Desenvolvimento e Simulação de um Processo para a ... · Índice Lista de Figurasxv Lista de...

Raquel Santiago Serra

Estudante de Engenharia Química e Bioquímica

Desenvolvimento e Simulação de um Processopara a Purificação de Peptídeos

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em

Engenharia Química e Bioquímica

Orientador: José Paulo Barbosa Mota, Professor Catedrático,Universidade Nova de Lisboa

Co-orientador: Tiago Pereira dos Santos, Mestre,Universidade Nova de Lisboa

Júri

Presidente: Prof. Dr. Mário Fernando José EusébioArguente: Dr. Ricardo J S Silva

Vogal: Prof. Dr. José Paulo Barbosa Mota

Setembro, 2019

Desenvolvimento e Simulação de um processo para a Purificação de Peptídeos

Copyright © Raquel Santiago Serra, Faculdade de Ciências e Tecnologia, Universidade

NOVA de Lisboa.

A Faculdade de Ciências e Tecnologia e a Universidade NOVA de Lisboa têm o direito,

perpétuo e sem limites geográficos, de arquivar e publicar esta dissertação através de

exemplares impressos reproduzidos em papel ou de forma digital, ou por qualquer outro

meio conhecido ou que venha a ser inventado, e de a divulgar através de repositórios

científicos e de admitir a sua cópia e distribuição com objetivos educacionais ou de inves-

tigação, não comerciais, desde que seja dado crédito ao autor e editor.

Este documento foi gerado utilizando o processador (pdf)LATEX, com base no template “novathesis” [1] desenvolvido no Dep. Informática da FCT-NOVA [2].[1] https://github.com/joaomlourenco/novathesis [2] http://www.di.fct.unl.pt

https://github.com/joaomlourenco/novathesis

http://www.di.fct.unl.pt

The book of nature is written in the language of mathematics.Galileu Galilei

Agradecimentos

Primeiramente gostava de agradecer ao Prof. José Paulo Mota, pelo conhecimento que for-

neceu em becos que pareciam não ter saída e pelas sugestões relevantes que foi apresen-

tando ao longo do trabalho. Seguidamente, gostava de deixar um agradecimento especial

ao Tiago Santos, que acompanhou e orientou o meu trabalho e que considero ter sido uma

enorme ajuda e também um grande amigo e companhia ao longo desta fase.

A todo o grupo com quem partilhei gabinete, laboratório, dúvidas, conhecimentos

e sorrisos. Em especial à Abimaelle que me ajudou imenso com a parte escrita e que

também foi uma grande companhia, em termos pessoais.

Depois dos agradecimentos às pessoas que acompanharam o trabalho desenvolvido

na presente tese tenho de deixar uma mensagem com o mais puro dos obrigados às

minhas colegas Ana e Filipa que me acompanharam em todas as vertentes desta etapa

universitária, Obrigada. Como é óbvio também não posso deixar de agradecer a todas as

pessoas com quem partilhei sorrisos e experiências ao longo destes anos de Faculdade.

Por último quero agradecer à minha família com especial destaque para os meus pais,

os meus avós e o meu irmão que ajudaram a construir a minha personalidade e todo o

conhecimento de foro pessoal. Os meus pais que, como é óbvio, forneceram-me os meios

necessários para chegar até ao dia de hoje e por todo o carinho que revelam ter por mim.

O meu irmão que apesar de tudo foi uma fonte de inspiração.

Por fim gostaria de deixar uma nota especial a meu avô que embora não esteja entre

nós, viu-me começar esta etapa e sempre manteve o bom humor apesar das adversidades

que lhe iam aparecendo.

vii

Resumo

Atualmente, o mercado de peptídeos farmacêuticos está em crescimento, sendo que em

2016 o volume mundial de vendas foi de cerca de 20 mil milhões de euros. Os peptídeos

são biomoléculas constituídas por cadeias de aminoácidos e são utilizadas, maioritaria-

mente, em terapias de reposição hormonal e oncológica.

A via utilizada a nível industrial para a obtenção de peptídeos sintéticos é a síntese

em fase sólida. Este processo origina uma mistura líquida que contém não só o peptídeo

alvo, mas também quantidades residuais de reagentes e compostos indesejados associados

à síntese incompleta. Por este motivo, é necessário purificar de forma eficaz a mistura

resultante, uma vez que o composto-alvo é utilizado como fármaco e a pureza requerida

pelas agências farmacêuticas de controlo de qualidade, tal como a FDA, é elevada.

Atualmente o processo de purificação de péptidos mais utilizado a nível industrial é

a cromatografia líquida em fase reversa. Tradicionalmente, a purificação cromatográfica

de peptídeos é realizada em modo descontínuo monocoluna, apesar do baixo rendimento.

Por este motivo, tem surgido investigação com o objetivo de mudar o modus operandi da

cromatografia de descontínuo para contínuo, que se sabe ser mais eficiente. Resultados

preliminares mostraram que em modo descontínuo monocoluna o rendimento obtido é

cerca de 50%, enquanto que em modo multicoluna contínuo ronda os 95%.

O objetivo do presente trabalho consistiu na aplicação do princípio da cromatogra-

fia em contínuo à separação de misturas de peptídeos. Tendo em conta a novidade do

trabalho foi necessário realizar uma vasta revisão bibliográfica das soluções já existentes.

Reconstruiu-se e expandiu-se uma instalação experimental de cromatografia preparativa

contínua com três colunas e desenvolveu-se um modelo de simulação da unidade. Este

modelo foi aplicado a um caso de estudo de aplicação do processo GSSR(Gradiente de

solvente com reciclo em estado estacionário). Foram ainda efetuadas experiências para a

caracterização das colunas utilizadas no sistema e as isotérmicas dos compostos, passíveis

de serem utilizados aquando da validação experimental do sistema.

Palavras-chave: Separação de peptídeos, Cromatografia em contínuo, Simulação de pro-

cessos, GSSR

ix

Abstract

Currently, the pharmaceutical peptides market is growing, and in 2016, the world sales

volume was about 20 billion euros. Peptides are bio-molecules consisting of amino acid

chains that are mostly used in replacement therapy and oncologic treatment.

The most commonly used pathway at industrial level for obtaining synthetic peptides

is the solid phase synthesis.This process originates a liquid mixture that contains not

only the target peptide, but also residual amounts of reagents and unwanted compounds

associated with incomplete synthesis. Since the target compound is used as a drug and

its purity required by the pharmaceutical quality control agencies, such as the FDA, is

high, it is necessary to efficiently purify the mixture resulting from the synthesis process.

Currently, the process of purification of peptides most widely used at industrial level is

reverse phase liquid chromatography.

Typically, chromatography is performed in single-column batch mode, however the

yield obtained is low. For this reason, research has arisen in order to change the modusoperandi of the discontinuous chromatography to continuous, which is known to be more

efficient. Preliminary results showed that in a single column discontinuous mode the

yield obtained is about 50%, while in continuous multicolumn mode the yeld rounds the

95%.

The objective of the present work consisted in the application of the principle of chro-

matography in continuous mode to the separation of peptides mixtures.As the continuous

chromatography is in an early stage of developmente it was necessary to undertake a com-

prehensive bibliographic review of existing solutions. An experimental installation of

continuous preparatory chromatography with three columns for operation in GSSR and

MCSGP mode was reconstructed and expanded. Additionally, a simulation model of the

unit was developed and it was applied to a case study of the application of the GSSR

process. Experiments were also carried out to characterize the columns used in the sys-

tem and to determin the isotherms of the compounds, which could be used during the

experimental validation of the system.

Keywords: Peptides separation, continuous chromatography, Processes Simulation, GSSR

xi

Índice

Lista de Figuras xv

Lista de Tabelas xvii

Siglas xix

1 Enquadramento e Objetivos 1

1.1 Peptídeos na Indústria farmacêutica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

1.2 Síntese de peptídeos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

1.3 Processo de Downstream de Bioprodutos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

1.4 Cromatografia . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

1.4.1 Modo de funcionamento . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

1.5 Objetivos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

2 Revisão de Literatura 7

2.1 Leito móvel verdadeiro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

2.2 Leito móvel simulado . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

2.3 Sistema de purificação com gradiente de solvente em contracorrente utili-

zando várias colunas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

2.3.1 Sistema de 6 Colunas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13



2.4 Gradiente de solvente com reciclo em estado estacionário . . . . . . . . . 17

3 Protótipo Desenvolvido 19

3.1 Descrição . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

3.1.1 Funcionamento da bomba . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

3.1.2 Reciclo das correntes de entrada . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20

3.1.3 Entrada das correntes de alimentação e de solvente . . . . . . . . . 20

3.1.4 Saída de produto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

3.1.5 Circuito entre colunas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

3.1.6 By-pass de colunas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

3.1.7 Leitura UV . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

xiii

ÍNDICE

3.2 Materiais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

3.3 Comunicação com o sistema . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

4 Modelo matemático 27

4.1 Balanço mássico . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

4.2 Condições Iniciais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

4.3 Condições Fronteira . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

4.4 Dispersão Axial . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

4.5 Adsorção . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

4.5.1 Isotérmica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

4.5.2 Cinética de adsorção . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 31

5 Modelo e Simulação 33

5.1 Descrição dos modelos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

5.1.1 Coluna . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

5.1.2 Entradas e Saídas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

5.1.3 Ligação entre colunas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

5.1.4 Gradiente de solvente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

5.2 Case study . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

5.2.1 Balanço mássico da coluna . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

5.2.2 Análise do crude mix . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

5.2.3 Schedule . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 38

5.2.4 Resultados e discussão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

5.2.5 Conclusão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

6 Trabalho Experimental 45

6.1 Materiais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 45

6.2 Caracterização da coluna . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

6.2.1 Volume morto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 46

6.2.2 Porosidade interparticular . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

6.2.3 Porosidade Total . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 51

6.3 Isotérmicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

6.3.1 Guanosina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

6.3.2 Uridina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

6.3.3 Comparação e discussão . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

6.4 Bomba não isocrática . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

7 Conclusões e trabalho futuro 65

Bibliografia 67

xiv

Lista de Figuras

1.1 Síntese de Peptídeos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3

2.1 Esquema de TMB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 8

2.2 Separação de componentes no TMB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

2.3 Perfil de concentração da espécies no TMB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 9

2.4 Comutação do SMB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

2.5 Dois SMBs em série . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

2.6 Corte central . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

2.7 Perfil de concentração do MCSGP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

2.8 MCSGP de 6 colunas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

2.9 Produtividade e pureza do MCSGP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

2.10 MCSGP de 3 colunas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

2.11 MCSGP de 2 colunas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

2.12 GSSR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

3.1 Flowsheet do processo desenvolvido . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

3.2 Estrutura física da instalação . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

4.1 Tipos de Isotérmica . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

5.1 Esquema do modelo da coluna cromatográfica . . . . . . . . . . . . . . . . . . 34

5.2 Esquema do modelo das entradas e saídas da coluna . . . . . . . . . . . . . . 36

5.3 Esquema do modelo ligação entre colunas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36

5.4 Cromatograma da mistura de peptídeos utilizada. . . . . . . . . . . . . . . . 39

5.5 Steps do GSSR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

5.6 Cout da coluna 3 do GSSR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

5.7 Cout do composto 1 das colunas do GSSR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41





5.12 Pureza e rendimento obtidos utilizando o GSSR . . . . . . . . . . . . . . . . . 44

6.1 Método de EAM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

xv

Lista de Figuras

6.2 Absorvância de BD fazendo by-pass à coluna . . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

6.3 Absorvância de BD passando pela coluna 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

6.4 Absorvância de BD passando pela coluna 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

6.5 Absorvância duma solução aquosa de 90% de etanol passando pela coluna 2 52

6.6 Absorvância duma solução aquosa de 90% de etanol passando pela coluna 3 52

6.7 Concentração de saída da solução de Guanosina nas experiências de isotérmica 57

6.8 Isotérmica da Guanosina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

6.9 Concentração de saída da solução de Uridina nas experiências de isotérmica 60

6.10 Isotérmica da Uridina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

6.11 Absorvância de um gradiente de BD fazendo o by-pass à coluna . . . . . . . . 63

6.12 Absorvância de um gradiente de BD passando pela coluna . . . . . . . . . . . 63

xvi

Lista de Tabelas

5.1 Concentração e caudais da correntes utilizadas no GSSR . . . . . . . . . . . . 39

5.2 K ′ e n dos compostos do GSSR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39

5.3 variáveis temporais do GSSR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

6.1 Condições de operação e resultados da experiência de Volume morto . . . . . 48

6.2 Condições de operação para as experiências de obtenção da porosidade inter-

particular. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

6.3 Porosidade interparticular e análise probabilística dos resultados obtidos para

a coluna 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

6.4 Porosidade interparticular e análise probabilística dos resultados obtidos para

a coluna 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 50

6.5 Condições de operação para as experiências de obtenção da porosidade total. 51

6.6 Resultados relativos à porosidade total da coluna 2 e respetiva análise proba-

bilística . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

6.7 Resultados relativos à porosidade total da coluna 3 e respetiva análise proba-

bilística . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 53

6.8 Volume das partículas e dos poros das duas colunas . . . . . . . . . . . . . . 54

6.9 Concentrações utilizadas de Guanosina e Uridina . . . . . . . . . . . . . . . . 54

6.10 Condições de operação para as experiências de obtenção da isotérmica da Gua-

nosina. O volume morto não é o mesmo utilizado nas experiências anteriores,

uma vez que foi necessário modificar o sistema, tendo sido realizadas novas

experiências para determinar o novo volume morto. . . . . . . . . . . . . . . 56

6.11 Reta de Calibração da Guanosina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

6.12 Tempos médios de residência do composto no sistema, dependendo da con-

centração alimentada de Guanosina para as várias experiências. . . . . . . . 57

6.13 Constantes de isotérmica para a Guanosina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 58

6.14 Condições de operação para as experiências de obtenção da isotérmica da

Uridina. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

6.15 Reta de Calibração da Uridina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 59

6.16 Tempo de saída da solução de Uridina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60

6.17 Constantes de isotérmica para a Uridina . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

6.18 Constante de henry para os compostos analisados . . . . . . . . . . . . . . . . 62

xvii

Siglas

BD Solução aquosa de Blue dextran.

EAM Método das áreas equivalentes.

GSSR Gradiente de solvente com reciclo em estado estacionário.

HPLC Cromatografia líquida de alta pressão/performance.

MCSGP Sistema de purificação com gradiente de solvente em contracorrente

utilizando várias colunas.

P Substância de interesse, produto.

S Substância fortemente retida.

SMB Leito Móvel Simulado.

W Substância fracamente retida.

xix

Capítulo

1Enquadramento e Objetivos

1.1 Peptídeos na Indústria farmacêutica

Na indústria farmacêutica, a unidade estrutural mais utilizada são as moléculas de peque-

nas dimensões. No entanto, tem vindo a crescer a quantidade de fármacos cuja unidade

estrutural são os peptídeos, tendo sido estimada uma taxa anual de crescimento de 9.41%

até 2024 [1]. Os Peptídeos são constituídos por cadeias de aminoácidos conectados por

meio de ligações peptídicas [2].

Desde 1980 foram registadas cerca de 240 proteínas e peptídeos para fins clínicos,

sendo que aproximadamente 100 já estão a ser comercializados. Em 2016, as vendas

relativas a produtos constituídos por peptídeos e proteínas corresponderam a uma receita

entre os 15 e os 20 mil milhões de dólares [3], o que equivale a cerca de 10% do mercado

total de fármacos [4, 5].

A utilização de peptídeos tem múltiplos benefícios, tais como [6]:

• Eficácia no que diz respeito à ligação peptídeo-recetor;

• Baixos níveis de toxicidade, uma vez que a sua decomposição não deixa resíduos

metabólicos tóxicos;

• Utilização em múltiplas terapias, sendo que uma destas vertentes é a reposição

de hormonas em casos em que o organismo tem dificuldades em produzir certas

hormonas que são essenciais, como é o caso da insulina [4].

Por outro lado, os peptídeos são suscetíveis a degradação por meio de proteases e

peptiases, enzimas presentes no trato digestivo, e devem ser administradas por via de

injeção, contrariamente ao fármacos constituídos por moléculas de pequenas dimensões

que são administrados por via oral.

1

CAPÍTULO 1. ENQUADRAMENTO E OBJETIVOS

No entanto, através da síntese controlada e estudada, podem ser implementadas estra-

tégias de modo a modular a farmacocinética, melhorando a performance dos peptídeos

[6, 7].

1.2 Síntese de peptídeos

Desde 1901, data de registo do primeiro peptídeo sintético, as barreiras associadas à sín-

tese química, devidas à falta de investigação, foram neutralizadas, pelo que este processo

está em crescimento em termos de utilização em detrimento do processo de extração [7].

O processo de síntese pode ser realizado em:

1. Fase liquida. Este processo, apesar de continuar a ser utilizado, tem algumas desvan-

tagens no que toca à solubilidade das fases utilizadas e ao acréscimo de dificuldade

do processo de purificação de cadeias longas de aminoácidos. No entanto é um

processo mais antigo e com bastante informação [8].

2. Fase sólida. Este processo é mais rápido e simples no que diz respeito ao processo

de síntese, uma vez que todo o processo é realizado no mesmo recipiente. Quanto

ao processo de separação, este é benéfico uma vez que há menos perdas de produto

tornando o processo mais eficiente. Este processo tem sido alvo de investigação, o

que permite um vasto conhecimento e, consequentemente, a redução dos preços de

produção [9, 10].

A síntese dos peptídeos mais antigos continua a ser realizada em fase líquida, no

entanto o processo em larga escala de novos peptídeos é realizado maioritariamente em

fase sólida.

Em termos de ligação, a síntese de peptídeos é, normalmente, feita entre o grupo car-

boxílico do aminoácido a ser acoplado e o terminal N da cadeia já existente. No entanto,

os aminoácidos têm múltiplos grupos reacionais, pelo que devem ser evitadas reações

secundárias nas quais as ligações são realizadas através destes grupos reacionais. É, por-

tanto, necessário proteger os grupos reacionais de modo a disponibilizar apenas o grupo

carboxílico e o terminal N, mitigando assim as reações secundárias.

O processo de ligação de aminoácidos para a obtenção de um peptídeo pode ser

observado na figura 1.1a. O esquema de desproteção dos diversos grupos funcionais do

peptídeo obtido está representado na figura 1.1b [11].

Não obstante, a reação não ocorre como seria desejável, uma vez que alguns dos ami-

noácidos não são adicionados à cadeia já existente. Desta forma, são obtidos peptídeos

que diferem dos desejados por apenas alguns aminoácidos, sendo que não têm as mesmas

características a nível funcional. Esta combinação de aminoácidos constitui uma mis-

tura de separação difícil, uma vez que as características dos peptídeos obtidos são muito

semelhantes.

2

1.3. PROCESSO DE DOWNSTREAM DE BIOPRODUTOS

(a) Esquema da síntese em fase sólida de umdipeptídeo [12].

(b) Desagregação dos grupos de proteção as-sociados aos grupos funcionais do peptídeo[11].

Figura 1.1: Síntese de Peptídeos

1.3 Processo de Downstream de Bioprodutos

Um processo pode ser dividido em duas grandes fases, o upstream, onde ocorre a prepa-

ração das matéria primas e a reação, e o downstream que é responsável pela obtenção e

purificação do produto no seu estado final de consumo.

Tipicamente, o processo de downstream pode ser dividido em 4 fases [13, 14]:

1. Separação sólido-líquido, consiste numa separação da solução, proveniente da ul-

tima fase de upstream, que contém: produto, microrganismos e meio de cultura.

Sendo que a fase líquida é constituída pelo produto-alvo e algumas impurezas de

pequenas dimensões. Por outro lado, a fase sólida é constituída pelos microrganis-

mos, o meio de cultura e as impurezas de maiores dimensões. Este passo pode ser

obtido por meio de centrifugação ou filtração.

2. Concentração, que é responsável pela separação de compostos que diferem subs-

tancialmente nas características físico-químicas, essencialmente volatilidade ou ta-

manho molecular. Este passo é realizado, recorrendo a métodos como evaporação,

extração líquido-líquido, adsorção, filtração por membrana ou precipitação.

3. Cromatografia, sucede o passo de concentração, no qual é diferenciado o produto

alvo das impurezas que lhe estavam associadas. Após este passo, afigura-se neces-

sário recorrer a um passo de purificação com vista à obtenção do produto desejado.

Para este efeito é utilizado o processo cromatográfico.

4. Formulação, em que é realizada a estabilização do produto. Isto é, o produto já tem

a pureza desejada. No entanto é necessário proceder à estabilização do produto para

efeitos de armazenamento e distribuição, recorrendo-se a processos de cristalização

e spray-drying.

No entanto, quando estamos perante um processo de síntese de peptídios ou proteínas

os passos de separação e de concentração não são necessários. Isto sucede-se porque o

crude mix não contém resíduos oriundos de atividade biológica como meio de cultura,

3


células e produtos intra-celulares, contendo apenas resíduos com características idênticas

às do produto de interesse. Pelo que, neste processo o passo de purificação é o de maior

importância. Adicionalmente, é de notar que, quando nos referimos ao downstream de

bio produtos, é necessário ter em conta as condições de degradação das moléculas, como

temperatura, pressão e concentração de sais [15].

Na produção de produtos para uso farmacêutico, as purezas requeridas são muito

elevadas, entre 95 e 99(%v/v). Esta alta pureza é muitas vezes alcançada em prol da re-

cuperação, uma vez que são precisas múltiplas operações unitárias e em cada uma destas

etapas é perdido parte do produto pretendido. A complexidade e o baixo recuperação da

fase de purificação contribuem para que esta seja a fase mais dispendiosa do processo,

atingindo cerca de 80% do custo total de produção [16].

1.4 Cromatografia

Resumidamente, a cromatografia pode ser utilizada com duas finalidades distintas. Por

um lado é utilizada para a identificação dos componentes presentes numa mistura, por

outro lado é utilizada para a purificação de misturas. Independentemente da finalidade,

o princípio adjacente é o mesmo, separação dos compostos com base nas diferenças das

características das várias moléculas presentes na mistura.

As diferenças nas características dos composto levam a diferentes interações entre os

componentes e as fases presentes na coluna cromatográfica. Estas interações podem ter

como base o tamanho, carga, afinidade, e polaridade dos diferentes compostos.

Quanto à composição, uma coluna cromatográfica é constituída por duas fases:

• A fase estacionária, constituída por um sólido adsorvente, que deve ser escolhida

consoante a característica a explorar.

• A fase móvel, que no caso da cromatografia líquida, é constituída por um líquido.

Este serve para eluir a mistura alimentada à coluna, servindo de meio de transporte.

Esta fase deve ser selecionada tendo em conta os compostos presentes na mistura e

o nível de separação que é requerido.

Aprofundando, o principio de separação reside na interação entre os compostos pre-

sentes na mistura alimentada à coluna e as fases móvel e estacionária. Esta diferença entre

as interações permite uma separação dos compostos, isto é, os componentes com maior

afinidade para a fase estacionária têm um maior tempo de retenção e movem-se mais

lentamente enquanto que os componentes com menor afinidade têm um menor tempo

de retenção e movimentam-se mais rapidamente, sendo eluídos em primeiro lugar.

Quanto às condições de operação a cromatografia divide-se em diversos tipos, sendo

que o mais utilizado para processos de separação é a cromatografia realizada numa co-

luna e muitas das vezes esta coluna é operada a elevadas pressões, HPLC, de modo a

4

1.4. CROMATOGRAFIA

compensar a perda de carga, possibilitando a utilização de uma fase estacionária consti-

tuída por partículas de menor dimensão, que por sua vez tem uma maior área superficial,

promovendo a interação entre fases [17].

No que toca à separação de macro-moléculas, como é o caso dos peptídeos, a croma-

tografia tem como base as interações hidrofóbicas e de permuta iónica. Em particular, a

separação de peptídeos explora as características hidrofóbicas das moléculas, uma vez

que reduz a possibilidade de desnaturação dos peptídeos, comparando com a cromato-

grafia de permuta iónica [18]. Como vimos anteriormente em 1.2, os peptídeos obtidos

têm composições muito similares, no entanto as pequenas diferenças existentes geram

uma conformação espacial (estrutura ternária) diferente entre as várias moléculas. Con-

sequentemente, as moléculas diferem relativamente às zonas hidrofóbicas expostas, pelo

que vão interagir de modo diferente com a fase estacionária. É portanto utilizada uma

cromatografia com base nas interações hidrofóbicas, mais especificamente cromatografia

de fase reversa, em que a fase estacionária é apolar e a fase móvel é maioritariamente

polar, sendo que uma porção do solvente é necessariamente de origem orgânica.

A fase móvel é normalmente constituída pela mistura entre água e um álcool, como

o metanol ou o isopropanol. Quando nos referimos a álcoois cuja viscosidade é baixa, é

necessário adicionar água, de modo a aumentar a viscosidade total da solução e, conse-

quentemente diminuir a perda de carga associada. Por outro lado, podem ser também

utilizados compostos orgânicos como é o caso do acetonitrilo cuja viscosidade é elevada

existindo a necessidade de baixar este paramento, de modo a diminuir a pressão exercida

pela bomba sobre o líquido.

A fase estacionária, é constituída por uma base de sílica que é complementada, de

modo a tornar-se apolar, adicionando cadeias de hidrocarbonetos com 8 ou 18 carbonos à

sua superfície [19].

1.4.1 Modo de funcionamento

A cromatografia tradicional é um processo que opera em batch. A mistura é alimentada

periodicamente numa extremidade da coluna e as frações puras são recolhidas na ex-

tremidade oposta, sendo que as fração que não satisfazem os requisitos de pureza são

descartadas.

Recentemente tem-se vindo a aumentar o interesse em transformar este processo, de

modo a atingir um modo contínuo de operação. Esta preocupação surge, principalmente,

pela vasta utilização do processo cromatográfico e a baixa produtividade do processo em

batch. Uma vez que um processo contínuo garante um maior aproveitamento do composto

alvo é obtida uma redução no custo do produto, uma vez que este é rentabilizado [20].

De modo a conseguir um processo contínuo, é também necessário que este se torne

um processo automatizado, uma vez que é um sistema com maior grau de complexidade.

Um processo automatizado permite:

• Recolha de dados em linha, o que ajuda a tomar decisões em tempo real;

5


• Menor margem para erros humanos, uma vez que há uma menor interação com o

sistema, alcançando assim um aumento na produtividade [21].

1.5 Objetivos

Tendo em conta as necessidades do mercado, os objetivos da dissertação são os seguintes:

• Elaboração de um processo cromatográfico para separação em contínuo de misturas

ternárias, com ênfase para a separação de peptídeos;

• Construção de um modelo matemático que defina o sistema;

• Montagem da instalação referente ao processo idealizado;

• Simulação do processo.

6

Capítulo

2Revisão de Literatura

Tendo como ponto de partida os objetivos e função do sistema a desenvolver, é necessário

realizar uma revisão de literatura de modo a compreender o funcionamento das soluções

já existentes. Estas soluções vão ser enunciadas e descritas no presente capítulo, assim

como os prós e contras das mesmas, tendo em conta a finalidade desejada.

Resumidamente, os objetivos do sistema são:

• Separação de uma mistura ternária recorrendo à cromatografia

• Operação em modo contínuo ou semi-contínuo.

• Elevado rendimento do processo.

Considerando os objetivos apresentados, os sistemas de maior relevância para uma

revisão bibliográfica são:

• Leito móvel simulado, SMB, que opera de modo contínuo para a separação de mis-

turas binárias. Embora seja destinado para a separação de misturas binárias é in-

teressante e relevante perceber este método de funcionamento, uma vez que serve

também de base para outros sistemas. No entanto, o conjunto de dois SMB conecta-

dos em série, pode separar misturas ternárias

• Purificação com gradiente de solvente em contracorrente utilizando várias colunas,

MCSGP, este sistema opera de modo semi-contínuo para a separação de misturas

ternárias sendo um sistema não isocrático, isto é, a concentração de eluente não se

mantém constante.

• Gradiente de solvente com reciclo em estado estacionário, GSSR, este sistema é

semelhante ao MCSGP, com a particularidade de que a alimentação e a recolha de

produto são sempre efetuadas na mesma coluna.

7

CAPÍTULO 2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1 Leito móvel verdadeiro

A tecnologia de leito móvel verdadeiro, TMB em inglês, permite a injeção contínua e a

separação de misturas binárias. O TMB envolve a circulação real do sólido no sentido

oposto à circulação do fluido. O contacto oposto entre o sólido e o líquido maximiza a

força motriz da transferência de massa, levando a uma redução significativa do uso das

fases móvel e estacionária em comparação com a cromatografia de eluição.

O TMB tem duas correntes de entrada, a do eluente e da alimentação. Sendo que a

alimentação é constituída pela mistura multi-componente, alvo de separação, que contém

o produto alvo juntamente com impurezas. Deste modo, temos duas correntes de saída, o

extrato, que contém o componente mais adsorvido, e o refinado, que contém o composto

menos adsorvido. Um esquema deste sistema pode ser visto na figura 2.1 [22] [23].

Figura 2.1: Representação do TMB. O sólido é representado pela letra A, e o líquidorepresentado pela letra B. O sentido do movimento das duas fases é contrário, sendo queopera em contra-corrente. A alimentação é feita entre as secções II e III e a recolha deextrato é feita entre as secções I e II, a recolha de refinado é feita entre as secções III e IV.Por fim o eluente “fresco” é inserido no inicio da secção I [22].

Cada sistema divide-se em quatro secções, em que cada secção pode ser constituída

por mais de uma coluna consoante a necessidade de separação. Cada uma destas secções

tem um papel especifico. Abaixo está representada a função de cada secção.

• Secção I - Sólido é regenerado antes de envia-lo para a secção 4, eluindo as espécies

mais adsorvida.

• Secção II - O composto menos retido é dessorvido de modo a evitar contaminação

da corrente de extrato.

• Secção III - A espécie mais adsorvida é dessorvida de modo a evitar contaminação

da corrente de refinado.

• Secção IV - O eluente é regenerado antes de envia-lo para a secção 1, adsorvendo

as espécies menos retidas.

8

2.1. LEITO MÓVEL VERDADEIRO

Este percurso das espécies pode ser observado na figura 2.2 e analisado em termos de

concentração na figura 2.3.

Figura 2.2: Esquema de TMB com ênfase no percurso das espécies mais e menos retidas[22].

Figura 2.3: Gráfico de concentração dos compostos mais (B) e menos (A) retidos ao longodo perfil axial das várias colunas constituintes do sistema [22].

Nas figuras 2.2 e 2.3 podemos ver a separação das espécies, tendo como referência o

sitio onde é feita a alimentação. A espécie mais retida segue com o sólido, sendo removida

entre as secções I e II. Contrariamente, a espécie menos retida segue com o eluente, sendo

removida entre as secções III e IV. Resumidamente, nas regiões II e III dá-se a separação

9


entre espécies, enquanto que nas secções I e IV são efetuadas as regenerações do sólido e

do líquido, respetivamente.

Este sistema é apenas uma idealização e constitui um modelo teórico, uma vez que

não é transposto para a prática pelas complicações que tem associado. Estas complicações

estão relacionadas com a própria contra-corrente, trazendo problemas de abrasão do equi-

pamento, causada pelo contacto entre a coluna e o sólido. Igualmente, o contacto entre as

partículas de enchimento é também prejudicial, causando o desgaste do adsorvente [22].

2.2 Leito móvel simulado

Os problemas associados ao leito móvel real são resolvidos com uma aproximação à

contracorrente, dando origem a um sistema de leito móvel simulado, SMB em inglês.

O SMB simula o TMB, utilizando várias colunas dispostas em série e, adicionalmente, a

localização das portas de entrada e saída são comutada no sentido da circulação do fluido,

como é mostrado na Figura 5.1. Ou seja, as unidades de SMB e TMB são equivalentes

quando as secções integrantes de um SMB são constituídas por um elevado número de

colunas e a comutação de portas ocorre com elevada frequência. No sistema SMB, a

localização das portas de entrada e saída são comutada no sentido da circulação do fluido,

em vez do movimento do sólido, como é mostrado na Figura 5.1.

Figura 2.4: Esquema do SMB antes e depois de um passo de rotação. Passado um determi-nado tempo,τ , a comutação das portas é feita no sentido do caudal de fluido. Ou seja, ascorrentes são movidas, neste caso, para a direita pela razão de uma coluna, mantendo onumero de colunas por secção por exemplo o numero de colunas entre o feed e o refinadoé mantido, sendo sempre de 2 [24].

Em 1961 surgiu a primeira patente referente a um processo que tem como base o

sistema de SMB, que foi apresentado pela UOP. Esta tecnologia foi desenvolvida, ini-

cialmente, tendo em vista as áreas de refinação de petróleo e a petroquímica, ficando

conhecido como o processo de Sorbex. Atualmente, este processo é também utilizado nas

indústrias farmacêuticas e do açúcar [22] [25].

Focando agora nas (1) vantagens e (2) desvantagens deste processo.

1. Aproveitamento do sólido. A mistura é continuamente alimentada ao processo

10

2.3. SISTEMA DE PURIFICAÇÃO COM GRADIENTE DE SOLVENTE EM

CONTRACORRENTE UTILIZANDO VÁRIAS COLUNAS

e está também em contacto contínuo com a fase sólida, é necessária uma menor

quantidade de sólido;

Produtividade é superior, uma vez que o processo se torna mais rápido e efici-

ente;

Aproveitamento de solvente e obtenção do produto com uma maior concentra-

ção. O solvente é recirculado, deste modo há um menor desperdício e o respetivo

aproveitamento do solvente, sendo que o produto é também retirado do sistema

com uma maior concentração;

2. Separações binárias. Este método é apenas válido para a separações de misturas

binárias, no entanto, uma possível solução para o tratamento de misturas ternárias

é a utilização de dois SMB em série, como mostrado na figura 2.5. Sendo que esta

possibilidade foi estudada por Hur e Wankat [26]. Porém, esta solução aumenta o

custo inicial do processo.

Figura 2.5: Sistema de dois SMB em serie para o tratamento de misturas ternárias. Asduas zonas funcionam como uma SMB convencional, em que a corrente de extrato ourefinado, conforme a corrente que contém o composto pretendido, é canalizada para osegundo sistema de SMB servindo de corrente de alimentação, F. Figura adaptada de [26].

2.3 Sistema de purificação com gradiente de solvente em

contracorrente utilizando várias colunas

Em 2007 foi desenvolvido, por parte de Morbidelli e colegas, um processo cromatográfico

para separação ternária utilizando um gradiente de solvente para a dessorção, MCSGP

em inglês. Este sistema tem por base o sistema de SMB e o principio de cromatografia

rudimentar [27–29].

11


Quando falamos em misturas ternárias ou pseudo-ternárias estamos perante mistu-

ras constituídas por três frações. O processo de obtenção da fração intermédia, que é

o caso do produto desejado em relação ao crude mix, consiste numa separação de corte

central, representado na figura 2.6. De modo a aumentar o rendimento do processo, as

partes sobrepostas de produto e resíduo são aproveitadas, seguindo para uma separação

posterior.

Figura 2.6: Esquema de um cromatograma e respetiva explicação de um processo deseparação de corte central. As frações impuras, que contêm produto, são reaproveitadaspara posterior purificação [30].

Neste sistema é utilizado um gradiente de solvente de modo a separar tanto as subs-

tâncias menos retidas como as mais retidas. Para uma concentração menor de eluente as

substâncias menos fortemente adsorvidas são removidas, no entanto as substâncias mais

fortemente retidas são apenas removidas fazendo uso duma concentração mais elevada

de eluente. A figura 2.7 mostra a concentração das substâncias e do solvente ao longo do

tempo.

Figura 2.7: Perfil de concentrações tanto da corrente de saída como do eluente injetadono processo de MCSGP. Em primeiro lugar são eluídas as substâncias menos retidas, W, epor ultimo as substâncias mais retidas, S [31].

O processo de MCSGP consiste na disposição de, pelo menos, duas colunas croma-

tográficas cujas correntes são comutadas na direção do fluxo do fluido, aparentando o

12



movimento da coluna, uma vez que adquire funções diferentes. As colunas cromatográfi-

cas estão conectadas em série de tal forma que, à medida que a mistura se move através

das colunas, o composto é purificado em várias frações.

Este processo combina duas técnicas de separação cromatográfica:

1. Utilização de um gradiente de eluente. Para a purificação de bio-moléculas, é con-

veniente um gradiente suave de solvente, uma vez que muitas atividades biológicas

são influenciadas pela concentração externa e não se deseja uma diferença muito

díspar na concentração de solvente [15];

2. Sistema contínuo em contracorrente simulado, SMB. O processo consiste em várias

colunas cromatográficas, que são comutadas em posição oposta à direção do fluxo,

de modo a otimizar o processo.

Muitas vezes, as resinas preparativas têm uma baixa eficiência devido à forte disper-

são axial e transferência de massa lenta. Deste modo, a utilização de um processo de

purificação com apenas uma etapa cromatográfica não apresenta resultados satisfatórios.

Existem artigos e investigação, realizados no sentido da utilização de sistemas com 6, 3 e

2 colunas. Estes sistemas vão ser analisados, com um nível baixo de detalhe, de modo a

perceber apenas o principio de funcionamento de cada um.

2.3.1 Sistema de 6 Colunas

O sistema, representado na figura 2.8, funciona como duas secções distintas, uma secção

que opera em Bach em que são retirados os compostos conforme especificação (pureza

mínima requerida) e outra zona que opera em contínuo para a qual segue a restante mis-

tura. Ou seja, as frações impuras são transferidas de uma coluna cromatográfica para a

seguinte. Esta reciclagem é feita automaticamente e não requer análise de pureza pos-

terior. Durante esta transferência, são adicionadas correntes de alimentação e eluente

“frescas”. Isto assegura uma operação contínua e conduz a um rendimento elevado.

De modo a perceber como funciona este sistema será explicitado a função de uma

coluna na várias posições:

• Na posição 6, é recolhida a mistura de vW. Seguidamente a coluna passa para a

posição 3, quando a corrente de saída é composta pelo produto-alvo, conforme

especificação.

• Na posição 3, é adicionada a corrente de alimentação e é recolhida a fração corres-

pondente às impurezas que ficam menos retidas, W. A coluna segue para a posição

5 quando a corrente de saída é composta pela mistura de , w, e o produto-alvo ,P.

• Na posição 5, é removida a mistura de w e P. Quando a corrente de saída é composta

pela fração do composto-alvo, conforme especificação, a coluna passa para a posição

2.

13


Figura 2.8: Esquema do sistema MCSGP de 6 colunas, adaptado de [31]. A comutaçãodas correntes de entrada é cíclica e feita em co-corrente, em que o percurso das colunas,relativamente às posições estabelecidas é 6->3->5->2->4->1->6. As colunas que ocupamas posições inferiores operam em batch, onde são recolhidas as frações conforme especi-ficação. Por outro lado as colunas que ocupam as posições superiores operam em modocontínuo, estando interligadas. Adaptado de [31].

• Na posição 2, é recolhida a fração de P. Quando começa a sair uma mistura de S e P,

esta coluna segue para a posição 4;

• Na posição 4, é removida a mistura de P e S. A coluna passa para a posição 1 quando

a corrente de saída deixa de ter o composto-alvo em concentrações relevantes.

• Na posição 1, é recolhida a fração corresponde às impurezas fortemente adsorvidas,

S. A posição 1 corresponde ao fim do ciclo, ou seja, quando a coluna chega a esta

posição a solução já foi separada, pelo que a coluna volta para a posição inicial,6.

Este sistema foi verificado experimentalmente para a purificação da hormona de cal-

citonina, a partir de uma mistura multi-componente de peptídeos. Foi determinado que

para um pureza de 93% (pureza exigida) é alcançado um rendimento próximo de 100%,

no sistema MCSGP. No entanto, a recuperação dos mesmos componentes com o mesmo

grau de pureza, num processo batch, é de 66%. Neste sistema, como em muitos outros, a

produtividade é inversamente proporcional ao rendimento como podemos observar na

figura 2.9


O sistema de 6 colunas pode ser otimizado para a utilização de apenas 3 colunas. Isto é

possível, porque o sistema de seis colunas é constituído por duas secções, a que opera em

14



Figura 2.9: Produtividade em função do rendimento. No presente gráfico podemos esta-belecer uma comparação entre a separação utilizando o MCSGP e batch. Podemos ver quepara a separação recorrendo ao MCSGP é obtida uma produtividade muito mais elevadaquando comparada com a separação em batch. No entanto para MCSGP a relação entrepureza e produtividade é mais acentuada, sendo que o declive da reta é muito maior emmódulo [27].

batch e a que opera em contínuo, sendo que estas secções operam independentemente.

O sistema, de 3 colunas, intercala a operação em batch e contínuo, sendo bastante viável

no sentido de redução de custos com enchimento e custo inicial das colunas e bombas.

No entanto, este processo é semi-contínuo ao invés de contínuo como é o caso do sistema

com 6 colunas.

Adicionalmente o sistema de 3 colunas, representado na figura 2.10, pode ser bené-

fico uma vez que é acrescentado um grau de liberdade. No entanto, num sistema com

6 colunas o tempo de comutação é o mesmo para as duas secções. Pelo contrário, num

sistema em que há apenas uma secção que serve as duas finalidades, o tempo de comu-

tação pode ser distinto. Deste modo, o sistema com 3 colunas opera com dois tempos de

comutação diferente, o tempo tB, onde as colunas operam no modo batch e o tempo tC ,

onde as colunas operam em série.

Analisando a função da mesma coluna em posições diferentes podemos verificar que:

• Posição 3. O Feed é adicionado à coluna, sendo recolhida a fração de vW, em seguida,

é aberta a válvula de modo a recolher a fração corresponde a W. A coluna passa

para a posição 2 quando a corrente de saída contém uma mistura de W e P.

• Posição 2. Primeiramente é re-circulada a mistura de w e p, em seguida é recolhida

a fração "pura"de P. A coluna passa para a posição 1 quando a corrente de saída

contém uma mistura de S e P

• Posição 1. Primeiramente é recirculada a mistura de s e P, em seguida é recolhida a

15


Figura 2.10: Esquema de montagem de um processo MCSGP de 3 colunas. Adaptado de[28].

fração “pura” de S. No final deste passo, a coluna presente nesta posição volta para

a posição 3 e o processo é repetido.


O MCSGP de 2 colunas, representado na figura 2.11, é utilizado para a separação semi-

continua de misturas ternárias. No entanto é propício o uso de misturas em que não haja

componentes com tempos de retenção muito díspares, deste modo a separação conse-

gue ser realizada nas duas colunas disponíveis, não sendo necessária a utilização de um

solvente mais “forte” para a dessorção das moléculas mais retidas [29].

Figura 2.11: Esquema do sistema MCSGP de 2 colunas. A mistura é alimentada à coluna1, e as frações puras são removidas do sistema e coletadas enquanto que as zonas desobreposição tanto de W e P como P e S são encaminhadas para a coluna 2. Na coluna 2as zonas de sobreposição são separadas, aumentando o rendimento do processo [29].

Experimentalmente, uma das utilizações deste processo, é a separação de uma mistura

proveniente de canábis. Nesta mistura o produto alvo é um composto utilizado para o

16

2.4. GRADIENTE DE SOLVENTE COM RECICLO EM ESTADO ESTACIONÁRIO

alivio das dores, Canabidiol, no entanto é necessário remover os restantes componentes

como é o caso da Tetraidrocanabinol (THC), que tem efeitos psicoativos.

2.4 Gradiente de solvente com reciclo em estado estacionário

O sistema de Gradiente de solvente com reciclo em estado estacionário, GSSR em inglês,

é um processo cromatográfico para a separação de misturas ternárias que opera em semi-

contínuo e está representado na figura 2.12. Mais concretamente, consiste na disposição

em serie de 3 colunas cuja concentração do solvente alimentado é feita sob a forma

de gradiente, para eluição dos compostos e a mistura alimentada ao sistema vai sendo

separada [32].

Este processo é análogo ao de MCSGP de 3 colunas, na medida em que simula o

movimento de contracorrente e faz uso do gradiente da concentração do solvente. No

entanto, a corrente de alimentação é sempre injetada na mesma coluna e o produto sempre

recolhido na mesma coluna. O processo pode ser observado como a sobreposição de três

eventos, um passo de alimentação, outro respetivo ao movimento e gradiente do solvente,

e por fim a recolha de produto.

Um dos parâmetros para a seleção do solvente ou o intervalo do gradiente, é a zona de

interceção entre as impurezas e o composto alvo. Esta sobreposição pode ser de elevada

dimensão, pelo que são necessários gradientes suaves de eluente de modo a separar estas

frações. Adicionalmente, para mistura com impurezas que ficam fortemente absorvidas

é necessária uma limpeza no local, sendo que esta limpeza é feita com um solvente mais

forte que os anteriormente utilizados.

Em termos de funcionamento este sistema será observado com maior detalhe no ca-

pitulo de simulação, onde será realizado um Case study deste processo e vão ser expli-

citados os vários passos de cada ciclo, assim como algumas variáveis de processo, como

concentração e caudal de solvente e tempos de comutação. O processo de GSSR foi expe-

rimentalmente validado para a separação de uma mistura de peptídeos numa coluna de

fase reversa. A mistura de peptídeos continha cerca de 5% (V/V) de produto-alvo, sendo

que algumas das impurezas tinham tempos de retenção muito idênticos ao do produto de

interesse. Perante estas condições e para uma pureza de 98% do produto-alvo foi alcan-

çado um rendimento de 95.3% relativamente ao produto desejado. Por outro lado, num

processo batch foi estimado um rendimento de apenas 52% para a mesma pureza [32].

17


Figura 2.12: Esquema gráfico do sistema GSSR e das várias correntes conectadas às co-lunas. Podemos repara que a corrente de alimentação está apenas conectada à entradada coluna na posição 1 e por outro lado a corrente de recolha de produto está apenasconectada à saída da coluna da posição 3 [32].

18

Capítulo

3Protótipo Desenvolvido

A revisão bibliográfica foi fundamental para idealizar e conceber um novo sistema. Como

foi observado no capitulo da revisão bibliográfica, muitas das soluções existentes são uma

variação do sistema MCSGP. O presente sistema tem como base a união de um sistema

MCSGP de 3 e 2 colunas.

O objetivo do presente capitulo é de explicitar o sistema em termos funcionais, ou

seja, analisar a função dos vários elementos. Adicionalmente, serão também explicita-

dos os materiais e métodos utilizados para a montagem e realização de experiências de

confirmação da correta montagem do sistema.

3.1 Descrição

Em termos funcionais é importante salientar e interpretar algumas das características

mais relevantes do sistema:

1. Tipo e funcionamento das bombas;

2. Reciclo das corrente de entrada;

3. Entrada das correntes de alimentação e de solvente;

4. Saída de produto;

5. Circuito entre colunas;

6. By-pass de colunas;

7. Leitura UV.

3.1.1 Funcionamento da bomba

Em termos de funcionamento da bomba, podemos considerar dois tipos de bomba:

19

CAPÍTULO 3. PROTÓTIPO DESENVOLVIDO

Bomba isocrática, ou seja não realiza gradiente de concentrações. Esta bomba tem

unicamente a função de extrair o liquido e fornecer-lhe pressão. É utilizada para a corrente

de alimentação e dos solventes, cuja concentração se mantém constante.

Bomba não isocrática, ou de gradiente, que permite alterar as concentrações de sol-

vente. Esta bomba pode realizar a mistura de dois solvente alterando a concentração da

mistura final. Por exemplo, para uma concentração de 5/95 (%V/V) de etanol/água a

bomba irá misturar 5% de etanol e 95% de água, ou para uma concentração de 50/50

(%V/V) de etanol/água a bomba irá misturar 50% de etanol e 50% de água. O gradiente

pode ser linear, ou seja a variação da concentração é constante ao longo do tempo. Por

outro lado, o gradiente pode ser realizado em degrau, em que a variação da concentração

é realizada periodicamente.

Um das alternativas à bomba de gradiente seria a utilização de duas bombas isó-

craticas, em que cada uma fornece um caudal volumétrico, consoante a concentração

pretendida. Mais à frente, na secção 6.4, será estudada a eficiência da mistura realizada

pela bomba de gradiente.

3.1.2 Reciclo das correntes de entrada

Em todas as saídas da bomba existem dois caminhos possíveis, o que segue para o sistema

e o que volta para o recipiente, que constitui um reciclo da solução alimentada. Este

reciclo é feito de modo a que, quando a solução em causa não é utilizada, volta para

o recipiente andando em loop. Esta reciclagem poderia ser evitada com a paragem da

bomba, no entanto, o processo de ligar/desligar a bomba não é instantâneo e pode causar

variações no caudal. Exemplificando, para a corrente de alimentação, F, a bomba está

continuamente a retirar o líquido do recipiente F e a enviá-lo para a corrente C1, se as

válvulas adjacentes às correntes C3, C4 e C5 estiverem fechadas ir-se-ia criar pressão

no sistema e a bomba atingiria a pressão máxima. No entanto a válvula adjacente à

corrente C2 é aberta fazendo com que o líquido saía do recipiente, passe pela bomba para

a corrente C1, seja encaminhado para a corrente C2 e por fim segue novamente para o

recipiente F.

3.1.3 Entrada das correntes de alimentação e de solvente

Em termos das entradas das correntes de alimentação e solventes, estas são auto explicati-

vas tendo em conta a figura 3.1. As correntes que serão alimentadas à coluna convergem

no conector colocado anteriormente à própria coluna.

Recorrendo novamente à corrente de alimentação, como exemplo, será explicado o

percurso da solução desde o recipiente de alimentação, F, passando pela coluna 1 e aca-

bando no recipiente de resíduos. O líquido é recolhido pela bomba, passa pela corrente

C1, como a corrente C2 está “fechada”, o líquido continua na C1 seguindo para o conector

A3. O conector A3 junta 4 correntes, 1 de entrada e 3 de saída, podendo apenas estar

"aberta"a corrente de entrada e apenas uma corrente de saída. A solução segue para a

20

3.1. DESCRIÇÃO

coluna 1, pelo que a corrente C3 está aberta e as correntes C4 e C5 estão "fechadas". O

líquido passa pelo conector A6, é direcionado para a corrente C17, passa pela coluna pela

corrente C20, C23, C24 chegando ao conector A9, onde a corrente é direcionada para a

corrente C33 ("fechando"as correntes C27, C30 e C38).

3.1.4 Saída de produto

Quando o líquido sai da coluna pode percorrer vários caminhos, sendo que um deles

leva à sua remoção do sistema. Mais concretamente, para o caso de remoção do sistema,

o líquido pode ser recolhido para o recipiente de produto, P, ou de impurezas, W. É de

salientar que esta remoção é feita na totalidade do caudal volumétrico e por frações de

tempo. Recorrendo ao exemplo anterior, de modo a completar o percurso do líquido que

entra na coluna 1, assumimos que a válvula adjacente à corrente C30 está “aberta” (conse-

quentemente as válvulas das correntes C33, C27 e C38 necessitam de estar “fechadas” de

modo a direcionar o fluido para a corrente C30). Deste modo o líquido passa pela bomba

de alimentação, passa pela corrente C1, segue para a corrente C3, passa pela coluna 1,

e quando sai da coluna 1 segue pelas correntes C20, C23 e C24. No conector o líquido

é direcionado para a corrente C30 pelo que segue para o recipiente de produto, onde é

recolhido.

3.1.5 Circuito entre colunas

Retomando os caminhos possíveis que o líquido pode percorrer aquando da saída da

coluna, vamos agora explorar a possibilidade deste ser reciclado, seguindo para a próxima

coluna. O objetivo do sistema reside na recirculação da fração impura em vez de ser

descartada, pelo que pode ser enviada para qualquer coluna. Normalmente, a mistura

proveniente da coluna anterior é também misturada com uma solução “fresca”, no entanto

esta atuação depende do planeamento do sistema. Retomando aos exemplo e recorrendo

agora ao caso em que a corrente de alimentação entra na coluna 3 e a válvula adjacente à

corrente C40 está aberta (as válvulas das correntes C28, C32 e C35 necessitam de estar

“fechadas”). Neste caso a corrente sai da coluna 3 passando pelas correntes C22, C26,

chegando à bifurcação onde pode seguir vários caminhos no entanto segue pela corrente

C40 que irá levar ao conector A6 onde esta corrente pode ser misturada e é alimentada à

coluna 1 (abrindo a válvula da corrente C17).

3.1.6 By-pass de colunas

A última possibilidade existente aquando da saída do fluido da coluna, consiste igual-

mente no reciclo da mistura, no entanto este reciclo pode ter como destino qualquer uma

das restantes colunas. Esta funcionalidade é ótima se alguma das colunas estiver em fase

de limpeza ou no caso de não ser necessária a passagem por três colunas para a purifica-

ção da solução. Em termos de flexibilidade, este processo demonstra vantagem em relação

21


àqueles previamente revistos no capitulo de revisão bibliográfica, uma vez que o sistema

pode receber misturas com características diferentes, isto é, que tenham maior ou menor

necessidade de separação conforme as zonas de interceção entre o produto e as impurezas.

É conciliado o processo de MCSGP de 3 e o de 2 colunas. De modo análogo aos pontos

anteriormente apresentados, irá ser demonstrado o fluxo do líquido, fazendo uso desta

funcionalidade. Neste exemplo vamos supor que a mistura proveniente da coluna 1 é

enviada para a entrada da coluna 3 e a saída desta é enviada para produto. Respeitando

a condição anterior, o caudal de fluido segue pelas correntes C17 onde é alimentado à

coluna 1, seguidamente sai da coluna 1 por via da corrente C20, segue pela C23 e 24

e no conector A9 o fluido é direcionado para a corrente C27 (fechando as válvulas das

correntes C30, C33 e C38). A corrente C27 constitui um by-pass à coluna 2 pelo que vai

diretamente para o conector A8 e depois para a corrente C19 que constitui a entrada da

coluna 3, aquando da saída a válvula C32 está aberta e o líquido é encaminhado para o

recipiente de recolha de Produto.

3.1.7 Leitura UV

As células UV servem para a análise da concentração das correntes, que é feita através

da absorvância recorrendo a um espetofotometro. Deste modo podemos realizar experi-

ências de modo a analisar da interação sólido-líquido, de várias misturas. Pode também

ser realizada a validação experimental, de modo a observar a correspondência entre a

simulação e a realidade. Recorrendo ao UV1, é também possível a análise das correntes,

sem que estas passem pela coluna, para tal é necessário abrir a válvula da corrente C16 e

fechar a válvula da corrente C17.

A versão, desenvolvida até à data, referente ao flowsheet do processo, está representada

na figura 3.1.

3.2 Materiais

O sistema é composto, em termos de colunas, por três colunas com dimensões de 1x10

cm de aço inoxidável empacotadas com uma resina de Kromasil C18.

• O enchimento de Kromasil C18 é composto por uma base esférica de sílicas reves-

tida com hidrocarbonetos compostos por cadeias de 18 átomos de carbono. Este

enchimento, devido às propriedades químicas das cadeias acopladas, é altamente

hidrofóbico, tendo um tamanho de poro de 100 Å.

• A combinação do elevado volume de poros e da área superficial juntamente com a

excelente estabilidade mecânica e química, tornam o Kromasil uma resina ideal para

a separação de uma grande variedade de substâncias, especialmente substâncias que

requerem um elevado grau de pureza, como é o caso dos peptídeos e proteínas que

são utilizados como fármacos [33].

22

3.2. MATERIAIS

Figura 3.1: Flowsheet do processo desenvolvido

23


• As interações iónicas entre os peptídeos e os grupos residuais de silanol, presentes

na maioria dos enchimentos, produzem um pico com cauda, o que é indesejável.

Para evitar o sucedido, o Kromasil é submetido a um processo de end-caping, que

elimina estes grupos residuais de silanol, diminuindo portanto o efeito de tailing[33] [34].

Através da caracterização das colunas dois e três podemos ainda inferir que a po-

rosidade total da coluna 2 é de 74% e 73% para a coluna 3. Em termos de porosidade

externa a coluna 2 apresenta o valor de 34% e a coluna 3 de 37%. Os dados e análise

referentes à caracterização das colunas serão explicitados na secção 6.2. A coluna 1 não

foi caracterizada devido à dificuldade na ligação entre a bomba, a coluna e a célula UV.

As válvulas utilizadas no sistema são do tipo ON/OFF, ou seja, permitem apenas

a passagem ou não do líquido. As válvulas utilizadas são do modelo SFVO da Valco

International, com atuação pneumática, ou seja, a aplicação de uma certa pressão “abre”

a válvula (esta pressão é fornecida à válvula por meio de um sistema de ar comprimido).

Globalmente falando foram utilizadas 26 válvulas.

Em termos de monitorização da solução por espectrofotometria são necessários:

• Fonte luminosa que emite um feixe de luz com intensidade constante que é direcio-

nado para o sensor de UV por meio de um cabo de fibra ótica. A fonte luminosa é

do tipo DH-2000-S-DUV.

• Sensor UV que recebe, numa das extremidades a luz de intensidade constante, di-

recionada esta luz fazendo-a passar pela solução e emite a luz resultante para o

espectrofotómetro, por meio de um cabo de fibra ótica.

• Espectrofotómetro que recebe a luz proveniente da célula UV e mede a intensidade

da luz. Este detetor funciona a vários comprimentos de ondas sendo que o modelo

é o USB2000 da Ocean Optics, com atenuador.

Referentemente às bombas, como anteriormente referido foram utilizadas duas bom-

bas distintas, uma isocrática e outra não-isocrática. Como bomba isocrática foi utilizado

o modelo K501 da Knauer, com uma cabeça de 10ml. Por outro lado, para a bomba não

isocrática foi usado o modelo S-1050, sem câmara de mistura. Ambas as bombas estão

conectadas ao computador por via RS232.

Em termos de capilares, os utilizados são próprios para aguentar altas pressões, uma

vez que são de HPLC. Percentualmente a diferença entre diâmetro interno e externo é

elevada, o que os torna resistentes a elevadas pressões. Em relação ao volume morto, este

deve ser reduzido ao máximo, através da redução do comprimento dos capilares utili-

zados. No entanto, deve ser estabelecido um equilíbrio relativamente ao comprimento

dos capilares, ou seja, um equilíbrio entre o volume morto e a funcionalidade do sis-

tema. A figura 3.2 demonstra o objetivo para esta montagem da instalação em termos de

distribuição dos materiais e secções.

24

3.3. COMUNICAÇÃO COM O SISTEMA

Figura 3.2: Estrutura física da instalação

Analisando a figura 3.2 vemos que, no canto superior esquerdo, estão dispostas as

válvulas responsáveis pelo sistema de reciclo do líquido. No lado esquerdo, estão os equi-

pamentos que não necessitam de estar a uma temperatura controlada, como é o caso das

bombas e das balanças (idealmente os recipientes deveriam estar a uma temperatura con-

trolada, no entanto devem estar próximos das bombas). No lado direito, estamos perante

um sistema fechado, uma vez que a temperatura deve ser controlada, atuando no grau de

refrigeração do sistema, através de uma ventoinha presente no sistema. Relativamente a

este sistema: As colunas, idealmente, estão presas num cilindro que se situa no centro;

As válvulas (sem ser as de reciclo) serão colocadas num suporte próprio, que se encontra

nas extremidades inferiores; Os capilares que transportam o líquido da parte esquerda da

instalação para o interior do sistema, são passados sob o tabuleiro do sistema, passando

através de cavidades para o seu interior.

3.3 Comunicação com o sistema

Como foi referido anteriormente no enquadramento, é extremamente benéfica a utiliza-

ção de um sistema automatizado. Como não poderia deixar de ser, perante um sistema

destes, que é extremamente preciso, foi desenvolvido um método de comunicação entre

o computador e o sistema. Este programa, ChromatographyStudio, permite a comunicação

com vários elementos do sistema, tendo sido escrito na linguagem de programação Julia.

25


O desenvolvimento deste sistema foi realizado pelo grupo de investigação do Professor

José Paulo Mota. Este software foi utilizado, no presente trabalho, na monitorização de ex-

periências para averiguar a correta montagem do sistema e para a realização de algumas

experiências.

Atualmente a comunicação entre o computador e o sistema permite:

• Abrir e fechar válvulas;

• Controlar parâmetros de funcionamento das bombas;

• Monitorizar os dados fornecidos pelo espetrómetro.

Em termos de controlo e comunicação com a bomba isocrática, é possível definir

o caudal. Por outro lado, é também possível controlar a bomba de gradiente, havendo

múltiplas possibilidades. É possível definir o nível de mistura de cada componente, ou

seja, a percentagem volumétrica de cada composto presente na mistura, assim como

definir, percentualmente, as concentrações inicial e final dos vários compostos, assim

como o tempo desta variação.

Para ambas as bombas, podem ser criados programas que permitem o planeamento

das experiências, em que podem ser definidos tanto a duração de cada passo como os

vários passos.

26

Capítulo

4Modelo matemático

4.1 Balanço mássico

De modo a descrever, o perfil de concentração do fluido ao longo da coluna cromatográfica

é necessário estabelecer, matematicamente, o balanço mássico. É necessário definir os

fluxos das correntes de entrada e saída, assim como o termo de acumulação. Estas relações

estão definidas nas equações 4.1, 4.2 e 4.3, respectivamente.

Relativamente aos termos de entrada e saída temos de ter em conta o termo de disper-

são axial, DL, que reflete a dispersão axial existente, conduzindo ao consequente atraso

da solução, em termos de concentração. O termo de entrada é constituído pelo fluxo de

entrada, Ni,z, e o termo de saída pelo fluxo de saída,Ni,z+∆z.

Ni,z = εS(uCi −Dl,i

∂Ci∂z

) ∣∣∣∣∣z,t

(4.1)

Ni,z+∆z = εS(uCi −Dl,i)

∂Ci∂z

) ∣∣∣∣∣z+∆z,t

(4.2)

O termo geral de acumulação é constituído pois dois termos, o primeiro corresponde

ao líquido fora das partículas e o segundo diz respeito ao líquido que está retido nas

partículas, como está representado na equação 4.3, [23].

Acumulado = S∆z(ε∂Ci∂t

+ (1− ε)∂Cs,i∂t

) ∣∣∣∣∣z,t

(4.3)

Em que i é o índice que se refere aos diversos componentes (i = 0 é o índice que denota

o solvente), C é a concentração na fase líquida, Cs é a concentração na fase sólida, ε é a

porosidade do leito, t refere-se às coordenadas de tempo, z à coordenada referente ao

comprimento da coluna, DL o coeficiente de dispersão axial, u a velocidade intersticial do

líquido e por fim, S que é a área da secção reta (unidades de comprimento 2).

27

CAPÍTULO 4. MODELO MATEMÁTICO

A equação 4.5 corresponde à equação geral de balanço de massa para uma coluna

cromatográfica, que descreve, em termos de concentração, o fluxo dos vários compostos

ao longo da coluna. Analisando agora a equação, vemos que os primeiros dois termos são

referentes à acumulação, tanto na fase móvel como na fase estacionária, respetivamente.

O terceiro termo diz respeito à transferência de massa por convecção e, no lado direito da

igualdade, o termo é referente ao efeito de dispersão axial.

De modo a proceder ao balanço de massa é necessário agregar as várias equações acima

apresentadas, respeitando a equação 4.4 de balanço de massa geral, através da relação

entre variáveis e considerando um elemento infinitesimal de comprimento (z→ 0).

Entra = Sai +Acumulado (4.4)

∂Ci∂t

+1− εε

∂Cs,i∂t

+u∂Ci∂z

=Dl,i∂2Ci∂z2 (4.5)

Na elaboração do balanço mássico são assumidas algumas condições que permitem a

simplificação das condições de entrada, saída e adsorção [23]. É então considerado que:

• A dispersão axial é constante ao longo da coluna;

• A velocidade é constante ao longo da coluna;

• O fator de dispersão axial é constante em todo o comprimento da coluna;

• O fator de compressibilidade é nulo;

• O volume molar das substâncias é o mesmo em ambas as fases da coluna;

• Não há efeitos térmicos (energia de adsorção é considerada 0) e consequentes fatores

associado à variação de temperatura no sistema, tanto em termos de adsorção como

em termos de mobilidade;

• A coluna está sob condições operatórias constantes.

4.2 Condições Iniciais

É necessário definir os parâmetros para o início do processo, isto é, para t=0.

No caso da cromatografia, inicialmente a coluna não contém as substâncias alvo de

separação. A concentração destas espécies na corrente de alimentação (sem contar com o

solvente, em que i=0) é nula, como mostrado na equação 4.6.

Ci∣∣∣z,t=0

= 0 (4.6)

Por outro lado, é também necessário definir a concentração inicial de solvente. Inicial-

mente, a fase móvel é composta pelo solvente de dessorção. Deste modo, a concentração

desta substância, C0 , é equivalente à concentração da solução alimentada, Cin0 . Esta rela-

ção é explicitada na equação 4.7.

28

4.3. CONDIÇÕES FRONTEIRA

C0

∣∣∣z,t=0

= Cin0 (4.7)

Ambas as equações apresentadas são válidas para o domínio de 0 < z < L, sendo que

para z = 0 e z = L existem descontinuidades. Nestes pontos de descontinuidade, são

necessárias condições fronteira para descrever estas zonas, de modo a completar o resto

do domínio.

4.3 Condições Fronteira

As condições fronteira partem do principio que na parcela infinitesimal entre 0- e 0+ não

existe dispersão, pelo que a equação elementar desta zona é:

Ni,0− =Ni,0+ (4.8)

Resolvendo esta equação com base nas equações 4.1 e 4.2 considerando o fluxo para

0+, chegamos à equação 4.9

uCi −DL,i∂Ci∂z

∣∣∣z=0

= Cini (4.9)

Por outro lado, no final da coluna, a concentração é contínua e não há variação na

concentração. Em termos matemáticos obtemos a equação 4.10.

∂Ci∂z

∣∣∣z=L

= 0 (4.10)

As equações 4.9 e 4.10 são as condições fronteira de Danckwerts [35]. Foram conside-

radas estas equações pois, embora existam várias condições fronteira, as de Danckwerts

são as mais realistas, uma vez que consideram a continuidade do sistema contrariamente

a alterações em pulso [36].

4.4 Dispersão Axial

O termo que contempla a dispersão axial,Dl , é muitas vezes relacionado com a altura equi-

valente de um prato teórico, Hl , que é diferente consoante o composto considerado.Esta

relação é demonstrada sob a forma matemática na equação 4.11 [36].

Dl,i =Hl iL

2t0=Hl iu

2(4.11)

Em que t0 é o tempo de hold-up da coluna, t0 = Lu .

Por sua vez, a altura equivalente do prato teórico está relacionada com as restrições

difusionais, pelo que é comum relacionar este termo com um termo que exprime estas

restrições difusionais, o Peclet. O Peclet hidrodinâmico, P e, é um numero adimensional

que compreende o rácio entre dois modos de transporte, a convecção e difusão [35]. A

relação entre P e e Hl é dada pela equação 4.12.

29

CAPÍTULO 4. MODELO MATEMÁTICO

P e =uLDL

=2LHl

(4.12)

Adicionalmente, é possível obter um altura de prato adimensional, hl , em que hl = HlL .

Obtendo o número de Peclet em função da altura adimensional do prato teórico, equação

4.13.

P e =uLDL

=2hl

(4.13)

4.5 Adsorção

A adsorção é um fenómeno de agregação de moléculas numa superfície sólida, que leva à

transferência de uma molécula entre o fluido e a superfície do sólido. Na maioria dos casos

este processo é descrito, aquando do equilíbrio da transferência do composto, por meio

de equações que quantificam a quantidade de substância presente no sólido em função

da concentração do mesmo componente no fluido. Estas equações são as isotérmicas, no

entanto estas dependem também das várias cinéticas presentes no processo de adsorção

[37].

4.5.1 Isotérmica

A isotérmicas de adsorção de um composto reflete a quantidade de massa adsorvida por

volume de sólido em função da concentração total do composto no líquido, isto é, que foi

alimentada ao sistema. A descrição das isotérmicas é um tema muito vasto pelo que vai

apenas ser abordado de uma maneira pouco aprofundada.

Normalmente, quando a concentração total do componente presente no sistema au-

menta a quantidade adsorvida é também incrementada. No entanto, esta subida pode não

ser linear, podendo ser do tipo de Langmuir ou anti-Langmuir, como podemos observar

na figura 4.1.

Figura 4.1: Representação gráfica de vários tipos de Isotérmica.A isotérmica de Lang-muir tem um carácter logarítmico enquanto que a isotérmica de anti-langmuir exibe ocomportamento contrário, ou seja, exponencial [36].

30

4.5. ADSORÇÃO

4.5.2 Cinética de adsorção

A cinética de adsorção contempla, como próprio nome indica, as várias cinéticas no pro-

cesso de adsorção. A cinética global de adsorção reflete a taxa de transferência de massa

entre o líquido e o sólido, explicitando a concentração de componente presente no sólido.

No caso da cromatografia de afinidade, mais concretamente da separação de peptídeos

formados por longas cadeias, a transferência de massa é bem aproximada a uma cinética

linear de transferência de massa entre o líquido e o sólido, uma vez que a velocidade de

transferência de massa é baixa. A concentração de componente na fase sólida ao longo

do tempo é dada pela equação 4.14, pelo que a função g depende da isotérmica que

por sua vez contempla a cinética da transferência de massa, exceptuando o caso em que

se considera um modelo de equilíbrio. A função contempla também as velocidades de

adsorção e dessorção, que por sua vez dependem das concentrações dos compostos no

líquido e no sólido assim como a concentração do solvente [36].

∂Cs,i∂t

= gi(C1, ...,Ci ,C0,Cs,1, ...,Cs,i

)(4.14)

A cinética de adsorção trata-se de um balanço entre a adsorção e a dessorção cuja

variação de massa no sólido, ao longo no tempo, corresponde à diferença entre a (1) massa

adsorvida e a (2) massa dessorvida [36].

(1) A massa adsorvida ao longo do tempo é proporcional a uma constante de adsorção,

Ka, e depende, tanto da disponibilidade de adsorção por parte do adsorvente, como da

concentração do composto no líquido.

(2) A massa dessorvida ao longo do tempo é proporcional à massa adsorvida, em que

a razão de dessorção é dada por Kd .

Quando temos uma maior concentração do composto quer dizer que temos um maior

numero de moléculas disponível para o local de adsorção e probabilisticamente falando

é mais fácil que as moléculas sejam adsorvidas. Para uma adsorção linear, a quantidade

de massa adsorvida é igual a uma constante de adsorção multiplicada pela concentração

de massa presente no líquido.

Este balanço é verificado na equação 4.14, em que o primeiro termo diz respeito à

adsorção, que por sua vez depende de uma constante de adsorção, Ka, e contrariamente,

uma termo de dessorção que é proporcional à constante de dessorção, Kd .

∂Cs,i∂t

= ka(qs,i −Cs,i

)− kdCs,i (4.15)

O conjunto de equações apresentadas neste capitulo têm a função de descrever, em

termos de concentração, a composição da corrente ao longo duma coluna cromatográfica.

Primeiramente foi apresentado o balanço mássico e, em seguida, o termo de adsorção.

31

Capítulo

5Modelo e Simulação

O objetivo do capítulo consiste na apresentação e explicação dos modelos matemáticos

relativos ao sistema, assim como a integração destes de modo a realização a simulação

do sistema. Uma vez que o sistema não está totalmente desenvolvido, foi realizado um

case study de um dos sistema revistos no capitulo 2, que é utilizado para a separação de

misturas de peptídeos em semi-contínuo, o GSSR.

5.1 Descrição dos modelos

As diferentes equações matemáticas que regem o sistema, apresentadas anteriormente,

têm de ser relacionadas entre si. Adicionalmente, em termos matemáticos, algumas das

equações são de difícil resolução, especialmente a equação 5.18, que é uma equação

diferencial parcial de segunda ordem. Através da simulação é ainda possível obter todo o

perfil de concentração ao longo do tempo e espaço dos vários componentes. Deste modo

foi utilizado o programa gPROMS, que resolve estes sistemas.

Primeiramente, foi realizado código em gPROMS referente às várias partes integrantes

do sistema de modo a explicitar o processo. Deste modo foram construídos os seguintes

modelos:

1. Coluna. Descreve a variação de concentração ao logo da coluna.

2. Entradas e saídas. Indica como se processam as entradas e saídas da coluna, tanto

em termos de concentração como de caudal.

3. Ligação entre colunas. Reflete o modo como é feita a ligação entre colunas, em

termos de concentração e volume, ou seja, a relação entre três modelos do tipo 2.

33

CAPÍTULO 5. MODELO E SIMULAÇÃO

5.1.1 Coluna

De modo a simular a variação de concentração ao longo da coluna, foi realizado um

modelo onde foram inseridas as equações 4.5, 4.9, 4.10, 4.6, 4.7, interligadas entre elas.

É também necessário definir as variáveis e as constantes necessárias.

A coordenada axial foi definida separando o comprimento total em várias partes. É

ainda importante definir as posições de entrada e saída, uma vez que são locais onde são

inseridas descontinuidades e onde as equações fronteira são aplicáveis.

Figura 5.1: Modelo referente à coluna cromatográfica. Este modelo descreve a variação daconcentração ao longo do espaço e tempo

Em termos de dados fornecidos (input) temos a concentração de entrada, cin, e o caudal

volumétrico, Qv. Por outro lado, temos os dados que são obtidos através dos restantes

modelos que é o caso da concentração de saída cout.

5.1.2 Entradas e Saídas

Este modelo explicita as relações que definem o sistema em termos de volume e concen-

tração das entradas e saídas.

Explicando, cada coluna tem (1) uma corrente de alimentação e (2) uma corrente de

saída.

(1) A contente de entrada da coluna, Qvin, resulta da conjugação de várias correntes.

A corrente de entrada compreende as correntes de saída das restantes colunas, Qvprev ,

alimentação,QvF , e os vários eluente,QvEn (em que E indica que é um solvente e o índice

n o tipo). A equação 5.1 reflete esta relação.

Qvinj =Qvprevj +QvFj +Ns∑En=0

QvEn(5.1)

O índice inferior, j, denota o numero coluna, o índice superior, corresponde à corrente,

em que in é a corrente de entrada, F a alimentação e, En os solventes utilizados.

Alem do balanço volumétrico, é necessário realizar o balanço mássico, em que o prin-

cipio adjacente é que, a massa de entrada tem de ser igual à massa de saída. Este balanço é

realizado em separado para os componentes presentes na alimentação e para o composto

responsável pela dessorção (i=1:5). A equação 5.2 é referente ao balanço de massa do

34

5.1. DESCRIÇÃO DOS MODELOS

composto a separar e a equação 5.2 corresponde ao balanço mássico ao composto para

dessorção.

QvFj CFi,j +Qvprevj C

previ,j =Qvinj C

ini,j (5.2)

Qvinj,EtOHcinj,EtOH =

Ns∑En=0

QvEn × cEnEtOH,j +QvprevcprevEtOH,j (5.3)

(2) Por outro lado, a corrente de saída que é igual, em termos de caudal, à corrente de

entrada, divide-se em várias corrente. A corrente proveniente da coluna ,Qvin, pode dar

origem à corrente de produto,QvP , de resíduo,QvW , e a própria corrente de saida,Qvout.

Contrariamente à corrente de entrada, a corrente de saída não necessita de um balanço

mássico, uma vez que as correntes, que dela degeneram têm todas a mesma concentração,

sendo apenas necessário estabelecer o balanço volumétrico, que está representado na

equação 5.4.

Qvoutj =Qvinj −QvPj +QvWj (5.4)

Estas correntes, são controladas por válvulas, vcorrentecoluna , e estas têm um carácter binário

ou seja, quando a válvula está fechada o líquido não passa, no entanto, quando a válvula

está aberta o líquido continua o seu percurso normal. Esta condição é estabelecida através

das equações 5.5 a 5.8. No caso das correntes de entrada de solvente, estas podem

estar "abertas"caso sejam alimentadas ao sistema ou "fechadas"quando não são inseridas

no sistema. Por outro lado, a corrente de saída tem vários “caminhos” possíveis que

são definidos consoante a posição da válvula. Como estas válvulas derivam da mesma

corrente elas estão dependentes umas das outras, pelo que, pode apenas estar uma válvula

aberta em simultâneo.

QvPj =Qvinj × vPj (5.5)

QvWj =Qvin × vwj (5.6)

QvFj =QvF,in × vFj (5.7)

QvEnj =QvEn,in × vEnj (5.8)

Em que o líquido antes da válvula é Qvcorrente,in e depois da válvula é Qvcorrente

A posição destas válvulas muda ao longo do tempo e é controlada consoante os passos

que são pretendidos, pelo que estas são definidas na parte da calendarização (Scheduleem inglês).

35


Figura 5.2: Esquema do modelo referente às entradas e saídas da coluna. O modeloexplicita as relações das correntes que convergem no conector antes da coluna e dascorrentes que divergem do conector depois da coluna. As relações são realizadas a nívelde balanços de caudal e de massa.

5.1.3 Ligação entre colunas

A função deste modelo é de relacionar as variáveis das diferentes colunas. Anteriormente,

no modelo que define as correntes de entrada e saída é explicitado o cálculo das correntes.

No entanto, é necessário definir a conexão entre as várias colunas de modo a estabelecer

a relação entre as variáveis que entram nos cálculos do modelo anterior. Em termos de

representação gráfica, o modelo é transcrito a figura 5.3 .

Figura 5.3: Modelo de ligação entre colunas. Este modelo faz uso dos vários modelosanteriormente utilizados. No entanto, o objetivo é o de estabelecer a relação entre asvárias colunas, ou seja, definir as correntes representadas por Qvprev através do uso dascorrentes de Qvout.

Mais concretamente, uma da parcelas de entrada na coluna é proveniente das outras

colunas. A corrente, P rev, corresponde à soma das correntes de saída das outras colunas.

Em termos de caudal, esta relação é descrita pelas equações 5.9 a 5.11.

Qvprev1 =Qvout3 +Qvout2 (5.9)



Qvprev1 C

previ,1 =Qvout3 Couti,3 +Qvout2 Couti,2 (5.12)

36

5.2. CASE STUDY

Qvprev2 C


Qvprev3 C


5.1.4 Gradiente de solvente

No presente sistema é utilizado um gradiente de solvente, sendo que este é representado

pela corrente de solvente EG. Em termos de caudal, esta corrente mantém-se constante

(quando é utilizada), no entanto há um gradiente de concentração. Este gradiente de

concentração é linear e pode ser descrito pela equação 5.15, no entanto, é necessário esta-

belecer a concentração máxima,CEGmax, e a concentração mínima,CEG0 , sendo que o declive

depende do tempo necessário para ir de uma concentração a outra, ou seja o tempo de

alimentação, τ .

cEG (t) = cEG0 +cEGmax − c

EG0

τ(5.15)

5.2 Case study

De modo a testar o código escrito, foi realizado um case study relativamente ao sistema

GSSR, em que os parâmetros utilizados são referentes ao mesmo, cujos dados estão des-

critos no artigo de apresentação deste sistema [32].

5.2.1 Balanço mássico da coluna

O balanço mássico à coluna do sistema de GSSR, é um pouco mais particular, relativa-

mente àquele apresentado na equação 4.5.

Relativamente ao termo de adsorção do composto, este pode e deve ser relacionado

com o gradiente de concentração da fase móvel pelo que é necessário modificar a equação,

4.15. Quanto maior a concentração de solvente, menor será a força de interação entre

o composto e o sólido pelo que é necessário verificar a relação entre a isotérmica e a

concentração de solvente. Adicionalmente, a isotérmica pode ser considerada linear, ou

seja, a relação entre a massa adsorvida e a concentração da mistura é linear, uma vez que

são alimentadas concentrações baixas dos componentes. O termo que rege a isotérmica,

é a constante de Henry, Hi sendo que este termo pode ser dividido. Dentro da constante

aparente de Henry temos uma verdadeira constante de Henry, H0, que se estabelece um

relação de proporcionalidade com a concentração do solvente, esta relação está descrita

na equação 5.16.

Hi =H ′icni0

(5.16)

37


Em que H ′i e ni são parâmetros obtidos por ajuste dos dados experimentais. Obtendo

a constante de Henry, Hi . Analisando a equação 5.16, vemos também que a relação entre

a constante de Henry e a concentração de solvente é inversamente proporcional, como é

observado na realidade.

Na equação de balanço ao sistema é utilizada uma constante de Henry expressa em

termos de volume da coluna, K . Esta relação é descrita pela equação 5.17 [36].

Ki = (1− εb)Hi (5.17)

É ainda necessário introduzir um termo que reflicta a influência do volume morto

no perfil de concentração. A variável de volume da coluna extra dead,Ve, influência o

primeiro termo da equação 4.5, referente à acumulação de composto na fase liquida [32].

Por fim, juntando as equações obtidas, 4.15, 5.16, 5.17 e adimensionalizando a

equação 4.5, ficamos com a equação 5.18, que contempla o modo de operação do sistema.

∂ci∂t

(ε+

VeV

)+Ki

(∂ci∂t− nicic0

∂c0

∂t

)=QV

(hi2∂2ci∂x2 −

∂ci∂x

)(5.18)

5.2.2 Análise do crude mix

A mistura de peptídeos que é alimentada ao sistema foi identificada, em termos de cro-

matograma, e está representada na figura 5.4. A mistura foi dividida em 5 frações:

• Composto fracamente adsorvido;

• Composto moderadamente retido que, a nível de cromatograma, está na zona de

interceção com o composto-alvo, situando-se à esquerda do mesmo;

• Composto-alvo;

• Composto moderadamente retido que, a nível de cromatograma, está na zona de

interceção com o composto-alvo, situando-se à direita do mesmo;

• Composto fortemente adsorvido. A separação destas frações, o cromatograma da

mistura de peptídeos fornecida e as percentagens de cada fração estão representadas

na figura 5.4.

5.2.3 Schedule

É necessário definir as variáveis de operação, com base no planeamento do processo. Os

passos do processo foram estabelecidos pela NOVAsep Process e parâmetros de operação

que vão ser explicitados, foram obtidos a partir de otimizações realizadas pelo professor

José Paulo Mota .

Como variáveis manipuláveis, foram determinados e apresentados na tabela 5.1 os

caudais e a concentração de solvente de cada corrente.

38

5.2. CASE STUDY

(a) Identificação das várias frações (b) percentagens dos compostos

Figura 5.4: Cromatograma da mistura de peptídeos utilizada[32].

Tabela 5.1: Concentração de solvente e caudal de cada corrente [32].

Corrente Concentração de EtOH %(v/v) Qv (mL/min)

Alimentação 0.25 2.00Solvente A 0.324-0.354 5.70Solvente B 0.25 1.00Solvente C 0.25 1.25Solvente D 0.5 5.00

O solvente utilizado foi o etanol, pelo que os parâmetros de K e n resultam da rela-

ção entre a mistura de peptídeos e este solvente. Os valores apresentados na tabela 5.2

resultaram do tratamento de dados dos valores obtidos experimentalmente para várias

experiências a várias concentrações da mistura de peptídios em etanol.

Tabela 5.2: K ′ e n para os vários compostos [32].

Composto1 2 3 4 5

K ′ 8×10−7 0.016 0.016 0.018 0.017n 8.36 3.83 4.02 4.08 4.47

Por outro lado, é também necessário definir as posições das válvulas (abertas ou fe-

chadas) e o tempo de cada passo. As válvulas são abertas conforme a entrada de solvente

em cada coluna, as ligações entre colunas e o destino da solução. A figura 5.5 mostra as

entradas e saídas de cada coluna e é através desta figura que se definem as posições das

válvulas.

5.2.4 Resultados e discussão

Em seguida vão ser apresentados os resultados obtidos através da simulação, sob a forma

de gráfico.

39


Figura 5.5: Solução das correntes de entrada e posição de saída dos vários passos de umciclo. Adaptado de [32].

Tabela 5.3: Definição das variáveis temporais do processo [32].

Variável τ tD ∆tF ∆tP tp e tf

Tempo (min) 3.5 1.5 0.5 1.0 7.0

Primeiramente vamos observar, no gráfico da figura 5.6, relativo à concentração dos

vários compostos na corrente de saída e a respetiva posição da válvula (aberta=1 ou

fechada=0) da última coluna, onde é recolhido o produto periodicamente.

De modo a conhecer o funcionamento do sistema, é relevante ver o percurso de cada

componente ao longo das colunas. De modo a observar esse comportamento vamos anali-

sar os gráficos, representados nas figuras 5.7 a 5.11, que mostram a composição de cada

composto nas correntes de saída das várias colunas.

Podemos reparar que o composto 1 é retirado quase na totalidade. Entre a coluna 2

e 3, a concentração do produto baixa drasticamente sendo apenas residual a composição

deste composto na corrente de saída da coluna 3.

Quanto aos compostos 3 e 5, é espectável que o nível de separação não seja muito

grande, uma vez que estão perto do produto-alvo, havendo uma zona de interceção. O

gradiente de solvente é aplicado de modo a separar os compostos indesejados do pre-

tendido, no entanto a sobreposição está presente na mesma. Perante a separação destes

três compostos, é necessário um compromisso entre a pureza do composto-alvo, a taxa de

recuperação, a produtividade e o custo inicial do sistema. Perante este equilíbrio é neces-

sário analisar o preço de mercado do composto assim como o rendimento do processo, a

margem bruta e a produtividade. Este equilíbrio foi considerado aquando da otimização

dos parâmetros de operação, incluídos nas tabela 5.3 e 5.1, como tempos de extração,

gradiente de solvente e caudais utilizados. A pureza do produto obtido, tal como a taxa

40

5.2. CASE STUDY

Figura 5.6: Concentração dos vários componentes na corrente de saída da última colunaao longo do tempo.

Figura 5.7: Cout do composto 1 nas várias colunas

41




42

5.2. CASE STUDY



43


Figura 5.12: Pureza da corrente de produto e recuperação de produto ao longo do tempo

de recolha ao longo do tempo de processo, foram determinadas e estão apresentadas no

gráfico da figura 5.12.

5.2.5 Conclusão

Em relação ao resultados obtidos em termos de pureza e recuperação, estes revelam ser

satisfatórios. A pureza conseguida quando o sistema atinge o estado estacionário é de

98.3% e, por outro lado, a taxa de recuperação é de 99.4%, sendo que são valores obtidos

para os parâmetros de operação utilizados. Em relação à pureza obtida, podemos inferir

que é um valor bastante razoável para fins clínicos.

É ainda relevante realizar uma comparação entre o sistema estudado, o GSSR, com

outros sistemas que servem o mesmo objetivo de separação em contínuo. No GSSR, a

posição relativa das colunas é sempre a mesma, pelo que o perfil, após a estabilização do

sistema, é o mesmo, sendo que cada coluna tem um objetivo específico. Por outro lado, em

sistemas como o SMB ou MCSGP, a posição relativa da coluna é sempre diferente, sendo

que o objetivo de cada coluna é diferente consoante o tempo.

44

Capítulo

6Trabalho Experimental

Para além da simulação, é relevante realizar trabalho experimental, uma vez que é neces-

sário definir algumas variáveis do sistema.

O trabalho experimental dividiu-se em duas partes:

• Caracterização das colunas. Dentro da caracterização das colunas foram realizadas

experiências de modo a obter 3 parâmetros: o volume morto, a porosidade externa

e a porosidade total.

• Obtenção de isotérmicas. Para a obtenção das isotérmicas foram realizadas experi-

ências em escada, de modo a calcular a respetiva isotérmica.

As experiências foram replicadas, no mínimo, três vezes de modo a proceder a estudo

estatístico dos dados obtidos. Através das várias experiências, foi determinado o erro

relativo que deverá ser menor que 10%. Deste modo, é possível demonstrar a concordância

entre os dados obtidos através do erro relativo.

É ainda de referir que este trabalho experimental foi controlado e monitorizado fa-

zendo uso do programa ChromatographyStudio.

6.1 Materiais

Como solvente líquido foi utilizado o etanol absoluto da Panreac.

Em termos de compostos, foram utilizados:

• Blue Dextran, cuja base de dextran tem um peso molecular de 2× 106 Da;

• Uridina com pureza de 99%;

45

CAPÍTULO 6. TRABALHO EXPERIMENTAL

• Guanosina com pureza de 98%.

O produtor das substancias sólidas é a Sigma-Aldrich.

Como equipamento, foi utilizado:

• Duas colunas cromatográficas de dimensões 1cmx10cm cuja resina é Kromasil C18;

• Cabos de aço para HPLC;

• Bomba de gradiente da Knauer, modelo S-1050.

6.2 Caracterização da coluna

Neste subcapítulo vão ser descritas as experiências para a caracterização da coluna, o

tratamento de dados e a discussão dos resultados. A caracterização da coluna é funda-

mental, não só para o cálculo das isotérmicas, como também para trabalho futuro. Para

complementar a caracterização da coluna, é necessário definir as porosidades interna e

externa, pelo que foram realizadas múltiplas experiências. De modo a proceder ao cálculo

das porosidades, são necessárias três etapas experimentais, de modo a determinar: (1)

volume morto, (2) porosidade externa, (3) porosidade interna.

6.2.1 Volume morto

O volume morto, Vmorto, é o volume não útil do sistema. Tudo o que não seja o volume da

coluna, como capilares e conectores. O volume morto é muito simples de calcular através

dos resultados experimentais e do caudal volumétrico, Qv, definido. Pela equação 6.1.

vemos que é possível obter este volume obtendo experimentalmente os dados referentes

ao tempo de residência da substância no sistema,tsistema.

Vmorto =Qv ×∆tsistema (6.1)

O tempo é calculado através da relação demonstrada na equação 6.2.

tsistema = tinjecao − tsaida (6.2)

Experimentalmente, o tempo de saída, tsada é obtido através da monitorização por es-

petrofotometria da corrente de saída. Primeiramente é utilizada água destilada de modo

a definir o referencial e a limpar o sistema. Em seguida é utilizada uma solução aquosa

corada, utilizando blue dextran, BD, de modo a ter um sinal UV facilmente detetável

(resultados sob a forma de absorvância,abs). O tempo de inicio de injeção, tinjecao, é conhe-

cido uma vez que está registado no ficheiro de monitorização. Ao longo dos resultados

apresentados, o tempo de injeção foi considerado nulo, sendo que os dados tiveram o

inicio da experiência como referencial de tempo.

46

6.2. CARACTERIZAÇÃO DA COLUNA

Figura 6.1: Curva de rutura e a coordenada tsaida que faz com que A1 seja igual a A2. A1é a área inferior e A2 a área superior.

No entanto, o tsaida não corresponde exatamente ao início de saída da solução. Como

existe o efeito de dispersão do líquido, o cromatograma tem uma curva de rutura. Para

o cálculo do tsaida, é necessário calcular o tempo para o qual a massa de saída é igual

nos dois lados da curva. A coordenada x, que faz com que para o lado esquerdo, a área

inferior à linha seja equivalente à área superior à linha do lado direito da coordenada.

Este método é o das Áreas iguais, em inglês EAM. A figura 6.1 representa um exemplo

gráfico para o cálculo da coordenada de tsaida.

O cálculo das áreas é feito com base no cálculo da área dos trapézios de dois pontos

consecutivos do cromatograma, da seguinte maneira:

Ainf erior =[[abs (ti+1) + abs (ti)]− 2absref erencia

]× ti+1 − ti

2(6.3)

Asuperior = [2abspatamar − [abs (ti+1) + abs (ti)]]×ti+1 − ti

2(6.4)

Em que absref erencia é o valor de absorvância médio, do patamar inferior àquele que

está a ser analisado e abspatamar é o valor de absorvância do patamar superior àquele

que está a ser analisado. Por ultimo, ti define um instante de tempo e t(i+1) refere-se ao

instante de tempo imediatamente seguinte.

Os resultados obtidos foram transpostos para o gráfico representado na figura 6.2.

Para obtenção do tempo de saída, foi analisada a curva de rotura, utilizando os dados de

início e fim da mesma. Os dados obtidos, após o tratamento de dados estão apresentados

na tabela 6.1.

Este volume morto corresponde ao volume desde a saída da bomba até à célula UV.

Quanto maior for este volume, maior é a mistura entres frentes de concentração. Esta

mistura não é desejada, no entanto para esta grandeza o efeito de mistura não é relevante.

6.2.2 Porosidade interparticular

A porosidade interparticular, εb, é uma fração entre o volume exterior às partículas de

resina, volume interparticular e o volume total da coluna .

47


Figura 6.2: Absorvância da corrente de saída em função do tempo decorrido, após ainjeção.

Tabela 6.1: Tempo de saída, caudal utilizado, volume morto do sistema e respetivo desviopadrão e erro dos resultados obtidos.

Experiência tsaida(s) Qv (mL/min) Vmorto (mL) Desvio Padrão Erro

1 57.7840.5

0.4820.034 8%2 52.861 0.441

3 47.315 0.397Média 0.440

Para esta experiência, é necessário utilizar uma solução líquida em que o componente

seja detetado por espectrofotometria e passe apenas pelo exterior das partículas, como é

o caso do blue dextran [38]. Deste modo, o tempo que a solução demora a sair é devido

ao volume morto, Vmorto, e ao volume interparticular da coluna, Vinterparticular .

Para efeitos de cromatografia, é boa prática utilizar uma solução com um solvente

orgânico a, pelo menos, 5% (v/v). O composto orgânico escolhido foi o etanol, uma vez

que é miscível com a água, não é retido numa coluna de fase reversa uma vez que é

polar e exibe algumas características óticas para a análise por UV [39]. Deste modo, para

estabelecer a referência, foi utilizada uma solução aquosa com 5% de etanol (v/v).

Recapitulando, o volume total do sistema, Vsistema, é composto pelo volume da coluna,

Vcoluna, e o volume morto, Vmorto (que foi anteriormente calculado).

Quando é passada a solução de blue dextran na coluna, esta solução apenas ocupa o

volume interparticular, Vinterparticular .

É ainda de interesse relacionar o Vinterparticular com o volume total da coluna, Vcoluna,

de modo a conhecer a porosidade interparticular, εb.

48


Tabela 6.2: Condições de operação para as experiências de obtenção da porosidade inter-particular.

Qv (mL/min) Vmorto (mL) Vcoluna (mL)

2.0 0.440 7.85

Tabela 6.3: Porosidade interparticular e análise probabilística dos resultados obtidos paraa coluna 2

Experiência tsaida (s) Porosidade Desvio Padrão Erro

1 97.412 0.357

0.0117 3%2 89.785 0.3253 94.563 0.3974 92.923 0.338

Média 0.342

Vsistema = Vcoluna +Vmorto (6.5)

Vcoluna = Vinterparticular +Vpartculas na coluna (6.6)

É ainda de interesse relacionar o Vinterparticular com o volume total da coluna, Vcoluna,

de modo a conhecer a porosidade interparticular, εb.

Vinterparticular = Vcoluna × εb (6.7)

Em termos experimentais são obtidos tempos e não volumes, pelo que os tempos

obtidos são relacionados com o caudal, segundo a equação 6.1. Pela relação entre as

equações 6.7 e 6.9 obtemos a equação 6.10, que é utilizada nos cálculos da porosidade

interparticular. Uma vez que todas as variáveis são conhecidas ou calculadas à excepção

da porosidade interparticular, esta será determinada pela relação abaixo estabelecida.

tinjecao − tsaida =Vcoluna × εb +Vmorto

Qv(6.8)

As experiências foram realizadas de modo a determinar o tempo em que a solução

demora a deixar o sistema, tsaida. Os resultados obtidos foram transpostos para os gráficos

representados nas figuras 6.3 e 6.4, sendo que as condições operatórias estão explicitadas

na tabela 6.2. Os resultados obtidos assim como a análise probabilística foram resumidos

nas tabelas 6.3 e 6.4.

49


Figura 6.3: Absorvância da corrente de saída da coluna 2 em função do tempo decorridoapós a injeção da solução aquosa de Blue Dextran.

Figura 6.4: Absorvância da corrente de saída da coluna 3 em função do tempo decorridoapós a injeção da solução aquosa de Blue Dextran.

Tabela 6.4: Porosidade interparticular e análise probabilística dos resultados obtidos paraa coluna 3


1 100.4 0.370

0.0139 4%2 101.2 0.3743 94.6 0.401

Média 0.372

50


Tabela 6.5: Condições de operação para as experiências de obtenção da porosidade total.

Qv (mL/min) Vmorto (mL) Vcoluna (mL)

2.0 0.440 7.85

Podemos inferir que seria de esperar que os resultados da porosidade externa fossem

equivalentes para as duas colunas, no entanto observamos uma pequena discrepância. A

porosidade da coluna 3 é 8% mais elevada que a da coluna 2. Para todos os resultados a

porosidade da coluna 2 é inferior à da coluna 3.

6.2.3 Porosidade Total

Para calcular experimentalmente o volume dentro e fora das partículas,Vutildacoluna, é

necessário escolher um solvente que passe pelo interior dos poros da resina e que não seja

retido.

Para efeitos de cálculo da porosidade total, ε, foi utilizada uma solução aquosa com

90% (v/v) etanol, na medida em que o diâmetro das moléculas de água e de etanol são

inferiores ao diâmetro do poro. Não foi utilizado BD, que conferia melhores resultados,

numa análise por espectrofotometria, uma vez que é uma solução corada. No entanto,

tem um diâmetro de partícula superior ao diâmetro de poro.

De modo idêntico à experiência anterior, foi utilizada uma solução aquosa com 5%

(v/v) de etanol para estabelecer a referência.

Adaptando as equações 6.10 e 6.9 referentes ao cálculo do volume interparticular,

para o caso onde o líquido ocupa também o volume dentro das partículas e mantendo a

mesma linha de pensamento, obtemos assim as equações 6.9 e 6.10.

Vutil da coluna = Vcoluna −Vsolido na coluna = Vcoluna × ε (6.9)

tinjecao − tsaida =Vcoluna × ε+Vmorto

Qv(6.10)

De modo similar, foram realizadas as experiências para a obtenção do tempo de saída

da solução, Tsaida, que foi calculado por EAM utilizando os dados obtidos. Os parâmetros

de operação estão explícitos na tabela 6.5 e os resultados representados graficamente nos

gráficos das imagens 6.5, para a coluna 2 e 6.6, para a coluna 3.

Os resultados obtidos, assim como a análise probabilística, foram resumidos nas tabe-

las 6.6 e 6.7.

Como foi referido anteriormente, uma solução corada apresentaria um sinal de absor-

vância mais fidedigno. No entanto, foi utilizada uma solução de etanol que não apresenta

um sinal de absorvância muito forte, o que é uma possível explicação para a inexistência

51


Figura 6.5: Absorvância da corrente de saída da coluna 2 em função do tempo decorridoapós a injeção da solução aquosa contendo 90% de etanol.

Tabela 6.6: Resultados relativos à porosidade total da coluna 2 e respetiva análise proba-bilística


1 173.6 0.6810.0584 8%

2 201.1 0.798Média 0.739

Figura 6.6: Absorvância da corrente de saída da coluna 3 conforme o tempo após a injeçãoda solução aquosa contendo 90% de etanol.

52

6.3. ISOTÉRMICAS

Tabela 6.7: Resultados relativos à porosidade total da coluna 3 e respetiva análise proba-bilística


1 195.3 0.7730.0139 4%2 180.6 0.711

3 177.0 0.695Média 0.726

de uma curva de rutura nos gráficos 6.5 e 6.6 assim como a falta de concordância entre

a curva experimental e a curva teórica, sem patamares e pontos de inflexão.

Quanto ao valor obtido, é normal que a porosidade total seja maior que a porosidade

externa, uma vez que as moléculas têm um maior trajeto. No entanto, estes valores são

elevados relativamente ao esperado. Esta elevada discrepância entre porosidade externa

e total demonstra a elevada porosidade das partículas e, consequentemente, a alta área

superficial que é necessária para a obtenção de um elevado grau de separação.

A relação entre os valores de porosidade total, ε, e porosidade externa, εb, de modo a

obter a porosidade da partícula, εp é dada pela equação 6.11.

ε = εb + (1− εb)εp (6.11)

É ainda possível obter o volume total das partículas,Vparticula, (sólido+poros) e dos

poros,Vporos, para ambas as colunas, apresentado na tabela através das relações apresen-

tadas nas equações 6.12 e 6.13.

Vparticula = Vcoluna × εb (6.12)

Vporos = Vparticulas × εp (6.13)

Na tabela 6.8 estão apresentados os resultados obtidos após a análise das porosidades

obtidas.

6.3 Isotérmicas

Foram usados dois compostos para a determinação das suas isotérmicas. Os compostos

utilizados foram a Guanosina e a Uridina.

De modo a perceber a concentração máxima a utilizar, foram realizados testes de

solubilidade do composto, no solvente utilizado (5% etanol). A concentração máxima

alimentada ao sistema cromatográfico deve ser inferior à concentração máxima de solubi-

lidade, sendo que foi utilizado 80% deste valor. Para condições de pressão e temperatura

53


Tabela 6.8: Volume das partículas e dos poros para as duas colunas, tendo por base ocálculo das porosidade interna e externa assim como o valor conhecido do volume dacoluna

Volume (mL)Coluna Partículas Poros

2 2.683 1.6213 2.920 1.648

Tabela 6.9: Concentrações utilizadas de Guanosina e Uridina

Concentração (g/L)Uridina Guanosina

33.683 0.47329.940 0.42626.198 0.378

22.45 0.33118.713 0.28014.970 0.23711.228 0.189

7.485 0.1423.743 0.095

0.047

diferentes das experimentais, os compostos podem precipitar, adicionalmente é possível

que a concentração do composto não seja constante em todo o seu volume, pelo que em

algumas partes da solução a concentração pode ser superior à concentração máxima de

solubilidade. É ainda de referir que a concentração da solução alimentada foi feita a par-

tir da mistura de uma solução-mãe, com uma elevada concentração do produto-alvo e

uma solução aquosa de 5% de etanol. Na tabela 6.9 estão representadas as concentrações

utilizadas tanto de Guanosina como de Uridina.

De modo a estabelecer uma relação que nos permita calcular a constante de isotérmica,

é necessário realizar o balanço mássico descrito na equação 6.14

minjetada −mremovida =m0,sistema +mintraparticular +madsorvida (6.14)

Em que mremovida é a massa que sai do sistema, ou seja, por um lado temos a massa

que entra no sistema e por outro a massa que sai do sistema. A massa que fica retida

no volume morto é m0,sistema e a massa que fica retida na partícula é a massa adsorvida,

54

6.3. ISOTÉRMICAS

madsorvida.

É necessário ainda passar os termos da equação anterior para uma forma explícita,

de modo a calculá-los com os dados experimentais obtidos e as condições operatórias

utilizadas. Estas relações estão representadas nas equações 6.15 a 6.18

minjetada = tinjecao ×Qv × ci (6.15)

mremovida =(tinicio de saida − tf im de saida

)×Qv × ci (6.16)

m0,sistema = Vmorto ×Ci (6.17)

mintraparticular = Vcoluna × ε ×Ci (6.18)

(6.19)

Em que o tempo de injeção, tinjecao, está indicado no ficheiro de monitorização, o

caudal volumétrico, Qv, é definido e o volume da coluna, Vcoluna, é conhecido. O tinjecaofoi considerado nulo, uma vez que serviu de referencia para o começo da experiência.

Adicionalmente, o tempo de início de saída é calculado pelo EAM da primeira curva e o

tempo de fim de saída é calculado utilizando o mesmo método para a segunda curva do

gráfico das concentrações ao longo do tempo, relativamente ao patamar (concentração) a

ser analisada.

No entanto, é benéfico passar os dados recolhidos sob a forma de absorvâncias para

concentrações, recorrendo a uma reta de calibração obtida entre a concentração alimen-

tada e a média das absorvâncias obtidas.

Depois de obtidos os resultados de massa acumulada, macumulada, é necessário passá-

los para massa adsorvida por volume de sólido, quando é atingido o equilíbrio, q∗. O valor

de q∗ é obtido utilizando a equação 6.20.

q∗ =macumuladaVslido

=macumuladaVcoluna × εb

(6.20)

Um dos possíveis métodos experimentais, é o método das escadas, em que a injeção

é feita em contínuo, sendo que, em intervalos de tempo estipulados a solução injetada

muda de concentração, sendo que a nova concentração é superior à anterior. Deste modo,

é apenas necessária uma experiência global, pelo que é aproveitada a massa adsorvida

entre passos. A massa total acumulada na partícula, Macumulada,cj , é dada pela equação

6.21.

Macumulada, cj =Nc∑i=1

Madsorvida,ci (6.21)

6.3.1 Guanosina

Abaixo estão representados os resultados experimentais e os resultados após o tratamento

dos dados obtidos para a experiência utilizando a Guanosina.

55


Tabela 6.10: Condições de operação para as experiências de obtenção da isotérmica daGuanosina. O volume morto não é o mesmo utilizado nas experiências anteriores, umavez que foi necessário modificar o sistema, tendo sido realizadas novas experiências paradeterminar o novo volume morto.

Qv (mL/min) Vmorto (mL) Vcoluna (mL) tinjecao (s) Porosidade

2.0 0.356 7.854 270 0.342

Tabela 6.11: Índices da equação polinomial, de segundo grau, que define a reta de Calibra-ção da Guanosina. Cada linha corresponde ao valor obtido para a respectiva experiênciarealizada

Experiência x2 x

1 0.212 0.8822 0.191 0.9013 0.242 0.867

Na tabela 6.10 estão explicitados os parâmetro operatórios utilizados e os dados

conhecidos, antes da experiência, necessários para o calculo das isotérmicas. Adicional-

mente, na Tabela 6.11 estão explicitados os coeficientes da função que descreve a reta de

calibração, ou seja, a função que permite passar as absorvâncias para concentrações.

No gráfico da figura 6.7 estão representados os dados obtidos experimentalmente,

ou seja, a concentração (posteriormente foi passada a absorvância para concentração)

obtida em função do tempo após a injeção. Os dados obtidos, relativamente ao tempo de

saída para as várias concentrações alimentadas e para as 3 experiências realizadas, estão

identificados na tabela 6.12.

Por fim, na Tabela 6.13 estão apresentados os dados calculados, referente às constan-

tes de isotérmica,q∗(gGuanosina/Lsolido), para as 3 experiências (colunas) e para as várias

concentrações (linhas), assim como a respectiva análise probabilística referente aos dados

das 3 experiências. Estes dados foram transpostos para o gráfico da figura 6.8, que corres-

ponde ao gráfico da isotérmica da Guanosina. Com base no gráfico obtido, foi verificada

uma linearidade entre os pontos obtidos, esta linha de tendência está representada no

mesmo gráfico, assim como os valores do declive, o declive da reta permite calcular a

constante de henry para a Guanosina em relação ao enchimento, como vamos ver mais à

frente na subsecção 6.3.3

56

6.3. ISOTÉRMICAS

Figura 6.7: Concentração da corrente de saída contendo Guanosina a diferentes concen-trações em função do tempo após a injeção.

Tabela 6.12: Tempos médios de residência do composto no sistema, dependendo da con-centração alimentada de Guanosina para as várias experiências.

Concentração (g/L)Experiência

1 2 3

0.05 216.00 207.45 211.410.09 480.42 477.08 479.050.14 748.94 746.50 748.280.19 1015.64 1013.92 1017.190.24 1284.00 1284.19 1287.140.28 1553.92 1553.39 1557.700.33 1824.97 1825.05 1823.840.38 2093.92 2095.27 2095.050.43 2365.77 2365.23 2365.050.47 2633.46 2634.58 2634.02

57


Figura 6.8: Isotérmica da Guanosina. Massa adsorvida por volume de sólido a váriasconcentrações.

Tabela 6.13: Resultados dos valores da constante de isotérmica, q∗(gGuanosina/Lsolido) de-pendendo da concentração de Guanosina alimentada e consequente análise probabilística.


Média Desvio Padrão Erro1 2 3

0.0473 0.0382 0.0356 0.0366 0.0368 0.0011 0.02860.0946 0.0745 0.0711 0.0724 0.0727 0.0014 0.01940.1419 0.1104 0.1063 0.1076 0.1081 0.0017 0.01550.1892 0.1452 0.1408 0.1423 0.1428 0.0018 0.01250.2365 0.1794 0.1754 0.1768 0.1772 0.0016 0.00920.2838 0.2136 0.2098 0.2115 0.2116 0.0016 0.00730.3311 0.2479 0.2446 0.2450 0.2458 0.0015 0.00610.3784 0.2818 0.2795 0.2788 0.2800 0.0013 0.00460.4257 0.3162 0.3144 0.3125 0.3144 0.0015 0.00480.4730 0.3498 0.3491 0.3457 0.3482 0.0018 0.0051

58

6.3. ISOTÉRMICAS

Tabela 6.14: Condições de operação para as experiências de obtenção da isotérmica daUridina.

Experiência Qv(mL/min) Vmorto (mL) Vcoluna (mL) tinjecao (s) Porosidade

12.0 0.356 7.854

1050.3422 180

3 150

Tabela 6.15: Na seguinte tabela estão identificados os parâmetros adjacente à reta de cali-bração da Uridina. Cada linha corresponde ao valor obtido para a respectiva experiênciarealizada. Para a primeira experiência foi obtida uma reta de calibração bastante dife-rente das restantes devido ao comprimento de onda utilizado, deste modo é explicitadoos comprimentos de onda utilizados.

Experiência x3 x2 x Comprimento de onda (nm)

1 9.4571 7.8727 15.208 295.032 87.939 299.843 84.492 299.84

6.3.2 Uridina

A experiência para a obtenção da isotérmica da Uridina, foi realizada de modo análogo

ao utilizado e anteriormente explicado, para a Guanosina.

Abaixo estão representados os resultados experimentais e os resultados após o tra-

tamento dos dados para a Uridina. Na tabela 6.14 estão explicitados os parâmetros de

operação e algumas características relevantes do sistema e da coluna. Relativamente à

passagem das absorvâncias obtidas para concentrações, estão identificados os parâme-

tros da reta de calibração na tabela 6.15. Entretanto, a passagem de absorvâncias para

concentrações foi realizada, pelo que os resultados de concentração em função da concen-

tração estão compilados no gráfico da figura 6.9. Os dados relativos ao tempos médios

de saída do composto estão representados na tabela 6.16. Por último, os dados referentes

à isotérmica estão apresentados na tabela 6.17 e representados graficamente na imagem

6.10.

6.3.3 Comparação e discussão

Através da análise dos dados obtidos, referentes às isotérmicas da Guanosina e da Uridina,

podemos afirmar que a relação entre q∗ e c, é linear para a gama de concentração testada. A

linearidade da isotérmica facilita os cálculos, uma vez que a isotérmica apenas varia com

59


Figura 6.9: Concentração da corrente de saída contendo Uridina a diferentes concentra-ções em função do tempo após a injeção.

Tabela 6.16: Tempos médios de saída dependendo da concentração alimentada de Uridinapara as várias experiências.


1 2 3

3.74 101.31 200.72 200.507.49 201.02 369.81 342.50

11.23 306.30 549.84 490.0914.97 411.95 728.69 638.4418.71 516.47 908.81 787.8122.46 622.36 1264.31 936.6326.20 1444.3829.94 1622.4433.68 1798.81

60

6.3. ISOTÉRMICAS

Tabela 6.17: Resultados dos valores da constante de isotérmica, q∗(gUridina/Lsolido) deter-minada para cada experiência, dependendo da concentração de Guanosina alimentada econsequente análise probabilística.


Média Desvio Padrão Erro1 2 3

3.743 2.689 2.643 2.630 2.654 0.025 0.0107.485 5.119 5.029 5.066 5.071 0.037 0.007

11.228 7.556 7.405 7.442 7.468 0.064 0.00914.970 10.011 9.752 9.774 9.845 0.117 0.01218.713 12.427 12.102 12.090 12.206 0.156 0.01322.455 14.876 18.684 14.377 14.626 0.250 0.01726.198 25.264 25.26429.940 31.793 31.79333.683 41.890 41.890

Figura 6.10: Isotérmica da Uridina. Massa adsorvida por volume de solido a várias con-centrações.

61


Tabela 6.18: Resultados da constante de henry para os compostos analisados.

Guanosina Uridina

H 0.742 0.657

a concentração de solvente, sendo que a constante de Henry volumétrica, H , é constante

em toda a gama de concentrações analisada. Especialmente quando estamos a falar em

validar sistemas novos, misturas de compostos cujas isotérmicas são lineares são a forma

mais simples de proceder à devida análise. Para isotérmicas lineares, a absorvância total

é igual à soma das absorvâncias dos compostos 1 e 2.

Através dos gráficos obtidos de q∗ em função de c, é possível obter a constante de

henry, H . Se a relação entre q∗ e c for linear a equação 6.22 descreve a relação entre as

variáveis de modo a calcular a constante de henry.

q∗ =H × c (6.22)

Na tabela 6.18 são apresentadas as constantes de henry determinadas para os dois

compostos.

6.4 Bomba não isocrática

De modo a perceber o nível de mistura da bomba de gradiente utilizada, foram realiza-

dos dois tipos de experiência em que a solução proveniente da bomba passou pelos: (1)

Capilares, sem coluna; (2) capilares e coluna.

Na primeira experiência, apresentada no gráfico 6.11, foram testados tempos de

injeção de 30 segundos, 3 minutos e 10 minutos utilizando um caudal de 2.0 mL/min.

No tempo de injeção estabelecido, é realizada a variação da concentração de uma forma

contínua, começando com 0% de volume da solução de BD e 100% de volume de água e

acabando com 100% de volume da solução de BD e 0% da solução de água.

Vemos que se nota uma oscilação. Esta oscilação no cromatograma é devida ao gradi-

ente, pois é injetado BD e só depois água, sendo que esta injeção devia ter uma duração

mais reduzida, de modo a serem misturados quase continuamente. Podemos concluir que

a bomba não realiza um gradiente satisfatório, utilizando intervalos de tempo de mistura

para o qual se nota a diferença de composição da mesma.

No entanto, a frente de concentração pode ser suavizada aquando da passagem da

solução pela coluna, uma vez que o volume é maior e os fatores que possivelmente pro-

movem a mistura são consideráveis, como o atrito entre o líquido, as extremidades da

coluna e a própria resina. Por outro lado, na entrada da coluna existe uma câmara que

promove a distribuição do líquido e pode também ser um fator que promove a mistura da

62

6.4. BOMBA NÃO ISOCRÁTICA

Figura 6.11: Absorvância em função do tempo de injeção. Em que é realizado um gradi-ente de concentração e a solução passa apenas pelos capilares.

Figura 6.12: Absorvância em função do tempo de injeção. Foi realizado um gradiente deconcentração e a solução passou pelos capilares e pela coluna.

solução. Foi, portanto, realizada a mesma experiência de injeção da solução recorrendo

a um gradiente de concentração de BD, perante as mesmas condições de caudal e tempo

de injeção, relativamente à experiência anterior. Os dados obtidos estão representados no

gráfico da figura 6.12.

Podemos observar que as frentes de concentração são, de facto, amenizadas e o gra-

diente, embora com a existência de patamares de concentração, é suavizado. No entanto,

quando a bomba for utilizada no sistema completo , o volume morto é superior aquele

existente nas experiências realizadas, pelo que existe a mistura da solução.

Uma possível solução para a realização de gradientes mais preciso é a utilização de

63


duas bombas distintas que fornecem a fração de volume necessária para a mistura total.

No entanto, esta alternativa representa um maior custo inicial do sistema. Outra solução

possível seria a aquisição de uma câmara de mistura para a bomba de gradiente.

64

Capítulo

7Conclusões e trabalho futuro

Ao longo deste trabalho, procedeu-se à caracterização das colunas, sendo que a porosidade

interna foi de 0.739 e 0.726 e a porosidade externa foi de 0.342 e 0.372, relativamente à

coluna 2 e 3, respetivamente.

Foram também determinadas as isotérmicas, ou seja, o comportamento de adsorção

exibido por parte da Uridina e da Guanosina face ao enchimento presente na coluna de

fase reversa utilizada, cujo enchimento é um C18. Foi verificada uma isotérmica linear

em que a constante de henry volumétrica, H , em que os valores obtidos foram de 0.742

para a Guanosina e 0.657 para a Uridina.

Adicionalmente, foi realizado o case study do processo de GSSR, utilizando o código

desenvolvido. Este case study foi bem sucedido, uma vez que os resultados obtidos e

aqueles apresentados no artigo foram semelhantes. Foi obtida uma pureza de 98.3 e uma

taxa de recuperação de 99.4.

O trabalho realizado foi apenas uma parte inicial do sistema pretendido, sendo que

há múltiplas tarefas a serem realizadas futuramente, de modo a completar o sistema.

• Primeiramente é necessária uma melhoria na disposição do sistema, reduzindo o

volume morto.

• Seguidamente é também necessário planear e realizar uma validação experimental

do sistema com compostos de composição conhecida, como é o caso da Uridina e da

Guanosina que, adicionalmente, são compostos de relativa fácil obtenção.

• Adicionalmente, é necessária a análise dos compostos isolados, que estão presentes

no crude mix, de forma a obter os valores da cinéticas de adsorção dos vários

compostos.

65

CAPÍTULO 7. CONCLUSÕES E TRABALHO FUTURO

• Por último, mas com maior relevância, é necessário fazer uma optimização precisa

de modo a conhecer os parâmetros de operação, ou seja, os tempos de operação,

os caudais utilizados, a pureza, o recuperação, o número de colunas a utilizar, e

a calendarização do processo em termos das correntes de entrada e o destino das

correntes de saída.

Um objetivo mais ambicioso seria a elaboração de um sistema que contemplasse tanto

a separação como a própria produção de peptídeos. No entanto, a etapa de produção

teria uma alta componente de química pura, pelo que é um tema muito díspar daquele

abordado aquando da separação. Adicionalmente, é um trabalho demorado e para o qual

é necessária uma grande componente de investigação, uma vez que é um processo pouco

estudado e, consequentemente, com pouca informação disponível.

66

Bibliografia

[1] Z. M. Research. Peptide Therapeutics Market. 2018. url: https://www.globenewswire.

com / news - release / 2018 / 10 / 22 / 1624591 / 0 / en / Peptide - Therapeutics -

Market-Will-Reach-USD-43-26-Billion-By-2024-Globally-Zion-Market-

Research.html.

[2] S. Sachdeva. “Peptides as ‘Drugs’: The Journey so Far”. Em: International Journalof Peptide Research and Therapeutics 23.1 (2017), pp. 49–60. issn: 1573-3904. doi:

10.1007/s10989-016-9534-8. url: https://doi.org/10.1007/s10989-016-

9534-8.

[3] Developing the Tools to Evaluate Complex Drug Products: Peptides. url: https://

www.fda.gov/Drugs/ScienceResearch/ucm578111.htm.

[4] S. S. Usmani, G. Bedi, J. S. Samuel, S. Singh, S. Kalra, P. Kumar, A. A. Ahuja, M.

Sharma, A. Gautam e G. P. S. Raghava. “THPdb: Database of FDA-approved peptide

and protein therapeutics”. Em: PLOS ONE 12.7 (jul. de 2017), pp. 1–12. doi: 10.

1371/journal.pone.0181748. url: https://doi.org/10.1371/journal.pone.

0181748.

[5] M. Mikulic. Global Pharmaceutical Industry - Statistics Facts. 2019. url: https://

www.statista.com/topics/1764/global-pharmaceutical-industry/ (acedido

em 30/09/2010).

[6] W. Pytlik. “Healthcare industry”. Em: The growing significance of peptide therapeutics(2014). url: https://www.gesundheitsindustrie-bw.de/en/article/news/

the-growing-significance-of-peptide-therapeutics.

[7] J. L. Lau e M. K. Dunn. “Therapeutic peptides: Historical perspectives, current

development trends, and future directions”. Em: Bioorganic Medicinal Chemistry26.10 (2018). Peptide Therapeutics, pp. 2700 –2707. issn: 0968-0896. doi: https:

//doi.org/10.1016/j.bmc.2017.06.052. url: http://www.sciencedirect.

com/science/article/pii/S0968089617310222.

[8] C. D. Schteingart e J. L. Lau. “Chapter Fifteen - From Natural Peptides to Market”.

Em: Platform Technologies in Drug Discovery and Validation. Ed. por R. A. Goodnow.

Vol. 50. Annual Reports in Medicinal Chemistry. Academic Press, 2017, pp. 543

–586. doi: https://doi.org/10.1016/bs.armc.2017.08.003. url: http:

//www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0065774317300064.

67

https://www.globenewswire.com/news-release/2018/10/22/1624591/0/en/Peptide-Therapeutics-Market-Will-Reach-USD-43-26-Billion-By-2024-Globally-Zion-Market-Research.html




https://doi.org/10.1007/s10989-016-9534-8

https://doi.org/10.1007/s10989-016-9534-8

https://www.fda.gov/Drugs/ScienceResearch/ucm578111.htm


https://doi.org/10.1371/journal.pone.0181748

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0181748

https://www.statista.com/topics/1764/global-pharmaceutical-industry/

https://www.statista.com/topics/1764/global-pharmaceutical-industry/

https://www.gesundheitsindustrie-bw.de/en/article/news/the-growing-significance-of-peptide-therapeutics

https://www.gesundheitsindustrie-bw.de/en/article/news/the-growing-significance-of-peptide-therapeutics

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0968089617310222




BIBLIOGRAFIA

[9] J. M. Palomo. “Solid-phase peptide synthesis: an overview focused on the prepara-

tion of biologically relevant peptides”. Em: RSC Adv. 4 (62 2014), pp. 32658–32672.

doi: 10.1039/C4RA02458C. url: http://dx.doi.org/10.1039/C4RA02458C.

[10] V. Glaser. “Strategies for Optimizing Peptide Synthesis”. Em: Gnetic EngenineeringBiotechnology News 31 (13 2011). url: https://www.genengnews.com/magazine/

162/strategies-for-optimizing-peptide-synthesis/.

[11] Peptide Synthesis. url: https://www.thermofisher.com/pt/en/home/life-

science/protein- biology/protein- biology- learning- center/protein-

biology-resource-library/pierce-protein-methods/peptide-synthesis.

html.

[12] Peptide synthesis. 2019. url: https : / / en . wikipedia . org / wiki / Peptide _

synthesis#/media/File:Solid-phase_peptide_synthesis_(SPPS).svg.

[13] Downstream Process (DSP) - What is it? 2018. url: https://esiultrapure.com/

downstream-process/.

[14] R. Freitag e J. Breier. “Displacement chromatography in biotechnological downs-

tream processing.” Em: Journal of Chromatography A 1-2 (691 1995), pp. 101–112.

url: https://link.springer.com/content/pdf/10.1007\%2fbfb0102324.pdf.

[15] J. Gurdon, S. Dyson e D. St Johnston. Cells’ Perception of Position in a ConcentrationGradient. 1998. url: https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/

S009286740081747X?via\%3Dihub (acedido em 30/09/2010).

[16] C. for Drug Evaluation e Research. Developing the Tools to Evaluate Complex DrugProducts: Peptides. url: https : / / www . fda . gov / Drugs / ScienceResearch /

ucm578111.htm.

[17] Custom Affinity Chromatography Service. url: https://www.creative-biostructure.

com/custom-affinity-chromatography-service-257.htm.

[18] C. O. “Separation techniques: Chromatography”. Em: Northern clinics of Istanbul 3

(2 2016), 156–160. doi: 10.14744/nci.2016.32757.

[19] Reversed phase chromatography. 1999. url: http://wolfson.huji.ac.il/purification/

pdf/reversephase/amershamrpcmanual.pdf.

[20] Continuous chromatography in downstream processing of a monoclonal antibody. url:

https://www.gelifesciences.co.jp/catalog/pdf/AKTApccAN_1.PDF.

[21] Benefits of automated protein purification. url: https://www.gelifesciences.com/

en/us/news-center/benefits-of-automated-protein-purification-10001.

[22] A. Rodrigues, C. Pereira, M. Minceva, L. Pais, A. Ribeiro, M. Silva, N. Graça e J.

Santos. “Principles of Simulated Moving Bed”. Em: Simulated moving bed technology.

Reading, Massachusetts: Elsevier Academic Press, 2015. Cap. 1.

68

http://dx.doi.org/10.1039/C4RA02458C

https://www.genengnews.com/magazine/162/strategies-for-optimizing-peptide-synthesis/

https://www.genengnews.com/magazine/162/strategies-for-optimizing-peptide-synthesis/

https://www.thermofisher.com/pt/en/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/peptide-synthesis.html




https://en.wikipedia.org/wiki/Peptide_synthesis#/media/File:Solid-phase_peptide_synthesis_(SPPS).svg

https://en.wikipedia.org/wiki/Peptide_synthesis#/media/File:Solid-phase_peptide_synthesis_(SPPS).svg

https://esiultrapure.com/downstream-process/

https://esiultrapure.com/downstream-process/

https://link.springer.com/content/pdf/10.1007\%2fbfb0102324.pdf

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S009286740081747X?via\%3Dihub

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S009286740081747X?via\%3Dihub



https://www.creative-biostructure.com/custom-affinity-chromatography-service-257.htm

https://www.creative-biostructure.com/custom-affinity-chromatography-service-257.htm

http://wolfson.huji.ac.il/purification/pdf/reversephase/amershamrpcmanual.pdf

http://wolfson.huji.ac.il/purification/pdf/reversephase/amershamrpcmanual.pdf

https://www.gelifesciences.co.jp/catalog/pdf/AKTApccAN_1.PDF

https://www.gelifesciences.com/en/us/news-center/benefits-of-automated-protein-purification-10001

https://www.gelifesciences.com/en/us/news-center/benefits-of-automated-protein-purification-10001

BIBLIOGRAFIA

[23] G. Guiochon, A. Felinger, D. Shirazi e A Katti. “Simulated Moving Bed Chromato-

graphy”. Em: Fundamentals of preparative and nonlinear chromatography. 2nd. Rea-

ding, Massachusetts: Elsevier Academic Press, 2006. Cap. 17.

[24] R Silva. “Compact simulated countercurrent chromatography for downstream pro-

cessing of (bio)pharmaceuticals”. Tese de doutoramento. Faculdade de Ciencias e

Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa, 2013.

[25] D. B. Broughton e C. G. Gerhold. Continuous sorption process employing fixed bedof sorbent and moving inlets and outlets. US Patent 2,985,589. 1957. url: https:

//patents.google.com/patent/US2985589A/en.

[26] J. Hur e P. Wankat. “New Design of Simulated Moving Bed (SMB) for Ternary

Separations”. Em: Industrial Engineering Chemistry Research 44.6 (2005), pp. 1906–

1913.

[27] L. Aumann e M. Morbidelli. “A continuous multicolumn countercurrent solvent

gradient purification (MCSGP) process.” Em: International Journal of Peptide Rese-arch and Therapeutics 44.6 (2007), pp. 728–733.

[28] S. Sachdeva. “Peptides as ‘Drugs’: The Journey so Far”. Em: International Journal ofPeptide Research and Therapeutics 98.5 (2007), pp. 1043–1055.

[29] U. Wenzel e Ullrich. “Twin column chromatography for industrial-scale deconta-

mination processes”. Em: Journal of Chromatography A 1023.2 (2004), pp. 207–213.

[30] Chromacon. Continuous chromatography for polishing processes: MCSGP. url: https:

//www.chromacon.com/en/technology/continuous-polishing-processes-

mcsgp (acedido em 30/09/2010).

[31] L. Aumann, M. Morbidelli, B. Schenkel e G Stroehlein. “A continuous multicolumn

countercurrent solvent gradient purification (MCSGP) process”. Em: BioPharma22.1 (2009). url: http://www.biopharminternational.com/protein-peptide-

purification-using-multicolumn-countercurrent-solvent-gradient-purification-

mcsgp-pr?id=&sk=&date=&pageID=2 (acedido em 30/09/2010).

[32] R. Silva, R. Rodrigues, H. Osuna-Sanchez, M. Bailly, E. Valéry e J. Mota. “A new

multicolumn, open-loop process for center-cut separation by solvent-gradient ch-

romatography”. Em: Journal of Chromatography A 1217.52 (2010), pp. 8257–8269.

[33] Kromasil. The perfectly shaped silica. url: https://www.kromasil.com/products/

classic/the_silica.php (acedido em 30/09/2010).

[34] Justchromatography. Endcapping. url: http://www.justchromatography.com/

wiki/endcapping (acedido em 30/09/2010).

[35] H Fogler. Elements of Chemical Reaction Engineering,5th ed. Prentice Hall, 2016.

Cap. 3.

69

https://patents.google.com/patent/US2985589A/en

https://patents.google.com/patent/US2985589A/en

https://www.chromacon.com/en/technology/continuous-polishing-processes-mcsgp



http://www.biopharminternational.com/protein-peptide-purification-using-multicolumn-countercurrent-solvent-gradient-purification-mcsgp-pr?id=&sk=&date=&pageID=2



https://www.kromasil.com/products/classic/the_silica.php

https://www.kromasil.com/products/classic/the_silica.php

http://www.justchromatography.com/wiki/endcapping

http://www.justchromatography.com/wiki/endcapping

BIBLIOGRAFIA

[36] F. A.S. D. Guiochon G. e A Katti. “Simulated Moving Bed Chromatography”. Em:

Fundamentals of preparative and nonlinear chromatography. 2nd. Reading, Massachu-

setts: Elsevier Academic Press, 2006. Cap. 2.

[37] Y Artioli. Encyclopedia of Ecology. Elsevier, 2008. Cap. Adsorption.

[38] blue dextran - an overview. url: https://www.sciencedirect.com/topics/

medicine-and-dentistry/blue-dextran (acedido em 30/09/2010).

[39] Reversed Phase Mobile Phase Solvents.

[40] B. L. Nilsson, M. B. Soellner e R. T. Raines. “Chemical synthesis of proteins”. Em:

Annual review of biophysics and biomolecular structure 34 (2005), 91–118. doi: https:

//doi.org/10.1146/annurev.biophys.34.040204.144700. url: https://www.

ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2845543/.

[41] G. Guiochon, A. Felinger, D. Shirazi e A Katti. “Simulated Moving Bed Chromato-

graphy”. Em: Fundamentals of preparative and nonlinear chromatography. 2nd. Rea-

ding, Massachusetts: Elsevier Academic Press, 2006. Cap. 3.

[42] E. R. Z. Melander W. e C. Horváth. “). Interplay of hydrophobic and electrostatic

interactions in biopolymer chromatography”. Em: Journal of Chromatography A 469

(1989), pp. 3–27.

70

https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/blue-dextran

https://www.sciencedirect.com/topics/medicine-and-dentistry/blue-dextran

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2845543/

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2845543/

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