0

UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALFENAS

INSTITUTO DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA

CAMPUS AVANÇADO DE POÇOS DE CALDAS

KARINE CAPPUCCIO DE CASTRO

Desenvolvimento e Caracterização de um dispositivo à base de

Quitosana e Colágeno para potencial aplicação como substituto ósseo

Poços de Caldas

2015

1

KARINE CAPPUCCIO DE CASTRO

Desenvolvimento e Caracterização de um dispositivo à base de

Quitosana e Colágeno para potencial aplicação como substituto ósseo

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado

ao curso de Engenharia Química da

Universidade Federal de Alfenas, Campus

avançado de Poços de Caldas.

Orientadora: Profa. Dra. Maria Gabriela

Nogueira Campos.

Poços de Caldas-MG

2015

2

3

4

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus, que me concedeu o dom da sabedoria, para que fosse

possível a realização com êxito deste trabalho.

A minha orientadora Professora Maria Gabriela Nogueira Campos, pela amizade

durante todos esses anos, pela dedicação, orientação, confiança e conhecimento

compartilhado.

Ao Msc. Guilherme Maia Mulder Van de Graaf pela colaboração e realização dos

ensaios mecânicos.

Enfim, a todos que contribuíram direta ou indiretamente, para realização deste

trabalho.

5

RESUMO

Biopolímeros como quitosana e colágeno apresentam excelente biocompatibilidade e podem

ser utilizados na remodelação do tecido ósseo. Os substitutos ósseos devem apresentar

resistência mecânica e alta compatibilidade com tecido original. O colágeno é a proteína mais

abundante no tecido ósseo, seu uso como biomaterial é extremamente favorável devido a suas

propriedades físico-químicas. A quitosana apresenta interessantes propriedades biológicas:

biodegradabilidade e atividades hemostáticas, fungistática e antitumoral. O glutaraldeído é um

agente reticulante capaz de interligar as cadeias de quitosana e colágeno, criando uma

estrutura tridimensional que favorece o crescimento de células. Neste contexto, o objetivo

deste trabalho foi formular um dispositivo a base de quitosana, colágeno e fosfato de cálcio

para aplicação como substituto ósseo. A adição de fosfato de cálcio à rede polimérica cria um

compósito com a força e flexibilidade dos polímeros e a resistência e dureza do mineral. O

dispositivo foi caracterizado quanto às propriedades mecânicas (resistência à compressão,

deformação relativa e módulo de elasticidade); química, através da técnica de espectroscopia

na região do infravermelho (FTIR), utilizada para identificar os grupos funcionais e confirmar

a reação de reticulação; e térmicas, pelas análises termogravimétrica e de calorimetria

diferencial exploratória, a fim de verificar as temperaturas características do material e as

perdas de massa envolvidas, respectivamente. Pela análise de FTIR foi possível observar um

pico característico relativo à reticulação de quitosana e colágeno. As análises de DSC e TG

mostraram duas faixas de temperaturas relativas à perda de massa o que era esperado para este

tipo de dispositivo na faixa de varredura realizada. O ensaio mecânico de compressão

forneceu módulo de elasticidade igual a 239,25±78,37 MPa e tensão máxima de -4,33±0,95

MPa o que se compara com alguns substitutos ósseos comerciais e com dispositivos

semelhantes ao estudado.

Palavras-chave: Quitosana. Colágeno. Fosfato de Cálcio. Tecido Ósseo. Regeneração.

6

ABSTRACT

Biopolymers, such as chitosan and collagen, have excellent biocompatibility and can be used

for bone remodeling. Bone substitutes must have mechanical strength and high compatibility

with original tissue. Collagen is the most abundant protein in bone tissue and its use as

biomaterials is extremely favorable due to the physicochemical properties of collagen.

Chitosan has interesting biological properties, such as biodegradability and hemostatic,

fungistatic and antitumor activities. Glutaraldehyde is a cross-linking agent capable of linking

chitosan and collagen chains, creating a three-dimensional structure, which favors the growth

of cells. In this context, the aim of this study was to formulate a chitosan, collagen and

calcium phosphate-based device for potential application as bone substitutes. The addition of

calcium phosphate to the polymeric network creates a composite with polymer’s strength and

flexibility and mineral’s hardness. The device was characterized by mechanical properties

(compressive strength on deformation and modulus of elasticity); by chemical composition,

using spectroscopy technique (FTIR) in order to identify the functional groups and confirm

the crosslinking reaction; and by thermal behavior, using thermogravimetric and differential

scanning calorimetry analyses, in order to verify characteristics temperatures of the material

and mass losses involved, respectively. By FTIR analysis, it was possible to observe a

characteristic peak relating to the crosslinking of chitosan and collagen. DSC and TG analyses

showed two temperature ranges for the weight loss that were expected for this type of device

in the studied scanning range. Mechanical tests provided an elastic modulus equal to

239.25±78.37 MPa and maximum straining of -4.33±0.95 MPa, which are comparable to

some commercial bone substitutes and other similar studied devices found in the Literature.

Keywords: Chitosan. Collagen. Calcium Phosphate. Bone Tissue. Regeneration.

7

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO............................................................................................................. 8

2 OBJETIVOS ............................................................................................................... 11

2.1 GERAL ................................................................................................................. 11

2.2 ESPECÍFICOS....................................................................................................... 11

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................... 12

3.1 COLÁGENO ......................................................................................................... 12

3.2 QUITOSANA ........................................................................................................ 14

3.3 FOSFATO DE CÁLCIO ........................................................................................ 15

3.4 TECIDO ÓSSEO ................................................................................................... 15

3.5 PROPRIEDADE MECÂNICA DOS OSSOS ......................................................... 16

3.6 SUBSTITUTOS OSSÉOS COMUNMENTE UTILIZADOS ................................. 17

4 MATERIAIS E MÉTODOS ....................................................................................... 20

4.1 PREPARO DO DISPOSITIVO .............................................................................. 20

4.2 INFRAVERMELHO (FTIR) ................................................................................. 20

4.3 TESTE DE RESISTÊNCIA MECÂNICA .............................................................. 21

4.4 ANÁLISE TÉRMICA............................................................................................ 21

5 RESULTADOS E DISCUSSÕES ............................................................................... 22

5.1 ANÁLISE MACROSCÓPICA .............................................................................. 22

5.2 FTIR ...................................................................................................................... 22

5.3 ANÁLISE TÉRMICA............................................................................................ 24

5.4 RESISTÊNCIA MECÂNICA ................................................................................ 25

6 CONCLUSÃO ............................................................................................................. 29

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................. 30

8

1 INTRODUÇÃO

Atualmente, um dos maiores problemas da ortopedia é a perda do tecido ósseo,

causados por acidentes ou doenças. Na busca de soluções para reconstrução de tecidos ósseos

os cientistas têm utilizado de enxertos (1).

Os enxertos autólogos (aloenxertos) estão dentre os mais utilizados, uma vez que

apresentam células osteogênicas e fatores de crescimento adequados a osteogênese por serem

enxertos provenientes do próprio indivíduo. Porém esses são restritos devido às diversas

complicações provocadas no local de retirada do osso (1).

Os enxertos heterólogos (xenoenxertos) têm sido bastante utilizados, esses enxertos são

obtidos de espécies distintas, desta forma são de fácil obtenção e se apresentam em grandes

quantidades. Todavia esses enxertos podem provocar contaminação e/ou rejeição (1).

Devido às restrições provocadas pelos enxertos autólogos e heterólogos, os enxertos

homólogos (homoenxerto) têm sido utilizados, esses enxertos são obtidos de indivíduos da

mesma espécie e tem como objetivo a diminuição dos sintomas pós-operatórios da enxertia

autógena. No entanto esses enxertos podem trazer riscos como os de transmissão de doenças,

reações imunológicas e infecções (1).

Nesse sentido a busca de biomateriais, como quitosana e colágeno, para este fim tem

sido altamente estudada, pois são substâncias ou combinações de substâncias utilizadas para

melhorar ou substituir qualquer tecido, órgão ou função.

Os dois materiais mencionados acima são derivados de fontes naturais e têm

características que os tornam um atrativo na medicina regenerativa, os fatores que tornam

esses materiais especiais incluem a compatibilidade com o implante e a capacidade de ser

degradado ao longo do tempo. O Colágeno do tipo I é a principal proteína estrutural de muitos

tecidos e contém uma variedade de locais bioativos que promovem a ligação de células e

regulam a diferenciação celular (2).

A quitosana tem sido explorada por causa da sua elevada adesividade e de suas

propriedades antibacterianas. O compósito destes materiais foi explorado porque eles

oferecem a oportunidade de integrar os benefícios de cada componente, aumentando a rigidez

mecânica de andaimes e induzindo a diferenciação osteogênica de células estaminais da

medula óssea, relativa a qualquer componente puro (2).

Desta forma a utilização da quitosana como biomaterial se justifica devido às suas

diversas propriedades, dentre elas destacam-se a biocompatibilidade e biodegrabilidade. O

uso do colágeno por sua vez se torna bastante pertinente para regeneração óssea, visto que o

9

tecido conjuntivo possui em torno de 85% de colágeno, o que favorece o desempenho dos

compósitos utilizados para correção de falhas, além de suas favoráveis propriedades. Já o

fosfato de cálcio é o componente principal do osso (hidroxiapatita), responsável

principalmente pela resistência mecânica do tecido ósseo (2).

A utilização de ácido cítrico e glucose na composição têm como objetivo aumentar a

resistência mecânica do dispositivo. Liu et al. demonstraram em seus estudos que a resistência

a compressão de dispositivos para substituição óssea aumentou devido à maior concentração

desses componentes (3). Além disso, o ácido cítrico pode oferecer maior cicatrização e

adesividade óssea e quando associado com a glucose funcionam como anticoagulante

sanguíneo (4).

A reticulação, ou seja, a ligação cruzada entre moléculas produzindo estruturas

tridimensionais com alta massa molar, também é uma alternativa para aumentar a resistência

mecânica dos materiais. De acordo com os grupos funcionais reativos disponíveis para a

reticulação, agentes reticuladores podem ser usados para unir as moléculas. Entretanto, o uso

de agentes reticuladores, que são moléculas altamente reativas, pode promover a reação de

diferentes grupos funcionais/moléculas (5). O glutaraldeído é um dialdeído saturado bastante

usado na reticulação de polímeros, devido a sua dupla funcionalidade. Na Figura 1 estão

representadas as fórmulas estruturais de todos os compostos e os grupos funcionais passíveis

de reticulação com glutaraldeído estão destacados em vermelho. Entretanto, espera-se que a

reticulação entre as cadeias de quitosana e colágeno seja favorecida, devido a reatividade dos

amino-grupos presentes em ambos polímeros.

10

Figura 1 – Possíveis interações entre os compostos e o agente reticulante.

Fonte: Autora.

11

2 OBJETIVOS

2.1 GERAL

Preparar e caracterizar um dispositivo à base de quitosana, colágeno, fosfato de cálcio,

glucose e ácido cítrico, para substituição de tecido ósseo.

2.2 ESPECÍFICOS

Reticular a quitosana e o colágeno utilizando glutaraldeído como agente reticulador;

Caracterizar o dispositivo quanto ao comportamento mecânico através de ensaio de

Tensão x Deformação;

Identificar os grupos funcionais presentes no dispositivo através da técnica de

espectroscopia na região do infravermelho;

Analisar a estabilidade térmica do dispositivo através das técnicas de calorimetria

diferencial de varredura e termogravimetria.

12

3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

O osso é um tecido altamente vascularizado e dinâmico, que tem extraordinárias

propriedades mecânicas e de capacidade de regeneração intrínseca. Nas últimas duas décadas

a engenharia de tecidos ósseos tem sido desenvolvida como um método alternativo para o

tratamento de deterioração deste tecido (6).

Este trabalho focou no uso do colágeno (a proteína mais abundante da matriz

extracelular), quitosana (um polissacarídeo natural estruturalmente semelhante aos

glicosaminoglicanos) e fosfato de cálcio que é capaz de promover a osteogênese e melhorar a

regeneração óssea através de um processo que envolve a dissolução e absorção, como

componentes principais para o desenvolvimento de matrizes com potencial aplicação como

substitutos ósseos (7).

Na produção destes sistemas compostos têm sido utilizados diferentes métodos de

reticulação, tais como a reticulação química ou física. Dentre elas, o glutaraldeído é um dos

mais utilizados agentes reticulantes para reagir os grupos –OH e –NH2 da quitosana e do

colágeno (6).

3.1 COLÁGENO

O colágeno é a proteína mais abundante em vertebrados e está presente principalmente

nos ossos, pele e tendões. Seu uso industrial é de especial interesse devido à grande

disponibilidade desta matéria-prima no Brasil, um dos grandes produtores mundiais de gado

bovino (8).

Este biomaterial, misturado ao fosfato de cálcio, é considerado com um bom substituto

ósseo, que pode ser combinado com o osso medular aspirado do local da fratura. As diferentes

organizações de fibras de colágeno (Figura 2) têm como consequência às diferentes

propriedades do tecido conjuntivo (9).

Esta proteína tem como principal finalidade a formulação de fibras insolúveis,

modulação das forças internas e externas exercidas no organismo, estrutura e orientação de

tecidos em desenvolvimento.

13

Figura 2 – Representação esquemática do arranjo das moléculas de colágeno em estruturas

fibrilares e de fibras.

Fonte: Moreira (2014) (10).

Como biomaterial o colágeno apresenta características bastante significativas, tais

como baixa irritabilidade, biodegrabilidade, biocompatibilidade, interação com plaquetas,

ativa o processo de coagulação sanguínea, promove o crescimento celular e ainda são

susceptíveis a modificações químicas, essas propriedades conferem a esse biomaterial

inúmeras aplicações.

O colágeno do tipo I vem despertando bastante interesse para engenharia de tecidos,

isso porque ele é a glicoproteína extracelular mais abundante no tecido ósseo, além de possuir

alta similaridade da sequência de aminoácidos entre as diversas espécies, alta estabilidade

conformacional e capacidade de suportar a adesão e proliferação celular (10).

Apesar das propriedades do colágeno serem favoráveis para sua utilização como

biomaterial, seu uso é limitado devido a sua baixa resistência mecânica. Dessa forma, se faz

necessário o estabelecimento de ligações cruzadas no material, tal procedimento geralmente é

realizado com o uso de glutaraldeído, porém é possível estabelecer esse tipo de ligação

através da produção de compósitos, como com a quitosana por exemplo. Neste caso, as

interações eletrostáticas são estabelecidas entre os grupos amino da quitosana e os grupos

carboxila do colágeno, o que estabiliza a estrutura do material e resulta em uma matriz com

propriedades mecânicas adequadas para utilização como ―scaffold‖ (Matriz (material poroso)

para crescimento, promove a estabilidade mecânica para a proliferação tridimensional das

células, serve como um suporte para o desenvolvimento do tecido) (11, 12).

14

3.2 QUITOSANA

A quitosana como sendo um polissacarídeo derivado da quitina é tradicionalmente

usada nos países orientais para o tratamento de queimaduras e cicatrização de feridas. A

quitosana foi isolada em 1859 pelo aquecimento da quitina em solução concentrada de

hidróxido de potássio, resultando na sua desacetilação. Pode ser encontrada naturalmente na

parede dos fungos, especialmente nas espécies do gênero Mucor. A maior fonte disponível de

quitosana é a partir da desacetilação alcalina da quitina (Figura 3) (13).

Figura 3 – Esquema da reação de desacetilação alcalina da quitina para obtenção da quitosana.

Fonte: Moreira (2014) (10).

Atualmente esse biomaterial tem sido altamente empregado na substituição do tecido

ósseo, Fakhry, Schneider, Zaharias, e Senel constataram que a quitosana apresentou maior

fixação e disseminação das células nos osteoblastos em relação aos fibroblastos. Mesmo com

os bons resultados obtidos no emprego deste material, ainda existe uma necessidade de

melhorar a sua afinidade pelo tecido ósseo e o desempenho das propriedades mecânicas (14).

A quitosana apresenta propriedades antimicrobianas e estimulantes do sistema imune,

as quais são manifestadas na aceleração de cicatrização (13). Outras propriedades que estão

presentes na quitosana incluem: inibição de células tumorais, efeito antifúngico,

imunomoduladora, estrutura cristalina altamente organizada, como comprovada por difração

de raios-X, baixa reatividade química, atividade antiácida e antiúlcera, ação hemostática,

hipocolesterolêmica e suas características físico-químicas como biodegrabilidade,

biocompatibilidade e bioatividade (9). As propriedades da quitosana dependem do seu grau de

desacetilação.

15

3.3 FOSFATO DE CÁLCIO

Fosfato de cálcio é o nome dado a um grupo de minerais que contém íons de cálcio

(Ca2+

) juntamente com ortofosfatos (PO43-

), metafosfatos ou pirofosfatos (P2O74-

) e

ocasionalmente hidrogênio ou íons de hidróxido. Sua fórmula molecular é Ca3(PO4)2.

Os ―cimentos de fosfato de cálcio‖ (CPC) são materiais constituídos por um pó e um

líquido, os quais, ao serem misturados, formam uma pasta que endurece espontaneamente à

temperatura ambiente ou corporal como resultado da precipitação de um ou vários fosfatos de

cálcio (15, 16).

As características que determinam os CPC como biomateriais atrativos para a

reconstituição ou remodelação óssea, são a facilidade de manipulação e moldagem, sem ter de

dar forma prévia ao implante, adaptando-se totalmente à forma da cavidade óssea, obtendo

um íntimo contato entre o osso e o cimento desde os primeiros estágios da implantação; não

aquecem durante o processo de endurecimento, evitando a necrose tecidual no sítio de

implantação (17, 18).

Os CPCs têm sido amplamente utilizados como substitutos ósseos em aplicações

clínicas, seu uso se tornou interessante devido a sua boa biocompatibilidade, auto-definição e

suas propriedades de osteocondução (19).

3.4 TECIDO ÓSSEO

O tecido ósseo é uma forma especializada de tecido conjuntivo, onde a matriz

extracelular é mineralizada, esse é constituído por mais de 200 ossos de tamanho, forma e

composição variáveis. Além de sua função estrutural, que dá forma e rigidez ao corpo, os

ossos são responsáveis pela proteção de órgãos vitais, como o cérebro e órgãos sensoriais;

pela fabricação de células sanguíneas, que ocorre na medula óssea vermelha situada no tecido

esponjoso e pela homeostase que ajuda manter constante o nível de cálcio no sangue. O tecido

ósseo tem uma grande capacidade de remodelação, renovando-se constantemente para

responder às necessidades metabólicas do corpo e a manutenção da estabilidade da calcemina.

Vale ressaltar que tecido ósseo é formado por células e um material intercelular

calcificado, a matriz óssea. As células são: 1) osteócitos: situados em cavidades no interior da

matriz; 2) osteoblastos: responsáveis pela produção da parte orgânica da matriz; 3)

16

osteoclastos: células gigantes multinucleadas que auxiliam na reabsorção do tecido ósseo e

que participam dos processos de remodelação dos ossos (20).

Para a criação do tecido substituto, é necessário que um pequeno número de células

seja colhido do paciente e cultivado até que atinjam um número adequado em laboratório.

Essas células são necessárias para a geração do novo tecido pela produção de matriz

extracelular, sendo responsáveis pela manutenção em longo prazo dessa matriz (20).

Em seguida, as células podem ser então expandidas num arcabouço (molde), natural

ou sintético, que forneça estabilidade mecânica em curto prazo e uma organização

tridimensional para a fabricação do tecido. Conforme sejam estabelecidos sinais e condições

adequadas, as células secretarão vários componentes da matriz extracelular possibilitando a

formação de um tecido vivo que poderá ser implantado no sítio defeituoso do paciente. A fim

de se extinguir riscos de rejeição em longo prazo, o arcabouço deve se degradar na medida em

que o tecido substituto se forme (21).

3.5 PROPRIEDADE MECÂNICA DOS OSSOS

O osso é um compósito natural poroso e denso, sua composição não homogênea e

anisotrópica fornece diferentes valores para módulos de elasticidade quando o osso é testado

em variados locais. As propriedades medidas neste tecido serão dependentes da direção

realizada, sendo assim ele apresenta um valor para o módulo no sentido transversal diferente

do valor do módulo no sentido longitudinal. Esses valores diferentes devem-se em parte, a

composição não homogênea e as fibras colágenas que formam diferentes agrupamentos

dependendo do tipo do osso (22).

A propriedade frequentemente utilizada para caracterizar o comportamento mecânico

de substitutos ósseos é resistência à compressão. Para esta aplicação é importante ter em

mente que a força de compressão do osso cortical humano varia entre 90 e 230 MPa, enquanto

que a resistência à compressão do osso esponjoso varia entre 2 e 45 MPa (23).

O módulo de elasticidade é uma grandeza representada pela razão entre a tensão e a

deformação, dentro do limite elástico. A deformação nesta região é totalmente reversível e

proporcional à tensão. O módulo de elasticidade é aplicado tanto na tração quanto na

compressão e, refere-se ao coeficiente angular do gráfico de tensão/deformação obtido no

ensaio (24).

17

A curva da Figura 4 ilustra o comportamento de um material durante o ensaio de

compressão. Esse tipo de ensaio fornece parâmetros mecânicos, tais como, módulo de

elasticidade, tensão máxima e tensão de ruptura do material em estudo.

Figura 4 – Curva Tensão x Deformação.

Fonte: Callister (2000) adaptado pela autora (24).

3.6 SUBSTITUTOS OSSÉOS COMUNMENTE UTILIZADOS

Doenças, tais como osteoporose, e traumas podem causar a perda ou fratura do tecido

ósseo. Tratamento de defeitos ósseos ainda é um desafio para os cirurgiões ortopédicos (25).

O tratamento tradicional nestas circunstâncias especiais são os enxertos ósseos (26). Embora

os auto-enxertos sejam o método padrão-ouro de substituição óssea, eles possuem algumas

desvantagens, tais como complicações no local doador e morbidade (27). Os aloenxertos têm

sido altamente utilizados no tratamento de defeitos. No entanto, as limitações de aloenxertos

incluem potencial transmissão de doenças e reabsorção/rejeição (28). Outra alternativa para a

substituição são os xenoenxertos, mas as suas limitações são semelhantes ao dos aloenxertos.

18

No entanto, além de maior taxa de rejeição, a principal preocupação dos xenoenxertos é a

transmissão de doenças zoonóticas desconhecidas a partir de animais (28, 25).

Para superar os problemas de enxertos de base biológica, enxertos sintéticos têm sido

desenvolvidos devido à sua fonte ilimitada e não transmissão de doenças (29). O enxerto deve

apoiar, reforçar e organizar o tecido a ser regenerado e interagir com componentes da matriz

extracelular, fatores de crescimento e receptores celulares (30, 31). Outras características

desejáveis de enxertos sintéticos são altos potenciais osteoindutores e angiogênicos, segurança

biológica, biodegradabilidade, propriedades mecânicas e custo razoável (29).

Polímero, cerâmica, metal e materiais compósitos têm sido extensivamente estudados

como substitutos de enxertos ósseos (32, 33, 34, 35). Mais ainda, matrizes poliméricas

biodegradáveis têm sido investigadas como substitutos ósseos temporários devido a sua

integração com o tecido em crescimento durante o processo de cicatrização (36).

Na Tabela 1, estão relacionados alguns biomateriais disponíveis comercialmente,

utilizados como substitutos ósseos.

Tabela 1 - Visão geral das propriedades mecânicas.

Grupo Produto Origem Resistência à

compressão (MPa)

Módulo de

Elasticidade (MPa)

Fosfato de Cálcio/

Hidroxiapatita

Cerabone Bovina

4,2-5,6 -

Endobon 1-20 20-3100

Pro-

Osteon Coral 2-4 -

Compósito

Bone

Source

Sintética

6,3-34 3,6-4,7

Biopex 80 -

Cementek 20 -

Calcibon 60-70 -

Calcibon 35-55 2500-3000

HydroSet 14-24 125-240

Norian

SRS 23-55 -

Fosfato Tricálcico Biosorb Sintética 15-150 -

Sulfato de Cálcio MIIG X3

Sintética 0,6 -

OsteoSet 0,6-0,9 59

Vidro Bioativo Cortross Sintética 91-179 6400

Fonte: Van Der Stok et. al. (2011) (37).

19

Martínez et. al. estudou os efeitos causados no módulo de elasticidade após uso de

diferentes agentes reticulantes e diferentes proporções de quitosana (Qui) e colágeno (Col) na

formulação de ―scaffolds”. A Tabela 2 mostra os principais resultados de módulos de

elasticidades obtidos em seu estudo (7).

Tabela 2 – Módulos de Elasticidade (MPa).

Composição

Reticulador 80Qui/20Col 50Qui/50Col 20Qui/80Col

- 0,0045±0,0003 0,0069±0,0008 0,0055±0,0002

EDAC 0,0099±0,0004 0,012±0,001 0,023±0,002

Tripolifosfato de sódio 0,020±0,002 0,0117±0,0007 0,015±0,002

Fonte: Martínez et. al. (2015) (7).

Outros autores como Przekora; Palka; Ginalska obtiveram em seus estudos ―scaffolds”

de Quitosana/Hidroxiapatita com módulo de elasticidade e força de compressão igual a 0,46

MPa e 1,23 MPa, respectivamente. ―Scaffolds” de Quitosana/Glucana/Hidroxiapatita também

foram ensaiadas e apresentaram módulo de elasticidade de 0,25 MPa e força de compressão

de 0,26 MPa (38).

Serra et. al. concluiu através de suas análises de compressão que ―scaffolds”

Quitosana/β-TCP, Quitosana/Gelatina e Quitosana/Gelatina/β-TCP apresentaram uma

resistência a compressão maior que os ―scaffolds” de quitosana, ocasionando uma melhoria

de 0,07 MPa até cerca de 0,12 MPa (6).

De acordo com a literatura os polímeros utilizados para a produção de ―scaffolds”, tal

como a quitosana, apresentam fracas propriedades mecânicas, o que limita a sua

aplicabilidade na engenharia de tecido ósseo. Para superar esta desvantagem, a adição de

fosfato de cálcio em quitosana tem sido utilizada para melhorar as propriedades mecânicas

desses dispositivos. Além disso, vários estudos têm demonstrado que, quando a quitosana é

misturada com outros polímeros, tal como o colágeno, as propriedades mecânicas são também

melhoradas (6).

Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi o estudo das propriedades mecânicas de

um dispositivo a base de quitosana, colágeno e fosfato de cálcio e seu potencial para aplicação

como substituto ósseo.

20

4 MATERIAIS E MÉTODOS

4.1 PREPARO DO DISPOSITIVO

Inicialmente os reagentes apresentados na Tabela 3 foram pesados. O procedimento

consistiu-se na homogeneização de quitosana (alto peso molecular, Sigma-Aldrich), ácido

cítrico (Sigma-Aldrich), colágeno previamente extraído do tendão bovino (CASTRO, et. al.

2014) e glucose (Sigma-Aldrich) em um almofariz. Após tal procedimento, foram

acrescentados 4g de água a 20g da mistura obtida. As proporções dos componentes nas

amostras estão descritas na Tabela 3. Posteriormente, a massa obtida foi reticulada com

glutaraldeído 25% v/v. Em seguida, foi adicionado fosfato de cálcio na proporção de 1g da

mistura obtida inicialmente para 0,6g de fosfato de cálcio.

Tabela 3 – Composição do dispositivo.

Massa (g) Volume

(mL)

Formulação Colágeno Quitosana Ac. Cítrico Glucose GA

1,0 1,0 12,5 10,0 1,0

Fonte: Autora.

A etapa sequente consistiu na moldagem e secagem do material obtido anteriormente.

Foi utilizado um molde de teflon com dimensões 12 mm de comprimento por 6 mm de

largura e as amostras foram secas a 37ºC em estufa com ventilação forçada por 24 horas

4.2 INFRAVERMELHO (FTIR)

A espectroscopia de infravermelho (espectroscopia IV) é um tipo de espectroscopia de

absorção a qual se usa a região do infravermelho do espectro eletromagnético. Todos os

componentes utilizados na preparação do dispositivo, bem como o dispositivo foram submetidos à

análise de FTIR para confirmar a reação de reticulação e a identificação dos grupos funcionais. As

amostras foram inseridas diretamente no equipamento de análise, não houve preparo prévio das

amostras para leitura. O equipamento Agilent Technlogies modelo Cary 630 do Laboratório

Multiusuário do Programa de pós-graduação em Ciência e Engenharia de Materiais do campus de

Poços de Caldas da UNIFAL-MG foi utilizado. Os espectros foram coletados de 650 a 4000 cm-1

.

21

4.3 TESTE DE RESISTÊNCIA MECÂNICA

Os ensaios biomecânicos foram realizados no Laboratório de Biomecânica do

Departamento de Cirurgia da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade

de São Paulo, seguindo a norma da ABNT NBR ISO 5833 alterada com relação à velocidade

de deslocamento para 5 mm/min (40).

Os ensaios compressivos foram realizados em máquina universal de ensaios

mecânicos KRATOS modelo KE 3000 MP dotada de célula de carga 3000 kgf. Antes da

realização de cada ensaio os valores de diâmetro e comprimentos dos corpos de provas foram

medidos com uso de paquímetro Mytutoyo modelo 530 – 104 – B10 com resolução de 0.05

mm e esses dados foram inseridos no programa da KRATOS antes do início dos ensaios.

4.4 ANÁLISE TÉRMICA

Para o estudo da estabilidade térmica do material, utilizou-se a técnica de calorimetria

exploratória diferencial (DSC), onde se mede o fluxo de calor entre a amostra e um material

termicamente inerte, enquanto ambos são submetidos a uma variação de temperatura. Este

ensaio foi realizado em um Calorímetro Diferencial de Varredura (NETZSCH - Modelo STA

449 F3Jupter). A fim de simular as condições de secagem e avaliar se alguma alteração

significativa ocorre a 37ºC que é a temperatura do corpo humano, o dispositivo foi preparado

de acordo com a metodologia descrita no item 4.1, porém a amostra foi seca somente por duas

horas antes do início da análise. Posteriormente foi feito uma isoterma a 37ºC por 2 horas e

em seguida um aquecimento a uma razão de 10°C/min na faixa de temperatura de 37 a 400°C.

Com este ensaio obteve-se também a curva de termogravimetria (TG). A análise de TG-DSC

foi feita em um cadinho de platina contendo 26mg de amostra e ensaiada em atmosfera de

nitrogênio.

22

5 RESULTADOS E DISCUSSÕES

5.1 ANÁLISE MACROSCÓPICA

O molde de teflon foi preenchido com o auxílio de uma seringa descartável e levado

para uma estufa com ventilação forçada por 24h. Os corpos de prova foram retirados do

molde com o auxílio de um pino polimérico e martelo e acondicionados em frascos de vidro.

Após a secagem os corpos de prova apresentaram uma cor amarelada com formatos

cilíndricos e de fácil manuseio. Os corpos de prova após a secagem foram apresentados na

Figura 5.

Figura 5 – Corpos de prova após a secagem por 24h a 37ºC.

Fonte: Autora.

Foi possível observar irregularidade na superfície dos dispositivos, essas

irregularidades são defeitos ocasionados no processo de moldagem e desmoldagem.

5.2 FTIR

O espectro de FTIR da amostra preparada foi apresentado na Figura 6 juntamente com

os espectros da quitosana e do colágeno.

23

Figura 6 – Espectros de FTIR do colágeno, quitosana e do dispositivo.

Fonte: Autora.

Como pode ser observado na Figura 6, o espectro do dispositivo apresentou

divergência quando comparado com os espectros dos compostos separadamente, tal fato já era

esperado uma vez que houve adição de componentes como dextrose, fosfato de cálcio e ácido

cítrico, além da posterior reticulação desses componentes. Algumas bandas características se

mantiveram, porém foi possível observar o deslocamento das mesmas.

Os picos de 1653 cm-1

encontrados na quitosana e no colágeno são característicos de

amidas primárias, este pico corresponde ao estiramento C=O, o mesmo pico foi observado no

dispositivo preparado, porém o pico foi deslocado (1689 cm-1

). Vale ressaltar que a

reticulação é caracterizada pela presença de ligações do tipo imina (C=N) formadas a partir da

reação dos grupos –OH e –NH2 de quitosana e colágeno com os grupos –C=O do

glutaraldeído, porém é provável que esta banda sobreponha-se ao grupo C=O da amida I, uma

vez que ambos absorvem na mesma região do espectro infravermelho, estes picos podem ser

observados na região circulada em verde na Figura 6 (41).

O mesmo ocorreu com os picos 1546 cm-1

do colágeno e 1564 cm-1

da quitosana, que

correspondem à deformação axial de N-H e o estiramento da ligação CN (Amida II) nesse

caso o pico do material se manteve igual ao da quitosana.

O pico de 1236 cm-1

é característico da Amida III, onde ocorre o alongamento de C-N

juntamente com a flexão de N-H e o movimento rápido de CH2.

1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000

40

60

80

100

Re

flect

an

cia

Frequencia (1/cm)

Colageno

Quitosana

Dispositivo

24

Também foi possível observar a presença da banda correspondente ao estiramento de

C-O cíclico da quitosana em 1030 cm-1

que se manteve presente também no dispositivo. A

banda de 1057 cm-1

correspondente a deformação simétrica de PO4 3-

é proveniente do fosfato

de cálcio. Finalmente a região de 840 cm-1

a 1000 cm-1

é característica dos grupos C-O e C-C

que são modos de vibração originados da dextrose.

5.3 ANÁLISE TÉRMICA

As curvas de TG-DSC do dispositivo estão apresentadas na Figura 7.

Figura 7 – Curvas de TG-DSC do dispositivo.

Fonte: Autora.

A 37ºC que é a temperatura de aplicação do dispositivo, o corpo de prova apresentou

estabilidade térmica, o material perde a água superficial que não está fortemente ligada em

sua estrutura. O mecanismo de perda de água ocorre por a transferência de calor e de massa

com o objetivo de remover grande parte da água presente no material poroso por meio de seu

transporte e evaporação em um meio gasoso que envolve o material, similarmente como

ocorre na estufa.

As curvas mostram que o dispositivo apresentou duas perdas de massa consecutivas. A

primeira perda de massa ocorreu entre 75ºC e 195ºC e a segunda ocorreu entre 200ºC e

0 50 100 150 200 250 300 350 400 450

-1,0

-0,8

-0,6

-0,4

-0,2

0,0

DSC/(mW/mg)

Mass/%

Temperatura (°C)

DS

C/(

mW

/mg

)

60

70

80

90

100

Ma

ssa

(%

)

25

230ºC, essas perdas de massas são referentes à quebra de ligações de hidrogênio inter e intra-

moleculares seguida da perda de água adsorvida na superfície do material.

Já a perda de massa gradativa no intervalo de 230ºC a 400ºC ocorreu devido à

decomposição de espécies de baixo peso molecular, à desidratação dos anéis sacarídeos,

despolimerização e decomposição da matéria orgânica (42).

Du et. al. estudou a modificação de matrizes de colágeno e quitosana reticuladas com

alginato dialdeído, as temperaturas características de perdas de massa ocorreram entre 30 e

150ºC e 250 a 500ºC. Segundo o autor a segunda perda de massa está relacionada com a

destruição da tripla hélice do colágeno e a melhoria da propriedade de retenção de água (42).

As temperaturas características do dipositivo se assemelha as encontradas por Du et.

al., a divergência pode ser associada a composição e ao modo de reticulação por exemplo.

O ruído presente na curva de DSC na fase inicial se deve as condições de temperatura

utilizadas no ensaio, uma vez que o forno vertical tubular sofre interferências do meio quando

solicitado a baixas temperaturas.

5.4 RESISTÊNCIA MECÂNICA

Na figura 8 encontram-se as imagens do corpo de prova no início e durante o ensaio de

compressão.

Figura 8 – Ensaio de Compressão (a) início (b) durante.

Fonte: Autora.

O ensaio foi realizado com 10 corpos de prova e as curvas de força versus deformação

estão apresentadas na Figura 9.

26

Figura 9 – Curva de Força x Deformação.

Fonte: Autora.

O esperado é que houvesse sobreposição das curvas da Figura 9, isso não ocorreu

porque os corpos de prova apresentavam irregularidades na superfície, porém é possível

observar um comportamento semelhante entre as curvas.

Na Tabela 4 foi apresentado os valores de diâmetro e comprimento médio dos

cilindros submetidos ao ensaio de compressão

Tabela 4 – Diâmetro e comprimento médio dos corpos de prova.

Diâmetro Externo (mm) Comprimento (mm)

6,160±0,108 12,66±0,25

Fonte: Autora.

De acordo com a literatura o osso cortical apresenta Módulo de Elasticidade igual a

7500 MPa e resistência a compressão de 137,8 MPa enquanto que o osso trabeculado

apresenta Módulo de Elasticidade de 500 MPa e resistência à compressão de 41,4 MPa (43).

A Resistência a Compressão é dada pela força aplicada para causar fratura, ou carga

correspondente a 2% de deformação permanente (região elasto-plástica) dividida pela área da

seção transversal original do cilindro (44).

Na Tabela 5 foi apresentado o resultado de Tensão Máxima e Módulo de Elasticidade

obtido durante o ensaio mecânico do dispositivo preparado.

27

Tabela 5 – Resultados do ensaio de compressão.

Força Máx.

(N)

Tensão Máxima

(N/mm²)

Deformação Relativa

(%)

Módulo de

Elasticidade

(N/mm²)

Área do

Gráfico (N.mm)

-129,01±27,88 -4,33±0,95 3,74±0,97 239,25±78,37 249,59±54,35

Fonte: Autora.

Ao se calcular a tensão após 2% de deslocamento da reta de deformação elástica,

percebeu-se que o valor era inferior à tensão máxima atingida durante os ensaios. Tais

resultados indicam que o material apresentou grande rigidez e pouca deformação até o ponto

de maior tensão verificada no teste e por isso as análises foram feitas usando como parâmetro

a tensão máxima obtida no ensaio.

A resistência a compressão e o módulo de elasticidade do dispositivo preparado

apresentaram valores baixos quando comparados com a resistência a compressão de alguns

substitutos ossos comerciais como Calcibon (60-70 MPa), Biosorb (15-150 MPa), Biopex (80

MPa) e Cementek (20 MPa). Por outro lado existem alguns substitutos comerciais que

apresentam valores semelhantes com os valores obtidos experimentalmente como, por

exemplo, o Pro-Osteon (2-4 MPa) e o Endobon (1-20 MPa) (45).

Comparando o dispositivo em estudo com os dispositivos a base de colágeno e

quitosana apresentados por Przekora; Palka; Ginalska, Serra et. al. e Martínez et. al. foi

possível observar que a formulação apresentou resultados superiores de módulo de

elasticidade e resistência a compressão (6, 7, 38). Os dispositivos preparados por Graaf et.

al. se diferenciaram do dispositivo preparado nas proporções dos componentes da formulação,

na ausência de colágeno e glutaraldeído e na temperatura de secagem. O autor encontrou um

módulo de elasticidade de 400,53 MPa, resistência a compressão de 9,75 MPa e deformação

relativa igual a 8,31% para corpos de prova secos a 38ºC e ensaiados após 24h depois de

preparado. Já para os dispositivos secos a 38ºC e ensaiados após 48h a deformação relativa foi

de 3,95% que é semelhante à obtida pelo dispositivo em estudo (46).

Neste caso, supõe-se que a presença de colágeno e glutaraldeído reduziram os

parâmetros mecânicos de resistência a compressão, módulo de elasticidade e deformação

relativa, porém é possível que essa redução seja relativa ao tempo entre o preparo da amostra

e a realização do ensaio que para este caso foram dias, o parâmetro tempo é importante e gera

alterações significativas como foi descrito por Graaf et. al.

Uma potencial aplicação para este dispositivo é na regeneração de ossos esponjosos.

Apesar de não apresentarem elevada resistência mecânica, alguns autores relataram que

28

dispositivos semelhantes ao produzido foram capazes de agir como moldes durante as

primeiras fases de regeneração óssea, sendo biodegradado e substituído pela nova matriz

óssea a uma velocidade compatível com a formação do novo tecido (47, 48).

29

6 CONCLUSÃO

A análise de FTIR mostrou que as bandas características dos polímeros presentes na

formulação se mantiveram, porém o agente reticulante deslocou e/ou intensificou os picos

como já era esperado. Além disso, a banda característica da reticulação com glutaraldeído de

quitosana e colágeno foi observada no pico de 1689 cm-1

.

As temperaturas características apresentadas nas análises de DSC e TG correspondem

à perda de água e a degradação dos biopolímeros respectivamente. Outro aspecto importante

foi que o dispositivo apresentou estabilidade térmica a 37ºC que é a temperatura de aplicação

do material.

O ensaio mecânico mostrou bons resultados quando comparado com alguns substitutos

ósseos comerciais e com dispositivos a base de quitosana e colágeno.

30

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1 KIRSCHBAUER, K. G. Mineralização in vitro de matrizes colagênicas derivadas de

tendões bovinos e de avestruz. (Dissertação de Mestrado). Universidade de São Paulo,

Instituto de Química de São Carlos. São Carlos, 2009.

2 WANG, L.; STEGEMANN, J. P. Glyoxal crosslinking of cell-seeded chitosan/collagen

hydrogels for bone regeneration. Acta Biomaterialia, v. 7, p. 2410–2417, 2011.

3 LIU, H. et. al. Novel injetable calcium phosphate/chitosan composites for bone substitute

materials. Acta Biomaterialia, n. 2, p. 557-565, 2006.

4 MARTINS, J. V. Principais biomateriais utilizados em cirurgia de levantamento de seio

maxilar: abordagem clínica. Revista Odontológica de Araçatuba, v.31, n.2, p. 22-30, 2010.

5 COSTA JR., E. S. et. al. Preparação e Caracterização de Blendas de Quitosana/Poli(Álcool

Vinílico) Reticuladas Quimicamente com Glutaraldeído para Aplicação em Engenharia de

Tecido. Química Nova, v. 31, p. 1460-1466, 2008.

6 SERRA, I. R. et al. Production and characterization of chitosan/gelatin/β-TCP scaffolds for

improved bone tissue regeneration. Materials Science and Engineering: C, v. 55, p. 592–

604, 2015.

7 MARTÍNEZ, A. et al. Tailoring chitosan/collagen scaffolds for tissue engineering: Effect of

composition and different crosslinking agents on scaffold properties. Carbohydrate

Polymers, v. 132, p. 606–619, 2015.

8 SANTANA, R. C.; CUNHA, R. L. Emulsões estabilizadas por colágeno: efeito da

hidrólise térmica e do processo de homogeneização. (Dissertação de Mestrado). Universidade

Estadual de Campinas. Campinas. 2009.

9 AMARAL, M. B. Citotoxidadein vitro e Biocompatibilidade in vivo de Compósitos a

base de Hidroxiapatita, Colágeno e Quitosana. 98f. (Dissertação de Mestrado).

Universidade de São Paulo, São Carlos, 2006.

10 MOREIRA, C. D. F. Avaliação da adição de colágeno tipo I e nanopartículas de vidro

bioativo a hidrogéis termossensíveis de quitosana para uso na engenharia de tecido. 91f.

(Dissertação de Mestrado). Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 2014.

11 YOSHIOKA, A. S.; BRAILE, D. M.; RAMIREZ, V.; GOISSIS, G. Reticulação de

Matrizes Colagênicas com Diacetais de Glutaraldeído para a Preparação de novos

Biomateriais. Polímeros: Ciência e Tecnologia, 1995.

12 PARENTEAU-BAREIL, R. et al. Comparative study of bovine, porcine and avian

collagens for the production of a tissue engineered dermis. Acta biomaterialia, v. 7, n. 10, p.

3757–65, out. 2011.

13 DAMIAN, C. et al. Quitosana: Um amino polissacarídio com características funcionais.

Alim. Nutr, v.16, nº2, p.195-205. Araraquara, 2005.

31

14 FAKHRY, A., SCHNEIDER, G. B., ZAHARIAS, R., & SENEL, S. (2004). Chitosan

supports the initial attachment and spreading of osteoblasts preferentially over fibroblasts.

Biomaterials, v. 25, p. 2075–2079, 2004.

15 SANTOS L. A., et al. Influence of polymeric assitives on the mechanical properties of a-

tricalcium phosphate cement. Bone, v. 25, p. 99-102, 1999.

16 MIRTCHI A. A., LEMAITRE J., MUNTING E. Calcium phosphate cements: study of the

beta-tricalcium phosphate-dicalcium phosphate-calcite cements. Biomaterials, v.11, p. 83-8,

1990.

17 SCHMITZ J. P., HOLLINGER J. O., MILAN S. B. Reconstruction of bone using calcium

phosphate bone cement: a critical review. J. Oral MaxillofacSurg, v. 57, p.1122-6, 1999.

18 DRIESSENS F. C. M., et. al. Osteotransductive bone cements. Proceedings of the

Institution of Mechanical Engineers, Part H: Journal of Engineering in Medicine, v. 6, p.

427-35, 1998.

19 MENG, D., DONG, L., WEN, Y., XIE, Q. Effects of adding resorbable chitosan

microspheres to calcium phosphate cements for bone regeneration. Materials Science and

Engineering, v. 47, p.266–272, 2015.

20 COELHO, M. B. Desenvolvimento de Metodologia para Produção de Estruturas

Tridimensionais Porosas de Vidro Bioativo para Aplicação em Engenharia de Tecidos.

156f. (Tese de Doutorado). Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, 2003.

21 SENA, L. A. Produção e Caracterização de Compósitos Hidroxiapatita-Colágeno

para Aplicações Biomédicas. 107f. (Tese de Doutorado). Universidade Federal do Rio de

Janeiro, Rio de Janeiro, 2004.

22 SIQUEIRA, L. C. B. Formulação e Caracterização de Biomateriais Compósitos com

Hidroxiapatita. 136f. (Dissertação de Mestrado). Universidade Estadual do Norte

Fluminense Darcy Ribeiro, Campos dos Goytacazes, 2009.

23 HANNINK, G.; ARTS, J. J. C. Bioresorbability, porosity and mechanical strength of bone

substitutes: What is optimal for bone regeneration? Injury, v. 42, n. SUPPL. 2, p. S22–S25,

2011.

24 CALLISTER, W. D. Ciência e Engenharia dos Materiais: Uma Introdução. 5. ed. Rio

de Janeiro. LTC S. A., 2000. Cap.13, p. 265-290.

25 ORYAN A.; ALIDADI S.; MOSHIRI A. Current concerns regarding healing of bone

defects. Hard Tissue,v. 26, p. 1-12, 2013.

26 SUMNER-SMITH G. Bone in clinical orthopedics. 2nd ed. Dübendorf: AO Publishing;

2002.

27 CALORI GM, MAZZA E, COLOMBO M, RIPAMONTI C. The use of bone-graft

substitutes in large bone defects: any specific needs? Injury, v. 42,p. 56-63, 2011.

32

28 MOSHIRI A.; ORYAN A. Role of tissue engineering in tendon reconstructive surgery and

regenerative medicine: current concepts, approaches and concerns. Hard Tissue, v. 1, p. 1-11,

2012.

29 AMINI A. R.; LAURENCIN C. T.; NUKAVARAPU S. P. Bone tissue engineering: recent

advances and challenges. Critical Reviews in Biomedical Engineering, v. 40, p.363-08,

2012.

30 KHAN Y.; YASZEMSKI M. J.; MIKOS A. G.; LAURENCIN C. T. Tissue engineering of

bone: material and matrix considerations. Journal of Bone and Joint Surgery, v. 90p. 36-42,

2008.

31 MADIHALLY S. V.; MATTHEW H. W. T. Porous chitosan scaffolds for tissue

engineering. Biomaterials, v. 20, p. 1133- 42, 1999.

32 DABROWSKI B.; SWIESZKOWSKI W.; GODLINSKI D.; KURZYDLOWSKI K. J.;

Highly porous titanium scaffolds for orthopedic applications. Journal of Biomedical

Materials Research, Part B, Applied Biomaterials. v. 95, p.53-61, 2010.

33 HING K. A.; WILSON L. F.; BUCKLAND T. Comparative performance of three ceramic

bone graft substitutes. The Spine Journal, v. 7, p. 475-90, 2007.

34 HUTMACHER D. W. Scaffolds in tissue engineering bone and cartilage. Biomaterials, v.

21, p. 2529-43.

35 LI J.; BAKER B. A.; MOU X.; REN N.; QIU J.; BOUGHTON R. I.; LIU H.

Biopolymer/calcium phosphate scaffolds for bone tissue engineering. Advanced Healthcare

Materials, v. 3, p. 469-84, 2014.

36 ARMENTANO I.; DOTTORI M.; FORTUNATI E.; MATTIOLI S.; KENNY J. M.

Biodegradable polymer matrix nanocomposites for tissue engineering: a review. Polymer

Degradation & Stability, v. 95, p. 2126-46, 2010.

37 VAN DER STOK, J. et al. Bone substitutes in the Netherlands - A systematic literature

review. Acta Biomaterialia, v. 7, n. 2, p. 739–750, 2011.

38 PRZEKORA, A.; PALKA, K.; GINALSKA, G. Biomedical potential of chitosan/HA and

chitosan/β-1,3-glucan/HA biomaterials as scaffolds for bone regeneration — A comparative

study. Materials Science and Engineering: C, v. 58, p. 891–899, 2015.

39 CASTRO, K. C., et. al. Obtention and Characterization of Collagen and Chitosan based

Cements for Bone Regeneration. Part 1: Extraction and Characterization of Collagen.

Materials Science Forum, v.775-776, p. 29-33, 2014.

40 ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS TÉCNICAS. NBR ISSO 5833: Implantes

para cirurgias – cimentos de resina acrílica. Rio de Janeiro, 2004.

41 MALLMANN, E. J. J. Obtenção de um novo compósito biológico com propriedades

magnéticas. 90f. (Dissertação de Mestrado). Universidade Federal do Ceará, Fortaleza 2010.

33

42 DU, T. et al. Modification of collagen–chitosan matrix by the natural crosslinker alginate

dialdehyde. International Journal of Biological Macromolecules, p. 1-9, 2015.

43 GALEGO, N., et. al. Characterization and application of poly(β-hydroxyalkanoates)

family as composite biomaterials. Polymertesting, 2000, v.19, p. 485-492.

44 GRAAF, G. M. M. V. Avaliação da resistência mecânica à compressão axial de

diferentes formulações de poliuretana de mamona com carbonato de cálcio e de

quitosana com fosfato de cálcio. 101f. (Dissertação de Mestrado). Universidade de São

Paulo, São Paulo 2012.

45 HABRAKEN, W.J.E.M., WOLKE, J.G.C., JANSEN, J.A. Ceramic composites as

matricesand scaffolds for drug for drug delivery in tissue engineering. Advanced Drug

Delivery Reviews, 2007, v. 59, p. 234-248.

46 GRAAF, G. M. M. VAN DE, et. al. Obtenção e Caracterização de Cimentos de Quitosana

com Fosfato de Cálcio para Preenchimento de Falhas Ósseas. In: CONGRESSO

BRASILEIRO DE ENGENHARIA BIOMÉDICA, 2014, Uberlândia. Anais...Uberlândia:

Sociedade Brasileira de Engenharia Biomédica, 2014. p. 1426 -1429.

47 MIRANDA, S. C. C., et. al. Three-dimensional culture of rat BMMSCs in a porous

chitosan-gelatin scaffold: A promising association for bone tissue engineering in oral

reconstruction. Arch. Oral Biol. 2011, v. 56, p. 1–15.

48 YIN, Y., et. al. Preparation and characterization of macroporous chitosan-gelatin/beta

tricalcium phosphate composite scaffolds for bone tissue engineering. J. Biomed. Mater.

Res. 2003, v. 67, p. 844–855.