inibidores do simporte de Na+- K+- 2Cl- (diurticos de ala; diurticos de

alto limiar) ......................................................................................................... 35

3.2.1.4 Inibidores do simporte de Na+- Cl- (diurticos tiazdicos e semelhantes

aos tiazdicos) .................................................................................................. 36

3.2.1.5 Inibidores dos canais de Na+ do epitlio renal (diurticos poupadores de

K+) 36

3.2.1.6 Antagonistas dos receptores mineralocorticoides (antagonistas da

aldosterona; diurticos poupadores de K+) ...................................................... 37

3.2.1.7 Furosemida .......................................................................................... 37

3.2.1.8 Hidroclorotiazida ................................................................................... 39

3.3 TCNICAS UTILIZADAS NO DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIAS ANALTICAS DE

ESTABILIDADE ..................................................................................................... 40

3.3.1 Eletroforese Capilar (CE) ......................................................................... 40

3.3.1.1 Instrumentao ..................................................................................... 41

3.3.1.2 Fluxo Eletrosmtico .............................................................................. 42

3.3.1.3 Classificao da eletroforese capilar .................................................... 42

3.3.1.4 Vantagens e Limitaes ....................................................................... 45

3.3.2 Cromatografia Lquida de alta eficincia (HPLC) .................................... 47

3.3.2.1 Instrumentao ..................................................................................... 48

3.3.2.2 Princpios de Separao ...................................................................... 49

3.3.2.3 Vantagens e limitaes ........................................................................ 52

4. OBJETIVOS ............................................................................................ 53

4.1 OBJETIVO GERAL ....................................................................................... 53

4.2 OBJETIVOS ESPECFICOS ............................................................................ 53

5. MATERIAL E MTODOS ........................................................................ 54

5.1 MATERIAL .................................................................................................. 54

5.1.1 Amostras ................................................................................................. 54

5.1.2 Placebo ................................................................................................... 54

5.1.3 Solventes e reagentes: ........................................................................... 54

5.1.4 Solues e tampes ............................................................................... 55

5.1.5 Equipamentos ......................................................................................... 55

5.1.6 Consumveis ........................................................................................... 56

5.2 MTODOS .................................................................................................. 56

5.2.1 Caracterizao do padro ....................................................................... 56

5.2.1.1 Temperatura de fuso .......................................................................... 56

5.2.1.2 Espectrometria de absoro na regio do Infravermelho .................... 57

5.2.1.3 Espectrofotometria de absoro na regio do Ultravioleta .................. 57

5.2.1.4 Calorimetria exploratria diferencial .................................................... 57

5.2.1.5 Anlise por termogravimetria ............................................................... 57

5.2.2 Desenvolvimento de metodologia analtica ............................................ 58

5.2.2.1 Eletroforese capilar.............................................................................. 58

5.2.2.1.1 Eletrlito ........................................................................................... 58

5.2.2.1.2 Preparo das amostras ...................................................................... 58

5.2.2.2 Cromatografia Liquda de Alta Eficincia ............................................. 59

5.2.2.2.1 Preparo das amostras ...................................................................... 60

5.2.2.2.2 Fase mvel ....................................................................................... 60

5.2.3 Degradao forada .............................................................................. 61

5.2.3.1 Degradao por hidrlise .................................................................... 61

5.2.3.2 Degradao por hidrlise cida ........................................................... 62

5.2.3.3 Degradao por hidrlise alcalina ....................................................... 62

5.2.3.4 Degradao por oxidao ................................................................... 63

5.2.3.5 Degradao por termlise ................................................................... 63

5.2.3.6 Degradao por Fotlise ..................................................................... 64

5.2.4 Validao de metologia analtica ........................................................... 65

5.2.4.1 Eletroforese capilar.............................................................................. 65

5.2.4.1.1 Condies cromatogrficas .............................................................. 65

5.2.4.1.2 Especificidade .................................................................................. 65

5.2.4.1.3 Linearidade ....................................................................................... 66

5.2.4.1.1 Limite de deteco e Limite de quantificao ................................... 67

5.2.4.1.2 Preciso do sistema ......................................................................... 68

5.2.4.1.3 Preciso intermediria ...................................................................... 68

5.2.4.1.4 Repetibilidade ................................................................................... 68

5.2.4.1.5 Exatido ........................................................................................... 68

5.2.4.1.6 Robustez .......................................................................................... 69

5.2.4.2 Cromatografia liquda de alta eficincia............................................... 70

5.2.4.2.1 Condies cromatogrficas .............................................................. 70

5.2.4.2.2 Especificidade .................................................................................. 70

5.2.4.2.3 Linearidade ....................................................................................... 71

5.2.4.2.1 Limite de deteco e Limite de quantificao ................................... 72

5.2.4.2.2 Preciso sistema .............................................................................. 72

5.2.4.2.3 Preciso intermediria ...................................................................... 72

5.2.4.2.4 Repetibilidade ................................................................................... 73

5.2.4.2.5 Exatido ........................................................................................... 73

5.2.4.2.6 Robustez .......................................................................................... 74

5.2.4.2.7 Adequabilidade do sistema (System Suitability) ............................... 74

6. RESULTADOS E DISCUSSO ............................................................... 75

6.1 CARACTERIZAO E IDENTIFICAO DA FUROSEMIDA..................................... 75

6.1.1 Temperatura de fuso ............................................................................ 75

6.1.2 Espectrofotometria no ultravioleta (UV): ................................................ 75

6.1.3 Espectroscopia de absoro na regio do infravermelho (IV):............... 76

6.1.4 Calorimetria exploratria diferencial (DSC): ........................................... 77

6.1.5 Anlise por termogravimetria ................................................................. 78

6.2 ELETROFORESE CAPILAR ............................................................................ 79

6.2.1 Desenvolvimento de metodologia analtica ............................................. 79

6.2.1.1 Degradao forada da furosemida .................................................... 80

6.2.1.1 Padro interno ..................................................................................... 83

6.2.1.2 Eletrlito .............................................................................................. 85

6.2.2 Validao de metodologia analtica por eletroforese capilar .................. 87

6.2.2.1 Especificidade ..................................................................................... 87

6.2.2.2 Linearidade .......................................................................................... 95

6.2.2.3 Limite de Deteco e Limite de Quantificao .................................... 95

6.2.2.4 Preciso do Sistema ............................................................................ 97

6.2.2.5 Preciso intermediria ......................................................................... 97

6.2.2.6 Repetibilidade ...................................................................................... 97

6.2.2.7 Exatido .............................................................................................. 98

6.2.2.8 Robustez ............................................................................................. 98

6.2.2.9 Adequabilidade do sistema (System Suitability) .................................. 99

6.3 CROMATOGRAFIA LIQUDA DE ALTA EFICINCIA........................................... 100

6.3.1 Desenvolvimento de metodologia analtica ........................................... 100

6.3.2 Validao de metodologia analtica por HPLC ...................................... 103

6.3.2.1 Especificidade ................................................................................... 103

6.3.2.2 Linearidade ........................................................................................ 109

6.3.2.3 Limite de Deteco e Limite de Quantificao .................................. 110

6.3.2.4 Preciso do Sistema .......................................................................... 111

6.3.2.5 Preciso intermediria ....................................................................... 111

6.3.2.6 Repetibilidade .................................................................................... 112

6.3.2.7 Exatido ............................................................................................ 112

6.3.2.8 Robustez ........................................................................................... 113

6.3.2.9 Adequabilidade do sistema (System Suitability) ................................ 114

6.4 COMPARAO ENTRE TCNICAS DE FSCE E HPLC PARA A QUANTIFICAO DE

FUROSEMIDA .................................................................................................... 114

7. CONCLUSO ........................................................................................ 116

8. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ..................................................... 117

10

Souza, A.

LISTA DE ABREVIATURAS

a Intercepto da curva

ACN Acetonitrila

Anvisa Agencia nacional de vigilncia sanitria

b Inclinao da curva

CE Eletroforese capilar

CEC Eletrocromatografia capilar

CGE Eletroforese capilar em gel

CIEF Eletroforese por focalizaoisoeltrica

CITP Esotacoforese capilar

di Dimetro interno do capilar

DP Desvio padro

DPR Desvio padro relativo

DSC Calorimetria exploratria diferencial

FDA Food and Drug Administration

FEO Fluxo eletroosmtico

FSCE Eletroforese capilar em soluo livre

FUR Furosemida

HID Hidroclorotiazida

HPLC Cromatografia lquida de alta eficincia

ICH International Conference on Harmonization

IFA Insumo farmacutico ativo

IR Infravermelho

k Fator de capacidade

LD Limite de deteco

11

Souza, A.

LQ Limite de quantificao

lux Unidade de medida de iluminamento

MECK Cromatografia capilar eletrocintico micelar

MEECK Cromatografia capilar eletrocintico micelar por microemulso

N Nmero de pratos tericos

Pd Produto de degradao (em FSCE)

PD Produto de degradao (em HPLC)

PI Ponto isoeltrico

R Resoluo

TBS Tetraborato de sdio

TGA Termogravimetria

Tr Tempo de reteno

USP United States Pharmacopeia

UV Ultravioleta

12

Souza, A.

LISTA DE FIGURAS

Figura 1: O nfron. BC, Cpsula de Bowman; G, glomrulo; PCT, tbulo contorcido proximal; PST, tbulo reto proximal; DHL, ramo descendente da ala de Henle; TALH, ramo espesso ascendente da ala de Henle; DCT, tbulo contorcido distal; CD, ducto coletor. (KOROLKOVAS; BURCKHALTER, 1982) ............................................................................ 34

Figura 2: Estrutura qumica da Furosemida .................................................... 38

Figura 3: Estrutura qumica da hidroclorotiazida ............................................. 39

Figura 4: Diagrama esquemtico do sistema CE. R1 e R2 so os recipientes contendo soluo eletroltica onde se encontram os eletrodos (e1 e e2) conectados fonte de potncia (F). Os crculos brancos representam os ons, as reas representam as massas e os sinais negativos e positivos indicam as cargas. A deteco radial da absoro molecular representada por uma fonte de radiao (v) e um detector (D) acoplado a um computador (C). No retngulo mostrado o registro temporal dos sinais (GERVASIO et al., 2003). ............................................................... 41

Figura 5: Representao esquemtica do fluxo eletroosmtico em FSCE (QUEIROZ; JARDIM, 2001). ..................................................................... 42

Figura 6: Representao de um equipamento de HPLC (CZAPLICKI, 2013) . 49

Figura 7: Espectro de absoro na regio UV para a furosemida 5,0 g/mL em NaOH 0,1M ............................................................................................... 76

Figura 8: Espectro de absoro da furosemida na regio do infravermelho (IV). .................................................................................................................. 76

Figura 9: Curva DSC da furosemida obtida no intervalo de 50 a 400C, razo de aquecimento de 10C/min e fluxo de 50,0ml/min. ................................ 78

Figura 10: Curva TGA da furosemida obtida no intervalo de 0 a 800C, razo de aquecimento de 10C/min e fluxo de 50,0ml/min ................................. 78

Figura 11: Estrutura qumica e ionizao da furosemida (Chemicalize.org, 2015) ......................................................................................................... 79

Figura 12: Eletroferograma da degradao forada da Furosemida em diferentes meios degradantes Condies: eletrlito tetraborato de sdio a 20mmol/L, metanol 20%, pH 9,3; tenso 20kV; temperatura de 25C; deteco UV a 273nm e injeo por presso 0,5psi/8s. ........................... 81

Figura 13: Esquema da degradao de furosemida em meio cido (Adaptado de BUNDGAARD; NRGAARD; NIELSEN, 1988) ................................... 82

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13

Souza, A.

Figura 14: Eletroferograma da furosemida (500,0g.mL-1) e hidroclorotiazida (500,0g.mL-1) . Condies: eletrlito tetraborato de sdio a 20mmolL-1, metanol 20%, pH 9,3; tenso 20kV; temperatura de 25C; deteco UV a 273nm e injeo por presso 0,5psi/8s. .................................................... 84

Figura 15: Eletroferograma da furosemida (500,0g.mL-1) e hiroclorotiazida (500,0g.mL-1) com diferentes concentraes de TBS, metanol e diferentes voltagens. A) 20mM TBS, 20% MeOH, 20kV; B) 20mM TBS, 20% MeOH e 25kV; C) 20mM TBS, 10% MeOH e 20kV; D) 20mM TBS, 10% MeOH e 25kV. .................................................................................. 85

Figura 16: Eletroferograma da furosemida (500,0g.mL-1) e hiroclorotiazida (500,0g.mL-1) com diferentes concentraes de TBS, metanol e diferentes voltagens. A) 30mM TBS, 20% MeOH, 20kV; B) 30mM TBS, 20% MeOH e 25kV; C) 30mM TBS, 10% MeOH e 25kV; D) 30mM TBS, 10% MeOH e 20kV ................................................................................... 86

Figura 17: Eletroferograma do padro de furosemida (100,0 g mL-1), adicionada do padro interno hidroclorotiazida (100,0 g mL-1). Condies: eletrlito contendo 20,0 mmol L-1 de tetraborato de sdio, pH 9,3. Capilar de slica fundida 30,2 cm x 50,0 m i.d; injeo hidrodinmica por presso 0,5 psi por 5,0 s; voltagem aplicada: +25 kV; temperatura: 25C. Deteco UV em 273 nm. Picos: HID e FUR. ........................................................... 87

Figura 18: Eletroferograma do placebo da amostra de comprimidos de furosemida (100,0 g mL-1). Condies: eletrlito contendo 20,0 mmol L-1 de tetraborato de sdio, pH 9,3. Capilar de slica fundida 30,2 cm x 50,0 m d.i.; injeo hidrodinmica por presso 0,5 psi por 5,0 s; voltagem aplicada: +25 kV; temperatura: 25C. Deteco UV em 273 nm. ............. 88

Figura 19: Eletroferograma da soluo padro de furosemida (100,0 g mL-1) exposto degradao forada neutra, adicionada da soluo do padro interno hidroclorotiazida (100,0 g mL-1). Condies: eletrlito contendo 20,0 mmol L-1 de tetraborato de sdio, pH 9,3. Capilar de slica fundida 30,2 cm x 50,0 m d.i; injeo hidrodinmica por presso 0,5 psi por 5,0 s; voltagem aplicada: +25 kV; temperatura: 25C. Deteco UV em 273 nm. Picos: HID e FUR. ..................................................................................... 88

Figura 20: Eletroferograma da amostra de comprimidos de furosemida (100,0 g mL-1) exposta a degradao forada neutra, adicionada da soluo do padro interno hidroclorotiazida (100,0 g mL-1). Condies: eletrlito contendo 20,0 mmol L-1 de tetraborato de sdio, pH 9,3. Capilar de slica fundida 30,2 cm x 50,0 m d.i.; injeo hidrodinmica por presso 0,5 psi por 5,0 s; voltagem aplicada: +25 kV; temperatura: 25C. Deteco UV em 273 nm. Picos: HID e FUR. ....................................................................... 88

Figura 21: Eletroferograma do placebo da amostra de comprimidos de furosemida (100,0 g mL-1) exposto a degradao forada neutra. Condies: eletrlito contendo 20,0 mmol L-1 de tetraborato de sdio, pH 9,3. Capilar de slica fundida 30,2 cm x 50,0 m d.i.; injeo hidrodinmica por presso 0,5 psi por 5,0 s; voltagem aplicada: +25 kV; temperatura:

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14

Souza, A.

25C. Deteco UV em 273 nm. ............................................................... 89

Figura 22: Eletroferograma do padro de furosemida (100,0 g mL-1) expostos degradao forada cida, adicionada da soluo do padro interno hidroclorotiazida (100,0 g mL-1). Condies: eletrlito contendo 20,0 mmol L-1 de tetraborato de sdio, pH 9,3. Capilar de slica fundida 30,2 cm x 50,0 m d.i; injeo hidrodinmica por presso 0,5 psi por 5,0 s; voltagem aplicada: +25 kV; temperatura: 25C. Deteco UV em 273 nm. Picos: HID, FUR e Pd1.............................................................................. 89

Figura 23: Eletroferograma da amostra de comprimidos de furosemida (100,0 g mL-1) exposta a degradao forada cida, adicionada da soluo do padro interno hidroclorotiazida (100,0 g mL-1). Condies: eletrlito contendo 20,0 mmol L-1 de tetraborato de sdio, pH 9,3. Capilar de slica fundida 30,2 cm x 50 m d.i.; injeo hidrodinmica por presso 0,5 psi por 5 s; voltagem aplicada: +25 kV; temperatura: 25C. Deteco UV em 273 nm. Picos: HID, FUR e Pd1. ...................................................................... 89

Figura 24: Eletroferograma do placebo da amostra de comprimidos de furosemida (100,0 g mL-1) exposto a degradao forada cida. Condies: eletrlito contendo 20,0 mmol L-1 de tetraborato de sdio, pH 9,3. Capilar de slica fundida 30,2 cm x 50,0 m d.i.; injeo hidrodinmica por presso 0,5 psi por 5,0 s; voltagem aplicada: +25 kV; temperatura: 25C. Deteco UV em 273 nm. ............................................................... 90

Figura 25: Eletroferograma do padro de furosemida (100,0 g mL-1) exposto degradao forada bsica, adicionada da soluo do padro interno hidroclorotiazida (100,0 g mL-1). Condies: eletrlito contendo 20,0 mmol L-1 de tetraborato de sdio, pH 9,3. Capilar de slica fundida 30,2 cm x 50,0 m d.i; injeo hidrodinmica por presso 0,5 psi por 5,0 s; voltagem aplicada: +25 kV; temperatura: 25C. Deteco UV em 273 nm. Picos: HID e FUR. ....................................................................................................... 90

Figura 26: Eletroferograma da amostra de comprimidos de furosemida (100,0 g mL-1) exposta a degradao forada bsica, adicionada da soluo do padro interno hidroclorotiazida (100,0 g mL-1). Condies: eletrlito contendo 20,0 mmol L-1 de tetraborato de sdio, pH 9,3. Capilar de slica fundida 30,2 cm x 50,0 m d.i.; injeo hidrodinmica por presso 0,5 psi por 5,0 s; voltagem aplicada: +25 kV; temperatura: 25C. Deteco UV em 273 nm. Picos: HID e FUR. ....................................................................... 90

Figura 27: Eletroferograma do placebo da amostra de comprimidos de furosemida (100,0 g mL-1) exposto a degradao forada bsica. Condies: eletrlito contendo 20,0 mmol L-1 de tetraborato de sdio, pH 9,3. Capilar de slica fundida 30,2 cm x 50,0 m d.i.; injeo hidrodinmica por presso 0,5 psi por 5,0 s; voltagem aplicada: +25 kV; temperatura: 25C. Deteco UV em 273 nm. ............................................................... 91

Figura 28: Eletroferograma do padro de furosemida (100,0 g mL-1) exposto degradao forada oxidativa, adicionada da soluo do padro interno hidroclorotiazida (100,0 g mL-1). Condies: eletrlito contendo 20,0 mmol

15

Souza, A.

L-1 de tetraborato de sdio, pH 9,3. Capilar de slica fundida 30,2 cm x 50,0 m d.i; injeo hidrodinmica por presso 0,5 psi por 5,0 s; voltagem aplicada: +25 kV; temperatura: 25C. Deteco UV em 2735 nm. Picos: Pd2, HID, FUR, Pd3 e Pd4. ....................................................................... 91

Figura 29: Eletroferograma da amostra de comprimidos de furosemida (100,0 g mL-1) exposta a degradao forada oxidativa, adicionada da soluo do padro interno hidroclorotiazida (100,0 g mL-1). Condies: eletrlito contendo 20,0 mmol L-1 de tetraborato de sdio, pH 9,3. Capilar de slica fundida 30,2 cm x 50,0 m d.i.; injeo hidrodinmica por presso 0,5 psi por 5,0 s; voltagem aplicada: +25 kV; temperatura: 25C. Deteco UV em 273 nm. Picos: Pd2, HID, FUR, Pd3 e Pd4. .............................................. 91

Figura 30: Eletroferograma do placebo da amostra de comprimidos de furosemida (100,0 g mL-1) exposto a degradao forada oxidativa. Condies: eletrlito contendo 20,0 mmol L-1 de tetraborato de sdio, pH 9,3. Capilar de slica fundida 30,2 cm x 50,0 m d.i.; injeo hidrodinmica por presso 0,5 psi por 5,0 s; voltagem aplicada: +25 kV; temperatura: 25C. Deteco UV em 273 nm. ............................................................... 92

Figura 31: Eletroferograma do padro de furosemida (100,0 g mL-1) exposto degradao forada trmica, adicionada da soluo do padro interno hidroclorotiazida (100,0 g mL-1). Condies: eletrlito contendo 20,0 mmol L-1 de tetraborato de sdio, pH 9,3. Capilar de slica fundida 30,2 cm x 50,0 m d.i; injeo hidrodinmica por presso 0,5 psi por 5,0 s; voltagem aplicada: +25 kV; temperatura: 25C. Deteco UV em 273 nm. Picos: HID e FUR. ....................................................................................................... 92

Figura 32: Eletroferograma da amostra de comprimidos de furosemida (100,0 g mL-1) exposta a degradao forada trmica, adicionada da soluo do padro interno hidroclorotiazida (100,0 g mL-1). Condies: eletrlito contendo 20,0 mmol L-1 de tetraborato de sdio, pH 9,3. Capilar de slica fundida 30,2 cm x 50,0 m d.i.; injeo hidrodinmica por presso 0,5 psi por 5,0 s; voltagem aplicada: +25 kV; temperatura: 25C. Deteco UV em 273 nm. Picos: HID e FUR. ....................................................................... 92

Figura 33: Eletroferograma do placebo da amostra de comprimidos de furosemida (100,0 g mL-1) exposto a degradao forada trmica. Condies: eletrlito contendo 20,0 mmol L-1 de tetraborato de sdio, pH 9,3. Capilar de slica fundida 30,2 cm x 50,0 m d.i.; injeo hidrodinmica por presso 0,5 psi por 5,0 s; voltagem aplicada: +25 kV; temperatura: 25C. Deteco UV em 273 nm. ............................................................... 93

Figura 34: Eletroferograma do padro de furosemida (100,0 g mL-1) exposto degradao forada fotoltica, adicionada da soluo do padro interno hidroclorotiazida (100,0 g mL-1). Condies: eletrlito contendo 20,0 mmol L-1 de tetraborato de sdio, pH 9,3. Capilar de slica fundida 30,2 cm x 50,0 m d.i; injeo hidrodinmica por presso 0,5 psi por 5,0 s; voltagem aplicada: +25 kV; temperatura: 25C. Deteco UV em 273 nm. Picos: HID e FUR. ....................................................................................................... 93

16

Souza, A.

Figura 35: Eletroferograma da amostra de comprimidos de furosemida (100 g mL-1) exposta a degradao forada fotoltica, adicionada da soluo do padro interno hidroclorotiazida (100,0 g mL-1). Condies: eletrlito contendo 20,0 mmol L-1 de tetraborato de sdio, pH 9,3. Capilar de slica fundida 30,2 cm x 50,0 m d.i.; injeo hidrodinmica por presso 0,5 psi por 5,0 s; voltagem aplicada: +25 kV; temperatura: 25C. Deteco UV em 273 nm. Picos: HID e FUR. ....................................................................... 93

Figura 36: Eletroferograma do placebo da amostra de comprimidos de furosemida (100,0 g mL-1) exposto a degradao forada fotoltica. Condies: eletrlito contendo 20,0 mmol L-1 de tetraborato de sdio, pH 9,3. Capilar de slica fundida 30,2 cm x 50,0 m d.i.; injeo hidrodinmica por presso 0,5 psi por 5,0 s; voltagem aplicada: +25 kV; temperatura: 25C. Deteco UV em 273 nm. ............................................................... 94

Figura 37: Curva analtica da soluo padro de furosemida na faixa de 70,0 a 130,0 g mL-1 utilizando FSCE ................................................................ 96

Figura 38: Esquema do resduo da furosemida............................................... 97

Figura 39: Cromatograma furosemida obtido com: A) ACN: gua acidificada com cido frmico 0,1% 30:70 v/v; B) ACN: tampo gua acidificada com cido frmico 0,1% 50:50 v/v; C) ACN: tampo gua acidificada com cido frmico 0,1% 70:30 v/v ............................................................................ 101

Figura 40: Cromatograma da determinao do padro de furosemida (10,0 g mL-1). Condies: Coluna Shim-pack CLC-ODS(M) (250 mm x 4.6 mm, 5 m), fase mvel constituda por gua:acetonitrila (50:50 v/v) com cido fosfrico 0,1%. Velocidade do fluxo de 1,0 mL.min-1, 20,0 l de injeo de amostra, comprimento de onda em 273nm. Pico: FUR .......................... 102

Figura 41: Cromatograma do placebo da amostra de comprimidos de furosemida. Condies: Coluna Shim-pack CLC-ODS(M) (250 mm x 4.6 mm, 5 m), fase mvel constituda por gua:acetonitrila (50:50 v/v) com cido fosfrico 0,1%. Velocidade do fluxo de 1,0 mL.min-1, 20,0 l de injeo de amostra, comprimento de onda em 273nm. .......................... 103

Figura 42: Cromatograma do padro de furosemida (10,0 g mL-1) exposta degradao forada neutra. Condies: Coluna Shim-pack CLC-ODS(M) (250 mm x 4.6 mm, 5 m), fase mvel constituda por gua:acetonitrila (50:50 v/v) com cido fosfrico 0,1%. Velocidade do fluxo de 1,0 mL.min-1, 20,0 l de injeo de amostra, comprimento de onda em 273nm. Pico: FUR ......................................................................................................... 103

Figura 43: Cromatograma da amostra de comprimidos de furosemida (10,0 g mL-1) exposta degradao forada neutra. Condies: Coluna Shim-pack CLC-ODS(M) (250 mm x 4.6 mm, 5 m), fase mvel constituda por gua:acetonitrila (50:50 v/v) com cido fosfrico 0,1%. Velocidade do fluxo de 1,0 mL.min-1, 20,0 l de injeo de amostra, comprimento de onda em 273nm. Pico: FUR ................................................................................... 104

17

Souza, A.

Figura 44: Cromatograma do placebo da amostra de comprimidos de furosemida exposto degradao forada neutra. Condies: Coluna Shim-pack CLC-ODS(M) (250 mm x 4.6 mm, 5 m), fase mvel constituda por gua:acetonitrila (50:50 v/v) com cido fosfrico 0,1%. Velocidade do fluxo de 1,0 mL.min-1, 20,0 l de injeo de amostra, comprimento de onda em 273nm. ........................................................... 104

Figura 45: Cromatograma do padro de furosemida (10,0 g mL-1) exposto degradao forada cida. Condies: Coluna Shim-pack CLC-ODS(M) (250 mm x 4.6 mm, 5 m), fase mvel constituda por gua:acetonitrila (50:50 v/v) com cido fosfrico 0,1%. Velocidade do fluxo de 1,0 mL.min-1, 20,0 l de injeo de amostra, comprimento de onda em 273nm. Picos: PD1 e FUR. ............................................................................................. 104

Figura 46: Cromatograma da amostra de comprimidos de furosemida (10,0 g mL-1) exposta degradao forada cida. Condies: Coluna Shim-pack CLC-ODS(M) (250 mm x 4.6 mm, 5 m), fase mvel constituda por gua:acetonitrila (50:50 v/v) com cido fosfrico 0,1%. Velocidade do fluxo de 1,0 mL.min-1, 20,0 l de injeo de amostra, comprimento de onda em 273nm. Picos: PD1 e FUR. ..................................................................... 105

Figura 47: Cromatograma do placebo da amostra de comprimidos de furosemida exposto degradao forada cida. Condies: Coluna Shim-pack CLC-ODS(M) (250 mm x 4.6 mm, 5 m), fase mvel constituda por gua:acetonitrila (50:50 v/v) com cido fosfrico 0,1%. Velocidade do fluxo de 1,0 mL.min-1, 20,0 l de injeo de amostra, comprimento de onda em 273nm. .................................................................................................... 105

Figura 48: Cromatograma do padro de furosemida (10,0 g mL-1) exposto degradao forada bsica. Condies: Coluna Shim-pack CLC-ODS(M) (250 mm x 4.6 mm, 5 m), fase mvel constituda por gua:acetonitrila (50:50 v/v) com cido fosfrico 0,1%. Velocidade do fluxo de 1,0 mL.min-1, 20,0 l de injeo de amostra, comprimento de onda em 273nm. Pico: FUR. ........................................................................................................ 105

Figura 49: Cromatograma da amostra de comprimidos de furosemida (10,0 g mL-1) exposta degradao forada bsica. Condies: Coluna Shim-pack CLC-ODS(M) (250 mm x 4.6 mm, 5 m), fase mvel constituda por gua:acetonitrila (50:50 v/v) com cido fosfrico 0,1%. Velocidade do fluxo de 1,0 mL.min-1, 20,0 l de injeo de amostra, comprimento de onda em 273nm. Pico: FUR. .................................................................................. 106

Figura 50: Cromatograma do placebo da amostra de comprimidos de furosemida exposto degradao forada bsica. Condies: Coluna Shim-pack CLC-ODS(M) (250 mm x 4.6 mm, 5 m), fase mvel constituda por gua:acetonitrila (50:50 v/v) com cido fosfrico 0,1%. Velocidade do fluxo de 1,0 mL.min-1, 20,0 l de injeo de amostra, comprimento de onda em 273nm. ........................................................... 106

Figura 51: Cromatograma do padro de furosemida (10,0 g mL-1) exposto degradao forada oxidativa. Condies: Coluna Shim-pack CLC-

18

Souza, A.

ODS(M) (250 mm x 4.6 mm, 5 m), fase mvel constituda por gua:acetonitrila (50:50 v/v) com cido fosfrico 0,1%. Velocidade do fluxo de 1,0 mL.min-1, 20,0 l de injeo de amostra, comprimento de onda em 273nm. Picos: PD2, PD3, PD4 e FUR .................................................... 106

Figura 52: Cromatograma da amostra de comprimidos de furosemida (10,0 g mL-1) exposta degradao forada oxidativa. Condies: Coluna Shim-pack CLC-ODS(M) (250 mm x 4.6 mm, 5 m), fase mvel constituda por gua:acetonitrila (50:50 v/v) com cido fosfrico 0,1%. Velocidade do fluxo de 1,0 mL.min-1, 20,0 l de injeo de amostra, comprimento de onda em 273nm. Picos: PD2, PD3, PD4 e FUR .................................................... 107

Figura 53: Cromatograma do placebo da amostra de comprimidos de furosemida exposto degradao forada oxidativa. Condies: Coluna Shim-pack CLC-ODS(M) (250 mm x 4.6 mm, 5 m), fase mvel constituda por gua:acetonitrila (50:50 v/v) com cido fosfrico 0,1%. Velocidade do fluxo de 1,0 mL.min-1, 20,0 l de injeo de amostra, comprimento de onda em 273nm. ........................................................... 107

Figura 54: Cromatograma do padro de furosemida (10,0 g mL-1) exposto degradao forada trmica. Condies: Coluna Shim-pack CLC-ODS(M) (250 mm x 4.6 mm, 5 m), fase mvel constituda por gua:acetonitrila (50:50 v/v) com cido fosfrico 0,1%. Velocidade do fluxo de 1,0 mL.min-1, 20,0 l de injeo de amostra, comprimento de onda em 273nm. Pico: FUR ................................................................................... 107

Figura 55: Cromatograma da amostra de comprimidos de furosemida (10,0 g mL-1) exposta degradao forada trmica. Condies: Coluna Shim-pack CLC-ODS(M) (250 mm x 4.6 mm, 5 m), fase mvel constituda por gua:acetonitrila (50:50 v/v) com cido fosfrico 0,1%. Velocidade do fluxo de 1,0 mL.min-1, 20,0 l de injeo de amostra, comprimento de onda em 273nm. Pico: FUR ................................................................................... 108

Figura 56: Cromatograma do placebo da amostra de comprimidos de furosemida exposto degradao forada trmica. Condies: Coluna Shim-pack CLC-ODS(M) (250 mm x 4.6 mm, 5 m), fase mvel constituda por gua:acetonitrila (50:50 v/v) com cido fosfrico 0,1%. Velocidade do fluxo de 1,0 mL.min-1, 20,0 l de injeo de amostra, comprimento de onda em 273nm. ........................................................... 108

Figura 57: Cromatograma do padro de furosemida (10,0 g mL-1) exposta degradao forada fotlise. Condies: Coluna Shim-pack CLC-ODS(M) (250 mm x 4.6 mm, 5 m), fase mvel constituda por gua:acetonitrila (50:50 v/v) com cido fosfrico 0,1%. Velocidade do fluxo de 1,0 mL.min-1, 20,0 l de injeo de amostra, comprimento de onda em 273nm. Pico: FUR ......................................................................................................... 108

Figura 58: Cromatograma da amostra de comprimidos de furosemida (10,0 g mL-1) exposta degradao forada fotlise. Condies: Coluna Shim-pack CLC-ODS(M) (250 mm x 4.6 mm, 5 m), fase mvel constituda por gua:acetonitrila (50:50 v/v) com cido fosfrico 0,1%. Velocidade do fluxo

19

Souza, A.

de 1,0 mL.min-1, 20,0 l de injeo de amostra, comprimento de onda em 273nm. Pico: FUR ................................................................................... 109

Figura 59: Curva analtica da furosemida por HPLC. .................................... 111

Figura 60: Esquema do resduo da furosemida............................................. 111

20

Souza, A.

LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Classificao dos testes, segundo a sua finalidade: ........................ 31

Tabela 2: Ensaios necessrios para validao de mtodos analticos, segundo

sua finalidade: ................................................................................. 32

Tabela 3: Vantagens e desvantagens do CE em relao cromatografia

Lquida (HPLC) (Adaptado de PICO; RODRIGUEZ; MANES, 2003).

........................................................................................................ 46

Tabela 4: Eletrlitos para FSCE. ..................................................................... 58

Tabela 5: Fases mvel utilizadas no desenvolvimento do mtodo analtico para

HPLC. .............................................................................................. 61

Tabela 6: Preparo de solues para o teste de linearidade ............................. 67

Tabela 7: Procedimento experimental para teste de exatido em mtodo de

FSCE. .............................................................................................. 69

Tabela 8: Variaes empregadas no teste de robustez para FSCE. ............... 70

Tabela 9: Preparo de solues para o teste de linearidade ............................. 72

Tabela 10: Procedimento experimental para teste de exatido em mtodo de

HPLC. .............................................................................................. 73

Tabela 11: Variaes empregadas no teste de robustez para HPLC. ............. 74

Tabela 12: Comprimentos de onda terico e experimental dos padres de

furosemida ....................................................................................... 75

Tabela 13: Bandas do espectro de absoro da furosemida ........................... 77

Tabela 14: Condies empregadas no teste de estresse ................................ 81

Tabela 15: Substncias analisadas para padro interno em FSCE. ................ 83

Tabela 16: Resultados obtidos empregando FSCE aps condies de estresse

da furosemida .................................................................................. 94

Tabela 17: Resultados Obtidos em curvas analticas da furosemida .............. 96

Tabela 18: Resultados obtidos nas determinaes da repetibilidade e da

preciso intermediria do mtodo por FSCE. .................................. 97

Tabela 19: Resultados obtidos na determinao da recuperao do mtodo

especfico por FSCE. ....................................................................... 98

Tabela 20: Resultados obtidos nos testes de robustez com variao no tempo

21

Souza, A.

de injeo, proporo de metanol no eletrlito e voltagem para a

determinao de furosemida por FSCE em comparao com

condio inicial ................................................................................ 99

Tabela 21: Resultados estatsticos obtidos no teste de adequabilidade do

sistema para FSCE. ...................................................................... 100

Tabela 22: Resultados obtidos empregando HPLC aps condies de estresse

da furosemida ................................................................................ 109

Tabela 23: Resultados obtidos em curvas analticas da furosemida ............. 110

Tabela 24: Resultados obtidos nas determinaes da repetibilidade e da

preciso intermediria do mtodo por HPLC ................................. 112

Tabela 25: Resultados obtidos na determinao da recuperao do mtodo

especfico por HPLC. ..................................................................... 113

Tabela 26: Resultados obtidos nos testes de robustez com variao no fluxo,

proporo de acetonitrila na fase mvel e temperatura para a

determinao de furosemida por HPLC em comparao com

condio inicial. ............................................................................. 113

Tabela 27: Resultados estatsticos obtidos no teste de adequabilidade do

sistema para HPLC. ...................................................................... 114

Tabela 28: Parmetros estatsticos e estudo comparativo entre FSCE e HPLC,

para a determinao de furosemida, concentrao 40,0 mg/cp. ... 115

22

Souza, A.

Resumo

SOUZA, A. Desenvolvimento de metodologia indicativa de estabilidade

para medicamentos utilizados como diurticos. 2015. 121f. Dissertao de

Mestrado Faculdade de Cincias Farmacuticas, Universidade de So Paulo,

So Paulo, 2015.

Os diurticos aumentam o fluxo urinrio e a excreo de sdio e so

utilizados para ajustar o volume e/ou a composio dos lquidos corporais em

uma variedade de situaes clnicas. A furosemida um agente diurtico

potente que induz uma poderosa diurese. utilizada no tratamento de edema

associado com o corao e doenas renais. Nesta pesquisa objetivou-se

desenvolver mtodos indicativos de estabilidade para a furosemida, por

eletroforese capilar em soluo livre (FSCE) e cromatografia liquida de alta

eficincia (CLAE). O mtodo por FSCE utilizou um capilar de slica fundida com

comprimento total de 30,2 cm x 50,0 m d.i. O tampo utilizado foi tetraborato

de sdio 2,0 mmol L-1 e 10% de metanol, injeo hidrodinmica 0,5 psi/5s,

tenso aplicada +25 kV, deteco em 273 nm e temperatura a 25C. O tempo

de migrao da furosemida foi de 1,8 minutos. O mtodo obteve boa

linearidade no intervalo de 70,0 a 130,0 g.mL-1 com coeficiente de correlao

maior de 0,99. Os limites de deteco e de quantificao foram 6,2 g.mL-1 e

20,6 g.mL-1, respectivamente. A preciso do sistema foi inferior a 2,0%. A

repetibilidade e preciso intermediria foram inferiores a 5,0%. A recuperao

mdia foi de 102,1 %. No teste de especificidade, foram detectados trs

potenciais produtos de degradao com os seguintes tempos de reteno 1,3

2,0 e 2,2 min. O mtodo por CLAE utilizou uma coluna Shim-pack CLC-

ODS(M) (250mm x4.6mm, 5m). A fase mvel era constituda de

acetonitrila:gua (50:50) com 0,1% de cido frmico. O fluxo foi de 1.0 mL min-1

e deteco em 273 nm e temperatura a 30 1 C. O mtodo apresentou boa

linearidade nas concentraes entre 7,0 e 13 g.mL-1; com coeficiente de

correlao maior de 0,99. E tempo de reteno para furosemida foi de 4,9

minutos. Os limites de deteco e de quantificao foram 0,6 g.mL-1 e 1,9

g.mL-1, respectivamente. A preciso do sistema foi inferior a 1,0%. A

repetibilidade e preciso intermediria foram inferiores a 3,0%. A recuperao

mdia foi de 105,1 %. No teste de especificidade, foram detectados trs

potenciais produtos de degradao com os seguintes tempos de reteno 2,4,

3,1 e 3,8 min.

Palavras chaves: mtodo indicativo de estabilidade, cromatografia lquida,

eletroforese capilar, degradao forada, produtos de degradao.

23

Souza, A.

Abstract

SOUZA, A. Development of stability-indicating assay for diuretics drugs.

2015. 121 f. Dissertao de Mestrado Faculdade de Cincias Farmacuticas,

Universidade de So Paulo, So Paulo, 2015.

Diuretics increase urine flow and sodium excretion and are used to adjust

volume and / or composition of body fluids in a variety of clinical situations.

Furosemide is a potent diuretic agent that induces a strong diuresis. It is used in

the treatment of edema associated with heart and kidney disease. This

research aimed to develop stability indicative methods for furosemide, by

capillary electrophoresis in free solution (FSCE) and high-performance liquid

chromatography (HPLC). The method FSCE used a fused silica capillary with a

total length of 30.2 cm x 50.0 um di The buffer used was sodium tetraborate 2.0

mmol L-1 and 10% methanol, hydrodynamic injection 0.5 psi / 5s, +25 kV

applied voltage, detection at 273 nm and 25 C. The furosemide migration time

was 1.8 minutes. The method achieved good linearity in the range of 70.0 to

130.0 g.mL-1 with correlation coefficient higher of 0.99. The limits of detection

and quantification were 6.2 and 20.6 g.mL-1 g.mL-1, respectively. The system

accuracy was less than 2.0%. The repeatability and intermediate precision were

less than 5.0%. The average recovery was 102.1%. The specificity test

detected three potential degradation products with the following retention times

1.3, 2.0 and 2.2 min. The HPLC method used a Shim-pack CLC-ODS (M)

column (250mm x 4.6mm, 5m). The mobile phase consisted of acetonitrile:

water (50:50) with 0.1% formic acid. The flow rate was 1.0 mL min-1, detection

at 273 nm and temperature at 30 1C. The method showed good linearity in

concentrations between 7.0 and 13.0 g.mL-1; with correlation coefficient higher

of 0.99. Retention time for furosemide was 4.9 minutes. The limits of detection

and quantification were 0.6 g.mL-1 and 1.9 g.mL-1, respectively. The system

accuracy was less than 1.0%. The repeatability and intermediate precision were

less than 3.0%. The average recovery was 105.1%. The specificity test

detected three potential degradation products of the following retention times of

2.4, 3.1 and 3.8 min.

Key words: stability indicating method, liquid chromatography, capillary

electrophoresis, forced degradation, the degradation products.

24

Souza, A.

1. Introduo __________________________________________

Um mtodo indicativo de estabilidade um procedimento analtico

quantitativo validado capaz de detectar as mudanas, com o tempo, nas

propriedades pertinentes das substncias ativas e seus produtos. Um mtodo

indicativo de estabilidade mede precisamente as substncias ativas, sem a

interferncia de produtos de degradao e excipientes. As agncias

reguladoras recomendam a utilizao do mtodo indicativo de estabilidade para

estudos de estabilidade (AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA,

2013; FDA, 2014).

O desenvolvimento do mtodo indicativo de estabilidade envolve trs

etapas: a gerao da amostra, onde a molcula ser estressada para forar a

degradao; o desenvolvimento da metodologia indicativa de estabilidade; e

por ltimo, a validao do mtodo indicativo de estabilidade. (SWARTZ;

KRULL, 2005).

O ensaio de estresse permite identificar os provveis produtos de

degradao, dando subsdio ao estabelecimento da via de degradao e a

estabilidade intrnseca da molcula (ICH, 2003).

Aps a gerao da amostra um mtodo analtico deve ser

desenvolvido envolvendo alguns fatores como: fase mvel, fase estacionria,

uso de tampes e diversos pH. A seletividade e a especificidade so dois

parmetros importantes. Segundo a Farmacopeia Americana a avaliao da

especificidade deve envolver pureza do pico baseado na deteco UV/visvel

por arranjo de diodo (DAD) e/ou por deteco por espectrometria de massas

(MS) (SWARTZ; KRULL, 2005).

Diferentes mtodos tm diferentes requerimentos quando se trata de

validao. A Farmacopeia Americana (USP, 2014) reconhece quatro categorias

e define as caractersticas de desempenho analtico que devem ser medidos

para validar cada tipo de mtodo. O mtodo indicativo de estabilidade

includo na categoria 2, procedimentos analticos para determinao de

impurezas em frmacos a granel ou compostos de degradao em produtos

farmacuticos acabados (SWARTZ; KRULL, 2005; USP, 2014).

25

Souza, A.

2. JUSTIFICATIVA______________________________________

As empresas responsveis pelo desenvolvimento e fabricao de

medicamentos realizam normalmente os testes e estudos constantes em

farmacopeias. E poucas monografias citam a anlise de produtos de

degradao e poucos fabricantes conhecem metodologias validadas para

deteco e quantificao destes produtos.

A International Conference on Harmonization (ICH) e Food Drug

Administration (FDA) colocam como diretriz a necessidade de desenvolver

metodologias indicativas de estabilidade (FDA, 2014; ICH Q1A (R2), 2003).

Alm disso, a Farmacopeia Americana em seu captulo: Estudos de

Estabilidade durante a Fabricao recomenda que as amostras retiradas

durante o processo de fabricao devem ser analisadas por mtodos

quantitativos indicativos de estabilidade (USP, 2014).

A Anvisa na RE n 899 de 29 de maio de 2003 (AGNCIA

NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA, 2003), por meio do "Guia para

validao de mtodos analticos e bioanalticos" recomenda a validao de

mtodos analticos com anlise de produtos de degradao e impurezas. A

RDC n 58 de 20 de dezembro de 2013, estabelece parmetros para a

notificao, identificao e qualificao de produtos de degradao em

medicamentos com substncias ativas sintticas e semissintticas,

classificados como novos, genricos e similares, e d outras providncias

(AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA, 2013).

26

Souza, A.

3. REVISO DA BIBLIOGRAFIA __________________________

3.1 Mtodos Indicativos de Estabilidade:

O mtodo indicativo de estabilidade um mtodo que utilizado

para a anlise da estabilidade de amostras na indstria farmacutica. Com o

advento dos guias do ICH a exigncia do estabelecimento de mtodo indicativo

de estabilidade tornou-se mais claramente ordenado. As orientaes exigem a

realizao de estudos de degradao forada sob uma variedade de

condies, como pH, luz, oxidao, calor seco, etc, e a separao do frmaco

a partir de produtos de degradao (ICH, 2003).

Segundo o guia do ICH Q1A Testes de Estabilidade para novos

Medicamentos e Produtos a anlise dessas caractersticas deve ser feita por

mtodo indicativo de estabilidade validado (BAKSHI; SINGH, 2002).

O desenvolvimento do mtodo indicativo de estabilidade envolve trs

etapas: a gerao da amostra, onde a molcula ser estressada para forar a

degradao; o desenvolvimento da metodologia indicativa de estabilidade; e

por ltimo, a validao do mtodo indicativo de estabilidade (SWARTZ; KRULL,

2005).

Segundo o ICH Q1A (R2) o ensaio de estresse realizado em um

nico lote do frmaco e deve incluir o efeito da temperatura, umidade, oxidao

e fotlise. O teste deve tambm avaliar a susceptibilidade do frmaco a

hidrlise numa vasta gama de pH quando em soluo ou suspeno (ICH,

2003).

3.1.1 Gerao da Amostra

O teste de degradao forada ou estresse realizado para

demonstrar a especificidade no desenvolvimento de mtodos indicativos de

estabilidade, principalmente quando h pouca informao disponvel sobre

potenciais produtos de degradao. Estes estudos tambm fornecem

informaes sobre as vias de degradao e produtos de degradao que

27

Souza, A.

poderiam se formar durante o armazenamento. Estudos de degradao forada

podem ajudar a facilitar o desenvolvimento farmacutico, tais como em reas

de desenvolvimento de formulao, fabricao e embalagem, em que o

conhecimento do comportamento qumico pode ser usado para melhorar um

medicamento (REYNOLDS et al., 2002)

As orientaes das agncias reguladoras fornecem pouca

informao sobre as estratgias e princpios para a realizao de estudos de

degradao forada, incluindo problemas de frmacos pouco solveis e

compostos excepcionalmente estveis (AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA

SANITRIA, 2013; ICH, 2003; REYNOLDS et al., 2002).

O protocolo experimental para estudos de degradao de novos

frmacos e medicamentos, idealmente, resulta em amostras que foram

degradadas em aproximadamente 10%, ou foram exposta a uma quantidade

de energia que excede ligeiramente a fornecida sob condies aceleradas de

armazenamento (por exemplo, 40C durante 6 meses) (AGNCIA NACIONAL

DE VIGILNCIA SANITRIA, 2013; REYNOLDS et al., 2002).

Estudos de degradao forada devem ser realizados sempre que

um estudo indicativo de estabilidade for requerido. Estudos de degradao

forada devem ser realizados na formulao nica antes do incio estudos

formais de estabilidade (AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA SANITRIA,

2013).

Segundo a RDC n58 de 20 de dezembro de 2013 o estudo de

degradao forada deve ser conduzidos em um lote, em escala laboratorial,

piloto ou industrial do medicamento e para fins de comparao a execuo do

estudo deve ser feita tambm com a formulao, com o placebo e no insumo

farmacutico ativo isolado e associado no caso de associaes em dose fixa.

Alm disso, o estudo de degradao forada deve ser realizado em todas as

concentraes do medicamento (AGNCIA NACIONAL DE VIGILNCIA

SANITRIA, 2013).

O estudo de degradao forada deve submeter a amostra as

seguintes condies: aquecimento; umidade; soluo cida; soluo bsica;

soluo oxidante; exposio fotoltica; e ons metlicos (AGNCIA NACIONAL

28

Souza, A.

DE VIGILNCIA SANITRIA, 2013).

3.1.1.1 Hidrlise

A gua considerada como um dos principais catalisadores em

reaes de degradao. Muitos frmacos so considerados como instveis

nesse meio e necessitam de intervenes durante a formulao e

armazenamento, para que a eficcia, sua estabilidade e a da forma

farmacutica final no sejam comprometidas. Para a avaliao da instabilidade

sob a condio de hidrlise, tambm deve ser levado em considerao o pH do

meio, pois ons hidrognio e hidroxila podem acelerar ou retardar o processo

de degradao (ALLEN Jr; POPOVICH; ANSEL, 2013).

Ensaio de estresse cido ou bsico envolve a degradao forada

de uma substncia por exposio a condies cidas ou bsicas, que geram

produtos de degradao primria em gama desejvel. A seleo do tipo e

concentrao de cido ou de base depende da estabilidade da substncia

medicamentosa. cido clordrico ou cido sulfrico (0,1-1 M) para hidrlise

cida e o hidrxido de sdio ou hidrxido de potssio (0,1-1M) para hidrlise

bsica, so reagentes sugeridos adequados para hidrlise (ALSANTE et al.,

2007; BAKSHI; SINGH, 2002; BLESSY et al., 2014).

3.1.1.2 Oxidao

Reaes de oxidao so um dos dois mais comuns mecanismos de

degradao de frmacos. As reaes de degradao oxidativa de frmacos

so normalmente de auto-oxidao, ou seja, a reao iniciada por um radical

iniciador. Reaes com radical iniciador comeam com a fase de iniciao,

envolvendo a formao de radicais, seguida pela fase de propagao e

eventualmente a fase terminal. Assim, a reao cintica frequentemente segue

uma curva em forma de S quando a degradao x tempo plotada em grfico

(BAERTSCHI; ALSANTE; REED, 2005).

Perxido de hidrognio amplamente utilizado para oxidao de

frmacos em estudo de degradaes foradas, mas outros agentes oxidantes,

29

Souza, A.

como ons metlicos, oxignios e radicais iniciadores, tambm podem ser

usados. A seleo de agentes oxidantes, suas concentraes e condies

dependem do frmaco utilizado (ALSANTE et al., 2007; BLESSY et al., 2014).

3.1.1.3. Degradao Trmica

Degradao trmica consiste na degradao causada por exposio

a temperaturas altas, o suficiente para induzir a quebra de ligaes, conhecida

como pirlise (BAERTSCHI; ALSANTE; REED, 2005).

Segundo o ICH a temperatura utilizada para testes de estresse deve

ser maior em 10C do que as utilizadas em estudo de estabilidade acelerada

(ICH, 2003).

A anlise trmica possibilita uma ampla faixa de aplicao para

medidas de propriedades fsicas, como: estudo de reaes qumicas, avaliao

da estabilidade trmica, determinao da composio de materiais e

desenvolvimento de metodologia analtica (FARIA et al., 2002; SILVA et al.,

2009).

3.1.1.4. Degradao por fotlise

A reao de fotlise iniciada aps absoro de radiao

eletromagntica pelo insumo farmacutico ativo (IFA). A maioria das

substncias ativas apresenta mximos de absoro na regio do ultravioleta do

espectro eletromagntico. A radiao ultravioleta muito energtica e pode

propiciar a clivagem de muitas ligaes qumicas, ocorrendo a degradao da

molcula. Desta forma, importante conhecer a fotoestabilidade das

substncias ativas e seus produtos de degradao obtidos apartir de fotlise, e

avaliar a toxicidade destes ltimos (MORIWAKI et al., 2008).

A degradao por fotlise a degradao que resulta de exposio

a luz ultravioleta ou visvel no intervalo de comprimento de onda de

aproximadamente 300 a 800nm (BAERTSCHI; ALSANTE; REED, 2005).

Segundo as recomendaes para os testes de fotoestabilidade

descritos pelo ICH (ICH, 1996), as amostras de substncia do frmaco e

30

Souza, A.

slido/medicamento liqudo devem ser expostas a um mnimo de 1,2 milhes

de lux horas e 200Wh/m2 luz (BLESSY et al., 2014).

O ICH descreve dois tipos de fontes de luz para o teste de foto

estabilidade: Para a opo 1 utiliza-se qualquer fonte de luz que projetada

para produzir uma sada similar a um padro de emisso D65 / ID65, como

uma lmpada fluorescente que combina luz visvel e ultravioleta (UV), xenon,

ou lmpadas de iodetos metlicos. D65 o padro internacional para a luz do

dia ao ar livre reconhecida pela norma ISO 10977 (1993). ID65 o equivalente

ao padro de luz do dia indireto e interno, com radiao menor que 320nm.

Para a opo 2, a mesma amostra deve ser exposta tanto a luz

fluorescente branca fria quanto lmpada ultravioleta. Uma lmpada

fluorescente branca fria deve ser projetada para produzir uma sada

semelhante ao especificado na norma ISO 10977 (1993); e uma lmpada

fluorescente UV com uma distribuio espectral de 320 nm a 400 nm com uma

emisso mxima de energia entre 350 nm e 370 nm.

3.1.2 Desenvolvimento de metodologia

Antes de iniciar o desenvolvimento do mtodo, vrias propriedades

fsico-qumicas, como valor da constante de dissociao (pKa), coeficiente de

partilha leo-gua (log P), solubilidade e a intensidade de absoro na regio

UV do medicamento devem ser conhecidos, pois estabelecem uma base para

o desenvolvimento do mtodo cromatogrfico. Log P e solubilidade permitem

selecionar a fase mvel e solvente da amostra, enquanto o valor pKa auxilia na

determinao do pH da fase mvel (BAKSHI; SINGH, 2002).

Aps submetido ao estresse, o composto de origem pode gerar

amostras contendo produtos de degradao, podendo ser usadas para

desenvolvimento de procedimentos analticos adequados. importante notar

que os produtos de degradao gerados nas amostras submetidos ao estresse

podem ser classificados como potenciais produtos de degradao, as quais

podem ser formados sob condies relevantes de armazenamento

(BAERTSCHI; ALSANTE; REED, 2005).

31

Souza, A.

3.1.3 Validao de metodologia

Diferentes mtodos tm diferentes requerimentos quando se trata de

validao. A Farmacopeia dos Estados Unidos reconhece quatro categorias

(Tabela 1) e define as caractersticas de desempenho analtico que devem ser

medidas para validar cada tipo de mtodo (Tabela 2). O mtodo indicativo de

estabilidade includo na categoria 2, procedimentos analticos para

determinao de impurezas em frmacos a granel ou compostos de

degradao em produtos farmacuticos acabados (USP, 2014).

Tabela 1: Classificao dos testes, segundo a sua finalidade:

Categoria Finalidade do Teste

I Testes quantitativos para determinao do princpio ativo em

produtos farmacuticos ou matria-prima.

II Testes quantitativos ou ensaios limites para determinao de

impurezas ou produtos de degradao em produtos

farmacuticos ou matria-prima

III Testes de desempenho (por exemplo: dissoluo, liberao do

ativo)

IV Testes de identificao

32

Souza, A.

Tabela 2: Ensaios necessrios para validao de mtodos analticos, segundo sua finalidade:

Parmetro Categori

a I

Categoria II Categoria

III

Categoria

IV Quantitativo Ensaio

Limite

Especificidade Sim Sim Sim * Sim

Linearidade Sim Sim No * No

Intervalo Sim Sim * * No

Preciso /Repetitividade Sim Sim No Sim No

Preciso Intermediria ** ** No ** No

Limite de deteco No No Sim * No

Limite de quantificao No Sim No * No

Exatido Sim Sim * * No

Robustez Sim Sim Sim No No

* pode ser necessrio dependendo da natureza do teste especfico

** Se houver comprovao da reprodutibilidade no necessria a comprovao da preciso intermediria.

3.2 Diurticos.

Os antigos empregavam como diurticos preparados herbceos

contendo leos volteis. Extrato de ch e caf tambm foram usados com esta

finalidade. Em 1884, Koschlakoff identificou a cafena como sendo o

componente diurtico ativo do caf. Em 1902, Minkowski descobriu a atividade

diurtica da teofilina (KOROLKOVAS; BURCKHALTER, 1982).

O efeito diurtico dos compostos organometlicos foi descoberto,

1919, por acaso. Vogl empregou o merbafeno para tratar um paciente sifiltico e

observou o efeito diurtico deste frmaco. A ao cataltica da anidrase

carbnica foi descrita em 1930 e sua inibio pela sulfanilamida, observada

pela primeira vez, em 1949. Aps esta descoberta inmeras sulfanilamidas

derivadas foram descobertas e estudadas. Como por exemplo a acetazolamida

em 1954; a clortalidona, em 1959, a furosemida, em 1962 (KOROLKOVAS;

33

Souza, A.

BURCKHALTER, 1982).

As benzotazidas foram produto inesperado do estudo sistemtico de

inibidores da anidrase carbnica. O primeiro membro desta nova classe de

diurticos foi a clorotiazida, obtida em 1957, por Novello e Sprague. Em breve

surgiam outros benzotiazdicos: hidroclorotiazida, em 1958, por Stevens e

colaboradores; hidroflumetiazida, em 1959; quinetazona, em 1960, por Cohen e

colaboradores (KOROLKOVAS; BURCKHALTER, 1982).

Considerando que a aldosterona, hormnio do crtex adrenal,

apresenta acentuadas propriedades de reter sdio por promover a reabsoro

de Na+, iniciou-se no fim da dcada de 1950 a investigao sistemtica de

antagonistas e inibidores da aldosterona, mediante modificao da mlecula do

hormnio. Esta pesquisa culminou na introduo, em 1962, da espironolactona,

diurtico cuja constituio qumica muito semelhante da aldosterona

(KOROLKOVAS; BURCKHALTER, 1982).

Os diurticos aumentam o fluxo urinrio e a excreo de sdio e so

utilizados para ajustar o volume e/ou a composio dos lquidos corporais em

uma variedade de situaes clnicas. Os diurticos clinicamente teis alm de

aumentar a velocidade de fluxo de urina aumentam a taxa de excreo do Na+

(natriurese) e do nion associado, em geral Cl-. O NaCl no organismo o

principal determinante do volume de lquido extracelular, e as aplicaes

clnicas dos diurticos visam, em sua maioria, reduo do volume de lquido

extracelular ao diminuir o contedo de NaCl (BRUNTON; CHABNER;

KNOLLMANN, 2006).

Os diurticos so utilizados em dois importantes estados, edema e

hipertenso. Mas tambm so usados no tratamento em numerosos outros

estados incluindo aumento craniano (trauma ou cirurgia) ou aumento

intraocular (glaucoma), aumento da presso (diurticos osmticos), diabetes

insipidus (tiazdicos), hipercalcemia (diurticos de ala), doena das alturas

(inibidores da anidrase carbnica), hiperaldosteromismo primrio (i.e.

antagonistas da aldosterona) e osteoporose (tiazdicos) (FOYE; LEMKE;

WILLIAMS, 2008).

34

Souza, A.

3.2.1 Classificao dos diurticos

Na Figura 1 abaixo possvel verificar um nfron e os locais de ao

de cada um dos tipos de diurticos elucidados at hoje.

3.2.1.1 Inibidores da Anidrase Carbnica

Quando a sulfanilamida foi introduzida como agente quimioterpico,

constatou-se a ocorrncia de acidose metablica como efeito colateral. Essa

observao levou realizao de estudos in vitro e in vivo que demonstraram

ser a sulfanilamida um inibidor da anidrase carbnica. Posteriormente, um

enorme nmero de sulfanilamidas foi sintetizado e testado quanto sua

capacidade de inibir a anidrase carbnica; desses compostos, a acetazolamida

foi o mais intensamente estudado. A anidrase carbnica responsvel pela

reabsoro de NaHCO3 e secreo de cido. Assim, a inibio de anidrase

carbnica est associada a uma rpida elevao da excreo urinria de

HCO3- para cerca de 35% da carga filtrada (BRUNTON; CHABNER;

KNOLLMANN, 2006).

Apesar de a acetazolamida ser utilizada no tratamento de edema, a

eficcia dos inibidores da anidrase carbnica como agentes isolados baixa, e

os inibidores da anidrase carbnica no so amplamente utilizados neste

Figura 1: O nfron. BC, Cpsula de Bowman; G, glomrulo; PCT, tbulo contorcido proximal; PST, tbulo reto proximal; DHL, ramo descendente da ala de Henle; TALH, ramo espesso ascendente da ala de Henle; DCT, tbulo contorcido distal; CD, ducto coletor. (KOROLKOVAS; BURCKHALTER, 1982)

35

Souza, A.

aspecto (BRUNTON; CHABNER; KNOLLMANN, 2006).

3.2.1.2 Diurticos Osmticos

Os diurticos osmticos so agentes livremente filtrados no

glomrulo, que sofrem reabsoro limitada pelo tbulo renal e so

relativamente inertes do ponto de vista farmacolgico. Ao extrarem gua dos

compartimentos intracelulares, expandem o volume lquido extracelular,

diminuem a viscosidade do sangue e inibem a liberao de renina (BRUNTON;

CHABNER; KNOLLMANN, 2006).

Os diurticos osmticos aumentam a excreo urinria de quase

todos os eletrlitos, incluindo Na+, K+, Ca+, Mg2+, Cl-, HCO3-, e fosfato

(BRUNTON; CHABNER; KNOLLMANN, 2006).

3.2.1.3 Inibidores do simporte de Na+- K+- 2Cl- (diurticos de ala;

diurticos de alto limiar)

Os inibidores do simporte de Na+- K+- 2Cl- formam um grupo de

diurticos que tem em comum a capacidade de bloquear o simportador Na+-

K+- 2Cl- no ramo ascendente espesso da ala de Henle; por isso, esses

diurticos so tambm conhecidos como diurticos de ala (BRUNTON;

CHABNER; KNOLLMANN, 2006).

Os inibidores do simporte de Na+- K+- 2Cl- constituem um grupo de

frmacos quimicamente diversos. A furosemida, a bumetamina, a azosemida, a

piretamida e a tripamida contem um componente sulfonamida, enquanto o

cido etacrnico um derivado do cido fenoxiactico (BRUNTON; CHABNER;

KNOLLMANN, 2006).

Devido ao bloqueio do simportador de Na+- K+- 2Cl-, os diurticos de

ala provocam acentuado aumento na excreo urinria de Na+ e Cl- (i.e., at

25% da carga filtrada de Na+) A abolio da diferena de potencial transpitelial

tambm resulta em notveis aumentos na excreo de Ca2+ e Mg2+

(BRUNTON; CHABNER; KNOLLMANN, 2006).

36

Souza, A.

3.2.1.4 Inibidores do simporte de Na+- Cl- (diurticos tiazdicos e

semelhantes aos tiazdicos)

Ao contrrio dos inibidores da anidrase carbnica, que aumentam

primariamente a excreo de NaHCO3, foi constatado que os

benzotiadiazdicos aumentam predominantemente a excreo de NaCl, um

efeito independente da inibio da anidrase carbnica (BRUNTON; CHABNER;

KNOLLMANN, 2006).

Como os inibidores originais do simporte de Na+- Cl- eram derivados

da benzotiadiazina, essa classe de diurticos tornou-se conhecida como

diurticos tiazdicos. Subsequentemente, foram desenvolvidos agentes

farmacologicamnete semelhantes aos diurticos tiazdicos, mas que no eram

tiazidas. Esses frmacos so denominados diurticos semelhantes aos

tiazdicos (BRUNTON; CHABNER; KNOLLMANN, 2006).

Os diurticos tiazdicos so utilizados no tratamento do edema

associado a cardiopatia (insuficincia cardaca congestiva), hepatopatia

(cirrose heptica) e de doena renal (sndrome nefrtica, insuficincia renal

crnica, glomerulonefrite aguda) (BRUNTON; CHABNER; KNOLLMANN,

2006).

3.2.1.5 Inibidores dos canais de Na+ do epitlio renal (diurticos

poupadores de K+)

O triantereno e a amilorida so os nicos dois frmacos dessa

classe de uso clnico. Ambos provocam pequenos aumentos na excreo de

NaCl e, em geral, so utilizados pelas suas aes anticalurticas para

compensar os efeitos de outros diurticos que aumentam a excreo de K+.

So frequentemente classificados como diurticos poupadores de potssio (K+)

(BRUNTON; CHABNER; KNOLLMANN, 2006).

Como a poro final do tbulo distal e do ducto coletor tem uma

capacidade limitada de reabsorver solutos, o bloqueio de canais de Na+ nessa

parte do nfron resulta em ligeiro aumento nas taxas de excreo de Na+ e Cl-

(cerca de 2% da carga filtrada). Assim, a natriurese leve provocada por esses

frmacos faz com que eles raramente sejam utilizados como frmacos nicos

37

Souza, A.

no tratamento do edema ou da hipertenso (BRUNTON; CHABNER;

KNOLLMANN, 2006).

3.2.1.6 Antagonistas dos receptores mineralocorticoides (antagonistas

da aldosterona; diurticos poupadores de K+)

Os mineralocorticides provocam reteno de sal e de gua e

aumentam a excreo de K+ e H+ atravs de sua ligao a receptores de

mineralocorticoides especficos. A espironolactona, constitui o nico membro

dessa classe disponvel nos EUA (BRUNTON; CHABNER; KNOLLMANN,

2006).

Os efeitos da espironolactona na excreo urinria so muito

semelhantes aos induzidos por inibidores dos canais de Na+ do epitlio renal.

Entretanto, ao contrrio dos inibidores dos canais de Na+, a eficcia clnica da

espironolactona uma funo dos nveis endgenos de aldosterona. Quanto

mais elevados os nveis endgenos de aldosterona, maiores os efeitos da

espironolactona na excreo urinria (BRUNTON; CHABNER; KNOLLMANN,

2006).

Tal como outros diurticos poupadores de K+, a espironolactona

frequentemente administrada junto com diurticos tiazdicos ou de ala no

tratamento do edema ou da hipertenso (BRUNTON; CHABNER;

KNOLLMANN, 2006).

3.2.1.7 Furosemida

A furosemida um diurtico inibidor do simporte de Na+- K+- 2Cl-.

Quimicamente o cido 5-(aminosulfonil)-4-cloro-2-[(furanilmetil)amino]

benzico. Sua frmula molecular C12H11ClN2O5S com massa molecular de

330,75g/mol, possui faixa de fuso em 206C e pKa de 4,25, 9,83 e 16,96

(BRITISH PHARMACOPOEIA, 2010; Chemicalize.org, 2015; ONEIL, 2013).

38

Souza, A.

Figura 2: Estrutura qumica da Furosemida

A furosemida um dos medicamentos diurticos mais potentes e

eficazes disponveis. Exerce a sua ao na ala de Henle, que uma poro

do nfron, e que regula o balano de gua e sdio do organismo; na verdade,

furosemida induz uma perda total de cloreto de sdio e gua

(HEIDARIMOGHADAM; FARMANY, 2016). Este composto foi originalmente

usado como um agente antibacteriano. Mas recentemente suas propriedades

diurticas fizeram da furosemida um medicamento til para o tratamento de

hipertenso e a reteno de lquidos (edema) em pacientes com insuficincia

cardaca congestiva, doena heptica e disfuno renal, tais como a sndrome

nefrtica. A furosemida tambm um agente comum encontrado em exames

de doping no esporte (KOR; ZAREI, 2016).

A furosemida identificada em preparaes farmacuticas utilizando

espectrofotometria no UV/VIS (BRITISH PHARMACOPOEIA, 2010;

VALLADO; IONASHIRO; ZUANON NETTO, 2008; DIAS; OLIVEIRA NETO;

MARTINS, 2004; FARMACOPEIA BRASILEIRA, 2010; USP, 2014),

espectrofotometria no infravermelho (BRITISH PHARMACOPOEIA, 2010;

FARMACOPEIA BRASILEIRA, 2010; USP, 2014) e colorimetria (BRITISH

PHARMACOPOEIA, 2010; FARMACOPEIA BRASILEIRA, 2010; USP, 2014).

Para doseamento as seguintes tcnicas so utilizadas: espectrofotometria no

UV/VIS (FARMACOPEIA BRASILEIRA, 2010), titulometria (FARMACOPEIA

BRASILEIRA, 2010; USP, 2014), cromatografia liquida de alta eficincia

(HPLC) com deteco UV (BRITISH PHARMACOPOEIA, 2010; DIAS;

OLIVEIRA NETO; MARTINS, 2004; USP, 2014) mtodos potenciomtricos

(DIAS; OLIVEIRA NETO; MARTINS, 2004).

Tem como impurezas os seguintes produtos: cido 2-cloro-4-

[(furano-2-ilmetil)amino]-5-sulfamoilbenzico; cido 2,4-dicloro-5-

sulfamoilbenzico; cido 2-amino-4-cloro-5-sulfamoilbenzico; cido 2,4-

39

Souza, A.

bis[(furano-2-ilmetil)amino]-5-sulfamoilbenzico; cido 2,4-diclorobenzico

(BRITISH PHARMACOPOEIA, 2010; BUNDGAARD; NRGAARD; NIELSEN,

1988; CARDA-BROCH; ESTEVE-ROMERO; GARCIA-ALVAREZ-COQUE,

2000; FIORI et al., 2003; MIZUMA; BENET; LIN, 1998).

3.2.1.8 Hidroclorotiazida

A hidroclorotiazida um diurtico inibidor do simporte de Na+- K+.

Quimicamente 6-cloro-3,4-diidro-2H-1,2,4-benzotiodiazina-7-sulfonamida-1,1-

dixido. Sua frmula molecular C7H8ClN3O4S2 com massa molecular de

297,74g/mol (FARMACOPEIA BRASILEIRA, 2010).

Figura 3: Estrutura qumica da hidroclorotiazida

A hidroclorotiazida identificada em preparaes farmacuticas

utilizando espectrofotometria em UV/VIS (BRITISH PHARMACOPOEIA, 2010;

FARMACOPEIA BRASILEIRA, 2010; USP, 2014), espectrofotometria no

infravermelho (BRITISH PHARMACOPOEIA, 2010; FARMACOPEIA

BRASILEIRA, 2010; USP, 2014), cromatografia em camada delgada (CCD)

(BRITISH PHARMACOPOEIA, 2010; VALLADO; IONASHIRO; ZUANON

NETTO, 2008; FARMACOPEIA BRASILEIRA, 2010) e colorimetria (BRITISH

PHARMACOPOEIA, 2010; FARMACOPEIA BRASILEIRA, 2010). Para

doseamento utiliza-se as seguintes tcnicas: titulometria em meio aquoso

(FARMACOPEIA BRASILEIRA, 2010), cromatografia liquida de alta eficincia

(HPLC) com deteco UV (BRITISH PHARMACOPOEIA, 2010;

FARMACOPEIA BRASILEIRA, 2010; USP, 2014) e espectrofotometria em UV.

(VALLADO; IONASHIRO; ZUANON NETTO, 2008; FARMACOPEIA

BRASILEIRA, 2010).

Tem com impurezas os seguintes produtos: clorotiazida; 4-amino-6-

40

Souza, A.

clorobenzeno-1,3-disulfonamida (salamida), 6-cloro-N-[(6-cloro-7-sulfamoil-2,3-

dihidro-4H-1,2,4-benzotiadiazina-4-il-1,1-dixido)metil]-3,4-dihidro-2H-1,2,4-

benzotiadiazina-7-sulfonamida-1,1-dixido (BRITISH PHARMACOPOEIA,

2010).

3.3 Tcnicas utilizadas no desenvolvimento de metodologias analticas

de estabilidade

Para o presente trabalho foram escolhidas as tcnicas de

Cromatografia Lquida de Alta Eficincia (HPLC) e Eletroforese Capilar (CE)

por serem atualmente as tcnicas mais utilizadas.

3.3.1 Eletroforese Capilar (CE)

A eletroforese capilar (CE) uma tcnica de separao em fase

lquida que se baseia na migrao diferencial de espcies inicas ou ionizveis

quando as mesmas so submetidas a um campo eltrico. Essa tcnica de

separao para as amostras de tamanho macro foi desenvolvida inicialmente

por Arne Tiselius, um qumico sueco, nos anos 1930, para o estudo de

protenas do soro sangneo, que ganhou o Prmio Nobel por esse trabalho

(SKOOG et al., 2006; TAVARES, 1996).

No incio dos anos 1980, os cientistas comearam a verificar a

viabilidade de realizar separaes com microamostras em tubos capilares de

slica fundida. Seus resultados mostraram-se promissores em termos de

resoluo, velocidade e potencial para automao. Em consequncia, a CE

tornou-se uma ferramenta importante para a soluo de ampla variedade de

problemas analticos envolvendo separaes (SKOOG et al., 2006).

O rpido avano da eletroforese capilar decorre, em parte, da

simplicidade instrumental, mas principalmente da variedade dos modos de

separao que podem ser efetuados em uma nica coluna capilar e da

diversidade dos compostos passveis de anlise em cada modo (TAVARES,

1997).

41

Souza, A.

3.3.1.1 Instrumentao

Como mostrado na Figura 4, a instrumentao para a eletroforese

capilar simples. Um capilar de slica fundida preenchido com um tampo,

tipicamente com um dimetro interno entre 10 e 100 m e com comprimento de

40 a 100 cm, estendido entre dois reservatrios de tampo que tambm

contm eletrodos de platina. A introduo da amostra realizada em uma das

extremidades e a deteco na outra. Um potencial de 5 a 30 kV aplicado

entre os eletrodos (ALTRIA, 1996; SKOOG et al., 2006).

A injeo de amostra, na eletroforese capilar, pode ser feita por:

injeo hidrodinmica e eletrocintica. Na injeo hidrodinmica utiliza-se uma

gradiente de presso, feita aplicando-se presso pela introduo de um gs

inerte no reservatrio contendo a amostra ou pela aplicao de vcuo no

reservatrio que contm a soluo tampo na outra extremidade do capilar. A

injeo por sifonagem feita pelo deslocamento de lquido provocado pela

diferena de altura dos reservatrios de amostra e tampo. Na injeo

eletrocintica um gradiente de alta tenso aplicado na amostra durante um

curto perodo de injeo, feita pela aplicao de um potencial, geralmente

entre 5 e 15 kV, por alguns segundos (ALTRIA, 1996; SANTOS; TAVARES;

RUBIM, 2000).

Figura 4: Diagrama esquemtico do sistema CE. R1 e R2 so os recipientes contendo soluo eletroltica onde se encontram os eletrodos (e1 e e2) conectados fonte de potncia (F). Os crculos brancos representam os ons, as reas representam as massas e os sinais negativos e positivos indicam as cargas. A deteco radial da absoro molecular representada por uma fonte de radiao (v) e um detector (D) acoplado a um computador (C). No retngulo mostrado o registro temporal dos sinais (GERVASIO et al., 2003).

42

Souza, A.

3.3.1.2 Fluxo Eletrosmtico

Uma caracterstica particular da eletroforese capilar consiste no fluxo

eletroosmtico (FEO). Quando uma alta voltagem aplicada por meio de um

capilar de slica fundida contendo uma soluo tampo, um FEO geralmente

produzido, causando uma migrao do solvente em direo ao ctodo

(SKOOG et al., 2006).

Como mostrado na Figura 5, a causa do FEO a dupla camada

eltrica que se desenvolve na interface slica/soluo. A valores de pH maiores

que 3, a parede interna do capilar de slica encontra-se carregada

negativamente em virtude da ionizao dos grupos silanis (SiOH) da sua

superfcie. Para contrabalancear as cargas da parede, h na regio prxima a

esta, o excesso de cargas positivas, provenientes dos ctions da soluo. Os

ctions na camada difusa externa dupla camada so atrados para o ctodo,

ou eletrodo negativo, e uma vez que esto solvatados arrastam o solvente com

eles. A eletroosmose leva a um fluxo lquido da soluo com um perfil plano

atravs do tubo porque o fluxo origina-se em suas paredes. Esse perfil

contrasta com o perfil laminar (parablico) observado em fluxos gerados por

presso encontrados na HPLC. Visto que o perfil essencialmente plano, o

fluxo eletroosmtico no contribui significativamente para o alargamento de

banda, como o fluxo gerado por presso o faz em cromatografia lquida

(ALTRIA, 1996; SKOOG et al., 2006).

Figura 5: Representao esquemtica do fluxo eletroosmtico em FSCE (QUEIROZ; JARDIM, 2001).

3.3.1.3 Classificao da eletroforese capilar

A eletroforese capilar classificada de acordo com o modo de

43

Souza, A.

separao. Esses modos so os seguintes: Eletroforese capilar de zona

(FSCE) que compreende a eletroforese capilar em soluo livre (FSCE), a

cromatografia capilar eletrocintica micelar (MECK), cromatrografia capilar

eletrocintica micelar por microemulso (MEEK), eletroforese capilar em gel

(CGE), eletrocromatografia capilar (CEC). Outros mtodos tambm utilizados

so: a eletroforese por focalizao isoeltrica capilar (CIEF) e esotacoforese

capilar (CITP).

Eletroforese capilar em soluo livre

A separao de ons a forma mais simples de CE e denominada

eletroforese capilar em soluo livre (FSCE). Muitos compostos podem ser

separados rapidamente e facilmente por esta tcnica. A separao em FSCE

baseada nas diferenas nas mobilidades eletroforticas resultantes das

diferentes velocidades de migraes de espcies inicas no tampo, contido

dentro do capilar. (QUEIROZ; JARDIM, 2001).

A mobilidade eletrosmtica (FEO) do tampo dada pela equao:

=

4

Equao 1

Onde a constante dieltrica do tampo, o potencial zeta e o

a viscosidade do tampo (BAKER, 1995).

As molculas so separadas de acordo com o tamanho e o nmero

de agrupamentos ionizveis. Sendo a mobilidade eletroosmtica dependente

somente das caractersticas do tampo, isto , da constante dieltrica,

viscosidade, pH e concentrao (que influencia o potencial zeta), sendo

independente da tenso aplicada. Na FSCE espcies neutras no so

separadas, porm permite a separao de ctions e nions na mesma corrida

(BAKER, 1995; QUEIROZ; JARDIM, 2001).

44

Souza, A.

Cromatografia capilar eletrocintica micelar (MEKC)

A limitao primria dos mtodos eletroforticos em soluo livre a

impossibilidade de separar compostos neutros, a menos que existam

diferenas significativas de massa molecular. Em geral, compostos neutros

migram no capilar por ao exclusiva do FEO (QUEIROZ; JARDIM, 2001).

Nesta nova verso, agentes tensoativos inicos, em condies

aprop