Determinação de Aflatoxinas (B , B , G em alimentos … · MS/MS para quatro tipos de alimentos...

Determinação de Aflatoxinas (B1, B2, G1, G2) em alimentos usando o triplo quadrupoloLC/MS/MS

Celso Blatt, Ph.D.

Agilent Technologies Brasil Ltda

1

Agenda:

1. Descrever um método viável e robusto para determinarsimultaneamente as aflatoxinas B1, B2, G1 e G2, usando LC-MS/MS para quatro tipos de alimentos (farinha de milho, amendoim, trigo e nozes);

2. Descrição do método e otimização;

3. Comparação entre preparos de amostra e custos;3. Comparação entre preparos de amostra e custos;

4. Mostrar a boa linearidade da curva atraves da faixa de concentração entre 0.1 a 100ng/g;

5. Descrever a sensibilidade e recuperação para cada aflatoxinaadicionada em cada uma das 4 matrizes;

6. Comparar o uso de padrão interno isotópico.

2

Introdução

“Aflatoxinas são um grupo de micotoxinas produzidas como metabolitos de um fungo Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus” :

•Elas podem ser encontradas em vários alimentos como grãos, nozes

e especiarias;

•As quatro aflatoxinas mais comuns naturalmente são: B , B , G e •As quatro aflatoxinas mais comuns naturalmente são: B1, B2, G1 e

G2;

•A exposição a elas pode causar cancer em humanos ou em animais;

•Métodos analíticos confiáveis e sensíveis para determinação de

aflatoxinas são necessários para garantir que nosso alimento seja

seguro.

3

Análises de aflatoxinas:

•Micotoxinas são produtos químicos tóxicos formados como metabólitossecundários de uma espécie de fungo que rapidamente coloniza as plantações e contamina tudo ou após a colheita;

•Aflatoxinas e Ocratoxinas são micotoxinas mais significativas;

•Os métodos de pre-tratamento de amostra mais usados são extraçãolíquido-liquido, extração em fase sólida ou extração com fluidoslíquido-liquido, extração em fase sólida ou extração com fluidossupercríticos;

•Os métodos de separação/analíticos mais usados são TLC, HPLC, GC, CE e ELISA.

*Review article – Nicholas W. Turner, Sreenath Subrahmanyam, Sergey A. Piletsky, Analytica Chimica Acta 632 (2009) 168–180.

4

Aflatoxinas deste estudo:

Aflatoxina G1 & G2 :

(produzida pela Aspergillus parasiticus.)

Aflatoxina B1 & B2 :

(produzida pela Aspergillus flavus

e A. parasiticus. )

5

Metodologia – preparo da amostra

10g of ground Corn flour, wheat,

peanut or walnut

Spiked with mixture of aflatoxins

@ 5 & 25 ng/g

Sample extracted in 40ml ACN/H O Sample extracted in 40ml ACN/H2O

(84/16%, v/v), 30 min/ambient/shaking

Natural settlement, supernatant

Transferred via two methods

MycoSep Clean-upSolid phase dispersive

Clean-up

6

Metodologia – preparo da amostra (continuação)

MycoSep Clean-up#226, Romer

Solid phase dispersiveClean-up

7ml supernatant cleaned with flash

Multifunctional MycoSep column

0.4ml aliquot diluted with Add 200mg of C18 ODS SPE bulk

0.8ml supernatant transferred to

1.7ml micro-centrifuge tubes

0.4ml supernatant diluted with 0.6ml

10mM ammonium acetate for LC/MS

Vortex for 1 min & centrifuge

@ 14,000 rpm, 3min

Supernatant used for

LC/MS analysis

Centrifuge @ 14,000 rpm,

3 min

0.4ml aliquot diluted with

0.6ml (10mM) ammonium acetate

Add 200mg of C18 ODS SPE bulk

Sorbent, Agilent (p/n 5982-1182)

7

Metodologia - HPLC

Coluna: Zorbax Eclipse C18, 4.6 x 50 mm, 1.8 µm

Fluxo: 0.6 mL/minTemp. Coluna: 40°C

Volume injeção: 5 µL

Canal A: 10 mM acetato de amonia em água,

Canal B: methanol

Gradiente: Tempo (min)

A (%) B (%)

(LC�Waste) 0 95 5

(LC�MS) 1.3 95 5

5 0 100

6.0 0 100

Pós-corrida: 1.5 min

Tempo de cliclo: 8 min

8

Metodologia – MS QQQ

Temp. gás secagem: 325°CFluxo do gás: 10 L/min Pressão nebulizador: 50 psi

Temp. Sheath gas: 350°CFluxo do Sheath gas: 11 L/min

Nebulizer N2 gas

(near sonic velocity)

Super-heated N2

sheath gas

LC flow

Fluxo do Sheath gas: 11 L/minVoltagem da agulha: 1000 V

delta EMV: 400 VVoltagem capilar: 4000 V

Thermal focusing

Electrospray

9

Formula Nominal

Mass

[M+H]+

m/z

Aflatoxin B1 C17

H12

O6

312.07 313.1

Aflatoxin B2 C17

H14

O6

314.08 315.1

Aflatoxin G1 C17

H12

O7

328.06 329.1

Aflatoxin G2 C17

H14

O7

330.08 331.1

Aflatoxinas – Ion precursor

10

QQQ – Otimização do analito: Maximizando a sensibilidade do QQQ.

Voltagem do fragmentor Energia de colisão

11

Aflatoxina B1 – Otimização do fragmentor

220 V200 V

180 V160 V100 V80 V60 V40 V 140 V120 V

Cromatograma do ion extraído, m/z = 131.1

180 V160 V100 V80 V60 V40 V 140 V120 V

Máxima transmissão da AFL B1 [M+H]+ = 130 V

12

Aflatoxina B1 – Otimização da energia de colisão

5x10

0

1

+ESI Product Ion (0.411-0.650 min, 30 scans) Frag=140.0V [email protected] (313.1 -> **) Aflatoxin B1_FIA_CD.d

313.1

285.1

5x10

0

0.5

1

1.5+ESI Product Ion (0.926-1.171 min, 29 scans) Frag=140.0V [email protected] (313.1 -> **) Aflatoxin B1_FIA_CD.d

313.1

285.1

4x10

0

5


313.1

285.1270.0

4x10

2

4


313.1285.1

270.0298.1241.1214.1

20 eV

15 eV

10 eV

5 eV

5x10

1.05

1.1

1.15

1.2

1.25

1.3

1.35

1.4

1.45

1.5

1.55

1.6

1.65

1.7

1.75

1.8

1.85

1.9


313.1

Product Ion Spectra Overlaid;

(All Collision Energies)

4x10

2.3

2.4

2.5

2.6

2.7

2.8

2.9

3

3.1

3.2

3.3

3.4

3.5

3.6

3.7

3.8

3.9

4

4.1

4.2


313.1

285.1

Ion produto m/z = 285.1

Energia de colisão = 20 eV

4x10

2.8

2.9

3


285.120 eV

FIA TIC – AFL B1

0

4x10

0

1


285.1269.1 313.1241.1

214.1 298.0257.1187.1

4x10

0

0.5

1

1.5


241.1 269.0285.1

214.1

253.0 313.1229.1 298.0185.1158.0141.1

4x10

0

1


241.1269.0

214.1

185.1 285.1253.1158.1141.1115.1

4x10

0

1


241.1213.1

269.1185.1

115.1 158.1141.1 253.1201.1 227.0

Counts vs. Mass-to-Charge (m/z)

50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450

25 eV

35 eV

30 eV

40 eV0

0.05

0.1

0.15

0.2

0.25

0.3

0.35

0.4

0.45

0.5

0.55

0.6

0.65

0.7

0.75

0.8

0.85

0.9

0.95

1

285.1


50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 410 420 430 440 450

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

1.6

1.7

1.8

1.9

2

2.1

2.2

2.3

270.0

298.1

241.1 257.1


240 245 250 255 260 265 270 275 280 285 290 295 300 305 310 315 320

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1

1.1

1.2

1.3

1.4

1.5

1.6

1.7

1.8

1.9

2

2.1

2.2

2.3

2.4

2.5

2.6

2.7

2.8

284.1


278.5 279 279.5 280 280.5 281 281.5 282 282.5 283 283.5 284 284.5 285 285.5 286 286.5 287 287.5 288 288.5 289 289.5 290 290.5 291

5 eV

15 eV

10 eV

25 eV

13

Transições MRM – aflatoxinas B1, B2, G1 & G2

Name Retention

time (min)

Fragmentor

voltage

(V)

Precursor ion

(m/z)

Product ion

(m/z)

Collision

energy

(eV)

Aflatoxin B1 4.68 130 313.1 241.1 35

285.1 20

269.1 25

Aflatoxin B2 4.57 130 315.1 287.1 25

259.1 25

243.1 40

Aflatoxin G1 4.40 130 329.1 243.1 25

311.1 20

283.1 20283.1 20

Aflatoxin G2 4.26 130 331.1 245.1 30

285.1 25

313.1 25

Isotope B1 4.68 130 330.1 301.1 20

255.1 40

Isotope B2 4.57 130 332.1 303 25

273.0 30

Isotope G1 4.40 130 346.1 257.1 25

299.1 25

Isotope G2 4.26 130 348.1 330.1 25

259.1 30

14

Cromatogramas sobrepostos do branco e adicionado (spike)

a, Branco de amendoin e spike 5 ppb b, Branco milho e spike 5 ppb

15

Chromatografia

B1

G2

B2G1

aflatoxinas

Sobreposição EICs

Quant ion & 2 x Qualifiers

(1ppb)

G2

Aflatoxinas marcadas

Sobreposição EICs

Quant ion & Qualifier ion

(2.5ppb)

B1

G2

B2G1

16

B1

Curvas com Aflatoxinas

B2

17

G1

Curvas com Aflatoxinas

G2

18

Curvas com Aflatoxinas B1, B2, G1 & G2

400,000

500,000

600,000

700,000

800,000

LC

-MS

resp

on

ses

B1, y=6747x + 938, R2=0.9988

B2, y=5099x + 1329, R2=0.9984

G1, y=4308x + 739, R2=0.9989

G2, y=1088x + 241, R2=0.9988

B2

G1

B1

SEMPadrãoInterno

0

100,000

200,000

300,000

0 20 40 60 80 100 120

Aflatoxin concentration (ng/mL)

LC

-MS

resp

on

ses

G2

Interno

19

90,000

120,000

150,000

LC

-MS

resp

on

ses

B1, y=6747x + 938, R2=0.9988

B2, y=5099x + 1329, R2=0.9984

G1, y=4308x + 739, R2=0.9989

G2, y=1088x + 241, R2=0.9988

Curvas com Aflatoxinas – (ampliado)

B2

G1

B1

SEM

0

30,000

60,000

0 4 8 12 16 20


LC

-MS

resp

on

ses

G2

SEMPadrãoInterno

20

Limite de detecção do método em milhoComparação dos métodos de clean-up

Aflatoxin Mycosep

(#226, Romer)

Dispersive C18ODS SPE bulk

Sorbent,

Agilent (p/n 5982-1182)

LOD LOR LOD LOR

B1 0.047 0.16 0.060 0.20

Milho – média de 7x Batches

B2 0.036 0.12 0.085 0.28

G1 0.08 0.28 0.10 0.35

G2 0.046 0.15 0.033 0.11

Units = ng/g,

LOD = Limit of Detection (S/N >3 )

LOR = Limit of reporting (S/N > 10)

S/N algorithm = peak to peak

21

Limite de detecção do método em trigoComparação dos métodos de clean-up

Aflatoxin Mycosep

(#226, Romer)


Sorbent,

Agilent (p/n 5982-1182)

LOD LOR LOD LOR

B1 0.068 0.23 0.012 0.042

Trigo – média de 7x Batches

B2 0.11 0.36 0.037 0.12

G1 0.14 0.47 0.15 0.50

G2 0.038 0.13 0.11 0.36

Units = ng/g,




22

Limite de detecção do método em amendoimComparação dos métodos de clean-up

Aflatoxin Mycosep

(#226, Romer)


Sorbent,

Agilent (p/n 5982-1182)

LOD LOR LOD LOR

B1 0.051 0.17 0.056 0.19

Amendoim – média de 7x Batches

B2 0.045 0.15 0.069 0.23

G1 0.07 0.23 0.05 0.15

G2 0.052 0.17 0.14 0.45

Units = ng/g,




23

Limite de detecção do método em nozesComparação dos métodos de clean-up

Aflatoxin Mycosep

(#226, Romer)


Sorbent,

Agilent (p/n 5982-1182)

LOD LOR LOD LOR

B1 0.12 0.41 0.093 0.31

Nozes – média de 7x Batches

B2 0.035 0.12 0.098 0.33

G1 0.03 0.10 0.12 0.40

G2 0.047 0.16 0.04 0.13

Units = ng/g,




24

Limites de detecção para Aflatoxinas

Dispersive C18 ODS bulk sorbent, vortexed.

Food Matrix B1LOD (ng/g)

B2LOD (ng/g)

G1LOD (ng/g)

G2LOD (ng/g)

Corn 0.060 0.085 0.100 0.033

Wheat 0.012 0.037 0.150 0.110

Peanut 0.056 0.069 0.050 0.140

Walnut 0.093 0.098 0.120 0.040



Average = 0.055 0.072 0.105 0.080

Mass On-Column = 275 fg 360 fg 525 fg 400 fg

25


Mycosep, #226 clean-up

Food Matrix B1LOD (ng/g)

B2LOD (ng/g)

G1LOD (ng/g)

G2LOD (ng/g)

Corn 0.047 0.036 0.080 0.046

Wheat 0.068 0.110 0.140 0.038

Peanut 0.051 0.045 0.070 0.052

Walnut 0.120 0.035 0.030 0.047



Average = 0.072 0.057 0.080 0.046


26


Método Dispersive C18 x Mycosep, #226 clean-up

aflatoxin: B1LOD

B2LOD

G1LOD

G2LOD

Dispersive C18 Average




Mycosep 3226:Average


27

Curvas de aflatoxinas B1, B2, G1 & G2

400,000

500,000

600,000

700,000

800,000

LC

-MS

resp

on

ses

B1, y=6747x + 938, R2=0.9988

B2, y=5099x + 1329, R2=0.9984

G1, y=4308x + 739, R2=0.9989

G2, y=1088x + 241, R2=0.9988

B2

G1

B1

SEMPadrãoInterno

0

100,000

200,000

300,000

0 20 40 60 80 100 120


LC

-MS

resp

on

ses

G2

Interno

28

25

30

35

40

45

50

Re

sp

on

se

ra

tio

n

(afl

ato

xin

/is

oto

pe

afl

ato

xin

2.5

ng

/mL

)B1, y=0.46x-0.18, R2=0.9998

B2, y=0.40x-0.12, R2=0.9996

G1, y=0.40x-0.08, R2=0.9999

G2, y=0.44x-0.05, R2=0.9999

b

Curvas ISTD para aflatoxinas B1, B2, G1 & G2

0

5

10

15

20

25

0 20 40 60 80 100 120


Re

sp

on

se

ra

tio

n

(afl

ato

xin

/is

oto

pe

afl

ato

xin

2.5

ng

/mL

)

b

Com padrão interno@ 2.5ng/ml

29

Estudos de recuperação - milho(% Recuperação, ± RSD, N=7)

Aflatoxin Corn spiked

at 5 ng/g

C18 clean-up

Corn spiked

at 25 ng/g

C18 clean-up

Corn spiked

at 5 ng/g

MycoSep#226

Corn spiked

at 25 ng/g

Mycosep#226

B1 101.7 ± 3.7 95.7 ± 3.0 107.8 ± 2.8 105.4 ± 2.8

B2 95 ± 6.3 95.4 ± 1.4 103.0 ± 5.7 105.3 ± 2.0

G1 102.7 ± 7.1 96.8 ± 1.75 110.2 ± 7.9 103.7 ± 3.0

G2 107.9 ± 3.5 97.8 ± 0.88 108.1 ± 5.4 104.3 ± 2.4

Sem Padrão interno:

Padrão interno:

Aflatoxin Corn spiked

at 5 ng/g

C18 clean-up

Corn spiked

at 25 ng/g

C18 clean-up

Corn spiked

at 5 ng/g

MycoSep#226

Corn spiked

at 25 ng/g

Mycosep#226

B1 102.3 ± 2.9 100.1 ± 2.4 108.2 ± 5.1 97.8 ± 3.3

B2 100.0 ± 7.9 94.0 ± 3.1 101.7 ± 4.7 92.8 ± 3.5

G1 107.3 ± 3.5 97.0 ± 6.0 110.3 ± 3.6 102.5 ± 1.8

G2 101.3 ± 5.6 100.4 ± 3.8 104.9 ± 5.4 97.2 ± 6.3

Padrão interno:

30

Estudos de recuperação - trigo(% Recuperação, ± RSD, N=7)

Sem padrão interno:

Padrão interno:

Aflatoxin Wheat spiked

at 5 ng/g

C18 clean-up

Wheat spiked

at 25 ng/g

C18 clean-up

Wheat spiked

at 5 ng/g

MycoSep#226

Wheat spiked

at 25 ng/g

Mycosep#226

B1 100.1 ± 4.4 96.6 ± 2.9 113.5 ± 5.9 100.6 ± 1.8

B2 98.2 ± 6.9 96.4 ± 2.6 105.1 ± 4.5 102.1 ± 4.4

G1 100.5 ± 5.5 105.4 ± 3.8 111.5 ± 10.4 106.1 ± 4.0

G2 104.9 ± 3.2 106.7 ± 1.3 108.6 ± 5.2 103.7 ± 2.9

Padrão interno:

Aflatoxin Wheat spiked

at 5 ng/g

C18 clean-up

Wheat spiked

at 25 ng/g

C18 clean-up

Wheat spiked

at 5 ng/g

MycoSep#226

Wheat spiked

at 25 ng/g

Mycosep#226

B1 100.9 ± 3.6 109.3 ± 4.7 107.5 ± 4.8 111.7 ± 4.9

B2 85.2 ± 7.7 99.8 ± 2.8 92.4 ± 6.3 101.0 ± 4.0

G1 110.6 ± 7.8 112.8 ± 1.8 117.6 ± 7.7 109.3 ± 5.7

G2 108.4 ± 6.2 108.3 ± 3.9 115.6 ± 7.1 109.8 ± 3.6

31

Estudos de recuperação - amendoim(% Recuperação, ± RSD, N=7)


Padrão interno:

Aflatoxin Peanut spiked

at 5 ng/g

C18 clean-up

Peanut spiked

at 25 ng/g

C18 clean-up

Peanut spiked

at 5 ng/g

MycoSep#226

Peanut spiked

at 25 ng/g

Mycosep#226

B1 96.7 ± 3.4 97.0 ± 4.6 112.0 ± 8.4 104.9 ± 1.7

B2 98.3 ± 4.7 97.4 ± 2.9 108.0 ± 4.6 104.5 ± 2.0

G1 95.0 ± 5.6 95.0 ± 4.9 109.9 ± 2.1 105.7 ± 3.4

G2 100.0 ± 2.3 100.0 ± 2.0 114.7 ± 3.2 106.3 ± 1.1

Padrão interno:

Aflatoxin Peanut spiked

at 5 ng/g

C18 clean-up

Peanut spiked

at 25 ng/g

C18 clean-up

Peanut spiked

at 5 ng/g

MycoSep#226

Peanut spiked

at 25 ng/g

Mycosep#226

B1 101.8 ± 3.6 96.1 ± 2.0 100.0 ± 6.8 103.0 ± 3.5

B2 102.5 ± 5.5 100.2 ± 5.0 99.4 ± 4.1 102.9 ± 2.7

G1 105.7 ± 7.3 99.2 ± 2.2 105.2 ± 4.3 101.7 ± 5.2

G2 107.5 ± 10.9 104.9 ± 6.7 109.3 ± 8.7 102.4 ± 3.1

32

Estudos de recuperação - nozes(% Recuperação, ± RSD, N=7)


Padrão interno:

Aflatoxin Walnut spiked

at 5 ng/g

C18 clean-up

Walnut spiked

at 25 ng/g

C18 clean-up

Walnut spiked

at 5 ng/g

MycoSep#226

Walnut spiked

at 25 ng/g

Mycosep#226

B1 84.9 ± 3.7 85.2 ± 2.2 101.4 ± 3.2 101.0 ± 2.3

B2 91.5 ± 3.9 89.8 ± 2.8 104.2 ± 7.9 106.3 ± 2.9

G1 89.4 ± 4.4 86.7 ± 1.5 103.9 ± 5.9 101.7 ± 4.2

G2 84.0 ± 4.0 83.1 ± 1.3 109.9 ± 3.4 106.3 ± 1.5

Padrão interno:

Aflatoxin Walnut spiked

at 5 ng/g

C18 clean-up

Walnut spiked

at 25 ng/g

C18 clean-up

Walnut spiked

at 5 ng/g

MycoSep#226

Walnut spiked

at 25 ng/g

Mycosep#226

B1 106.5 ± 4.9 98.9 ± 4.1 93.8± 1.4 100.2 ± 2.9

B2 99 ± 5.4 96.5 ± 3.5 92.4 ± 2.7 98.7 ± 4.4

G1 103.2 ± 5.9 94.9 ± 2.5 102.8 ± 9.0 102.1 ± 3.9

G2 100.2 ± 6.2 97.5 ± 4.6 99.5 ± 6.8 101.2 ± 3.8

33

Resumo - Estudos de recuperação

• Em uma matriz alimento isenta de aflatoxinas foi feito o spike com aflatoxinasB1, B2, G1, G2 @ 5 e 25 ng/g;

•Clean-up usando Dispersive C18, ou Mycosep #226;

•Ambos métodos de preparo deram recuperações entre 95-110%;

•Não houve nenhuma diferença substancial entre os métodos de clean-up paraas amostras de milho, trigo e amendoim;

•Nenhuma diferença em resultados com e sem padrão interno para milho, trigo e •Nenhuma diferença em resultados com e sem padrão interno para milho, trigo e amendoim;

•A recuperação para dispersive C18 foi consistentemente menor para nozes(83-90%);

•Os dados de precisão para recuperação foram tipicamente abaixo de 5% RSD nos 7 batches;

•As baixas recuperações para nozes foram superadas com o uso do padrãointerno.

34

Resumo do método de aflatoxina e desempenho

•O método de clean-up barato e rápido Dispersive C18 clean-up demonstraresultados comparáveis com a técnica conhecida MycoSep com muitasemelhança em performance analitica;

•aflatoxinas B1, B2, G1 & G2 deram um LODs menor do que 140ng/g (menos do que 530fg on-column) para as 4 matrizes de alimentos;

•Os estudos de recuperação para 7 batches mostraram uma recuperação•Os estudos de recuperação para 7 batches mostraram uma recuperaçãoentre 95 e 110% para ambos métodos de clean-up;

•Uma exceção devido provavelmente a supressão de ions ocorrreu com nozes usando a dispersive C18 para o clean-up. Isto foi superado usandopadrões internos marcados isotopicamente.

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Determinação de Aflatoxinas (B , B , G em alimentos … · MS/MS para quatro tipos de alimentos...

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