Desenvolvimento e avaliação de candidatos vacinais à … · la palabra “saudade” (nostalgia)...

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”

Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara

Programa de Pós-graduação Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia

Desenvolvimento e avaliação de candidatos vacinais

à base de proteínas da superfície celular de

Sporothrix schenckii

Deivys Leandro Portuondo Fuentes

ARARAQUARA

Julho de 2015

Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”

Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara

Programa de Pós-graduação Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia

Deivys Leandro Portuondo Fuentes

Desenvolvimento e avaliação de candidatos vacinais

à base de proteínas da superfície celular de

Sporothrix schenckii.

.

Orientadora: Profa. Dra. Iracilda Zeppone Carlos

Co-orientador: Prof. Dr. Alexander Batista Duharte

Araraquara

2015

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Biociências e Biotecnologia

aplicadas à Farmácia, da Faculdade de

Ciências Farmacêuticas, UNESP, como parte

dos requisitos para obtenção do Título de

Doutor em Biociências e Biotecnologias

aplicadas à Farmácia.

Ficha Catalográfica

Elaborada Pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação Faculdade de Ciências Farmacêuticas

UNESP – Campus de Araraquara

Fuentes, Deivys Leandro Portuondo F954d Desenvolvimento e avaliação de candidatos vacinais à base de proteínas da superfície

celular de Sporothrix schenckii / Deivys Leandro Portuondo Fuentes. – Araraquara, 2015 117 f. Tese (Doutorado) – Universidade Estadual Paulista. “Júlio de Mesquita Filho”. Faculdade

de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em Biociências e Biotecnologia aplicadas à Farmácia

Orientador: Iracilda Zeppone Carlos 1. Sporothrix schenckii. 2. Esporotricose. 3. Imunogenicidade. 4. Vacina. 5. Adjuvante.

6. Alumínio. 7. Pet Gel A. I. Carlos, Iracilda Zeppone, orient. III. Título.

CAPES: 40300005

Este trabalho foi realizado no Laboratório de Imunologia Clínica do

Departamento de Análises Clínicas da Faculdade de Ciências Farmacêuticas

de Araraquara (UNESP). Bolsista do Programa PAEDEX (Programa de Apoio

a Estudantes de doutorado do Exterior)-AUIP (Associação Universitária

Ibero-Americana de Pós-graduação).

Dedicatória

Siempre me he sentido orgulloso y maravillado por la hermosa familia que tengo, humilde y de

corazones transparentes. Aprendí a caminar por ustedes, a escuchar y ser escuchado, apodado como el

“popó”me han formado sobre los preciados valores de la amistad y la sinceridad. No me alcanzan las

palabras para expresar el amor que siento por todos ustedes. Muy Bendecido soy por tenerlos, por eso

dedico especialmente:

A mi linda madrecita, MI INMESA MADRE, por ser el pilar más importante de mi vida, donde

descansan y cobra vida mis sueños, mis fuerzas y la voz que me anima a creer en mí y vencer las

disímiles travesuras de la vida. Para ti viejita, que siempre has estado cerca, sabes que te quiero un

MUNDO.

A mi PAPÁ, por todos sus consejos, por su apoyo y por todo lo que representa en mi vida. Sabes bien

que te amo mi viejo y que siempre te he escuchado papi.

A mi tía Mirtha, por todo el apoyo incondicional que recibí y aún recibo de ella. Sus valores humanos

no tienen medida en nuestro mundo. Siento mucha admiración por usted mi bella mi tía.

A la memoria de mi abuela Mariana Mozo y mi maravillosa tía Esperanza, gracias por sus

enseñanzas, pues hoy, soy en la vida un vestigio de sus actitudes.

A mi hermano David, nuestro grande DAVID, que particularmente sigue mirándome como un hijo y

yo como un PADRE, y es que siempre lo vi así, por toda la ayuda y orientación que recibí desde

pequeño, siempre empujando mis pasos hacia el conocimiento. Gracias mi hermanito.

A Daniel y a Marcos, MIS MARAVILLOSOS HERMANOS, a quienes ADMIRO y trato de

imitarlos, ambos son como especie de un refugio de donde siempre encuentro fuerzas para soñar y

creer en mí. Por sus enseñanzas me han hecho un hombre de bien, gracias y muchas gracias hermanos.

A toda mi familia, hermanos, cuñadas, tíos, primos por darme el aliento necesario en los momentos

que todo lo veía negativo.

Agradecimientos

Casi cuatro años en este hermoso País, tildado por muchos como el corazón de nuestra maravillosa

América. Simplemente Brasil, un País que embriaga y te vuelve adicto de su gente. Tan cariñoso es! que

la palabra “saudade” (nostalgia) la aprendes, pero al instante la desaprende por la contagiosa cultura y

aprecio innato que muestran los nativos de este País a los extranjeros. Por todo lo que he aprendido y

apoyo recibido, Gracias y muchas gracias Brasil. Así que agradezco:

A mi tutora, Iracilda Zeppone Carlos, a quien considero un pozo de bondad en lo personal y profesional,

por los excelentes conocimientos transmitidos, su extremo apoyo, por las alas de motivación em todo

momento, obviamente; han sido de vital importancia en mi formación. Muchas gracias profesora

Nunca conseguiré abotonar mis ideas en un sentido simple, que testimonien el aprecio, amistad, profunda

admiración como profesional y extremo agradecimiento a quien también me ha guiado brillantemente en

la realización de este proyecto ,que a su vez enmarca otro escalón de formación profesional en mi vida.

Sin más, agradezco de igual manera a mi co-tutor, Dr. Alexander Batista Duharte, gracias mi Hermano

por haberme aliviado el camino.

También a la computadora Lucas (hauau), aquella luz notoria de nuestro laboratorio, a la cual muchos

recurrimos en tiempos desesperación y como magia nos vuelve a retomar el camino “certo”. Gracias viejo

por la amistad y su importante contribución en este trabajo.

A Damiana, por sus conocimientos, su rigor académico, su especial aporte a mi trabajo y sobre todo por el

apoyo emocional que me transmite, casi un sentimiento maternal!! Gracias y muchas gracias.

A Adam, por la sincera amistad y su apoyo en todo momento, muchas gracias viejito!!

Quiero también agradecer a Mariana Santoro de Carmargo, por toda la energía, cariño, conocimiento y

sobre todo pór su apoyo y preocupación. Gracias mari!!

Un especial agradecimiento para Marisinha e Rosângela, con certeza sus conocimiento han sido de gran

importancia para mi formación.

Agradezco también a Francine, Amanda, Juliana, Maluzinha, Camila y Carol, por su apoyo y ayuda

incondicional. Gracias.

Con mucho agrado a la profesora Alesandra Medeiros, Ana Marisa, Paulo, Rubén y a todos los profesores

de la UNESP, que de alguna manera hicieron posible la terminación de este trabajo.

A mis viejos y lejanos amigos de Cuba, Luisito, Daniel, Jordenis, Leglis, Eberth Ramirez, Román,

Miladys, Villegas, eberth, Argota, Edgar, Yuleidys, Tito, Bonne, Armandito, Maylen, Luis Cano,

Neydita, Maria Isabel, David Castillo y todos aquellos que han aportado igual medida de cariño y apoyo.

A Jane Marcos albear, por sus sabios consejos, por la fuerza en todo momentos, por nuestra amistad.

A Clara Berenguer Rivas, por su preocupación constante, por el aliento y el ánimo en la distancia, gracias

bella.

A los nuevos amigos que conquisté o me conquistaron, Marcelo, Herrinque y Aline, Elias, Gustavo, Carol,

Laurianhe e Isley, Patricia, Robertinha, a Juliana y Felipe, Elaine, Mayte, Pablo, Michael, Tony e patri,

Alexander y familia, en fin a todos un montón de gracias.

A Nieves y Rafaela, por la profunda y admirable amistad que me han mostrado, ambas están en mi

corazón.

A mi galera de la Saudosa Maloca, a Pedro, Cassio, Panta, Lili, Bone, Haroldo, Laranja, Abrão, Suelen,

Wanesa, Amandinha y aquellos que saben que su amistad la llevo tatuada en mi corazón.

Quiero también agradecer a la post-graduación, Cláudia, Joyse y Daniela, Isabela, por darme una

ejemplar acogida y apoyo desde el inicio de mi llegada a este País. Por toda su preocupación gracias.

Mi mayor agradecimiento a ese que mora en las alturas, aquel que siempre actúa de manera extraña pero

acertada. De quien temo algún día soltarme de su mano, A Dios Padre. Amén.

Sumário Lista de figuras 9

Lista de tabelas 10

Lista de abreviaturas e siglas 11

Resumo 13

Abstract 15

Capítulo 1 16

1. Introdução 17

2. Revisão da literatura 18

2.1. História da esporotricose e epidemiologia 19

2.2. O fungo Sporothrix schenckii 21

2.3. Patogenia do fungo S. schenckii 21

2.4. Fatores de virulência de S. schenckii 23

2.5. Resposta imune ao S. schenckii 25

2.6. Aspetos terapêuticos e limitações 28

2.7. Estudos pré-clínicos de vacinas 30

2.8. Vacinas e adjuvantes para fungos 31

3. Objetivo 35

3.1. Objetivo geral 35

3.2. Objetivos específicos 35

4. Materiais e métodos 36

4.1. Animais 37

4.2. Microrganismo e condições de cultivo 37

4.3. Descrição dos métodos de extração das proteínas de S. schenckii na fase de levedura 38

4.3.1. Extração de proteínas de S. schenckii pelo “Kit” Y-PER 38

4.3.2. Extração das proteínas da parede celular 38

4.3.3. Extração da fração proteica do exoantígeno produzido por S. schenckii 39

4.3.4. Extração das proteínas da superfície celular 40

4.4. Ensaio de viabilidade celular por fluorescência (LIVE/DEAD) 40

4.5. Dosagem de proteínas 41

4.6. Separação de proteínas por SDS-PAGE 42

4.7. Espectrometria de massas Maldi-TOF das PSC de S. schenckii 43

4.7.1. Digestão tríptica em gel de poliacrilamida 43

4.7.2. Purificação da mistura de peptídeos utilizando ZipTips 43

4.7.3. Predição de adesinas presentes nas PSCs de S. schenckii pelo programa FungalRV 44

4.8. Purificação da enolase por eletroeluição 45

4.9. Formulação vacinal 45

4.9.1. Preparação da formulação vacinal PSC/Al(OH)3 45

4.9.2. Cinética de adsorção das PSCs ao gel de Al(OH)3 45

4.9.3. Preparação da formulação vacinal PSC/Montanide TM Pet Gel A 46

4.10. Obtenção de macrófagos peritoneais para ensaio de citotoxidade 47

4.10.1. Avaliação da viabilidade celular 48

4.11. Esquema de imunização 48

4.12. Obtenção de soro dos camundongos 49

4.13. Obtenção de soro policlonal anti-enolase de S. schenckii em camundongos Balb/C. 50

4.14. Demonstração da presença de PSCs de S. schenckii por citometria de fluxo 50

4.15. Ensaio de immunoblot 51

4.16. Detecção de IgG Total anti-PSC no soro dos camundongos imunizados 52

4.17. Detecção das subclasses IgG1 e IgG2a anti-PSC de S. schenckii 52

4.18. Obtenção dos macrófagos peritoneais dos grupos vacinados e estimulação com as PSC 53 4.19. Obtenção dos esplenócitos dos grupos vacinados e estimulação com as PSCs 53

4.20. Ensaio imunoenzimático (ELISA) para detecção da produção de citocinas 54

4.21. Ensaio de fagocitose 55

4.22. Ensaio de inibição da adesão de S. schenckii sobre fibroblastos 56

4.23. Estudo de proteção 57

4.24. Determinação de UFC no baço e fígado 57

4.25. Análise histológica 57

4.26. Análise estatística 59

5. Resultados 60

5.1. Perfil eletroforético das proteínas isoladas da parede celular de S. schenckii 60

5.2. Análise da viabilidade celular e integridade da membrana 62

5.3. Identificação proteômica das PSC de S. schenckii 63

5.4. Determinação do tempo de equilíbrio da adsorção 64

5.5. Isoterma de adsorção 65

5.6. Citotoxicidade in vitro das formulações vacinais 66

5.7. Títulos de anticorpos da clase IgG e subclases IgG1 e IgG2a induzidos pelas

formulações vacinais

68

5.8. Demonstração da presença da enolase e PSC de S. schenckii por citometria de fluxo 70

5.9. Proteínas imunorreativas reconhecidas pelo soro dos camundongos vacinados 72

5.10. Indução de IL-12, IFN-γ, IL-4 e IL-17 pelas formulações vacinais 73

5.11. Análise da fagocitose in vitro induzida pelo soro dos grupos vacinados 75

5.12. Ensaio de inibição 78

5.13. Ensaio de proteção 79

5.14. Análise histopatológica 80

6. Discussão 84

7. Conclusões 97

8. Referências bibliográficas 99

9. Apêndice 118

Capítulo 2 126

Artigo publicado 127

Artigo publicado 148

Lista de figuras

Figura 1. Esquema de imunização e eutanásia. 49

Figura 2. Perfil eletroforético dos isolados proteicos de S. schenckii caracterizados por SDS-PAGE 61

Figura 3. Viabilidade celular das leveduras de S. schenckii através do kit LIVE/DEAD Yeast. 62

Figura 4. Efeito do tempo de contato das PSC sobre HA 64

Figura 5. Isoterma de adsorção das PSC sobre o HA 65

Figura 6. Citotoxicidade celular das formulações em cultura com macrófagos peritoneais de

camundongos Balb/C

67

Figura 7. Resposta de anticorpos IgG, IgG1 e IgG2a contra as PSC de S. schenckii 69

Figura 8. Detecção da presença da enolase e PSC de S. schenckii por citometria de fluxo 71

Figura 9. Western blot com um pool de soro anti-PSC obtido dos animais tratados com as formulações vacinais

72

Figura 10. Quantificação das citocinas IL-12, IFN-γ, IL-4 e IL-17 74

Figura 11. Fagocitose de leveduras não opsonizadas (A) e opsonizadas (B) de S. schenckii pelos macrófagos peritoneais obtidos de camundongos dos grupos vacinados com as diferentes

76

Figura 12. Imagem representativa da fagocitose realizada com leveduras opsonizadas e não opsonizadas de S. schenckii

77

Figura 13. Inibição da adesão de S. schenckii aos fibroblastos (Fb) 78

Figura 14. Unidades Formadoras de Colônias no baço (A) e no fígado (B) dos animais tratados passivamente com o soro anti-PSC

79

Figura 15. Análise histológica no tecido subcutâneo (ponto de inoculação) dos animais imunizados com as diferentes formulações vacinais

81

Figura 16. Análise histológica no tecido subcutâneo (ponto de inoculação) dos animais imunizados com as diferentes formulações vacinais

82

Lista de Quadros

Quadro 1. Distribuição dos grupos de camundongos imunizados por via subcutânea 49

Quadro 2. Identificação das proteínas da superfície celular de S. schenckii por MALDI-TOF 63

Quadro 3. Capacidade de adsorção das PSC sobre o HA. 64

Lista de abreviaturas e siglas

μg - Microgramas

μm - Micrômetro

AIDS- Acquired immunodeficiency syndrome (Síndrome de Imunodeficiência

adquirida)

CD -Cluster of Differentiation (Grupo de Diferenciação)

CO2 - Gás Carbônico

ELISA - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay ( Ensaio Imunoenzimático)

ExoAg - Exoantígeno do fungo Sporothrix schenckii

HIV - Human immunodeficiency vírus (Virus da Immunodeficiência Humana)

kDa - Kilodaltons

mg - Miligrama

mL - Mililitros

nm - Nanômetros

pg - Picograma

pH - Potencial Hidrogeniônico

°C - Graus Celsius

rpm - Rotação por Minuto

SFB - Soro Fetal Bovino

PAMPS - Pathogen-associated molecular patterns (Padrões Moleculares Associados

ao Patógeno)

PRR - Pattern recognition receptor (Receptores de Reconhecimento Padrão)

TLR - Toll Like Receptor (Receptores do tipo Toll)

NO- Óxido Nítrico

NOS - Óxido Nítrico Sintase

TNF-α - Tumor Necrosis Factor alfa (Fator de Necrose Tumoral Alfa)

PECs - Peritoneal Exudate Cells (Células do Exsudato Peritoneal)

IL - Interleucina

IFN-γ - Interferon Gamma

LPS - Lipopolissacarídeo

ATCC- American Type Culture Collection

INI- Instituto Nacional de Infectologia Evandro Chagas

BHI- Brain Heart Infusion (Meio Infusão de Cérebro e Coração)

Kit Y-PER- Yeast Protein Extraction Reagent

PMSF- Phenylmethylsulfonyl Fluoride (Fluoreto de fenil metil sulfonil)

SDS- Sodium Dodecyl Sulfate (Dodecil Sulfato de Sódio )

TCA-Ácido Tricloroacético

PSCs-Proteínas da Superfície Celular

DTT- Dithiothreitol (Ditiotreitol )

EDTA-Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético

FUN-1- (iodeto de 2-cloro-4-[2,3-(dihidro-3-metil) benzo -1,3-tiazol-2 metilideno]-

1-fenilquinolinio)

CW-Calcofluor White-(4,4'-bis-[4-anilino-bis-dietilamino-5-triazina-2-ilamino]-2,2'-

estilbeno-ácido dissulfónico

TEMED- N,N,N´,N´- tetrametil-etilenodiamina

IAA- Iodoacetamida

TFA- Trifluoroacetic acid (ácido trifluoroacético)

ACN-Acetonitrila

MTT- brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2)-2,5-difeniltetrazólio

CEMIB- Centro Multidisciplinar para Investigação na Área de Ciência de Animais

de Laboratório

SCNI- Soro de Camundongos não Infectado

MFI- Median Fluorescence Intensity (mediana da intensidade de fluorescência)

EIVC- Estruturas Intravacuolares Cilíndricas

Resumo

A esporotricose é uma infecção subaguda ou crônica que afeta seres humanos e

outros mamíferos, causada pelo complexo de espécies Sporothrix schenckii. A doença tem

uma distribuição mundial, mas é endêmica no Brasil, principalmente no estado do Rio de

Janeiro, onde o gato tem se tornado o principal agente transmissor. O tratamento

antifúngico convencional é demorado e está associado a efeitos adversos, apontando a

necessidade de terapias mais eficazes e seguras, sendo a vacinação profilática ou

terapêutica provavelmente a alternativa mais promissora. Neste estudo foi avaliada a

imunogenicidade e a toxicidade de candidatos vacinais à base de proteínas da superfície

celular (PSCs) de S. schenckii stricto sensu. As PSCs isoladas com o agente redutor

Ditiotreitol foram caracterizadas por eletroforese, espectrometria de massas e pelo

programa preditor de adesinas FungalRV. As PCSs foram formuladas com dois adjuvantes,

hidróxido de alumínio (HA) ou Gel PetA, em duas concentrações ou usadas isoladamente.

As formulações resultantes (PSC10, PSC100, HA+PSC10, HA+PSC100, PetA+PSC10 e

PetA+PSC100) foram administradas em duas doses pela via subcutânea em camundongos

Balb/C com intervalo de 2 semanas. O soro obtido de cada grupo sete dias após a segunda

dose foi usado para analisar a imunogenicidade de cada formulação. O soro de todos os

grupos vacinados, exceto os grupos PSC10 e HA+PSC10, reagiram com uma banda de 47

kDa, previamente identificada como a enzima glicolítica enolase e predita como uma

adesina pela base dados FungalRV. Posteriormente foi demonstrada por citometria de fluxo

a presença dessa proteína na parede celular de S. schenckii, sugerindo o papel imunogênico

da mesma. A indução das imunoglobulinas IgG e IgG2a foi significativamente maior com

HA+PSC100 e Pet+PSC100 em relação a PSC10, PSC100, HA+PSC10 e PetA+PSC10. A

indução significativa dos subtipos IgG1 e IgG2a e das citocinas IL-12, IFN-γ, IL-4 e IL-17

pela HA+PSC100, sugere um equilíbrio entre as respostas imune Th1, Th2 e Th17, o qual

poderia ser vantajoso na defesa contra a esporotricose. A formulação PetA+PSC100

induziu preferencialmente a produção de IgG2a, IL-12, IFN-γ e IL-4, evidenciando um

balanço de resposta imune Th1/Th2. Os soros dos animais vacinados com HA+PSC100 e

Pet+PSC100 foram capazes de inibir significativamente a adesão de S. schenckii a

fibroblastos, de potencializar a fagocitose das leveduras por macrófagos obtidos desses

animais e, ainda, de levar à diminuição das unidades formadoras de colônia do fungo no

baço e fígado de animais previamente tratados com esses soros. Por fim, a formulação

PetA+PSC100 apresentou uma toxicidade menor do que a HA+PSC100, demonstrada pela

baixa citotoxicidade contra macrófagos in vitro e pela ausência de granulomas no tecido

subcutâneo do local de inoculação. Nossos resultados ressaltam o potencial imunogênico

das PSCs de S. schenckii quando formuladas com os adjuvantes HA e Gel PetA,

evidenciando o seu uso como alvo potencial para o desenvolvimento de uma vacina contra

a esporotricose.

Abstract

Sporotrichosis is a subacute or chronic infection affecting humans and other mammals,

caused by the Sporothrix schenckii species complex. The disease has a worldwide

distribution, but is considered endemic in Brazil, mainly in the state of Rio de Janeiro,

where the cat has become the main transmitting agent. The antifungal treatment is very

long and often associated to adverse effects indicating the demand for preventive or more

effective and safe therapeutic strategies. One of the more promissory approaches would

probably be the prophylactic or therapeutic vaccination. This study evaluated the

immunogenicity and toxicity of cell surface protein-based (CSP) vaccine candidates of S.

schenckii stricto sensu. The CSPs isolated with dithiotreitol were characterized by

electrophoresis, mass spectrometry and FungalRV adhesin predictor. The CSPs were

formulated with two adjuvants, aluminum hydroxide (AH) or gel PetA, or used alone, in

two concentrations. The obtained formulations (CSP10, CSP100, AH+CSP10,

AH+CSP100, PetA+ CSP10 and PetA+ CSP100) were administered to Balb/C mice in two

subcutaneous doses at 2 weeks interval. The serum obtained from each group 7 days after

the second dose was used to analyze the immunogenicity of each formulation. All the

serum obtained from vaccinated groups, except those from CSP10 and AH+CSP10 groups,

reacted with a 47 kDa band, previously identified as the glycolytic enolase enzyme and

predicted as an adhesin in the FungalRV program. Subsequently, we demonstrated the

presence this protein in the cell wall of S. schenckii, suggesting its immunogenic role. The

induction of IgG and IgG2a immunoglobulins was significantly higher with AH+CSP100

and PetA+CSP100 formulations with respect to CSP10, CSP100, AH+CSP10, and

PetA+CSP10. The significant induction of IgG1 and IgG2a subtypes and IL-12, IFN-γ, IL-

4 and IL-17 by AH+CSP100, suggests a balance in the immune response Th1 /Th2 /Th17,

which could be advantageous for protecting against sporotrichosis. The formulation

PetA+CSP100, preferably induced the production of IgG2a, IL-12, IFN-γ and IL-4,

evidencing a Th1/Th2 response profile. The sera of vaccinated animals with AH+CSP100

and PetA+CSP100 were found to significantly inhibit the adherence of S. schenckii to

fibroblasts, to potentize yeast phagocytosis by macrophages obtained from these animals,

and to decrease colony forming units of the fungus into spleen and liver of animals

previously treated with these sera. Finally, The PetA+CSP100 formulation showed lower

toxicity than AH+CSP100, as demonstrated by low in vitro cytotoxicity against

macrophages and lack of granulomas in the subcutaneous tissue of the inoculation site. Our

results emphasize the immunogenic potential of S. schenckii CSPs when formulated with

both AH and PetA adjuvants, indicating their use as potential target for the development of

a vaccine against sporotrichosis.

Capítulo 1

1. Introdução

17

A esporotricose é uma micose subcutânea de evolução subaguda e crônica que

apresenta distribuição geográfica universal, mais frequente na América Latina, e endêmica

no Brasil (Carrada-Bravo et al., 2013), principalmente no estado do Rio de Janeiro, onde o

gato tem se tornado a principal fonte de infecção (Barros et al., 2011). Por muito tempo se

pensou que o fungo Sporothrix schenckii, era o único agente etiológico causador desta

doença, tanto no ser humano quanto em animais (Barros et al., 2011; Carrada-Bravo et al.,

2013), porém sobre a base de estudos genéticos, características nutricionais e fenotípicas,

este fungo passou a ser reconhecido como um complexo de espécies crípticas, das quais S.

brasiliensis, S. globosa, S. mexicana e S. schenckii sensu estrito apresentam interesse

clínico (Marimon et al., 2007; 2008).

De modo geral, a rota de infecção, a virulência da cepa e fundamentalmente o

estado imunológico do hospedeiro, influenciam no aparecimento das formas clínicas

observadas na esporotricose (Arenas, 2005; Kong et al., 2006; Fernandes et al., 2013),

como a cutânea fixa (Roldán-Marín et al, 2009), linfocutânea (Vasquez-del-Mercado et al.,

2012), cutânea disseminada (Morris-Jones, 2002; Figueiredo et al., 2004) ou a extracutânea

que acomete geralmente pacientes imunodeprimidos levando à formas mais graves da

esporotricose (Yelverton et al., 2006), o que sugere que o S. schenckii é um patógeno

oportunista emergente (Freitas et at., 2014).

As principais limitações dos esquemas terapêuticos disponíveis são: o longo tempo

de tratamento, a alta toxicidade, assim como o custo excessivo dos fármacos antifúngicos.

Tudo isso aponta a necessidade de tratamentos mais eficazes e seguros e a procura de

métodos de prevenção principalmente em populações de alto risco, tais como os pacientes

imunocomprometidos com AIDS ou que fazem uso de drogas imunosupressoras.

Vários estudos têm confirmado o papel imunogênico das proteínas da parede celular

do fungo S. schenckii (Charoenvit et al., 1979; Verdan et al., 2012; Gonçalvez et al., 2015)

mas até o momento não há uma vacina anti-Sporothrix, assim como poucos estudos estão

sendo desenvolvidos como esse objetivo, o que justifica ampliar a investigação neste

campo como resposta ao problema de saúde pública que tem se tornado essa doença no

Brasil.

Referências bibliográficas

2.Revisão da literatura

19

2.1. História da esporotricose e epidemiologia

A esporotricose é uma micose de evolução subaguda e crônica de lesões nodulares

cutâneas ou subcutâneas e, com menor frequência disseminada em pessoas com

compromentimento imunológico (Barros et al., 2011). O agente causal é um fungo

dimórfico chamado Sporothrix schenckii o qual faz parte de um complexo de diferentes

espécies (Marimon et al., 2006; 2007; 2008). Casos de esporotricose têm sido reportados

em todos os continentes, porém as regiões tropicais e subtropicais com alta temperatura e

umidade exibem a maior incidência, principalmente na América Latina, Japão, Índia,

África do Sul, China e Malásia (Tang et al., 2012; Carrada-Bravo e Olveras-Macias, 2013;

Zhao et al., 2015). No Brasil, algumas regiões do sudeste e sul têm elevada taxa de

incidência dessa micose, que é uma importante zoonose (Chakrabarti et al., 2015). A

infecção tanto no ser humano quanto em animais está geralmente associada à inoculação

acidental na pele de materiais contaminados com o fungo, como solo, vegetais, espinhos ou

outros (Barros et al., 2011; Cruz, 2013). Em 1898, Benjamin Schenck, um estudante de

medicina no Hospital Johns Hopkins em Baltimore, Estados Unidos, isolou uma amostra

desse fungo pela primeira vez de lesões cutâneas de um paciente de 36 anos de idade e mais

tarde, o micologista Erwin F. Smith classificou-a como uma espécie relacionada ao gênero

Sporotricum (Schenck, 1898). Dois anos depois, Hektoen e Perkins também isolaram esse

agente etiológico de lesões cutâneas de outro paciente e por meio de estudos morfológicos

foi classificado como Sporothrix schenckii (Hektoen e Perkins, 1900; Bonifaz e Vázquez,

2010).

No Brasil, o primeiro caso de esporotricose em humanos foi descrito em 1907 por

Lutz e Splendore e desde então um aumento considerável de casos clínicos, em particular,

nos últimos 15 anos tem se evidenciado fundamentalmente no Rio de Janeiro onde a doença

tem assumido proporções epidêmicas alarmantes (Rodrigues et al., 2013), acometendo

regiões com dificuldades socioeconômicas e ambientais (Barros et al., 2010). Nesse estado

brasileiro, o risco de contrair a infecção é ainda maior devido ao fato de que o gato ser a

principal fonte de infecção do fungo, estando vinculado aproximadamente a 91% dos casos

de esporotricose em humanos (Cruz, 2013; Freitas et al., 2010, 2014). Entre os anos 1998 e

2009 o IPEC/Fiocruz diagnosticou a esporotricose em aproximadamente 2200 seres


20

humanos e 3244 gatos. A Clínica Labovet, com sede no Rio de Janeiro, no período 2005 a

2012 analisando por meio de citologia e cultivo, 741 materiais coletados da superfície de

lesões cutâneas ulceradas de gatos, identificou a presença de S. schenckii em 325 amostras,

perfazendo 43,86 % do total (Cruz, 2013).

Reis e colaboradores (2009) demonstraram a existência de uma semelhança

genética entre cepas de S. schenckii isoladas das lesões cutâneas, cavidades nasais e unhas

de gatos infectados e as obtidas de seus donos com a micose, confirmando que o gato é o

principal transmissor da esporotricose no estado do Rio de Janeiro. Realmente a

esporotricose é uma micose negligenciada e representa um problema de Saúde Pública no

Brasil (Martin, 2014; Pereira et al., 2014); a grande incidência desta micose no Rio de

Janeiro levou a Secretaria Estadual de Saúde deste estado a incluir a esporotricose na lista

de doenças de notificação compulsória (publicado no Diário oficial da União em 16 de

julho de 2013), no entanto até o momento não é possível conhecer a real incidência ou

dimensionar a endemia desta doença nesse estado (Martin, 2014).

A esporotricose também tem sido encontrada em Minas Gerais (de Souza Barros et

al., 2013) e no estado do Rio Grande do Sul (Madrid et al., 2007), porém em menor

proporção. Atualmente esta doença é a micose subcutânea mais importante que afeta os

animais no estado de São Paulo. Em um estudo retrospectivo realizado no Serviço de

Dermatologia de um hospital veterinário do estado de São Paulo entre janeiro de 1993 e

dezembro de 2011 foi constatado que o gato, a exceção dos cães, foram os responsáveis por

45,9% da infecção nos humanos e animais que com ele coabitavam (Rossi et al., 2013). Em

outro estudo mais recente, entre o mês de março de 2011 a abril de 2014 foi identificado

um aumento considerável de casos de esporotricose felina nas cidades de Itaquera e Itaim

Paulista, com 83 e 56 casos respectivamente (Montenegro et al., 2014). Este mesmos

autores descreveram a presença de um número menor de gatos com esporotricose em outras

cidades como Diadema (10 casos) e Guarulhos (17 casos), indicando a propagação da

epidemia, a qual pode aumentar o risco da transmissão zoonótica nas regiões

metropolitanas no estado de São Paulo.


21

2.2. O fungo Sporothrix. schenckii

As espécies do gênero Sporothrix, pertencem à Divisão Ascomycota, classe

Pyrenomycetes, ordem Ophiostomatales e família Ophiostomataceae (Romeo e Criseo,

2013). O fungo S. schenckii habita regiões tropicais, com uma temperatura média entre 20 e

25°C e umidade relativa acima de 90% (Bonifaz e Velázquez, 2010), podendo ser

encontrado no solo, plantas, arbustos e materiais sob condições ambientais adequadas de

temperatura e umidade (Morris-Jones, 2002). É um fungo termodimórfico que em vida

saprofítica ou cultivada em ágar Sabouraud a 25°C, apresenta-se na forma filamentosa, com

hifas delgadas, septadas e ramificadas com 1 a 2 μm de diâmetro e aglomerados de

conídios, em forma de margarida ou crisântemo (Barros et al., 2011). Em parasitismo ou

quando cultivado a 37°C em meios ricos, tais como ágar infusão cérebro-coração, cresce

como levedura unicelular ovalada, globosa e em forma de charuto, com 2 a 6 μm de

diâmetro podendo apresentar um ou mais brotamentos (Lopes-Bezerra et al., 2006; Barros

et al., 2011).

Por muito tempo pensou-se que o fungo S. schenckii era o único agente etiológico

desta doença (Barros et al., 2011; Carrada-Bravo et al., 2013), porém sobre a base de

estudos de sequenciamento do gene da calmodulina, características nutricionais (como

assimilação de diferentes fontes de carbono) e fenotípicas (como diâmetro das colônias e

morfologia dos conídios) em distintos meios de cultura e velocidade de crescimento a

diferentes temperaturas, a espécie S. schenckii passou a ser reconhecida como um complexo

de espécies crípticas, das quais S. brasiliensis, S. globosa, S. mexicana e S. schenckii sensu

stricto são as únicas de interesse clínico (Marimon et al., 2006; 2007; 2008); sendo que S.

lurei e S. pallida têm sido identificadas, mas estão menos relacionadas à ocorrência de

doença (Oliveira et al., 2014).

2.3. Patogenia do fungo Sporothrix schenckii

De modo geral, a rota de infecção, a virulência da cepa e fundamentalmente o

estado imunológico do hospedeiro, influenciam no aparecimento das manifestações clínicas

identificadas na esporotricose (Arenas, 2005; Kong et al., 2006; Fernandes et al., 2013).

Uma vez que o fungo penetra no organismo, ele pode permanecer restrito ao local da


22

inoculação gerando a formação de nódulos pequenos que podem ulcerar dando origem à

forma cutânea fixa (Roldán-Marín et al., 2009), ou ainda pode se disseminar pelos

linfonodos adjacentes desenvolvendo diferentes nódulos ao longo dos canais linfáticos,

podendo supurar, ulcerar e drenar pus correspondendo à forma linfocutânea (Vasquez-del-

Mercado et al., 2012), a qual é responsável por 70-80 % dos casos cutâneos de

esporotricose (Vikram et al., 2014).

Ocasionalmente, o fungo pode disseminar-se por via hematogênica, atingindo os

ossos e articulações. A doença pulmonar pela inalação de conídios é rara e está

caracterizada por tosse, febre baixa, perda de peso, linfadenite mediastinal, cavitação,

fibrose e outros sinais clínicos que lembram a tuberculose (Vikram et al, 2014). As formas

mais graves da esporotricose têm sido associadas a pacientes alcoólatras, transplantados de

órgãos, indivíduos sob corticoterapia e especialmente em pacientes infectados com o vírus

da imunodeficiência humana (HIV) (Yelverton et al., 2006), o que sugere que o S.

schenckii é um patógeno oportunista emergente (Freitas et at., 2014). Aung e

colaboradores (2013) relataram que de um total de 64 casos de esporotricose pulmonar

primária e 22 casos de doença multifocal afetando os pulmões, 19 mortes foram reportadas,

14 das quais devidas diretamente a complicações da infecção por S. schenckii. Segundo os

autores, essa alta taxa de mortalidade poderia estar diretamente vinculada a

imunossupressão destes pacientes, à demora no diagnóstico e especialmente à ineficácia do

tratamento medicamentoso.

Nos gatos tem-se observado as formas clínicas cutânea, cutânea linfática e

disseminada, mas são difíceis de diagnosticar. Na forma cutânea, aparecem lesões ulceradas

profundas, geralmente com pus na cabeça, nos membros e na base do rabo (Lloret et al.,

2013., Schubach et al., 2004), que costumam se generalizar rapidamente por via

hematogênica ou pela autoinoculação do fungo pelo próprio animal (Rosser et al., 2006).

A forma linfática pode ser clinicamente evidente, mas apenas pode ser confirmada por meio

do exame histológico (Lloret et al., 2013).


23

2.4. Fatores de virulência de Sporothrix schenckii.

Os fatores de virulência são elementos constitutivos ou induzíveis em determinados

microrganismos que tem uma função importante na colonização e invasão do patógeno no

hospedeiro e determinam a patogenicidade. Existem evidências de que muitos destes

fatores podem ser induzidos pelas condições estressantes do meio ambiente e isto permite

também uma maior resistência aos mecanismos imunológicos do hospedeiro, fenômeno

conhecido como “dual effect” (Casadeval et al., 2003; Téllez et al., 2014)

A parede celular dos fungos é uma estrutura dinâmica que mantém o equilíbrio

osmótico da célula, a proteção física contra outros microrganismos ou ainda contra a ação

fagocítica das células do hospedeiro (Oda et al., 1983; Latgé, 2010). A estrutura e síntese

da parede celular do fungo são únicas e, muitos dos seus componentes não estão presentes

nas células dos mamíferos, o que faz dela um excelente alvo para o desenvolvimento de

fármacos com pouca toxicidade para os seres humanos (Bowman & Free, 2006).

Nos últimos anos, tem-se focado a atenção sobre os componentes da parede celular

de S. schenckii que possam estar envolvidos na indução da resposta imune e no processo de

adesão no tecido do hospedeiro. Durante o curso de uma infecção, os microrganismos são

capazes de se aderirem às células epiteliais, endoteliais, fatores solúveis do soro,

componentes da matriz extracelular e materiais inertes implantados no corpo do hospedeiro.

Essa adesão é mediada por componentes presentes na parede celular, reconhecidas como

adesinas (Bernal et al., 2009). As adesinas são consideradas importantes fatores de

virulência usados pelos patógenos durante o processo de infecção, sendo que estão sendo

testadas como potenciais antígenos em várias formulações vacinais contra doenças

fúngicas, entre elas, a enolase 2 fosfo-D-glicerato hidrolase de Candida albicans (Li et al.,

2011), DAB-1 de Blastomyces dermatitidis (Wüthrich et al., 2002), e gp43 de

Paracoccidioides brasiliensis (Travassos e Taborda, 2012).

Atualmente o principal componente antigênico presente nessa porção proteica do

complexo peptídico-polissacarídeo de S. schenckii é a glicoproteína tipo adesina que se une

à laminina e fibronectina (Ruiz-Baca et al., 2009; Teixeira et al., 2009, Castro et al, 2013)

de 70 kDa (3-carboximuconato ciclase), a qual pode apresentar-se com peso molecular

variando de 55 a 73 kD e ponto isoelétrico de 4.33 a 4.85 (Rodrigues et al, 2015).


24

Curiosamente, os autores também demonstraram que a glicoproteína de 60 kDa,

previamente reportada por Ruiz-Baca e colaboradores (2011) como uma proteína

imunogênica de S. schenckii também presente em S. brasiliensis (Fernandes et al., 2013) é

uma variante glicosilada da proteína polimórfica gp70 (Rodrigues et al., 2015).

A transferência passiva de um anticorpo monoclonal IgG1 (P6E7) específico contra

a gp 70 em camundongos infectados com S. schenckii (Nascimento et al., 2005, 2008) e S.

brasiliensis (de Almeida et al., 2015) gerou proteção, confirmada pela queda de unidades

formadoras de colônias (UFC), nos órgãos avaliados em relação aos camundongos

controles. Tal fato tem demonstrado o potencial imunogênico da gp70 e tem estimulado

experimentos visando uma terapia no controle da infecção (Almeida, 2012). Visando a

função das adesinas na patogênese dos fungos, Teixeira e colaboradores (2014) analisaram

o genoma de S. schenckii e S. brasiliensis com duas bases de dados: ProFasta (prediz

proteínas da superfície celular) e FungalRV (prediz a presença de adesinas), sendo

identificadas 68 e 54 proteínas de superfície celular para ambas as espécies

respectivamente, e nessa ordem 61 e 63 proteínas provavelmente com funções de adesinas.

Porém, outros estudos proteômicos mais aprofundados precisam ser feitos para confirmar a

presença e função dessas moléculas de adesão na parede celular de ambas as especies.

Outro fator de virulência apresentado por S. schenckii, assim como por outros

fungos patogênicos, é a sua termotolerância. Por exemplo, isolados capazes de crescer a

35°C, limitam-se a desenvolver infecções cutâneas fixas, mas os fungos isolados de lesões

linfangíticas, disseminadas e extracutâneas apresentam tolerância e crescem a 37 °C

(Kwon-Chung e Bennet, 1992).

Por outro lado, a produção de melanina tem sido referida como a “armadura dos

fungos” devido a sua função de protegê-los frente a diferentes contaminantes e fatores

ambientais, como a toxicidade de metais pesados, radiações ultravioletas, temperaturas

extremas, assim como à ação dos radicais de nitrogênio e oxigênio produzidos pelos

macrófagos (Gessler et al., 2014; Tellez et al., 2014). Estudos demonstram que os conídios

de S. schenckii produtores de melanina são mais resistentes à fagocitose pelos macrófagos e

aos compostos oxidativos que as cepas não produtoras (Morris-Jones et al., 2003). A

produção de melanina por isolados de Histoplasma capsulatum e Cryptococcus neoformans


25

tem mostrado pouca suscetibilidade à ação do antifúngico anfotericina B, sugerindo que

esta poderia ocorrer em pacientes imunodeprimidos com manifestações clínicas severas da

esporotricose (Barros et al., 2011).

2.5. Resposta imune ao S. schenckii.

A resposta imune contra os fungos requer uma adequada colaboração entre o

sistema imune inato e adaptativo. As células do sistema imune inato, particularmente as

células fagocíticas apresentadoras de antígenos (APCs) como dendríticas e macrófagos são

capazes de reconhecer estruturas moleculares conservadas na superfície dos patógenos,

PAMPs “pathogen – associated molecular patterns” por meio de receptores de

reconhecimento de padrão, como os PRR “pattern recognition receptors” presentes nessas

células (Abdelsadik e Trad, 2011).

Os PAMPs presentes no fungo, como os carboidratos (β-glucanas), glicoproteínas

(mananas), ácidos nucléicos (DNA e RNA), glicolípideos (lipopolissacarídeos),

peptidoglicano, lipoproteínas e outros, são reconhecidos pelo menos por um dos receptores

presentes dentre as quatrograndes famílias de PRRs, a saber: 1) receptores de lectina C

(CLRs), como dectina 1, dectina 2, DC-SIGN, mincle e receptor de manose; 2) receptores

semelhantes a NOD (domínio de oligomerização e ligação de nucleotídeo), como o

inflamassomo NALP3; 3) receptores scavenger (CD5 e CD36) e 4) fundamentalmente a

família de “toll like receptor” (TLR), considerada a maior classe de reconhecimento inato

em vertebrados (Netea et al., 2006; Levitz, 2010, Romani, 2011). Por outro lado as

opsoninas, como as imunoglobulinas, colectinas e componentes do complemento (C3bi)

aumentam o repertório de reconhecimento antigênico favorecendo a internalização e morte

dos microrganismos pelos macrófagos (Stuart e Ezekowitz, 2005).

De modo geral, a ativação dos PRRs desencadeia uma cascata de eventos

intracelulares produzindo a ativação de moléculas co-estimulatórias como CD40, CD80 e

CD86 nas APCs e a produção de citocinas IL-1, IL-6, TNF-α, IL-12 (Lahiri et al., 2008) e

quimiocinas, cuja função é modular a reposta antifúngica (Goodridge e Underhill, 2007).

Alguns dos PRRs implicados no reconhecimento de S. schenckii têm sido abordados

nos últimos anos identificando-se o papel imunoestimulante dos componentes da parede


26

deste fungo. Por exemplo, Sassá e colaboradores (2009; 2012) utilizando camundongos

C3H/HeJ deficientes no receptor TLR-4 avaliaram o papel deste receptor durante 10

semanas de infecção com S. schenckii. A produção de NO, TNF-α e IL-10 foi diminuída

nos camundongos C3H/HeJ, demonstrando que o TLR-4 está envolvido no reconhecimento

de frações lipídicas na parede celular S. schenckii. O receptor TLR-2 também participa no

reconhecimento de componentes da parede celular de S. schenckii, sendo que Negrini e

colaboradores (2013) demonstraram que os macrófagos obtidos de camundongos

“knockout” para o receptor TLR-2 (TLR2-/-

) apresentaram diminuição tanto na fagocitose

como na produção de TNF-α, IL-1 β, IL-2 e IL-10 quando estimulados em cultura com os

antígenos solúveis e lipídicos da parede celular do fungo, indicando a importância desse

receptor no reconhecimento do fungo. O mesmo grupo também demonstrou que a produção

de IL-17 foi independente de TLR-2 com os animais TLR-2-/-

, apresentando alta produção

deste mediador quando comparados aos animais selvagens, portando o receptor TLR-2

(Negrini et al., 2014).

Os macrófagos, por exemplo, quando ativados em cultura com componentes da

parede celular do fungo produzem citocinas pro-inflamatórias como IL-1, IL-6, TNF-α que

estimulam a resposta fagocítica (Carlos et al., 2009) e liberam compostos intermediários do

nitrogênio e do oxigênio com função fungicida (Carlos et al., 2003; Sheisa et al., 2012).

Fernandes e colaboradores (2008) demonstraram in vitro a efetividade do óxido nítrico

(NO) na eliminação das células leveduriformes de S. schenckii, no entanto esse efeito se

tornou limitado quando avaliado em modelo de esporotricose murina. Essa supressão da

resposta imune contra o fungo foi previamente relatada por Carlos e colaboradores (2003),

onde evidenciou-se o papel do NO com uma forte participação na eliminação do S.

schenckii nas primeiras três semanas da infecção, comprovada pela diminuição do

crescimento do fungo no fígado e baço. Por outro lado, entre a quarta e sexta semana de

infecção, a alta produção do NO, estimulada pelo IFN-γ e IL-12, aumentou a

suscetibilidade dos animais à infecção nos mesmos órgãos avaliados (Carlos et al., 2003;

Maia et al., 2006).


27

Atualmente os macrófagos têm sido classificados em dois grupos: a saber, a via

clássica ou macrófagos M1, os quais quando ativados pela exposição a IFN-, TNF-α ou

indutores dessas citocinas como os ligantes de receptores Toll (TLR-2 e TLR-4) (Benoit et

al., 2008) e outros ligantes, expressam na superfície celular MHC II, CD86, CD16 e

produzem citocinas pro-inflamatória e IL-12, assim como, NO e H2O2, polarizando a

resposta imune para um perfil Th1 (Correa e López, 2007) e a via alternativa ou M2 que

incluem os macrófagos M2a estimulados por IL-4/IL-13 (Mantovani et al., 2007), M2b

induzidos por complexos imunes e M2c os quais são ativados por hormônios (Benoit et al.,

2008), IL-10 e TGF-β (Correa e López, 2007). Os macrófagos M2 quando ativados

produzem citocinas antiinflamatórias como a IL-10 e expressam na sua superfície celular

arginina 1, CD206 e receptor da IL-4 (Murray e Wynn, 2011). Alegranci e colaboradores

(2013) avaliaram o papel dos macrófagos M1 e M2, durante 8 semanas, em modelo murino

de esporotricose experimental, quando estimulados em cultura com um peptídeo-

polissacarídeo obtido da parede celular do fungo. Os resultados mostraram predomínio da

subpopulação dos macrófagos M1 entre a primeira e quarta semana da infecção,

evidenciada pela alta produção de IL-12 e NO, nesse período. Nesse sentido, a participação

dos macrófagos M1 ajudou eliminar o fungo nessa primeira fase. A partir da quarta semana

e até o final do modelo experimental, houve predomínio da subpopulação de macrófagos

M2 sobre a M1, evidenciado pela alta expressão do receptor CD206, arginina 1 e a

produção significativa de IL-10 e TGF-β, o que explica o estabelecimento da infecção pelo

fungo nessa fase.

Tradicionalmente, a resposta imune Th1, produtoras de IFN-γ e IL-12 tem sido

considerada essencial para conferir imunidade protetora contra fungos, enquanto que as

respostas Th2 mediadas pela IL-4 e IL-5 levam ao aumento da suscetibilidade à infecção

por esses patógenos (Antachopoulos e Roilides, 2005). Já foi demonstrado o

desenvolvimento de resposta imune celular durante a infecção murina por S. schenckii

(Carlos et al,. 1992) e, posteriormente que as respostas Th1 e Th2 são induzidas de modo

antígeno-específico contra componentes da parede celular desse fungo (Maia et al., 2006).

Células com padrão Th17 compreendem um novo subtipo de célula T que possuem

um papel emergente na imunidade adaptativa para uma variedade de fungos (Romani,


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2011), incluindo S. schenckii, conforme demonstrado recentemente em camundongos

infectados com este fungo que conseguiram eliminar a infecção no período de 20 dias

caracterizada pela alta produção da citocina IL-17 (Ferreira et al., 2015), confirmando o

papel relevante deste subtipo celular na defesa contra S. schenckii.

A resposta imune humoral, na dependência da quantidade e qualidade dos

anticorpos, pode proteger o hospedeiro contra as infecções fúngicas de diferentes formas,

seja prevenindo a aderência, a neutralização de toxinas, opsonizando para favorecer o

processo de fagocitose ou mediando a citotoxicidade celular dependente do complemento

(Pérez et al.,2013). Essas observações têm sido suportadas por diferentes estudos; por

exemplo, na identificação de anticorpos protetores e não protetores na infecção induzida

por Cryptococcus neoformans e Candida albicans, indicando que a resposta imune humoral

contra os fungos pode gerar anticorpos de variada eficácia (Blanco e Garcia, 2008;

Edwards, 2012). No caso de S. schenckii foi demonstrado que animais tratados com um

anticorpo monoclonal contra a gp70 antes e depois da infecção com o fungo foram capazes

de induzir proteção, evidenciado pela diminuição na carga fúngica no baço e o fígado

(Nascimento et al., 2008).

2.6. Aspetos terapêuticos e limitações

A escolha do tratamento antifúngico para controlar esta doença, está relacionada ao

tipo de manifestação clínica desenvolvida pelo paciente. Segundo as recomendações atuais

o itraconazol, apesar do seu alto custo, continua sendo o fármaco de escolha para o

tratamento das manifestações clínicas da esporotricose menos severas, como cutâneas fixas

e linfocutâneas, onde o tratamento pode durar 4 meses (Kauffman et al., 2007). Porém o

itraconazol é metabolizado no fígado pela isoenzima 3A4 do sistema enzimático citocromo

P450, uma via enzimática comum para fármacos rotineiramente usados na atenção

primária, como digoxina, warfarina, carbamazepina, fenobarbital e outros medicamentos

(Francesconi et al., 2011; Vikram et al., 2014).


29

O iodeto de potássio, o qual tem preço mais acessível e tem sido usado nos países

desenvolvidos com grande sucesso nas formas cutâneas da esporotricose, também tem

mostrado sérias limitações, atribuídas ao desconhecimento do seu mecanismo de ação e à

alta frequência de reações adversas, como alergias, edema pulmonar, angioderma, mialgia,

linfadenopatia, urticária, vasculite, psoríase pustular, acidose metabólica e iododerma,

lacrimejamento, expectoração abundante, coriza, espirros, insônia e problemas tireoidianos

(Silva e Pereira, 2009). O fluconazol, sendo parte do grupo dos azóis como o itraconazol,

devido a menor eficácia é utilizado apenas como uma opção terapêutica de segunda linha

(Francesconi et al., 2009).

A terbinafina é pertencente ao grupo das alilaminas, outro fármaco alternativo ao

itraconazol para o tratamento de formas menos agressivas da esporotricose devido a sua

baixa ligação (aproximadamente 5%) com o sistema enzimático P450, diminuindo a

probabilidade de interagir com outros fármacos metabolizados por este sistema, como foi

explicado anteriormente, no entanto ainda não há consenso sobre a dose e a duração do

tratamento (Chapman et al., 2004, Kauffman et al., 2007; Francesconi et al., 2009).

A anfotericina B lipossomal e desoxicolato são os fármacos de escolha junto com o

itraconazol para o tratamento de formas graves da esporotricose, tais como a osteoarticular,

pulmonar, meningeal e disseminada (Kauffman et al., 2007) que ocorrem geralmente em

pacientes HIV positivos. A terapia com as diferentes formas farmacêuticas de anfotericina

B nos pacientes imunodeprimidos é difícil devido às reações adversas como a hipocalemia,

hipomagnesemia, anemia normocítica e principalmente nefrotoxicidade (Vikram et al.,

2014).

Resumidamente, as principais limitações das opções terapêuticas são: a longa

duração do tratamento associada com um aumento da resistência aos fármacos antifúngicos

e toxicidade, as interações com outros fármacos, o custo excessivo do tratamento

especialmente em pacientes imunocomprometidos que sofrem a forma disseminada da

esporotricose. Tudo isso aponta à necessidade de tratamentos mais eficazes e seguros e a

procura de métodos de prevenção principalmente, em populações de alto risco.


30

2.7. Estudos pré-clínicos de vacinas

Dentre os estudos pré-clínicos de vacinas existem diferentes objetivos: 1) garantir

uma formulação vacinal eficaz e segura. Para isto é importante a seleção de antígenos

apropriados para gerar uma adequada imunogenicidade protetora. 2) a seleção do adjuvante

adequado que permita um ótimo balanço na estabilidade, imunopotenciação e baixa

toxicidade com os antígenos que são formulados com ele (WHO, 2013).

Conforme a Agência Europeia de Medicamentos (EMEA) a avaliação da

formulação antígeno-adjuvante deve ser feita comparativamente na presença ou na ausência

do adjuvante (EMEA, 2004). Por exemplo, para as formulações que utilizam o adjuvante

hidróxido de alumínio ou adjuvantes de natureza particulada, recomenda-se avaliar a

cinética de adsorção/desorção do complexo antígeno adjuvante (Lindblad, 2004; EMEA,

2004, 2005). Outro objetivo é demonstrar o efeito da vacina sobre a resposta imune

utilizando modelos in vitro ou in vivo (Mastelic et al., 2013). Para isto é importante

determinar a estimulação da imunidade inata e especifica incluindo estudos de citocinas

pro-inflamatórias, resposta Th1/Th2/Th17, os níveis de anticorpos específicos, estudos

funcionais associados aos mecanismos de defesa demonstrados contra o microrganismo em

questão (Garçon et al., 2011a). Outro objetivo é estudar a segurança da formulação através

de estudos in vitro para determinar a citotoxicidade direta do candidato vacinal sobre as

células e também estudos in vivo como a tolerância local no sitio de inoculação que pode

ser avaliada durante o próprio estudo da imunogenicidade (EMEA, 2004, 2005). Estudos

mais específicos de toxicidade são geralmente realizados em etapas mais avançadas

(Garçon et al., 2011b).

Uma vez alcançadas as evidências de imunogenicidade e segurança, devem ser

realizados ensaios de proteção utilizando modelos de infecção padronizados para garantir

uma adequada avaliação da capacidade profilática ou terapêutica do produto em estudo

(Mastelic et al., 2013).

Os estudos pré-clínicos devem combinar ensaios in vitro e in vivo, primeiro em

modelos murinos, geralmente camundongos, e depois se possível, em outras espécies

animais antes de se passar aos ensaios em humanos (WHO 2003; EMEA 1997, 2005;

Vecchi et al., 2011; Garçon et al., 2011b).


31

2.8. Adjuvantes e vacinas antifúngicas

A Organização Mundial da Saúde (OMS) tem considerado as vacinas como uma das

intervenções médicas profiláticas mais eficazes para o controle de doenças infecciosas em

relação custo-benefício (Pashine et al., 2006). O principal objetivo da vacinação é preparar

o sistema imune, tão logo o indivíduo vacinado se torne hospedeiro, para responder mais

rápida e eficazmente contra um determinado patógeno, além de induzir uma memória

imunológica de longa duração (O’Hagan, 2006).

As vacinas tradicionais utilizam organismos inteiros vivos e/ou mortos. As

primeiras são altamente imunogênicas e mais eficazes para a indução de proteção, já que a

resposta imunológica a essas vacinas é muito semelhante àquela produzida em resposta à

infecção natural, resultando em imunidade humoral (linfócitos B com a produção de

anticorpos) e celular (linfócitos TCD4+ e linfócitos T citotóxicos, CTLs), mas seu uso está

limitado pela probabilidade potencial de reversão parcial ou total ao fenótipo patogênico e

causar doença particularmente em indivíduos imunodeprimidos (Moigeon et al., 2001;

Coeshott et al., 2004; Tlaskalová et al., 2004). Enquanto que as vacinas que utilizam

organismos mortos são menos imunogênicas e geralmente necessitam de adjuvantes para

gerar a resposta imune desejada. Por outro lado, as vacinas de nova geração que contêm

componentes antigênicos simples e mais bem definidos do que as vacinas convencionais,

por exemplo, peptídeos sintéticos e proteínas recombinantes são mais seguras quanto ao

uso, porém devido a sua baixa imunogenicidade, também precisam de um adjuvante para

alcançar o efeito imune desejado (Schijns, 2006).

O termo adjuvante originou-se da palavra latina adjuvare que significa ajudar. Neste

sentido qualquer substância que possa amplificar ou intensificar a cascata de eventos

imunológicos que compõem a resposta imune pode ser classificada como adjuvante

(Schijns, 2006). O aumento do interesse em adjuvantes nas últimas décadas ocorreu pela

necessidade de estimular a resposta imune frente às vacinas compostas por subunidades

simples e seguras, porém pouco imunogênicas.

Até o momento, os avanços mais importantes na vacinologia têm sido obtidos com a

prevenção de doenças virais e bacterianas e não contra doenças antiparasitárias e

antifúngicas (Portuondo et al., 2015). Durante muito tempo, a falta de compreensão nas


32

interações ausência de visibilidade das infecções fúngicas oportunistas e endêmicas têm

dificultado o desenvolvimento de vacinas para fungos (Edwards, 2012). No entanto, a

incidência de doenças crônicas associadas a micoses oportunistas como exemplo,

candidíase, paracoccidioidomicose, aspergilose, e mais recentemente a esporotricose, têm

despertado o interesse no desenvolvimento desta alternativa terapêutica (Cutler et al., 2006;

López-Romero et al., 2011; Portuondo et al., 2015).

Os adjuvantes podem ser utilizados para melhorar a resposta imune aos antígenos

por diferentes caminhos, incluindo: potencialização da imunogenicidade de imunógenos

fracos, aumento da velocidade e duração da resposta imune, modulação da especificidade,

isotipo e distribuição das sub-classes de anticorpos, estimulando a resposta de linfócitos T

citotóxicos, promovendo a indução da imunidade de mucosa, aumentando a resposta imune

de indivíduos imunologicamente imaturos ou senescentes, reduzindo os custos das vacinas

pela diminuição das doses dos antígenos e ajudando a controlar a competição de antígenos

em vacinas combinadas (Singh e O’Hagan, 2003; Sivakumar et al., 2011).

Singh e O’Hagan (2003), classificaram os adjuvantes de vacinas em dois grandes

grupos: sistemas de liberação e imunopotencializadores. Os sistemas de liberação, tais

como micropartículas, emulsões, complexos imuno estimulantes (ISCOMs), lipossomas,

virossomas e partículas semelhantes a vírus têm dimensões comparáveis aos patógenos e,

portanto, são efetivamente capturados em uma forma mais natural pelas células

apresentadoras de antígeno, facilitando assim a indução de uma potente resposta imune

(Mutwiri et al., 2007, 2011). O efeito imunopotencializador, como monofosforil lipídeo e

derivados sintéticos, muramildipetídeo e derivados, sequencias CpG, lipopetídeos, entre

outros refere-se à ativação direta sobre as células imunes inatas, principalmente através dos

receptores Toll e outras famílias de receptores (O’Hagan e Valiante, 2003; Batista- Duharte

et al., 2013, 2014).

Muitos desses adjuvantes imunológicos têm demonstrado estimular uma proteção

eficaz em modelos murinos, especialmente, contra candidíase, criptococose,

coccidioidomicose, blastomicose, histoplasmose, paracoccidioidomicose, infecções

causadas por Pneumocystis e, mais recentemente para a aspergilose (Torosantucci et al.,

2005; Pietrella et al., 2010).


33

Apesar desses avanços, ainda nenhuma vacina antifúngica tem sido aprovada pelas

agências reguladoras para imunização em humanos (Portuondo et al., 2015). Atualmente,

apenas existem duas vacinas antifúngicas em fase clínica, a vacina NDV-3 contra C.

albicans e Staphylococcus aureus formuladas com hidróxido de alumínio e a vacina PEV-7

contra a vulvovaginite formulada com o adjuvante virossoma (Portuondo et al., 2015).

Os sais de alumínio, como o fosfato e hidróxido de alumínio, desde a sua criação em

1926 por Glenny, têm sido os adjuvantes mais amplamente utilizados em seres humanos

(EMEA, 2004, 2005; Simon e Edelman, 2006; Aguilar e Rodriguez, 2007). Os sais de

alumínio atuam como um sistema de liberação formando um depósito no lugar da

inoculação que fornece o recrutamento de células como monócitos CD11c+ e células

dendríticas. Existem outras evidências que sugerem que o alumínio produz necrose celular,

resultando na produção de ácido úrico, ativando os “NOD like receptor” como o NLRP3 e

que este complexo seja importante no efeito imunoestimulante do alumínio (Franchi L et

al., 2008; Coffman et al., 2010). Muitos adjuvantes, incluindo o hidróxido de alumínio

estimulam o sistema imune, induzindo irritação local e necrose (Batista-Duharte et al.,

2014). Embora os sais de alumínio sejam amplamente utilizados, sua principal limitação é

que induzem uma forte resposta imune Th2, com produção de anticorpos IgE que estão

associados às reações de hipersensibilidade, e além disso, a resposta imune é de curto

prazo (Garçon et al., 2011). Por esse motivo, atualmente existe um grande esforço no

desenvolvimento de adjuvantes que sejam mais potentes e seguros que os sais de alumínio.

A empresa SEPPIC sediada na França, desde 1997 trabalha no desenvolvimento de

adjuvantes que têm evidenciado maior potência que os sais de alumínio, com baixo perfil

tóxico, para serem formulados em vacinas de uso humano e veterinárias. Várias famílias de

adjuvantes têm sido desenvolvidas pela SEPPIC, as quais têm demonstrado baixa

toxicidade quando administradas sistemicamente em animais e humanos com uma robusta

resposta imune, tais como, o Montanide ISA 51, ISA 720 e IMS 1313 N VG PR

(Aucouturier et al., 2002; Mancebo et al., 2012, Portuondo et al., 2015). O Montanide gel

PET A pertence à nova geração de adjuvantes da SEPPIC que tem demonstrado em gatos,

cães e cavalos, uma melhor resposta e baixa toxicidade quando comparado com o hidróxido

de alumínio. O Montanide gel PET A é constituído de uma dispersão aquosa de um


34

polímero sintético classificado na categoria de ácido poliacrílico, de elevado peso

molecular e baixa quantidade do adjuvante Montanide (Deville et al., 2011).

Uma recente revisão sobre os diferentes tipos de adjuvantes, mecanismos de ação,

toxicidade e a sua influência nas diferentes formulações vacinais antifúngicas testadas até

hoje foi abordada extensamente pelo autor por meio de publicação intitulada “Adjuvants

and delivery systems for antifungal vaccines: current state and future developments” anexo

a esta tese no Capítulo II.

Levando em consideração a necessidade atual de buscar alternativas terapêuticas

mais efetivas contra S. schenckii, somado ao potencial imunogênico das proteínas presentes

na parede celular desse fungo em gerar resposta imune, considera-se de grande importância

iniciar estudos de candidatos vacinais à base dessas proteínas dirigidas a esta infecção.

Objetivos


35

Hipóteses de trabalho

As proteínas da parede celular de S. schenckii formuladas com adjuvantes podem

potencializar a imunogenicidade delas e ter um efeito protetor contra uma infecção pelo

fungo com adequado perfil de segurança. Sendo assim estes formulações podem ser úteis

como futuros candidatos vacinais contra a esporotricose.

3.1. Objetivo geral

Avaliar a capacidade protetora induzida por formulações vacinais compostas por proteínas

da parede celular de S. schenckii.

3.2. Objetivos específicos:

1. Obter e purificar antígenos da parede celular de S. schenckii.

2. Determinar a citotoxicidade in vitro induzida pelas formulações vacinais.

3. Determinar a resposta de anticorpos específicos induzida por cada formulação vacinal.

4. Quantificar o perfil de citocinas Th1, Th2 e Th17 estimuladas pelos candidatos vacinais

5. Avaliar a capacidade de inibição da adesão de S. schenckii aos fibroblastos dos

anticorpos induzidos pelas formulações vacinais.

6. Determinar se os anticorpos induzidos por cada formulação vacinal favorecem a

fagocitose.

7. Determinar a toxicidade local in vivo das formulações avaliadas.

8. Avaliar o efeito protetor do soro de cada formulação vacinal por transferência passiva.

Materiais e métodos

4. Materiais e Métodos

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4.1. Animais

Foram utilizados camundongos Balb/c machos, pesando entre 20 e 25 gramas com cinco

semanas de idade, obtidos do Centro Multidisciplinar para Investigação na Área de Ciência de

Animais de Laboratório (CEMIB), UNICAMP, Campinas, São Paulo. Estes animais foram

mantidos em mini-isoladores, em grupos de cinco, em condições ambientais estáveis (23°C ±

2°C de temperatura e 56% de umidade relativa do ar) e ciclos claro/escuro de 12 horas. Água e

ração foram oferecidas ad libitum. Todos os procedimentos realizados nesse trabalho foram

aprovados pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de

Araraquara – UNESP (CEUA/FCF/CAr n° 30/2012).

4.2. Microrganismos e condições de cultivo

Foi utilizada a cepa de S. schenckii ATCC 16345 isolada de um caso de infecção

pulmonar humano de esporotricose (Baltimore, MD) e gentilmente cedida pela da Fundação

Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brasil e as cepas S. brasiliensis 250 e 256 isolada de gatos e

gentilmente cedida pelo Prof. Dr. Sandro Antonio Pereira do Instituto Nacional de Infectologia

Evandro Chagas (INI), Fundação Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Brasil. Atualmente estes

isolados são mantidos no Laboratório de Imunologia Clínica da Faculdade de Ciências

Farmacêuticas de Araraquara, UNESP, na forma miceliar a 25°C em meio de cultura sólido

MycoselTM (BD Biosciences). Para obter a forma de levedura, uma alíquota da fase miceliar das

cepas foi transferida para meio líquido BHI (Difco) e cultivada a 37°C sob agitação constante de

150 rpm por sete dias. Em seguida, uma alíquota contendo 108 unidades fúngicas foi transferida

para um Erlenmeyer de 2000 mL, contendo 1000 mL de caldo BHI e cultivada por cinco dias

nas mesmas condições anteriores conforme descrito Ferreira e colaboradores (2015).


38

4.3. Descrição dos métodos de extração das proteínas de S. schenckii na fase de

levedura.

4.3.1. Extração de proteínas de S. schenckii pelo “Kit” Y-PER.

As proteínas totais do fungo foram extraídas por meio do “Kit” Y-PER (Thermo

scientific, EUA) seguindo as orientações do fabricante. As leveduras foram separadas da cultura

por centrifugação a 3000 xg durante 5 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, uma fração

úmida de 1 mg foi ressuspendida em 5 mL do reagente Y-PER, suplementado com 10 µL/mL de

anti-protease PMSF (fluoreto de fenil metil sulfonil) (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) e deixado

sob agitação leve durante 20 minutos. Posteriormente, as leveduras foram separadas do

sobrenadante por centrifugação a 15000 xg durante 10 minutos e o sobrenadante foi filtrado com

membrana de 0,22 µm. O filtrado foi dialisado e as proteínas presentes foram precipitadas,

aliquotadas e estocadas em freezer a -20°C. O perfil de proteínas totais obtidas por este método

foi usado como controle comparativo do teste de extração de proteínas descrito no item a seguir.

4.3.2. Extração das proteínas da parede celular

As proteínas da parede celular S. schenckii foram obtidas de acordo com a metodologia

descrita por Ruiz-Baca e colaboradores (2009) com algumas adaptações. As células

leveduriformes obtidas, como descrito acima, foram lavadas duas vezes com tampão A (TrisHCL

pH 7,5 50 mM) e centrifugadas (Centrífuga Fanem, Ind. Bras.) a 12000xg por 10 minutos. A

seguir, foi adicionado 1 mL do tampão A suplementado com o inibidor de proteases fluoreto

fenilmetilsulfonil (1µM) (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) e 0,8 g de pérolas de vidro (1 mm de

diâmetro) e foram realizadas 16 seções de vortex intercalando com esfriamento (1 minuto) em

gelo.

A suspensão foi lavada com água milli-Q a 27000xg por 15 minutos e o sobrenadante

descartado. O precipitado foi dissolvido em água milli-Q e centrifugado a 1000 xg a fim de obter

a fração da parede celular no sobrenadante. O precipitado foi descartado e o sobrenadante

obtido na fase anterior foi centrifugado a 27000x g e, em seguida, adicionou-se o dodecil sulfato


39

de sódio (SDS) 1% e o pellet foi esquentado durante 5 minutos para dissolver as proteínas. O

extrato de proteínas foi então dialisado contra PBS pH 7,4 (PBS) com troca a cada oito horas

durante dois dias. Transcorrido esse tempo, o extrato de proteínas foi precipitado em álcool

70%, deixado a 4°C por 18 horas e depois centrifugado novamente a 27000 xg por 15 minutos e

finalmente o precipitado foi ressuspendido em água milli-Q estéril, aliquotado e estocado a -

20°C.

4.3.3. Extração da fração proteica do exoantígeno produzido por S. schenckii

Para obter a fração proteica do exoantígeno produzido por S. schenckii foi utilizado o

protocolo descrito por Nascimento e Almeida (2005). Alíquotas do fungo crescido em meio

Mycosel foram transferidas para três tubos contendo meio ágar-BHI (Anexo I) e mantidos por

três dias a 37°C sob agitação a 100 rpm. Após esse período, alíquotas desse pré-inóculo foram

transferidas para um Erlenmeyer de 100 mL contendo 40 mL de caldo BHI e foi cultivado por

dois dias a 37°C sob agitação constante de 100 rpm. Após centrifugação a 1000 x g durante

cinco minutos, o pellet foi transferido para um Erlenmeyer de 1000 mL com 400 mL de meio

YCG (Anexo I) e mantido a 37°C sob agitação de 100 rpm durante três dias. Outra

centrifugação foi feita e o pellet foi então transferido para um Elernmeyer de 2000 mL com 1000

mL de meio YCG e mantido nas mesmas condições por mais sete dias. Em seguida, o

crescimento fúngico foi interrompido pela adição de 0,2 g/L de timerosal e o cultivo mantido por

24 horas a 4°C. Após esse período, a cultura foi centrifugada por 5 minutos descartando o

precipitado e o sobrenadante foi filtrado com filtro de porosidade de 0,22 µm em condições

estéreis. Depois disso, o filtrado foi concentrado 100 vezes pelo sistema Amicon (Millipore,

EUA) com membrana de celulose YM10 (Millipore) e em seguida dialisado contra água

deionizada, a 4°C com duas trocas diárias durante três dias. O exoantígeno foi então liofilizado e

estocado a -20°C para posteriormente ser obtida sua fração proteica como descrito a seguir.

Aproximadamente 12 mg do exoantígeno liofilizado foram dissolvidas em 0,1 mL de PBS

e esse volume foi completado com 10 volumes de uma solução de 10% de ácido tricloroacético


40

(TCA) /acetona (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) e incubado durante 16 horas a -20°C. Após

esse período foi centrifugado a 15000 x g por cinco minutos a 4°C. O sobrenadante foi removido

e em seguida foi adicionado 10 volumes de acetona pura gelada e deixado a -20°C por 10

minutos. Após centrifugar a 15000 x g por cinco minutos a 4°C, o sobrenadante foi removido e o

precipitado de proteínas foi ressuspendido em PBS. A fração proteica assim obtida foi aliquotada

e estocada em freezer a -20°C.

4.3.4. Extração das proteínas da superfície celular

A extração das proteínas da superfície celular (PSC) foi realizada conforme realizado por

Castro e colaboradores (2013). Após a conversão à fase de levedura, a cultura celular foi filtrada

com gaze estéril e a massa celular de leveduras foi isolada por centrifugação (500 x g por 10

minutos) e lavada três vezes com 25mM de Tris-HCL pH 8,5 gelado. Após as lavagens, o pellet

celular foi incubado com solução de extração, contendo 2mM de Ditiotreitol (DTT) (Sigma-

Aldrich, St. Louis, EUA), 1 µM de PMSF e 5 mM de ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA)

(Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) em 25mM de Tris-HCL pH 8,5) durante 120 minutos a 4°C

com agitação leve. O sobrenadante, contendo as proteínas solúveis do fungo foi separado por

centrifugação a 3000 x g por 10 minutos a 4°C e então filtrados com membrana de porosidade

de 0,22 µm. O filtrado foi dialisado contra água destilada a 4°C com várias trocas por 24 horas e

em seguida concentrado em tubos de filtração (Amicon® Ultra-15 de 10K, Millipore, EUA) por

centrifugação a 4000 x g durante 20 minutos. O extrato de proteínas foi precipitado com TCA,

aliquotado e estocado a -20°C como descrito no item anterior.

4.4. Ensaio de viabilidade celular por fluorescência (LIVE/DEAD)

Para verificar a viabilidade celular das leveduras, assim como a integridade da sua

membrana, uma suspensão de leveduras obtida como descrito no item 4.2 foi corada com o “Kit”

Live/Dead Yeast (Molecular Probes®, Life TechnologiesTM, Eugene, OR) antes e após serem

tratadas com o tampão de extração de proteínas contendo DTT como descrito no item anterior.


41

O procedimento de coloração foi realizado conforme as instruções do fabricante. Esse ensaio usa

dois corantes fluorocromos, o FUN-1 (iodeto de 2-cloro-4-[2,3-(dihidro-3-metil) benzo -1,3-

tiazol-2 metilideno]-1-fenilquinolinio) e o Calcofluor white M2R (CFW) (4,4'-bis-[4-anilino-bis-

dietilamino-5-triazina-2-ilamino]-2,2'-estilbeno-ácido dissulfónico).

O FUN1 (excitação/emissão 480/530) penetra nas células por difusão passiva e é

concentrado nos vacúolos, gerando estruturas intravacuolares cilíndricas (EIVC) com uma cor

fluorescente laranja-vermelho nas células metabolicamente ativas com integridade da membrana

plasmática, porém as células comprometidas inclusive com a membrana citoplasmática íntegra,

mas com baixa ou nenhuma atividade metabólica, exibem uma gama de cores fluorescentes entre

o amarelo-verde. O CFW (excitação/emissão 365/461) tem a capacidade de se unir às ligações

β-1-4 da quitina presente na parede celular dos fungos, gerando uma cor azul fluorescente nessa

estrutura. Para este ensaio, 0,2 mL da suspensão de leveduras obtidas como descrito no item 4.2

foram lavadas uma vez com a solução estéril de GH (2% de D-glicose solução e 10 mM Na-

HEPES, pH 7.2) por cinco minutos a 10.000 x g. Após, o pellet foi diluído à concentração de

106 células/mL na mesma solução de GH, contendo os corantes FUN1(20 µM) e CFW (5 µM).

A amostra foi então incubada a 30°C durante 30 minutos na ausência da luz e após 10 μL dessa

suspensão foi depositada em uma lâmina para ser analisada no microscópio fluorescência (BH50,

Olympus, Japão) com filtro para fluoresceína e DAPI (4', 6'-diamidino-2-phenylindole) na

visualização das células coradas com FUN1 e CFW respectivamente.

4.5. Dosagem de proteínas

A dosagem de proteínas foi feita pelo método do ácido bicinconínico (BCA), segundo as

orientações do fabricante (“Kit” 23225 da Thermo Scientific, Estados Unidos) utilizando albumina

sérica bovina (BSA) como padrão de proteínas. Esse método baseia-se na redução de cobre (II)

com proteínas, em meio alcalino, produzindo o cobre (I) e formando um complexo com o BCA

que absorve a 562 nm (máxima absorbância).


42

4.6. Separação de proteínas por SDS-PAGE

As PSC foram separadas em gel de corrida a 10% e em gel de empilhamento a 5% de

acrilamida/bis-acrilamida na proporção de 30:0,8% na presença de SDS sob condições

redutoras com DTT (Laemmli, 1970). O gel de separação foi polimerizado com solução

contendo 1,5 M de Tris-HCL pH 8,8 e 0,1% de SDS, em presença de 0,1% v/v de N,N,N´,N´-

tetrametil-etilenodiamina (TEMED, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e 0,1% de persulfato

de amônio (APS). O gel de empilhamento foi preparado com solução de 0,5 M de Tris-HCl pH

6,8 e 0,4% de SDS, além de 0,1% de APS e 0,05% v/v de TEMED. As amostras e o padrão de

peso molecular foram diluídos em tampão de amostra Lane Marker Sample Buffers (0,3 M

Tris-HCL, 5% SDS, 50% glycerol, 100 mM de DTT e quantidade apropriada de corante rosa)

da Thermo Scientific, na relação de 10 µL do tampão da amostra/50 µL da solução de antígenos

e no caso do padrão de peso molecular, a relação foi de 5µL/20 µL. Após as amostras serem

aquecidas a 100°C (banho-maria) por 5 minutos e depositadas nos poços, a eletroforese foi

realizada à temperatura ambiente em cuba de eletroforese da Thermo Scientific em placas mini-

gel (10 x 8), empregando uma fonte de corrente contínua (Model 1000/500 Power Supply– Bio

Rad) ajustada a 20mA (120V) durante aproximadamente 2 horas e 20 minutos.

O tampão da cuba constituiu de Tris 0,125 M, glicina 0,96M, SDS 0,1 % pH 8,3. As

corridas foram acompanhadas com o padrão de peso molecular (GE Healthcare), a saber,

fosforilase b (94 kDa), albumina bovina (67 kDa), ovoalbumina (43 kDa), anidrase carbônica (30

kDa), inibidor de tripsina (20 kDa) e lacto-albumina (14 kDa) ou o marcador PageRuler Plus

Prestained Protein Ladder (Thermo Scientific) composto por 9 proteínas com os seguintes

pesos moleculares: 10; 15; 25; 35; 55; 70; 100; 130 e 250 kDa. Os géis foram corados com

nitrato de prata (ver descrição da metodologia no Anexo II).


43

4.7. Espectrometria de massas Maldi-TOF das PSC de S. schenckii

4.7.1. Digestão tríptica em gel de poliacrilamida

Tanto a digestão das amostras quanto a sua preparação para as análises no Maldi-Q-

TOF foram feitas segundo o protocolo descrito pelo Laboratório Max Feffer de Genética de

Plantas, Departamento de Genética, Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” ESALQ,

USP, Piracicaba, São Paulo. Resumidamente, após excisão das bandas de proteínas,

descoloração e desidratação com acetonitrila (ACN) 100%, as amostras foram reduzidas com

20 mM de DTT por 40 minutos a 56°C e em seguida alquiladas com 55 mM de iodoacetamida

(IAA) por 30 minutos à temperatura ambiente e ao abrigo da luz. A digestão proteica foi

realizada com 15 µL (20 ng/µL) da solução estoque de tripsina (Trypsin, Sigma-Aldrich, St.

Louis, MO, EUA ) ressuspendida em 40 µL de bicarbonato de amônio 25 mM durante 14 horas

a 37°C. A ação da tripsina foi interrompida com 15 µL de ácido fórmico a 5% em ACN 50%, e

posteriormente os peptídeos foram eluídos com as soluções de ácido fórmico a 1% diluído em

metanol ou ACN.

4.7.2. Purificação da mistura de peptídeos utilizando ZipTips

A purificação foi realizada utilizando colunas Reverse-Phase Zip-Tip Pippete (Millipore,

Estados Unidos) de acordo com as instruções do fabricante, com modificações segundo Salvato

e colaboradores, 2010. As amostras peptídicas foram ressuspendidas em solução 0,1% de ácido

trifluoroacético (TFA). As ponteiras ZipTips foram equilibradas aspirando 10 µL de uma solução

de ACN e 0,1% TFA e descartando, sendo este procedimento realizado três vezes. Em seguida

foram aspirados 10 µL de uma solução de água e 0,1% TFA, descartou-se por três vezes. Para a

ligação da amostra nas colunas contidas nas ponteiras foram aspirados 5 µL da amostra de

peptídeos de sete a 10 vezes para aumentar a fixação em misturas complexas. Após a ligação dos

peptídeos às colunas, foram realizadas duas lavagens, primeiramente aspirando 10 µL de solução

de água e 0,1% de TFA, repetindo o processo três vezes e em seguida aspirando 10 µL de

solução 5% de metanol e 0,1% de TFA, repetindo três vezes. Para finalizar, foi realizada a


44

eluição dos peptídeos aspirando e dispensando várias vezes em um eppendorf limpo 5 µL de

solução ACN e 0,1% TFA (Salvato et al., 2010).

Posteriormente, 1 µL da amostra dissolvido em 50% (vol:vol) de ACN e 1 µL do ácido

alfa-ciano-4-hidroxicinamínico foi aplicado na placa de MALDI para a análise. A análise foi

realizada em modo automático e a calibração foi realizada com padrão interno, CAL Mix1

(ABsciex). Foi utilizado o CID “Collision Induced Dissociation” como método para o

experimento de MS/MS (fragmentação dos peptídeos).

O programa utilizado para obter os resultados da espectrometria foi o ABsciex Maldi

Tof/Tof series explorer version 4.1.0 e os espectros resultantes foram processados utilizando o

Software MASCOT MS/MS Ion Search. As sequências foram então comparadas com

sequências depositadas no banco de dados SwissProt e UniProt. Todas as sequências

identificadas aparecem descritas nos Anexos III, VI e V.

4.7.3. Predição de adesinas presentes nas PSCs de S. schenckii pelo programa

FungalRV

Com o intuito de identificar possíveis adesinas dentre as PSCs, as suas sequências foram

analisadas pelo programa predictor Fungal RV, disponível em http://fungalrv.igib.res.in/. Essa

base de dados contém sequências de adesinas ou prováveis adesinas de oito fungos patogênicos

aos humanos (C. albicans, C. glabrata, Aspergillus fumigatus, Coccidioides immitis,

Coccidioides posadasii, Blastomyces dermatitidis, P. brasiliensis e Histoplasma

capsulatum). As proteínas tipo adesinas ou com característica de adesinas são identificadas pelo

programa por meio de um limiar com pontuação igual ou acima de 0,5. Deste modo, as

sequências de proteínas introduzidas não correlacionadas com propriedades de adesinas e com

pontuação abaixo de 0,5 são identificadas pelo programa com uma cor verde, enquanto as

sequências de proteínas com pontuação igual ou acima desse limiar são identificadas com uma

cor vermelha.

http://fungalrv.igib.res.in/


45

4.8. Purificação da enolase por eletroeluição

Após a análise por espectrometria de massa a enolase foi eletroeluida usando a técnica

descrita por (Neophytou et al, 1996, Sá-Pereira et al, 2000). Resumidamente, foram realizadas

várias eletroforeses conforme no item 4.6 e após corrida, a enolase foi localizada em cada um dos

géis, removida e eletroeluída em tampão glicina (192 mM Glicina; 25 mM Tris base, 0,1% SDS)

com membrana de diálise de 10mA, por 4h a 4ºC

4.9. Formulação vacinal

Antígenos: Foram usadas as PSCs de S. schenckii obtidas pelo método descrito por

Castro e colaboradores (2013) (Ver descrição da metodologia no item 4.3.4).

Adjuvantes: Dois tipos de adjuvantes foram usados: o gel de hidróxido de alumínio

Al(OH)3 a 2% ou Alhydrogel comercializado pela InvivoGen, EUA, na forma de uma suspensão

coloidal estéril, livre de pirógenos e com um conteúdo de Al 3+ entre 9-11 mg/mL; e o adjuvante

Montanide TM Pet Gel A, gentilmente cedido pela SEPPIC, França, composto por uma dispersão

de partículas micro-esféricas altamente estáveis de poliacrilato de sódio em água.

4.9.1. Preparação da formulação vacinal PSC/Al(OH)3

Duas concentrações das PSCs (0,1 mg e 1 mg/0,9 mL de PBS) foram misturadas com

0,1 mL da suspensão coloidal do gel de Al(OH)3 a 2% ressuspendido em PBS. A mistura

antígeno/adjuvante foi mantida sob agitação leve durante 40 minutos à temperatura ambiente.

Essas condições de formulação do adjuvante Al(OH)3 com ambas diluições de proteínas foram

definidas por meio de uma cinética de adsorção descrita a seguir.

4.9.2. Cinética de adsorção das PSCs ao gel de Al(OH)3

Da suspensão coloidal do gel de Al(OH)3 a 2%, 0,1 mL (aproximadamente 1,0 mg) foi

lavado por meio de centrifugação com 0,5 mL de PBS, a 5000 x g por cinco minutos. Após

descartar o sobrenadante, o gel foi ressuspendido em 0,1 mL de PBS. Uma concentração de


46

PSCs 1 mg/0,9 mL em PBS pH 7,2 foram misturadas com 0,1 mL da suspensão coloidal do gel

de Al(OH)3 previamente lavada. A mistura foi mantida sob agitação leve à temperatura ambiente

durante tempos diferentes (10, 20, 30, 40, 60, 80 e 100 minutos). O estudo foi feito em triplicata

para cada intervalo de tempo. A mistura proteínas/adjuvante foi centrifugada a 5000 x g durante

cinco minutos. A concentração de proteínas adsorvidas ao adjuvante foi determinada pelo

método do ácido bicinconínico (BCA) (Item 4.5) por meio da diferença na concentração de

proteínas presente na solução inicial e a obtida no sobrenadante após a centrifugação do gel

(Lindblad e Schonberg, 2010). Os resultados foram expressos como porcentagem de proteínas

adsorvidas ao gel/tempo de incubação. Para verificar se o processo de adsorção comprometeu

as estruturas das bandas de proteínas foi realizada uma eletroforese dos sobrenadantes obtidos

em todos os tempos (10, 20, 30, 40 60, 80 e 100minutos).

Uma vez definido o tempo ótimo de adsorção foi determinada a isoterma de adsorção

das PSCs sobre o Al(OH)3 usando diferentes concentrações da solução de antígenos (0,05; 0,1;

0,25; 0,5; 0,75; 1,0 e 1,250 mg /0,9 mL em PBS) durante um período de incubação de 40

minutos nas condições descritas acima. Transcorrido esse tempo, a quantidade de proteínas

unidas ao adjuvante for determinada pelo ensaio de BCA.

A fim de facilitar a identificação das formulações com o adjuvante Al(OH)3 no decorrer

do trabalho, o termo Al(OH)3 será nomeado como HA.

4.9.3. Preparação da formulação vacinal PSC/Montanide TM Pet Gel A

Duas concentrações das PSCs do fungo, 0,1 mg e 1 mg/0,95 mL de PBS, foram

misturadas com 0,05 ml do gel Montanide TM Pet Gel A (a partir daqui nomeado PetA) ficando o

adjuvante à concentração de 5% na solução. A mistura foi deixada em agitação durante 10

minutos, 200 rpm à temperatura ambiente seguindo instruções do fabricante.


47

4.10. Obtenção de macrófagos peritoneais para ensaio de citotoxidade

Para realizar o ensaio de citotoxicidade das formulações foram utilizados macrófagos

peritoneais obtidos do exsudato peritoneal (PEC) de camundongos Balb/C sadios. Três dias

antes de realizar a extração, três animais foram inoculados com 3,0 mL de tioglicolato de sódio

(DIFCO Lab. LTDA) a 3,0%. Transcorrido esse tempo foram eutanasiados em câmara de CO 2,

em seguida a pele da região abdominal de cada camundongo foi retirada assepticamente em

câmara de fluxo laminar Classe 100 (Veco) e o peritônio exposto. Posteriormente foram

inoculados 5,0 mL de PBS gelado na cavidade abdominal que foi massageada para a liberação

das células peritoneais. O líquido peritoneal resultante foi coletado com seringa e agulha,

transferido para um tubo cônico estéril com capacidade de 15 mL (Corning, Inc.) e centrifugado

a 1500 x g durante 5 minutos e o sedimento celular foi lavado três vezes com 3 mL de PBS.

Após a última lavagem, as células foram ressuspendidas em 1 mL de meio de cultura RPMI-1640

(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) contendo 2β-mercaptoetanol (Sigma-Aldrich, St. Louis,

MO, EUA) a 2x10-5M, penicilina 100 U/mL (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA),

estreptomicina 100 U/mL (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA), L-glutamina 2mM (Sigma-Aldrich,

St. Louis, EUA) e 5% de soro fetal bovino (SFB), sendo o meio assim composto designado de

RPMI-1640 completo (RPMI-1640-C).

Para o ensaio foi feito um pool das células de cada animal e em seguida se realizou a

contagem em câmara de Neubauer (Boeco, Germany). A suspensão celular foi ajustada a

5x105/mL em RPMI-1640-C e então 0,1 ml dessa suspensão foi transferida para placas de

cultura de 96 poços (Corning, Inc.) e incubadas em estufa a 37°C com 5% de CO2 durante

overnight para a aderência dos macrófagos. Em seguida, os sobrenadantes foram descartados

com o intuito de retirar as células não aderentes e um novo meio de cultura foi adicionado na

proporção de 1:1 com as formulações PSC10, PSC100, HA+PSC10, HA+PSC100, HA,

PetA+PSC10, PetA+PSC10, PetA+PSC100, PetA ou NaOH 1N como controle positivo ou

apenas meio RPMI-1640-C como controle negativo do teste. As placas foram incubadas


48

novamente nas condições descritas e em seguida a viabilidade celular foi avaliada pelo ensaio de

MTT descrito no item a seguir.

4.10.1. Avaliação da viabilidade celular

Para avaliar a citotoxicidade celular gerada pelas diferentes formulações foi empregada

para a técnica colorimétrica descrita por Mosmann (1983), a qual utiliza uma solução de brometo

de 3-(4,5-dimetiltiazol-2)-2,5-difeniltetrazólio (MTT). A técnica se baseia na verificação da

atividade e integridade mitocondrial, interpretada como uma medida de viabilidade celular por

meio da redução do sal de MTT por enzimas microssomais e também pela enzima succinato

desidrogenase mitocondrial das células viáveis. O produto dessa redução são cristais de

formazana, insolúveis e de cor púrpura, acumulando-se nas células devido a sua incapacidade de

atravessar a membrana celular. O álcool isopropílico por sua vez é utilizado para a solubilização

da formazana, produzindo uma solução homogênea que possibilita a medição da densidade ótica

em espectrofotômetro UV/Visível. Após o período de incubação foram adicionados sobre a

cultura celular, 100 μl de uma solução de brometo de MTT (Across Organics) a 0,5 mg/mL em

RPMI-1640. A placa foi então incubada por mais três horas nas mesmas condições descritas no

item anterior. Após este período, o conteúdo da placa foi vertido e 100 μL de álcool isopropílico

(Mallinckrodt) foram adicionados a cada orifício para solubilizar os cristais de formazana

formados. A leitura da absorbância foi feita em espectrofotômetro UV/Visível para microplacas

(Multiskan Ascent, Labsystems) em 540 nm com filtro de referência de 620 nm. Esse ensaio foi

repetido três vezes.

4.11. Esquema de imunização

Foram definidos sete grupos de camundongos contendo cinco animais por grupo para

serem imunizados pela via subcutânea. O esquema de imunização seguiu-se conforme a Figura 1

abaixo. Os animais foram imunizados com as formulações descritas no quadro 1 no dia 0 e no dia

14 foi administrada uma dose reforço. Cada grupo de camundongos recebeu 100 µL da


49

formulação descrita no quadro 1. No vigésimo primeiro dia, os animais foram eutanasiados para

que o sangue fosse coletado por punção cardíaca dando seguimento aos protocolos de

experimentação.

Figura 1. Esquema de imunização e eutanásia.

Quadro 1. Distribuição dos grupos de camundongos imunizados por via subcutânea (n=5 por

grupo).

Grupos

experimentais Formulações administradas

Grupo 1 PBS

Grupo 2 0,1mg de PSC/mL PBS (PSC10)

Grupo 3 1 mg de PSC /mL PBS (PSC100)

Grupo 4 0,1mg de PSC /mL PBS + 0,1 mL HA (HA+PSC10)

Grupo 5 1 mg de PSC /mL PBS+ 0,1 mL de HA (HA+PSC100)

Grupo 6 0,1mg de PSC /mL PBS+ Pet Gel A 5% (PetA+PSC10)

Grupo 7 1 mg de PSC /mL PBS+ Pet Gel A 5% (PetA+PSC100)

4.12. Obtenção do soro dos camundongos

Conforme aparece identificado na figura 1, sete dias após a última imunização foi extraído o

sangue de todos os camundongos após a eutanásia. O procedimento de extração foi feito por

punção cardíaca com seringa e agulhas descartáveis (eBiosciences). O sangue total foi

acondicionado em tubos de microcentrífuga estéreis de 1,5mL e incubado em estufa a 37°C por

0 7 14 21 28 Dias Coleta do sangue e

eutanásia

Imunização


50

20 minutos. Em seguida foram centrifugados a 117xg por 10 minutos, os soros colhidos e

transferidos para outros tubos estéreis e armazenados a -20°C até o momento do uso para a

quantificação de anticorpos IgG e subclasses.

4.13. Obtenção de soro policlonal anti-enolase de S. schenckii em camundongos Balb/C.

A enolase eletroeluída foi formulada com adjuvante completo de Freund e a formulação

resultante foi então inoculada por via subcutânea em camundongos Balb/C (n=5) no dia zero,

enquanto que uma segunda imunização foi realizada no dia 14 conforme esquema de imunização

descrito no item 4.11. Na segunda imunização a enolase foi formulada com adjuvante incompleto

de Freund. Decorridos sete dias da última inoculação os animais foram eutanasiados e o sangue

coletado para a obtenção do soro como descrito no item 4.12. O pool de soros anti-enolase de

cada animal foi estocado a -80°C até a realização dos testes propostos.

4.14. Demonstração da presença de PSCs de S. schenckii por citometria de fluxo

O ensaio foi realizado conforme Silva e colaboradores (2014) com modificações. Para

este teste, 5 mL de uma suspensão celular do fungo obtida conforme o item 4.2 foi centrifugada a

1000 x g durante 5 minutos a 4°C. Após, o pellet celular foi lavado duas vezes em PBS na

mesma condição anterior e em seguida foi filtrado através de oito camadas de gaze estéril para a

obtenção de uma suspensão contendo apenas leveduras, confirmada visualmente por microscopia

óptica. Após, alíquotas de 100μL contendo 106 leveduras foram transferidas para tubos

Eppendorf e incubadas por 1h a 37°C com um pool de soros anti-enolase, anti-PSC obtidos de

animais tratados com PSC10, PSC100, HA+PSC10, HA+PSC100, PetA+PSC10 conforme

descrito no item 4.12, ou com o soro de animais infectados com S. schenckii (SCI) todos

diluídos 1/20. Como controle da marcação inespecífica foi usado o soro de camundongos não

infectado e não imunizados (SCNI) na mesma diluição. Em seguida, as suspensões foram lavadas

como acima, ressuspendidas em 100μL de PBS e então incubadas por 1h a 37ºC com um

anticorpo secundário anti-IgG de camundongo obtido em coelho conjugado com FITC (Sigma-


51

Aldrich, St. Louis, EUA) diluído 1/50. As amostras foram lavadas mais duas vezes para remoção

dos anticorpos não ligados e então adquiridas no citômetro de fluxo BD Accuri C6 (BD

Biosciences) e analisadas usando o software proprietário do equipamento. O limiar de aquisição

das amostras foi ajustado para 50.000 no parâmetro FSC-H (“forward scatter – height”) para

exclusão do debri e pelo menos 60.000 eventos foram efetivamente incluídos em cada análise. A

ligação dos anticorpos presentes nos soros testados à superfície das leveduras foi avaliada pela

mediana da intensidade de fluorescência (MFI).

4.15. Ensaio de immunoblot

Duas alíquotas das PSCs contendo 0,05mg em 0,05mL e tampão de amostra Lane

Marker Sample Buffers (Thermo scientific, EUA) foram submetidas paralelamente à eletroforese

em gel de poliacrilamida 10% nas mesmas condições da corrida descrita no item 4.6. Após a

eletroforese, os géis foram colocados sobre membranas de nitrocelulose de 0,45 µm (GE

Healthcare), recobertos com papel de filtro e comprimidos com esponjas de poliuretano. Todos

os materiais foram previamente embebidos em tampão de transferência bicarbonato de sódio e

metanol pH 9,9 e, em seguida encaixados em placas acrílicas perfuradas e mergulhadas na

câmara de transferência contendo o mesmo tampão. A transferência foi feita durante a noite com

amperagem constante de 0,4 mA a 4°C em câmara de transferência para mini-gel 10 x 8

(Thermo Fisher Scientific, EUA).

Após lavagem de 15 minutos, as membranas de nitrocelulose contendo os antígenos

foram cortadas em tiras e incubadas com solução bloqueadora (5% de leite desnatado em PBS)

por 4 horas. Um pool do soro obtido dos animais de cada grupo imunizado foi diluído 1/30 em

PBS, colocados sobre as tiras e deixados sob agitação durante a noite à temperatura ambiente.

Como controle positivo e negativo foi utilizado soro de animais infectados e não infectados com

S. schenckii respectivamente, ambos diluídos a 1/30 em PBS.

Em seguida, as tiras foram lavadas com PBS três vezes, com trocas a cada 10 minutos, para

a retirada do excesso do soro. Então, foram incubadas por 2 horas com conjugado

imunoenzimático, soro anti-IgG de camundongo (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) marcado com


52

peroxidase na diluição de 1/500 em PBS. O excesso de conjugado foi retirado com novo ciclo

de lavagens. As tiras foram reveladas para evidenciar os complexos antígeno-anticorpo formados

com o substrato cromógeno, que consistiu de 0,005 g de diaminobenzidina (Sigma-Aldrich, St.

Louis, EUA) diluída em 30 mL de PBS acrescidos de 150 µL de peróxido de hidrogênio no

momento do uso. A reação foi interrompida com água destilada.

4.16. Detecção de IgG Total anti-PSC no soro dos camundongos imunizados

Foi usado um pool do soro dos animais de cada grupo experimental para a quantificação de

anticorpos IgG totais específicos para as PSCs do fungo. Foram adsorvidas microplacas de 96

poços (Corning Inc.) com 1% de PSC diluídas em PBS (100 µL/poço) e incubadas por 18 horas

a 4°C. As placas foram lavadas três vezes com PBS contendo 0,1% de Tween-20 (PBS-T) em

lavadora Multi Wash II (TriContinent) e em seguida bloqueadas com 200 µL/poço de tampão de

bloqueio (PBS + 10% SFB) durante 1 hora a temperatura ambiente.

A placa foi lavada e diluições do pool do soro 1/100 em tampão de bloqueio foram

adicionadas aos poços. Após incubação de duas horas em estufa a 37°C, a placa foi lavada e

então adicionado 100 µL do conjugado marcado com peroxidase (1/1000) em tampão de

bloqueio. Após incubação de 1 hora a 37°C, e uma nova lavagem foi adicionado o substrato

3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (eBioscience) e deixado por 30 minutos a temperatura ambiente na

ausência de luz. A reação foi interrompida com 50 µL de HCl 3N, e a densidade ótica (DO) foi

lida a 450 nm utilizando leitor de ELISA UV/visível de microplacas (Multiskan Ascent,

Labsystems Research Tech. Div. Helsinki, Finland). A leitura final foi realizada em duplicata e a

média determinada.

4.17. Detecção das subclasses IgG1 e IgG2a anti-PSC de S. schenckii

Também foram dosadas as subclasses de IgG (IgG1 e IgG2a) específicas para as PSCs do

fungo no pool do soro obtido de cada grupo experimental. O procedimento de adsorção e

bloqueio das placas foi feito como no item anterior. Após lavagem com PBS-T, uma diluição do


53

pool do soro 1/30 em tampão de bloqueio foi adicionada aos poços. Após incubação por duas

horas em estufa a 37°C, a placa foi lavada e 100 µL dos anticorpos monoclonais de camundongo

anti-IgG1 e anti-IgG2a, foram administrados sem diluir seguindo as orientações do fabricante

(Mouse typer Sub-isotyping Panel, 172-2055, Bio Rad) e deixada em incubação à temperatura

ambiente durante uma hora. Após lavagem, 100 µL do conjugado marcado com peroxidase

diluído 1/500 em tampão de bloqueio foi adicionado, incubada uma hora à temperatura ambiente,

e em seguida foi adicionado o substrato 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina deixando reagir durante 30

minutos. A reação foi interrompida e a DO lida como no item 4.16. A leitura final foi determinada

em duplicata e a média determinada.

4.18. Obtenção dos macrófagos peritoneais dos grupos vacinados e estimulação com as

PSC

Todos os animais vacinados foram inoculados com 3,0 mL de tioglicolato de sódio

(DIFCO Lab. LTDA) a 3,0% três dias antes de serem eutanasiados em câmara de CO 2 e os

macrófagos peritoneais foram extraídos como descrito no item 4.10, com a diferença que os

macrófagos aqui obtidos foram estimulados com uma solução de PSC de S. schenckii (40

μg/mL). As placas foram incubadas a 37°C por 24 horas em estufa com tensão constante de 5%

de CO2. Em seguida, os sobrenadantes obtidos foram centrifugados a 4°C durante 10 minutos a

14000x g, aliquotados e estocados a -80°C até o momento da dosagem da citocina IL-12.

4.19. Obtenção dos esplenócitos dos grupos vacinados e estimulação com as PSCs

Após a extração das células peritoneais, o peritônio foi aberto para a extração do baço.

O mesmo foi fragmentado com auxílio de pinça anatômica em placa de Petri estéril (Corning,

Inc.) contendo 2,0 mL de RPMI-1640-C gelado para a liberação das células. O conteúdo da

placa contendo a suspensão celular foi aspirado e transferido para um tubo cônico estéril

(Corning, Inc.) de 15 mL. As hemácias foram lisadas com NH4Cl e a suspensão foi lavada três

vezes em PBS estéril a 700xg por 5 minutos a 4°C. Após a última lavagem as células foram


54

ressuspensas em 1 mL de meio RPMI-1640-C e contadas em câmara de Neubauer pela técnica

de exclusão com azul de Trypan a 0,04%. A concentração das células foi ajustada para 5x106

células/Ml em RPMI-1640-C para a realização dos testes propostos.

As suspensões celulares ajustadas para 5x106 células/mL, obtidas de cada animal foram

distribuída em placas de cultura de tecidos de 48 poços (Corning, Inc.) na proporção de 1:1 com

solução de PSC de S. schenckii (40μg/mL) ou Concanavalina A (0,5μg/mL) como controle

positivo ou apenas com o meio RPMI-1640C como controle negativo e incubadas a 37°C por

24 horas em estufa com tensão constante de 5% de CO2 (Forma Scientific). Em seguida, os

sobrenadantes obtidos foram centrifugados a 4°C durante 10 minutos a 14.000 x g, aliquotados e

estocados a -80°C até o momento da dosagem das citocinas e IFN-γ, IL-4 e IL-17.

4.20. Ensaio imunoenzimático (ELISA) para detecção da produção de citocinas

A citocina IL-12 (PharMingen) foi quantificada no sobrenadante das culturas de

macrófagos estimuladas com as PSCs e as citocinas IFN-γ, IL-4 e IL-17 (todas da e-

Bioscience) foram quantificadas no sobrenadante da cultura de esplenócitos estimulados com a

solução de antígeno (PSC).

Todos os procedimentos foram feitos conforme as instruções dos fabricantes.

Basicamente, placas de 96 poços (Corning,NY,USA) foram recobertas com 100 µL/poço de

solução contendo anticorpos purificados de captura, diluídos em tampão apropriado. As placas

foram incubadas a 4°C por 18 horas. Após a incubação, foram realizadas três lavagens com

solução PBS-Tween 20 (0,05%) e as placas foram incubadas com 200 µL/poço de solução de

bloqueio (PBS contendo 10% SFB) durante uma hora a temperatura ambiente. As placas foram

novamente lavadas por três vezes e adicionou-se o padrão e 100 µL/poço das amostras

(sobrenadante). As placas foram incubadas por duas horas a temperatura ambiente. Após o

tempo de incubação, as placas foram lavadas por cinco vezes e incubadas com 100 µL/poço com

anticorpo anti-citocinas (anticorpo biotinilado mais Streptavidina-peroxidase) por 1 hora a

temperatura ambiente. Novamente as placas foram lavadas e foram adicionados 100 µL/poço da


55

solução do substrato. Desta vez, as placas foram incubadas sob proteção da luz durante 30

minutos. Após o tempo determinado a reação foi interrompida com a adição de 50 µL/poço de

uma solução de H2SO4 2N. A absorvância foi lida a 450 nm em um leitor de microplaca

(Multiskan Ascent, Labsystems) e as concentrações das citocinas foram calculadas por meio de

uma curva padrão de concentrações conhecidas das citocinas em questão. Os resultados foram

expressos em pg/mL.

4.21. Ensaio de fagocitose

Para o ensaio de fagocitose foi usada a mesma suspensão de macrófagos (5x106) obtidos

dos camundongos vacinados como descrito no item 4.18. Previamente ao ensaio, células de

leveduras de S. schenckii obtidas como em 4.2.1 foram ajustadas na concentração de 4x107

células/mL e opsonizadas com soro de cada camundongo vacinado na diluição de 1/100 em PBS

durante 1 hora a 37°C sob agitação leve. Em seguida, parte da suspensão de leveduras foi lavada

e ressuspendida em 1 mL de RPMI-1640-C, enquanto outra parte foi deixada sem opsonizar. O

ensaio foi realizado em câmaras para cultura celular LabTex (Nunc, Naperville IL). Em cada

poço foi colocado 500 µL da suspensão de macrófagos e incubadas a 37°C em estufa contendo

5% de CO2 por 24 horas. Cada poço foi lavado com RPMI-1640-C e em seguida adicionado

500 µL da suspensão de leveduras opsonizadas. Para cada camundongo, o ensaio foi feito em

duplicata usando leveduras opsonizadas e não opsonizadas. Em seguida, as câmaras foram

incubadas por duas horas a 37°C e 5% de CO2. Transcorrido esse tempo os poços foram

lavados exaustivamente com PBS para eliminar as leveduras não fagocitadas. Posteriormente a

cultura foi fixada com metanol puro durante cinco minutos e coradas pelo método de Giemsa

durante 30 minutos. Em seguida as câmaras foram lavadas com água corrente para eliminar o

excesso do corante e então analisadas em microscópio óptico comum (Nikon Model YS100)

com objetiva de 40X. Finalmente, foram contados 400 macrófagos por amostra para se

determinar o índice fagocítico (IF) por meio da seguinte fórmula (de Lima et al., 2011):


56

Cálculo do IF:

Porcentagem de macrófagos que fagocitaram X Média de leveduras fagocitadas

4.22. Ensaio de inibição da adesão de S. schenckii sobre fibroblastos

O ensaio de inibição da adesão de S. schenckii à linhagem de fibroblastos L929 foi

realizado conforme Mendes-Giannini (2004). Previamente realizado em placas de 6 poços

contendo no interior uma lamínula quadrada. A linhagem de fibroblastos L929 foi expandida em

meio DMEM (Gibco, Grand Island, NY) suplementado com 10% de SFB (Gibco, Grand Island,

NY), penicilina (1ul/mL), estreptomicina (1ul/mL) e garamicina (1ug/ml) a 37 °C e 5% CO 2 com

passagem a cada três dias. Após tripsinização e homogeneização da suspensão celular, as células

foram retiradas da garrafa e então centrifugadas a 500 x g durante 10 minutos a 4°C. A

suspensão celular em meio DMEM foi contada em câmara de Neubauer pela técnica de exclusão

com azul de trypan a 0,04% e ajustada à concentração 2,5x105células/mL em DMEN. Várias

alíquotas dessa suspensão foram transferidas para placas de 6 poços contendo uma lamínula

quadrada e então incubada durante uma noite em estufa a 37°C e 5% CO2. No outro dia antes

de realizar o ensaio de inibição o meio foi descartado.

As células de S. schenckii obtidas como no item 4.2 foram lavadas duas vezes com PBS

a 1000 x g durante 5 minutos a 4°C. As leveduras foram contadas em câmara de Neubauer e

ajustadas à concentração de 25 x 107/mL. Dessa suspensão foram tomadas várias réplicas de 0,1

mL e então incubadas alternativamente durante 1 hora a 37°C com um pool do soro, diluído

1/100 em PBS dos grupos vacinados ou com o soro de camundongos não infectados com S.

schenckii. Após duas lavagens com PBS, as leveduras foram transferidas para as placas de 6

poços contendo os fibroblastos e então incubadas por três horas a 37°C. Após esse tempo as

lâminas foram retiradas dos poços, lavadas com PBS, fixadas com metanol (10 minutos) e então

coradas com violeta cristal para quantificação como no item 4.21, mas com objetiva 100 x

utilizando óleo de imersão. O índice de inibição foi calculado pela porcentagem de fibroblastos


57

com pelo menos 1 levedura unida a sua membrana multiplicado pela média da quantidade de

leveduras unidas a esses fibroblastos (Bianco et al., 1975).

4.23. Estudo de proteção

Para o ensaio de um pool dos soros obtidos dos camundongos vacinados com as

formulações PSC100, HA+PSC100 e PetA+PSC100 foram diluídos 1/2 em 100 µl PBS e em

seguida transferidos individualmente pela via intraperitoneal em camundongos Balb/c (n=7 por

grupo). Duas horas após, os camundongos foram infectados com 200 µl de uma suspensão de

leveduras de S. schenckii (1x106 ) em PBS. O soro de camundongos não infectados foi utilizado

como controle negativo do teste. A proteção foi avaliada pela contagem de unidades formadoras

de colônias (UFC) presentes no baço e fígado como descrito no item a seguir.

4.24. Determinação de UFC no baço e fígado

Para a contagem de UFC, o baço e o fígado dos camundongos tratados passivamente

foram extraídos cinco dias após à infecção, quando o pico da carga fúngica é elevado neste

modelo de infecção por S. schenckii (Ferreria et al., 2015). Ambos os órgãos foram removidos

assepticamente e passado através de uma malha de nylon, com poros de 100 µm para a

fragmentação dos mesmos com auxílio de pinça anatômica em placa de Petri estéril (Corning,

Inc.) contendo 2 mL de PBS. Em seguida 200 µl de uma diluição 1/200 da suspensão celular

desses órgãos foram plaqueados individualmente em placas de Petri contendo meio Mycosel. O

número de UFC foi contado após três e sete dias de incubação à temperatura ambiente. Os

resultados foram expressos como o número de UFC/órgão.

4.25. Análise histológica

O processamento histológico das amostras de interesse foi realizado pelo Prof. Dr.

Cleverton Roberto de Andrade do Departamento de Fisiologia e Patologia, Laboratório de

Patologia, Faculdade de Odontologia da UNESP-Universidade Estadual Paulista de Araraquara,


58

São Paulo. Resumidamente, após a eutanásia dos animais foram extraídos os tecidos cutâneos na

região de inoculação e armazenados em solução formaldeído a 10% por 24 horas.

Posteriormente, procedeu-se o processamento histológico para inclusão em parafina. O

processamento histológico foi realizado iniciando-se pela descrição macroscópica das peças

coletadas. As mesmas foram medidas no comprimento, largura e altura. Em seguida, foram

realizados cortes seriados do tecido cutâneo (a cada 3mm no sentido de maior comprimento)

para que todo o tecido fosse avaliado. Por fim, as peças foram incluídas em cassetes histológicos

devidamente identificados.

Após a confecção dos blocos de parafina, estes foram submetidos aos cortes

histológicos em micrótomo manual, com espessura de corte da ordem de 4 μM. Estes cortes

foram submetidos à solução de etanol 10º GL e posteriormente à água aquecida à 46º C, a fim de

serem esticados mantendo-se a qualidade necessária. Estes cortes foram então dispostos em

lâminas de vidro lapidadas, sendo então encaminhadas para estufa a 61ºC a fim de que ocorresse

a adesão dos cortes. Após a adesão, foi realizada a coloração histológica, seguindo o protocolo

da coloração da Hematoxilina de Harris com adição de Eosina amarelada.

Os tecidos cutâneos foram analisados sempre da epiderme para a derme. Inicialmente

verificou-se alterações epiteliais (acantose, normal e atrofia do epitélio) e alterações em anexos

cutâneos. Em seguida, no tecido conjuntivo, observou-se a presença ou ausência de corpo

estranho assim como a formação ou não de reposta inflamatória do tipo corpo estranho. Além do

tipo (aguda, crônica e mista) e intensidade da resposta inflamatória (leve, moderada e forte). Por

fim, verificou-sea camada muscular estriada quanto a presença de necrose, regeneração e

interrupção de continuidade com substituição por tecido conjuntivo (cicatrização tardia da lesão

anterior).

As fases do processamento das amostras para inclusão em parafina, assim como as

soluções e o procedimento de coloração com Hematoxilina e Eosina aparecem detalhadas nos

Anexos VI e VII.


59

4.26. Análise estatística

Para realização da análise estatística foi utilizado o programa Graph Prism 5.0. A análise

de variância (ANOVA) foi realizada e a prova de Tukey para comparar as diferenças estatísticas

entre os diferentes grupos experimentais. Foram considerados significativos os valores com

p<0,05.

Resultados

5. Resultados

60

5. RESULTADOS

5.1. Perfil eletroforético das proteínas isoladas da parede celular de S. schenckii

Na Figura 2 observam-se os géis de eletroforese vertical contendo os perfis das proteínas

obtidas do fungo S. schenckii na fase de levedura, através das três metodologias testadas neste

trabalho. É possível observar na Figura 2 A (Metodologia de Ruiz-Baca et al., 2009) um perfil

de bandas de proteínas pouco definidas (linha 3), difusas e difíceis de contar, similares às bandas

de proteínas isoladas pelo reagente Y PER (Thermo), o qual foi usado como controle

comparativo do teste. Na Figura 2 B (Metodologia de Nascimento e Almeida, 2005) a

eletroforese mostra apenas quatro bandas (linha 2) bem definidas no intervalo de 25 a 100 kDa

da fração proteica isolada do exoantígeno e outras bandas pouco visíveis abaixo desse peso

molecular, já na Figura 2 C (Metodologia de Castro et al., 2013) pode-se observar sete bandas

de proteínas bem definidas entre os pesos moleculares de 25 e 130kDa e outras duas menos

definida com peso molecular entre 15 e 25 kDa.

5. Resultados

61

Figura 2. Perfil eletroforético dos isolados proteicos de S. schenckii caracterizados por

SDS-PAGE. A linha 1 dos três géis corados pelo método com nitrato de prata corresponde ao

padrão de peso molecular. Em A, linha 2: proteínas de S. schenckii obtidas com o “Kit” Y-Per;

linha 3: proteínas obtidas usando metodologia descrita por Ruiz-Baca e colaboradores (2009). Em B,

linha 2: fração proteica do exoantígeno do fungo usando a metodologia de Nascimento e Almeida

(2005). Em C, linha 2: proteínas do fungo obtidas com tampão de extração contendo DTT

(metodologia descrita por Castro et al., 2013).

5. Resultados

62

5.2. Análise da viabilidade celular e integridade da membrana

Como observado na Figura 3, o procedimento de extração das PSC do fungo não afetou

a viabilidade celular conferida pela integridade da parede celular (corada em azul) e a presença de

EIVC alaranjadas no citoplasma antes e depois do tratamento com o tampão de extração

contendo DTT, sugerindo que o isolado de proteínas foi preferencialmente da superfície celular e

não produto do rompimento das células.

Figura 3. Viabilidade celular das leveduras de S. schenckii através do “kit” LIVE/DEAD

Yeast. Este “kit” usa o fluorocromo Calcofluor White M2R para a coloração da parede celular

(azul) e verificar a integridade da membrana celular e o FUN1, também flurocromo para verificar a

atividade metabólica das células viáveis através formação de estruturas intravacuolares cilíndricas

(EIVC) vermelhas ou alaranjadas. Ambas as colorações nas leveduras foram visualizadas

simultaneamente por microscopia de fluorescência usando canal DAPI para a marcação com

Calcofluor White M2R e canal de fluoresceína para o FUN1. Na imagem A, a seta mostra a parede

celular corada em azul e nas imagens B e C, as setas mostram as EIVCs alaranjadas (sinal de

viabilidade) formadas no fungo antes e após a extração das proteínas com DTT.

(B) Leveduras viáveis (A) Membrana íntegra

Tratamento com DTT

(C) Leveduras viáveis

Antes tratamento com DTT

5. Resultados

63

5.3. Identificação proteômica das PSC de S. schenckii

A análise por espectrometria de massas das PSC revelou sete proteínas com funções

desconhecidas e apenas duas foram identificadas com peso molecular de 44 kDa (peptídeo

hidrolases) e 47 kDa (enolase) presentes tanto na cepa de S. schenckii ATCC 58251 quanto em

S. brasiliensis 5110, sendo que a enolase foi predita como uma adesina pelo programa

FungalRV (Quadro 2).

Quadro 2. Identificação das proteínas da superfície celular de S. schenckii por MALDI-TOF

Bandas

de

proteínas

Número de acesso pI/ PM (kDa) Score Proteína FungalRV

1 U7PYE2_SPOS

C

5,92/116 36 Não caracterizada Não-Adesina

2 U7PWE7_SPOSC 4,51/82 51 Não caracterizada Não-Adesina

3 U7Q5N4_SPOSC 5,31/44 29 Peptídeo Hidrolases Não-Adesina

4 U7PQE7_SPOSC 8,13/71 83 Não caracterizada Não-Adesina

5 U7PSS1_SPOSC 5,20/47 73

Enolase S.

schenckii ATCC

58251 e S.

brasiliensis 5110

Adesina

6 U7PHE8_SPOSC 5,11/46 35 Não caracterizada Não-Adesina

7 U7Q491_SPOSC 9,44/10 25 Não caracterizada Não-Adesina

8 U7Q6P0_SPOSC 6,91/14 32 Não caracterizada Não-Adesina

9 U7PTB3_SPOSC 8,37/45 27 Não caracterizada Não-Adesina

pI: ponto isoelétrico, PM: peso molecular teórico.

5. Resultados

64

kDa

94

67

43

30

20

1 2 3 4 5 6 7 8 9

A B

5.4. Determinação do tempo de equilíbrio da adsorção

Os resultados revelaram que o tempo de adsorção ótima para as PSC (1 mg) misturado com

HA (1 mg) no volume final de 1 mL em PBS foi obtido aos 40 minutos (Figura 4 A) com uma

capacidade máxima de adsorção de 474,85 µg de PSC/mg de HA (Quadro 3). Como pode ser

observar na Figura 4 (B) a eletroforese realizada aos sobrenadantes obtidos nos tempos de adsorção

10, 20, 30, 40 e 60 minutos, revelou que aparentemente não houve degradação das PSC durante o

processo de adsorção.

Figura 4. Efeito do tempo de contato das PSC sobre HA. As PSC (1mg/0,9mL em PBS)

foram misturadas com 0,1 mL (1 mg) do HA e deixada reagir durante tempos diferentes (10, 20,

30, 40, 60, 80 e 100 minutos) a PBS a 25°C e pH 7.4. Em A: cada tempo o sobrenadante foi

separado por centrifugação e a quantidade de proteínas unidas ao gel de HA foi determinada pelo

método do BCA subtraindo a quantidade de proteínas presentes na solução inicial e a obtida no

sobrenadante após a adsorção. Em B, Linha 1: peso molecular, linha 2: concentração inicial das PSC

1mg/mL, Linha: 3, 4, 5, 6 e 7 (corrida eletroforética dos sobrenadantes da cinética de adsorção

obtidos nos tempos 10, 20, 30, 40, 60. 80 e 100 minutos, respectivamente.

Quadro 3. Capacidade de adsorção das PSC sobre o HA

Concentração AL3 dentro

HA (mg/mL)

Concentração

das PSC (mg/0.9

mL)

Condições de

adsorção

Tempo de

Adsorção

máxima

(min)

Capacidade

de adsorção

(µg/mg AH) Meio pH

0,1 1 PBS 7,4 40 474,85

5. Resultados

65

5.5. Isoterma de adsorção

Considerando o resultado anterior, a máxima adsorção das proteínas sobre o HA foi

alcançada aos 40 minutos e este tempo foi usado para determinar a isoterma de adsorção. Os

resultados indicaram que a adsorção da mistura de proteínas sobre o adjuvante de alumínio é

complexa e não segue o comportamento linear da isoterma de Langmuir, sugerindo que as PSC

foram adsorvidas em várias capas sobre o HA (Figura 5).

Qe

(µ

g P

SC

ad

so

rvid

a/m

g H

A)

0 1 0 0 2 0 0 3 0 0 4 0 0 5 0 0 6 0 0 7 0 0

0 .0

0 .2

0 .4

0 .6

0 .8

P S C e m so lu ç ã o , C e (µ g /m L )

Figura 5. Isoterma de adsorção das PSC sobre o HA. As PSC foram adicionadas ao gel de

HA a diferentes concentrações e incubadas durante 40 minutos. A quantidade de proteínas unida ao

adjuvante foi determinada pelo método do BCA subtraindo a quantidade de proteínas presentes na

solução inicial e a obtida no sobrenadante após a adsorção. Qe (quantidade de proteínas adsorvidas

(µg) por mg de HA no tempo de equilíbrio), Ce (Concentração do equilíbrio).

5. Resultados

66

5.6. Citotoxicidade in vitro das formulações vacinais

A citotoxicidade das formulações vacinais foi avaliada em cultura com macrófagos

peritoneais obtidos de camundongos sadios Balb/C durante 20 h a 37°C em estufa. Como indica

a Figura 6 para ambas as doses de antígenos PSC10 e PSC100 testadas na ausência dos

adjuvantes induziram aproximadamente 22% de citotoxicidade nos macrófagos quando

comparadas com o controle RPMI. As formulações HA+PSC10 e HA causaram uma

citotoxicidade significativamente maior de 80%, assim como o controle positivo deste ensaio

NaOH 0,1N. As formulações HA+PSC100 e o PetA induziram 56.6 e 64 % de citotoxicidade,

respectivamente. Ambas as concentrações das PSC formuladas com o PetA induziram no redor

do 40% de toxicidade nos macrófagos. Os resultados demonstram claramente que o adjuvante

PetA quando formulado ou não com as PSCs é menos tóxico do que o HA.

5. Resultados

67

Figura 6. Citotoxicidade celular das formulações em cultura com macrófagos peritoneais

de camundongos Balb/C. O ensaio foi realizado durante 20 h a 37°C, CO2 e a viabilidade celular

foi determinada pelo ensaio do MTT. RPMI (controle negativo do teste), NaOH 1N (controle

positivo do teste), PSC (proteínas da superfície celular de S. schenckii). PSC10 (10µg do

antígeno/100µL em PBS), PSC100 (100µg do antígeno/100µL em PBS). HA (adjuvante hidróxido de

alumínio, 100 µg/dose), PetA (adjuvante Montanide TM

Pet Gel A a 5%). Ambos os adjuvantes

foram formulados com a menor e maior concentração das PSC: HA+PSC10, HA+PSC100,

PetA+PSC10 e PetA+PSC100. Concentração do HA (100 µg/dose) e o PetA (5%/dose). A

significância estatística foi determinada por ANOVA usando o teste de comparações múltiplas de

Tukey com intervalo de confiança de 95%. Letras distintas representam diferenças significativas

entre os diferentes tratamentos (p < 0,05).

5. Resultados

68

5.7. Títulos de anticorpos da classe IgG e subclasses IgG1 e IgG2a induzidos pelas

formulações vacinais

Como pode se observar na Figura 7 A, a produção de anticorpos IgG contra as PSC foi

evidente em todos os grupos, com exceção do grupo controle PBS, e este aumento foi

significativamente maior nas formulações HA+PSC100 e PetA+PSC100. No entanto, mesmo

sendo evidente a indução de anticorpos nos grupos PSC100, HA+PSC10 e PetA+PSC10, não

houve diferença significativa entre eles. A produção de IgG1 (Figura 7 B) foi também estimulada

por todas as formulações, porém houve homogeneidade dessa subclasse entre os grupos PSC10,

PSC100 e HA+PSC10, assim como entre este último grupo e as formulações HA+PSC100 e

PetA+PSC100. A maior indução desse subtipo de imunoglobulina G foi evidenciada na

formulação PetA+PSC10, mas essa produção não foi significativa quando comparada com

HA+PSC100. O maior nível de produção do subtipo IgG2a (Figura 7 C) foi alcançado no grupo

imunizado com o candidato vacinal PetA+PSC100. As formulações PetA+PSC10 e

HA+PSC100 também induziram nos camundongos a produção desta subclasse, sendo

estatisticamente diferente quando comparada com os tratamentos PSC10, PSC100,

HA+PSC10, assim como no grupo controle PBS, porém o nível de produção induzido por

PetA+PSC10 foi estatisticamente inferior a HA+PSC100.

5. Resultados

69

Figura 7. Resposta de anticorpos IgG, IgG1 e IgG2a contra as PSC de S. schenckii. Cada

grupo de camundongos Balb/C (n=5) recebeu duas dose das formulações vacinais por via

subcutânea com intervalo de 14 dias, e sete dias após a segunda imunização foi determinado no soro

de cada animal o título de anticorpos IgG (A), IgG1(B) e IgG2a (C) contras as PSC. PSC10 (10µg

do antígeno/100µL em PBS), PSC100 (100µg do antígeno/100µL em PBS), HA (adjuvante hidróxido

de alumínio, 100 µg/dose), PetA (adjuvante Montanide TM

Pet Gel A a 5%). Ambos os adjuvantes

foram formulados com a menor e maior concentração das PSC: HA+PSC10, HA+PSC100,

PetA+PSC10 e PetA+PSC100. A significância estatística foi determinada por ANOVA usando o

teste de comparações múltiplas de Tukey com intervalo de confiança de 95%. Letras distintas

representam diferenças significativas entre os diferentes tratamentos (p < 0,05).

5. Resultados

70

5.8. Demonstração da presença da enolase e PSC de S. schenckii por citometria de

fluxo.

A presença da enolase na parede celular de S. schenckii ATCC 16345, assim como das

PSC desse mesmo fungo, foi confirmada por citometria de fluxo. O soro anti-enolase de S.

schenckii, obtido pela imunização dos camundongos com essas proteínas foi capaz de se ligar às

leveduras não permeabilizadas dessa espécie (Figura 8), indicando a presença da enolase na

superfície celular desse fungo. Haja vista a forte reatividade cruzada do soro anti-enolase com os

dois isolados de gatos (Sb250 e Sb256) é possível que a enolase também esteja presente na

parede celular dessas espécies (Figura 8, B e C). Houve uma alta reatividade cruzada entre as

proteínas da parede celular das três cepas (Figura 8, A, B e C). Conforme esperado, o soro das

diferentes formulações vacinais, HA+PSC10 (MFI: 248,4), HA+PSC100 (MFI:474,27) e

PetA+PSC10(MFI:238) marcaram mais intensamente a superfície celular da cepa S. schenckii

ATCC 16345 do que as formulações PSC10(MFI:197.52) e PSC100(MFI:167,9) , sugerindo a

capacidade potencial dos dois adjuvantes de potencializar a reposta imune a baixa dos antígenos.

5. Resultados

71

Figura. 8. Detecção da presença da enolase e PSC de S. schenckii por citometria de

fluxo. Uma suspensão de leveduras de S. schenckii foi previamente incubada com o soro anti-PSC dos

grupos PSC10, PSC100, HA+PSC10, HA+PSC100, PetA+PSC10, com o soro anti-enolase ou com o soro de

camundongos infectados (SCI), todos diluídos 1/20. Em seguida, as células foram incubadas com um anticorpo

anti-IgG de camundongo obtida em coelho e conjugada com FITC. Como controle negativo foi usado o soro de

camundongos não infectados e não imunizados (SCNI). (A-F) Histogramas representativos das marcações dos

diferentes grupos. (G) Valores de mediana da intensidade de fluorescência (MFI) e indicação das linhas

correspondentes a cada grupo nos histogramas. PSC10 (10µg do antígeno/100µL em PBS), PSC100 (100µg do

antígeno/100µL em PBS), HA+PSC10 e HA+PSC100 (HA formulado com PSC10 e PSC100, respectivamente),

PetA+PSC10 (adjuvante MontanideTM

Pet Gel A formulado com PSC10).

5. Resultados

72

5.9. Proteínas imunorreativas reconhecidas pelo soro dos camundongos vacinados

Um pool dos soros obtido de cada grupo vacinado foi usado para identificar as bandas

de proteínas imunorreativas do isolado proteico de S. schenckii. Este estudo revelou que o soro

de todos os grupos, a exceção do grupo 2 (PSC10), foram capazes de reconhecer duas

proteínas imunorreativas de 47 e 71 kDa que também foram reconhecidas pelo soro de

camundongos infectados, sendo a proteína de 47 kDa a enolase com propriedades de adesina

(Figura 9).

Figura 9. Western blot com um pool de soro anti-PSC obtido dos animais tratados com as

formulações vacinais . Cada grupo de camundongos Balb/C (n=5) recebeu duas doses das

formulações vacinais por via subcutânea com intervalo de 14 dias, e sete dias após a segunda

imunização foi colhido o soro de cada animal nos diferentes grupos: na linha 1: PBS, linha 2: PSC10,

linha 3: PSC100, linha 4: HA+PSC10, linha 5: HA+PSC100, linha 6: PetA+PSC10, linha 7:

PetA+PSC100, linha 8: soro de camundongos infectados com S. schenckii e linha 9: soro de

camundongos não infectados. A seta indica a proteína de 47 kDa ou enolase com propriedades de

adesina. PSC10 (10µg do antígeno/100µL em PBS), PSC100 (100µg do antígeno/100µL em PBS),

HA (adjuvante hidróxido de alumínio, 100µg/dose), PetA (adjuvante Montanide TM

Pet Gel A a 5%).

Ambos os adjuvantes foram formulados com a menor e maior concentração das PSC: HA+PSC10,

HA+PSC100, PetA+PSC10 e PetA+PSC100.

5. Resultados

73

5.10. Indução de IL-12, IFN-γ, IL-4 e IL-17 pelas formulações vacinais

A produção de IL-12 e IFN-γ foi maior nos grupos HA+PSC100 e PetA+PSC100,

porém entre eles a estimulação da citocina IL-12 foi significativamente maior no grupo

PetA+PSC100 (Figuras 10 A e B). Os demais tratamentos não mostraram diferença significativa

entre eles com respeito a essas citocinas. A produção de IL-4 e IL-17 foi estimulada nos

camundongos vacinados com HA+PSC10 e HA+PSC100 com respeito ao resto dos grupos

(Figuras 10 A e B), sugerindo que a formulação HA+PSC100 induziu um padrão de reposta

imune Th1, Th2 e Th17, no entanto HA+PSC10 estimulou um padrão preferencialmente Th2 e

Th17. Os resultados também mostraram que as formulações do PetA com ambas as

concentrações de proteínas estimularam um balanço na reposta Th1/Th2.

5. Resultados

74

Figura 10. Quantificação das citocinas IL-12, IFN-γ, IL-4 e IL-17. Cada grupo de

camundongos Balb/C (n=5) recebeu duas doses das diferentes formulações vacinais por via

subcutânea com intervalo de 14 dias, e sete dias após a segunda imunização, as células dos animais

foram obtidas e estimuladas com PSC (0,5μg/mL), como controle negativo do teste, o RPMI, e

controle positivo, o LPS. Os grupos vacinais do estudo foram: PSC10 (10µg do antígeno/100µL em

PBS), PSC100 (100µg do antígeno/100µL em PBS), HA (adjuvante hidróxido de alumínio, 100

µg/dose), PetA (adjuvante Montanid e TM

Pet Gel A a 5%). Ambos os adjuvantes foram

formulados com a menor e maior concentração das PSC: HA+PSC10, HA+PSC100, PetA+PSC10

e PetA+PSC100. A significância estatística foi determinada por ANOVA usando o teste de

comparações múltiplas de Tukey com intervalo de confiança de 95%. Letras distintas representam

diferenças significativas entre os diferentes tratamentos (p < 0,05).

5. Resultados

75

5.11. Análise da fagocitose in vitro induzida pelo soro dos grupos vacinados

Os resultados do ensaio de fagocitose in vitro de leveduras não opsonizadas e

opsonizadas de S. schenckii pelos macrófagos peritoneais dos camundongos vacinados são

mostrados na Figura 11. Em todos os grupos, o índice fagocítico foi extremamente menor na

presença de leveduras não opsonizadas (Figuras 11 A). No entanto, quando a fagocitose foi

analisada na presença de leveduras opsonizadas o índice fagocítico aumentou consideravelmente

(Figura 11 B), principalmente na cultura de macrófagos obtidos dos animais imunizados com a

formulação PetA+PSC100, a qual foi estatisticamente maior com respeito a HA+PSC100 e

PetA+PSC10. A indução de anticorpos opsonizantes pela formulação PetA+PSC10 foi

estatisticamente maior quando comparado com os grupos PSC10, HA+PSC10 e PBS, mas

estatisticamente inferior com respeito à formulação HA+PSC100. Não houve diferença estatística

entre os grupos PSC10, PSC100, HA+PSC10 e PBS. Na figura 12 mostra-se uma imagem

representativa da fagocitose de leveduras opsononizadas ou não com macrófagos obtidos dos

grupos tratados com PBS, PSC100, HA+PSC100 e PetA+PSC100.

5. Resultados

76

Figura 11. Fagocitose de leveduras não opsonizadas (A) e opsonizadas (B) de S.

schenckii pelos macrófagos peritoneais obtidos de camundongos dos grupos vacinados

com as diferentes formulações. Os macrófagos foram obtidos sete dias após a segunda

imunização e então cultivados com leveduras de S. schenckii, previamente opsonizadas com um

pool (1:100) do soro diluído de cada formulação vacinal em PBS durante 1 hora a 37°C, antes do

ensaio de fagocitose. PSC10 (10µg do antígeno/100µL em PBS), PSC100 (100µg do antígeno/100µL

em PBS), HA (adjuvante hidróxido de alumínio, 100 µg/dose), PetA (adjuvante Montanide TM

Pet

Gel A a 5%). Ambos os adjuvantes foram formulados com a menor e maior concentração das

PSC: HA+PSC10, HA+PSC100, PetA+PSC10 e PetA+PSC100. A significância estatística foi

determinada por ANOVA usando o teste de comparações múltiplas de Tukey com intervalo de

confiança de 95 %. Letras distintas representam diferenças significativas entre os diferentes

tratamentos (p < 0,05).

5. Resultados

77

Figura 12. Imagem representativa da fagocitose realizada com leveduras opsonizadas e

não opsonizadas de S. schenckii. Os macrófagos foram obtidos sete dias após a segunda

imunização e então cultivados com leveduras de S. schenckii, previamente opsonizadas com um

pool (1:100) do soro diluído de cada formulação vacinal em PBS durante 1 hora a 37°C, antes do

ensaio de fagocitose. Em A, C, E e G: fagocitose com leveduras não opsonizadas. Em B, D, F e H:

fagocitose com leveduras opsonizadas. As fotos são representativas dos Grupos PBS (A e B),

PSC100 (C e D), HA+PSC100 (E e F), PetA+PSC100 (G e H). A seta azul indica leveduras não

fagocitadas e a seta preta indica leveduras no citoplasma dos macrófagos. As células foram coradas

por Giemsa e analisadas por microscopia ótica 100x.

5. Resultados

78

5.12. Ensaio de inibição

Como mostra a Figura 13, todas as formulações induziram títulos de anticorpos inibidores

da adesão de S schenckii aos fibroblastos, porém essa resposta foi estatisticamente superior nos

grupos HA+PSC100 e PetA+PSC100, não havendo diferença estatística entre eles. Os grupos

PSC10 e PSC100 também induziram anticorpos que inibiram a adesão do fungo aos fibroblastos,

sendo esta inibição estatisticamente inferior com relação a HA+PSC10 e PetA+PSC10.

Figura 13. Inibição da adesão de S. schenckii aos fibroblastos (Fb). As leveduras de S.

schenckii foram lavadas com PBS e opsonizadas com o soro anti-PSC (diluição 1:100) dos grupos

vacinados (PSC10, PSC100, HA+PSC10, HA+PSC100, PetA+PSC10 e PetA+PSC100) ou com

soro de camundongos não infectados (SCNI) como controle. As células foram lavadas e

transferidas para placas contendo fibroblastos e em seguida, as leveduras não unidas foram retiradas

por lavagem e a ligação de S. schenckii aos fibroblastos foi visualizada por coloração com violeta

cristal. Na figura, a imagem mostra as leveduras de S. schenckii aderidas ou não aos fibroblastos.

A significância estatística foi determinada por ANOVA usando o teste de comparações múltiplas de



5. Resultados

79

5.13. Ensaio de proteção

A transferência passiva de soro anti-PSC induzido pelas formulações HA+PSC100 e

PetA+PSC100 diminuíram a carga fúngica no baço e no fígado, e em seguida, os animais foram

desafiados com S schenckii (Figura 14). Essa resposta foi estatisticamente maior quando

comparada com o grupo de camundongos que recebeu soro obtido de animais imunizados com

PSC100, evidenciando o papel protetor de ambas as formulações.

Figura 14. Unidades Formadoras de Colônias no baço (A) e no fígado (B) dos animais

tratados passivamente com o soro anti-PSC. Os soros obtidos dos camundongos vacinados

com PBS, PSC100, HA+PSC100, PetA+PSC100 foram transferidos passivamente, assim como

também o soro de camundongos não imunizados (SCNI). Duas horas após a transferência passiva

desses soros, os camundongos foram desafiados com 1x106

leveduras de S. schenckii.

Transcorridos 5 dias, o baço e o fígado foram extraídos para determinação das UFCs. A

significância estatística foi determinada por ANOVA usando o teste de comparações múltiplas de



5. Resultados

80

5.14. Análise histopatológica

A análise histológica indica que os grupos imunizados com ambas as concentrações de

antígenos usadas neste estudo (PSC10 e PSC100) na ausência dos adjuvantes HA e o PetA,

mostraram presença de leve infiltrado inflamatório agudo (neutrófilos), degeneração de algumas

fibras musculares estriadas subcutâneas e edema no tecido cutâneo analisado (Figura 15 A e B).

Já nas formulações HA+PSC10, PetA+PSC10 e PetA+PSC100 observa-se moderada resposta

inflamatória mista (neutrófilos e macrófagos), abundantes fibroblastos, assim como a perda de

continuidade nas fibras musculares estriadas subcutâneas (Figura 15 C, D e figura 16 G, H, I e

J). Na formulação HA+PSC100 verifica-se resposta inflamatória intensa e formação de

granulomas de corpo estranho em todos os camundongos analisados (Figura 15 E e F).

5. Resultados

81

Figura 15. Análise histológica no tecido subcutâneo (ponto de inoculação) dos animais

imunizados com as diferentes formulações vacinais. A e B: imagens representativas dos

animais imunizados com PSC10 ou PSC100. Observa-se um infiltrado inflamatório agudo com a

presença de neutrófilos, fibras musculares estriadas e edema. C e D: são imagens representativas

do grupo imunizado com a formulação HA+PSC10 e, as imagens E e F pertencem ao grupo

HA+PSC100. Em ambos os grupos observa-se a presença de granulomas de corpo estranho. H&E,

2,5x e 20x.

5. Resultados

82

Figura 16. Análise histológica no tecido subcutâneo (ponto de inoculação) dos animais

imunizados com as diferentes formulações vacinais. G e H: são imagens representativas dos

animais imunizados com a formulação PetA+PSC10 e, as imagens I e J são representativa do

ponto de inoculação dos animais imunizados com a formulação PetA+PSC100. Em ambos os

grupos, observa-se uma moderada resposta inflamatória, com a presença de neutrófilos e

macrófagos, fibroblastos e a perda de continuidade nas fibras musculares estriadas subcutâneas. H&E, 2,5x e 20x.

Discussão

Discussão

84

6. Discussão

Apesar de nos últimos anos terem sido propostas novas estratégias para o controle da

esporotricose, a taxa de incidência e as estadias hospitalares não parecem diminuir (Barros

et al., 2010; 2011). Isto devido à longa duração do tratamento e a indisponibilidade deste de

forma gratuita para humanos e, especialmente em gatos os quais constituem a principal

fonte de transmissão da doença (Barros et al., 2010), somado às reações adversas e à

resistência aos antifúngicos, tem apontado a necessidade de terapias mais eficazes e

seguras, sendo a vacinação profilática ou terapêutica provavelmente a alternativa mais

promissora (de Souza et al., 2011; Almeida, 2012; Portuondo et al., 2015).

Para a obtenção de um preparado vacinal, uma ótima purificação e caracterização dos

antígenos escolhidos constituem um importante passo (Rueckert e Guzmám, 2012). Sendo

assim várias metodologias de extração de proteínas foram testadas na fase de levedura de S.

schenckii, a fim de se escolher aquela que garantisse um preparado antigênico de proteínas

preferencialmente da superfície celular do fungo, por fazerem parte do contato direto com o

meio externo, inclusive o sistema imune.

Dentre os métodos de extração analisados foi possível detectar uma diferença

qualitativa e quantitativa baseada na resolução com bandas de proteínas bem definidas. A

metodologia descrita por Ruiz-Baca e colaboradores (2009) usa um equipamento especial

nomeado homogeneizador tipo “Braun” (Fleet e Manners, 1976), o qual permite que as

amostras de leveduras em suspensão em contato com de pérolas de vidro possam ser ao

mesmo tempo sonicadas e centrifugadas a alta velocidade, com intervalos de congelamento

contribuindo a lise celular. Na ausência deste aparelho no laboratório, optou-se por realizar

a extração de proteínas da parede celular do fungo pela trituração mecânica em graal das

leveduras usando pérolas de vidro como descrito por Noumi e colaboradores (2012).

A alta variabilidade e aparência difusa do isolado proteico obtido, similar ao perfil

eletroforético das proteínas majoritárias do fungo utilizado como controle comparativo

neste estudo, nos levou a acreditar que a adaptação feita ao protocolo original descrito por

Ruiz-Baca e colaboradores (2009) gerou provavelmente uma mistura de proteínas

intracelulares e da superfície celular, mostrando-se inapropriada para a nossa preparação

antigênica. Em relação à metodologia proposta por Nascimento e colaboradores (2005), o

Discussão

85

perfil proteico isolado do exoantígeno do fungo apresentou melhor resolução e definição

das bandas de proteínas em comparação com a metodologia anterior, porém essas bandas

nem sempre estiveram presentes nas amostras obtidas em momentos diferentes, sendo que a

pouca reprodutibilidade do protocolo limitou a escolha desse método como ponto de partida

para a extração de proteínas com interesse vacinal.

De todas as metodologias testadas para obter um preparado antigênico preferencialmente

da superfície celular do fungo, a extração das proteínas por meio do agente redutor DTT

(Castro et al., 2013) mostrou ser a mais adequada para esta finalidade, devido a definição

das bandas, assim como ao simples procedimento de extração e reprodutibilidade do

protocolo quando realizado em momentos diferentes da extração. Os resultados mostraram

que o procedimento de extração com o agente redutor DTT não afetou a integridade da

membrana celular e por conseqüência a viabilidade das leveduras, confirmado pela

formação de EIVC alaranjadas fluorescentes antes e após do tratamento destas com o

tampão de extração de proteínas, sugerindo que o isolado proteico foi preferencialmente da

superfície celular e não produto da lise celular. Como será abordado mais adiante, a

presença destas proteínas da superfície celular no isolado proteico foi confirmado por

citometria de fluxo (Figura 8).

Resultados similares usando o mesmo procedimento de extração já foram relatados por

outros autores em C. albicans (Klis et al., 2007), A. fumigatus (Kubitschek-Barreira et al.,

2013) e P. brasiliensis (Longo et al., 2014). É importante ressaltar que utilizando o DTT, o

isolado proteico pode conter, além de proteínas constitutivas da superfície celular do fungo

também algumas proteínas associadas com funções citoplasmáticas (Angiolella et al.,

1996), como proteínas do choque térmico e enzimas glicolíticas as quais têm demonstrado

estarem vinculadas à adesão e patogenicidade do fungo (López-Ribot et al., 1996; Gil-

Navarro et al., 1997; Klis et al., 2007; Kubitschek-Barreira et al., 2013). Desta maneira, a

análise do sequenciamento das PSC de S. schenckii 16345 mostrou homologia com duas

proteínas de pesos moleculares de 44 kDa (peptídeo hidrolases) e 47 kDa (enolase)

presentes tanto nas cepas S. schenckii 58251 e S. brasiliensis 5110, sendo que a enolase foi

predita como uma adesina pelo programa FungalRV. As enzimas proteolíticas ou proteases

pertencem ao grupo das hidrolases as quais estão envolvidas na quebra das ligações

Discussão

86

peptídicas das proteínas intracelulares danificadas ou que se tornaram desnecessárias para

as células (Sakai et al., 1985) ou inclusive hidrolisando grandes cadeias polipeptídicas em

pequenas moléculas que posteriormente as células podem absorver em benefício do seu

metabolismo celular (Whithaker et al., 1994). Essas enzimas são geralmente sintetizadas

junto à membrana celular e quando liberadas no meio extracelular podem contribuir na

patogenicidade do fungo, causando danos diretos nos tecidos ou aumentando a capacidade

invasão do microrganismo no hospedeiro (Whithaker et al., 1994).

Em relação à enzima enolase identificada com propriedades de adesina, ela constitui

uma das enzimas citosólicas mais abundantes vinculadas à via glicolítica de muitas

bactérias e fungos (Holland e Holland, 1978; Kustrzeba et al., 2000; Esgleas et al., 2008)

mediando a desidratação do 2-fosfoglicerato para fosfoenolpiruvato (Chaffin et al., 1998).

Apesar desta enolase, estar vinculada a essa função citosólica, também tem sido localizada

na parede celular de C. albicans (Angiolella et al.,1996; Eroles et al.,1997; Silva et al.,

2014), A. fumigatus (Denikus et al., 2005) e P. brasiliensis (Donofrio et al., 2009) como

uma adesina favorecendo a união das leveduras à fibronectina, laminina e células do

epitélio intestinal (Donofrio et al., 2009; Silva et al., 2014).

O potencial imunogênico da enolase tem sido demonstrado na candidíase por meio da

estimulação da resposta celular e de anticorpos (Sundstrom et al., 1994), como

imunodiagnóstico (Pitarch et al., 2004; Lain et al., 2007) e candidato vacinal (Van

Deventer et al., 1996; Li et al., 2011). Como resultado relevante no atual estudo foi

demonstrado que a enolase está presente na parede celular de S. schenckii 16345 e pela

imunoreatividade do soro anti-enolase com a parede celular dos dois isolados de gatos

(isolados Sb250 e Sb256), sugerem a presença desta proteína em ambas as cepas. O

reconhecimento da enolase pelos soros de camundongos infectados com S. schenckii 16345

e de animais vacinados com as PSC obtidas da mesma, assim como a sua provável

expressão em ambas as cepas de S. brasiliensis consideradas altamente virulentas dentro do

complexo S. schenckii, nos leva a considerar que esta adesina também possa ser um alvo

relevante de estratégias vacinais e/ou terapêuticas na proteção contra a esporotricose.

Neste trabalho as PSC de S. schenckii foram formuladas com dois adjuvantes, o gel

de hidróxido de alumínio amplamente usado em vacinas humanas e veterinárias, incluindo

Discussão

87

vacinas antifúngicas experimentais (Portuondo et al., 2015) e o Montanide gel PetA que

tem demonstrado em felinos e outros animais uma melhora na indução da resposta imune e

baixa toxicidade quando comparado ao hidróxido de alumínio (Deville et al., 2011).

Os adjuvantes vacinais apresentam a propriedade de aumentar a imunogenicidade in

vivo dos antígenos com os quais eles são co-administrados. Neste sentido, tanto o adjuvante

como os antígenos devem ser administrados no mesmo ponto de inoculação e ao mesmo

tempo, caso contrário não se poderia justificar ou inferir se a resposta imune induzida pela

formulação vacinal deve-se à natureza própria do antígeno ou ao adjuvante sozinho

(Lindblad, 2006; 2007). Por esse motivo e mesmo sendo relatado por alguns autores que a

adsorção dos antígenos no adjuvante pode não ser necessária para induzir uma resposta

imnune efetiva no hospedeiro, os guias de avaliação de novas formulações antígeno-

adjuvantes descritas pela EMEA recomendam determinar o grau de adsorção dos

componentes antigênicos unidos ao adjuvante antes deles serem administrados no

hospedeiro (Sesardic, 2004; EMEA, 2004, 2005).

Levando-se em conta essas considerações, foram escolhidas duas concentrações (0,1

e 1 mg/mL) das PSC de S. schenckii para determinar o grau de adsorção das mesmas sobre

o adjuvante HA, sendo que a dose de alumínio escolhida para ambas as concentrações de

antígenos foi de 100 µg AL3+

/100 µl da formulação vacinal, a qual tem demonstrado

eficácia na indução da resposta imune quando testada com outros antígenos (Gupta e Siber,

1995).

Por outro lado, embora os estudos não clínicos servissem para definir o máximo do

conteúdo de Al3+

dentro do gel HA para as vacinas humanas, no caso de estudos não

clínicos de imunogenicidade realizados em camundongos, o conteúdo do Al3+

na

formulação vacinal é determinado através do balanço entre a toxicidade local e a eficácia da

formulação adjuvante-antígeno (Gupta, 1998; Lindblad, 2004, 2010; Vecchi et al., 2011),

porém esses estudos em camundongos devem ser iniciados com uma concentração do Al3+

dentro do HA abaixo de 150±20µg de Al3+

em 100 µl da formulação final, já que esta

corresponde aproximadamente à dose máxima deste adjuvante em vacinas humanas, 0,85

mg de AL3+

(Vecchi et al., 2011). Como resultado, no presente estudo foi escolhida a dose

de 100 µg AL3+

/100 µl da formulação vacinal final com ambas as concentrações das PSC

Discussão

88

descritas acima, e também pela eficácia verificada por meio da adequada resposta quando

testada com outros antígenos (Gupta e Siber, 1995).

A literatura contém muitos exemplos de estudos de adsorção usando HA, na maioria

dos casos tem sido descritos a cinética de adsorção para antígenos simples (Al-Shakhshir et

al., 1994, 1995; Morefiel et al., 2005; Hansen et al., 2007) e poucos para misturas de

proteínas (Matheis et al., 2002; Heimlich et al., 1999). A adsorção diferencial de proteínas

simples ou preparados antigênicos compostos por várias proteínas sobre o adjuvante

hidróxido de alumínio, depende de diferentes fatores, como a natureza química do antígeno

(Gupta e Siver, 1995), composição de aminoácidos, temperatura e tempo de incubação

(Heimlich et al., 1999), força iônica (Rinella et al., 1996), tipo do gel de alumínio (HA ou

fosfato de alumínio PA) (Lindblad, 2004), e fundamentalmente o valor do pH do meio, o

qual influencia na polaridade e densidade da carga das proteínas e mesmo no adjuvante,

sendo essencial para a atração eletrostática e a adsorção das proteínas sobre a superfície do

adjuvante (Lindblad, 2010; Clapp et al., 2011). Como uma regra geral, a superfície do HA

ao pH das formulações vacinais (6 - 7,5 pH) está carregado positivamente, facilitando a

união das proteínas com ponto isoeléctrico (pI) ácido (Dagouassat et al., 2001; Hogen et

al., 2012), como a ovoalbumina que tem um pI de 4.6 (Hogen et al., 2012).

Em nosso trabalho a cinética de adsorção foi realizada com uma mistura complexa

de PSC de S. schenckii composta por diferentes pesos moleculares e pontos isoelétricos. Os

resultados indicaram que após 40 minutos (tempo de máxima adsorção das PSC sobre o

HA) houve uma redução na capacidade da adsorção das PSC sobre o HA, a qual poderia ser

atribuída ao intercambio competitivo entre as proteínas sobre a superfície do HA

provavelmente determinado pelas forças de Van der Waals, interações electrostáticas,

afinidade molecular e repulsões estéricas, como já foi descrito por outros autores (Heimlich

et al., 1999; Matheis et al., 2002). Por outro lado, resultado interessante é o de que a

eletroforese realizada nos sobrenadantes obtidos em cada tempo de adsorção, revelou que

aparentemente não houve fragmentação das bandas de PSC, as quais poderiam

comprometer a indução da resposta antígeno específica contra as PSC.

O processo de adsorção das PSC sobre o HA foi analisado através da isoterma de

adsorção. Os resultados indicaram que o processo de adsorção não seguiu o comportamento

Discussão

89

linear da isoterma de Langmuir, sugerindo que a adsorção é altamente complexa devido ao

fato de que as proteínas foram adsorvidas formando várias camadas sobre o HA, tornando-

se a adsorção favorecida em dependência da concentração inicial das PSC no meio.

A isoterma de Langmuir (1918) baseia-se na adsorção do adsorvato sobre uma

superfície completamente uniforme do ponto de vista do adsorvente, sem a interferência

lateral entre os adsorvatos presentes, sendo que todos os sítios de adsorção são idênticos.

Resultados similares, mas com antígenos simples têm sido obtidos por outros autores, por

exemplo, a adsorção do toxóide diftérico (DT) sobre o HA indicou o comportamento linear

da curva de Langmuir, enquanto que essa mesma proteína sobre o adjuvante fosfato de

alumínio exibiu um tipo de isoterma não linear, indicando que o DT foi adsorvido

formando várias capas intermitentes sobre o HA (Matheis et al., 2002). Seeber e

colaboradores (1991) obtiveram comportamento similar quando determinaram a isoterma

de adsorção da albumina sobre o HA.

O efeito citotóxico observado nos macrófagos em cultura com o adjuvante HA na

ausência das PSC é consistente com os resultados reportados por Goto et al., 1993. Nesse

estudo uma suspensão deste adjuvante equivalente à mesma concentração usada no

presente trabalho, resultou em 80% e 60% de toxicidade em macrófagos peritoneais e

polimorfonucleares de cobaias, respectivamente. Os mesmos autores também relataram que

a administração do HA pela via intramuscular em camundongos, causou necrose nas fibras

musculares e infiltração de neutrófilos e macrófagos após a inoculação (Goto et al, 1982;

1993; 1997). Este resultado poderia ser atribuído ao próprio mecanismo de ação do AH,

como será discutido posteriormente.

A percentagem reduzida da toxicidade gerada por HA+PSC100 em comparação

com HA+PSC10 e HA, sugere que a concentração das proteínas no meio de cultura ou

mesmo unidas à superfície do HA deixou menos sítios disponíveis de contato entre este

adjuvante em relação aos macrófagos, o que contribuiu à diminuição do efeito tóxico da

formulação, já que HA+PSC10 exibiu uma maior toxicidade provavelmente devido à baixa

capacidade de adsorção das PSC (2,12 ug PSC/mg HA, resultado não mostrado), quando

comparado com HA+PSC100 (474,8 mg SCP/mg AH).

Discussão

90

Como foi descrito na seção Materiais e Métodos, as PSC foram formuladas com o

adjuvante PetA seguindo as orientações do fabricante. Esse adjuvante pertence à linha de

adjuvante Montanide ™ tipo gel os quais tem demonstrado uma alta capacidade de

adsorver proteínas à sua superfície (Vialle et al., 2010). O ensaio de toxicidade in vitro

revelou que o gel PetA foi menos tóxico do que o HA quando formulado ou não com

ambas concentrações das PSC (PetA+PSC10 e PetA+PSC100). Este resultado também nos

permite especular que talvez as PSC em formulação com o PetA possam contribuir na

inibição do efeito citotóxico direto do adjuvante sobre os macrófagos, pelo fato de que

provavelmente o PetA tenha uma capacidade de adsorção maior do que HA, já que a

formulação PetA+PSC10 mostrou uma menor toxicidade do que HA+PSC10.

A resposta imune induzida pelos adjuvantes vacinais continua sendo um enigma

para os vacinólogos, sendo que a ação simultânea de diferentes mecanismos de ações

podem ser responsáveis de dita resposta (Bergmann-Leitner et al., 2014). Conforme Gupta

e Siver (1995) deve existir um equilíbrio entre a segurança e adjuvanticidade na formulação

vacinal para induzir um máximo de resposta imune e ao mesmo tempo uma baixa

toxicidade. No entanto a maioria dos adjuvantes formulados com os antígenos não atendem

a esse requisito, sendo que as reações adversas locais após a vacinação parecem ser

essenciais para a indução de uma resposta imune eficaz (Batista-Duharte et al., 2013).

Vários trabalhos têm proposto que o HA pode gerar um efeito “deposito” no local

da injeção, criando um contexto inflamatório que favorece o recrutamento de células

apresentadoras de antígenos (APC) que fagocitam os antígenos liberados por este adjuvante

seguido da ativação das células T antígenos específicas (Wang et al., 2011). Esse processo

inflamatório quando exacerbado pode gerar a formação de granulomas, caracterizados pela

presença de células plasmáticas produtoras de anticorpos e infiltração de neutrófilos

(Batista-Duharte et al., 2013; Bergmann-Leitner et al., 2014). Outro mecanismo sugere

que o HA ativa a NALP3 através da necrose in vivo no local da inoculação (Marichal et al.,

2011). A NALP3 é membro da família de receptores NLR (domínio de ligação a

nucleotídeo contendo resíduos de leucina) que reconhece sinais endógenos liberados pelas

células necróticas em resposta a uma variedade de estímulo, tais como: ácido úrico, ATP,

DNA do hospedeiro, sílica e outros (Martinon et al., 2009; Marichal et al., 2011; Hogen et

Discussão

91

al., 2012). A NALP3 junto com a caspase-1 e a proteína adaptadora PYCARD (também

conhecida como ASC) forma o inflamasoma, o qual ativado estimula a liberação de IL-1 β,

IL-18 e IL-33 pelos leucócitos e outras células hospedeiras (Marichal et al., 2011).

Essas citocinas contribuem na defesa do hospedeiro contra as infecções,

aumentando as propriedades antimicrobianas dos fagócitos e mediando a resposta Th1 e

Th17 (Veerdonk FL et al., 2011), as quais têm mostrado gerar proteção em modelos

experimentais de C. albicans (Hise et al., 2009; Lin et al., 2009), Blastomyces dermatitidis,

H. capsulatum e Coccidioides posadasii (Wang et al., 2014).

Considerando a citotoxicidade in vitro induzida pelo HA formulado ou não com as

PSC, somado à moderada ou intensa resposta inflamatória visualizada no local da

inoculação após a imunização é possível que a indução da resposta imune pelas

formulações HA+PSC10 e HA+PSC100 esteja vinculada a uma sobreposição dos dois

mecanismos acima descritos. No entanto, outros estudos precisam ser realizados para

confirmar esta hipótese. Alguns estudos têm demonstrado que os adjuvantes da linha

MontanideTM

tipo gel (PetA ou Gel 01) exercem o seu mecanismo imunoadjuvante similar

ao AH, por meio da formação de um efeito de depósito no local da inoculação (Vialle et al.,

2010; Cauchard et al., 2014), favorecendo a apresentação antigênica e a indução da

resposta imune (Dupis et al., 2008; Vialle et al., 2010).

Por outro lado, a análise histológica realizada no tecido subcutâneo extraído do local

da imunização de cada camundongo, revelou que o adjuvante PetA quando formulado com

a maior concentração de antígenos (PSC100) foi menos tóxico do que HA, evidenciado

pela formação de granulomas macroscopicamente (resultado não mostrado) e

microscopicamente visíveis em todos os camundongos vacinados com a formulação

HA+PSC100, porém em apenas um dos cinco animais do grupo PetA+PSC10 foi

observado um granuloma. Este resultado e a presença de abundantes fibroblastos

observados nos grupos PetA+PSC10 e PetA+PSC100, indicam uma rápida recuperação do

tecido subcutâneo e segurança da formulação como foi também reportado em outro estudo

por Deville e colaboradores (2011).

Por muitos anos o papel da resposta de anticorpos contra as infecções fúngicas foi

questionado, enquanto que a imunidade mediada por células foi sempre identificada como o

Discussão

92

mecanismo básico de defesa do hospedeiro contra os fungos (Carlos et al., 2009). No

entanto, nas duas últimas décadas o papel da resposta imune humoral contra vários fungos

tem sido descrita em H. capsulatum (Nosanchuk et al, 2003), C. albicans (Polonelli et al.,

2003), Cryptococcus neoformans (Rivera et al., 2005), P. brasiliensis (Buissa-Filho et al.,

2008) e S. schenckii (de Almeida et al., 2015).

Nossos resultados mostraram que o título de anticorpos IgG anti-PSC foi

estatisticamente superior nos grupos HA+PSC100 e PetA+PSC100, porem à exceção dos

camundongos vacinados com a menor concentração do antígeno (PSC10), os demais

grupos (PSC100, HA+PSC10 e PetA+PSC10) também induziram altos títulos desta

imunoglobulina sem nenhuma diferença significativa entre eles. Esse resultado confirma as

propriedades imunogênicas das PSC de S. schenckii já demonstrada por outros autores

(Charoenvit et al., 1979; Nascimento et al., 2008) e especialmente a capacidade dos dois

adjuvantes usados neste estudo de aumentar a resposta de anticorpos quando formulados

com a concentração mais baixa dos antígenos (PSC10). Este resultado foi conferido por

citometria de fluxo, onde a mediana da intensidade de fluorescência para HA+PSC10 e

PetA+PSC10 foi de 248 e 238 respectivamente maior do que 197.5 da formulação PSC10.

A produção combinada das imunoglobulinas IgG1 e IgG2a induzida pelas

formulações HA+PSC100 e PetA+PSC100 poderia ser vantajoso no controle da infecção

por S. schenckii, como demonstrado previamente por meio da transferência passiva de um

anticorpo monoclonal IgG1 (P6E7) específico contra a gp 70 em camundongos infectados

com S. schenckii (Nascimento et al., 2008) e S. brasiliensis (de Almeida et al., 2015)

gerando proteção, confirmada pela queda de unidades formadoras de colônias (UFC) nos

órgãos avaliados dos camundongos em relação aos controles.

Por outro lado as funções biológicas do isotipo IgG2a são determinadas pela sua

capacidade de fixar o complemento e ligar-se aos receptores Fcy presentes nos macrófagos,

estimulando a citotoxicidade celular mediada por anticorpos (Pérez et al., 2013). A

subclasse IgG2a quando exacerbada é considerada um marcador da resposta imune do tipo

Th1, e o subtipo IgG1 é indicativo de resposta de Th2 (Iglesias et al, 2006).

Alguns estudos em modelos murino têm revelado que respostas Th1 e Th2 são

induzidas de modo antígeno-específico contra componentes da parede celular de S.

Discussão

93

schenckii (Maia et al., 2006) e mais recentemente que o reconhecimento do exoantígeno

desse fungo por células dendríticas leva ao desenvolvimento de uma resposta Th17 in vitro

(Verdan et al., 2012). Por outro lado também foi demonstrado que a infecção por S.

schenckii em camundongos induz o desenvolvimento de células Th17 e Th1/Th17 mistas in

vivo, assim como a liberação antígeno-específica de IL-17 e IL-22 ex vivo (Ferreira et al.,

2015), sendo que em um modelo de depleção de IL-23 mediada por anticorpo foi

demonstrado que a resposta Th17 intacta é necessária para a ótima eliminação do fungo.

Nós acreditamos que a mistura IgG1/IgG2a, assim como as citocinas IL-12, IFN-γ e IL-4

induzidas pela formulação HA+PSC100 sugerem a possibilidade de um equilíbrio na

resposta imune Th1/Th2/Th17, o qual poderia potencialmente ser relevante na defesa do

hospedeiro contra S. schenckii. Os resultados também indicam que a alta produção de

IgG1/IgG2a assim como IL-12, IFN-γ e IL-4 induzidas por PetA+PSC100 evidenciam um

equilíbrio na resposta Th1/Th2, o qual também poderia favorecer a resposta antifúngica

contra S. schenckii.

Os soros de todos os grupos, com exceção de PSC10, reconheceram duas proteínas

imunorreativas de 71 kDa e 47 kDa que também foram reconhecidas pelo soro dos

camundongos infectados com S. schenckii, ressaltando como especialmente interessante a

proteína enolase a qual foi predita como uma adesina e que está presente na parede celular

do fungo como foi descrito anteriormente.

Vários estudos têm demonstrado o papel dos macrófagos na defesa contra S.

schenckii (de Lima et al., 2011; Alegranci et al., 2013). Em relação à atividade fagocítica,

em todos os grupos o índice fagocítico foi extremamente menor na presença de leveduras

não opsonizadas. Esta inibição da fagocitose de S. schenckii poderia ser atribuída ao

componente lipídico da parede celular, o qual desempenha importante papel na patogênese

deste fungo, inibindo o processo de fagocitose através da elevada produção de óxido nítrico

em culturas de macrófagos, sugerindo um possível mecanismo de escape do patógeno

durante a infecção fúngica (Carlos et al., 2003). No entanto, o índice fagocítico aumentou

consideravelmente na presença das leveduras opsonizadas especialmente com os soros

obtidos dos animais imunizados com HA+PSC100 e PetA+PSC100, o qual sugere o efeito

Discussão

94

da concentração dos antígenos na formulação, e corroborando o papel dos anticorpos na

resposta antifúngica (Casadevall e Pirofski., 2012).

Atualmente tem se voltado a atenção aos componentes do fungo que possam estar

envolvidos no processo de adesão no tecido do hospedeiro e na indução da resposta imune.

Durante o curso de uma infecção, os microrganismos são capazes de se aderir às células

epiteliais, endoteliais, fatores solúveis do soro, componentes da matriz extracelular e

materiais inertes implantados no corpo do hospedeiro, sendo a adesão o primeiro passo para

a colonização e instalação dos agentes patogênicos no hospedeiro. Vários estudos tem

demonstrado a adesão de S. schenckii a fibronectina humana, laminina e colágeno tipo II

(de Lima et al., 2004) correlacionando a sua virulência à expressão de adesinas na parede

celular (Teixeira et al., 2009). Similares resultados foram revelados em cepas de P.

brasiliensis, as quais mostraram uma relação direta entre o índice de adesão in vitro à

matrix extracelular e a sua virulência nos animais (Barbosa et al., 2006).

Visando o papel dos anticorpos na defesa contra as infecções fúngicas, torna-se

evidente que uma vacina antifúngica eficaz necessita induzir anticorpos contra a adesão do

fungo nas células do hospedeiro, os quais ajudariam a evitar a invasão e colonização do

mesmo no hospedeiro e ao mesmo tempo favoreceria a ação de outros mecanismos imunes

para eliminar a infecção. Em relação a isto também os soros de HA+PSC100 e

PetA+PSC100 inibiram in vitro a adesão de S. schenckii aos fibroblastos, umas das

principais células do tecido conjuntivo subcutâneo, sugerindo que provavelmente além da

enolase outras proteínas vinculadas na adesão de S. schenckii possam estar presentes.

A partir deste resultado foram escolhidas as formulações PSC100, HA+PSC100 e

PetA+PSC100 para avaliar a eficácia dos anticorpos induzidos por essas formulações no

controle da infecção por S. schenckii. Os resultados mostraram que a transferência passiva

dos soros obtidos das formulações HA+PSC100 e PetA+PSC100A em camundongos

sadios induziram proteção após eles serem infectados com o fungo, evidenciado pela

diminuição estatisticamente significativa das UFCs no baço e no fígado. A diminuição da

adesão S. schenckii aos fibroblastos, assim como a proteção gerada pelo soro da maior

concentração das PSC formuladas com ambos os adjuvantes testados neste estudo são

comparáveis aos relatados pelo grupo de Almeida (2015), os quais mostraram uma redução

Discussão

95

significativa no número de UFC no fígado e no baço de camundongos, quando estes foram

tratados com um anticorpo monoclonal contra a gp70, antes, durante e após o desafio com

S. schenckii (Nascimento et a.l, 2005, 2008, de Almeida et al., 2015).

No presente estudo foram caracterizadas PSCs da cepa S. schenckii ATCC 16345.

Como resultado relevante foi demonstrado pela primeira vez a presença da enolase na

parede celular de S. schenckii, predita como uma adesina, além de ser imunogênica. A forte

reatividade cruzada do soro anti-enolase com dois isolados representativos da espécie S.

brasiliensis, considerada a mais virulenta dentro do complexo S. schenckii, nos leva a

pensar que esta adesina também poderia ser um marcador da esporotricose e ao mesmo

tempo um alvo relevante no tratamento e prevenção desta micose, como já observado para

candidíase (Van Deventer et al., 1996; Pitarch et al., 2004; Lain et al., 2007. Li et al.,

2011). Nossos resultados também revelaram a eficácia dos anticorpos gerados pelas

formulações vacinais contendo as PSCs formuladas com dois adjuvantes, hidróxido de

alumínio e o Gel PetA, em inibir a adesão de S. schenckii aos fibroblastos, e potencializar a

opsonofagocitose das leveduras in vitro por macrófagos isolados dos camundongos

vacinados. Por outro lado foi confirmado o efeito protetor desses anticorpos pela

transferência passiva em camundongos sadios antes da infecção com o fungo pela

significativa diminuição de UFC no baço e no fígado desses animais. Segundo os padrões

de Th1, Th2 e Th17 gerados pelas formulações, pode se pensar na importância dessas

células no desenvolvimento de uma efetiva resposta protetora ou vacinal, resultados esses

que serão confirmados em testes futuros por meio do desafio com o fungo em animais

previamente vacinados. Desta forma, o presente estudo permitirá gerar novas ferramentas

na obtenção de uma vacina eficaz na esporotricose.

Conclusões

Conclusões

97

As proteínas da fase de levedura de S. schenckii ATCC 16345 foram extraídas,

purificadas e caracterizadas adequadamente, demonstrando-se a presença da proteína

imunogênica enolase na superfície celular deste fungo e provavelmente em duas cepas

de S. brasiliensis (250 e 256).

As formulações vacinais contendo o Pet Gel A induziram uma menor citotoxicidade in

vitro que as formulações contendo o HA.

As formulações vacinais HA+PSC100 e PetA+PSC100 induziram uma significativa

resposta de anticorpos IgG, IgG1 e IgG2a.

As formulações vacinais HA+PSC100 e PetA+PSC100 produziram os maiores índices

de inibição da adesão do fungo aos fibroblastos.

A formulação PetA+PSC100 mostrou o maior índice fagocítico.

Todas as formulações vacinais contendo o adjuvante PetA mostraram um menor perfil

de toxicidade no local da inoculação em relação a HA+PSC100.

A transferência passiva dos soros obtidos dos grupos HA+PSC100 e PetA+PSC100

em camundongos sadios e posteriormente infectados conferiram proteção.

Ambos adjuvantes HA e o PetA formulados com a maior concentração das PSCs

foram imunogênicos e induziram uma resposta imune protetora nos camundongos

infectados pelo fungo, mas a formulação PetA+PSC100 exibiu menor toxicidade in

vitro e in vivo.

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Apêndice

Anexo I

Meios de cultivos usados para S. schenckii:

Meio Mycozel

Mycozel 37 g Água destilada q.s.p 1000 mL

Meio Agar-BHI Ágar infusão cérebro coração (BHI) 47 g

Água destilada q.s.p 1000 mL

Meio “yeast nitrogen-casamino Acids

glucose” (YCG)

Nitrogênio Levedura Base (YNB 6,7 g

Ácido Casamino 2,5 g Glucose 50 g Mistura vitamínica 1 mL

Água destilada q.s.p 1000 mL

Composição da mistura vitamínica

Tiamina dicloreto 50 mg Riboflavina 50 mg

Piridoxina hudroclorida 10 mg Ácido p-aminobenzoico 10 mg

Inositol 10 mg Pantotenato de cálcio 50 mg Ácido nicotínico 50 mg

Biotina 0,4 mg Ácido fólico 1 mg

Água q.s.p 100 mL

http://www.splabor.com.br/meios-de-cultura/meios-para-testes-bioquimicos/nitrogenio-levedura-base-ynb-modelo-m139.html

Anexo II

Coloração com nitrato de prata

Etapa Solução Tempo (minutos)

Fixação 50% Metanol/etanol e 5% de ácido acético em água

20

Lavagem 50% Metanol/etanol em

água

10

Lavagem Água bidestilada 5

Lavagem Água bidestilada 20

Sensibilização 0,025% Na2SO3 em água 1

Lavagem (2x) Água bidestilada 1

Coloração 0,15% AgNO3 em água gelada

20

Lavagem (2x) Água bidestilada Rápido

Revelação 3% Na2CO3 e 0,05 % de formaldeído em água

Interrupção (3x) 5 % de ácido acético em água

Estoque 1 % de ácido acético à 4°C

Anexo III

Identificação das PSC de S. schenckii por MALDITOF

Anexo IV


Anexo V


Anexo VI

Fases do processamento para inclusão em parafina:

I – 1 hora em álcool 90º Gl;

II – 5 trocas sucessivas em frascos com álcool absoluto, com intervalos de 30

minutos entre cada uma;

III – 30 minutos em solução (1:1) de álcool absoluto e solvente xilol;

IV – 30 minutos em solução de xilol puro;

V – 1 hora em outra solução de xilol puro;

VI – 1 hora em parafina liquida em estufa a 61 ºC;

VII – 2 horas em nova parafina líquida em estufa a 61ºC;

VIII – Confecção dos blocos em inclusora padrão, com uso de parafina líquida,

formas metálicas e placa fria.

Anexo VII

Soluções e descrição dos procedimentos da coloração com Hematoxilina e Eosina

Solução de Hematoxilina de Harris: Hematoxilina (5 g), álcool 95% (50 mL), sulfato de

Alumínio e Potássio (100g), água destilada (1000mL), óxido de Mercúrio (2,5g).

Procedimento:

Dissolver a hematoxilina no álcool e o alúmen na água destilada com sob

aquecimento. Misturar as duas soluções e ferver o mais rápido possível.

Remover do aquecimento e acrescentar o óxido de mercúrio paulatinamente.

Reaquecer até a fervura aguardando 1 minuto. Afastar da fonte de calor e

mergulhar em água e gelo imediatamente. Após o resfriamento, adicionar 4 mL

de ácido acético.

Solução de Eosina: (Eosina: 2,5g, 50mL de água destilada, 200mL de álcool 95%, 750mL

de álcool 80%).

Procedimento:

Dissolver a eosina em água destilada e acrescentar o álcool 95%. Acrescentar os

750mL de álcool 80% e mais 5 mL de ácido ácetico.

Procedimento Geral para coloração:

A. Desparafinar e hidratar

B. Corar com Hematoxilina de Harris filtrada por 1 minuto e 45 segundos

C. Lavar em água corrente por 7 minutos

D. Corar com Eosina amarela por 5 segundos

E. Lavar em água corrente por 3 vezes

F. Desidratar, diafanizar e montar em permount

Capítulo 2

Medical Mycology, 2015, 53, 69–89doi: 10.1093/mmy/myu045

Advance Access Publication Date: 31 October 2014Review Article

Review Article

Adjuvants and delivery systems for antifungal

vaccines: Current state and future developments

Deivys Leandro F. Portuondo1, Lucas S. Ferreira1, Ana C. Urbaczek1,

Alexander Batista-Duharte1,2,3 and Iracilda Z. Carlos1,∗

1Universidade Estadual Paulista Julio Mesquita Filho (UNESP), Faculdade de Ciencias Farmaceuticas De-partamento de Analises Clınicas Rua Expedicionarios doBrasil, Araraquara SP, Brazil, 2ImmunotoxicologyLaboratory, Toxicology and Biomedicine Center, Medical Science University, Santiago de Cuba, Cubaand 3Programa Professor Visitante do Exterior (PVE-CAPES) Program

*To whom correspondence should be addressed. Iracilda Zeppone Carlos, Departamento de Analises Clınicas, Faculdadede Ciencias Farmaceuticas de Araraquara, UNESP, Rua Expedicionarios do Brasil, no 1621, Araraquara, SP, Brasil, CEP14.801-902. Tel: +55-16-3301-5712; Fax: +55-16-3322-0073; E-mail: [email protected]

Received 3 January 2014; Revised 30 March 2014; Accepted 14 June 2014

Abstract

Mycoses are gaining increasing attention in modern medicine because of the increasein diseases associated with opportunistic fungal infections. Despite the recognized roleof the immune system in the control of fungal infections, no antifungal vaccines arecurrently licensed for use in humans. However, numerous vaccine candidates are be-ing developed in many laboratories, as proof of the renewed interest in integrating orreplacing chemotherapy with vaccines to reduce antibiotic use and consequently limitdrug resistance and toxicity. In the effort to use safer and simpler fungal antigens forvaccinations, adjuvants have become relevant as immunostimulators to elicit successfulprotective immune responses. To address the relevant role of adjuvants as determinantsin the balance of vaccine efficacy and safety, an updated and critical review of the ad-juvants used in preclinical antifungal vaccines is presented, and prospective trends areaddressed. Selected recent papers and other historically relevant and innovative strate-gies using adjuvants in experimental fungal vaccines are highlighted.

Key words: adjuvant, antifungal vaccine, efficacy, toxicity.

Introduction

The incidence rates of fungal diseases are notably increasingworldwide, with an associated increase in immunocompro-mised patients due to AIDS, cancer, diabetes, immunosup-pressant use for transplantation and autoimmune diseases,senescence, and similar diseases. The elevated use of pre-scription antifungals is giving rise to resistant fungi, result-ing in low effectiveness and high toxicity of conventionaltreatments [1]. To date, the most important advances in

vaccines have been related to the prevention of viral andbacterial diseases. However, antifungal and antiparasiticvaccines have not had similar success. The lack of a goodunderstanding of fungal–host interactions including the in-nate and specific immune responses, together with otherobstacles such as an underappreciation of the magnitude ofopportunistic and endemic fungal infections, have largelyhindered the development of vaccines against pathogenicfungi in recent decades [2].

C© The Author 2014. Published by Oxford University Press on behalf of The International Society for Human and Animal Mycology.All rights reserved. For permissions, please e-mail: [email protected]

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70 Medical Mycology, 2015, Vol. 53, No. 1

Recent elucidation of the immune mechanisms that pro-vide protective immunity against fungal diseases and theincreased incidence of chronic diseases associated with op-portunistic mycoses and emergent fungal diseases such assporotricosis have renewed interest in the development ofantifungal vaccines [3–6]. There has been extensive researchrelating to development of veterinary and human vaccinesfor both opportunistic and endemic fungal infections, espe-cially candidiasis, cryptococcosis, coccidioidomycosis, blas-tomycosis, histoplasmosis, paracoccidioidomycosis, andinfections caused by Pneumocystis, and, more recently, as-pergillosis. However, none have yet been approved by reg-ulatory agencies for either active or passive immunizationin humans [2–4,7,8]. Edwards has listed several reasons forthe lack of approval of human antifungal vaccines [2]. Twofactors considered by this author are the high cost of prepar-ing antigens for use in human studies and the high cost oftoxicology studies. Consequently, the selection of adequateadjuvants for vaccine formulations is an important aspectof optimizing the use of antigens and improving their im-munogenicity, though the influence of adjuvants on toxicitymust be considered [9,10]. Advances in the understandingof the biology of dendritic cells and innate immune activa-tion have allowed for more rational approaches to the selec-tion of adjuvants for prophylactic and therapeutic vaccines.In parallel, the interest in developing antifungal vaccines isgrowing. This fact is reflected in the increase in articles, bothoriginal works and reviews, discussing this topic (Fig. 1).Today, two antifungal vaccines are in clinical development;one containing ALs3p-N formulated with an aluminumhydroxide adjuvant (NDV-3 vaccine) directed againstCandida albicans and Staphylococcus aureus and theother containing rSap2p plus virosome adjuvant (PEV-7)directed against vulvovaginitis [2,11]. No still antifungalvaccines are licensed for use.

Here, our objective was to provide an update on the useof adjuvants in antifungal vaccines while analyzing strate-

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Figure 1. Evolution of the number of publications related to fungal vac-cines (1992–2012). Data obtained from PubMed.

gies to improve efficacy in the future. Despite adjuvantsthat cannot be used in humans, such as Freunds adjuvants,and do nothing directly to advance the vaccine antigeninto clinical development, they help to advance in mech-anistic studies. This review does not include cell-based orcytokine- and antibody-based therapies or other adoptivetherapy techniques discussed in another recent review [12].

Adjuvant overview and mechanism of action

Adjuvants are molecules, compounds, or macromolecularcomplexes that can increase and/or modulate the intrinsicimmunogenicity of an antigen and elicit strong and long-lasting immune responses. They have been important com-ponents of human and veterinary vaccines for more than80 years [13]. Adjuvants include alum, a universally ac-cepted adjuvant for human use, although more recently,several adjuvant formulations have been accepted for spe-cific vaccines [9,14]. In fact, any adjuvanted vaccine mustbe more efficacious than the aqueous vaccine, and this ben-efit must outweigh its risk. A number of new substanceswith documented adjuvant activity have been reported inthe literature in recent years [15–17]. Recently, the trend invaccine development has been to move from using wholeinactivated organisms without adjuvants to less complexantigens such as purified, recombinant, or synthetic proteinsor even peptides that need adjuvants for effective immuneinduction (Fig. 2).

In addition to their immunostimulatory properties, sev-eral post-vaccination toxicity reactions have been describedin adjuvanted vaccines [18]. For this reason, very few ad-juvants have been approved for use in preventive humanvaccines [9,14].

Adjuvants can be grouped as follows: antigen deliverysystems that promote antigen uptake by antigen-presentingcells (APCs) such as liposomes and micro- or nanoparti-cles and immunopotentiators that activate APCs mainly

Needs of adjuvants use and complexity

Killed or atenuated whole cell

Purified extracts

Highly purified subunities

Recombinant or synthetic peptides

Figure 2. Antigen complexity and need for adjuvants on antifungal vac-cines. The earliest vaccines were based on complete microorganisms.The new generation of vaccines comprise simpler but poorly immuno-genic antigens, for example, highly purified subunities, recombinant orsynthetic peptides, or DNA vaccines. Therefore, adjuvants are propor-tionally required to become effective vaccine.

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Table 1. Side effects described for experimental and licensed

immunoadjuvants.

Frequency Manifestation

Frequent Local: inflammation, local pain, granulomasSystemic: flu-like symptoms and other acutephase responses

Less frequentor rare

Local: lysis, ulcer, cyst, Arthus reactions,macrophagic myofasciitis, Bell’spalsy (intranasal route), tumorsSystemic: allergy, vascular leak syndrome,modification of hepatic metabolism, inductionor worsening of autoimmune system, embryofetal immunotoxicity

through innate immune receptors that either directly or in-directly induce the expression of cytokines and chemokines,thereby modulating the local microenvironment to activateand stimulate immune cells [19]. Thus, an adjuvant’s effi-cacy largely relies on its ability to activate innate immuneresponses and regulate the interplay between the innate andacquired immune systems to cause the desired specific im-mune response [20].

Efficacy–toxicity balance of adjuvanted vaccines

The search for new, more potent, and safe adjuvants is a sci-entific challenge today. Obviously, the overstimulation ofthe immune response by adjuvants can be associated withlocal and systemic effects (Table 1) [18,21,22]. Many ad-juvants were developed under empirical conditions. How-ever, today, a better understanding of the innate immuneresponse and its connections with the adaptive immunesystem permits the rational design of new adjuvants withhigher efficacy and lower toxicity [10,23–25].

Fungal molecules involved in immune activation

For a long time, adaptive immunity has been regarded asthe major player in the protection against most fungal in-fections. Nevertheless, in recent years, innate immunity hasreceived special attention because, despite its low specificitycompared with the adaptive immune system, it effectivelydistinguishes host cells (self) from pathogens (non-self) andactivates adaptive immune mechanisms by providing spe-cific signals [26,27]. The evidence suggests that both innateand adaptive responses integrate to produce effective anti-fungal protection [28,29].

Pathogenic fungi contain a number of pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) such as carbohy-drates (β-glucans), glycoproteins (mannans), nucleic acids(DNA and RNA), glycolipids (lipopolysaccharides), pep-

tidoglycans (PGs), and diacyl and triacyl lipopeptides(lipoproteins) that are recognized by receptors that acti-vate innate immune cells [30–32]. These PAMPs are oftenessential for fungal survival and pathogenesis and are notfound on mammalian cells [33,34].

Knowledge about these naturally occurring fungalmolecules and how they stimulate the immune system al-lows the selection of immunological adjuvants that causethese responses in antifungal vaccines (Tables 2 and 3)[35–37].

Adjuvants and delivery systems used in antifungalvaccines

The manipulation of the antifungal immune response is be-coming an important strategy for the prevention and treat-ment of systemic mycoses, and is an alternative to con-ventional toxic drug-based treatments [4]. Many differentimmunological adjuvants have been used in vaccine formu-lations to achieve effective and long-lasting protection byimproving the protective immune response. The evaluationof most of these adjuvants has only been done in animals.Following is a summary of representative experiments withvarious adjuvants in experimental antifungal vaccines, witha brief discussion of the results.

Emulsions

Freund’s adjuvant. Freund’s adjuvants are water-in-oilemulsions. Freund’s complete adjuvant (FCA) is a mixtureof mineral oil (Marco 52) and emulsifier (Arlacel A, man-nide monooleate) prepared as an emulsion of 85% min-eral oil and 15% emulsifier with 500 μg of heat-killed anddried Mycobacterium tuberculosis per milliliter of emulsi-fier mixture. Freund’s incomplete adjuvant (FIA) lacks themycobacterial component, making it safer but less potent[38,39]. Investigators have frequently considered FCA to bethe gold standard of adjuvants used in testing new vaccinecandidates used in animals [38].

Often FCA is used in the first immunization dose, andFIA is used for boosting [40]. These formulations are po-tent adjuvants with the ability to elicit both T helper (Th)1(FCA) and Th2 (incomplete Freund’s adjuvant [IFA]) re-sponses. The mycobacterial components, which elicit theTh1 response of FCA, also activate Th17 cells in murinecell culture and in vivo, which is accompanied by elevatedinterleukin (IL)-6, IL-23, and transforming growth factor–β

levels [41].Many reports on Freund’s adjuvants in antifungal ex-

perimental vaccines exist. FCA has been formulated withP10, a synthetic peptide derived from gp43, a glyco-protein of 416 amino acids from the cell wall of the

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Table 2. TLR-independent fungal PAMPs and corresponding known adjuvants´ ligands

PRRsSelected fungalPAMP(s)/ligands

Pathogenic fungiexamples PRRs agonist as adjuvants

Selectedreferences

C-type lectin receptor family

Mannose receptor (CD206) Fucose and terminal C. albicans Mannans [165]mannose structures C. neoformans, Chitin/chitosan [29]

Pneumocystis Lipoarabinomannan [117]P. jirovecii

Dectin 1 1,3-β-glucan C. albicans Laminarin (β -1,3- and β [166]-1,6-glucan), Curdlan (1,3-β-glucan), [167]Glucan particles (GPs) puriffied [168] [169]S. cerevisiae cell walls [170]

Dectin 2 α-mannan H. capsulatum, Mannans [171]P. brasiliensis, [172] [31]C. neoformans [173] [174]C. albicansMicrosporumaudouinii

MBL 1,3-β-glucan Blastomyces Mannans [175]dermatitidis β-glucan [117]

Mincle α -mannose Candida sp., TDM (cord factor) [176]Malassezia sp. [165]Fonsecaeapedrosoi

[31]

DC-SIGN mannoproteins C. neoformans Lipoarabinomannan [177] [178]Conidia A. fumigatus [179]High-mannosestructures

C. albicans [180]

MMR Mannoproteins C. neoformans Glucans, dextrans, lentinans, [181]Manosa, fucosa S. cereviciae glucomanans, galactomanans, [10]

Levans y xylans

Galectin-3 b-1,2-mannosides C. albicans ? [182]

SCARF1/CD36 b-1,3-glucan C. albicans ? [183]

SP- A 120-kD surfaceglycoprotein

P. carinii ? [184]

SP- D 1,3-β-glucan B. dermatitidis ? [185]

NLR receptors family

NLRP3∗ ? C. albicans Alum [186][187][188][79]

Zymosam andmannan

S. cerevisiae [189]

Scavenger receptor cysteine-rich (SRCR) domains family

CD5 ectodomain β-glucan S. cerevisiae, ? [190]C. neoformans

CD, leukocyte cluster of differentiation; DC-SIGN, dendritic cell specific ICAM-3 grabbing non-integrin; MBL, mannose-binding lectins; MMR, macrophagemannose receptor; NLR, NOD-like receptor; NLRP3, NLR family, pyrin domain containing 3; PRR, pattern recognition receptors; SCARF1/CD36, scavengerreceptors; SP-A and SP-D, collectins (collagen-containing C-type lectins); TDM (Cord factor), trehalose 6,6′-dimycolate; ?, unknown.

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Table 3. TLR-dependent fungal PAMPs and corresponding known adjuvants’ ligands

PRRs (TLR family) Selected fungal PAMP(s)/ligandsPathogenic fungiexamples PRRs agonist as adjuvants

Selectedreferences

TLR 1 ? A. fumigatus [191]

TLR 2 Conidia, phospholipomannan C. albicans Zymosan (b-1,3-glucan from [32]Conidia and hyphae A. niger and Saccharomyces) [192]Zymosan A. fumigatus [193]Gucuronoxylomannanl (GXM) S. cerevisiae∗ [194]Cell wall protein Yps3p C. neoformans [195]? H. capsulatum [196] [197]

P. brasiliensis [198][199][200][70]

Cell wall proteins and lipids S. schensckii Artin M, muramyl dipeptide(MDP)

[117]

TLR 3 Double-stranded RNA A. fumigatus poly(I:C) [201][202]

TLR 2/ TLR1 GXM C. neoformans Triacylated synthetic [203]? A. fumigatus lipoprotein (Pam3CSK4) [191]

[202]

TLR 2/ TLR 6 Zymosan S. cerevisiae MDP [204]GXM C. neoformans Pam2Cys [203]? A. fumigatus [191]

TLR 4 Conidia, mannans C. albicans Lipid A monophosphoryl (MPL), [30]Conidia and hyphae A. niger RIBI, [205]LPS S. schensckii MDP [192]GXM C. neoformans [206]Conidia A. fumigatus [207]

[204][191][50][70]

TLR 5 Salmonella enterica FliC flagellin [107][68]

TLR 7 Single-stranded RNA C. albicans Imiquimod [196][202]

TLR 9 Oligodeoxynucleotides (CpG)DNA

C. neoformans Oligodeoxynucleotides (CpG),CpG 1668

[208]

A. fumigatus [96][209][98]

CpG, cytosine guanine dinucleotide; GXM, gucuronoxylomannan; LPS, lipopolysaccharide; MDP, muramyl dipeptide; PRR, pattern recognition receptors; RIBI,RIBI adjuvant system (ARS); TLR, toll-like receptor; Yps3p, H. capsulatum yeast phase-specific protein; ?, unknown.∗S. cereviciae is non-pathogenic but use in anti-fungal vaccines.

thermodimorphic fungus Paracoccidioides brasiliensis, thecausative agent of paracoccidioidomycosis (PCM) [42–44]. Additionally, Spellberg et al. report that immuniza-tion with a recombinant protein (rAls3p-N) from C. al-bicans mixed with Freund’s adjuvant can protect micefrom lethal Candida infection [45]. Another experimen-tal vaccine against Cryptococcus neoformans was preparedusing glucuronoxylomannan–tetanus toxoid formulated

with FCA. The survival of infected mice after immunizationwas significantly improved compared with controls duringthe 301 days after infection [46].

Similarly, subcutaneously administered soluble antigenicfractions from Histoplasma capsulatum emulsified in FCAprotected mice from a lethal challenge in msurine models.This protection was linked to the in vitro production ofinterferon-gamma (IFN-γ) [47].

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The use of FCA has been limited to experimental immu-nizations in animal studies due to the severity of adversereactions [21,40], whereas IFA was used successfully in nu-merous human trials in the 1950s. However, the use ofIFA in vaccines was discontinued because of safety con-cerns based on animal trials [41,48]. In addition, it is cur-rently unacceptable to compare experimental antifungalvaccines to those formulated with FCA for ethical reasonsbecause this emulsion is very toxic and is not used in humanvaccines.

Ribi adjuvant system. This adjuvant is a formulation ofsqualene, Tween 80, and monophosphoryl lipid A and isused in various experimental antifungal vaccines. Ribi andtwo variants using monophosphoryl lipid-squalene (MPL-SE) or MPL-AF (an aqueous micellar suspension of MPLdispersed in dipalmitoyl phosphatidylcholine) formulatedwith the rAg2 fusion protein from Coccidioides showedvariable but effective results regarding the reduction of thefungal burden in the liver, lungs, and spleen and enhancedsurvival after fungal challenge [49,50]. These results arediscussed later.

In another report, both antigens separated by con-canavalin A affinity chromatography into adherent (manno-protein [MP]) and nonadherent (flowthrough [FT])fractions from C. neoformans strain B3501 culturefiltrates formulated with Ribi adjuvant, were adminis-tered intraperitoneally to C57BL/6 and CBA/J mice. Micethat received two inoculations of MP and FT exhib-ited prolonged survival and reduced brain and kidneyfungal loads following intravenous challenge with thepathogenic fungi in comparison with adjuvant alone.On the other hand, CBA/J mice also benefited fromimmunization with FT and MP; however the benefitswere less evident than those observed in C57BL/6 mice.Furthermore, MP and FT immunization also protectedB-cell–deficient, but not T-cell–deficient, mice, suggest-ing that protection was mediated by T-cell–dependentmechanisms [51].

Montanide oil adjuvants. Mineral oils in water–oil emul-sions, such as IFA, stay at the injection site and produce lo-cal inflammation [21]. Because IFA has not been acceptedas a commercially viable adjuvant due to safety concernsbased on animal studies [48], a proprietary, highly refinedemulsifier from the mannide monooleate family in a natu-ral metabolizable oil solution called Montanide ISA 51 wasdeveloped by SEPPIC (Paris, France). This adjuvant con-tains mannide oleate in a mineral oil solution (DRAKEOL6VR). These formulations are generally well tolerated sys-temically, though several instances of mild to severe localreactions have been reported [52,53]. Other low-viscosityformulations containing highly purified oils and injectableemulsifying agents that have high immunopotentiation ca-

pacity and milder side effects are available. For example,ISA 720 is an emulsion containing a highly refined emulsi-fier from the mannide monooleate family in a natural me-tabolizable oil solution [52,54]. SEPPIC has developed an-other family of adjuvants called IMS that are composedof nanoparticles suspended in aqueous solutions combinedwith an immunostimulatory compound [55]. One of themore closely studied is the IMS 1313 N VG PR (IMS 1313)adjuvant, which consists of water-soluble liquid nanoparti-cles combined with an immunostimulatory compound. Be-cause this adjuvant has an aqueous phase, it is suitable as amucosal delivery vehicle [56,57].

The ISS/Montanide adjuvant was evaluated for safety,immunogenicity, and efficacy using the recombinantAg2/PRA106 + CSA chimeric fusion protein (CFP) ex-pressed in Saccharomyces cerevisiae. The vaccine wasadministered via the intramuscular route in adult fe-male cynomolgus macaques challenged with Coccidioidesposadasii. Animals received three immunizations using twodoses of CFP plus adjuvant or adjuvant alone on days0, 28, and 112 and were intratracheally challenged 28days following the final immunization with arthroconidia(C. posadasii strain Silveira). At the time of the challenge,all animals showed evidence of disease. Animals vaccinatedwith the highest doses of CFP were protected and showedevidence of enhanced sensitization compared with adjuvantcontrols and animals vaccinated with lower doses of CFP.This observation was based on higher serum anti-CFP titers,enhanced secretion of IFN-γ from stimulated bronchoalve-olar lavage mononuclear cells, reduced pulmonary radi-ologic findings following intratracheal challenge, reducedterminal complement fixation titers, and reduced necropsyfindings. Overall the vaccine was well tolerated [58].

TiterMax. TiterMax (TM) is a water-in-oil emulsionconsisting of squalene, an emulsifier (sorbitan monooleate80), block copolymers of polyoxypropylene and poly-oxyethylene, and microparticulate silica. This formulationallows for the incorporation of a wide variety of antigensfor antibody production and vaccines. TM presents antigento the immune system in a highly concentrated form thatoften produces antibody titers comparable to or higher thanFCA. This adjuvant stimulates complement activity and in-creases class II major histocompatibility complex expres-sion on macrophages. Toxicity is lower than other water-in-oil adjuvants such as FCA [40].

TM was used by Ito et al. in an experimental vac-cine against Aspergillus fumigatus when the following twoantigens were evaluated: recombinant Asp f 3 (rAsp f 3)and Asp f 1. The rAsp f 3 vaccine induced a protec-tive immune response only in the presence of the TMadjuvant. Subcutaneous injections of Asp f 3 with orwithout TM and the mock immunizations with either

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Table 4 Adjuvant formulations used in human-licensed vaccines

Adjuvant Basic composition Manufacturer Indication

Tested inexperimentalanti-fungalvaccine

Adjuvant used as part of licensed human vaccines

Alum Al(OH)3 or Several Several YesAl4(OHPO4)3, orAl(OHPO4)SO

Calcium phosphate Ca3(PO4)2 Sanofi DTP NoMF59 squalene polysorbate 80, sorbitan

triolate, sodium citrateNovartis Seasonal Flu Yes

MPL O-desacyl-4-monophosphoryllipid A, derived from LPS of S.minnesota R595

Allergy Therapeutics Allergy Yes

AS03 Squalene, DL-α-tocopherol GSK Pandemic No(vitamin E) polysorbate 80 flu

AS04 MPL/Alum GSK HBV, HPV NoRC529 Synthetic MPL/Alum Berna Biotech HBV NoVirosome (VLP, IRIV) Phosphatidylcholine bilayer

liposomesBerna Biotech HAV Yes

AF03 Sanofi InfluenzaAFPL1TM Outer membrane vesicles

(Neisseria meningitidis B)Finlay Institute Meningococcal disease No

Tested in clinical trials but not yet licensed

CpG Unmethylated motif of DNAbacterial

HBV, Influenza Cancer Yes

IC31 TB NoImiquimod TLR7/8 agonist Cancer NoFlagellin TLR 5 agonist Influenza YesAS01 MPL/ liposomas/QS21 GSK Malaria NoAS02 MPL/w/o emulsion/QS21 GSK Malaria, TB, Cancer NoAS15 GSK Cancer NoIscomatrix Phospholipid/colesterol/saponin HCV, influenza, HPV, cancer NoMontanide ISA51,ISA720

o/w emulsion Seppic Malaria, HIV, cancer Yes

LT Heat-labile enterotoxin from Influenza, ETEC NoLTK63 E. coliVirosome (VLP, IRIV) rSap2, a truncated, recombinant

aspartyl proteinase-2Pevion Biotech AG Influenza, TB,HIV Yes

Alum Candidal Als3p adhesin NovaDigm PEV7, Candida YesTherapeutics NDV-3, Candida and S. aureus

Alum, aluminum adjuvants; AS, adjuvant system; CpG, CpG oligodeoxynucleotides (or CpG ODN); DTP, diphtheria, tetanus, pertussis; GSK, GlaxoSmithKline;HBV, hepatitis B virus; HIV, human immunodeficiency virus; HPV, human papillomavirus; IC, IRIV, immunostimulating reconstituted influenza virosomes; ISA,montanide incomplete Seppic Adjuvants; LPS, lipopolysaccharide; LT, labile toxin; LTK, adjuvant nontoxic derivatives of heat-labile enterotoxin of E. coli; MF59,immunologic adjuvant; MPL, monophosphoryl lipid A; NDV, NovaDigm Therapeutics; PEV, pharmaceutical company Pevion Biotech; QS21; saponin adjuvantderived tree Quijalla saponaria Molina; rSAP, recombinant aspartyl proteinases-2 of C. albicans; TLR, Toll-like receptor; VLP, virus-like particle.

phosphate buffered saline (PBS) or TM alone were not pro-tective. The lungs of Asp f 3–vaccinated survivors werefree of hyphae and showed only a patchy low-density infil-trate of mononuclear cells. In contrast, the nonimmunizedanimals died and showed invasive hyphal elements and acompact peribronchial infiltrate of predominantly polymor-

phonuclear leukocytes [59]. Recent work from this grouphas focused on the protective mechanisms of this vaccine,in particular, the roles of antibodies and especially CD4+T cells [60]. TM has shown good immunostimulatoryproperties under experimental conditions but is too toxicfor use in humans.

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MF59. MF59 is an oil-in-water (o/w) system from No-vartis that consists of 4.3% squalene, a metabolizable oilfrom shark liver; 0.5% polysorbate 80; 0.5% sorbitan tri-olate; and 10 mM sodium citrate, with a size of 160 nm[24,61]. Although the mode of action is still unclear, themechanism of adjuvanticity by MF59 is proposed to beattributed, in part, to its depot effect and cellular infiltra-tion, including the recruitment of APCs to the injection site,enhancement of antigen uptake into APCs, and activationof innate immunity without activating Toll-like receptor(TLR) pathways [14,16,62]. MF59 has been used in a li-censed influenza vaccine (Fluad) with good safety in numer-ous countries for more than 15 years. This vaccine exhibitsan adequate protection and safety balance, with acceptable,mild, and transient local injection site reactions [63,64].

MF59 has been tested in combination with laminarinfrom Laminaria digitata (Lam), a β-glucan from a non-fungal source that has a molecular structure resemblingthat of fungal β-glucans, to generate various experimen-tal glycoconjugate vaccines using the nontoxic diphthe-ria toxin mutant CRM197. These laminarin–diphtheriatoxoid conjugates were either natural (Curd-CRM197)or synthetic linear (15mer-CRM197) or β-(1,6)-branched(17mer-CRM197) β-(1,3)-oligosaccharides. All of theseconjugates combined with the MF59 adjuvant resulted inimmunogenicity and elicited antibodies against both Lamand the native β-glucan from Candida. However, Curd-CRM197 and 15mer-CRM197 conjugates induced highanti-β-(1,3)-glucan immunoglobulin G (IgG) titers, but noantibodies against β -(1,6)-glucan, that conferred protec-tion to mice challenged with a lethal dose of C. albicans.In contrast, the 17mer-CRM197 conjugate, which inducedanti-β-(1,6)-glucan antibodies in addition to the anti-β-(1,3)-glucan IgG, was nonprotective [65].

MF59 is regarded as a potent and safe adjuvant thathas been used in licensed human vaccines with excellent re-sults, making it an interesting adjuvant for future antifungalvaccines.

Cationic lipids. Cationic lipid (dioctadecyl-dimethylammonium bromide [DODAB]) adjuvantsare able to carry antigens, efficiently stimulate antibodyproduction, and activate cytotoxic T cells at a low antigendose [66,67]. DODAB also induces dendritic cell matura-tion and the production of high levels of IL-12 and IFN-γ[68,69]. DODAB is another adjuvant that was evaluatedin the previously mentioned experiment. The best resultswere observed with the combination P10 + DODAB in theimmunized mice 30 days after infection with P. brasiliensis[70].

Sesame oil. Sesame oil, also known as gingelly oil, isan edible vegetable oil derived from sesame seeds. Its ad-juvant properties were demonstrated by Kimura as part of

a water-in-oil-in-water emulsion [71]. Sesame oil (Sigma–Aldrich Inc., St. Louis, MO, USA) was used by the Stevensgroup in an experimental vaccine against coccidioidomyco-sis using heat-killed S. cerevisiae (HKY) as the antigen. Ashappened with other adjuvants used, this oil did not im-prove the protection against systemic coccidioidomycosisin vaccinated animals [72].

In comparison, o/w emulsions seem to be safer thanwater-in-oil emulsions [16].

Aluminum compounds

In 1926, Glenny and colleagues discovered that a suspen-sion of alum-precipitated diphtheria toxoid had a muchhigher immunogenicity than the fluid toxoid [13]. Histor-ically, the word “alum” has been used in the adjuvant lit-erature to describe both aluminum phosphate (AlPO4) andaluminum hydroxide Al(OH)3 gels, but this use of termi-nology is incorrect. Potassium alum, KAl(SO4)2–12H2O,which has not been used as an adjuvant, conforms to thechemical definition of an alum, whereas neither Al(OH)3

nor Al(PO)4 is chemically considered an alum [73].Despite their long period of use, a flurry of activity aimed

at understanding the adjuvant action of these compoundshas occurred only within the past two decades. Initially, theproposed mechanism of action was the depot effect in thelocal site of inoculation and slow antigen release [13,74].Currently, the depot effect has been shown to not be a rel-evant mechanism of alum adjuvanticity [75]. In contrast,the cytotoxicity of aluminum salt was suggested to causethe release of uric acid [76] and DNA [77] from dyinghost cells in vivo, which acts as a damage-associated molec-ular pattern required for their adjuvant activity throughcaspase-1 activation. This process is mediated by thenucleotide oligomerization domain-like receptor (NLR)family, pyrin domain containing 3 (NLRP3) and apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD (N-terminal caspase recruitment) domain collectively knownas the NLRP3 inflammasome [78,79].

Alum has been tested in several experimental vaccinesagainst fungi. A vaccine against coccidioidomycosis wastested using HKY as antigen. Alum administration provednot to be beneficial and, in fact, appeared detrimental tothe protective capacity of the HKY [72]. However, otheranti-Candida vaccines based on synthetic, short β-(1→2)-linked mannose oligosaccharide haptens conjugated totetanus toxoid admixed with alum were able to inducehigher opsonizing antibody titers and a significant reduc-tion in the fungal burden in vital organs after two injectionsin a standard model of invasive candidiasis [80]. Concur-rently, this group also reported that a disaccharide fromC. albicans conjugated with chicken serum albumin induces

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a secondary immune response, as demonstrated by the de-tection of high levels of IgG antibodies specific for the cellwall β-mannan and reduced fungal burden in rabbits chal-lenged with live C. albicans [81].

In another study, Lin et al. reported that vaccination withthe candidal Als3p adhesin (rAls3p-N) with aluminum hy-droxide (Al(OH)3) adjuvant reduced the tissue infectiousburden of mice subsequently infected intravenously withC. albicans or methicillin-resistant S. aureus. They alsoshowed that the mechanism of protection was a Th1/Th17response, resulting in recruitment and activation of phago-cytes at sites of infection and more effective clearance of S.aureus and C. albicans from tissues [82].

A first-in-human phase 1 clinical trial involving 40healthy adult subjects showed that this vaccine was gen-erally well tolerated, causing only local site reactions char-acteristic of an intramuscular vaccine formulated with analuminum adjuvant. This reaction was characterized bytransient injection site pain and swelling that increased withhigher doses. Systemic effects were generally mild and re-solved quickly without sequelae [83].

Other vaccines prepared with different adjuvant combi-nations using alum are discussed later.

Bacterial-derived adjuvants

Monophosphoryl lipid A. Monophosphoryl lipid A (MPL)is composed of a series of 4′-monophosphoryl lipid Aspecies that vary in the extent and position of their fattyacid substitutions. It is isolated from the lipopolysaccharideof Salmonella minnesota R595 and retains much of the im-munostimulatory properties of the parent lipopolysaccha-ride without the inherent toxicity [84–86]. MPL is a TLR4and TLR2 agonist on dendritic cells and macrophages thatpreferentially signals via TRIF (TIR-domain-containingadapter-inducing interferon-β) over MyD88 [87]. More-over, MPL stimulates the production of the Th1 cytokinesIL-2 and IFN-γ and IgG2a antibodies and, to a lesser ex-tent, the Th2 cytokines IL-4 and IL-5 and IgE and IgG1antibodies in mice. Furthermore, it is capable of upreg-ulating human leukocyte antigen–DR, CD80, CD86, andCD40 and the activation marker CD83 expressed on den-dritic cells in vitro [41,88,89]. In clinical trials with morethan 10c000 healthy subjects, MPL was shown to have anacceptable tolerability and was effective in inducing IL-2,IFN-γ, and cytotoxic T cells [90].

Two inbred strains of mice (BALB/c and C57BL/6) werevaccinated with recombinant spherule-derived proline-richantigen protein (rPRA) from Coccidioides immitis in MPL.Four weeks after vaccination, mice were infected intraperi-toneally with arthroconidia. By 2 weeks, immunized micehad significantly lower pulmonary fungal burdens, ranging

from 3.0 to 4.5 log10 fewer colony-forming units. In vitroimmunologic markers of lymphocyte proliferation and IFN-γ release after splenocytes were stimulated with rPRA cor-related with protection. Additionally, the plasma concen-trations of rPRA-specific IgG1 and IgG2a showed increasesin vaccinated mice [49].

Two formulations of MPL that have been used are MPL-SE and MPL-AF. MPL-AF augments humoral and cellu-lar immune responses to vaccines administered by the in-tranasal route. These two variants have been explored inexperimental vaccines against coccidioidomycosis using re-combinant Ag2 fusion protein (rAg2/PRA) as the antigen[91]. The efficacy of rAg2/PRA in MPL-SE was comparedwith rAg2/PRA in FCA. Mice immunized with the for-mer were significantly more protected than mice immunizedwith the latter after intranasal challenge with 30 arthroconi-dia. Moreover, the administration of rAg2/PRA in MPL-AFadjuvant significantly protected BALB/c and C57BL/6 miceagainst pulmonary challenge with Coccidioides [49,50].

In other more recent studies, mice immunized with the14-mer peptide Fba, which is derived from the N-terminalportion of the C. albicans cytosolic/cell surface proteinfructose-bisphosphate aldolase, mixed with MPL as the ad-juvant conferred significant protection, which was associ-ated with the production of anti-Fba peptide antibodies inthe sera of immunized mice [92,93]. MPL is also used inseveral adjuvant combinations, which are discussed below.

Cytosine guanine dinucleotide oligodeoxynucleotide(CpG-ODN). Bacterial DNA contains cytosine guanine din-ucleotide (CpG) motifs and, unlike vertebrate DNA, acti-vates innate immune cells because the recognition of CpGmotifs in vertebrate DNA is suppressed by methylation.These motifs have the general structure of two 5′ purines,an unmethylated CpG motif, and two 3′ pyrimidines and oc-cur much more commonly in bacterial DNA than in mam-malian DNA [94,95].

CpG ODNs are recognized by TLR9, which is expressedexclusively on human B cells and plasmocytoid dendriticcells (pDCs). This receptor expression pattern induces Th1-dominated immune responses, making CpG ODNs usefulas vaccine adjuvants for peptide antigens as well as numer-ous microbial proteins. This adjuvant has been evaluated inneonates in a variety of species [96–98].

Romani et al. have shown that the combined intranasaldelivery of CpG ODN and the Asp f 16, but not the Aspf 3 Aspergillus allergen, resulted in the functional matura-tion and activation of airway DCs capable of inducing Th1priming and that this immunization was protective againstinvasive pulmonary aspergillosis in neutropenic BALB/cmice. CpG ODN predominantly induces Th1 activity andis a potent adjuvant for vaccine-induced protection againstfungi [99].

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Another study compared the protection obtained in miceagainst a respiratory coccidioidal infection by immuniz-ing mice with vaccines containing rAg2/PRA truncationsand a chimeric fusion protein composed of Ag2/PRA1–106 linearly coexpressed with CSA formulated with CpGODN and MPL-SE. Mice vaccinated with either combina-tion survived longer than mice given single antigens, ex-hibited high titers of specific IgG, and yielded interferon-gamma-producing splenocytes in response to eitherantigen [100].

Additionally, IFA mixed with either CpG1668 or curd-lan has been used. T-cell responses in the draining lymphnodes were analyzed on day 7 after immunization. Alter-natively, mice were challenged with C. albicans 3 weeksafter immunization. In this study, the choice of vaccineadjuvant appeared to be critical because mice that wereimmunized using CpG were not protected from candidia-sis despite the priming of Candida-speciffic CD4+ T cells.In this group, T cells primed in the presence of CpG dif-ferentiated into IFN-γ–secreting Th1 cells that lacked theability to produce IL-17, whereas mice immunized withcurdlan favored a Th17 response and were protected fromfatal candidiasis [101]. Capilla et al. [72] reported similarresults. They separately evaluated different adjuvants, in-cluding CpG in combination with HKY (heat-killed S. cere-visiae), to examine protection against systemic murine coc-cidioidomycosis. CD-1 mice received HKY subcutaneouslyor by oral gavage with or without adjuvants once weekly 3or 4 weeks prior to infection; oral live Saccharomyces wasalso studied. Subcutaneously administered CpG appeareddetrimental rather than beneficial to the protective capac-ity of the HKY, while HKY alone appeared to be the mosteffective [72].

In another recent study, female C57BL/6 mice and ho-mozygous Tlr3−/− mice (genetically deficient in TLR3) weretreated with A. fumigatus conidia or the protective recom-binant fungal Ag Crf1p using CpG as an adjuvant. Resis-tance to subsequent infection was determined by assessingsurvival, fungal growth, and patterns of cytokine gene ex-pression. In contrast to control mice, Tlr3−/− mice failedto develop vaccine-induced resistance in response to coni-dia, as revealed by their inability to survive infection andrestrict fungal growth, their susceptibility to pulmonary as-pergillosis, and their failure to produce protective IFN- γ

and IL-10. Tlr3−/− mice also failed to develop MHC classI–restricted CD8+ T-cell responses after vaccination. How-ever, surprisingly these mice developed full resistance afterCrf1p vaccination [102].

These conflicting results obtained using CpG in differentformulations are valuable examples that one simple anduniversal adjuvant effective for all types of antigens andconditions is elusive.

Muramyl dipeptide. Muramyl dipeptide (MDP) is an ad-juvant that was first identified in a mycobacterial peptido-glycan fraction known to have potent adjuvant activity. It iscomposed of N-acetylmuramic acid linked by its lactic acidmoiety to the N-terminus of an L-alanine D-isoglutaminedipeptide [103]. MDP is recognized by nucleotide-bindingoligomerization domain-containing protein 2 (NOD2), amember of the NLR family, a member of the NLR fam-ily. The characterization of Nod2 as the first pathogen-recognition molecule that detects MDP has helped tounravel the well-known biological activities of this im-munomodulatory compound [104]. MDP also acts via theTLR pathway, providing synergistic coactivation that leadsto the potent activation of nuclear factor-κB (NF-κB), themaster immune regulator, and the induction of inflamma-tory cytokine production [105,106]. MDP was another oneof the adjuvants evaluated by Capilla et al. in combinationwith HKY using the same conditions to CpG, and it wasalso ineffective against systemic infection with Coccidioides[72].

Flagellin. Flagellin is a highly conserved structural com-ponent of the flagellar filament in bacteria. Flagellin ob-tained from Salmonella enterica has been successfully usedas a vaccine adjuvant to generate antigen-specific antibod-ies and T cells either when administered to mice as nativepurified protein or as a hybrid protein genetically fused tothe target antigen, inducing both humoral and cellular re-sponses. Its strong adjuvant activity is mediated by TLR5 onCD11+ dendritic cells, linking innate and adaptive immu-nity. Flagellin exposure leads to a strong cellular responseaccompanied by high IFN-γ secretion, indicating a Th1-biased response. Furthermore, flagellin has been recentlyshown to promote Th17 differentiation in a certain subsetof dendritic cells (CD11chigh/CD11bhigh) [107–109].

FliC, a flagellin protein derived from S. enterica serovarDublin, significantly alters the Th1 immune response as-sociated with P10 of P. brasiliensis. BALB/c mice wereintranasally immunized with gp43, a secreted fungal cellwall protein of P. brasiliensis, or a 15-amino acid pep-tide called P10, which contains a CD4+ T-cell–specificepitope, in combination with FliC flagellin. Immunizationwith purified recombinant flagellin genetically fused withP10 or the synthetic P10 peptide admixed with purified FliCelicited a predominantly Th1-type immune response basedon lung cell–secreted type 1 cytokines. These immunizedmice exhibited reduced P. brasiliensis growth and lung dam-age after intratracheal challenge with P. brasiliensis yeastcells in comparison with those immunized with gp43 andFliC, which suffered increased fungal proliferation and lungtissue damage [110]. In another experiment from thisgroup, the therapeutic effect of several adjuvants, includingFliC formulated with P10, a 15-mer internal peptide of the

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glycoprotein gp43, the main antigen target of P. brasiliensis,were evaluated. Mice subcutaneously immunized with P10and FliC 30 days after intratracheal infection and boostedon days 37 and 44 showed low numbers of viable yeast cellsas well as reductions in granuloma formation and fibrosis.Concomitantly, in contrast to IL-4 and IL-10, the secretionof IFN-γ and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) was en-hanced in the lungs of immunized mice, and significant ther-apeutic effects were observed for experimental PCM [70].These results show that S. enterica FliC flagellin representsa promising alternative for the generation of preventive ortherapeutic anti-PCM vaccines.

Bacterial enterotoxins. The heat-labile enterotoxins ofEscherichia coli and Vibrio cholerae have been extensivelystudied for their contributions to virulence in microbialinfections and for their immunomodulatory properties.Thus, ADP-ribosylating enterotoxins, including choleratoxin (CT), heat-labile enterotoxin (LT) from E. coli andtheir mutants or subunits, are the best-studied mucosaladjuvants. These enterotoxins promote the induction ofantigen-specific IgA antibodies and long-lasting memory tocoadministered antigens when administered mucosally ortranscutaneously [111].

An MP extract and secreted aspartyl proteinase (Sap) ofC. albicans, with or without CT as a mucosal adjuvant wereformulated to immunize oophorectomized estrogentreatedrats by the intravaginal or intranasal route. Both routes ofimmunization were equally effective in inducing anti-MPand anti-Sap vaginal antibodies and conferred a high degreeof protection against vaginal infection by the fungus [112].

This same group developed a recombinant C. albicansvaccine consisting of a truncated 6xhis-tagged, enzymati-cally inactive Sap2 that lacks the N-terminus 76 amino acids(rSap2t) plus CT. This vaccine was used to intravaginallyimmunize oophorectomized estradiol-treated rats. Theseanimals received this formulation three times at weeklyintervals. At the end of the experiment, the immunizedrats produced local anti-rSap2t IgG and IgA antibodies andwere protected from the challenge of a highly vaginopathicstrain of the fungus. In independent experiments, the pas-sive transfer of immune vaginal fluid and the protectiveeffects of passive vaccination with anti-rSap2t IgM and IgGmonoclonal antibodies showed that protection was possiblydue to the specific antibodies [113].

Cardenas-Freytag et al. reported the effectiveness ofa mucosal vaccine composed of heat-killed C. albicans(HK-CA) or C. albicans culture filtrate (CaCF) in con-junction with the mucosal adjuvant LT (R192G) againstvulvovaginal candidiasis in an estrogen-dependent murinemodel. Mice vaccinated intranasally with HK-CA + LT(R192G) exhibited a significant but short-lived protec-tion accompanied by high titers of circulating (but not

in vaginal secretions) C. albicans–specific antibodies anda vigorous delayed-type hypersensitivity response. Vaginalpriming with C. albicans before vaccination did not al-ter the protective outcome, while CaCF + LT (R192G)administered intrarectally but not intranasally induced amodest level of protection [114]. However, in a previ-ous report from this group, use of killed C. albicans inconjunction with LT (R192G) administered intranasallyto male CBA/J mice resulted in significant levels of pro-tection after intravenous challenge with viable C. albi-cans and relevant stimulation of specific antibodies anddelayed-type hypersensitivity tested in the footpad withC. albicans mannan [115].

Torosantucci et al. [116] developed a vaccine formula-tion to protect against a variety of human pathogenic fungibased on laminarin (Lam), a well-characterized but poorlyimmunogenic beta-glucan from the brown alga Laminariadigitata conjugated with the diphtheria toxoid CRM197 asthe carrier protein and FCA as an adjuvant for systemicimmunization via the intravenous route and CT for mu-cosal (intravaginal) immunization. This Lam–CRM conju-gate was immunogenic and protective against both systemicand vaginal infections by C. albicans in mice. Moreover,passive transfer of whole immune serum, the immune vagi-nal fluid, and the affinity-purified anti-glucan IgG fractionsprovided protection to naive mice. This passive protectionwas prevented by adsorption of antibodies on Candida cellsor glucan particles before transfer. Additionally, in vitroinhibition of Candida by pretreatment with anti-glucan an-tibodies generated in immunized mice was observed. Inter-estingly, Lam–CRM-vaccinated mice were also protectedfrom a lethal challenge with A. fumigatus conidia, and theirserum also bound to and markedly inhibited the growth ofA. fumigatus hyphae. These experiments showed the pro-tective role of the anti–beta-glucan antibodies [116].

In spite of the efficacy demonstrated for CT and LT andtheir derivatives as mucosal adjuvants, safety issues haveprevented the full realization of the potential of this classof potent mucosal adjuvants [111,117,118].

Carbohydrate-based adjuvants

Several natural complex carbohydrates are able to stimulateimmune cells. The main source of these polysaccharides areplants and fungi. Polysaccharides that have adjuvant activ-ity include inulin, glucans, dextrans, lentinans, glucoman-nans, galactomannans, chitin/chitosan, levans, and xylans[119,120].

Macrophages have glucan and mannan receptors, andthe activation of these receptors stimulates phagocyto-sis and cytokine secretion in addition to the release ofleukotrienes and prostaglandins. In vitro, mannan activates

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monocytes and macrophages to secrete IFN, TNF, GM-CSF(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) IL-1and IL-6. Acemannan, a natural polysaccharide extractedas a mucilaginous gel of Aloe barbadensis, stimulates thegeneration of specific antibodies, cytotoxic T lymphocytes,and the cytotoxic activity of natural killer cells in labora-tory animals [119,121–124]. A carbohydrate derived fromplant roots of the Compositae family, γ-inulin, is effectiveat boosting cellular immune responses without toxicity. Thecomplement pathway is activated by γ-inulin, increasing ac-tivated C3 production and thereby activating macrophages.This adjuvant can be combined with a variety of other ad-juvants, for example, aluminum hydroxide (Algammulin).This combination induces a higher ratio of Th2 to Th1activity than γ-inulin alone [119].

The prophylactic effects of both the d-mannose-bindinglectin ArtinM, which is extracted from the seeds of Artocar-pus integrifolia (jackfruit), and its recombinant counterpartduring the course of experimental paracoccidioidomycosisinduced in mice were evaluated. The best effect was ob-tained after administration of two native or recombinantArtinM doses on days 10 and 3 before challenge with P.brasiliensis. This treatment strategy reduced the fungal bur-den and lung granuloma incidence and augmented the levelsof IL-12, IFN-γ , TNF-α, and nitric oxide (NO), favoringTh1 immunity in comparison with the untreated infectedmice [125].

Liu et al. [126] studied an acid-stable cell-wall man-nan (α-1, 6-linked backbone highly branched with α-1, 2;α-1, 3; and β-1, 2-linked manno-oligomers) derived fromC. albicans, conjugated or not to bovine serum albumin(BSA), as a vaccine against systemic aspergillosis. Theydemonstrated that mice vaccinated subcutaneously withthree doses of mannan or mannan-BSA conjugate weekly2 weeks prior to infection with A. fumigatus conidia ex-hibited protection and reductions in the fungal burdensin the brains and kidneys in a dose-dependent manner,and conjugation with BSA improved the protection ap-proximately 40-fold [126]. This result corroborates a re-port by Bystricky et al., who demonstrated that mannansalone do not induce sufficient levels of protective anti-bodies compared with a mannan–human serum albuminconjugate in immunized rabbits, which elicits a booster re-sponse with a significant increase in the serum IgG level andstrong inhibition of in vitro Candida growth in the secondcase [127].

It is interesting that many carbohydrates derived fromfungi can be used as antigens as well as adjuvants becausethey contain PAMPs that stimulate innate cells. This char-acteristic is a good opportunity to explore molecules withcommon structures in various pathogenic fungus to designuniversal antifungal vaccines [128].

Micro and nanoparticles

Liposomes. Liposomes are composed of natural, biodegrad-able, nontoxic, and nonimmunogenic phospholipids inwhich the antigen is either enclosed within the aqueous coreor intercalated into the lipid layer. Due to their flexibilitywith regard to size, composition, charge, and bilayer flu-idity, as well as their ability to incorporate large amountsof antigens and a variety of hydrophilic or hydrophobiccompounds, liposomes are widely used as antigen deliverysystems. In vaccine applications, their main functions are toprotect antigens from clearance in the body and to deliverthe antigens to professional antigen-presenting cells. Thus,they are an attractive alternative for the mucosal delivery ofantigens [129,130]. Liposomes can facilitate the in vivo mi-gration of antigens and deliver encapsulated antigen into thecytosol of antigen-presenting cells for both cell-mediatedand humoral immune responses. The uptake of liposomesis generally believed to occur through a phagocytic or en-docytic process, not by fusing with cellular membranes.Charged liposomes can readily bind to antigens and en-hance their uptake and the efficiency of their presentation.Liposomes also upregulate several chemokine genes includ-ing CCL2, CCL3, and CCL4 in dendritic cells [16,131].

A mannan extract from C. albicans that functions asan adhesin was encapsulated in multilamellar liposomesand used to vaccinate mice over a 5- to 6-week periodwith an initial vaccine dose and weekly booster immu-nizations. Circulating agglutinins specific for this frac-tion correlated with increased resistance to disseminatedcandidiasis [132]. Another liposomal vaccine was formu-lated with C. albicans ribosomes and the lipids dimyristoylphosphatidyl choline and dimyristoyl phosphatidyl glycerol(9:1 molar ratio). Some of the vaccines contained lipid-A as an additional adjuvant. The efficacy of these vac-cines in mice was evaluated using the survival rate againsta challenge with C. albicans; the induction of delayedtype hypersensitivity (DTH) and the anti-Candida anti-body titer. Unimmunized mice and mice vaccinated withribosomes supplemented with IFA were used as controls.The results indicate that the liposomal vaccines were atleast as effective as the IFA-based vaccine [133]. Simi-lar results were observed by Lambros et al. [134] for acryptococcal vaccine when they evaluated anticryptococ-cal DTH reactivity and the clearance of cryptococci fromgroups of mice immunized with liposome-encapsulatedCneF (CneF-liposome) compared with those of mice im-munized with CneF-CFA. The CneF-liposome formulationinduced a positive anticryptococcal DTH response andincreased the clearance of C. neoformans from tissuescompared with the saline-liposome formulation [134].More recently, groups of mice were immunized with

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C. albicans cytosolic proteins (Cp) that were unencapusu-lated, liposome-encapsulated or liposome-encapsulated,and further entrapped in fibrin cross-linked plasma beads.Among various Cp-based vaccines investigated, the prepa-ration containing liposomized Cp entrapped in plasmabeads was more immunogenic and imparted superior pro-tection in immunized mice, as evaluated by the survival rateand fungal burden in systemic circulation and vital organs,compared with other antigen delivery systems [135]. Theseresults suggest that liposomes may function as valuable im-munoadjuvants and delivery systems for generating protec-tive immunity against fungal infection, with the possibilityof being used in different antifungal vaccines.

Virosomes. Virosomes developed by Crucell, which areused as adjuvants and delivery systems, are reconstitutedviral envelopes derived from the influenza virus that are de-void of viral RNA but retain the viral components necessaryfor target cell binding and entry, including hemagglutinin-mediated fusion activity. The antigen of interest can be dis-played on the surface of virosomes in a highly immunogeniccontext owing to the virosomes combined action as a car-rier and adjuvant, strongly promoting antigen presentation[136]. Virosomes are used in vaccines against inffiuenza(Inffiexal V) and hepatitis A (Epaxal) [137,138].

A novel vaccine candidate (PEV7; Pevion Biotech),which consists of rSap2, a truncated, recombinant aspartylproteinase-2 of C. albicans, was developed as a virosomeformulation [139]. PEV7 generated a potent serum anti-body response in mice and rats following intramuscularimmunization. Rats were immunized using intravaginal orintramuscular plus intravaginal administration of PEV7.Anti-Sap2 IgG and IgA were detected in the vaginal fluidafter vaccination. In a rat model of candidal vaginitis, PEV7induced significant, long-lasting, likely antibody-mediatedprotection following intravaginal immunization. PEV7 wasalso found to be safe in a repeated-dose toxicological studyin rats [139].

Poly(lactic acid-glycolic acid). The biodegradable andbiocompatible polyesters known as poly(lactic acid-glycolicacid); PLGA) have been used in humans for many years assuture materials and as controlled-release delivery systemsfor peptide drugs and are the primary candidates for thedevelopment of microparticles as vaccines [140]. The ad-juvant properties of PLGA are due to small microspheres(<10 gm) that may be phagocytosed to enhance antigenpresentation. In addition, studies have shown that mi-croparticles also exert an adjuvant effect for cell-mediatedimmunity, including the induction of cytotoxic T-cell re-sponses following both systemic and mucosal administra-tion [141,142]. However, the primary use of PLGA for vac-cine delivery is based on their ability to control the release ofantigen after administration because their degradation rate

and antigen release can be predicted, thereby eliminatingor reducing the need for boost immunizations [143–145].Unfortunately, the potential of microparticles as vaccine ad-juvants has been limited by several studies that describe thedegradation and denaturation of proteins during microen-capsulation [146,147].

Recently, PLGA was used as a sustained delivery sys-tem for the immunomodulatory peptide P10 for reduc-ing the in vivo degradation of the peptide and to elicit aprotective immune response against paracoccidioidomyco-sis [148]. BALB/c mice were infected with P. brasiliensisyeast to mimic the chronic form of paracoccidioidomy-cosis. The animals were treated daily with sulfamethoxa-zole/trimethoprim alone or combined with peptide P10, ei-ther emulsified in Freund’s adjuvant or entrapped in PLGAnanoparticles at different concentrations. After 30 days oftreatment, animals given combined chemotherapy and P10nanotherapy presented a marked reduction in fungal load inthe lungs accompanied by high levels of IFN-γ in the lungscompared with untreated animals. In addition, this com-bined therapy was more effective than “free” P10 emulsifiedin Freund’s adjuvant. As an additional advantage, P10 in-corporation into PLGA nanoparticles dramatically reducedthe amount of peptide necessary to elicit a protective effect,in turn, reducing costs of production.

In another experimental vaccine, cytosolic proteins (Cp)from the pathogen C. neoformans were used as an anti-gen in combination with PLGA microspheres further co-encapsulated into the biocompatible fibrin cross-linkedplasma beads (Fib-PLGA-Cp) for immunization of mice.This formulation mediated the cytosolic delivery of antigento the target cells by both endocytosis as well as mem-brane fusion, thus helping in the activation of both CD4(+)and CD8(+) T cells. A protective response associated withTh1/Th2 polarization in favor of type-1 cytokines such asIFN-γ and IL-2 and high stimulation of specific IgG l andIgG 2a isotype responses was observed; the animals suc-cessfully cleared the fungal burden in vital organs, and thesurvival rate of immunized animals was increased [149].

The adjuvant effect of PLGAs can be further enhancedby their coadministration with additional adjuvants [150].

Conclusions and perspectives

Here, we discussed numerous reports that have experimen-tally demonstrated that modulating the host antifungal im-mune response for prophylactic and treatment of differentforms of mycoses is possible. The immune response requiredto control fungal growth is delicately balanced to minimizetissue damage associated with the immune response, andthis balance varies with each fungal pathogen and site ofinfection [6]. To achieve a protective and nontoxic vaccine,

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the correct selection of the antigen–adjuvant combinationin conjunction with the immunopathology of the specificfungi is necessary.

For a long time, the search for and development of ad-juvants had been empirical. However, in the last 15 years,improved knowledge of the mechanisms of activation ofinnate immunity and their connection with adaptive immu-nity [36,79,151,152] have fostered improved results, andnew adjuvants have been incorporated into human vaccines(Table 3) [9,17,153]. The increased knowledge of TLR bi-ology has favored the development of new TLR-dependentadjuvant candidates, although more studies must be per-formed on polymorphisms in TLR receptors to accountfor variations in vaccine efficacy [36,154]. Additionally,the discovery of TLR-independent activation pathways, es-pecially those associated with the NLRP3 inflammasomecomplex, aid in the understanding of mechanisms of othermany adjuvants such as alum, which has been used empir-ically since 1926 [20,78,155]. Other important recent dis-coveries regarding memory of innate immunity (also calledtrained immunity) [156,157] can be relevant for the futurerational design of adjuvanted vaccines [158,159].

Regarding antifungal vaccines, several aspects are be-ing considered for the rational design of future vaccines.A major challenge is the elucidation of what constitutesprotective immunity against the different pathogenic fungiand how to efficiently elicit the adaptive immune responsewith minimal reactogenicity. Undoubtedly, one of the moreimportant factors for success in the endeavor to develop fu-ture vaccines is the educated selection of adjuvants that candrive the immune response toward the desired protectiveresponse for each fungus [10].

Regarding prophylactic vaccines, antiviral and antibac-terial vaccines are administered widely, whereas fungalvaccine prophylaxis is performed according to risk crite-ria. For example, fungal vaccines might be used in peopleoccupationally exposed to pathogenic fungus, close fam-ily of patients with systemic mycoses, before long-lastingand high doses of immunosuppression therapy, and be-fore organs transplants. [2]. Prophylactic vaccines mightalso be used to immunize animals with the capacity totransmit some fungal diseases to humans in certain geo-graphic areas, for example, sporotricoses in areas with highprevalence.

To develop therapeutic antifungal vaccines, it is neces-sary to consider that patients with systemic mycoses are of-ten severely immunocompromised, and a number of factorscould influence the host’s response to antifungal drug ther-apy adversely, including relapsed/refractory hematologicalmalignancy, granulocytopenia, myeloablative antineoplas-tic chemotherapy, high-risk allogeneic hematopoietic trans-plantation, the use of high-dose immunosuppressive agents

and systemic corticosteroids, which can result in a poorresponse to antifungal therapy [160]. Although therapeu-tic antifungal vaccines have still not been used clinically,assessing these risk factors before applying these vaccinesin patients with all of these associated factors is logical.On the other hand, various adoptive therapies using hy-perimmune serum, monoclonal antibodies, cytokines, andcell-based immunotherapy seem to be better options forcritical patients suffering from invasive fungal infections[12,132,161,162].

As was reviewed here, different adjuvants have beentested under different experimental conditions. These stud-ies have helped us to understand the mechanisms of immuneantifungal defense and to address proposals for future vac-cines candidates. However, if the aim is to quickly developa vaccine for clinical use, the early, correct selection of theadjuvants for the formulation is a very important decision.Adjuvants are considered an integral part of the finishedvaccine product by regulatory agencies. Consequently, theyare not licensed per se, including those that were used withco-administered antigens. Fortunately, in recent years, thesurvey of adjuvants licensed in human clinical trials for spe-cific vaccines has been expanded (Table 3). This offers newopportunities to select better products or, alternatively, todesign novel formulations with compositions comparableto those of recognized adjuvants. These previous experi-ences are important because they increase the likelihood ofacceptance for clinical use from the regulatory viewpoint.

If the objective is a human preventative vaccine, we mustbegin evaluating adjuvants that have already been used inother human vaccines [9]. Despite several recent concernsabout possible risks associated with its clinical use [163–166], alum is still the gold standard for the evaluation ofnew adjuvants for human use, while considering the rec-ommendations to reduce its toxicity [167]. Alum has beenevaluated in various antifungal vaccines, with variable butgenerally acceptable results. Other adjuvants acceptable forhuman use that have been evaluated with antifungal vac-cines include MPL, virosomes, and MF59, while others suchas calcium phosphate, AS03, AS04, and RC529 have notbeen explored to date. For veterinary vaccines, the selectioncriteria are more flexible, and a wide spectrum of availableadjuvants can be used [168]. In this regard, a real problemcurrently is the limited commercial use of many adjuvantsdue to patent rights. Most vaccine companies develop theirown adjuvant formulations and keep the proprietary of thepatented product only with few vaccine products of theirinterest. Consequently, this limits the development of theadjuvant for other vaccine applications [9,169].

Because almost all systemic mycoses enter the hostvia mucosal surfaces (eg, upper respiratory, gastrointesti-nal, vaginal, or urinary tracts), the induction of mucosal

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immune responses (ie, secretory IgA) is an exciting line ofdevelopment in the search for adjuvants for mucosal im-munization (oral, intranasal, and others routes), allowingthe appropriate delivery of the antigen to the mucosal as-sociated lymphoid tissue. This approach is safer, cheaper,and more feasible and would greatly simplify rapid mas-sive vaccination. However, a major obstacle in the devel-opment of an effective mucosal vaccine is the requirementof breaching the mucosal epithelial barrier, presenting theantigen efficiently to the mucosal immune system, and over-coming natural tolerance at mucosal surfaces. In fact, theadequate selection of adjuvants and delivery systems is crit-ical to obtain optimal protective mucosal immune response[170–172].

Another interesting field of research is the developmentof a broadly protective “universal vaccine” to provide pro-tection against the most widespread fungal infections us-ing common antigens, e.g., HSP60 and β-glucan, raisingthe possibility of achieving cross-protective immunizationagainst several fungi with a single antigenic formulation[4,128]. However, several potential limitations to universalvaccines exist, such as balancing the dominance of antigenicdeterminants without excessive inflammation and carefullydissecting beneficial host immunity from harmful responses.In addition, these broadly specific immune responses couldcause the excessive elimination of commensal microorgan-isms, affecting the local control of other pathogens [173].The use of potent, well-selected adjuvants and delivery sys-tems would permit the modulation of the immune responsetoward the desired function [10].

Here, we reviewed the more relevant results obtainedwith different adjuvants in experimental antifungal vac-cines. This review can serve as a valuable reference forresearchers who are working in this promising field. Theselection and rational development of new adjuvants anddelivery systems for antifungal vaccines demand special at-tention and is undoubtedly an important factor of successin the balancing the efficacy and toxicity of a final producttoday.

Acknowledgments

This work was supported by the Program of Biosciences and Biotech-nology Applied to Pharmacy at the Faculty of Pharmaceutical Sci-ences, Universidade Estadual Paulista Julio Mesquita Filho (UNESP)Araraquara, SP, Brazil, and the PVE-CAPES program. The authorsare grateful for the support granted by the UNESP and the Pro-grama de Apoio a Estudantes Estrangeiros/Associacao UniversitariaIberoamericana de Pos-graduacao /Pro-Reitoria de Pos-Graduacaoda UNESP (PAEDEX/AUIP/PROPG) for the preparation of thismanuscript.

Declaration of interest

The authors report no conflicts of interest. The authors alone areresponsible for the content and the writing of the paper.

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Immunobiology

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cell wall protein-based vaccine candidate induce protectivemmune response against Sporothrix schenckii infection

eivys Leandro Portuondo a, Alexander Batista-Duharte b, Lucas Souza Ferreira a,amiana Téllez Martínez a, Marisa Campos Polesi a, Roberta Aparecida Duarte a,na Carolina Alves de Paula e Silva a, Caroline Maria Marcos a,na Marisa Fusco de Almeida a, Iracilda Zeppone Carlos a,∗

Department of Clinical Analysis, Araraquara’s School of Pharmaceutical Sciences, Universidade Estadual Paulista-UNESP, Júlio Mesquita Filho, Ruaxpedicionários do Brasil, 1621, Postal Code: 14801-902, Araraquara, SP, BrazilImmunotoxicology Laboratory, Toxicology and Biomedicine Center (TOXIMED), Medical Science University, Autopista Nacional Km. 1 1/2CP 90400, AP033 Santiago de Cuba, Cuba

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eywords:porothrix schenckiiporotrichosismmunogenicityluminumdjuvantaccine

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Sporotrichosis is a subcutaneous mycosis caused by several closely related thermo-dimorphic fungi ofthe Sporothrix schenckii species complex, affecting humans and other mammals. In the last few years,new strategies have been proposed for controlling sporotrichosis owning to concerns about its growingincidence in humans, cats, and dogs in Brazil, as well as the toxicity and limited efficacy of conventionalantifungal drugs. In this study, we assessed the immunogenicity and protective properties of two alu-minum hydroxide (AH)-adsorbed S. schenckii cell wall protein (ssCWP)-based vaccine formulations in amouse model of systemic S. schenckii infection. Fractioning by SDS-PAGE revealed nine protein bands,two of which were functionally characterized: a 44 kDa peptide hydrolase and a 47 kDa enolase, whichwas predicted to be an adhesin. Sera from immunized mice recognized the 47 kDa enolase and anotherunidentified 71 kDa protein, whereas serum from S. schenckii-infected mice recognized both these pro-teins plus another unidentified 9.4 kDa protein. Furthermore, opsonization with the anti-ssCWP sera ledto markedly increased phagocytosis and was able to strongly inhibit the fungus’ adhesion to fibroblasts.
Immunization with the higher-dose AH-adjuvanted formulation led to increased ex vivo release of IL-12,IFN-�, IL-4, and IL-17, whereas only IL-12 and IFN-� were induced by the higher-dose non-adjuvantedformulation. Lastly, passive transference of the higher-dose AH-adjuvanted formulation’s anti-ssCWPserum was able to afford in vivo protection in a subsequent challenge with S. schenckii, becoming a viable
ther t
vaccine candidate for fur
Please cite this article in press as: Portuondo, D.L., et al., A cell wall protagainst Sporothrix schenckii infection. Immunobiology (2015), http://d

Abbreviations: ssCWP, S. schenckii cell wall protein; AH, aluminum hydroxide;p70, glycoprotein of 70 kD; PMSF, phenylmethyl sulfonyl fluoride; EDTA, Ethylene-iamine tetraacetic acid; BCA, bicinchoninic acid; DTT, dithiothreitol; FA, formiccid; ACN, acetonitrile; FBS, fetal bovine serum; NIS, serum from non-immunizedice; IS, serum from S. schenckii-infected mice; MFI, median fluorescence intensity;

DCC, antibody-dependent cellular cytotoxicity.∗ Corresponding author: Department of Biosciences and Biotechnology Applied toharmacy, Araraquara’s School of Pharmaceutical Sciences, Universidade Estadualaulista−UNESP,Júlio Mesquita Filho, Rua Expedicionários do Brasil, 1621, Postalode: 14801–902, Araraquara, SP, Brazil. Fax: +55 16 3332 0880.

E-mail addresses: [email protected] (D.L. Portuondo),[email protected] (A. Batista-Duharte),[email protected] (L.S. Ferreira), [email protected]. Martínez), [email protected] (M.C. Polesi), [email protected]. Duarte), ana [email protected] (A.C.A. de Paula e Silva),

ttp://dx.doi.org/10.1016/j.imbio.2015.10.005171-2985/© 2015 Published by Elsevier GmbH.

esting.© 2015 Published by Elsevier GmbH.

1. Introduction

Diseases caused by opportunistic fungi are an increasinghealth problem, especially for immunocompromised individu-als. Sporotrichosis, also known as “rose gardener’s disease”, is asubcutaneous mycosis caused by several closely related thermo-dimorphic fungi of the Sporothrix schenckii species complex,including Sporothrix brasiliensis, Sporothrix globosa, Sporothrix mex-icana, Sporothrix luriei and S. schenckii sensu stricto (Oliveira et al.,

ein-based vaccine candidate induce protective immune responsex.doi.org/10.1016/j.imbio.2015.10.005

2014). The disease is commonly found in tropical and subtropi-cal regions, but isolated cases and outbreaks have been reportedworldwide (Rodrigues et al., 2013). S. schenckii is a ubiquitous envi-

marcos [email protected] (C.M. Marcos), [email protected](A.M.F.d. Almeida), [email protected] (I.Z. Carlos).

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http://www.sciencedirect.com/science/journal/01712985

http://www.elsevier.com/locate/imbio











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ARTICLEMBIO-51408; No. of Pages 10

D.L. Portuondo et al. / Imm

onmental saprophyte that can be isolated from soil and plantebris, normally causing infection by its traumatic inoculation fromontaminated material (Barros et al., 2011). In Brazil, sporotrichosisas become an important zoonosis, with cats being the main sourcef infection and transmitting agent to humans and other animalsRodrigues et al., 2013). Cat-transmitted sporotrichosis represents1% of all cases of human sporotrichosis in Brazil (Freitas et al.,010), which in great part due to the presence of a large num-er of viable yeasts on the surface of feline ulcerated lesions ory inoculation of the fungus following cat scratches (Cruz, 2013).porotrichosis’ most frequent clinical manifestations are the local-zed or regional lymphocutaneous forms, while the disseminatedorm has been mainly reported among immunocompromised indi-iduals (Barros et al., 2011).

The usual sporotrichosis treatment requires long periods of anti-ungal drug administration accompanied by frequent relapses inmmunocompromised patients (Kauffman et al., 2007). This ther-py is often associated with sometimes severe adverse effectsnd frequent fungal resistance (Rodrigues et al., 2014). Therefore,accination has been proposed as a viable alternative for both ther-peutic and prophylactic purposes (Almeida, 2012; Lacerda et al.,011). For decades, a variety of cell wall proteins (CWPs) from manyifferent pathogenic fungi have been evaluated in mouse modelsf vaccination for assessment of their immunogenicity, safety androtection-affording potential (Edwards, 2012). Several authorsave reported the development of a specific immune responsend increased resistance to subsequent infection following either

previous infection or active immunization with S. schenckii CWPsssCWPs) or whole cells (Charoenvit and Taylor, 1979; Tachibanat al., 1999).

Studies performed in our lab have shown that immunizationith dendritic cells stimulated with S. schenckii yeasts or their

xoantigen was able to induce a Th1 and Th17 mixed responsen vitro(Verdan et al., 2012), the latter of which has been since asso-iated with control of the S. schenckii infection in vivo (Ferreira et al.,015). Also, Nascimento and Almeida (2005) reported induction of apecific humoral response against the 70 kDa glycoprotein (gp70),

key immunodominant antigen of the S. schenckii cell wall, in aouse model of infection. This antigen’s relevance was confirmed

y studies in which transference of anti-gp70 mAbs was able to con-ey protection against highly virulent S. schenckii and S. brasiliensistrains, thus providing definitive evidence for the role of antibodiesn the protective immunity against S. schenckii (de Almeida et al.,015). Although very few clinical trials have been performed inumans, a growing number of antifungal vaccine candidates areeing evaluated in preclinical studies, as part of the renewed inter-st in the potential use of vaccines, replacing or associated withhemotherapy, to reduce antifungal drugs use and consequentlyimit drug resistance and toxicity (Portuondo et al., 2015).

In this study, we assessed the immunogenicity and protectiveroperties of two AH-adsorbed ssCWP-based vaccine formulations

n a mouse model of systemic S. schenckii infection. Our resultshowed the vaccine formulations to be immunogenic and able toromote protection-affording antibody production upon immu-ization.

. Materials and methods

.1. Animals

Male 5–7 week-old BALB/c mice were purchased from “Cen-


ro Multidisciplinar para Investigac ão Biológica na Área da Ciênciae Animais de Laboratório” (CEMIB), UNICAMP University (Brazil)nd maintained under standard laboratory care as previouslyescribed (Goncalves et al., 2015). This work was approved by the

PRESSology xxx (2015) xxx–xxx

Institutional Ethics Committee for Animal Use in Research (Proto-col CEUA/FCF/CAR no. 30/2012) and was in accordance with theNational Institutes of Health Animal Care guidelines.

2.2. Microorganism and culture conditions

S. schenckii ATCC 16345 was kindly provided by the OswaldoCruz Foundation, Rio de Janeiro, Brazil. The isolate was maintainedby regular passage in mice and grown on MycoselTM (BD Bio-sciences) agar tubes at 25 ◦C. Mycelial-to-yeast phase conversionwas accomplished as previously described (Ferreira et al., 2015).

2.3. Extraction of the ssCWPs

Extraction of the ssCWPs was performed as previously described(Castro et al., 2013), with minor modifications. Briefly, yeast cellscollected from logarithmically growing cultures were incubatedwith the dithiothreitol (DTT)-based protein extraction buffer (2 mMDTT, 1 mM phenylmethyl sulfonyl fluoride, and 5 mM EDTA inThis/HCl buffer) for 2 h at 4 ◦C under mild agitation. The ssCWP-containing supernatant was collected, dialyzed against distilledwater, filtered through a 0.22 �m nitrocellulose membrane (Mil-lipore) and then concentrated using the Amicon Ultra 15 MWCOconcentrator (Millipore). The proteins were then precipitated byovernight incubation with 10% (w/v) trichloroacetic acid in acetoneat 4 ◦C and the resulting pellets were washed in ice-cold acetone,dried in a SpeedVac® and reconstituted in phosphate bufferedsaline, pH 7.2–7.4 (hereafter referred to as PBS only). Protein con-centration was measured by the BCA assay (Pierce).

2.4. Yeast viability assay

The effect of DTT protein extraction on S. schenckii’s viabilitywas assessed using the LIVE/DEAD® yeast viability kit (MolecularProbes) in accordance with the manufacturer’s instructions. LiveDTT-untreated or heat-killed S. schenckii yeasts were used as thenegative or positive controls, respectively. Samples were visualizedon the BH50 fluorescence microscope (Olympus) using the fluores-cein and DAPI filters for the FUN1 and Calcofluor White M2R stains,respectively.

2.5. One-dimensional sodium dodecyl sulfate-polycrylamide gelelectrophoresis (SDS-PAGE) and MALDI-TOF mass spectrometryanalysis

Samples containing 50 �g of the ssCWPs were separated by SDS-PAGE (10%) as described by Laemmli (1970). Protein spots excisedfrom silver-stained gels were reduced, alkylated, and subjected totryptic digestion with trypsin (Promega). Next, tryptic peptideswere extracted and submitted to mass spectrometry (MS) analy-sis; results were collected with the AB Sciex Maldi TOF/TOF seriesexplorer version 4.1.0 and data was analyzed in the Protein PilotSoftware using the MASCOT search engine. The obtained sequenceswere compared to those in the SwissProt databanks (http://expasy.org/sprot). Additionally, prediction of adhesin-like proteins wasperformed using the FungalRV database.

2.6. Adsorption studies

Aluminum hydroxide (AH) gel (Invivogen) containing 10 mg/mLof Al3+ was used in the present work. The equilibrium time foradsorption of the ssCWPs on AH was determined by mixing 1 mg


of the ssCWPs with an amount of AH corresponding to 1 mg ofAL3+ to a final volume of 1 mL in PBS. The suspensions werekept under agitation on a rotary spinner at room temperature(RT) and pH 7.4 for 10–100 min. The amount of adsorbed protein

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http://expasy.org/sprot




ING ModelI

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D.L. Portuondo et al. / Imm

as determined in each time interval by subtracting the amountf protein remaining in the supernatant after adsorption fromhat initially added by the BCA assay. In order to assess proteinragmentation during adsorption, the supernatants above wereubjected to SDS-PAGE as described on item 2.5. Subsequently, thedsorption isotherm was determined by incubating a fixed 1 mgf Al3+/mL concentration with increasing protein concentrationsi.e., 0.01 mg/mL, 0.05 mg/mL, 0.1 mg/mL, 0.25 mg/mL, 0.5 mg/mL,.75 mg/mL, 1.0 mg/mL, and 1.25 mg/mL in PBS) for 40 min (theptimum adsorption time) at RT. The amount of adsorbed proteinas determined as before.

.7. Vaccine formulation and immunization protocol

AH-ssCWP formulations were prepared with 10 �g or 100 �g ofhe ssCWPs formulated with an AH equivalent of 100 �g of AL3+

termed AH+CWP10 and AH + CWP100, respectively) as describedn item 2.6, using an adsorption time of 40 min. Groups of 5 BALB/cice were subcutaneously (s.c.) immunized twice in a 2-week

nterval (at days 0 and 14) with AH+CWP10 or AH+CWP100, or with0 �g or 100 �g of the ssCWPs alone in PBS (termed CWP10 andWP100, respectively), or with PBS alone as the negative control.ne week after the second immunization, mice were euthanized in

CO2 chamber and bled by heart puncture. The resulting sera wereeat-inactivated at 56 ◦C for 30 min, aliquoted and stored at -20 ◦Cntil use.

.8. Cytokine induction assay

Thioglycollate-elicited peritoneal macrophages and totalplenocytes were harvested from mice immunized as describedn item 2.7, prepared in RPMI-1640 complete medium (RPMIc;efined as the base RPMI-1640 medium containing 0.02 mM�-mercaptoethanol, 100 U/mL penicillin, 100 U/mL streptomycin,

mM l-glutamine, and 5% fetal bovine serum [FBS]) as describedlsewhere (Goncalves et al., 2015) and cultured for 24 h at 37 ◦Cnd 5% CO2 in the presence of the ssCWPs. Final concentrationsere 2.5 × 106 cells/mL and 40 �g of ssCWPs/mL in RPMIc; con-

anavalin A (0.25 �g/mL) or E. coli O111B lipopolysaccharide10 �g/mL) were used as positive controls for the macrophages’r splenocytes’ cultures, respectively; RPMIc alone was used ashe negative control. The following supernatant-accumulatedytokines were measured by ELISA (eBioscience) according to theanufacturer’s instructions: IL-12, IFN-�, IL-4, and IL-17.

.9. Quantification of ssCWP-specific IgG, IgG1, and IgG2a byLISA

Quantification of serum ssCWP-specific IgG, IgG1 and IgG2a wasarried out by ELISA. Briefly, 96-well ELISA plates (Costar) wereoated with 100 �L/well of a 40 �g/mL ssCWP solution in 0.1 Micarbonate buffer, pH 9.6 and incubated overnight at 4 ◦C. Thelate was washed in PBS containing 0.1% Tween 20 (washing buffer)nd then blocked with PBS containing 10% FBS (blocking buffer)t 37 ◦C for 1 h. Next, dilutions of the anti-ssCWP sera in block-ng buffer were added to each well and incubated at 37 ◦C for 1 hs before. After washing once with washing buffer, 100 �l/well oferoxidase-conjugated anti-mouse IgG (1/500) (Sigma) in blockinguffer was added and incubated again at 37 ◦C for 1 h. Alternatively,or determination of the IgG1 and IgG2a subclasses, ELISA platesoated as before were first incubated with an unconjugated rabbit


nti-mouse IgG1 or IgG2a (Bio-Rad) at 37 ◦C for 1 h and then with aeroxidase-conjugated goat anti-rabbit IgG (Sigma) overnight at◦C. After exhaustive washes, the reaction was developed with

etramethylbenzidine during 30 min at RT and then stopped with

PRESSology xxx (2015) xxx–xxx 3

50 �L/well of 1 N H2SO4. Absorbance was read at 450 nm (Multiskanascent, Labsystem).

2.10. Flow cytometry

A 100 �L suspension containing 106 S. schenckii yeasts wereincubated for 1 h at 37 ◦C with the various anti-ssCWP sera, or withserum from S. schenckii-infected mice (IS), all in a 1/20 dilution.Serum from non-immunized mice (NIS) was used as a non-specificbinding control. Yeast suspensions were washed, resuspended in100 �L of PBS and then incubated for 1 h at 37 ◦C with a FITC-conjugated rabbit anti-mouse IgG antibody (Sigma–Aldrich) in a1/50 dilution. After washing, samples were acquired with the BDAccuri C6 flow cytometer (BD Biosciences). The acquisition thresh-old was set to 50,000 on FSC-H for debri exclusion and at least60,000 events were effectively included in each analysis. Bindingof serum antibodies to the yeasts’ cell surface was assessed throughthe median fluorescence intensity (MFI) on the FL1 channel usingthe flow cytometer’s proprietary software.

2.11. Immunoblotting

SDS-PAGE-fractionated proteins were transferred to a nitrocel-lulose membrane overnight at 4 ◦C. Next, the membrane-cut stripswere saturated with 5% dried skim milk in PBS for 4 h at 37 ◦C.After washing with PBS, each strip was incubated overnight at RTwith the various anti-ssCWP sera or with NIS as negative control.A secondary peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG antibody,diluted 1/500, was added after further washing, and immunoreac-tive proteins were visualized by adding 3,3′-diaminobenzidine plushydrogen peroxide.

2.12. Yeast opsonization

S. schenckii yeasts were opsonized for 1 h at 37 ◦C with a poolof the various anti-ssCWP sera, or with NIS as the negative con-trol, all in a 1/100 dilution. After exhaustive washes with PBS toremove unbound antibodies, yeast suspensions were adjusted to4 × 107/mL or 2.5 × 107/mL in PBS for use in the opsonophagocyto-sis or fungus-fibroblast adhesion-inhibiting assays, respectively.

2.13. Opsonophagocytosis assay

The opsonophagocytosis assay was based on a modification of apreviously described method (Negrini et al., 2013). Thioglycollate-elicited peritoneal macrophages were adjusted to 5 × 106 cells/mLin RPMIc and then plated (500 �L/well) in a 1.8 cm2/well LabTek®

slide (Nunc) and incubated overnight at 37 ◦C and 5% CO2. Afterdiscarding the supernatant, adherent cells were washed once withPBS and incubated with opsonized (as on item 2.12) or PBS-treated2 × 107 S. schenckii yeasts in 500 �L of PBS for 2 h at 37 ◦C. The slideswere stained with Giemsa and 200 macrophages were counted onan optical microscope under 100× magnification to determine thephagocytic index (PI), calculated as the percentage of phagocytos-ing cells multiplied by the mean number of internalized yeasts.

2.14. Inhibition of fungal adhesion to fibroblasts

A previously published adhesion assay (Mendes-Giannini et al.,2004) was adapted to determine whether immunization-inducedantibodies were able to inhibit fungal adhesion to fibroblasts.Briefly, mouse L929 fibroblasts were adjusted at 2.5 × 105 cells/mL


in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) and cultured in6-well plates with square coverslips-covered bottoms, at 37 ◦C for24 h. Next, opsonized (as on item 2.12) or PBS-treated 2.5 × 107

yeasts were added to each well in a 1:100 fibroblast-to-yeast ratio

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ig. 1. Yeast viability and cell wall integrity were not affected by extraction of the sswhite arrows). (B and C) FUN1®-stained yeast cells showing the orange intravacurofile of the DTT-extracted ssCWPs. Protein bands were visualized by silver stainin

nd incubated at 37 ◦C for 3 h. After discarding the supernatants,he coverslips-adhered cells were washed with PBS, fixed with

ethanol, and then stained with crystal violet. A total of 500broblasts were counted on an optical microscope under 100×agnification to determine the adhesion index, calculated as the

ercentage of fibroblasts containing attached yeasts multiplied byhe mean number of attached yeasts per fibroblast.

.15. Passive transference

Groups of 7 mice were intraperitoneally (i.p.) injected with00 �L of a 1/2 dilution of the CWP100 or AH + CWP100 sera inBS, or with NIS or PBS alone as negative controls two hours prioro infection with 106 S. schenckii yeasts in 200 �L of PBS through the.p. route. Protection was assessed by determining the number ofolony forming units (CFUs) recovered from mice’s spleen and livern day 5 post-infection, when the peak of systemic fungal burden

s expected to occur in this model (Ferreira et al., 2015). This wasone by plating an adequate dilution of the organs’ macerate onycoselTM agar plates. CFUs were counted after 3-day incubation

t RT.

.16. Statistical analysis


Data were analyzed in GraphPad Prism 5 using one-way analysisf variance (ANOVA) and the Tukey–Kramer method for compar-

son between groups. Confidence interval was set at 95% for allests.

with DTT. (A) Calcofluor white-stained S. schenckii yeast showing cell wall integrityuorescence (white arrows) before (B) and after (C) DTT treatment. (D) SDS-PAGEe 1: molecular weight standard. Lane 2: protein extract.

3. Results

3.1. SDS-PAGE profile and identification of the ssCWPs byMALDI-TOF/TOF

Extraction with DTT did not affect the yeasts’ integrity, asrevealed by the presence of an orange fluorescence characteris-tic of live cells when using the LIVE/DEAD® yeast viability kit, thusyielding an extract predominantly composed of proteins from theyeasts’ cell wall (Fig. 1A–C). Fractioning by SDS-PAGE revealednine bands ranging from 15 kDa and 130 kDa (Fig. 1D). MALDI-TOF/TOF mass spectrometry analysis showed, according to theSwissProt databanks, two functionally-characterized proteins: Apeptide hydrolase from S. schenckii ATCC 58,251 and an enolasefrom S. schenckii ATCC 58,251, S. schenckii 1099-18 and S. brasiliensisATCC 5110, with MWs of 44 kDa and 47 kDa, respectively (Supple-mental Table 1). Among these, only enolase was predicted to be anadhesin upon submission of the protein sequences to the FungalRVdatabase.

3.2. Adsorption isotherms

Next, we determined the optimal incubation time for adsorp-tion of the ssCWPs on AH. Our results revealed that adsorption ofthe ssCWPs on AH reached equilibrium after 40 min (Fig. 2A), with


a maximum adsorptive capacity of 474.85 �g of ssCWP per mg ofAH. Also, protein fragmentation was not caused by the adsorptionprocess, as judged by the absence of additional lower MW bandswhen compared to the protein extract prior to adsorption, which

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Fig. 2. Adsorption of the ssCWPs on AH reached equilibrium after 40 min and followed a non-linear isotherm. (A) A mixture of the ssCWPs with AH was left to react for thei ption

3 respect ssCWP

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3

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3

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ndicated times. (B) SDS-PAGE profile of the ssCWPs obtained before and after adsor–9: Supernatants obtained after 10, 20, 30, 40, 60, 80, and 100 min of adsorption,

he ssCWPs were added to a fixed concentration of 1 mg/mL of Al3+. Qe (amount of

ould affect the specificity of the following antibody response and,onsequently, the immunization’s effectiveness (Fig. 2B). Further-ore, adsorption of the ssCWPs on AH increased according to the

tarting protein concentration in a complex and non-linear waynlike a Langmuir isotherm (Fig. 2C), indicating that adsorption ofhe proteins occurred in several layers on AH.

.3. Ex vivo cytokine release

Our next step was to assess the type of cytokine response trig-ered by immunization with the vaccine formulations being tested.oth IL-12 and IFN-� were induced only by the higher-dose formu-

ations (CWP100 and AH + CWP100) (Fig. 3A and B). Also, adsorptionn AH was not able to trigger induction of neither IL-12 nor IFN-�y the lower-dose non-adjuvanted formulation (CWP10), suggest-

ng that these cytokines’ initial induction is mostly dependent onhe amount of ssCWPs rather than presence of the adjuvant. On thether hand, induction of IL-4 and IL-17 is, at least partially, depen-ent on AH, as treatment with both AH-adjuvanted, but not theon-adjuvanted formulations, was able to increase these cytokines’x vivo release (Fig. 3C and D). Furthermore, contrary to the induc-ion of IL-12 and IFN-�, the amount of ss CWPs does not seem tolay a role in the AH-adjuvanted formulations’ ability to induce

L-4 or IL-17, given these cytokines’ similar release by cells fromH + CWP10- and AH + CWP100-immunized animals.

.4. Antibody induction and immunoreactivity of sera

One of the key features of any vaccine formulation is its abilityo induce an antigen-specific antibody response against the desiredarget. As shown here, immunization with all formulations was


ble to induce production of ssCWP-specific total IgG and IgG1ntibodies, whereas only the two AH-adjuvanted formulations,lthough only slightly in the case of AH + CWP10, led to IgG2a anti-ody production (Fig. 4A–C). Furthermore, flow cytometry analysis

on AH. Lane 1: molecular weight standard. Lane 2: ssCWPs before adsorption. Lanestively. (C) Adsorption isotherm of the ssCWPs on AH. Increasing concentrations ofs adsorbed (�g) per mg of AH at equilibrium). Ce (equilibrium concentration).

showed that the ssCWP-specific antibodies present in all sera wereable to bind non-permeabilized S. schenckii yeasts, providing fur-ther confirmation of the DTT-extracted proteins’ cell surface origin(Fig. 4D–F). It is noteworthy that the amount of anti-ssCWP anti-bodies present in serum from AH + CWP100-immunized mice wassimilar to that obtained by the actual infection, as measured bytheir median fluorescence intensity (MFI), highlighting this formu-lation’s efficiency in triggering antibody production. Additionally,we sought to determine which proteins, among the numerousones present in our ssCWP extract, were being recognized byimmunoblotting the anti-ssCWP sera against the ssCWP’s one-dimensional SDS-PAGE product. Sera from CWP100-, AH + CWP10-,and AH + CWP100-immunized mice recognized the 47 kDa enolaseband and another unidentified 71 kDa protein, whereas serumfrom S. schenckii-infected mice recognized both these proteinsplus another unidentified 9.4 kDa protein. However, serum fromCWP10-immunized mice was not able to detect any of the testedproteins (Fig. 4H). In the future, determining these immunodomi-nant proteins’ role in the establishment of the S. schenckii infectionwill allow development of a specifically-targeted, homogenous, andlarge-scale production-suitable recombinant vaccine.

3.5. Opsonophagocytosis and adhesion assays

Effective fungal vaccines are generally able to induce antibod-ies that promote phagocytosis and inhibit the fungus’ adhesiononto host cells. In light of this, we assessed the ability of peritonealmacrophages obtained from previously immunized mice to phago-cytose S. schenckii yeasts in the presence or absence of opsonizationby the various anti-ssCWP sera. In the absence of opsonization,phagocytosis was extremely rare across all groups (Fig. 5A and B).


By contrast, phagocytosis was markedly increased when the yeastswere previously opsonized with any of the sera, and particularlyhigh when using the AH + CWP100 serum (Fig. 5C and D). Whenassessed for their yeast-fibroblast adhesion-inhibiting ability, all

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Fig. 3. Immunization with AH+CWP100 was able to induce a mixed Th1/Th2/Th17 cytokine profile in mice. Thioglycollate-elicited peritoneal macrophages and total spleno-cytes were harvested from immunized mice and cultured in the presence of the ssCWPs. Supernatant-accumulated cytokines were measured by ELISA. (A) Ex vivo release ofI splene ey’s ms

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3

bptPsetcr(

4

cicevopes

L-12 by peritoneal macrophages. (B–D) Ex vivo release of INF-�, IL-4, and IL-17 byxperiments. Statistical significance was determined by one-way ANOVA using Tukignificant differences between treatments (p < 0.05).

nti-ssCWP sera, but especially the two AH-adjuvanted sera andhe AH + CWP100 serum in particular, showed significant inhibitoryctivity (Fig. 5E and F).

.6. Passive transference assay

Our final step was to assess whether or not the formulationseing tested were able to afford protection in vivo. Mice wereassively transferred with sera from AH + CWP100- or CWP100-reated mice and challenged with S. schenckii two hours later.rotection was assessed on day 5 post-infection, when the peak ofystemic fungal burden is expected to occur in this model (Ferreirat al., 2015). Passive transference of the AH + CWP100, but not ofhe CWP100 serum, was able to afford protection in the subsequenthallenge with S. schenckii, as shown by the reduced number of CFUsecovered from the spleen and liver of AH + CWP100-treated miceFig. 6).

. Discussion

In the last few years, new strategies have been proposed forontrolling sporotrichosis owning to concerns about its growingncidence in humans, cats, and dogs in Brazil, as well as the toxi-ity and limited efficacy of conventional antifungal drugs (Barrost al., 2011; Rodrigues et al., 2013). The search for an anti-Sporothrixaccine is a clear example of such trend. In this study, we focused


n the CWPs from S. schenckii’s yeast-phase, which is this fungus’athogenic form. We expected that, by using the same proteinxtraction method employed by Castro et al. (2013) for other S.chenckii strains, we would be able to identify the gp70 adhesin,

ocytes. Results are presented as the mean ± SD of 5 mice from one of two separateultiple comparisons test and a 95% confidence interval. Different letters represent

which is the major immunogenic component characterized to dateand a cell wall component of different species within the S. schenckiicomplex (Rodrigues et al., 2015). However, as recently shown by deAlmeida et al. (2015), this glycoprotein’s expression differ amongthe species of the S. schenckii complex, possibly reflecting theirvirulence status. We identified two other proteins instead, a pep-tide hydrolase and an enolase, the latter of which was predictedas an adhesin by the FungalRV database. Despite enolase being anenzyme of the glycolytic pathway in different organisms (Marcoset al., 2014), its presence was also shown on the cell wall of Candidaalbicans (Eroles et al., 1997), Aspergillus fumigatus (Denikus et al.,2005), and Paracoccidiodes brasiliensis (Nogueira et al., 2010), favor-ing the union of the fungi to fibronectin, laminin, and cells of theintestinal epithelium (Donofrio et al., 2009; Nogueira et al., 2010;Silva et al., 2014). Its protection-inducing potential was shown in amurine model of systemic candidiasis, where C57BL/6 mice immu-nized with recombinant enolase were effectively protected againstinfection with different C. albicans strains (Li et al., 2011). In ourstudy, recognition of this protein by sera from both immunized andS. schenckii-infected animals allows us to speculate that it could bea valuable target in future therapies against sporotrichosis.

Generally, the particulate nature of AH-adsorbed antigens facil-itates their uptake by antigen-presenting cells and thus enhancesstimulation of the immune response (Ghimire, 2015). AH’s surfaceis positively charged at the pH range normally used for vaccineformulation (pH 6.0–7.5), favoring adsorption of lower isoelectric


point (pI) proteins which are negatively charged at such range(HogenEsch, 2012). Adsorption of the ssCWPs on AH occurred inseveral layers, as indicated by the non-linear adsorption isotherm,what could be attributed to their different degrees of affinity to

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Fig. 4. Immunization with both AH-adjuvanted formulations induced production of anti-cell wall IgG1 and IgG2a antibodies. Sera collected from mice immunized withthe indicated formulations was used to quantify ssCWP-specific IgG (A), IgG1 (B), and IgG2a (C) antibodies by ELISA and also to assess each serum’s capacity to bind theS. schenckii yeast’s surface by flow cytometry (D–G). For the latter, a S. schenckii yeast suspension was previously incubated with the anti-ssCWP sera or with sera from S.schenckii-infected mice (IS). Serum from non-immunized mice (NIS) was used as a non-specific binding control. (D–F) Representative histograms for each set of comparisons.(G) Median fluorescence intensity (MFI) values for each condition. (H) SDS-PAGE profile and immunoblotting of the ssCWPs with the anti-ssCWP sera. The arrow indicatest WP1f ne-wD .05).

Astpe

he 47 kDa protein band. Lane 1: PBS. Lane 2: CWP10. Lane 3: CWP100. Lane 4: AH+Crom one of two separate experiments. Statistical significance was determined by oifferent letters represent significant differences between each pair of means (p < 0

H’s surface. Furthermore, other individual characteristics of the


sCWP extract components could also help explain the desorp-ion process occurring after 40 min, provably caused by competitiverotein exchanges owning to the interplay between van der Waalsffects, electrostatic interactions, and steric repulsions on AH’s

0. Lane 5: AH+CWP100. Lane 6: IS. Results are presented as the mean ± SD of 5 miceay ANOVA using Tukey’s multiple comparisons test and a 95% confidence interval.

surface in a short-time interval (Lindblad and Schonberg, 2010;


Matheis et al., 2001). Moreover, the degree of ssCWPs adsorptionon AH had both qualitative and quantitative effects in the enhance-ment and modulation of the immune response, as seen by thechanges in antibody production and cytokine profile resulting from

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Fig. 5. Phagocytosis-enhancing and adhesion-inhibiting properties of the anti-ssCWP sera. (A–D) Thioglycollate-elicited peritoneal macrophages collected from mice immu-nized with the indicated formulations were incubated with opsonized or PBS-treated S. schenckii yeasts at a 1:4 macrophage to yeast ratio. (A and C) Phagocytic index foropsonized or non-opsonized yeasts, as indicated. (B and D) Representative photos of the AH+CWP100 treatment group in each experiment. (E and F) Opsonized or PBS-treatedS. schenckii yeasts were transferred to fibroblast (Fb)-coated plates and incubated for 3 h. (E) Adhesion index for each indicated condition. (F) Representative photo of theP pendeT represn

itfe

nidiab

BS-treated control (PBS). Results are presented as the mean ± SD from three indeukey’s multiple comparisons test and a 95% confidence interval. Different letters

on-immunized mice.

mmunization with AH+CWP100 discussed later. Lastly, recogni-ion of two protein bands by serum from AH+CWP10-, but notrom CWP10-immunized mice, further evidences AH’s immune-nhancing effect.

For many years, the protective role of antibody-mediated immu-ity in fungal infections was controversial, whereas cell-mediated

mmunity was considered the fundamental mechanism of hostefense. However, in the last two decades, a role for antibod-


es in host defense against different pathogenic fungi (Casadevallnd Pirofski, 2012b), including S. schenckii (Almeida, 2012), haseen shown in various forms, including opsonization and inhibi-

nt experiments. Statistical significance was determined by one-way ANOVA usingent significant differences between each pair of means (p < 0.05). NIS: serum from

tion of fungus adherence onto host cells, complement activation,and antibody-dependent cellular cytotoxicity (ADCC) (Casadevalland Pirofski, 2012a). It is thus expected that an effective anti-fungal vaccine would be able to induce antibodies against thefungus’ cell wall components in order to trigger some of the above-mentioned mechanisms. Accordingly, sera from both AH-CWP10-and AH+CWP100-immunized mice strongly inhibited adhesion ofS. schenckii yeasts to fibroblasts, as well as significantly enhanced


the fungus’ uptake by macrophages in vitro.As expected, passive transference of the AH+CWP100 serum was

able to afford in vivo protection, matching the results obtained in

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Fig. 6. Assessment of protection after passive transference of the anti-ssCWP sera. Mice were inoculated with the indicated formulations, or with NIS (serum from non-immunized mice) or PBS alone as negative controls two hours prior to infection with 106 S. schenckii yeasts. Protection was assessed by determining the number of CFUsr resens ons teb

testSciihacufinab2wynoc

igpaastgamrrctt

taamo

ecovered from mice’s spleen (A) and liver (B) on day 5 post-infection. Results are pignificance was determined by one-way ANOVA using Tukey’s multiple comparisetween each pair of means (p < 0.05).

he in vitro assays. Interestingly, although the CWP100 serum wasffective in enhancing phagocytosis and inhibiting adhesion of S.chenckii yeasts to fibroblasts, its passive transference was not ableo afford protection in a subsequent challenge with S. schenckii.ince both ssCWP-specific IgG1 and IgG2a antibodies were effi-iently induced by immunization with AH+CWP100, whereasmmunization with CWP100 induced production of IgG1 antibod-es only, we thus suggest that IgG2a induction by AH+CWP100 mayave been a key factor determining this formulation’s protection-ffording capability; in mice, IgG2a antibodies participate inomplement fixation and binding to Fc� receptors in order to stim-late phagocytosis and ADCC (Perez et al., 2013). Furthermore, ourndings resemble those reported by Almeida’s group showing a sig-ificant reduction in the number of CFUs recovered from the spleennd liver of anti-gp70-treated mice when the mAb was injectedefore, during, or after the S. schenckii infection (de Almeida et al.,015; Nascimento et al., 2008); they also found that opsonizationith an anti-gp70 mAb led to increased phagocytosis of S. schenckii

easts by macrophages (Franco Dde et al., 2012). Since we couldot detect gp70 in our protein extract, it seems that targeting ofther antigens may be sufficient for enhancing phagocytosis andontrolling the S. schenckii infection.

Interestingly, immunization with AH+CWP100 led to anncreased ex vivo release of IL-12, IFN-�, IL-4, and IL-17, sug-esting a balance between Th1, Th2, and Th17 responses. Suchrofile is consistent with that reported by Hung et al. (2011). Theseuthors showed that induction of this same Th1/Th2/Th17 bal-nce on C57BL/6 mice that were immunized with an attenuatedtrain of Coccidioides posadassi was responsible for affording pro-ection in a subsequent challenge. Also, a study performed by ourroup using a murine model of systemic infection showed a bal-nce between Th1 and Th2 responses induced in an antigen-specificanner against the S. schenckii exoantigen (Maia et al., 2006). More

ecently, we showed the development of a mixed Th1 and Th17esponse in vivo, and that the latter was required for optimal fungallearance (Ferreira et al., 2015). Further studies are needed to clarifyo what extent the cytokine profile found in vitro could contributeo afford in vivo protection in a future vaccination therapy.

In conclusion, this study showed that the AH+CWP100 formula-ion is immunogenic and able to promote phagocytosis-enhancing


nd adhesion-inhibiting, as well as in vivo protection-affordingntibodies. Directly challenging vaccinated animals should pro-ote a much better protection than just the passive transference

f immune sera, as numerous vaccination-triggered cell-mediated

ted as the mean ± SD of 7 mice from one of three separate experiments. Statisticalst and a 95% confidence interval. Different letters represent significant differences

effectors, plus additional humoral immune response elements (e.g.,complement proteins, which are absent from the inactivated sera),would aid in the clearance of the S. schenckii infection. Neverthe-less, our present results suggest that the AH+CWP100 formulationis a viable vaccine candidate for further testing. Futures studieswill allow us to better evaluate our proposed vaccine candidateprotective properties in an actual immunization protocol and todetermine its effectiveness as a tool for sporotrichosis’ immuno-prophylaxis in high risk areas.

Conflicts of interest

The authors declare no commercial or financial conflict of inter-est.

Acknowledgments

The authors are grateful for the support granted by the Pro-grama de Apoio a Estudantes Estrangeiros/Associac ão UniversitáriaIberoamericana de Pós-graduacão/Pró-Reitoria de Pós-graduacãoda UNESP (PAEDEX/AUIP/PROPG). This work was supportedby grants from the The State of Sao Paulo Research Foun-dation (FAPESP) (Grant no. 2012/24187-0), Coordenac ão deAperfeic oamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), and theForeigner Visiting Professor Program (Grant no. 07610130). Noneof these funding sources had any role in the determination of thestudy design, in the collection, analysis and interpretation of data,in the writing of the report or in the decision to submit the articlefor publication.

Appendix A. Supplementary data

Supplementary data associated with this article can be found,in the online version, at http://dx.doi.org/10.1016/j.imbio.2015.10.005.

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