Determinação de anfetaminas na urina humana através de microextração em fase sólida com...

Universidade Federal do Triângulo Mineiro

Disciplina Eletiva de Métodos Cromatográficos Modernos na área da Saúde

Professor Guilherme Vanucchi Portari

José Humberto FerreiraJosé Lucas Martins Rocha

Lais de Melo Valente Curso de Biomedicina

Uberaba - MGJunho/2015

Determinação de anfetaminas na urina humana através de

microextração em fase sólida com headspace e cromatografia a gás

Objetivo/justificativa do artigo

Estudo de métodos para otimizar a determinação de

anfetaminas, analitos semivoláteis, bem como a verificação da eficácia da microextração em fase

sólida (SPME) para tal fim

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Introdução DETER

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Figura 2. Estruturas químicas da anfetamina e dos seguintes derivados anfetamínicos: 3,4-metileno-dioxi-anfetamina (MDA), 3,4-metileno-dioxi-metanfetamina (MDMA), 3,4-metileno-dioxi-etil-anfetamina (MDEA), 2,5-dimetoxi-4-bromo-anfetamina (DOB), 2,5-dimetoxi-4-iodo-anfetamina (DOI), 2,5-dimetoxi-α,4-dimetil-feniletilamina (DOM), 2,5-dimetoxi-4-etil-anfetamina (DOET), 2,5-dimetoxi-4-propil-anfetamina (DOPR)

Metanfetamina(MA)

ecstasy

Ice, cristal, speed e

meth

Estimulantes do

sistema nervoso central (SNC)

PARA REALIZAÇÃO DESSE ESTUDO:

Resumo

Primeiramente, foi utilizada uma fibra revestida de 100 μm de dimetil polissiloxano (PDMS) para realizar a extração das anfetaminas de urina humana;

A determinação de anfetamina foi realizada utilizando cromatografia a gás (CG) com detecção por ionização de chama (Flame-ionization detection - FID);

A temperatura, o tempo e a saturação de sal foram otimizados para obter uma extração consistente;

Um único procedimento foi desenvolvido para a análise de anfetamina (AMP) e metanfetamina (MA – ice, cristal speed e meth) na urina, enquanto que outro procedimento foi desenvolvido para MDA, MDMA (ecstasy) e MDEA utilizando microextração em fase sólida com headspace (HS-SPME) e cromatografia a gás com detector por ionização de chama (GC-FID).;

Recuperações mais altas foram obtidas para anfetamina (19,5 – 47%) e metanfetamina (20 – 38,1%) comparativamente a MDA (5,1 - 6,6%), MDMA (7 – 9,6%) e MDEA (5,4 – 9,6%).

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Introdução

A microextração em fase sólida (SPME) é dada como uma metodologia confiável para a preparação de amostras;

Foi originalmente desenvolvida para a extração de compostos orgânicos a partir de amostras ambientais, sendo realizada posteriormente a cromatografia a gás (GC);

Vantagens:Simplicidade;Baixo custo;Compatibilidade com sistemas analíticos;Possibilidade de automação/automatização;Extração isenta de solventes

Tem sido acoplada à cromatografia líquida e à eletroforese por capilaridade para a análise de macromoléculas em amostras biológicas (urina, plasma, cabelo,etc.);

Ampla gama de analitos: drogas de abuso, antidepressivos tricíclicos, esteroides, alcoóis, analgésicos, entre outros.

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Porque

utilizar a

microextraçã

o em fase

sólida

(SPME)

As anfetaminas são frequentemente monitoradas utilizando-se de matrizes muito complexas

HS-SPME minimiza as interações

entre a amostra a ser analisada e a fibra da coluna

Ainda se fazem necessárias adaptações

para otimizar as condições analíticas

(recuperação dos analitos, ...)

Materiais & Métodos

1) MATERIAIS Reagentes(Merck® - Alemanha)

Metanol;K2CO3 [carbonato de potássio]; NaCl [cloreto de sódio];KOH [hidróxido de potássio];

Soluções estoque (Programa das Nações Unidas para o Controle de drogas - Áustria)

Anfetamina;Metanfetamina;MDA;MDMA;MDEA

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1) MATERIAIS Dispositivo de microextração em fase sólida (SPME); Fibra de 100 μm (espessura) revestida com dimetilpolissiloxano [PDMS] (Supleco® - EUA); Amostras de urina livre de drogas paciente adulto saudável do sexo masculino padrão de urina;Frascos de vidro transparente com capacidade volumétrica de 9 mL, vedados com septos de silicone e tampas de alumínio. (Alltech® - USA)

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2) CROMATOGRAFIA A GÁS

CE Instruments GC 8000 Top (ThermoQuest®- Italia); Coluna de 30m x 0.25 mm I.D. AT-5 (filme de 0,25 μm de espessura)(Alltech® - USA);Detector por ionização de chamas (DIT); C-R6A Chromatopac integrator (Shimadzu® - Japão) análise de dados;Sistema de injeção splitless;Gás de arraste: hélio

Fluxo: 1 mL/min;Temperatura do injetor e do detector: 220 e

280ºC;Temperatura do forno: 40ºC (1 minuto) -

280ºC (ɸ=20ºC/min)


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Nos experimentos preliminares usando HS-SPME com padrão de referência foram encontradas diferenças de recuperação entre as amostras de urina enriquecida com AMP ou MA (anfetamina e meta-anfetamina respectivamente) e as enriquecidas com MDA (3,4 metileno-dioxi-anfetamina), MDMA (3,4 metileno-dioxi-N-metanfetamina) e MDME (3,4-metileno-dioxi-N-etil-anfetamina);

Decidiu-se então desenvolver um processo de amostragem HS-SPME para AMP e MA e outros procedimentos para MDA, MDMA e MDEA (derivados anfetamínicos).

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Resultados & Discussão

3) AMOSTRAGEM PARA MICROEXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA

Preparação da amostra: pesagem de sal sólido no frasco vazio;Adição de amostra de urina;Selagem do frasco com septo de silicone e tampa de alumínio;Aquecimento à temperatura apropriada – bloco aquecedor de alumínio;Introdução da agulha de perfuração do septo do dispositivo de SMPE;Exposição da fibra ao headspace por 15 minutos;Remoção da agulha e inserção no orifício de alimentação do cromatógrafo a gás previamente aquecido (220ºC) etapa de dessorção (mover-se com a fase móvel).

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4) PROCEDIMENTO DE AMOSTRAGEM HS-SPME PARA ANFETAMINA E METANFETAMINA

Frasco de 9 mL contendo 1g de K2CO3 e 1mL de urina com 1559 ng/mL de anfetamina (AMP);Amostra aquecida a 60ºC, 70ºC e 80ºC por 30 minutos;Nos últimos 15 minutos a agulha metálica do dispositivo de microextração em fase sólida (SPME) foi introduzida no frasco através do septo e a fibra foi exposta; Amostras enriquecidas foram analisadas em duplicata à cada temperatura;A amostra com temperatura de 60º C obteve 29% de recuperação.

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4) PROCEDIMENTO DE AMOSTRAGEM HS-SPME PARA ANFETAMINA E METANFETAMINA

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Uma temperatura de aquecimento de 60ºC foi adotada para outro experimento devido à recuperação de analitos mais elevada;Tempo de 15 minutos para a exposição da fibra foi adotado em virtude de maior precisão;Anfetaminas são compostos semivoláteis e sua volatilidade a partir de uma matriz líquida é dependente de alguns parâmetros básicos, como o pH e a saturação de sal.

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5) CURVAS DE CALIBRAÇÃO, RECUPERAÇÃO E LIMITES DE DETECÇÃO DO MÉTODO DE MICROEXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA COM HEADSPACE (HS-SPME) PARA ANÁLISE DE ANFETAMINA E METANFETAMINA

Amostra de 1 mL com 1g de K2C03, com tempo de aquecimento de 30 minutos e tempo de adsorção nos últimos 15 minutos;As curvas foram construídas através da representação gráfica da média da área dos picos das duas medições;Os gráficos de calibração foram lineares para os intervalos de concentração testados: 125 a 3742 ng/mL para anfetamina e 129 a 3876 ng/mL para a metanfetamina;Os níveis mínimos detectáveis de anfetamina e metanfetamina na urina foram de 30 ng/mL para ambos os compostos.

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Fig.1. Cromatograma de cromatografia a gás de anfetamina (cromatógrafo a gás com detector de ionização de chama - GC-FID). Uma amostra de urina contendo 5000 ng de anfetamina foi analisada através do método de microextração em fase sólida com headspace (HS-SPME).


6) DESENVOLVIMENTO DE PROCEDIMENTO DE AMOSTRAGEM PARA MICROEXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA COM HEADSPACE (HS-SPME) PARA MDA, MDMA E MDEA

Método para AMP e MA baixas recuperações com valores similares de MDA, MDMA e MDEA;Extração sob condições diferentes para urina enriquecida com MDA;Baixa recuperação à 60°C;Aumento da concentração da urina enriquecida para 2760 ng/mL;Novamente, baixa recuperação à 70°;Aquecimento graduado dos frascos (80, 90 e 100°C) durante 45 min;

Obs: As amostragens foram realizadas em duplicata.

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Melhores resultados foram obtidos à temperatura de 90°C.

Urina enriquecida com MDA foi extraída sob diferentes condições (temperatura de aquecimento e volume de amostra) para anfetamina (AMP) e metanfetamina (MA):

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Verificação do volume:

1g/mL de K2CO3 colocado em frascos de 9 mL; Continham 1, 2, 3 e 4 mL de urina enriquecida com MDA (2760 ng/mL), respectivamente; Aquecimento à 90°C por 45 minutos; Últimos 15 minutos: exposição da agulha metálica da fibra de SPME no headspace.


O volume da amostra selecionada foi de 4 mL, por causa da sensibilidade mais elevada.

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7) AS CURVAS DE CALIBRAÇÃO, RECUPERAÇÕES E LIMITES DE DETECÇÃO DO MÉTODO DE HS-SPME PARA ANÁLISE DE MDA, MDMA E MDEA

Foi feito o procedimento:

4g de K2CO3, 4mL de amostra de urina enriquecida com MDA,Aquecida à 90°C por 45 minutos;Adsorção nos últimos 15 minutos;A curva de calibração foi obtida conforme a média da área do pico.


Conclusão

Microextração em fase sólida (SPME)

Rapidez;Isenta de solventes;Alternativa aos métodos tradicionais

OBJETIVO:

Maximizar a recuperação de analitos;Determinar MDA, MDMA e MDEA utilizando uma técnica que, anteriormente, era exclusiva para anfetamina e metanfetamina.

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Referências Bibliográficas

Disponível em: <http://p3.publico.pt/actualidade/sociedade/1945/europa-e-o-maior-produtor-de-anfetaminas-do-mundo >. Acesso em 28/05/2015. Disponível em: < http://images.slideplayer.com.br/10/2928477/slides/slide_3.jpg>. Acesso em 28/05/2015. RAIKOS, N.; CHRISTOPOULOU, K.; THEODORIDIS, G.; TSOUKALI, H.; PSAROULIS, D. Determination of amphetamines in human urine by headspace solid-phase microextraction and gas chromatography. Journal of Chromatography B, 789 (2003) 59-63.BULCÃO, R.; GARCIA, S. C.; LIMBERGER, R.P.; BAIERLE, M. Designer drugs: aspectos analíticos e biológicos. Quimica Nova, v. 35, nº 1, 149 – 158, 2012.

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http://p3.publico.pt/actualidade/sociedade/1945/europa-e-o-maior-produtor-de-anfetaminas-do-mundo

http://p3.publico.pt/actualidade/sociedade/1945/europa-e-o-maior-produtor-de-anfetaminas-do-mundo

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