DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL, TOXICIDADE, BIODEGRADABILIDADE E...

TÂNIA MARIA DA SILVA LIMA

DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL, TOXICIDADE, BIODEGRADABILIDADE E EFICÁCIA DE BIOSSURFACTANTES NA REMOÇÃO DE FENANTRENO E

CÁDMIO DE SOLO

Tese apresentada à Universidade Federal de Viçosa, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Agrícola, para obtenção do título de Doctor Scientiae.

VIÇOSA

MINAS GERAIS – BRASIL JUNHO - 2008

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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO DE CATALOGAÇÃO E CLASSIFICAÇÃO DA BIBLIOTECA CENTRAL DA UFV

TÂNIA MARIA DA SILVA LIMA

DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL, TOXICIDADE, BIODEGRADABILIDADE E EFICÁCIA DE BIOSSURFACTANTES NA REMOÇÃO DE FENANTRENO E CÁDMIO DE SOLO

Tese apresentada à Universidade Federal de Viçosa, como parte das exigências do Programa de Pós-Graduação em Microbiologia Agrícola, para obtenção do título de Doctor Scientiae.

APROVADA: 21 de fevereiro de 2008.

Profª Márcia Nitschke Universidade Estadual de São Paulo (USP)

Prof. Elson Santiago de Alvarenga Universidade federal de Viçosa (UFV)

(Co-orientador)

Prof. Arnaldo Chaer Borges Universidade federal de Viçosa (UFV)

(Co-orientador)

Prof. Antônio Nascimento Galvão Universidade federal de Viçosa (UFV)

(Co-orientador)

Prof. Marcos Rogério Tótola Universidade federal de Viçosa (UFV)

(Orientador)

i

Agradeço a Deus, por me permitir alcançar uma conquista a mais na minha carreira. Dedico: Aos meus pais Vicente (in memorium) e Maria, aos meus irmãos e aos meus sobrinhos, que compartilham os meus ideais e os alimentam, incentivando-me a prosseguir quaisquer que sejam os obstáculos. A Lorena Procópio, não só pela grande ajuda e colaboração no desenvolvimento deste trabalho, mas também pelo carinho, compreensão e principalmente por sua grande amizade. Minha eterna gratidão e reconhecimento de que nos méritos desta conquista há muito de sua presença.

Obrigada.

ii

AGRADECIMENTOS

A Deus, pois não houve um só momento em minha vida que me sentisse abandonada por

ele.

À Universidade Federal de Viçosa e ao Departamento de Microbiologia, pela oportunidade

de realização do curso.

Ao Conselho de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pela concessão da

bolsa de estudos.

Ao professor Marcos Rogério Tótola, meu orientador, cujos valiosos ensinamentos

transmitidos, a paciência, a dedicação e o apoio foram fundamentais para a transposição desta

etapa de minha vida.

Aos professores, Arnaldo Chaer Borges e Mauricio Dutra Costa, pelo apoio e ajuda que

nunca me foram negados.

Às professoras Maria Catarina Megumi Kasuya e Elza Fernandes de Araújo, pelos

aconselhamentos e por serem tão amigas e prestativas.

Ao professor Elson S. de Alvarenga pelo importante auxílio e prestabilidade.

A todos os professores do Departamento de Microbiologia Agrícola, pelos ensinamentos

que me ajudaram, direta ou indiretamente, na conclusão deste trabalho.

Ao professor Antônio Galvão por nunca ter me deixado desistir.

A todos os funcionários do BIOAGRO, pela amizade e ajuda no bom funcionamento do

laboratório.

A todos os colegas do laboratório, pela ajuda na parte experimental para a conclusão deste

trabalho.

Ao André Carvalho por sua amizade e fundamental ajuda nas análises estatísticas.

À Lorena Procópio e ao Felipe Brandão, pela ajuda na condução dos experimentos,

amizade, compreensão, pelo apoio e pela força nos momentos difíceis.

Ao Marcelo Rodrigues pelo amor incondicional.

À minha mãe Maria Lima, pelo imenso amor dedicado e pelo apoio incansável.

Aos meus irmãos e sobrinhos, por alegrarem a minha vida com sua existência.

iii

À minha grande amiga, Bruna, que me motivou, para que minha fragilidade humana não me

fizesse desistir.

À Cássia Fernandes, Rose e Adélia pela amizade, paciência, compreensão e apoio nos

melhores e maus momentos que tive nessa etapa da minha vida.

A todos os colegas do curso, pela amizade, pelos momentos de descontração e pela ajuda

nos momentos mais críticos.

Aos verdadeiros amigos que aqui encontrei: Antônio Galvão, Péricles Fernandes, Patrícia

Pimentel, Patrícia Leal, Maike Rosmman, Fabiane Mesquita, André Carvalho, Irene e Marcela Reis.

iv

ÍNDICE

LISTA DE TABELAS .............................................................................................. vii LISTA DE FIGURAS ............................................................................................... viii RESUMO GERAL ................................................................................................... xi INTRODUÇÃO GERAL........................................................................................... 1

CAPÍTULO 1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 1.1. SURFACTANTES: TIPOS, ESTRUTURAS E PROPRIEDADES ..................... 4 1.1.1. Tensão superficial e Concentração Micelar Crítica (CMC) ............................ 5 1.1.2. Emulsões e Surfactantes............................................................................... 10 1.1.3. Balanço Hidrofílico/Lipofílico (HLB) ............................................................... 11 1.1.4. Estabilidade de Uma Emulsão....................................................................... 13 1.2.BIOSSURFACTANTES: CLASSIFICAÇÃO E ORIGEM MICROBIANA ............ 13 1.2.1. Glicolipídeos .................................................................................................. 15 1.2.2. Lipopeptídeos e Lipoproteínas....................................................................... 17 1.2.3. Ácidos graxos, fosfolipídeos e lipídeos neutros ............................................. 19 1.2.4. Biossurfactantes Poliméricos......................................................................... 20 1.2.5. Biossurfactantes Particulados........................................................................ 21 1.3. PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTES......................................................... 21 1.4. RECUPERAÇÃO E ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DE BIOSSURFACTANTES 23 1.5. BIODEGRADABILIDADE E TOXICIDADE DE BIOSSURFACTANTES ........... 25 1.5.1. Biodegradação............................................................................................... 25 1.5.2. Efeitos tóxicos................................................................................................ 28 1.6. APLICAÇÃO DE SURFACTANTES NA REMOÇÃO DE METAIS PESADOS E

HIDROCARBONETOS POLIAROMÁTICOS (PAH’s) ..................................... 30 1.6.1. Agentes de Remediação para Metais Pesados ............................................. 32 1.6.2. Agentes de Remediação para Hidrocarbonetos Poliaromáticos (PAH’s)....... 33 1.6.3. Mecanismos de Remoção por Surfactantes .................................................. 34 1.6.4. Complexação de Metais na Solução de Surfactante-ligante.......................... 35 1.6.5. Aplicações de complexo Surfactante-ligante ................................................. 36 5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 38

CAPÍTULO 2. CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E FÍSICO-QUÍMICA DE SURFACTANTES BACTERIANOS

2.1. RESUMO.......................................................................................................... 50 2.2. INTRODUÇÃO.................................................................................................. 52 2.3. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................. 54 2.3.1. Microrganismos ............................................................................................. 54 2.3.2. Condições de Cultivo e Produção dos Biossurfactantes................................ 54 2.3.3. Extração e Purificação dos Biossurfactantes................................................. 55 2.3.4. Análise da Composição Química dos Biossurfactantes................................. 56 2.3.4.1. Espectroscopia de Infravermelho (FT-IR) ................................................... 56

v

2.3.4.2. Espectrometria de Massa - Ionização/Dessorção a Laser Assistida por Matriz com Tempo de Vôo- (MALDI-TOF-MS)................................................ 56

2.3.4.3. Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) ...................... 56 2.3.5. Interpretação dos Dados Espectrométricos e Espectroscópicos ................... 56 2.3.6. Caracterização Físico-Química dos Biossurfactantes Purificados................. 57 2.3.6.1. Concentração Micelar Crítica (CMC) .......................................................... 57 2.3.6.2. Atividade de Emulsificação e Estabilidade da Emulsão.............................. 57 2.3.6.3. Determinação do Efeito da Salinidade na Atividade dos Biossurfactantes . 58 2.3.6.4. Determinação do Efeito da Temperatura na Atividade dos Biossurfactantes 58 2.3.6.5. Determinação do Efeito do pH na Atividade dos Biossurfactantes ............. 58 2.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................... 59 2.4.1. Caracterização Estrutural dos Biossurfactantes ............................................ 59 2.4.1.1. Caracterização Quanto à Composição Química do Biossurfactante

Produzido por Bacillus sp. LBBMA 111A ........................................................ 59 2.4.1.2. Caracterização da Composição Química do Biossurfactante Produzido por

Bacillus subtilis LBBMA 155............................................................................ 66 2.4.1.3. Caracterização da Composição Química do Biossurfactante Produzido por

Arthrobacter oxydans LBBMA 201.................................................................. 70 2.4.1.4. Análise de Cromatografia de Camada Delgada Comparativa (CCDC) dos

Biossurfactantes Produzidos por Dietzia maris LBBMA 191 e Flavobacterium sp. LBBMA 168 ............................................................................................... 73

2.4.2. Tensão superficial e Concentração Micelar Crítica (CMC) dos Biossurfactantes Purificados ...................................................................................................... 74

2.4.3. Atividade Emulsificante e Estabilidade da Emulsão ...................................... 76 2.4.4. Efeito do pH, da Temperatura e da Força Iônica na Atividade dos

Biossurfactantes Purificados........................................................................... 79 2.5. CONCLUSÕES ................................................................................................ 86 2.6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 87

CAPÍTULO 3. AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DE SURFACTANTES BACTERIANOS PARA MICRORGANISMOS DEGRADADORES DE PETRÓLEO

3.1. RESUMO .......................................................................................................... 92 3.2. INTRODUÇÃO ................................................................................................. 94 3.3. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................. 96 3.3.1. Surfactantes................................................................................................... 96 3.3.2. Avaliação da Toxicidade Aguda de Biossurfactantes para a Bactéria

Luminescente Vibrio fischeri ........................................................................... 98 3.3.3. Avaliação da Toxicidade de Biossurfactantes Para Isolados Bacterianos ..... 99 3.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................... 101 3.4.1. Toxicidade Aguda de Biossurfactantes para a Bactéria Luminescente Vibrio

fischeri............................................................................................................. 101 3.4.2. Efeitos de surfactantes no Crescimento de Acinetobacter baumannii LBBMA

04, Acinetobacter junni LBBMA 36, Pseudomonas sp. LBBMA 101B e Acinetobacter baumanni LBBMA ES11 em meio mineral com glicose ........... 104

3.5. CONCLUSÕES ................................................................................................ 110 3.6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 111

vi

CAPÍTULO 4. AVALIAÇÃO DA BIODEGRADABILIDADE DE BIOSSURFACTANTES BACTERIANOS

4.1. RESUMO .......................................................................................................... 113 4.2. INTRODUÇÃO ................................................................................................. 115 4.3. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................. 117 4.3.1. Surfactantes................................................................................................... 117 4.3.2. Microrganismos utilizados nos testes de degradação ................................... 118 4.3.3. Avaliação da biodegradabilidade de surfactantes bacterianos ...................... 119 4.3.3.1. Ensaio de Biodegradabilidade em Fase Líquida......................................... 119 4.3.3.2. Ensaio de Biodegradabilidade em Microcosmos de Solo ........................... 120 4.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................... 122 4.4.1. Potencial de Culturas Puras em Degradar os Biossurfactantes .................... 122 4.4.2.Degradação de Biossurfactantes por Cultura Bacteriana Mista em Solo........ 126 4.5. CONCLUSÕES ................................................................................................ 131 4.6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 132

CAPÍTULO 5. REMOÇÃO SIMULTÂNEA DE FENANTRENO E CÁDMIO DE SOLO CONTAMINADO POR UMA SOLUÇÃO LIGANTE/BIOSSURFACTANTE

5.1. RESUMO .......................................................................................................... 134 5.2. INTRODUÇÃO ................................................................................................. 136 5.3. MATERIAL E MÉTODOS................................................................................. 138 5.3.1. Surfactantes................................................................................................... 138 5.3.2. Solo ............................................................................................................... 139 5.3.3. Procedimento de Contaminação do Solo....................................................... 141 5.3.4. Procedimento de Lavagem do Solo............................................................... 141 5.3.5. Análise de Fenantreno Residual.................................................................... 142 5.3.6. Análises Estatísticas...................................................................................... 142 5.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................... 143 5.4.1. Remoção de Cd2+ de um Latossolo por Soluções de Surfactantes-Ligante .. 143 5.4.2. Remoção de Fenantreno de um Latossolo por Soluções de Surfactantes-

Ligante ............................................................................................................ 150 5.4.3. Eficiência de Soluções Surfactantes-Ligante na Remoção Simultânea de Cd2+

e Fenantreno................................................................................................... 153 5.5. CONCLUSÕES ................................................................................................ 154 5.6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................ 155

vii

LISTA DE TABELAS

Tabela 1.1. Comparação da tensão superficial e Concentração Micelar Critica (CMC) de biossurfactantes e surfactantes sintéticos

6

Tabela 1.2. Valores de HLB de surfactantes e suas respectivas aplicações 12 Tabela 1.3. Classes de biossurfactantes e microrganismos produtores 14 Tabela 1.4. Toxicidade de biossurfactantes comparada aos surfactantes sintéticos 29 Tabela 1.5. Técnicas para remediação de áreas contaminadas 31 Tabela 2.1. Caracterização por espectrometria de massas MALDI-TOF dos principais

homólogos dos biossurfactantes (surfactina, iturina e fengicina) produzidos por B. subtilis LBBMA 111A, após separação por CCDP

64

Tabela 3.1. Tensão superficial (γ) e concentração micelar crítica (CMC) dos surfactantes utilizados neste estudo

96

Tabela 3.2. Concentrações dos surfactantes utilizados no ensaio de toxicidade aguda com Vibrio fischeri

98

Tabela 3.3. Isolados microbianos utilizados para a avaliação da toxicidade de surfactantes 99 Tabela 4.1. Tensão superficial (γ) e concentração micelar crítica (CMC) dos surfactantes

utilizados neste estudo 117

Tabela 4.2. Produção de CO2 durante o cultivo de Acinetobacter haemolyticus LBBMA 53, Acinetobacter baumanni LBBMA ES11 e Pseudomonas sp. LBBMA 101B em meio mineral suplementado com biossurfactantes e com o surfactante sintético SDS.

124

Tabela 4.3. Tensão superficial (γ) nos sobrenadantes dos meios de cultura inoculados e suplementados com surfactantes, após cultivo de 166 horas, a 30 ºC

125

Tabela 4.4. Emissão de CO2 e tensão superficial (γ) em microcosmos de solos estéreis e inoculados com uma cultura bacteriana mista, na presença de surfactantes, após 166 horas de incubação, a 30°C

129

Tabela 5.1. Caracterização dos surfactantes utilizados neste estudo 138 Tabela 5.2. Caracterização físico-química do solo experimental 140 Tabela 5.3. Remoção de Cd2+ de um latossolo vermelho-amarelo por surfactantes

combinados com diferentes concentrações do ligante iodeto (I-) 145

Tabela 5.4. Eficiência de remoção de fenantreno, após tratamento do solo com surfactantes, na presença/ausência do ligante

151

viii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1.1. Tipos de estruturas de associação de surfactantes em solução 7 Figura 1.2. Diagrama esquemático da variação da tensão superficial e solubilidade em

função da concentração de surfactante (CMC representa a concentração micelar crítica)

8

Figura 1.3. Modelo de Stigter para a formação de micela iônica normal com estrutura esférica

9

Figura 1.4. Duas Formas de Emulsão: (A) Óleo-em-água; (B) Água-em-óleo 10 Figura 1.5. Estrutura de ramnolipídeo de Pseudomona aeruginosa 15 Figura 1.6. Estrutura do trealolipídeo produzido por Rhodococcus erythropolis 16 Figura 1.7. Estrutura molecular de soforolipídeo de Candida (Torulopsis) bombicola 17 Figura 1.8. Lipopeptídeos produzidos por linhagens de Bacillus subtilis: (A) Surfactina (B)

Iturina A e (C) Fengicina 18

Figura 1.9. Estrutura de Fosfatidiletanolamina de Acinetobacter sp.. R1 e R2 são cadeias de hidrocarbonetos

19

Figura 1.10. Ácido corinomicólico de Corynebacterium sp. R1 e R2 são grupamentos alquílicos

20

Figura 1.11. Estrutura de Emulsan de Acinetobacter calcoaceticus 20 Figura 1.12. Mecanismo de oxidação (A) ω e (B) β da cadeia alquílica durante a

degradação de surfactante aniônico 27

Figura 1.13 Mecanismos de remoção de metal pelo biossurfactante Surfactina 35 Figura 2.1. Cromatografia de camada delgada (CCD) realizada em placa de sílica gel 60

F254 e eluido com CHCl3/CH3OH (60:40 v/v) 59

Figura 2.2. Espectro de IR do biossurfactante LBBMA 111A produzido por Bacillus sp. LBBMA 111A

60

Figura 2.3. Espectro de RMN-H1 (300 MHz, CDCl3) da (A) mistura de surfactantes produzidos por Bacillus sp. LBBMA 111A e da (B) amostra padrão de surfactina (SIGMA)

62

Figura 2.4. Estrutura de (A) surfacina, (B) iturina e (C) fengicina produzidos por diversas linhagens de Bacillus.

65

Figura 2.5. Espectro de IR da amostra contendo o biossurfactante produzido por Bacillus subtilis LBBMA 155

67

Figura 2.6. Espectro de ressonância Magnética nuclear (RMN) de H1 da (A) amostra contendo o surfactante LBBMA 155 produzido por Bacillus subtilis LBBMA 155 à 30°C e da (B) amostra padrão de surfactina (SIGMA)

68

Figura 2.7. Espectro de MALDI-TOF-MS da amostra de surfactante produzido por Bacillus subtilis LBBMA 155

69

Figura 2.8. Espectro de IR do biossurfactante LBBMA 201 produzido por Arthrobacter oxydans LBBMA 201

71

Figura 2.9. Espectro de ressonância Magnética nuclear (RMN) de H1 da amostra contendo o surfactante LBBMA 201 produzido por Arthrobacter oxydans LBBMA 201 à 30°C

72

Figura 2.10. Estrutura de artrofactina de Arhrobacter sp. MIS38 73 Figura 2.11. Variação da tensão superficial (γ) com a concentração do (A) LBBMA 111A, 75

ix

(B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191 e (E) LBBMA 201 e do surfactante sintético (F) SDS®, em solução aquosa à 28°C em pH 6.8. As curvas foram plotadas para médias de duas repetições com as barras de erros representando ± o desvio-padrão.

Figura 2.12. Atividade de emulsificação de vários hidrocarbonetos com os biossurfactantes (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191 e (E) LBBMA 201 e do surfactante sintético (F) SDS. As curvas foram plotadas para médias de duas repetições com as barras de erros representando ± o desvio-padrão.

78

Figura 2.13. O efeito do pH sobre a atividade tensoativa do biossurfactante (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191 e (E) LBBMA 201 e do surfactante sintético (F) SDS. As curvas foram plotadas para médias de duas repetições com as barras de erros representando ± o desvio-padrão.

81

Figura 2.14. Efeito da temperatura sobre a atividade tensoativa do biossurfactante (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191 e (E) LBBMA 201 e do surfactante sintético (F) SDS. As curvas foram plotadas para médias de duas repetições com as barras de erros representando ± o desvio-padrão.

83

Figura 2.15. Efeito da força iônica sobre a atividade tensoativa dos biossurfactantes (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191 e (E) LBBMA 201 e do surfactante sintético (F) SDS.. As curvas foram plotadas para médias de duas repetições com as barras de erros representando ± o desvio-padrão.

85

Figura 3.1. Inibição da luminescência da bactéria Vibrio fischeri após exposição de diferentes concentrações dos biossurfactantes (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191 e (E) LBBMA 201 e do surfactante sintético (F) SDS®. Dados relativos à média de três repetições com as barras de erros representando ± o desvio-padrão

102

Figura 3.2. Efeitos da concentração dos biossurfactantes (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191 e (E) LBBMA 201 e do surfactante sintético (F) SDS®, no crescimento de Acinetobacter baumannii LBBMA 04, em meio mineral com glicose 2%. Os dados representam as médias de três repetições

106

Figura 3.3. Efeitos da concentração dos biossurfactantes (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191 e (E) LBBMA 201 e do surfactante sintético (F) SDS®, no crescimento de Acinetobacter baumanni LBBMA ES11, em meio mineral com glicose 2%. Os dados representam as médias de três repetições

107

Figura 3.4. Efeitos da concentração dos biossurfactantes (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191 e (E) LBBMA 201 e do surfactante sintético (F) SDS®, no crescimento de Pseudomonas sp. LBBMA 101B, em meio mineral com glicose 2%. Os dados representam as médias de três repetições

108

Figura 3.5. Efeitos da concentração dos biossurfactantes (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191 e (E) LBBMA 201 e do surfactante sintético (F) SDS®, no crescimento de Acinetobacter junni LBBMA 36, em meio mineral com glicose 2%. Os dados representam as médias de três repetições

109

x

Figura 5.1a. Efeito de lavagens sucessivas na remoção de Cd2+ do solo. S1 (Surfactante LBBMA 111A); S2 (Surfactante LBBMA 155); C1 (0,0 mol L-1 de I-); C2 (0,168 mol L-1 de I-); C3 (0,336 mol L-1 de I-). ***, *, ** = significativas a 10, 5 e 1 % de probabilidade, respectivamente

146

Figura 5.1b. Efeito de lavagens sucessivas na remoção de Cd2+ do solo. S3 (Surfactante LBBMA 168); S4 (Surfactante LBBMA 201); S5 (Surfactante Triton X-100); C1 (0,0 mol L-1 de I-); C2 (0,168 mol L-1 de I-); C3 (0,336 mol L-1 de I-). ***, *, ** = significativas a 10, 5 e 1 % de probabilidade, respectivamente

147

Figura 5.1c. Efeito de lavagens sucessivas na remoção de Cd2+ do solo. S5 (Surfactante Triton X-100); C1 (0,0 mol L-1 de I-); C2 (0,168 mol L-1 de I-); C3 (0,336 mol L-1 de I-). ***, *, ** = significativas a 10, 5 e 1 % de probabilidade, respectivamente

148

Figura 5.2. Efeito da concentração do ligante (I-) na remoção de Cd2+ do solo. S1 (Surfactante LBBMA 111A); S2 (Surfactante LBBMA 155); S3 (Surfactante LBBMA 168); S4 (Surfactante LBBMA 201); S5 (Surfactante Triton X-100). ***, *, ** = significativas a 10, 5 e 1 % de probabilidade, respectivamente.

149

Figura 5.3. Efeito de lavagens sucessivas na remoção de fenantreno de solo. S1 (Surfactante LBBMA 111A); S2 (Surfactante LBBMA 155); S3 (Surfactante LBBMA 168); S4 (Surfactante LBBMA 201); S5 (Surfactante Triton X-100); C1 (0,0 mol L-1 de I-); C2 (0,168 mol L-1 de I-); C3 (0,336 mol L-1 de I-). ***, *, ** = significativos a 10, 5 e 1% de probabilidade, respectivamente

150

Figura 5.4. Efeito da concentração de ligante (I-) na remoção de fenantreno de solo. S1 (Surfactante LBBMA 111A); S2 (Surfactante LBBMA 155); S3 (Surfactante LBBMA 168); S4 (Surfactante LBBMA 201); S5 (Surfactante Triton X-100). ***, *, ** = significativas a 10, 5 e 1 % de probabilidade, respectivamente. S1= sem modelo, pois o coeficiente angular da reta é igual a zero, ou seja, não varia com a concentração do ligante

152

xi

RESUMO GERAL

LIMA, Tânia Maria da Silva, M.S., Universidade Federal de Viçosa, Fevereiro de 2008. Determinação Estrutural, Toxicidade, Biodegradabilidade e Eficácia de Biossurfactantes na Remoção de Fenantreno e Cádmio de Solo. Orientador: Marcos Rogério Tótola. Conselheiros: Arnaldo Chaer Borges, Maurício Dutra Costa e Elson Santiago de Alvarenga.

Neste trabalho, foi avaliada a hipótese de que biossurfactantes produzidos por Bacillus sp. LBBMA

111A, Bacillus subtilis LBBMA 155, Flavobacterium sp. LBBMA 168, Dietzia maris LBBMA 191 e

Arthrobacter oxydans LBBMA 201, pertencentes à coleção de culturas do Laboratório de

Biotecnologia e Biodiversidade para o Meio Ambiente (LBBMA) do Departamento de Microbiologia

da Universidade Federal de Viçosa, Minas Gerais, são menos tóxicos a microrganismos do solo e

aquáticos, mais facilmente biodegradáveis que os surfactantes sintéticos e que, combinados ao

ligante iodeto, propiciam a mobilização simultânea do metal pesado Cádmio e do hidrocarboneto

poliaromático Fenantreno, presentes como contaminantes de solo. Os biossurfactantes produzidos

por Bacillus sp. LBBMA 111A (mistura de surfactina, fengicina e iturina), Bacillus subtilis LBBMA

155 (surfactina) e Arthrobacter oxydans LBBMA 201 (artrofactina) foram purificados e

quimicamente caracterizados com o uso de técnicas de Espectrometria de Massas, Infravermelho e

Ressonância Magnética Nuclear. Os biossurfactantes produzidos por Flavobacterium sp. LBBMA

168 e Dietzia maris LBBMA 191 foram purificados, mas não puderam ser quimicamente

caracterizados. A atividade de redução da tensão superficial foi avaliada e os valores de

concentração micelar crítica (CMC) apresentados pelos biossurfactantes LBBMA 111A, LBBMA

155, LBBMA 168, LBBMA 191 e LBBMA 201 foram de 150 mg L-1, 180 mg L-1, 200 mg L-1, 150 mg

L-1 e 200 mg L-1, respectivamente. Os biossurfactantes apresentaram alta capacidade para

formarem emulsões consideradas estáveis com petróleo, tolueno, hexano, querosene e

Resumo Geral

xii

hexadecano e mostraram-se termo-estáveis na faixa de 20-70°C, estáveis em valores de pH acima

de 5,0 e resistentes à presença de até 5% de NaCl.

Os biossurfactantes LBBMA 111A, LBBMA 155, LBBMA 168, LBBMA 191 e LBBMA 201 não

apresentam toxicidade para V. fischeri em concentração próxima de 2CMC. A CE50 (concentração

em que ocorre redução de 50% da emissão de luz por V. fischeri) do surfactante sintético SDS,

após 30 minutos de exposição, foi de 450 mg L-1, equivalente a 0,21 CMC. Além disso, a inibição

do crescimento de culturas puras de Acinetobacter baumannii LBBMA 04, Acinetobacter junni

LBBMA 36, Pseudomonas sp. LBBMA 101B e Acinetobacter baumanni LBBMA ES11 em meios de

cultura contendo diferentes concentrações (2CMC, 4CMC e 8CMC) dos surfactantes biológicos foi

menor do que a causada pelas mesmas concentrações do surfactante sintético SDS®.

A biodegradabilidade dos biossurfactantes por culturas puras e por uma cultura mista foi avaliada

por meio da evolução de CO2. Em fase líquida, a capacidade de degradação dos biossurfactantes

por Pseudomonas sp. LBBMA 101B foi cerca de 54 vezes superior à de A. baumanni LBBMA ES11

e de 60 vezes à de Acinetobacter haemolyticus LBBMA 53. Em solo, uma cultura mista composta

dos isolados A. baumannii LBBMA 04, A. junni LBBMA 36, Pseudomonas sp. LBBMA 101B e A.

baumanni LBBMA ES11 foi capaz de utilizar os biossurfactantes como substrato.

A eficiência de combinações do ligante iodeto (I-) com os surfactantes LBBMA 111A, LBBMA 155,

LBBMA 168, LBBMA 201 e Triton X-100® na remoção simultânea de cádmio (Cd2+) e fenantreno de

um latossolo vermelho-amarelo foi avaliada. A remoção de Cd2+ aumentou com o aumento da

concentração do ligante. As máximas eficiências de remoção de Cd2+ foram de 99,20% para o

biossurfactante produzido por LBBMA 201 e de 99,23% para o produzido por LBBMA 111A, na

presença de 0,336 mol L-1 de I-. Já a eficiência máxima de remoção do Cd2+ pelo surfactante

sintético Triton X-100® foi de 65,04%. As soluções de biossurfactantes removeram entre 80% e 88%

do fenantreno presente no solo, não sendo a remoção influenciada pela presença do ligante. A

solução do surfactante Triton X-100® removeu entre 73% e 88% do fenantreno. Diferentemente do

observado com os biossurfactantes, a presença do ligante I- influenciou significativamente a

eficiência de remoção do contaminante hidrofóbico.

Introdução Geral

1

INTRODUÇÃO GERAL

Surfactantes são compostos com propriedades tensoativas que possuem grupos

hidrofílicos e hidrofóbicos. Eles podem ser produzidos por síntese química (surfactantes sintéticos)

ou biológica (biossurfactantes). Em decorrência de sua natureza anfifílica, são compostos

caracterizados pela capacidade de alterar as propriedades interfaciais de um líquido. Outra

propriedade dos surfactantes é a capacidade de formarem, em meio aquoso, agregados

denominados micelas. A concentração mínima na qual se inicia o processo de formação de micelas

é chamada de concentração micelar crítica (CMC), uma propriedade intrínseca e característica do

surfactante. Essas propriedades tornam os surfactantes adequados para uma ampla gama de

aplicações industriais, envolvendo: detergência, emulsificação, lubrificação, capacidade

espumante, capacidade molhante, solubilização e dispersão de fases (WOODS, 2004).

Os surfactantes têm um papel fundamental em processos como emulsificação. O tipo de

emulsão formada - água/óleo ou óleo/água - depende não só da razão entre os volumes da fase

dispersa e contínua, mas também da proporção entre a parte hidrofílica e lipofílica do surfactante.

Esta proporção pode ser descrita pelo valor do balanço hidrofílico-lipofílico (HLB), introduzido por

Griffin em 1949 (ADAMSON & GAST, 1997). Surfactantes com altos valores HLB são solúveis em

meio aquoso, e os que apresentam baixo HLB são solúveis em solvente orgânico (SABATINI et al.,

1995).

A maioria dos surfactantes comercialmente disponíveis é sintetizada a partir de derivados

de petróleo e são tóxicos para diferentes organismos, além de não serem prontamente

biodegradáveis. Entretanto, a amplitude de aplicações desses compostos resultou no aumento da

Introdução Geral

2

demanda por surfactantes e maior interesse em se desenvolverem novas formas de obtenção dos

mesmos. Assim, surfactantes naturais, principalmente os biossurfactantes, estão sendo

amplamente explorados também como forma de acompanhar a tendência de substituição dos

produtos sintéticos por biológicos em aplicações industriais e ambientais (SINGH et al., 2006). Os

biossurfactantes são produzidos por uma ampla variedade de microrganismos e são genericamente

classificados como sendo de baixo ou alto peso molecular (revisado por DESAI & BANAT, 1997;

CAMEOTRA & MAKKAR, 1998). Os biossurfactantes de baixo peso molecular são geralmente

glicolipídeos ou lipopeptídeos e os de alto peso molecular são polissacarídeos, proteínas,

lipopolissacarídeos e lipoproteínas (CHRISTOFI & IVSHINA, 2002).

Os biossurfactantes apresentam vantagens sobre os surfactantes sintéticos, como baixa

toxicidade, biodegradabilidade, a possibilidade de produção a partir de substratos renováveis e

efetividade em uma ampla faixa de temperatura, pH e salinidade (NITSCHKE & PASTORE, 2002).

Esses compostos ainda não são utilizados pela indústria de forma mais ampla em razão do alto

custo de produção (MUKHERJEE et al., 2006). O desenvolvimento de processos de produção mais

eficientes e baseados no uso de substratos de fontes renováveis e de baixo custo pode resultar

numa redução de 10-30 % do custo total (MUKHERJEE et al., 2006). Uma possível alternativa para

a produção de biossurfactantes em escala comercial é o uso de subprodutos agrícolas ou de

processamento industrial. Atualmente, o aproveitamento de resíduos vem sendo incentivado por

contribuir para a redução da poluição ambiental, bem como por permitir a valorização dos resíduos

que seriam descartados. Os processos de produção requerem ainda um método eficiente de

recuperação do composto produzido. Diferentes métodos têm sido usados nos processos de

extração, como a ultracentrifugação (MUKHERJEE et al., 2006), ultra-filtração (SEN &

SWAMINATHAN, 2005), precipitação com ácido ou sal (SEN & SWAMINATHAN, 2004), extração

por solvente e adsorção por cromatografia (DUBEY, 2005).

Além da aplicação industrial, os surfactantes são de grande importância em aplicações

ambientais, especialmente na biorremediação de ambientes contaminados com poluentes

orgânicos persistentes (POPs) e com metais pesados. Metais pesados e POPs exibem

características químicas divergentes, o que dificulta o uso de um único reagente para

Introdução Geral

3

dessorver/mobilizar, simultaneamente, os dois grupos de contaminantes (SHIN et al., 2005). O uso

de surfactantes em combinação com um ligante inorgânico, a exemplo do íon iodeto (I-) ou do

tiocianato (SCN-), pode favorecer a dessorção simultânea de metais pesados e POPs. Isto ocorre

porque o íon ligante forma um complexo com o íon metálico na solução de surfactante, reduzindo

seu caráter hidrofílico e permitindo que ele seja adsorvido dentro da micela do surfactante (SHIN et

al., 2000). Em estudo anterior, o surfactante não-iônico Triton X-100, em combinação com um

ligante inorgânico, iodeto (I-) ou tiocianato (SCN-), foi capaz de dessorver cádmio, cobre e zinco de

um solo que fora contaminado com metais pesados e bifenilas policloradas (PCB’s) (SHIN et al.,

2000).

Neste trabalho, foi avaliada a hipótese de que biossurfactantes produzidos por Bacillus sp.

LBBMA 111A, Bacillus subtilis LBBMA 155, Flavobacterium sp. LBBMA 168, Dietzia maris LBBMA

191 e Arthrobacter oxydans LBBMA 201 são menos tóxicos a microrganismos do solo e aquáticos,

mais facilmente biodegradáveis que os surfactantes sintéticos e que, combinados ao ligante iodeto,

propiciam a mobilização simultânea do metal pesado Cádmio e do hidrocarboneto poliaromático

Fenantreno, presentes como contaminantes de solo.

Introdução Geral

4

CAPÍTULO 1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1.1. SURFACTANTES: TIPOS, ESTRUTURAS E PROPRIEDADES

Surfactantes são moléculas com propriedades tensoativas que possuem grupos hidrofílicos

e hidrofóbicos, os quais determinam propriedades como adsorção, formação de micelas, formação

de macro e micro-emulsões, lubrificação, ação espumante ou antiespumante, capacidade

molhante, solubilização e detergência. Essas moléculas podem ser produzidas por síntese química

(surfactantes sintéticos) ou biológica (biossurfactantes). Os surfactantes são categorizados em

catiônicos, aniônicos, não-iônicos e zwiteriônicos, de acordo com a carga exibida pelo grupo

hidrofílico da molécula, já que o grupo hidrofóbico pouco varia (CRISTOFI & IVSHINA, 2002).

O grupo hidrofóbico de um surfactante é uma longa cadeia hidrocarbônica alifática com 10

a 20 átomos de carbono. Nos aniônicos, a parte hidrofílica é constituída por grupo carboxilato,

hidróxi, sulfato ou fosfato, enquanto que os catiônicos são constituídos por sais de amônio.

Surfactantes não-iônicos não contêm grupos com carga e, nos denominados anfotéricos, a parte

hidrofílica é constituída por grupos que contêm uma carga negativa e uma positiva, o que lhes

confere propriedades zwiteriônicas ou anfotéricas, dependendo do pH (WOODS, 2004).

Substâncias tensoativas são moléculas que, em baixas concentrações, têm a capacidade

de serem adsorvidas na interface de dispersões líquidas, reduzindo a tensão entre as fases que as

compõem. A adsorção na interface dos líquidos é conseqüência da estrutura molecular dos

surfactantes, ou seja: a parte polar ou iônica interage fortemente com a fase aquosa por meio de

forças do tipo dipolo-dipolo e a outra, a parte alifática apolar, interage com a fase orgânica. Esta

dupla solubilidade faz com que a região de maior estabilidade para a molécula tensoativa seja na

Capítulo 1. Revisão Bibliográfica

5

interface entre os dois líquidos. Assim, as moléculas tendem a se arranjar de modo a minimizar a

repulsão entre os grupos hidrofóbicos e a água: os grupos polares ficam na solução aquosa,

próximos à superfície, e os grupos apolares na interface água-óleo, minimizando o contato com a

água. Esse fato gera uma diminuição na tensão superficial da água, pois provoca um desarranjo de

sua superfície (WOODS, 2004).

1.1.1. Tensão Superficial e Concentração Micelar Crítica (CMC)

Os líquidos tendem a assumir a forma em que a área de sua superfície seja a maior

possível, para manter as moléculas com um elevado número de vizinhos semelhantes, a exemplo

da forma esférica, em que a razão superfície/volume é maximizada. As forças coesivas entre as

moléculas no interior de um líquido são compartilhadas com os átomos vizinhos. Aquelas da

superfície não têm átomos vizinhos acima delas e exibem uma força atrativa mais forte sobre suas

vizinhas mais próximas na superfície. Este aumento das forças atrativas intermoleculares na

superfície é chamado tensão superficial (MINATTI, 2005). Tanto os surfactantes sintéticos como os

biossurfactantes são capazes de reduzir a tensão superficial da água (72 mN m-1) para valores na

faixa entre 40 e 26 mN m-1 (Tabela 1.1) (MULLIGAN, 2005).

A molécula de um surfactante possui uma parte lipofílica, a cauda, e uma parte hidrofílica, a

cabeça, o que lhe confere a propriedade de interagir com as fases aquosa e orgânica em uma

mistura. Essa dupla solubilidade faz com que a região de maior estabilidade para essa molécula

seja a interface entre os dois líquidos. Quando um surfactante é adicionado à água, as suas

moléculas tendem a se arranjar de modo a minimizar a repulsão entre os grupos hidrofóbicos e a

água: os grupos polares ficam na solução aquosa, próximo à superfície, e os grupos apolares ficam

na interface água-ar, minimizando o contato com a água. Esse fato gera uma diminuição na tensão

superficial da água ao provocar um desarranjo em sua superfície, o mesmo ocorrendo para

surfactantes solúveis em óleo (FILIPE, 1996).

A tensão superficial da água é de 72 mN m-1 a 25°C, e a adição de um surfactante pode

reduzi-la para valores abaixo de 40 mN m-1. Quando um surfactante é adicionado à água em

concentrações crescentes, observa-se uma redução na tensão superficial até um valor crítico, a


6

partir do qual as moléculas de surfactantes se associam e formam estruturas supramoleculares,

como micelas, bicamadas e vesículas (PIRÔLLO, 2006).

Tabela 1.1. Comparação da tensão superficial e Concentração Micelar Critica (CMC) de biossurfactantes e surfactantes sintéticos.

Natureza do surfactante

Surfactante Tensão superficial (mN m-1)

CMC (mg L-1)

Biológico Rhodococcus rubber - glicolipídeo 26,8 54 Biológico Rhodococcus erythropolis - trealose tetraester 26,0 15 Biológico Pseudomonas aeruginosa - ramnolipídeo 29,0 50-200 Biológico Candida bombicola - soforolipídeo 33,0 82 Biológico Bacillus subtilis - surfactina 27,0 23

Sintético 1Dodecil Sulfato de Sódio (SDS®) 37,0 2120 Sintético Brometo de Cetiltrimetilamônio 30,0 1300 Sintético Triton X-100 35,0 268

Adaptada de IVSHINA et al. (1998) 1Fonte de Referência: BRAMWELL & LAHA, 2000.

Processo de Micelização

Uma das características comuns a todos os surfactantes é a capacidade de formarem

pequenos agregados em solução aquosa ou oleosa, a partir de uma determinada concentração.

Esses agregados são denominados micelas e a concentração em que se inicia o processo de

formação dessas micelas, a micelização, é denominada de concentração micelar crítica (CMC),

uma propriedade intrínseca e característica do surfactante (SAICHEK & REDDY, 2005). Numa

micela em meio polar, como a água, a parte lipofílica da molécula orienta-se para o interior e a

hidrofílica para o exterior da micela. As micelas mais simples são esferas, mas à medida que a

concentração do surfactante aumenta, elas crescem formando estruturas cilíndricas (Figuras 1.1 e

1.2) (SAICHEK & REDDY, 2005). Um aumento adicional da concentração leva as estruturas

cilíndricas a se empacotarem em estruturas geralmente hexagonais ou em camadas (Figura 1.1) e,


7

à medida que essas estruturas crescem, por aumento de concentração, mais ordenadas elas se

tornam e as maiores podem adquirir propriedades de cristais líquidos (ROSEN, 2004).

O tipo de associação coloidal formada por um surfactante depende da estrutura do

tensoativo (tamanho da cadeia hidrocarbônica) e das condições experimentais (força iônica, pH,

contra-íons, temperatura, etc) (MANIASSO, 2001). As micelas são termodinamicamente estáveis e

facilmente reproduzíveis, mas são destruídas pela diluição com água quando a concentração do

tensoativo estiver abaixo da CMC (MANIASSO, 2001).

Figura 1.1. Tipos de estruturas de associação de surfactantes em solução (Adaptada de ROSEN, 2004).

A principal razão que leva os monômeros de surfactantes a se associarem na forma de

micelas é a diminuição da área de contato entre as cadeias hidrocarbônicas apolares do

surfactante e a água, ou entre as frações polares e a fase oleosa (WOODS, 2004). Porém, a

formação dos agregados em solução aquosa leva o surfactante a uma situação de maior

proximidade dos grupos hidrofílicos polares, e a geração de uma repulsão eletrostática que se opõe

ao processo de micelização. Nessa circunstância, os contra-íons desempenham um papel

fundamental: quando em concentração suficiente, proveniente da própria ionização do surfactante

ou mesmo como aditivos à solução, eles blindam a carga do agregado e diminuem o potencial

Estrutura empacotada em camadas

Estrutura empacotada hexagonalmente

Esfera

Estrutura cilíndrica


8

elétrico e a repulsão entre os grupos hidrofílicos dos monômeros. O mesmo efeito se observa na

formação de emulsões inversas, onde as cabeças polares do surfactante estão mais próximas no

interior das gotículas da fase oleosa dispersa.

As micelas, ao contrário dos monômeros, ficam dispersas em toda a solução e não

apresentam efeito sobre a tensão superficial da água. Esse comportamento da interface água/ar

em função da concentração de surfactante utilizada encontra-se ilustrado na Figura 1.2.

Figura 1.2. Diagrama esquemático da variação da tensão superficial e solubilidade em função da

concentração de surfactante (CMC representa a concentração micelar crítica).

Adaptada de MULLIGAN (2005).

Em solução aquosa, o surfactante iônico se dissocia, dando origem a duas espécies

hidratadas: um cátion e um ânion, ou seja, o monômero do surfactante e o seu respectivo contra-

íon. O Dodecil Sulfato de Sódio (SDS®), por exemplo, é um surfactante aniônico em que o contra-

íon é o cátion Na+.

O Modelo de Stigter

Diversos são os modelos que tentam ilustrar a forma e o comportamento de uma micela,

destacando-se o de Stigter entre os mais aceitos (Figura 1.3) (ROSEN, 2004). Segundo esse

Concentração do surfactante

CMC

Solubilidade

Grandeza Física

Tensão superficial


9

modelo, os monômeros se organizam em forma esférica em solução aquosa e todas as porções

hidrofóbicas do surfactante estariam voltadas para o centro, formando o núcleo, e os grupamentos

hidrofílicos estariam orientados para a superfície da esfera, formando a interface com a água

(ROSEN, 2004).

O diâmetro do núcleo micelar varia com o tamanho da cauda do surfactante, sendo de

cerca de 3 nm para o SDS®. A camada de Stern é formada pelos grupos iônicos do surfactante e

seus respectivos contra-íons não-dissociados (ROSEN, 2004). A camada de Stern compreende a

parte da dupla camada elétrica que circunda a superfície externa da esfera micelar; a outra

camada, mais difusa e que contém os ânions remanescentes, é a denominada camada de Gouy-

Chapmman (GOODWIN, 2004). Nessa camada, a micela exerce uma atração eletrostática sobre

os contra-íons em solução e criam um gradiente de concentração de contra-íons à sua volta (Figura

1.3) (GOODWIN, 2004).

Figura 1.3. Modelo de Stigter para a formação de micela iônica normal com estrutura esférica

(Adaptada de MANIASSO, 2001).

Interface Micelar

Fase aquosa Contra-íon

Stern Gouy-Chapmman Núcleo Micelar


10

1.1.2. Emulsões e Surfactantes

Uma emulsão líquido/líquido pode ser conceituada como resultado da dispersão de um

determinado líquido em um meio contínuo constituído de outro líquido, quando a solubilidade entre

os dois é baixa (ROSEN, 2004). Geralmente a emulsão envolve uma fase aquosa, constituída por

água ou uma solução aquosa, e uma fase insolúvel em água, geralmente hidrocarbonetos e

aditivos. De acordo com o caráter hidrofílico ou lipofílico da fase dispersante, este sistema pode ser

classificado como água-em-óleo (A/O), que é quando a água está dispersa na fase oleosa da

emulsão, ou como óleo-em-água (O/A), quando o óleo encontra-se disperso sob a forma de

pequenas gotículas na fase aquosa (AZZINI et al., 1999). Os dois tipos de emulsão encontram-se

ilustrados na Figura 1.4.

Na descrição das características da emulsão é importante indicar a fração, ou a razão,

entre o volume da fase dispersa e o da fase contínua. Geralmente, o líquido em maior proporção na

mistura forma a fase contínua na qual estão dispersas as microfases do outro líquido que forma a

fase dispersa (ROSEN, 2004).

Figura 1.4. Duas Formas de Emulsão: (A) Óleo-em-água e (B) Água-em-óleo. Adaptada de

ROSEN (2004).

Quando dois líquidos insolúveis e com diferentes densidades são colocados em contato, na

ausência de agitação, observa-se a formação de duas camadas bem distintas e que representam a

água

Água

óleo

Controle do tipo de emulsão: Estrutura do emulsificante, pH,

salinidade, temperatura, etc. A B

água


11

forma mais estável desse sistema, ou seja, a com menor área interfacial. Durante a formação da

emulsão ocorre um expressivo aumento na área interfacial entre os líquidos, com conseqüente

consumo de energia. Sendo assim, muitos dos métodos de formação de emulsões requerem a

agitação para fornecer energia suficiente para sobrepor à tensão superficial e formar as microfases.

Uma vez cessada a agitação, as micro-gotículas tendem a se aproximar em razão das forças de

atração, principalmente as do tipo Van Der Walls (ROSEN, 2004).

O aumento na energia interfacial durante a emulsificação é diretamente proporcional ao

aumento na área interfacial e pode ser amenizado pelo uso de um surfactante. Esse composto

facilita a formação e a manutenção da emulsão, isto é, impede a coalescência das fases. Mesmo

em baixas concentrações, os surfactantes podem se posicionar na interface de dispersões líquidas

e contribuir para a redução da tensão superficial. O posicionamento na interface dos líquidos é

conseqüência da estrutura molecular dos surfactantes: a parte polar ou iônica interage fortemente

com a fase aquosa por meio de forças do tipo dipolo-dipolo ou íon-dipolo e a parte alifática apolar

interage com a fase orgânica (CREVECOEUR, 1997; ADAMSON & GAST, 1997).

1.1.3. Balanço Hidrofílico/Lipofílico (HLB)

O tipo de emulsão formada, A/O ou O/A, depende não só da razão entre os volumes das

fases, dispersa e contínua, mas também da composição das partes hidrofílica e lipofílica do

surfactante. Esta composição determina o valor de HLB do surfactante, valor introduzido por

GRIFFIN em 1949 para representar o balanço do tamanho e força das regiões hidrofílicas e

lipofílicas de um composto anfifílico, em uma escala numérica (ADAMSON & GAST, 1997;

CREVECOEUR, 1997). Os valores de HLB aumentam à medida que a substância se torna mais

hidrofílica (SILVA & SOARES, 1996).

O valor HLB de um surfactante aumenta de forma proporcional aos acréscimos na

polaridade da molécula, ou seja, ao aumento da solubilidade do surfactante em meio aquoso

(CREVECOEUR, 1997). Os valores de HLB esperados para emulsões A/O e suas respectivas

aplicações situam-se entre 4 e 6 (Tabela 1.2) (ADAMSON & GAST, 1997). O intervalo de valores


12

de HLB para cada aplicação pode variar de acordo com as características e afinidades entre as

fases e o surfactante (RENKEN & HUNKELER, 1999).

Tabela 1.2. Valores de HLB de surfactantes e suas respectivas aplicações

Comportamento da Solubilidade do Surfactante em Água

Número HLB Aplicação

0

2

Pouca dispersibilidade

Dispersão leitosa; instável

4

6

8

Dispersão leitosa; estável

Solução translúcida a transparente

10

12

Solução transparente

14

16

18

Adaptado de NEVES (2002).

A determinação do valor HLB pode ser feita por método empírico, atribuindo-se valores de

hidrofilicidade ou lipofilicidade para os principais grupos constituintes das moléculas de surfactantes

(ADAMSON & GAST, 1997). O HLB da molécula pode ser calculado adicionando-se 7 à soma

algébrica dos valores atribuídos aos grupos constituintes. Misturas de surfactantes podem ter o

HLB calculado da mesma forma, porém cada constituinte deve ter o seu HLB calculado pelo

método descrito e o valor final do HLB da mistura corresponderá à média ponderada pela massa

dos HLB’s de cada surfactante presente (ADAMSON & GAST, 1997).

A maior limitação do conceito de HLB é a de não considerar o fato de que as propriedades

funcionais da molécula de surfactante são alteradas significativamente pelas mudanças de

temperatura ou pelas condições da solução (DAVIS, 1994). Como exemplo, um surfactante pode

Solubilizante

Agente de molhamento

Emulsificante A/O

Emulsificante O/A

Sem dispersibilidade


13

ser capaz de estabilizar uma emulsão de óleo em água a uma dada temperatura e, em outra,

estabilizar uma emulsão de água em óleo, mesmo que tenha a mesma estrutura química.

1.1.4. Estabilidade de Uma Emulsão

A estabilidade de uma emulsão pode ser afetada por fatores diversos. Porém, todos

aqueles que causam instabilidade conduzem aos mesmos fenômenos: quebra da emulsão ou

inversão de fases.

A quebra da emulsão é geralmente quantificada pela taxa com que ocorre o processo de

coalescência, resultando no aumento do diâmetro médio e diminuição do número de microfases

presentes. Além disso, em casos extremos pode haver coalescência completa entre as gotículas,

forçando a separação de fases em duas camadas distintas de líquido.

Já o fenômeno de inversão consiste na troca entre as fases, ou seja, a fase dispersa torna-

se contínua e a fase contínua torna-se dispersa. Esse efeito é uma instabilidade observada apenas

em emulsões concentradas, onde o volume da fase dispersa encontra-se próximo ou superior ao

volume da fase contínua (ADAMSON & GAST, 1997). Essa inversão de fases pode ser provocada

pela perda de água e conseqüente variação da relação entre as fases, dispersa e contínua (SILVA

& SOARES, 1996).

1.2. BIOSSURFACTANTES: CLASSIFICAÇÃO E ORIGEM MICROBIANA

Alguns tensoativos são conhecidos como biossurfactantes, uma classe de surfactantes

produzidos por uma grande variedade de microrganismos (Tabela 1.3). Os biossurfactantes são

classificados como de baixo ou alto peso molecular (DESAI & BANAT, 1997; CAMEOTRA &

MAKKAR, 1998). Os biossurfactantes de baixo peso molecular são geralmente glicolipídeos ou

lipopeptídeos, são os mais efetivos na redução da tensão superficial (LIN, 1996). Os


14

biossurfactantes de alto peso molecular, como polissacarídeos, proteínas, lipopolissacarídeos e

lipoproteínas, são mais efetivos em estabilizar emulsões O/A (CHRISTOFI & IVSHINA, 2002).

Tabela 1.3. Classes de biossurfactantes e microrganismos produtores

Classe Biossurfactante Microrganismo Referência

Baixo Glicolipídeos: Peso Ramnolipídeos Pseudomonas aeruginosa BENINCASA et al. (2004) Molecular Soforolipídeos Candida bombicola,

Candida apicola HOMMEL et al. (1994)

Trealolipídeos Rhodococcus erythropolis UCHIDA et al. (1989) Flavolipídeos: Flavobacterium sp MTN11 BODOUR et al. (2004)

Lipopeptídeos e lipoproteínas:

Peptídeo-lipídeo Bacillus licheniformis YAKIMOV et al. (1998) Viscosina Pseudomonas fluorescens NEU et al. (1990) Surfactina Bacillus subtilis, Bacillus

pumilus CARILLO et al. (2003)

Gramicidina S Bacillus brevis AZUMA & DEMAIN (1996) Polimixina Bacillus polymyxa FALAGAS et al. (2005)

Ácidos graxos, lipídeos neutros e fosfolipídeos:

Ácidos graxos Corynebacterium lepus, Arthrobacter parafineus

MAKKAR & CAMEOTRA (2002)

Lipídeos neutros Nocardia erythropolis MAKKAR & CAMEOTRA (2002)

Fosfolipídeos Thiobacillus thiooxidans LEMKE et al. (1995)

Alto Surfactantes poliméricos:

Peso Emulsan Acinetobacter calcoaceticus ROSENBERG et al. (1993) molecular Biodispersan Acinetobacter calcoaceticus ROSENBERG et al. (1988) Liposan Candida lipolytica CIRIGLIANO & CARMAN

(1984) Manoproteína Saccharomyces cerevisiae CAMERON et al. (1988) Alasan Acinetobacter

radioresistens NAVON-VENEZIA et al. (1995)

Surfatantes particulados: Vesículas Acinetobacter calcoaceticus DESAI & BANAT (1997)

A massa molecular de biossurfactantes geralmente encontra-se entre 500-1500 Daltons e

os valores de CMC entre 1-200 mg L-1. Novas moléculas de biossurfactantes estão sendo


15

descritas, como a da classe denominada de flavolipídeos produzidos por Flavobacterium sp.

MIN11. (BODOUR et al. 2004), cujas massas variam entre 584 e 646 Daltons. Os flavolipídeos

apresentam uma CMC de 300 mg L-1 e podem promover a redução da tensão superficial para 26

mN m-1, formar emulsões estáveis, melhorar a mineralização do hexadecano e formar complexo

com Cd2+.

1.2.1. Glicolipídeos

Biossurfactantes da classe dos glicolipídeos têm na sua constituição moléculas de

carboidratos (glicose, manose, galactose, ou ramnose) em combinação com ácidos alifáticos de

cadeias longas (HOLMBERG, 2001). Entre os glicolipídeos, os mais conhecidos são os

ramnolipídeos, os trealolipídeos e os soforolipídeos.

Ramnolipídeos

Os ramnolipídeos, surfactantes pertencentes à classe dos glicolipídeos produzidos por

diversas estirpes de Pseudomonas aeruginosa, são os mais bem estudados. Eles possuem em sua

estrutura uma ou duas moléculas de ramnose ligadas a uma ou duas moléculas de ácido β-

hidroxidecanóico, sendo que sete homólogos já foram estruturalmente identificados (ABALOS et

al., 2001) (Figura 1.5). Pseudomonas aeruginosa pode produzir ramnolipídeos a partir de diversos

substratos, incluindo alcanos, succinato, piruvato, citrato, frutose, glicerol, óleo de oliva, glicose e

manitol (HOLMBERG, 2001).

Figura 1.5. Estrutura de ramnolipídeo de Pseudomona aeruginosa.

H

HO

CH3

O

O O

C

O

H O

H

CH3

(CH2)6

CH3

(CH2)6

O

CH3

O O

O

CH CH2 C

O

O CH CH2 COOH

CH CH (CH2)6 CH3


16

Trealolipídeos

Nos biossurfactantes trealolipídeos produzidos por espécies de Mycobacterium, Nocardia e

de Corynebacterium a molécula do dissacarídeo trealose encontra-se ligada aos carbonos 6 e 6’ de

ácidos micólicos (GAUTAM & TAYAGI, 2006). Trealolipídeos de diferentes organismos diferem no

tamanho e estrutura do ácido micólico, no número de átomos de carbono e no grau de insaturação

(ASSELINEAU & ASSELINEAU, 1978). Trealolipídeos de Rhodococcus erythropolis (Figura 1.6) e

Arthrobacter sp. reduzem a tensão superficial do meio aquoso de 72 para valores abaixo de 40 mN

m-1 (KRETSCHMER et al., 1982).

Figura 1.6. Estrutura do trealolipídeo produzido por Rhodococcus erythropolis.

Soforolipídeos

Estruturalmente, os soforolipídeos consistem de um carboidrato dimérico (soforose) ligado

glicosidicamente ao grupo hidroxil do penúltimo carbono do ácido graxo de cadeia longa (C16-C18)

(Figura 1.7). Eles são produzidos por leveduras, como Candida bombicola, Candida magnoliae

Candida petrophilum, Candida bogoriensis e Candida apicola (GORIN et al., 1961; TULLOCH et al.,

1968; COOPER & PADDOCK, 1984; GOBBERT et al., 1984; HOMMEL et al., 1987; HOMME &

HUSE, 1993). C. bombicola pode produzir soforolipídeo (Figura 1.7) utilizando carboidratos

(KLEKNER et al., 1991), óleos vegetais (ZHOU et al., 1992), ácido oléico (RAU et al., 1996) e

O

CH2O CO CH CHOH (CH2)m

OH

O O OOH

OH

OH

(CH2)n

CH3

CH3

H

CHCC

O (CH2)n

CH3

H(CH2)

CH3

m n = 27 a 31+

Hm O OCH2


17

alcanos (DAVILA et al, 1994) como substratos. Dependendo das condições de cultivo e da fonte de

carbono, até doze diferentes soforolipídeos podem ser produzidos (ASMER et al., 1988).

Soforolipídeos têm suas propriedades tensoativas mantidas em condições extremas de pH, NaCl e

temperatura (COOPER & PADDOCK, 1984). Além das propriedades tensoativas, os soforolipídeos

apresentam um grande potencial como agentes terapêuticos e podem funcionar como

antibacterianos (SHAH et al., 2007), anticancerígenos (SCHOLZ et al., 1998; CHEN et al., 2006),

antivirais (SHAH et al., 2005), e antifungícos (SHAH et al., 2007).

Figura 1.7. Estrutura molecular de soforolipídeo de Candida (Torulopsis) bombicola.

1.2.2. Lipopeptídeos e Lipoproteínas

Os surfactantes lipoprotéicos são talvez os mais conhecidos por suas atividades

antibióticas, sendo mais bem caracterizados os produzidos por Bacillus spp., incluindo surfactina,

iturina, fengicina, liquenisina (VATER et al., 2002), micosubtilisina (PEYPOUX et al., 1976) e

bacilomicina (PEYPOUX et al., 1984) que são surfactantes e antibióticos com potencial atividade

antimicrobiana. Esse tipo de composto se caracteriza pela existência de peptídeos ligados a ácidos

graxos, sendo que a porção protéica da molécula pode ser neutra ou aniônica e os aminoácidos

estão freqüentemente dispostos em uma estrutura cíclica (VATER et al., 2002). Os compostos

surfactina e iturina são ciclolipoheptapeptídeos que contêm um ácido graxo β-hidroxi e um ácido

graxo β-amino respectivamente, como componentes lipofílicos (Figura 1.8). Fengicina é um

lipodecapeptídeo com um ácido graxo β-hidroxi ligado à sua cadeia lateral (Figura 1.8).

O

CH2OR

OH

O

O

OO

O

CO

OHH

(CH2)15

COOH

CH3

HROH2

H

C


18

Já foram relatadas na literatura 20 linhagens diferentes de Bacillus subtilis produtoras de

surfactina. Ela reduz a tensão superficial de 72 para 27,9 mN m-1 numa concentração de 0,005 %

(ARIMA et al., 1968). Bacillus licheniformis produz biossurfactantes similares à surfactina e que

atuam sinergicamente, exibindo excelente estabilidade em condições extremas de temperatura, pH

e salinidade (MCINERNEY et al., 1990). O surfactante produzido por B. licheniformis é capaz de

reduzir a tensão superficial entre água/ar para 27,0 mN m-1.

Figura 1.8. Lipopeptídeos produzidos por linhagens de Bacillus subtilis: (A) Surfactina (B) Iturina A

e (C) Fengicina. Adaptada de VATER et al. (2002).

L Gln

L

L

Asn D

Pro D

Tyr L Asn C O

CH2

H CH2 n CH3

B

NH

C CH2 5 CH

CH3Asn L Ser

L

Asp D

Leu L

Leu L

Leu L

Leu O

Glu C

CH2

O

CH2 n CH3 AVal

L

D

CH2 5 CH

CH3

CH

CAla L

Pro LL

D Glu D

Gln L

aThr

Tyr L

D

Ile O

Tyr D Orn L Glu C

O

CH2

CO C11HH -13


19

1.2.3. Ácidos Graxos, Fosfolipídeos e Lipídeos Neutros

Bactérias e leveduras produzem grandes quantidades de ácidos graxos e fosfolipídeos

surfactantes quando utilizam alcanos como fonte de carbono e de energia (CIRIGLIANO &

GARMAN, 1985). O HLB desses biossurfactantes é diretamente relacionado ao comprimento da

cadeia hidrocarbônica em suas estruturas. Acinetobacter sp. produz vesículas de cadeias duplas

com áreas de cabeça polar pequenas, denominadas fosfatidiletanolamina (KAPPELI & FINNERTY,

1979) (Figura 1.9), as quais são capazes de promover a formação de microemulsões de alcanos

em água (DESAI & BANAT, 1997). Fosfatidiletanolamina, produzida por Rhodococcus erythropolis

durante o crescimento em meio de cultura contendo alcano como fonte de carbono e energia, leva

a uma redução da tensão superficial entre água e hexadecano para valores abaixo de 1 mN m-1 e

apresenta uma CMC de 30 mg L-1 (KRETSCHMER et al., 1982).

Figura 1.9. Estrutura de Fosfatidiletanolamina de Acinetobacter sp.. R1 e R2 são cadeias de

hidrocarbonetos.

Os lipídeos neutros compreendem os ácidos graxos, triacilgliceróis e ácidos micólicos. A

maioria dos lipídeos neutros, como os triacilgliceróis e seus ácidos graxos constituintes, mostram

algum grau de atividade tensoativa (COOPER & ZAJIC, 1980). Assim como os ácidos micólicos,

eles consitituem ácidos graxos mais complexos. Estes compostos, por sua vez, são sintetizados

por espécies de Mycobacterium spp. e por alguns espécies dos gêneros de Nocardia,

Corynebacterium e Rhodococcus; possuem misturas de ácidos graxos α e β-hidroxilados ligados a

longas cadeias hidrocarbônicas. A Figura 1.10 mostra um exemplo de ácido corinomicólico.

R2 C

O

O CH

C

C

O

O

C

P

O

O

CH2CH2NH3

R1

O

H2

H2


20

Figura 1.10. Ácido corinomicólico de Corynebacterium sp. R1 e R2 são grupamentos alquílicos.

1.2.4. Biossurfactantes Poliméricos

Biossurfactantes poliméricos ou lipopolissacarídeos são ácidos graxos ligados

covalentemente a polissacarídeos. Os biossurfactantes poliméricos mais bem estudados são o

Emulsan, o Liposan, a Manoproteína e outros complexos de proteínas-polissacarídeos. Emulsan é

um bioemulsificante extracelular produzido por A. calcoaceticus RAG-1 e foi o primeiro surfactante

microbiano a ser produzido e comercializado em larga escala e é um dos mais efetivos

emulsificantes (ROSENBERG & RON, 1999) (Figura 1.11). É caracterizado como um

heteropolissacarídeo polianiônico (FERRAREZZO, 1998).

Figura 1.11. Estrutura de Emulsan de Acinetobacter calcoaceticus.

O

CH2

OH NH

C

CH3

O

O

C O

CHOH

CH2)9

CH3

O

OOC

NH

C O

O O

OH NH

OCH2

O

C

CH2

CHOH

CH2)8

CH3

O

(

H

(CH2)12

CH3

C O

CH3

(

OO

n

O

R2 OH

OOH

R1


21

Liposan é um emulsificante extracelular sintetizado por C. lipolytica, sendo composto de

83% de carboidrato e 17% de proteínas (CIRIGLIANO & GARMAN, 1985). Manoproteína é uma

proteína produzida por S. cerevisiae, possuindo excelente atividade emulsificante com vários óleos,

alcanos e solventes orgânicos (CAMERON et al., 1988). É produzida através de um processo

biotecnológico simples, de larga escala e baixo custo (BARROS et al., 2007).

1.2.5. Biossurfactantes Particulados

As células microbianas e vesículas extracelulares com atividades tensoativas são

classificadas como biossurfactantes particulados. Algumas células microbianas apresentam

elevada hidrofobicidade superficial, sendo consideradas por si só como biossurfactantes, a

exemplo de algumas espécies de cianobactérias e patógenos, como S. aureus e Serratia sp.

Bactérias do gênero Acinetobacter sp., quando crescem em meio contendo hexadecano, produzem

vesículas extracelulares que têm função importante na captação de alcanos para a célula,

possuindo elevada atividade surfactante (GAUTAM & TAYAGI, 1979).

Um grande número de microrganismos tem se mostrado capaz de produzir compostos com

atividade superficial variada, cujas funções ainda não foram totalmente elucidadas. A Tabela 1.3

mostra as principais classes de biossurfactantes e os organismos envolvidos na sua produção.

1.3. PRODUÇÃO DE BIOSSURFACTANTES

Vários seres vivos produzem biossurfactantes, incluindo os animais, as plantas e os

microrganismos. Em decorrência do curto tempo de geração dos microrganismos,

comparativamente ao crescimento de animais e de plantas, a produção de biossurfactantes por

estes seres é considerada como a forma mais promissora de se produzir esses compostos (LANG,

2002).

Microrganismos produtores de biossurfactantes têm sido isolados de vários ambientes,

como solo, água do mar, sedimentos marinhos, entre outros. A presença de microrganismos

produtores de biossurfactantes é usual em solos, como demonstrado pela constatação de que pelo

menos um microrganismo produtor foi encontrado em 20 dos 21 tipos de solo estudados, entre os


22

quais encontravam-se solos não-contaminados, solos contaminados com hidrocarbonetos, solos

contaminados com metais ou contaminados com metais e hidrocarbonetos (BODOUR et al., 2003).

É grande a variedade de microrganismos com capacidade de síntese de biossurfactantes,

sendo que o tipo, a quantidade e a qualidade dos biossurfactantes produzidos por um

microrganismo são influenciados pela natureza do substrato e pela concentração de nutrientes

como fósforo (P), nitrogênio (N), magnésio (Mg) e ferro (Fe) no meio de cultivo (GEORGIOU et al.,

1992). As condições de crescimento como pH, temperatura, agitação e disponibilidade de oxigênio

também afetam a produção de biossurfactantes, dado o seu efeito sobre o crescimento e atividade

celulares (DESAI & BANAT, 1997).

A fonte de carbono é fator de importância no processo de produção de biossurfactantes. Os

microrganismos utilizam uma grande variedade dessas fontes, a exemplo de hidrocarbonetos

(BANAT, 1995), óleos vegetais e resíduos agro-industriais (NITSCHKE & PASTORE, 2003).

Segundo a fonte de carbono utilizada, os produtores de compostos tensoativos podem produzir

surfactantes tanto com hidrocarbonetos quanto com substratos hidrossolúveis, como Pseudomonas

spp. (HAFERBURG et al.,1986). A modificação do substrato de crescimento freqüentemente altera

a estrutura do biossurfactante produzido e, conseqüentemente, suas propriedades (REISER et al.,

1989). Na produção de surfactina por B. subtilis a transferência de oxigênio é também parâmetro

chave para a otimização e ampliação de escala de produção do composto (SHEPPARD &

COOPER, 1990).

Os biossurfactantes que são produzidos em substratos miscíveis em água são

considerados como os de uso mais provável, em termos de custo de produção. Há uma grande

variedade de substratos miscíveis alternativos que podem ser utilizados, como soro de leite ou

resíduos de destilarias (MUKHERJEE et al., 2006).

A maioria das moléculas de biossurfactantes sintetizadas é liberada no meio de cultura na

fase exponencial de crescimento dos microrganismos; em certos casos, as moléculas podem ser

mantidas no interior das células ou permanecer aderidas às membranas (DESAI & BANAT, 1997).

Dependendo da espécie microbiana e das condições de cultivo, o biossurfactante é produzido


23

durante uma parte do ciclo de crescimento e, a seguir, é desativado ou incorporado em outro

metabólito, como ocorre quando B. licheniformes é cultivado em meio mineral.

Diferentes fontes de carbono podem influenciar não só a composição do biossurfactante,

mas também a maneira como é produzido. Isolados de Arthrobacter retêm 75% do biossurfactante

produzido no ambiente intracelular quando crescem em etanol ou acetato; porém, com

hidrocarbonetos, a totalidade produzida é liberada para o meio extracelular (REISER et al., 1989).

Várias patentes já foram requeridas para processos de produção de biossurfactantes. Em

2001, no Japão, a empresa Showa Denko K. K. (SDK) melhorou a produção e venda de um

biossurfactante inovador para aplicações cosméticas, denominado de “Aminofect”, um análogo da

surfactina. A avaliação de resultados confirmou que é altamente ativo como agente de superfície,

mostrando uma alta estabilidade de emulsificação e dispersão, mesmo em baixas concentrações.

Também foi confirmado que o “Aminofect” provê um grau de irritação de pele substancialmente

mais baixo que o grau de "irritação convencional", sendo altamente biodegradável e seguro

(KITAMOTO et al., 2002).

1.4. RECUPERAÇÃO E ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DE BIOSSURFACTANTES

A recuperação de moléculas biossurfactantes depende principalmente de sua carga iônica,

solubilidade e localização - intracelular, extracelular ou ligadas à parede celular (DESAI & BANAT,

1997). Em geral, compostos intracelulares requerem maiores custos na recuperação, pois as

células devem ser primeiramente rompidas, por meios mecânicos ou enzimáticos, antes da

purificação, requerendo-se, assim, mais uma etapa no processo de produção (MULLIGAN &

GIBBS, 1993). O isolamento de biossurfactantes hidrossolúveis extracelulares geralmente envolve

várias etapas de concentração, enquanto que o de biossurfactantes associados a paredes

celulares, ou dos insolúveis em água, é relativamente mais fácil (LIN, 1996).

A recuperação e concentração do biossurfactante dos meios de cultura é que irão

determinar a viabilidade da produção em larga escala. Geralmente, a baixa concentração e a

estrutura do biossurfactante limitam a extração. Diferentes métodos são usados nos processos de

extração, como a ultra-centrifugação (MUKHERJEE et al., 2006), ultra-filtração (SEN &


24

SWAMINATHAN, 2005), precipitação com ácido ou sal (SEN & SWAMINATHAN, 2004; SHABTAI &

GUTNICK, 1986), extração por solvente (REILING et al., 1986; DUBEY, 2005) e cromatografia de

troca iônica (REILING et al, 1986). Uma grande variedade de solventes, a exemplo de compostos

orgânicos como hexano, etanol, diclorometano, clorofórmio, éter etílico, acetona e metanol, tem

sido usada na forma pura ou combinada em processos de extração. As misturas mais efetivas são

aquelas que utilizam clorofórmio e metanol, pois facilitam o ajuste de polaridade ao da molécula

que se pretende extrair (MESQUITA, 2004).

A precipitação com sulfato de amônio é utilizada para a extração de emulsan e

biodispersan. A surfactina e outros biossurfactantes produzidos por Bacillus podem ser extraídos

por precipitação ácida, ajustando-se o pH do meio para o ponto isoelétrico do composto desejado,

enquanto que biossurfactantes produzidos por espécies de Pseudomonas e por Candida tropicalis

são extraídos por precipitação com acetona (MULLIGAN & GIBBS, 1990).

A ultra-filtração tem sido utilizada para a separação de biossurfactantes do meio de

fermentação, como no caso de glicolipídeos, utilizando-se a capacidade de formarem micelas ou

agregados acima da CMC, que podem ser retidos em membranas de exclusão de alto peso

molecular (LIN & JIANG, 1997).

A elucidação estrutural de biossurfactantes é baseada em espectroscopia de ressonância

magnética nuclear (NMR) e espectrometria de massa (MS). Atualmente, os progressos em técnicas

de purificação, como cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com fase reversa e a

disponibilidade de técnicas espectroscópicas melhoradas, como NMR, MS com Bombardeamento

de Átomos Rápidos (FAB-MS) e, mais recentemente, Ionização/Dessorção a Laser Assistida por

Matriz com Tempo de Vôo (MALDI-TOF), têm demonstrado que novas estruturas de

biossurfactantes podem ser determinadas em tempos relativamente curtos e com uma quantidade

muito pequena de amostras (BODOUR et al., 2004).

Várias estruturas de biossurfactantes produzidos por diferentes espécies microbianas vêm

sendo elucidadas. Bioemulsificantes de P. putida ML2 foram purificados com uso da cromatografia

de filtração gélica e cromatografia de camada fina (TLC) e suas estruturas foram determinadas por

meio de técnicas bidimensionais de NMR (BONILA et al., 2005). Lipopeptídeos também já foram


25

separados com uso de HPLC e TLC e suas estruturas determinadas por espectroscopia de NMR

(1H e 13C) (KALINOVSKAYA et al., 2002). Para a descrição da nova classe de biossurfactantes,

flavolipídeos, produzidos por Flavobacterium sp. MTN11, os autores fizeram uso de técnicas de MS

(FAB e MALDI) e NMR para a demonstração de que o novo biossurfactante é uma mistura de 37

flavolipídeos, com massa molecular variando entre 584 e 686 Daltons (BODOUR et al., 2004).

1.5. BIODEGRADABILIDADE E TOXICIDADE DE SURFACTANTES

A ampliação do uso de surfactantes em processos de remediação de águas e de solos

contaminados com poluentes orgânicos hidrofóbicos tem sido limitada pela falta de conhecimento

sobre o destino desses compostos no ambiente - biodegradação das moléculas e dos metabólitos

intermediários - e, também, sobre a toxicidade quando aplicados in situ (HAIGH, 1996; DI GIOIA et

al., 2004).

1.5.1. Biodegradação

A biodegradabilidade de surfactantes é um atributo que pode ter efeitos positivos e

negativos no seu uso para biorremediação. Os efeitos negativos podem ser causados pelo

esgotamento de minerais e oxigênio, pela toxicidade de seus intermediários ou pela degradação

preferencial do surfactante, em detrimento da degradação do poluente-alvo (TIEHM, 1994). O efeito

positivo mais óbvio da degradação do surfactante é a sua remoção do local onde foi aplicado.

Muitos dos surfactantes podem ser degradados pelos microrganismos. Contudo, a

degradação de alguns surfactantes sintéticos por atividade microbiana pode levar à geração de

metabólitos tóxicos (VAN GINKEL et al., 1996). Além disso, alguns surfactantes sintéticos aplicados

em processos de remediação podem ser persistentes sob condições anaeróbias, como os

sulfonatos alquilbenzenos lineares (LAS). O LAS é um tensoativo aniônico constituído de uma

mistura de homólogos e isômeros de posição de cadeias alquiladas lineares variando de C10 a C16

com predominância de C10 a C13 (PENTEADO et al., 2006). Entre os fatores que afetam a

biodegradação de LAS está sua estrutura. O tamanho da cadeia linear e a posição do grupo fenil

na cadeia alquílica interfere na constante de biodegradação (k) (PENTEADO et al., 2006).


26

O principal mecanismo de biodegradação aeróbio dos surfactantes aniônicos envolve a

degradação da cadeia alquílica, seguida do grupo hidrofílico. A quebra da cadeia alquílica é

iniciada com a oxidação do grupo metil terminal, o qual, por meio de oxidação enzimática (oxidação

ω), é transformado em álcool, aldeído e, posteriormente, em ácido carboxílico (Figura 1.12A). Por

sua vez, o ácido carboxílico é submetido à oxidação que é catalisada por enzimas do tipo alcano

monooxigenase e deidrogenases (Figura 1.12B). Esse mecanismo de degradação ocorre

predominantemente na natureza (Figura 1.12) (SCHLEHECK, 2003).

Estudo sobre a biodegradabilidade de surfactantes, um biológico (ramnolipídeo) e um

sintético (Triton X-100), sob condições aeróbias, de redução de nitrato, de redução de sulfato e em

condições de fermentação, indica que o ramnolipídeo é superior ao Triton X-100 em termos de

biodegradabilidade, pois ele é biodegradável em todas as condições, enquanto que o Triton X-100

é parcialmente biodegradável sob condição aeróbia e não-biodegradável nas demais condições

(MOHAN et al., 2006).


27

Figura 1.12. Mecanismo de oxidação (A) ω e (B) β da cadeia alquílica durante a degradação de

surfactante aniônico. Adaptada de SCHLEHECK (2003).

C C C R XH

H

H

H

H

H

H

NADH O2

NAD+ H2O

C C C R XO

H

H

H

H

H

H

H

C C C R XH

H

H

H

H

O

C C C R XO

H

H

H

H

O

H

C C C R XA

H

H

H

H

O

CoS

Acildesidrogenase

SH CoA

C CA

H

O

C R X

H

CoS

Acilhidrolase H2O

C CA

H

O H

C R X

H

OH

CoS

Acildesidrogenase

C CA

H

O H

C R X

O

CoS

SH CoA

S CoA C

O

CH3 S CoA C

O

R X

(A)

(B)

ω-oxidação β-oxidação


28

1.5.2. Efeitos Tóxicos

Em análises comparativas, os tensoativos biológicos geralmente apresentam toxicidade

inferior à dos sintéticos (POREMBA et al., 1991; MAKKAR & ROCKNE, 2003; MULLIGAN, 2005)

(Tabela 1.4). Essa baixa toxicidade dos tensoativos biológicos às bactérias e a outros organismos

unicelulares é uma das principais características que levam os biossurfactantes a estimularem a

decomposição bacteriana de substâncias orgânicas hidrofóbicas (MORAN et al., 2000; HUA et al.,

2003). Nos surfactantes sintéticos, como os Alquilbenzenos Sulfonados Lineares (LAS), a

toxicidade a bactérias é atribuída ao efeito tóxico sobre as membranas (BRANDT et al., 2001), o

que, em alguns casos, pode inibir a decomposição bacteriana de substâncias orgânicas

hidrofóbicas (LINDSTROM & BRADDOCK, 2002).

Os biossurfactantes distinguem-se dos surfactantes sintéticos pelas suas propriedades

tensoativas extremamente suaves. Isso significa que apresentam uma alta compatibilidade com as

membranas biológicas. Essa característica é atribuída geralmente à sua estrutura polimérica e ao

seu conteúdo de grupos polifuncionais, que fazem com que essas substâncias apresentem, em

regra, uma menor polaridade que os surfactantes sintéticos. Uma das conseqüências dessas

características estruturais é o fato dos tensoativos biológicos formarem agregados, as micelas, com

uma menor carga eletrostática. Como resultado dessa propriedade, os biossurfactantes

apresentam uma maior compatibilidade com membranas biológicas quando comparados com

muitos dos tensoativos sintéticos utilizados para tratamento de ambientes contaminados com

compostos orgânicos hidrofóbicos (AL-TAHHAN et al., 2000; HUA et al., 2003). Nesses processos,

a presença de biossurfactantes propicia uma interação entre os compostos orgânicos hidrofóbicos

e a superfície celular dos microrganismos. Este fato não surpreende, dado que muitos dos

surfactantes sintetizados pelas bactérias, mesmo sob condições naturais, têm como função a de

regular a adesão de células bacterianas às superfícies de substratos lipofílicos (VAN HAMME et al.,

2006).


29

Tabela 1.4. Toxicidade de biossurfactantes comparada aos surfactantes sintéticos

Natureza do surfactante

Surfactante CE50 (mg L-1)

Biológico Rhodococcus ruber - Glicolipídeo 650 Biológico Rhodococcus erytrhropolis - Trealose tetraéster 49 Biológico Pseudomonas aeruginosa -Ramnolipídeo 1000

Sintético Finasol OSR-5® 7 Sintético Coretix 9597® 5

*CE50= Concentração efetiva que causa mortalidade a 50% dos organismos-teste, num determinado período de exposição. Adaptada de IVSHINA et al. (1998).

A toxicidade de surfactantes é avaliada considerando-se a estrutura química e outros

fatores que determinam o comportamento dessa classe de compostos. O principal dentre esses

fatores é a estrutura química. A toxicidade de surfactantes aniônicos e não-iônicos é uma função do

comprimento da cadeia alquil. Um aumento no comprimento da cadeia alquil corresponde a um

aumento na toxicidade do surfactante aniônico LAS e de outros surfactantes aniônicos (MANN,

2000). A toxicidade de uma substância depende, além de sua própria natureza, de fatores físico-

químicos (pH, temperatura e salinidade), do organismo-teste, da concentração da substância e das

condições impostas para o teste (KOZLOVA et al., 2004).

A proposta geral dos testes de toxicidade é estabelecer o impacto potencial de substâncias

químicas sobre a biota de um dado ambiente. A informação adquirida pode ser usada para se

administrar o tratamento ou para a liberação do uso de substâncias químicas.

Microrganismos são úteis nos testes de ecotoxicidade, pois podem ser avaliados em um

curto tempo e ocupam níveis tróficos onde a bioacumulação é problema potencial (VAN BEELEN &

DOELMAN, 1997). Os testes de toxicidade bacteriana medem uma ampla variedade de “endpoints”

e incluem testes de mutagenicidade (AMES et al., 1988 citado por LAYTON et al., 1999),

crescimento populacional (NENZDA & SEYDEL, 1988), produção de CO2 (JARDIN et al., 1990),

biossíntese enzimática, mineralização da glicose (RETEUNA et al., 1989) e a inibição da

bioluminescência (RIBO & KAISER, 1987 citado por LAYTON et al., 1999). Entre os bancos de


30

dados de toxicidade bacteriana, o mais amplo refere-se à inibição da bioluminescência em Vibrio

fischeri ou ao ensaio MICROTOX (KAISER & DEVILLERS citados por LAYTON et al., 1994).

A falta de maior compreensão dos mecanismos que envolvem a interação de surfactantes

com poluentes orgânicos hidrofóbicos, organismos e componentes do solo, leva a muitas

controvérsias com respeito à aplicação de surfactantes em biorremediação de solos contaminados

com compostos orgânicos hidrofóbicos (ZIQING OU, 2000). Isto também é indicativo da

necessidade de pesquisas sobre biodegradabilidade e toxicidade de surfactantes antes da sua

aplicação em processo de biorremediação de ambientes contaminados. Idealmente, os

surfactantes não devem causar uma poluição secundária, como resultado de sua aplicação em

processo de remediação.

1.6. APLICAÇÃO DE SURFACTANTES NA REMOÇÃO DE METAIS PESADOS E HIDROCARBONETOS POLIAROMÁTICOS (PAH’s)

A escolha da técnica para descontaminação de solos e sedimentos é determinada por

características do local contaminado e do(s) tipo(s) e concentração(s) do(s) poluente(s) presente(s).

Os hidrocarbonetos poliaromáticos (PAH’s) constituem um dos principais grupos de contaminantes

freqüentemente encontrados, juntamente com os hidrocarbonetos não-voláteis, hidrocarbonetos

voláteis, pesticidas orgânicos, bifenilas policloradas (PCB’s) e metais pesados (CASTELO-

GRANDE & BARBOSA, 2003). Os tratamentos de remediação para esses grupos, em solos e

sedimentos, podem ser denominados em função do local de aplicação, “in situ” ou “ex situ”. Podem

também ser baseados na ação usada na remediação do solo, sendo classificados em: térmicos,

biológicos, físico-químicos e métodos especiais, a exemplo da eletrocinese, que não se enquadra

nas classes anteriores (BOULDING, 1995) (Tabela 1.5). Esses métodos podem ser utilizados como

tratamentos únicos ou combinados, e cada tecnologia é específica para uma faixa de

contaminantes.

Dentre os processos físico-químicos, os métodos atualmente mais usados baseiam-se na

lavagem do solo (“Soil washing” e “Soil flushing”) (Tabela 1.5) (DENNIS et al., 1992). Esses


31

processos fundamentam-se na transferência de um contaminante do solo para um receptor de fase

líquida ou gasosa. Os principais produtos desses processos são os solos tratados e os

contaminantes concentrados. O processo específico de tratamento depende do(s) tipo(s) de

contaminante(s), especialmente no que se refere ao tipo de ligação que o(s) mesmo(s) estabelece

com as partículas do solo.

Tabela 1.5. Técnicas para remediação de áreas contaminadas

Método Tratamento Resíduo

Físico-químico:

Soil washing Ex situ (In)orgânicos; materiais radioativos Soil flushing In situ (In)orgânicos; materiais radioativos Solidificação /Estabilização In situ Cátion metálico; termoplásticos

Biológico:

Biorremediação aeróbia In situ; ex situ Resíduos orgânicos biodegradáveis Biorremediação anaeróbia In situ; ex situ Resíduos orgânicos halogenados Compostagem Ex situ Resíduos orgânicos biodegradáveis

Térmico:

Incineração In situ; ex situ Resíduos orgânicos Vitrificação In situ; ex situ Resíduos inorgânicos e alguns orgânicos Dessorção térmica In situ; ex situ Orgânicos voláteis e semi-voláteis

Adaptada de BOULDING (1995).

“Soil washing” é um processo ex situ em que se usa a água para a extração e a separação

de contaminantes. As etapas envolvidas no processo incluem a escavação, a fragmentação, a

separação granulométrica, a lavagem das diferentes frações e a solução sobre o destino a se dar

aos resíduos finais (GRIFFITHS, 1995).

“Soil flushing” é uma técnica de lavagem in situ que utiliza água ou agentes de extração

para mobilizar os contaminantes presentes (WASAY et al., 2000). O processo de “Soil flushing”

pode ser dividido em três etapas, a saber: caracterização do local, injeção de fluido e a utilização

de técnicas para mobilizar e recuperar o contaminante. Trata-se de uma técnica em que se

preenche o solo com uma solução que direciona o contaminante para uma área em que ele possa


32

ser removido. Características específicas do meio físico e do contaminante vão determinar o tipo de

solução flushing necessária. A solução flushing é utilizada de dois modos: somente água ou água

mais aditivo, ácidos orgânicos ou inorgânicos, agentes quelantes ou surfactantes.

“Soil washing” e “soil flushing” são técnicas utilizadas para se remover do solo uma ampla

faixa de contaminantes, incluindo orgânicos, inorgânicos e radioativos. O uso da água é o mais

econômico; contudo, a água tem uma baixa capacidade de complexar e é ineficaz em solos

contaminados com concentrações elevadas de metais e contaminantes orgânicos hidrofóbicos.

Solos contaminados com metais pesados e PAH’s requerem lavagem com água contendo agentes

de remediação. No entanto, por se tratar de classes de contaminantes que apresentam

comportamento químico distinto, há geralmente a necessidade de se utilizarem diferentes aditivos,

os quais permitem a mobilização simultânea dos metais e dos compostos hidrofóbicos.

Normalmente, metais pesados são mobilizados com a utilização de ácidos e agentes quelantes

(PETERS, 1999; REDDY & CHINTHAMREDDY, 2000), enquanto que os compostos hidrofóbicos

são removidos com o uso de surfactantes (FAVA & DI GIOIA, 1998; CHU & KWAN, 2003).

1.6.1. Agentes de Remediação para Metais Pesados

Em processos de remediação aplicados a metais pesados, são utilizados agentes de

extração como ácidos orgânicos ou inorgânicos, agentes quelantes e surfactantes (ABUMAIZAR &

SMITH, 1999; REDDY & CHINTHAMREDDY, 2000; NEILSON et al., 2003). Como os metais

pesados são relativamente móveis no solo, principalmente em condições de pH abaixo de 6,0, os

ácidos fortes têm sido utilizados como agentes de extração eficientes na remoção desses

contaminantes. Em um estudo envolvendo sete solos contaminados, o percentual de remoção de

chumbo (Pb2+) com o uso de ácidos fortes variou de 22 a 93%, variação atribuída ao possível fato

do íon Pb2+ ligar-se mais fortemente em alguns tipos de solos do que em outros (VAN

BENSCHOTEN et al., 1997). Ácidos orgânicos de baixo peso molecular, como citrato ou tartarato,

também são efetivos na solubilização de metais pesados ligados a frações minerais pouco solúveis

do solo, por formarem complexos estáveis com os íons metálicos. A avaliação do efeito de ácidos

orgânicos de baixo peso molecular, em comparação com sais inorgânicos, CaCl2 e NaNO3, no


33

tempo de residência e na dessorção de Cu, Cd e Pb de solos, demonstrou que os ligantes

orgânicos desempenharam papel dominante na dessorção dos metais (QIN et al., 2004). Agentes

quelantes como o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) e ácido nitrilitriacético (NTA) também são

usados para lixiviar metais de solos, por serem capazes de se complexar fortemente com metais

(WASAY et al., 1998).

Embora os ácidos fortes e os agentes quelantes sejam eficazes como agentes de

remediação de metais pesados de solo, estes não são ambientalmente aceitos por serem tóxicos e

por causarem distúrbios nas propriedades físicas, químicas e biológicas do solo. Agentes

quelantes, como EDTA, podem extrair, além dos metais pesados, importantes elementos do solo,

como Ca, Mg e Fe (WASAY et al., 1998).

Alguns surfactantes, sintéticos ou biológicos, possuem elevada eficácia para remover

metais do solo, com efeitos tóxicos menores que os causados por ácidos e agentes quelantes. A

adição de surfactantes aniônicos e não-iônicos pode melhorar a eficiência de extração de Cd, Pb e

Zn, enquanto que a adição de surfactantes catiônicos diminui a eficiência de extração de metais

pesados (DOONG et al., 1998).

Estudos demonstram que o biossurfactante ramnolipídeo, produzido por várias linhagens

de Pseudomonas aeruginosa, é capaz de complexar preferencialmente com metais pesados. Os

cátions de maior a menor afinidade com ramnolipídeo são Cu2+ > Pb2+ > Cd2+ > Zn2+ > Fe3+ > Hg2+ >

Ca2+ > Co2+ > Ni2+ > Mn2+ > Mg2+ > K+. A afinidade do ramnolipídeo com metais pesados é superior

à de cátions que são comuns no solo como Ca2+, Mg2+ e K+. Isto mostra o potencial do

ramnolipídeo na remoção de metais pesados presentes como contaminantes de solos (MULLIGAN,

2005).

1.6.2. Agentes de Remediação para Hidrocarbonetos Poliaromáticos (PAH’s)

Os agentes de remediação mais usados para solos contaminados com compostos

orgânicos hidrofóbicos são os solventes, os agentes complexantes e os surfactantes. Por serem

compostos lipofílicos com baixa solubilidade em água, os PAH’s tendem a se ligar à matéria

orgânica do solo. Além disso, PAH’s são relativamente persistentes em solos e apresentam baixa


34

biodegradabilidade sob condições naturais, comparativamente a outros contaminantes orgânicos

(ZHAO et al., 2005).

O processo de lavagem de solo contaminado com 4,4’-diclorobifenil pode ser realizado com

soluções de agentes de extração constituídas por combinações de solventes e surfactantes, a

exemplo das preparadas com três solventes, acetona, trietilamina e esqualeno, e três surfactantes,

Brij 35, Tween 80 e SDS® (CHU & KWAN, 2003). A combinação acetona/Brij 35 mostrou-se como

a melhor, promovendo a remoção de 82-95% do contaminante.

Surfactantes são um dos mais populares agentes de extração para solos contaminados

com PAH’s. Visto que as moléculas de surfactantes possuem um grupo hidrofílico e um grupo

hidrofóbico, os PAH’s podem ser solubilizados, em fase aquosa, na fase hidrofóbica das micelas.

Em um estudo de mobilidade de contaminantes em solos, diferentes agentes de lixiviação, como

água destilada, ácido húmico, fosfolipídeos e dodecil sulfato de sódio (SDS®) foram utilizados para

se avaliar a mobilização de PAH’s e PCB’s (HIRNER et al., 1998). Dentre eles, o SDS® foi

considerado como o agente lixiviante mais adequado para a mobilização dos contaminantes

orgânicos, sugerindo que a solubilização dos contaminantes foi causada pela interação entre os

contaminantes hidrofóbicos e a cadeia de hidrocarboneto do SDS®.

1.6.3. Mecanismos de Remoção por Surfactantes

Em operações de remoção de PAH’s de solos e sedimentos, têm sido extensivamente

empregados os surfactantes como agentes de lavagem nos processos “Soil washing” e “Soil

flushing (BILLINGSLEY et al., 2002; CHU & KWAN, 2003). Somente tipos especiais de surfactantes

podem remover metais, mas os mesmos não são muito efetivos na remoção simultânea de PAH’s.

Entre os mecanismos de ação de surfactantes avaliados em processos de dessorção de PCB’s,

PAH’s, hexaclorobenzeno e tetraclorofenol (PARK & BOYD, 1999; CHU & CHAN, 2003), o principal

mecanismo de dessorção foi o da partição dos contaminantes orgânicos nas micelas, por meio de

interações hidrofóbicas.

Os mecanismos envolvidos na remoção de metais são diferentes dos envolvidos na

dessorção de PAH’s, e também dependem dos tipos de metais e surfactantes. A remoção de


35

metais do solo com o uso de uma solução contendo surfactina, produzida por B. subtilis, removeu

os metais pesados Cd, Cu, Pb e Zn após sua sorção a superfícies do solo, seguida pela

solubilização do metal causada pela redução da tensão superficial e atração eletrostática e,

finalmente, incorporação do metal nas micelas do biossurfactante (Figura 1.13) (MULLIGAN et al.,

1999).

Figura 1.13. Mecanismos de remoção de metal pelo biossurfactante Surfactina. Adaptada de

MULLIGAN et al., 1999.

1.6.4. Complexação de Metais na Solução de Surfactante-ligante

Complexação de metais é a reação que leva à ligação de um íon metálico e um ligante,

pelo compartilhamento de elétrons. O íon metálico serve como aceptor de elétrons e o ligante como

doador (SHIN et al, 2000).

Os estudos do comportamento de complexação de metal em micelas de surfactantes têm

mostrado que a complexação de metais em solução micelar é diferente da que ocorre em solução

aquosa (UMEBAYASHI et al., 1997; SHIN et al, 2000; UMEBAYASHI et al., 2001). A interação

grupo aniônico

micela

metal adsorvido

Monômero de surfactante

Solo contaminado com metal

metal

1. Acumulação de surfactante como hemimicelas na interface do solo. 2. Remoção de metal pela redução da tensão interfacial e atração eletrostática. 3. Incorporação de metal na micela.


36

entre o íon tiocianato (SCN-) e uma série de íons metálicos em solução micelar mostra que

[Co(NCS)4]2- e [Zn(NCS)4]2- são comumente formados em solução micelar, enquanto que estas

espécies são raramente formadas em solução aquosa (UMEBAYASHI et al., 1997). Em um estudo

da complexação de Cd2+ com o I-, foi observada a formação de [CdI3]2- e [CdI4]2- em ambas as

fases, micelar e aquosa, e a formação dos complexos foi melhorada na fase micelar (SHIN et al.,

2000). A complexação em micelas obteve um valor de entalpia (-15 kJ mol-1) superior ao valor

obtido em fase aquosa (-5 kJ mol-1).

1.6.5. Aplicações de complexo Surfactante-ligante

Atualmente, técnicas de extração mediada por micela de surfactante, particularmente

aquelas em que se utilizam vários ligantes, têm sido aplicadas para a remoção de íons metálicos

como os de Cd, Cu, Zn, Co e Ni (AKITA et al., 1999; UDIN & KATHIRESAN, 2000). O uso de

surfactantes em combinação com um ligante inorgânico, a exemplo do iodeto ou tiocianato, pode

melhorar a complexação dos surfactantes com os íons metálicos. O íon ligante forma um complexo

com o íon metálico na solução de surfactante, reduzindo seu caráter hidrofílico e permitindo a sua

adsorção dentro da micela. A formação do complexo metálico em pseudo-fase micelar de

surfactante não-iônico foi demonstrada por SHIN et al. (2000).

O uso do ligante hidrofóbico 1-fenil-3-isoetil-1,3-propanodiona, combinado com o

surfactante catiônico CTAB (brometo de n-hexadeciltrimetilamônio), promoveu a remoção de Cu

(FILLIPI et al. (1997). Com a técnica de ultra-filtração, AKITA et al. (1999) usaram um surfactante

não-iônico com um ligante hidrofóbico para efetivamente separar Co e Ni de uma solução aquosa.

A remoção de contaminantes de ambientes com uso de surfactantes, especialmente de

metais pesados e poluentes orgânicos hidrofóbicos, é uma técnica considerada como de eficácia

comprovada (MULLIGAN, 2005) e à adição de ligantes a solução de surfactantes pode melhorar a

sua eficiência. Atualmente, as pesquisas que envolvem a utilização de ligantes em combinação

com surfactantes, têm sido limitadas ao uso de surfactantes sintéticos e à descontaminação de

soluções (SHIN et al., 2000). O comportamento de complexação de metal com íons ligantes, como

o iodeto e o tiocianato em solução de biossurfactante, pode ser aplicado a solos contaminados.


37

Íons ligantes específicos podem extrair metais pesados de solos, reduzindo seu caráter hidrofílico e

permitindo a sua adsorção dentro da micela de surfactante. Em razão desse comportamento,

infere-se a possibilidade de remoção simultânea de metais pesados e compostos orgânicos

hidrofóbicos de solos com a utilização de uma solução de surfactante contendo um íon ligante.

Com isso, infere-se como inovadora e factível a idéia de se utilizar de soluções contendo

biossurfactantes e um íon ligante para remover simultaneamente metais pesados e PAH’s de solos

contaminados.

O presente trabalho focaliza o estudo de biossurfactantes produzidos por isolados de

Bacillus subtilis LBBMA 155, Bacillus sp. LBBMA 111A, Flavobacterium sp. LBBMA 168, Dietzia

maris LBBMA 191 e Arthrobacter oxydans LBBMA 201, previamente selecionados como produtores

de biossurfactantes e pertencentes à coleção de culturas do Laboratório de Biotecnologia e

Biodiversidade para o Meio Ambiente (LBBMA) do Departamento de Microbiologia da Universidade

Federal de Viçosa, Minas Gerais, quanto às características estruturais das moléculas, bem como as

propriedades físico-químicas desses compostos. Além disso, as características de

biodegradabilidade e toxicidade dos biossurfactantes são também determinadas, com vistas à sua

aplicação em processos biotecnológicos, a exemplo da mobilização simultânea de fenantreno e

cádmio de solo.

Capítulo 1. Referências Bibliográficas

38

5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ABALOS, A., PINAZO, A., INFANTE, M.R., CASALS, M., GARCIA, F. & MANRESA, A. 2001. Physicochemical and antimicrobial properties of new rhamnolipids produced by Pseudomonas

aeruginosa AT10 from soybean oil refinery wastes. Langmuir, 17, 1367–1371.

ABUMAIZAR, R.J. & SMITH, E.H. 1999. Heavy metal contaminants removal by soil washing. Journal of Hazardous Materials, 70, 71-86.

ADAMSON, A.W. & GAST, A.P. 1997. Phisycal Chemistry of Surfaces, John Willey e Soons, Inc.,

6th. Ed., New York.

AKITA, S., CASTILLO, L.P., NII, S., TAKAHASHI, K. & TAKEUCHI, H. 1999. Separation of Co(II)/Ni(II) via ion-enhanced ultrafiltration using organophosphorus acid extractant by ion-ionic surfactant. Journal of Membrane Science, 162, 111-117.

AL-TAHHAN, R.A., SANDRIN, T.R., BODOUR, A.A. & MAIER, R.M. 2000. Rhamnolipid-induced removal of lipopolysaccharide from Pseudomonas aeruginosa: effect on cell surface properties and interaction with hydrophobic substrates. Applied and Environmental Microbiology, 66, 3262–3268.

ARIMA, K., KAKINUMA, A. & TAMURA, G. 1968. Surfactin, a crystalline peptide lipid surfactant produced by Bacillus subtilis: isolation, characterization and its inhibition of fibrin clot formation. Biochemistry and Biophysics Research Communication, 31, 488-494.

ASSELINEAU, C. & ASSELINEAU, J. 1978. Trehalose-containing glycolipids. Progress in the

Chemistry of Fats and other Lipids, 16, 59-99.

ASMER, H.-J., LANG, S., WAGNER, F. & WRAY, V. 1988. Microbial production, structure elucidation and bioconversion of sophorose lipids. Journal American Oil Chemistry Society, 65, 1460–1466.

AZUMA, T & DEMAIN, A.L. 1996. Interactions between gramicidin S and its producer, Bacillus

brevis. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 17, 56-61.

AZZINI, R.G. 1999. Desenvolvimento e avaliação in vitro e in vivo de emulsões contendo óleo de canola e ácidos carboxílicos. Dissertação de Mestrado. Faculdade de Ciências Farmacêuticas, Universidade de São Paulo, São Paulo.

BANAT, I. 1995. Biosurfactants production and possible uses in microbial enhanced oil recovery and oil pollution remediation. A review. Bioresourse Technology, 51, 1–12.


39

BENINCASA, M., ABALOS, A., OLIVEIRA, I. & MANRESA, A. 2004. Chemical structure, surface properties and biological activities of the biosurfactant produced by Pseudomonas aeruginosa LBI from soapstock. Antonie Van Leeuwenhock, 85, 1-8.

BILLINGSLEY, K.A., BACKUS, S.M., WILSON, S., SINGH, A., & WARD, O.P. 2002. Remediation of PCBs in soil by surfactant washing biodegradation in the wash by Pseudomonas sp. LB400. Biotechnology Letters, 24, 1827-1832.

BODOUR, A.A., GUERRERO-BARAJAS, C., JIORLE, B.V., MALCOMSON, M.E., PAULL, A.K., SOMOGYI, A., TRINH, L.N., BATES, R.B. & MAIER, R.M. 2004. Structure and characterization of flavolipids, a novel class of biosurfactants produced by Flavobacterium sp. Strain MTN11. Applied

and Environmental Microbiology, 70, 114-120.

BODOUR, A.A., DRESS, K.P. & MAIER, R.M. 2003. Distribution of biosurfactant-producing bacteria in undisturbed and contaminated arid Southwestern soils. Applied and Environmental Microbiology, 69, 3280–3287.

BRANDT, K.K., HESSELSØE, M.P., ROSLEV, K., HENRIKSEN, K. & SØRENSEN, J. 2001. Toxic effects of linear alkylbenzene sulfonate on metabolic activity, growth rate, and microcolony formation of Nitrosomonas and Nitrosospira strains. Applied and Environmental Microbiology, 67, 2489–2498.

BOULDING, J. R. 1995. Practical handbook of soil, vadose zone and ground-water contamination,

assessment, prevention, and remediation. Lewis Publishers, Boca Raton, Florida, USA.

CAMEOTRA, S. S. & MAKKAR, R. S. 1998. Synthesis of biosurfactants in extreme conditions. Applied Microbiology and Biotechnology, 50, 520-529.

CAMERON, D.R., COOPER, D.G. & NEUFELD, R.J. 1988. The Mannooprotein of the Saccharomyces cerevisiae is a effective bioemulsifier. Applied Environmental Microbiology, 54, 1420-1425.

CASTELO-GRANDE, T. & BARBOSA, D. 2003. Soil decontamination - A review. Chemical Industry

and Environment, 1, 157-165.

CARILLLO, C., TERUEL, J. A., ARANDA, F.J. & ORTIZ, A. 2003. Molecular mechanism of membrane permeabilization by the peptide antibiotic surfactin. Biochimica and Biophysica Acta, 1611, 91-97.


40

CHEN, J., SONG, X., ZHANG, H. & QU, Y. 2006. Production, structure elucidation and anticancer properties of sophorolipid from Wicker-hamiella domercqiae. Enzyme Microbial Technology, 39, 501-506.

CHU, W. & CHAN, K.H. 2003. The mechanism of the surfactant –aided soil washing system for hydrophobic and partial hydrophobic organics. Science Total Environmental. 307, 83-92.

CHRISTOFI, N. & IVSHINA, I.B. 2002. Microbial surfactants and their use in field tudies of soil remediation. Journal of Applied Microbiology, 93, 915-929.

CIRIGLIANO, M.C. & CARMAN, G.M. 1984. Isolation of a bioemulsifier from Candida . Applied and

Environmental Microbiology, 48, 747-750.

COOPER, D.G. & PADDOCK, D.A. 1984. Production of a biosurfactant from Torulopsis bombicola.

Applied and Environmental Microbiology, 47, 173-176.

CREVECOEUR, J.J., 1997. ”Water expandable polystyrene (WEPS)”, Tese de pós-doutorado, Eindhoven University of Technology, Eindhoven.

DAVILA, A.-M., MARCHAL, R. & VANDECASTEELE, J.-P. 1994. Sophorose lipid production from lipidic precursors: Predictive evaluation of industrial substrates. Journal of Industrial Microbiology,

13, 249–257.

DESAI, J. D. & BANAT, I. M. 1997. Microbial production of surfactants and their commercial potential. Microbiology Molecular Biology Reviews, 61, 47-64.

DUBEY, K.V. 2005. Adsorption-desorption process using wood-based activated carbon for recovery of biosurfactant from fermented distillery wastewater. Biotechnology Progress, 21, 860-867.

David, H.T. 1994. Factors determining emulsion type: hydrophile–lipophile balance, Colloids and

Surfaces A, 91, 9–24.

DENNIS, R.M., DWORKING, D., LOWE, W.L. & ZUKPO, A.J. 1992. Evaluation of commercially available soil-washing processes for site remediation”, Journal of Hazardous Industrial Wastes, 24, 515-525.

DI GIOIA, D., FAMBRINI, L., COPPINI, E., FAVA, F. & BARBERIO, C. 2004. Aggregation-based cooperation during bacterial aerobic degradation of polyethoxylated nonylphenols. Research in

Microbiology, 155, 761–769.


41

DOONG, R.-A., WU, Y.-W. & LEI, W.-G. 1998. Surfactant Enhanced Remediation of Cadmium Contaminated Soils. Water Science and Technology, 37, 65-71.

FAVA, F. & DI GIOIA, D. 1998. Effects of Triton X-100 and quillaya saponin on the ex situ bioremediation of a chronically polychlorobiphenyl-contaminated soil. Applied Microbiology and

Biotechnology, 50, 623-630.

FALAGAS, M.E., KASIAKOU & S.K., COLISTIN. 2005. The revival of polymyxins for the management of multidrug-resistant Gram-negative bacterial infections. Clinical Infectious Diseases, 40, 1333-1341.

FILIPE, E.J.M. 1996. Quando as moléculas se auto-organizam: micelas e outras estruturas supramoleculares. Fundação Calouste Gulbenkian, 25-38.

FILLIPI, B.R., SCAMEHORN, J.F., TAYLOR, R.W. & CHRISTIAN, S.D. 1997. Selective removal of copper from an aqueous solution using ligand-modified. Separation and Purification Technology, 32, 2401-2424.

FERRAREZZO, E.M. 1998. Isolamento e seleção de microrganismos produtores de bioemulsificantes a partir de efluentes de indústria de margarina e sabão. Dissertação de mestrado. Faculdade de Engenharia de Alimentos (FEA), Universidade Estadual de Campinas. Campinas-SP.

GAUTAM, K.K. & TYAGI, V.K. 2006. Microbial Surfactants: A Review. Journal of Oleo Science, 55, 155-166.

GEORGIOU, G., LIN, S.C. & SHARMA, M.M. 1992. Surface-active compounds from microrganisms. Biotechnology, 10, 60-65.

GOBBERT, U., LANG, S. & WAGNER, F. 1984. Sophorose lipid formation by resting cells of Torulopsis bombicola VR-8 isolate. Biotechnology, 6, 225-230.

GOODWIN, J.W. 2004. Colloids and interfaces with surfactants and polymers-An introduction. Interfacial Dynamics corporation. Portland Oregan, USA.

GORIN, P.A.J., SPENCER, J.F.T., TULLOCH, A.P. 1961. Hydroxy fatty acid glycosides of sophorose from Torulopsis magnoliae. Canadian Society for Chemistry, 9, 846-855.

GRIFFITHS, R.A. 1995. Soil-washing technology and practice, Journal of Hazardous Materials, 40, 175.


42

HAFERBURG, D., HOMMEL, R., CLAUS, R. & KLEBER, H.P. 1986. Extra-cellular microbial lipids as biosurfactants. Advances in Biochemistry and Engineering Biotechnology, 33, 53-93.

HAIGH, S.D. 1996. A review of the interaction of surfactants with organic contaminants in soil. Science Total Environmental, 185, 161-170.

HIRNER, A.V., PESTKE, F.M., BUSCHE, U. & ECKELHOFF, A. 1998. Testing contaminant mobility in soils and waste materials. Journal of Geochemical Exploration, 64, 127-132.

HOLMBERG, K. 2001. Natural surfactants. Current Opinion in Colloid & Interface Science, 6, 148-159.

HOMME, R. K. & HUSE, K. 1993. Regulation of sophorose lipid production by Candida (Torulopsis)

apicola. Biotechnology Letters, 15, 853-858.

HOMMEL, R.K., STUWER, O., STUBER, W., HAFERBURG, D. & KLEBER, H.P. 1987. Production of water soluble surface-active exolipids by Torulopsis bombicola. Applied Microbiology and


HOMMEL, R.K., STEGNER, S., KLEBER, H.P., WEBER, L. 1994. Effect of ammonium ions on glycolipid production by Candida (torulopsis) apicola. Applied Microbiology and Biotechnology, 42, 192-197.

HUA, Z., CHEN, J., LUN, S. & WANG, X. 2003. Influence of biosurfactants produced by Candida on surface properties of microorganism and biodegradation of n-alkanes. Water Research, 37, 4143-4150.

IVSHINA, I.B., KUYUKINA, M.S., PHILIP, J.C. & CHRISTOFI, N. 1998. Oil desorption from mineral and organic materials using biosurfactant complexes produced by Rhodococcus species. World

Journal of Microbiology and Biotechnology, 14, 711-717.

JARDIN, W. F., PASQUINI, C., GUIMARAES, J. R. & DE FARIA, L. D. 1990. Short-term toxicity test using Escherichia coli: Monitoring CO2 production by flow injection analysis. Water Environmental Resource, 24, 351-354.

KALINOVSKAYA, N., KUZNETSOVA, T.A., IVANOVA, E.P., ROMANENKO, L.A., VOINOV, V.G., HUTH, F. & LAATSCH, H. 2002. Characterization of surfactin-like cyclic depsipeptides synthesized by Bacillus pumilus Ascidian Halocynthia aurantium. Marine Biotechnology, 4, 179–189.

KAPPELI, O. & FINNERTY, W.R. 1979. Partition of alkane by an extracelular vesicle derived from hexadecane-grown Acinetobacter. Journal of Bacteriology, 140, 707-712.


43

KLEKNER, V., KOSARIC, N. & ZHOU, Q.H., 1991. Sophorose lipids produced from sucrose. Biotechnology Letters, 13, 345–348.

KITAMOTO D, ISODA H. & NAKAHARA T. 2002. Functions and potential applications of glycolipid biosurfactants from energy-saving materials to gene delivery carriers. Journal of Bioscience and

Bioengineering, 94, 187-201.

KOZLOVA, E.V., PUNTUS, I.F., SLEPENKIN, A.V. & BORONIN, A.M. 2004. Naphthalene degradation by Pseudomonas putida strains in soil model systems with arsenite. Process

Biochemistry, 39, 1305–1308.

KRETSCHMER, A., BOCK, H. & WAGNER, F. 1982. Chemical and physical characterization of interfacial-active lipids from Rhodococcus erythropolis grown on n-alkane. Applied and


LANG, S. 2002. Biological amphiphiles (microbial biosurfactants). Current Opinion in Colloid and

Interface Science, 7, 12–20.

LAYTON, A.C., GREGORY, B, SCHULTZ, T.W. & SAYLER, G.S. 1999. Validation of genetically engineered bioluminescent surfactant resistant bacteria as toxicity assessment tools. Ecotoxicology

and Environmental Safety, 43, 222–228.

LEMKE, M.J., CHURCHILL, P.F. & WETZEL, R.G. 1995. Effect of substrate and cell surface hydrophobicity on phosphate utilization in bacteria. Applied and Environmental Microbiology, 61, 913-919.

LINDSTROM, J.E. & BRADDOCK, J.F. 2002. Biodegradation of petroleum hydrocarbons at low temperature in the presence of the dispersant Corexit 9500. Marine Pollution. Bulletin, 44, 739-747.

LIN, S-C.1996. Biosurfactants: recent advances. Journal of Chemical Technology and


LIN, S.-C. & JIANG, H.-J. 1997. Recovery and purification of the lipopeptide biosurfactant of Bacillus

subtilis by ultrafiltration, Biotechnology & Technology, 1997, 11, 413–416.

MAKKAR, R.S. & CAMEOTRA, S.S. 2002. An update on the use of unconventional substrates for biosurfactant production and their new applications. Applied Microbiology and Biotechnology, 58, 428–434.


44

MAKKAR, R.S. & ROCKNE, K.J. 2003 Comparison of synthetic surfactants and biosurfactants in enhancing biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons. Environmental Toxicology and

Chemistry, 22, 2280-2292.

MANIASSO, N. 2001. Ambientes micelares em química analítica. Quimica Nova, 24, 87-93.

MANN, R.M. 2000. Toxicological impact of agricultural surfactants on Australian Frogs. Tese de

Doutorado, Curtin University of Technology.

MESQUITA, A.C. 2004. Uso das técnicas de oxidação química e biodegradação na remoção de alguns compostos recalcitrantes. Tese de doutorado, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro.

MINATTI, E. 2005. Um novo modelo para a interação entre polímeros neutros hidrossolúveis e surfactantes. Tese de Doutorado, Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Físicas e Matemáticas, Santa Catarina.

MCINERNEY, M.J., JAVAHERI, M. & NAGLE Jr., D. P. 1990. Properties of the biosurfactant produced by Bacillus licheniformis strain JF-2. Journal of industrial microbiology, 5, 95-102.

MOHAN, P.K., NAKHLA, G. & YANFUL, E.K. 2006. Biokinetics of biodegradation of surfactants under aerobic, anoxic and anaerobic conditions. Water Research, 40, 533-540.

MORÁN, A.C., OLIVERA, N., COMMENDATORE, M., ESTEVES, J.L., SIÑERIZ, F. 2000. Enhancement of hydrocarbon waste biodegradation by addition of a biosurfactant from Bacillus

subtilis O9. Biodegradation, 11, 65–71.

MULLIGAN, C.N. & GIBBS, B.F. 1990. Recovery of biosurfactants by ultrafiltration. Journal of

Chemical Technology and Biotechnology, 47, 23-29.

MULLIGAN, C.N. & GIBBS, B.F. 1993. Factors influencing the economics of biosurfactants. In: Biosurfactants: production, properties, applications. KOSARIC, N. ed., Marcel Decker Inc., New York, p. 392-371.

MULLIGAN, C.N., YONG, R.N., GIBBS, B.F., JAMES, S. & BENNETT, H.P.J. 1999. Metal removal from contaminated soil and sedimentsby the biosurfactant surfactin. Environmental Science &

Technology, 33, 3812-3820.

MULLIGAN, C.N. 2005. Environmental applications for biosurfactants. Environmental Pollution, 133, 183-198.


45

MUKHERJEE, S., DAS, P. & SEN, R. 2006. Towards commercial production of microbial surfactants. Trends in Biotechnology, 24, 509-515.

NAVON-VENEZIA, S. ZOSIM, Z. GOTTLIEB, A. LEGMANN, R. CARMELI, S. RON, E.Z. & ROSENBERG, E. 1995. Alasan, a new bioemulsifier from Acinetobacter radioresistens. Applied and


NEILSON, J.W., ARTIOLA, J.F. & MAIER, R.M. 2003. Characterization of lead removal from contaminated soils by Journal of environmental quality, 32, 899-908.

NENDZA, M. & SEYDEL, J.K. 1988. Quantitative structure-toxicity ralationships for ecotoxicologically relevant biotest systems and chemicals. Chemosphere, 17, 1585-1602.

NEU, T.R., HAERTNER, T. & PORALLA, K. 1990. Surface active properties of viscosin: A peptidolipid antibiotic. Applied Microbiology and Biotechnology, 32, 518-520.

NEVES, C.H. 2002. Estudo do processo produtivo do poliestireno utilizando água como agente de expansão física. Dissertação de mestrado. Universidade Federal de Santa Catarina, Florianópolis, Santa Catarina.

NITSCHKE, M. & PASTORE, G.M. 2002. Biossurfactantes: Propriedades e Aplicações. Química

Nova, 25, 772-776.

NITSCHKE, M. & PASTORE, G.M. 2003. Biossurfactantes a partir de resíduos agroindustriais. Biotecnologia Ciência & Desenvolvimento, 31, 63-67.

PARK, J.-W. & BOYD, S.A. 1999. Sorption of chlorobiphenyls in sediment –water systems containing nonionic surfactants. Journal of environmental quality, 28, 945-952.

PENTEADO, J.C., EL SEOUND, O.A. & CARVALHO, L.R.F. 2006. Alquilbenzeno sulfonato linear: uma abordagem ambienta e analítica. Química Nova, 29, 1038-1046.

PEYPOUX, F., MICHEL, G. & DELCAMBE, L. 1976. Structure of la mycosubtiline, antibiotique isolé de Bacillus subtilis. European Journal of Biochemistry, 63, 391-398.

PEYPOUX, F., POMMIER, M.T., DAS, B.C., BESSON, F., DELCAMBE, L. & MICHEL, G. 1984. Structures of Bacillomycim D and Bacillomycim L peptidolipid antibiotics from Bacillus subtilis.

Journal of Antibiotics, 77, 1600-1604.

PETERS, R.W. 1999. Chelant extraction of heavy metals from contaminated soils. Journal of

hazardous Materials, 166, 151-210.


46

PIRRÔLO, M.P.S. 2006. Estudo da produção de biossurfactantes utilizando hidrocarbonetos. Dissertação de Mestrado, Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Rio Claro, São Paulo.

POREMBA, K., GUNKEL, W., LANG, S. & WAGNER, F. 1991. Marine biosurfactants, III. Toxicity testing with marine microorganisms and comparison with synthetic surfactants. Zeitschrift für

Naturforschung, 46, 210–216.

QIN, F., SHAN, X. & WEI, B. 2004. Effects of low-molecular-weight organic acids and residence time on desorption of Cu, Cd and Pb from soils. Chemosphere, 57, 253-263.

RAU, U., MANZKE, C., WAGNER, F. 1996. Influence of substrate supply on the production of sophorose lipids by Candida bombicola ATCC 22214. Biotechnology Letters, 18, 149–154.

REDDY, K.R. & CHINTHAMREDDY, S. 2000. Comparison of extractants for removing heavy metals from contaminated clayey soils. Soil and Sediment Contamination, 9, 449-462.

REISER, J.; KOCH, A.K.; JENNY, K. & KAPPELI, O. 1998. Structure, properties, and production of biosurfactants. In: Advances in Applied Biotechnology Series, v.3: Biotechnology for aerospace applications. ORINGER, J.W.; TILLINGUEST, H.S. eds., Gulf Publishing Company, London, p. 85-97.

REILING, H.E., THANEI-WYSS, U., GUERRA-SANTOS, L.H., HIRT, R. KÄPPELI, O. & FIECHTER, A. 1986. Pilot plant production of rhamnolipid biosurfactant by Pseudomonas aeruginosa. Applied

Environmental and Microbiology, 51, 985-989.

RENKEN, A. & HUNKELER, D., 1999. Effect of the surfactant blend composition on the properties of polymerizing acrylamide-based inverse-emulsion: characterization by small angle neutron scattering and quasi-elastic light scattering. Polymer, 40, 3545-3554.

RETEUNA, C., VASSEUR, P. & CABRIDENC, R. 1989. Performances of three bacterial assays in toxicity assessment. Hydrobiologia, 188, 149-153.

ROSEN, M.J. 2004. Surfactants and interface phenomena. 2nd Ed. John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, New Jersey, NY.

ROSENBERG, E., RUBIONVITZ, C., LEGMANN, R. & RON, E. Z. 1993. Exploiting microbial growth on hydrocarbon – new markets. Trends Biotechnology, 11, 419-424.


47

ROSENBERG, E., RUBINOVITZ, C., GOTTLIEB, A., ROSENHAK, S. & RON, Z.E. 1988. Production of biodispersan by Acinetobacter calcoaceticus A2. Applied and Environmental

Microbiology, 54, 317-322.

ROSENBERG, E. & RON, E.Z. 1999. High- and low-molecular-mass microbial surfactants. Applied

Microbiology and Biotechnology, 52, 154-162

SAICHEK, R.E. & REDDY, K.R. 2005. Electrokinetically enhanced remediation of hydrophobic organic compounds in soils: a review. Critical Reviews in Environmental Science and Technology, 35, 115–192.

SCHLEHECK, D. 2003. Biodegradation of synthetic surfactants: linear alkylbenzenesulfonates (LAS) and related compounds. Doctor of Natural Sciences. University of Konstanz, Germany.

SEN, R. & SWAMINATHAN, T. 2004. Response surface modeling and opitimization to elucidate the effects of inocullum age and size on surfactin production. Biochemical Engineering Journal, 21, 141-148.

SEN, R. & SWAMINATHAN, T. 2005. Characterization of concentration and purification parameters and operating conditions for the small-scale recovery of surfactin. Process Biochemistry, 40, 2953-2958.

SHABTAI, Y. & GUTNIK, D.L. 1986. Enhanced emulsan production in mutants of Acinetobacter

calcoaceticus RAG-1 selected for resistence to cetyltrimethylammonium bromide. Applied and


SHAH, V., DONCEL, G. F., SEYOUM, T., EATON, K. M., ZALENSKAYA, I., HAGVER, R., AZIM, A. & GROSS, R. 2005. Sophorolipids, microbial glycolipids with anti-human immunodeficiency virus and sperm-immobilizing activities. Antimicrobial Agents Chemotherapy, 49, 4093-4100.

SHAH, V., JURJEVIC, M. & BADIA, D. 2007. Utilization of Restaurant Waste Oil as a Precursor for Sophorolipid Production. Biotechnology Progress, 23, 512-515.

SCHOLZ, C., MEHTA, S., BISHT, K., GUILMANOV, V., KAPLAN, D., NICOLOSI, R. & GROSS, R. 1998. Bioactivity of extracellular glycolpids: Investigation of potential anti-cancer activity of sophorolipids and sophorolipid derivatives. Proc. Am. Chem. Soc. Polym. Preprints 39, 168-169.

SHEPPARD, J.D. & COOPER, D.G. 1990. The effect of biosurfactant on oxigen transfer in a cyclone column reactor. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 48, 325- 336.


48

SHIN, M., UMEBAYASHI, Y., KANZAKI, R. & ISHIGURO, S.-I. 2000. Formation of copper(II) thiocyanato and cadmium(II) iodo complexes in micelles of nonionic surfactants with varying poly(ethylene oxide) chain lengths. Journal of Colloid and Interface Science, 225, 112-118.

SHIN, M., BARRINGTON, S.F., MARSHALL, W.D. & KIM, J.-W. 2005. Simultaneous soil Cd and PCB decontamination using a Surfactant/ligand solution. Journal of Environmental Science and

Health, 39, 2783-2798.

SILVA, E.C. & SOARES, I.C. 1996. Tecnologia de emulsões. Cosmetics & Toietries (ed. Port.), 8, 37-46.

SINGH, A., VAN HAMME, J.D. & WARD, O.P. 2006. Surfactants in Microbiology and biotechnology: Part 2. Application aspects. Biotechnology Advances, 25, 99–121.

TAN, H., CHAMPION, J.T., ARTIOLA, J.F., BRUSSEAU, M.L. & MILLER, R.M. 1994. Complexation of cadmium by a rhamnolipid biosurfactant. Environmental Science & Technology, 28, 2402–2406.

TIEHM, A.1994. Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in the presence of synthetic surfactants. Applied and Environmental Microbiology, 60, 258–263.

TULOCH, A. P., HILL, A., SPENCER, J.F.T. 1968. Structure and relations of lactonic and acidic sophorosides of 17-hydroxyoctadecanoic acid. Canadian Journal of Chemistry, 46, 3337-3351.

UCHIDA, Y, TSUCHIYA, R, CHINO, M, HIRANO, J. & TABUCHI, T. 1989. Extracellular accumulation of mono- and di-succinoyl trehalose lipids by a strain of Rhodococcus erythropolis grown on n-alkanes. Agricultural and Biological Chemistry, 53, 757-763.

UDDIN, M.S. & KATHIRESAN, M. 2000. Extraction of metal ions by emulsion liquid membrane using bi-functional surfactant: equilibrium and kinetic studies. Sep. Purif.Technol. 19, 3-9.

UMEBAYASHI, Y., SHIN, M. & ISHIGURO, S.-I. 1997. Thiocyanato and iodo complexation of cadmium(II) ions in micellar solutions of a nonionic surfactant Triton X-100. Journal of Colloid and

Interface Scienc, 191, 391-397.

UMEBAYASHI, Y., SHIN, M., KANZAKI, R. & ISHIGURO, S.-I. 2001. Thermodynamics of [Co(NCS)4]2- at poly(ethylene oxide) and octylphenyl moieties in micelles of nonionic surfactants. Journal of Colloid and Interface Science. 237, 167-173.

VAN BEELEN, P. & DOELMAN, P. 1997. Significance and application of microbial toxicity tests in assessing ecotoxicological risks of contaminants in soil and sediments. Chemosphere, 34, 455-499.


49

VAN BENSCHOTEN, J. E., MATSUMOTO, M. R. & YOUNG, W. H. 1997, Evaluation and Analysis of Soil Washing for Seven Lead Contaminated Soils. Journal of Environmental Engineering, 123, 217-224.

VAN GINKEL, C.G. 1996. Complete degradation of xenobiotic surfactants by consortia of aerobic microorganisms. Biodegradation, 7, 151-164.

VAN HAMME, J.D., SINGH, A. & WARD, O.P. 2006. Surfactants in microbiology and biotechnology: Part 1. physiological aspects. Biotechnology Advances, 24, 604-620.

VATER, J., KABLITZ, B., WILDE, C., FRANKE, P., MEHTA, N. & CAMEOTRA, S.S. 2002. Matrix-assisted laser desortion ionization-time of flight mass spectrometry of lipopeptide biosurfactants in whole cells and culture filtrates of Bacillus subtilis C-1 isolated from petroleum sludge. Applied and


ZHAO, B., ZHU, L., LI, W. & CHEN, B. 2005. Solubilization and biodegradation of phenanthrene in mixed anionic–nonionic surfactant solutions. Chemosphere, 58, 33-40.

ZHOU, Q.H., KLEKNER, V. & KOSARIC, N., 1992. Production of sophorose lipids by Torulopsis

bombolica from safflower oil and glucose. Journal of the American Oil Chemists’ Society, 69, 89–91.

ZIQING OU. 2000. Separate and combined environmental behaviour of surfactants and polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH’s). Tese de Doutorado. Institute of Ecological Chemistry, GSF-Research Center for Environment and Health, Neuherberg, Germany.

YAKIMOV, M.M., KRÖGER, A., SLEPAK, T.N., GIULANO, L., TIMMIS, K.N. & GOLYSHIN, P.N. 1998. A putative lichenysin A synthetase operon in Bacillus licheniformis: initial characterization. Biochimica et Biophysica Acta, 1399, 141–153.

WASAY, S.A., BARRINGTON, S. & TOKUNAGA, S. 2000. Organic acids for the in situ remediation of soils polluted by heavy metals:soil flushing in columns. Water, Air & Soil Pollution, 127, 301-314.

WASAY, S.A., BARRINGTON, S.F. & TOKUNAGA, S. 1998. Remediation of soils polluted by heavy metal using salts of organic acids and chelating agents. Environmental Technology, 19, 369-380.

WOODS JR. & CHARLES E. 2004. Examination of the effects of biosurfactant concentration on natural gas hydrate formation in seafloor porous media. Dissertação de Mestrado. Mississippi State University, 28p.


50

CAPÍTULO 2 CARACTERIZAÇÃO ESTRUTURAL E FÍSICO-QUÍMICA DE

SURFACTANTES BACTERIANOS

2.1. RESUMO

Surfactantes são compostos com propriedades tensoativas que possuem grupos

hidrofílicos e hidrofóbicos. Os biossurfactantes têm sido amplamente pesquisados, dada a

tendência de substituição dos produtos sintéticos por biológicos em aplicações industriais e

ambientais. Este trabalho teve como objetivo a caracterização estrutural e físico-química de

biossurfactantes produzidos por bactérias isoladas de ambientes contaminadas com petróleo e

derivados. Os biossurfactantes produzidos pelos isolados Bacillus sp. LBBMA 111A (mistura de

surfactina, fengicina e iturina), Bacillus subtilus LBBMA 155 (surfactina) e Arthrobacter oxydans

LBBMA 201 (artrofactina) foram purificados e quimicamente caracterizados com o uso de técnicas

de Espectrometria de Massas, Infravermelho e Ressonância Magnética Nuclear. Os

biossurfactantes produzidos por Flavobacterium sp. LBBMA 168 e Dietzia maris LBBMA 191 foram

purificados, mas não puderam ser quimicamente caracterizados. A atividade interfacial dos

surfactantes purificados foi avaliada e a concentração micelar crítica (CMC) foi estimada por

quantificação da tensão superficial pelo método de du Nouy. Os valores de CMC apresentados

pelos biossurfactantes LBBMA 111A, LBBMA 155, LBBMA 168, LBBMA 191 e LBBMA 201 foram

de 150 mg L-1, 180 mg L-1, 200 mg L-1, 150 mg L-1 e 200 mg L-1, respectivamente. Os

biossurfactantes apresentaram alta capacidade para formarem emulsões consideradas estáveis

com petróleo, tolueno, hexano, querosene e hexadecano, uma vez que seus volumes, 24 horas

após a formação, ainda correspondiam a 50 % ou mais do volume original. A avaliação da

estabilidade dos biossurfactantes purificados foi realizada frente a variações de pH, temperatura e


51

força iônica (NaCl), quanto à estabilidade da emulsão formada e à variação da atividade interfacial,

utilizando-se o parâmetro tensão superficial referente à CMC. Os surfactantes LBBMA 111A,

LBBMA 155, LBBMA 168, LBBMA 191 e LBBMA 201 mostraram-se termo-estáveis na faixa de 20-

70°C, estáveis em valores de pH acima de 5,0 e resistentes à presença de até 5% de NaCl.

Quando comparados a alguns surfactantes sintéticos, como o SDS®, os biossurfactantes obtidos

neste trabalho apresentaram excelentes propriedades tensoativas, pois além de reduzirem a

tensão superficial para valores abaixo de 40 mN m-1, foram capazes de promover a emulsificação

de petróleo, querosene e hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos puros. Estas propriedades tornam

esses biossurfactantes adequados para uma ampla gama de aplicações industriais e em processos

de remediação de ambientes contaminados com poluentes orgânicos.

Palavras-chave: Surfactante; SDS; Purificação; CMC; Estabilidade de emulsão.

Capítulo 2. Introdução

52

2.2. INTRODUÇÃO

A maioria dos surfactantes disponíveis comercialmente é sintetizada a partir de derivados

de petróleo. Com o aumento da preocupação entre os consumidores, combinada com novas

legislações de controle ambiental, o interesse em biossurfactantes tem aumentado

significativamente em decorrência de serem naturalmente biodegradáveis e de baixa toxicidade,

diminuindo assim o impacto ambiental (BARROS et al., 2007).

Os surfactantes possuem estruturas moleculares com grupos hidrofílicos e hidrofóbicos, os

quais determinam propriedades como detergência, emulsificação, lubrificação, ação espumante,

capacidade molhante, solubilização e dispersão de fases. Estas moléculas são categorizadas em

quatro grupos: catiônicos, aniônicos, não-iônicos e zwiteriônicos (anfotéricos). Esta classificação é

baseada na natureza do grupo hidrofílico. A estrutura do grupo polar tem sido usada para

subcategorizar os biossurfactantes nas seguintes classes: glicolipídeos, lipopeptídeos,

fosfolipídeos, ácidos graxos, além de surfactantes poliméricos e surfactantes particulados

(CHRISTOFI & IVSHINA, 2002). Tensão superficial, estabilização de emulsão e balanço lipofílico-

hidrofílico (HLB) são usados como indicadores para atividade de surfactantes (MANEERAT, 2005).

Os biossurfactantes apresentam a vantagem de possuírem grande diversidade química,

possibilitando aplicações específicas para cada caso particular. Além disso, possuem

características estruturais e propriedades físicas distintas, que os tornam compatíveis ou superiores

aos surfactantes sintéticos, em termos de eficiência e efetividade. Outra vantagem reside no fato de

não serem compostos derivados de petróleo, fator importante à medida que aumentam os preços

desse produto. Além disso, a possibilidade de modificação da estrutura química e das propriedades

físicas dos biossurfactantes, através de manipulações genéticas, biológicas ou químicas, permite o

desenvolvimento de produtos para necessidade especificas (MULLIGAN, 2005).

A recuperação e concentração do biossurfactante dos meios de cultura é que irão

determinar a viabilidade da produção em larga escala. Geralmente, a baixa concentração e a

estrutura do biossurfactante limitam a extração. Diferentes métodos são usados nos processos de

extração, como a ultra-centrifugação, ultra-filtração, precipitação com ácido ou sal, extração por

solvente e adsorção em cromatografia. Uma grande variedade de solventes, a exemplo de hexano,


53

etanol, diclorometano, clorofórmio, éter etílico, acetona e metanol tem sido usada na forma pura ou

combinada nos processos de extração. As misturas mais efetivas são aquelas que utilizam

clorofórmio e metanol, que facilitam o ajuste de polaridade da molécula de biossurfactante que se

pretende extrair (MESQUITA, 2004).

A elucidação estrutural de biossurfactantes é baseada em espectroscopia de ressonância

magnética nuclear (NMR) e espectrometria de massa (MS). Atualmente, os progressos em técnicas

de purificação, como cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC) com fase reversa e a

disponibilidade de técnicas espectroscópicas melhoradas, como NMR, MS com bombardeamento

de átomos rápidos (FAB-MS) e, mais recentemente, MS - tempo de vôo – ionização/dessorção a

laser assistida por matriz (MALDI-TOF-MS), têm demonstrado que novas estruturas de

biossurfactantes podem ser determinadas em tempos relativamente curtos e com o uso de

amostras muito pequenas (BODOUR et al., 2004).

As estruturas de biossurfactantes produzidos por diferentes espécies microbianas vêm

sendo elucidadas com o uso das técnicas atualmente disponíveis. Assim, compostos

bioemulsificadores produzidos por Pseudomonas putida ML2 foram purificados por cromatografia

de filtração gélica e cromatografia de camada fina (TLC) e, a seguir, as estruturas determinadas por

meio de técnicas bidimensionais de NMR (BONILA et al., 2005). Outros autores isolaram

flavolipídeos de culturas de Flavobacterium sp. MTN11 com o uso de cromatografia líquida (LC) e

TLC e identificaram as estruturas por técnicas de FAB-MS e MALDI-TOF-MS e NMR (BODOUR et

al., 2004). Soforolipídeos podem ser purificados em HPLC e TLC e as estruturas determinadas por

espectroscopia de NMR (1H e 13C) e cromatografia gasosa (GC) acoplada a MS (ASMER et al.,

1988).

Este trabalho teve como objetivo a caracterização estrutural e físico-química de

biossurfactantes produzidos por bactérias isoladas de ambientes contaminadas com petróleo e

derivados, visando à obtenção de estruturas moleculares promissoras a serem aplicadas em

processos industriais e biotecnológicos.

Capítulo 2. Material e Métodos

54

2.3. MATERIAL E MÉTODOS

2.3.1. Microrganismos

Cinco isolados bacterianos previamente selecionados como produtores de biossurfactantes

entre os pertencentes à coleção de culturas de microrganismos do Laboratório de Biotecnologia e

Biodiversidade para o Meio Ambiente (LBBMA) foram utilizados em estudo das características

estruturais e das propriedades físico-químicas das moléculas de biossurfactantes por eles

produzidos no meio de crescimento.

Os isolados Bacillus sp. LBBMA 111A, Bacillus subtilus LBBMA 155, Dietzia maris LBBMA

191 e Arthrobacter oxydans LBBMA 201 foram cultivados no meio mineral (MM) M1 (LIMA, 2003)

(ANEXO 1), enquanto que o isolado Flavobacterium sp. LBBMA 168 foi cultivado no meio mineral

(MM) descrito por BODOUR & MAIER (1998) (ANEXO 1).

2.3.2. Condições de Cultivo e Produção dos Biossurfactantes

Os isolados foram reativados em meio R2A (REASONER & GELDREICH, 1985) por 18

horas. Frascos erlenmeyer de 1,0 L contendo 500 mL do meio mineral suplementado com glicose a

2% (p v-1) e hexadecano a 2% (v v-1) (adicionado após o esgotamento da glicose), foram inoculados

com um volume de inóculo suficiente para se obter uma densidade ótica a 600 nm correspondente

a 0,02. Os frascos foram incubados sob temperatura de 30 °C e agitação constante de 200 rpm,

por sete dias. O consumo da glicose disponível foi avaliado a cada 3 horas pelo reagente GOD-

PAP (Merck System, Darmstadt, Germany). O isolado Flavobacterium sp. LBBMA 168 foi cultivado

em meio contendo somente a glicose como fonte de carbono, sob as mesmas condições de

incubação dos demais isolados.

A produção de biossurfactantes foi avaliada no sobrenadante, obtido após centrifugação a

12.000g por 20 minutos, pelo método do anel de du Nouy (COOPER et al., 1979), utilizando-se um

tensiômetro (Fisher Surface Tensiomat, Modelo 21, Pittsburgh, EUA).


55

2.3.3. Extração e Purificação dos Biossurfactantes

A purificação e o isolamento dos biossurfactantes produzidos foram realizados após a

remoção das células do meio por centrifugação (12.000 g, 20 minutos, 25 °C), seguida de filtração

em membrana de 0,45 μm. A extração primária dos biossurfactantes LBBMA 111A, LBBMA 155 e

LBBMA 201 foi realizada por precipitação ácida, ajustando-se o pH do meio para 2,0 com HCl 12

mol L-1, seguindo-se incubação a 4°C “overnight”. Os biossurfactantes precipitados foram

recuperados por centrifugação (12.000 g, 20 minutos, 20°C) (VATER et al., 2002) e dissolvidos em

água pH 7,0. O biossurfactante LBBMA 168 foi recuperado com o uso de célula de ultra-filtração

(modelo Amicon), munida de membrana com limite de exclusão de 1.000 Daltons (LIN et al. 1998).

Os biossurfactantes nos extratos semi-purificados foram extraídos utilizando-se

combinação de clorofórmio e metanol (CHCl3:CH3OH:extrato 2:1:3). Após evaporação dos

solventes em evaporador rotativo, os extratos foram submetidos à cromatografia de camada

delgada (CCD) em placas de sílica gel 60 F254 (VETEC). As moléculas de biossurfactantes foram

eluídas com os sistemas CHCl3/CH3OH/H2O (65:15:1 v v-1) ou CHCl3/CH3OH (60:40 v v-1), para

verificação da pureza dos compostos presentes nos extratos brutos. Os componentes plotados nas

placas de CCD foram visualizados sob lâmpada UV (254 nm) e revelados pela aplicação de

ninhidrina a 0,2% (p v -1) (Riedel de Haen, Seelze, Germany) ou H2SO4 a 3 mol L-1 (v v-1), seguida

do aquecimento das placas a 100°C por 5 minutos (HOROWITZ et al., 1990). A ninhidrina foi

utilizada como revelador específico para grupos amino e o ácido sulfúrico para verificar a presença

de outros componentes possivelmente presentes nos extratos brutos (HOROWITZ et al., 1990).

As frações impuras foram fracionadas em cromatografia de camada delgada preparativa

(CCDP) e eluídas com o sistema CHCl3/CH3OH/H2O (65:15:1 v v-1), para separação dos compostos

presentes nas misturas. Para isso, utilizou-se placa de sílica gel 60 F254 (VETEC), com revelação

sob luz UV. As bandas correspondentes aos biossurfactantes foram coletadas, ressuspendidas

com a mesma fase móvel e submetidas à evaporação em evaporador rotativo. A separação dos

biossurfactantes foi confirmada por CCD, nas condições descritas acima. Os biossurfactantes

purificados foram devidamente pesados, quantificados e submetidos às análises para determinação

de sua composição química.


56

2.3.4. Análise da Composição Química dos Biossurfactantes

2.3.4.1. Espectroscopia de Infravermelho (FT-IR)

Amostras dos biossurfatantes purificados foram submetidas à espectroscopia de

infravermelho com transformada de Fourier (FT-IR), utilizando um espectrômetro Perkin Elmer FT-

IR modelo Spectrum One. As amostras foram solubilizadas em um pequeno volume de clorofórmio

e aplicadas em pastilha de cloreto de sódio. Após evaporação do solvente em ambiente livre de

umidade, o espectro foi gerado entre 500-4000 cm-1 com resolução de 4 cm-1.

2.3.4.2. Espectrometria de Massa - Ionização/Dessorção a Laser Assistida por Matriz

com Tempo de Vôo- (MALDI-TOF-MS)

Um espectrômetro de massas MALDI-TOF (Bruker Daltonics Reflex) equipado com um

laser de nitrogênio (λ: 337 nm) foi usado para determinação do peso molecular dos

biossurfactantes purificados. Para análise, a amostra de biossurfactante purificado foi eluída com

10 μL de solução matriz (ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico em acetonitrila 70% contendo 0,1% de

TFA). A mistura resultante (1 μL) foi adicionada à placa alvo de alumínio MTP 384 (Bruker

Daltonics), seca ao ar e submetida à análise para obtenção dos espectros (VATER et al., 2002).

2.3.4.3. Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN)

As amostras de biossurfactantes purificados (20,0 mg) foram solubilizadas em 0,4 mL de

clorofórmio deuterado (CDCl3) e acondicionadas em tubos de vidro de 5 mm de diâmetro externo

(BODOUR et al., 2004). Os espectros convencionais de uma dimensão, RMN de 1H e 13C, foram

adquiridos em espectrômetro Varian Mercury modelo 300 (Palo Alto, Califórnia, USA), operando na

freqüência de 300 MHz FT-NMR.

2.3.5. Interpretação dos Dados Espectrométricos e Espectroscópicos

Com base nas informações estruturais obtidas pelos métodos espectrométricos e

espectroscópicos, foi definida a classe de grupo funcional à qual o biossurfactante pertence e a


57

estrutura total ou parcial do composto. Após uma pesquisa na literatura, as propriedades do

composto foram comparadas com compilações existentes de dados publicados para todos os

compostos de biossurfactantes já estudados. Os dados espectrais foram comparados com

espectros-referência obtidos de compostos conhecidos.

2.3.6. Caracterização Físico-Química dos Biossurfactantes Purificados

2.3.6.1. Concentração Micelar Crítica (CMC)

A CMC dos biossurfactantes purificados foi estimada pela medição da tensão superficial

pelo método do anel de du Nouy (COOPER et al., 1979). As diluições do biossurfactante foram

preparadas em água deionizada, sendo a tensão superficial das diluições do biossurfactante

quantificada em tensiômetro (Fisher Scientific, Pittsburgh, EUA). A CMC foi estimada após a

elaboração de gráficos de tensão superficial versus diluição do biossurfactante, como o recíproco

da diluição micelar crítica, na qual a tensão superficial começa a aumentar (COOPER et al., 1979).

Essa avaliação foi realizada com duas repetições para cada biossurfactante, sendo que cada

repetição foi avaliada em duplicata.

2.3.6.2. Atividade de Emulsificação e Estabilidade da Emulsão

A avaliação da capacidade de emulsificação de hidrocarbonetos líquidos, puros ou em

misturas (querosene, petróleo, hexadecano, hexano ou benzeno), foi realizada utilizando-se os

biossurfactantes purificados e segundo a metodologia descrita por COOPER & GOLDENBERG

(1987). Soluções dos biossurfactantes (2 mL) em concentração equivalente a 2CMC foram

misturadas a 2 mL do hidrocarboneto em um tubo de vidro de 100 mm X 15 mm. A mistura foi

agitada por dois minutos em tubo vedado com Parafilm (American National Can TM) e deixada em

repouso por dois minutos, medindo-se a seguir o volume da emulsão formada. A estabilidade da

emulsão foi avaliada em intervalos de tempo até 48 h após o início do ensaio. O índice de

emulsificação (E %) foi determinado medindo-se a altura da camada emulsionada (cm), dividindo-

se a mesma pela altura total do líquido e multiplicando-se o valor obtido por 100.


58

A emulsão foi considerada estável se seu volume, 24 horas após a sua formação,

correspondesse a 50 % ou mais de seu volume original (WILLUMSEM & KARLSON, 1997).

As emulsões formadas pelos biossurfactantes foram comparadas às formadas pelo

surfactante sintético SDS®, a uma concentração de 0,5% (p v-1) em água deionizada. Essa

concentração de SDS® foi escolhida por ser maior do que a sua concentração micelar crítica,

estimada em 0,18% (BODOUR & MAIER 1998). As avaliações foram realizadas com duas

repetições para cada biossurfactante.

2.3.6.3. Determinação do Efeito da Salinidade na Atividade dos Biossurfactantes

O efeito da salinidade sobre a atividade dos biossurfactantes foi investigado. Os

biossurfactantes foram dissolvidos em água deionizada contendo concentração de NaCl variando

entre 0,5 a 20% p v-1 (ILORI et al., 2005), seguindo-se avaliação da CMC e obtenção do índice de

emulsificação.

2.3.6.4. Determinação do Efeito da Temperatura na Atividade dos Biossurfactantes

A atividade dos biossurfactantes foi avaliada em temperaturas variando de 20 a 80°C, a fim

de se determinar a influência dessa variável sobre as características CMC e emulsificação.

Amostras dos biossurfactantes foram diluídas em água deionizada e mantidas em diferentes

temperaturas (ILORI et al., 2005), seguindo-se avaliação da CMC e obtenção do índice de

emulsificação.

2.3.6.5. Determinação do Efeito do pH na Atividade dos Biossurfactantes

O efeito do pH na atividade dos biossurfactantes foi avaliado por meio da mudança do pH

(5,0-9,0) da solução de biossurfactante, segundo o protocolo de ILORI et al. (2005), seguida da

realização da medida da CMC e do ensaio de emulsificação.

Capítulo 2. Resultados e Discussão

59

2.4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

2.4.1. Caracterização Estrutural dos Biossurfactantes

2.4.1.1. Caracterização da Composição Química dos Surfactantes Produzidos por

Bacillus sp. LBBMA 111A

O extrato bruto (140 mg L-1) contendo os surfactantes produzidos por Bacillus sp. LBBMA

111A, obtido após extração líquido-líquido, foi submetido à cromatografia de camada delgada

(CCD). Sob lâmpada UV, a placa de CCD apresentou três manchas que foram reveladas com

ninhidrina, indicando a presença de grupos aminos nos compostos presentes na amostra. A

amostra foi submetida a análises de IV, RMN de H1 e Espectrometria de Massas por MALDI-TOF

para determinação da composição química dessas moléculas.

Após confirmação da mistura de compostos, a fração impura foi fracionada por

cromatografia em camada delgada preparativa (CCDP) e eluída em misturas de clorofórmio e

metanol. Após recuperação das amostras da placa de CCDP, realizou-se a CCD. A revelação sob

luz UV permitiu a visualização de três manchas na placa de CCD, amostra 1 (Rf=0,61), amostra 2

(Rf=0,66) e amostra 3 (Rf=0,72), correspondentes a diferentes compostos e que foram analisadas

em MS-MALDI-TOF para determinação de suas respectivas massas moleculares (Figura 2.1).

P 1 2 3

Figura 2.1. Cromatografia de camada delgada (CCD)

realizada em placa de sílica gel 60 F254 e eluído com

CHCl3/CH3OH (60:40 v v-1). P= Surfactante padrão

Surfactina (SIGMA) (Rf=0,55).


60

N C

H O

N H

C H

A Figura 2.2 mostra o espectro no FT-IV da mistura de surfactantes produzidos por Bacillus

subtilus LBBMA 111A. Pode-se observar banda característica de peptídeos a 3304 cm-1 referente

ao estiramento da ligação N-H. Em 3071 cm-1 foi observada uma banda característica de OH de

ácido carboxílico. As bandas de absorção nas freqüências de 2956 a 2854 cm-1 são referentes a

cadeias alifáticas. A banda em 1722 cm-1 refere-se à absorção de grupo carbonila de anel lactona.

Em 1644 cm-1, observa-se o estiramento da ligação C=O e em 1538 cm-1 a deformação angular de

NH combinado com o estiramento da ligação C-N. Estes resultados indicam que a amostra

analisada contém cadeia alifática bem como uma porção peptídica. O espectro no IR obtido da

amostra analisada mostrou-se muito semelhante ao obtido com a surfactina padrão (SIGMA) por

NITSCHKE (2004).

Figura 2.2. Espectro no IR da mistura de surfactantes produzidos por Bacillus sp. LBBMA 111A.

1644

1538

2956

2854

3071

1722

3304 CO

O

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0

20

40

60

80

100

120

Abso

rvân

cia

Comprimento de onda (cm-1)


61

A análise por RMN de H1 (300 MHz, CDCl3) confirmou que as moléculas em estudo são

lipopeptídeos (Figura 2.3). O espectro mostrou um dupleto em δ=0,8 referente ao grupo (CH3)2-

CH, indicando a ligação terminal no componente de ácido graxo (SØRENSEN, 2002). O sinal entre

δ1,2-1,6 referente a CH2 indica presença de cadeia alifática longa. Os sinais em δ 7,2 a 8,0 ppm

são devidos aos grupos amida (N-H). Os sinais de hidrogênios α de aminoácidos podem ser

observados entre 4-5 ppm.


62

Figura 2.3. Espectro de RMN de H1 da (A) mistura de surfactantes produzidos por Bacillus sp.

LBBMA 111A (este trabalho) e (B) da amostra padrão de surfactina (SIGMA). Fonte: WEI & CHU

(1998).

(B)

C H CH 2 9

CαH2C CH2 CO

C OHNHs de aminoácidos Hα s de aminoácidosC CH O

O

C

H3C

H3C


63

O espectro de massas da mistura de surfactantes produzidos por Bacillus sp. LBBMA 111A,

obtido por MALDI-TOF, revelou a presença de grupos de sinais com valores de m/z entre 1030-

1060, 1070-1150 e 1450-1550. Os grupos de sinais podem ser atribuídos às formas protonadas

dos biossurfactantes surfactina, iturina e fengicina, além de seus adutos de Na+ e K+ (Tabela 2.1).

Após eluição da mistura de surfactantes em CCDP, três frações foram obtidas e

submetidas à análise de EM por MALDI-TOF. As moléculas com m/z 1036,11, 1044,19 e 1058,2

foram predominantes na fração 01 de biossurfactante (Tabela 2.1), sendo que a forma mais

abundante foi a com m/z 1058,2, correspondente à surfactina de massa molecular 1035 Da. Esta

molécula apresenta em sua composição um heptapeptídeo, uma cadeia alifática contendo 15

átomos de carbono, juntamente com um íon Na+. Além deste sinal, a molécula 1036,11 Da

apresenta-se na sua forma protonada (H+) e adicionada do íon K+ = 1074,2. A presença dos adutos

de sódio e potássio predomina na amostra, enquanto que as espécies protonadas aparecem em

menor intensidade, dado similar ao obtido por KOUMOUTSI et al. (2004).

O espectro de massas MALDI-TOF da fração 02 mostrou que as espécies com massa

1093,15, 1105,80 e 1121,10 foram os íons predominantes, os quais correspondem às massas de

íons [M+Na]+ do lipopeptídeo iturina, com cadeias de ácidos graxos de 16 ou 17 átomos de carbono

na cadeia lipídica. Os picos predominantes no EM são similares aos obtidos por VATER et al.

(2002).

As espécies com m/z 1461,80, 1475,8, 1485,28, 1499,8 e 1515,8 foram os íons

predominantes na fração 03 e podem ser atribuídos a homólogos de fengicina contendo uma

cadeia de ácidos graxos de 16 e 17 átomos de carbono. A forma mais abundante foi a de m/z

1485,28, correspondente a um aduto de Na+ de uma isoforma de 16 átomos de carbono. O outro

íon com m/z 1475,8 é uma forma protonada de uma isoforma de 17 átomos de carbono. Os picos

predominantes no EM são similares aos obtidos por VATER et al. (2002).


64

Tabela 2.1. Dados obtidos por espectrometria de massas MALDI-TOF dos principais

homólogos dos surfactantes (surfactina, iturina e fengicina) produzidos

por B. subtilis LBBMA 111A, após separação por CCDP.

FRAÇÃO SINAL PRINCIPAL (m/z) (Da) HOMÓLOGO

01 1036,11 C15 surfactina, [M+H]+

1044,19 C14 surfactina, [M+Na]+

1058,20 C15 surfactina, [M+Na]+

1074,20 C15 surfactina, [M+K]+

02 1070,50 C16 iturina, [M+H]+

1093,15 C16 iturina, [M+Na]+

1105,80 C17 iturina, [M+Na]+

1122,10 C17 iturina, [M+K]+

03 1461,80 C16 fengicina, [M+H]+

1475,80 C17 fengicina, [M+H]+

1485,28 C16 fengicina, [M+Na]+

1499,80 C17 fengicina, [M+Na]+

1514,90 C17 fengicina, [M+K]+

A partir dos resultados obtidos com as análises de IV, RMN de H1 e da comparação dos

dados de massas resumidos na Tabela 2.1 com os dados de massa molecular de outros

lipopeptídeos obtidos de outras linhagens de Bacillus (KAKINUMA et al., 1969; KOWALL et al.,

1998; LEENDERS et al., 1999; SCHNEIDER et al., 1999), os produtos lipopeptídicos de Bacillus sp.

LBBMA 111A puderam ser identificados como surfactinas, iturinas e fengicinas (Figura 2.4). Esses

compostos são peptídeos cíclicos anfifílicos contendo sete α-aminoácidos (surfactinas e iturinas) ou

dez α-aminoácidos (fengicinas) ligados a um ácido graxo β-hidroxi (surfactinas e fengicinas) ou um

ácido graxo β-amino (iturinas). O comprimento da cadeia de ácido graxo pode variar de C13 a C16

para surfactinas, de C14 a C17 para iturinas e de C14 a C18 para fengicinas, permitindo a existência

de diferentes compostos homólogos (AKPA et al., 2001; JACQUES et al., 1999).


65

L TyrL Ile

D Tyr

L

L Pro

L Glu

D Ala

D Allo ThrD Orm

HC

C

C

O

NHC

C

CNH NHC

C

N

C

C

NH

NH

C

NHOH

OH

NHC

H2N

CONH2

O

O

O

O

H

H

O

O

O

O

O

O OH

H

OHC13 C14

L Glu

O

H

Gln

OH

O

NHCNH

CC

C

OHC

CH

C

CH2

NH C

C

NH

C C

C

NH

C

NH

CNH

NH

NH

O

O

OO

O

O

OO

O

CH2 5CH2 n CHCH3

CH3

L Glu L Leu

D Leu

L Val

Asp

D LeuLeu

OOH

OHO

LL

A

Figura 2.4. Estrutura de (A) surfactina, (B) iturina e (C) fengicina produzidos por diversas linhagens

de Bacillus.

L Gln

L

L

Asn D

Pro D

Tyr L Asn C O

CH2

H CH2 n CH3

B

NH

C CH2 5 CH

CH3Asn L Ser


66

2.4.1.2. Caracterização da Composição Química do Surfactante Produzido por

Bacillus subtilis LBBMA 155

Para caracterização preliminar do surfactante LBBMA 155, foram realizados ensaios em

cromatografia de camada delgada (CCD) do extrato obtido (215 mg L-1). Dois sistemas eluentes

foram testados na CCD: um com caráter mais apolar, composto por CHCl3/CH3OH/H2O (65:15:1 v

v-1) e outro com caráter mais polar, composto por CHCl3/CH3OH (60:40 v v-1). Com o sistema

eluente mais polar, conseguiu-se o deslocamente da amostra e sua pureza foi constatada pela

presença de uma mancha com fator de retenção (Rf) de 0,56, enquanto que o padrão de surfactina

(SIGMA) apresentou um Rf de 0,55.

Analisando-se o espectro no IV da amostra contendo o biossurfactante LBBMA 155,

observa-se banda característica de peptídeos a 3309 cm-1 referente ao estiramento da ligação N-H.

Em 3069 cm-1 foi observada uma banda característica de OH de ácido carboxílico. A presença de

cadeia alifática (-CH3, -CH2) foi indicada pelas bandas de absorção nas freqüências de 2956 a 2854

cm-1. A banda em 1724 cm-1 refere-se à absorção de grupo carbonila de anel lactona. Em 1645 cm-

1 observa-se o estiramento da ligação C=O e em 1540 cm-1 a deformação angular de NH

combinado com o estiramento da ligação C-N. Estes resultados indicam que o biossurfactante

presente na amostra analisada contém cadeia alifática, bem como uma porção peptídica.

Comparando-se o espectro de IV do biossurfactante LBBMA 155 com o obtido com a surfactina

padrão (SIGMA) por NITSCHKE (2004), observam-se várias bandas em regiões semelhantes,

como na região 3300, 2900, 2800, 1700, 1600 e 1500 cm-1 (Figura 2.5).


67

Figura 2.5. Espectro no IR da amostra contendo o surfactante produzido por Bacillus subtilis

LBBMA 155.

A análise por RMN de H1 (300 MHz, CDCl3) confirmou que a molécula em estudo é um

lipopeptídeo (Figura 2.6). O espectro mostrou um dupleto em δ=0,8 para o grupo (CH3)2-CH,

indicando a ligação terminal no componente de ácido graxo. O sinal entre δ1,2-1,6 referente a CH2

indica a presença de uma cadeia alifática longa. Os sinais em δ 7,2 a 8,0 ppm são referentes aos

grupos amida (N-H). Os sinais de hidrogênios α de aminoácidos podem ser observados entre 4,3-

5,2 ppm. O espectro de RMN de H1 do surfactante produzido pelo isolado Bacillus subtilis LBBMA

155 mostrou-se muito semelhante ao obtido com a surfactina-padrão (SIGMA) por WEI & CHU

(1998) (Figura 2.6).

1645

1540

1724

CO

O

N C

H O

2854

3069

3309

2956

N H

C H

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0

20

40

60

80

100

A

bsor

vânc

ia



68

Figura 2.6. Espectro de RMN de H1 da (A) mistura de surfactantes produzidos por Bacillus subtilis

LBBMA 155 (este trabalho) e (B) da amostra padrão de surfactina (SIGMA). Fonte: WEI & CHU

(1998).

(B)

(A)

ppm

C H CH 2 9

C OHNHs de aminoácidosHα s de aminoácidos

C CH O

O

C

H3C

H3C

CαH2C CH2 CO


69

1060.277

1074.5591046.195

1030.115

1097.4021112.726

0

2

4

6

4x10

Inte

ns. [a.

u.]

950 1000 1050 1100 1150 1200 1250m/z

O EM determinado por MALDI-TOF da amostra contendo o biossurfactante produzido por

Bacillus subtilis LBBMA 155 apresenta como sinais predominantes os de m/z 1030,11, 1046,19,

1060,27 e 1074,45, indicando que as massas correspondem a moléculas homólogas de surfactina,

com ácidos graxos β-hidroxi C13, C14 e C15. A forma mais abundante foi a de m/z 1060,27,

corresponde à surfactina com massa molecular de 1035 Da e com cadeia alifática de C15

adicionada de seu aduto de Na+. Além deste sinal, a molécula aparece adicionada do íon K+ =

1074,2. O íon com m/z 1030,11 corresponde a um homólogo de surfactina com cadeia de ácido

graxo C13, juntamente com o seu aduto de Na+. O pico m/z 1046,19 corresponde à surfactina cuja

composição tem um heptapeptídeo e uma cadeia alifática contendo 14 átomos de carbono

adicionado de seu aduto de Na+ (Figura 2.7).

Figura 2.7. Espectro de MALDI-TOF-MS da amostra de surfactante produzido por Bacillus subtilis

LBBMA 155.


70

A co-produção de outros tipos de lipopeptídeos (iturinas, fengicinas) não foi detectada,

sugerindo que B. subtilis LBBMA 155 produz apenas um tipo de lipopeptídeo nas condições de

cultivo mantidas neste trabalho. Este fato pode representar uma vantagem, por reduzir os

problemas relacionados à purificação do biossurfactante.

2.4.1.3. Caracterização da Composição Química do Surfactante Produzido por

Arthrobacter oxydans LBBMA 201

A amostra de 142 mg L-1 do surfactante produzido por Arthrobacter oxydans LBBMA 201 foi

caracterizada preliminarmente por cromatografia de camada delgada (CCD). Após revelação da

placa com ninhidrina, apresentou uma banda com fator de retenção (Rf) 0,73, indicando a presença

de grupos amino no composto presente na amostra.

O espectro no infravermelho (IV) evidenciou a presença de banda característica de

peptídeo a 3310 cm-1, resultantes do estiramento da ligação N-H. Em 3050 cm-1, foi observada uma

banda característica de ácido carboxílico. A presença de bandas de absorção nas freqüências de

2970 a 2850 cm-1 e 1450 a 1380 cm-1, resultantes do estiramento de C-H, indica a presença de

cadeia alifática na molécula. A banda em 1730 cm-1 refere-se à absorção de grupo carbonila de

anel lactona. Em 1650 cm-1, observa-se o estiramento da ligação CO-N e em 1540 cm-1 a

deformação angular de NH, combinado com o estiramento da ligação C-N. Estes resultados

indicam que a amostra analisada contém cadeia alifática, bem como uma porção peptídica. O

espectro de IV obtido da amostra analisada (Figura 2.8) se revelou muito semelhante ao obtido

com o surfactante produzido por Arthrobacter sp. MIS38, o qual foi isolado e caracterizado por

MORIKAWA et al. (1993).


71

Figura 2.8. Espectro no IR da amostra contendo o surfactante produzido por Arthrobacter oxydans

LBBMA 201.

A análise por RMN de H1 (300 MHz, CDCl3) revelou inequivocamente que a molécula em

estudo é um lipopeptídeo (Figura 2.8). O espectro mostrou um dupleto em δ=0,8 para o grupo

(CH3)2-CH, indicando a ligação terminal no componente de ácido graxo. O sinal entre δ1,2-1,6,

referente a CH2, indica a presença de uma cadeia alifática longa. Os sinais em δ 7,2 a 8,0 ppm são

referentes aos grupos amida (N-H). Os sinais de hidrogênios α de aminoácidos podem ser

observados entre 4,3-5,2 ppm.

1650

N C

H O

3050

1730

3310 1540

1450 1380

2970

CO

O

N H

C H

C H

2850

4000 3500 3000 2500 2000 1500 1000 500

0

20

40

60

80

100

Abs

orvâ

ncia



72

Figura 2.9. Espectro de RMN de H1 da amostra contendo o surfactante LBBMA 201 produzido por

Arthrobacter oxydans LBBMA 201 à 30°C.

O EM determinado por MALDI-TOF obtido da amostra de surfactante produzido por

Arthrobacter oxydans LBBMA 201 demonstrou a predominância de uma molécula protonada de m/z

1355,11, o qual representa um lipopeptídeo que corresponde a uma molécula de peso molecular

1354 adicionada de sua forma protonada [H]+. Em comparação ao lipopeptídeo produzido por

Arthrobacter sp. MIS38 (MORIKAWA et al., 1993), conclui-se que o biossurfatante produzido por

Arthrobacter oxydans LBBMA 201 é o lipopeptídeo artrofactina (Figura 2.10).

ppm

C H CH 2 9

C OHNHs de aminoácidosHα s de aminoácidos

C CH O

O

C

H3C

H3C

CαH2C CH2 CO


73

Figura 2.10. Estrutura de artrofactina de Arhrobacter sp. MIS38. Adaptada de MORIKAWA et al.

(1993).

2.4.1.4. Análise de CCD dos Surfactantes Produzidos por Dietzia maris LBBMA 191

e Flavobacterium sp. LBBMA 168

As amostras dos compostos produzidos por Dietzia maris LBBMA 191 e Flavobacterium sp.

LBBMA 168 foram recuperadas a partir da CCDP e a pureza dos compostos ficou evidenciada

após análise dessas amostras em placas de CCD. A revelação da placa que continha a amostra

dos biossurfactantes produzidos por Dietzia maris LBBMA 191 apresentou duas manchas intensas

com Rf diferentes (0,4 e 0,18), enquanto que a placa que continha a amostra com os

biossurfactantes produzidos por Flavobacterium sp. LBBMA 168 apresentou apenas uma mancha

intensa com Rf=0,37. Porém, os compostos presentes nas placas não foram detectados quando

submetidos à revelação com ninhidrina (revelador utilizado para detectar a presença de grupos

amino). Com isso, podemos afirmar que os compostos produzidos Dietzia maris LBBMA 191 e os

produzidos por Flavobacterium sp. LBBMA 168 não pertecem à classe dos lipopeptídeos, pois os

mesmos foram revelados apenas quando utilizou-se o ácido sulfúrico-fenol.

HN

N

N

N

NH

NH

NH

O

O

O

OH

O

H

H

O

OH O

O

OH

O

O

O


74

2.4.2. Tensão superficial e Concentração Micelar Crítica (CMC) dos

Biossurfactantes Purificados

Segundo MULLIGAN & GIBBS (1993), a CMC dos biossurfactantes mais eficazes varia

entre 1-200 mg L-1. Os baixos valores de CMC dos biossurfactantes LBBMA 111A (150 mg L-1),

LBBMA 155 (180 mg L-1), LBBMA 168 (200 mg L-1), LBBMA 191(150 mg L-1) e LBBMA 201 (200 mg

L-1) indicam que esses biossurfactantes têm potencial para diversas aplicações biotecnológicas

(Figura 2.11).

O valor de CMC apresentado pelo biossurfactante LBBMA 168 (200 mg L-1) (Figura 2.10C)

é baixo, comparativamente ao obtido pelos flavolipídeos produzidos por Flavobacterium sp.

MTN11, que foi de 300 mg L-1 (BODOUR et al., 2004). Os flavolipídeos constituem uma nova

classe de biossurfactantes, relatada pela primeira vez por BODOUR et al. (2004) .

Os biossurfactantes LBBMA 191 e LBBMA 201 apresentam excelentes propriedades

tensoativas, pois os seus valores de CMC (150 e 200 mg L-1, respectivamente) estão na faixa dos

considerados como biossurfactantes potentes (Figura 2.11D e E). Dados referentes a valores de

CMCs de biossurfactantes produzidos por espécies de Dietzia maris e Arthrobacter oxydans são

relatados aqui pela primeira vez. HABA et al. (2000) estudaram a produção de biossurfactantes por

Arthrobacter oxydans e NAZINA et al. (2003) pelos isolados Dietzia sp. 263 e Arthrobacter oxydans

32C. Apesar dos biossurfactantes produzidos por aqueles isolados promoverem a redução da

tensão superficial para valores abaixo de 40 mN m-1, os valores de suas CMCs não foram

determinados).

Comparativamente ao surfactante sintético SDS® (Figura 2.11F), os biossurfactantes

obtidos neste trabalho possuem um alto poder de redução da tensão superficial e apresentam

valores de CMCs 10 vezes menores (Figura 2.11). Estas propriedades tornam esses

biossurfactantes adequados para aplicações ambientais, como a biorremediação e a dispersão de

manchas de óleo.


75


0 100 200 300 400 500 600

25303540455055606570

Dietzia maris LBBMA 191

Concentração do Surfactante (mg L-1)0 100 200 300 400 500 600

Tens

ão S

uper

ficial

(mN

m-1

)

25303540455055606570


Concentração do Surfactante (mg L-1)0 100 200 300 400 500 600

Tens

ão S

uper

ficial

(mN

m-1

)

25303540455055606570

0 100 200 300 400 500 600

Tens

ão S

uper

ficial

(mN

m-1

)

283338434853586368

SDS

Concentração de Surfactante mg L-1)1200 1500 1800 2100 2400 2700

Tens

ão S

uper

ficial

(mN

m-1

)

25303540455055606570

0 100 200 300 400 500 600

27

33

39

45

51

57

63

69

Concentração do Surfactante (mg L-1)


Flavobacterium sp. LBBMA 168

Tens

ão S

uper

ficial

(mN

m-1

)



Tens

ão S

uper

ficial

(mN

m-1

)

Figura 2.11. Variação da tensão superficial (γ) com a concentração do biossurfactante LBBMA 111A, LBBMA 155, LBBMA 168, LBBMA 191, LBBMA 201 e o surfactante sintético SDS®, em soluções aquosas a 28°C em pH 6,8. As curvas foram plotadas para médias de duas repetições com as barras de erros representando ± o desvio-padrão.


76

2.4.3. Atividade Emulsificante e Estabilidade da Emulsão

Os biossurfactantes LBBMA 111A, LBBMA 155, LBBMA 168, LBBMA 201 e LBBMA 191

foram capazes de formar emulsões estáveis com petróleo, querosene e hidrocarbonetos alifáticos e

aromáticos puros. Essa também é uma característica específica de moléculas que possuem caráter

anfifílico (ILORI et al., 2005). A resposta, porém, foi dependente do tipo de substrato utilizado para

emulsificação (Figura 2.12). Todos os biossurfactantes formaram emulsões consideradas estáveis,

uma vez que seus volumes, 24 horas após a formação, ainda correspondiam a 50% ou mais do

seu volume original (WILLUMSEN e KARLSON, 1979). É importante ressaltar que emulsões

recém-preparadas não devem ser submetidas a testes de estabilidade, pois durante seu

desenvolvimento pode não ter havido oportunidade de equilibrarem-se plenamente, o que pode ser

explicado quando se considera a instabilidade intrínseca das emulsões, ou seja, a dispersão pode

não ter adquirido estabilidade logo após o preparo. É desejável um período inicial de espera para

que haja a estabilização, sendo usualmente aceito um período entre 24 e 48 horas após o preparo

(DI MAMBRO, 2001; MASSON, 2005).

Os biossurfactantes apresentaram alta capacidade para estabilizar emulsões com petróleo

e querosene ao longo de 48 horas, comprovada pelos altos índices de emulsificação obtidos pelos

biossurfactantes LBBMA 111A (96,4 e 74,63%), LBBMA 155 (82,74 e 74,00%), LBBMA 168 (73,55

e 72,73%), LBBMA 191 (85,77 e 78,70%) e LBBMA 201 (87,78 e 79,80%), respectivamente (Figura

2.12). Os resultados foram superiores aos obtidos por ILORI et al. (2005), que apresentaram

índices de emulsificação inferiores (E=58% com petróleo e 40% com querosene) ao utilizarem o

surfactante produzido por Aeromonas sp.

Em geral, o petróleo foi o substrato com que se obtiveram os maiores índices de

emulsificação, exceto pelo biossurfactante LBBMA 168, que apresentou um valor (73,55%) inferior

aos obtidos pelos outros biossurfactantes, porém superior ao obtido pelo surfactante sintético SDS®

(70,34%) (Figura 2.12). Isto indica que os biossurfactantes, com exceção do LBBMA 168, atuam

com maior eficiência quando o substrato de hidrocarbonetos é composto por misturas de

componentes alifáticos e cíclicos. Isto também foi comprovado por ROSENBERG et al. (1979), ao

avaliarem a emulsificação de misturas de substratos oleosos pelo emulsificante de Arthrobacter


77

RAG-1. Os biossurfactantes apresentaram maior estabilidade de emulsão do que o surfactante

sintético SDS® (Figura 2.12) quando o substrato foi o petróleo ou querosene, pois o SDS®

estabilizou apenas 70,34 e 52,07% da emulsão após 48 horas, respectivamente. Os dados

mostram que a habilidade dos biossurfactantes em emulsificar misturas de hidrocarbonetos é

superior à do surfactante sintético SDS®.

Os biossurfactantes também foram capazes de emulsificar eficientemente os

hidrocarbonetos hexano, tolueno e hexadecano. A formação de emulsões estáveis dos

biossurfactantes com os diferentes hidrocarbonetos puros é refletida pelos altos valores de E%

obtidos 48 horas após sua formação (Figura 2.12). Em geral, os menores índices de emulsificação

foram os obtidos quando se utilizou como substrato o hexadecano, exceto quando o

biossurfactante utilizado foi o LBBMA 168, com o qual se obteve um E% de 77,5%, o maior valor

dentre os obtidos com esse biossurfactante (Figura 2.12C).

Os biossurfactantes LBBMA 191 e LBBMA 201 exibiram uma alta atividade emulsificante,

formando emulsões consideradas estáveis com todos os substratos testados (Figura 2.12 D e E).

HABA et al. (2000) estudaram a produção de biossurfactantes por Arthrobacter oxydans e NAZINA

et al. (2003) pelos isolados Dietzia sp. 263 e Arthrobacter oxydans 32C. Apesar de promoverem a

redução da tensão superficial para valores abaixo de 40 mN m-1, os índices de emulsificação

obtidos pelos isolados Arthrobacter oxydans, Dietzia sp. 263 e Arthrobacter oxydans 32C foram de

apenas 1,9%, 35% e 10%, respectivamente.

Esses resultados são relevantes para várias aplicações dos biossurfactantes, visto que a

capacidade de emulsificação é importante na solubilização de compostos hidrofóbicos em

processos de biorremediação (MIHELCIC et al., 1993, VOLKERING et al., 1995), na recuperação

avançada de petróleo (BANAT et al., 1995), na remoção do óleo retido em borras oleosas (BANAT

et al., 1991), entre outros.


78

Tempo (horas)

0 6 12 18 24 30 36 42 48

Esta

bilid

ade d

a Em

ulsã

o (%

)

50556065707580859095

100

Tempo (horas)

0 6 12 18 24 30 36 42 48

Esta

bilid

ade d

a Em

ulsã

o (%

)

50556065707580859095

100

Tempo (horas)

0 6 12 18 24 30 36 42 48

Esta

bilid

ade d

a Em

ulsã

o (%

)

50556065707580859095

100

Tempo (horas)

0 6 12 18 24 30 36 42 48

Esta

bilid

ade d

a Em

ulsã

o (%

)

50556065707580859095

100

Tempo (horas)

0 6 12 18 24 30 36 42 48

Esta

bilid

ade d

a Em

ulsã

o (%

)

50556065707580859095

100

Tempo (horas)

0 6 12 18 24 30 36 42 48

Esta

bilid

ade d

a Em

ulsã

o (%

)

50556065707580859095

100


SDS

Petróleo Tolueno Hexano Querosene Hexadecano


Dietzia maris LBBMA 191Flavobacterium sp. LBBMA 168


Figura 2.12. Atividade de emulsificação de vários hidrocarbonetos com os biossurfactantes (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191, (E) LBBMA 201 e (F) do surfactante sintético SDS®. As curvas foram plotadas para médias de duas repetições com as barras de erros representando ± o desvio-padrão.

A B

C D

E F


79

2.4.4. Efeito do pH, da Temperatura e da Força Iônica na Atividade dos

Biossurfactantes Purificados

A estabilidade e a efetividade dos biossurfactantes purificados foram avaliadas frente a

variações de pH, temperatura e força iônica, por meio da análise da estabilidade da emulsão

formada e da variação da atividade interfacial, utilizando-se o parâmetro tensão superficial (TS). O

estudo foi realizado com soluções contendo biossurfactantes em concentração correspondente a

2CMC.

A estabilidade de uma emulsão pode ser afetada por diversos fatores. Porém, todo fator

que causa instabilidade conduz aos mesmos fenômenos: quebra da emulsão ou inversão de fases

(ROSEN, 2004). A preservação da estabilidade sob condições adversas é um importante atributo

para os surfactantes, pois a maioria das áreas de aplicações de surfactantes requer um

comportamento constante.

A estabilidade dos biossurfactantes purificados e do surfactante sintético SDS®, em relação

à variação do pH, é mostrada na Figura 2.13. A atividade tensoativa dos biossurfactantes foi

mantida na faixa de pH de 5 a 9, com pequenas variações nos valores de γCMC e nos índices de

emulsificação (E%). Porém, houve um aumento gradual do valor de tensão superficial nas soluções

dos biossurfactantes à medida que o pH foi elevado para valores acima de 7,0. As atividades

tensoativas - tensão superficial referente à 2CMC e estabilidade de emulsão - dos biossurfactantes

LBBMA 111A, LBBMA 155 e LBBMA 191 foram afetadas quando os mesmos foram mantidos em

pH 6,5 e 7,0. A atividade emulsificante e a γCMC do biossurfactante LBBMA 168 foram levemente

reduzidas quando o pH foi mantido na faixa de 6,0 a 7,0. Na faixa de pH variando entre 5,0 e 7,5, o

biossurfactante LBBMA 201 manteve excelente estabilidade de emulsão e um aumento não-

significativo na tensão superficial referente à CMC em pH superior a 7,0.

Alterações de pH na faixa de 7,0 a 9,0 levaram a variações de tensão superficial dos

surfactantes; na faixa de pH entre 5,0 e 6,5, a tensão superficial referente a 2CMC e a estabilidade

da emulsão se mantiveram estáveis (Figura 2.13). Nota-se uma ligeira variação da γCMC, mas não

ultrapassando 35 mN m-1, característica considerada eficiente para um bom surfactante. Em pH 5,0

e 5,5, ocorre a desemulsificão do biossurfactante produzido por Flavobacterium sp. LBBMA 168 no


80

meio, resultando na instabilidade da emulsão. No entanto, a tensão superficial não foi afetada. Em

pH superior a 7,0, houve um aumento substancial nos valores de tensão superficial, mas os índices

de emulsificação se mantiveram estáveis, com exceção do biossurfactante LBBMA 168, cujos

índices de emulsificação apresentaram redução significativa nessa faixa de pH (Figura 2.13C).

Em comparação com os biossurfactantes, a estabilidade da emulsão formada pelo

surfactante SDS® foi pouco afetada quando o pH foi mantido na faixa de 4,5 a 6,0 e 7,0 a 9,0. Em

pH 6,5, a sua atividade tensoativa foi elevada substancialmente (Figura 2.13F).


81

pH

5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0

Tens

ão S

uper

ficial

(m

N m

-1)

3031323334353637383940

Esta

bilid

ade d

e Em

ulsã

o (%

)

50

55

60

65

70

75

80

pH

5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0

Tens

ão S

uper

ficial

(m

N m

-1)

3031323334353637383940

Esta

bilid

ade d

e Em

ulsã

o (%

)

50

55

60

65

70

75

80

pH

5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0

Tens

ão S

uper

ficial

(m

N m

-1)

3031323334353637383940

Esta

bilid

ade d

e Em

ulsã

o (%

)

50

55

60

65

70

75

80

pH

5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0

Tens

ão S

uper

ficial

(m

N m

-1)

3031323334353637383940

Esta

bilid

ade d

e Em

ulsã

o (%

)

50

55

60

65

70

75

80

pH

5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0

Tens

ão S

uper

ficial

(m

N m

-1)

3032343638404244464850

Esta

bilid

ade d

e Em

ulsã

o (%

)

50

55

60

65

70

75

80

pH

5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 9,0

Tens

ão S

uper

ficial

(m

N m

-1)

3031323334353637383940

Esta

bilid

ade d

e Em

ulsã

o (%

)

50

55

60

65

70

75

80

Estabilidade de Emulsão (%) Tensão Superficial (mN m-1)


SDS


Flavobacterium sp. LBBMA 168 Dietzia maris LBBMA 191


Figura 2.13. Efeito do pH sobre a atividade tensoativa dos biossurfactantes (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191, (E) LBBMA 201 e (F) do surfactante sintético SDS®. As curvas foram plotadas para médias de duas repetições com as barras de erros representando ± o desvio-padrão.

A B

C D

E F


82

Mudança na temperatura causa alterações consideráveis na estabilidade de emulsões; a

temperatura pode causar a inversão ou a quebra de emulsões. Para se verificar o efeito da

temperatura na estabilidade das emulsões formadas pelos biossurfactantes purificados, o volume

relativo de emulsão (E48) foi determinado em temperaturas na faixa de 20 a 80°C (intervalos de

10°C). O E48 dos biossurfactantes LBBMA 111A, LBBMA 155 e LBBMA 191 se manteve estável em

temperaturas na faixa de 20-70°C, nas quais o índice de emulsificação se manteve acima de 65%

(Figura 2.14).

O efeito da temperatura na γCMC de surfactantes, em meio aquoso, é complexo. A variação

da temperatura de 20 para 30°C resultou em aumento não-significativo na γCMC dos

biossurfactantes LBBMA 111A, LBBMA 155 e LBBMA 191. Porém; o aumento da γCMC dos

biossurfactantes produzidos por LBBMA 168 e LBBMA 201 e do surfactante sintético SDS® foi

bastante significativo (Figura 2.14C e E). Um aumento na temperatura de 30 para 40°C e de 40

para 50°C provocou aumento pouco ou não-significativo na γCMC dos biossurfactantes, porém

elevou significativamente a γCMC do surfactante SDS® (Figura 2.14F).

Em temperaturas de 50 a 80°C (intervalos de 10°C), a atividade superficial do

biossurfactante LBBMA 201 (Figura 2.14E) foi mantida. Porém, a atividade superficial dos outros

biossurfactantes sofreu alteração significativa, sendo observado aumento da γCMC a 50°C dos

biossurfactantes LBBMA 111A (34,2 mN m-1), LBBMA 155 (33,2 mN m-1), LBBMA 168 (34,1 mN

m-1), LBBMA 191 (35,1 mN m-1) e LBBMA 201 (36,8 mN m-1) para 36,4, 35,8, 37,0, 42,0 e 37,5

mN m-1, respectivamente (Figura 2.14). A γCMC do surfactante SDS® (43,2 mN m-1) aumentou para

45,2 mN m-1 com o aumento da temperatura de 50 para 80°C. Essas elevações nas γCMC dos

biossurfactantes e do SDS® em resposta à elevação da temperatura podem ser atribuídas ao

enfraquecimento das interações eletrostáticas entre as moleculas, o que desestabiliza as micelas

formadas por esses compostos.


83

Temperatura (°C)

20 30 40 50 60 70 80

Tens

ão S

uper

ficial

(m

N m

-1)

3031323334353637383940

Esta

bilid

ade d

e Em

ulsã

o (%

)

101520253035404550556065707580

Temperatura (°C)

20 30 40 50 60 70 80

Tens

ão S

uper

ficial

(m

N m

-1)

3031323334353637383940

Esta

bilid

ade d

e Em

ulsã

o (%

)

101520253035404550556065707580

Temperatura (°C)

20 30 40 50 60 70 80

Tens

ão S

uper

ficial

(m

N m

-1)

3031323334353637383940

Esta

bilid

ade d

e Em

ulsã

o (%

)

101520253035404550556065707580

Temperatura (°C)

20 30 40 50 60 70 80

Tens

ão S

uper

ficial

(m

N m

-1)

3032343638404244464850

Esta

bilid

ade d

e Em

ulsã

o (%

)

101520253035404550556065707580

Temperatura (°C)

20 30 40 50 60 70 80

Tens

ão S

uper

ficial

(m

N m

-1)

3032343638404244464850

Esta

bilid

ade d

e Em

ulsã

o (%

)

101520253035404550556065707580

Temperatura (°C)

20 30 40 50 60 70 80

Tens

ão S

uper

ficial

(m

N m

-1)

3032343638404244464850

Esta

bilid

ade d

e Em

ulsã

o (%

)

101520253035404550556065707580

Tensão Superficial (mN m-1)Estabilidade de Emulsão (%)


SDS




Figura 2.14. Efeito da temperatura sobre a atividade tensoativa dos biossurfactantes (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191, (E) LBBMA 201 e (F) do surfactante sintético SDS®. As curvas foram plotadas para médias de duas repetições com as barras de erros representando ± o desvio-padrão.

A B

C D

E F


84

O efeito da adição de NaCl, em concentrações variando de 0,5 a 20%, na estabilidade de

emulsão e na CMC dos biossurfactantes purificados foi também estudado (Figura 2.15). Os E48 dos

biossurfactantes permaneceram estáveis em soluções de até 5% de NaCl, com exceção do

biossurfactante produzido pelo isolado LBBMA 191, que teve uma pequena redução no E48 com a

adição de 5% de NaCl (Figura 2.15 D) .

De forma mais abrupta, concentrações de NaCl superiores a 10% promoveram alteração no

E48 de todos os biossurfactantes e do SDS® (Figura 2.15 F).

Uma emulsão instável pode ser eventualmente destruída, levando à separação completa

das duas fases. Nesse caso, não há estabilização no caso de emulsão do tipo água-em-óleo (A/O)

com uma concentração salina relativamente alta (>5,0%). Para se entender essa observação,

podemos considerar as mudanças das características na emulsão A/O como resultado da adição

de sal (NaCl). Pela teoria de difusão do íon, quando a concentração de sal aumenta, a energia

interna do sistema também aumenta (MOHAMED et al., 2003). Consequentemente, as emulsões

não são estáveis termodinamicamente e as gotas de água fundem-se umas com as outras para

produzir gotas maiores e aumentar a taxa de coalescência. Coalescência é um dos possíveis

mecanismos de destruição de emulsões, o qual ocorre quando a energia de adesão entre duas

gotas é maior que a energia de turbulência que causa a dispersão (CALDERON & POULIN, 1999).

A tensão superficial das soluções de surfactantes foi reduzida em concentrações de NaCl

na faixa de 0,0 a 5,0% (Figura 2.15). Resultados semelhantes foram obtidos por NOUR & YUNUS

(2006), que investigaram a influência da concentração de NaCl (0,0-5,5 %) em emulsões do tipo

água-óleo cru. Os autores argumentam que esse efeito ocorre porque o aumento da concentração

de NaCl aumenta a chance das moléculas dos surfactantes colidirem umas com as outras.


85

Concentração de NaCl (%)0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Tens

ão S

uper

ficial

(m

N m

-1)

2022242628303234363840

Esta

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ade d

e Em

ulsã

o (%

)

0

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50

60

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Tens

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Concentração de NaCl (%) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Tens

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50

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70

80

Tensão Superficial (mN m-1)Estabilidade de Emulsão (%)


SDS




Figura 2.15. Efeito da força iônica sobre a atividade tensoativa dos biossurfactantes (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191, (E) LBBMA 201 e (F) do surfactante sintético SDS®. As curvas foram plotadas para médias de duas repetições com as barras de erros representando ± o desvio-padrão.

BA

C D

E F

Capítulo 2. Conclusões

86

2.5. CONCLUSÕES

Os biossurfactantes produzidos por Bacillus sp. LBBMA 111A, Bacillus subtilis LBBMA 155,

Flavobacterium sp. LBBMA 168, Dietzia maris LBBMA 191 e Arthrobacter oxydans LBBMA 201

foram caracterizados como sendo pertencentes à classe dos lipopeptídeos (LBBMA 111A, LBBMA

155 e LBBMA 201), dos glicolipídeos (LBBMA 191) e dos flavolipídeos (LBBMA 168).

Quando comparados ao surfactante sintético SDS®, os biossurfactantes obtidos nesse

trabalho possuem um alto poder de redução da tensão superficial em meio aquoso e apresentam

valores de concentração micelar crítica cerca de 10 vezes menores.


foram capazes de formar emulsões estáveis com petróleo, querosene e hidrocarbonetos alifáticos e

aromáticos puros.

Os surfactantes LBBMA 111A, LBBMA 155, LBBMA 168, LBBMA 191 e LBBMA 201

mostraram serem termoestáveis na faixa de 20-70°C, estáveis em valores de pH acima de 5,0 e

resistentes à presença de até 5% de NaCl.

Os baixos valores de tensão superficial e a capacidade para estabilizar emulsões em

condições extremas de pH, temperatura e salinidade, tornam esses biossurfactantes adequados

para uma ampla gama de aplicações biotecnológicas e industriais envolvendo detergência,

emulsificação, lubrificação, capacidade espumante, capacidade molhante, solubilização e

dispersão de fases.


87

2.6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

ADAMSON, A.W., GAST, A.P. 1997. Phisycal Chemistry of Surfaces, John Willey e Soons, Inc.,

6th. Ed., New York.

AKPA, E., JACQUES, P., WATHELET, B., PAQUOT, M., FUCHS, R., BUDZIKIEWICZ, H., THONART, P. 2001. Influence of culture conditions on lipopeptide production by Bacillus subtilis. Applied Biochemistry and Biotechnology, 91-93, 551-561.

ASMER H.-J., LANG S., WAGNER F., WRAY, V. 1988. Microbial production, structure elucidation and bioconversion of sophorose lipids. Journal of the American Oil Chemists' Society, 65, 1460-1466.

BODOUR, A.A. & MAIER, R. M. 1998. Application of a modified drop-collapse technique for surfactant quantitation and screening of biosurfactant-producing microrganisms. Journal of

Microbiological Methods, 32, 273-280.

BANAT, I.M. 1995. Biosurfactant Production and Possible Uses in Microbial Enhanced Oil Recovery and Oil Pollution Remediation: A Review, Bioresource Technology, 51, 1–12.

BANAT, I.M., SAMARAH, N., MURAD, M., HORNE, R. & BANERJEE S. 1991. Biosurfactant production and use in oil tank clean-up. World Journal of Microbiology and Biotechnology, 7, 80–88.

BARROS, F.F.C., QUADROS, C.P., MARÓSTICA JR., M.R. & PASTORE, G. M. 2007. Surfactina: propriedades químicas, tecnológicas e funcionais para aplicações em alimentos. Química Nova, 30 (2), 409-414.

BODOUR, A.A. & MAIER, R. M. 1998. Application of a modified drop-collapse technique for surfactant quantitation and screening of biosurfactant-producing microrganisms. Journal of


BODOUR, A.A., GUERRERO-BARAJAS, C., JIORLE, B.V., MALCOMSON, M.E., PAULL, A.K., SOMOGYI, A.; TRINH, L.N., BATES, R.B. & MAIER, R.M. 2004. Structure and characterization of flavolipids, a novel class of biosurfactants produced by Flavobacterium sp. Strain MTN11. Applied


BONILLA, M., OLIVARO, C., CORONA, M., VAZQUEZ, A. & SOUBES, M. 2005. Production and characterization of a new bioemulsifier from Pseudomonas putida ML2. Journal of Applied



88

CALDERON, F. & POULIN, P. 1999. Progress in understanding emulsion metastability and surface forces. Current Opinion in Colloid & Interface Science, 4, 223-230.

CHRISTOFI, N. & IVSHINA, I.B. 2002. Microbial surfactants and their use in field tudies of soil remediation. Journal of Applied Microbiology, 93, 915-929.

COOPER, D.J. & GOLDENBERG, B.G. 1987. Surface active agents from two Bacillus species. Applied Environmental Microbiology, 54, 224–229.

CREVECOEUR, J.J., 1997. ”Water expandable polystyrene (WEPS)”, Tese de pós-doutorado, Eindhoven University of Technology, Eindhoven.

COOPER. D.G., ZAJIC. J.E. & GERSON, D.F. 1979. Production of surface-active lipids by Corynebacterium lepus. Applied and Environmental Microbiology, 37, 4-10.

DENNIS, R.M., DWORKING, D., LOWE, W.L. & ZUKPO, A.J. 1992. Evaluation of commercially available soil-washing processes for site remediation, Journal of Hazardous Industrial Wastes, 24, 515-525.

DESAI, J. D. & BANAT, I. M. 1997. Microbial production of surfactants and their commercial potential. Microbiology Molecular Biology Reviews, 61, 47-64.

DELEU, M., RAZAFINDRALAMBO, H., POPINEAU, Y., JACQUES, P., THONART, P. & PAQUOT, M. 1999. Interfacial and emulsifying properties of lipopeptides from Bacillus subtilis. Colloids and

Surfaces A, 152, 3–10.

DI MAMBRO, V.M. 2001. Desenvolvimento de formulações com superóxido dismutase: avaliação da estabilidade física das formulações e da atividade enzimática. Dissertação de Mestrado. 138p. Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP.

HABA, E., ESPUNY, M.J., BUSQUETS, M. & MANRESA, A. 2000. Screening and production of rhamnolipids by Pseudomonas aeruginosa 47T2 NCIB 40044 from waste frying oils. Journal of

Applied Microbiology, 88, 379–387.

HOROWITZ, S., GILBERT, J. N. & GRILFIN, W.M. 1990. Isolation and characterization of a surfactant produced by Bacillus licheniformis 86. Journal of industrial microbiology, 6, 243-248.

ILORI, M.O., AMOBI, C.J. & ODOCHA, A.C. 2005. Factors affecting biosurfactant production by oil degrading Aeromonas spp. isolated from a tropical environment. Chemosphere, 61, 985-992.


89

JENNY, K., O. KÄPPELI & A. FIECHTER. 1991. Biosurfactants from Bacillus licheniformis:

structural analysis and characterization. Applied Microbiology and Biotechnology, 36, 5-13.

KAKINUMA, A., OUCHIDA, A., SHIMA, T., SUGINO, H., ISONO, M., TAMURA, G. & ARIMA, K. 1969. Confirmation of the structure of surfactin by mass spectrometry. Agricultural and Biological

Chemistry, 33, 1669-1671.

KOWALL, M., VATER, J., KLUGE, B., STEIN, T., FRANKE, P. & ZIESSOW, D. 1998. Separation and characterization of surfactin isoforms produced by Bacillus subtilis OKB 105. Journal Colloid

Interface Science, 203, 1-8.

KOUMOUTSI, X.H., CHEN, A., HENNE, H., LIESEGANG, G., HITZEROTH, P., FRANKE, J., VATER & R. BORRISS. 2004. Structural and functional characterization of gene clusters directing nonribosomal synthesis of bioactive cyclic lipopeptides in Bacillus amyloliquefaciens strain FZB42, Journal of Bacteriology, 186, 1084–1096.

JACQUES, P., HBID, C., DESTAIN, J., RAZAFINDRALAMBO, H., PAQUOT, M., DE PAUW, E. & THONART, P. 1999. Optimization of biosurfactant lipopeptide production from Bacillus subtilis S499 by Plackett–Burman design. Applied Biochemistry and Biotechnology, 77, 223–233.

LEENDERS, F., STEIN, T.H., KABLITZ, B., FRANKE, P. & VATER, J. 1999. Rapid typing of Bacillus

subtilis strains by their secondary metabolites using matrix-assisted laser desorption/ionization massa spectrometry of intact cells. Rapid commun. Mass Spectrometry, 13, 943-949.

LIN, S.-C., M.A. MINTON, M.M. SHARMA & G. GEORGIOU. 1994. Structural and immunological characterization of a biosurfactant produced by Bacillus licheniformis JF-2. Appl. Environ. Microbiol., 60, 31-38.

LIMA, T.M.S. 2003. Produção de biossurfactantes visando ao tratamento de borra oleosa. Dissertação (mestrado) – Universidade Federal de Viçosa, 32p.

LIN, S.-C., CHEN, Y.-C. & LIN, Y.M. 1998. General approach for the development of high-performance liquid chromatography methods for biosurfactant analysis and purification. Journal of

Chromatografy A, 859, 149-159.

MANEERAT, S., NITODA, T., KANZAKI, H. & KAWAI, F. 2005. Bile acids are new products of a marine bacterium, Myroides sp. strain SM1. Applied Microbiology and Biotechnology, 67, 699–683.

MASSON, D.S. 2005. Desenvolvimento e da estabilidade físico-química de emulsões O/A quanto à variação de umectantes e à adição de ativos despigmentantes. Dissertação de Mestrado. 163p.


90

Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP.

MESQUITA, A.C. 2004. Uso das técnicas de oxidação química e biodegradação na remoção de alguns compostos recalcitrantes. Tese de doutorado, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro.

MIHELCIC, J.R., LUEKING, D.R., MITZELL, R.J. & STAPLETON, J.M. 1993. Bioavailability of sorbed- and separate-phase chemicals. Biodegradation, 4, 141–153.

MOHAMED, A.M.O., EL GAMAL, M. & ZEKRI, A.Y. 2003. Effect of salinity and temperature on water cut determination in oil reservoirs. Journal of Petroleum Science and Engineering, 40, 177-188.

MORIKAWA, M., DAIDO, H., TAKAO, T., MURATA, S., SHIMONISHI, Y. & IMANAKA, T. A new lipopeptide biosurfactant produced by Arthrobacter sp. strain MIS38. Journal of Bacteriology, 175, 6459–6466.

MULLIGAN, C.N. & GIBBS, B.F. Factors influencing the economics of biosurfactants. In: Biosurfactants: production, properties, applications. KOSARIC, N. ed., Marcel Decker Inc., New York, p. 392-371, 1993.

MULLIGAN, C.N. 2005. Environmental applications for biosurfactants. Environmental Pollution, 133, 183-198.

NAZINA, T.N., GRIGOR’YAN, A.A., YAN-FEN XUE, SOKOLOVA, D.S.H., NOVIKOVA, E.V., TOUROVA, T.P., POLTARAUS, A.B., BELYAEV, S.S. & IVANOV, M.V., Phylogenetic Diversity of Aerobic Saprotrophic Bacteria Isolated from the Daqing Oil Field, Mikrobiologiya, 71, 103–110.

NITSCHKE, M. 2004. Produção e caracterização de biossurfactante de Bacillus subtilis utilizando manipueira como substrato. Tese de Mestrado. Universidade Federal de Campinas, Campinas, São Paulo.

NOUR, A.H. & YUNUS, R.M. 2006. Stability of water-in- crude oil emulsion. Journal of Applied

Sciences, 6, 2895-2900.

REASONER, D.J. & GELDREICH, E.E., 1985. A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water. Applied and Environmental Microbiology, 49, 1-7.

SCHNEIDER, J., TARAZ, K., BUDZIKIEWICZ, H., JACQUES, P. & THONART, P. 1999. The structure of two fengycins from Bacillus subtilis S499. Zeitschrift fur Naturforschung, 54, 859-865.


91

SØRENSEN, D. 2002. Study and characterization of novel antibiotics and biocontrol agents. Tese

de Doutorado. University of Copenhagen.

VATER, J., KABLITZ, B., WILDE, C., FRANKE, P., MEHTA, N. & CAMEOTRA, S.S. 2002. Matrix-assisted laser desortion ionization-time of flight mass spectrometry of lipopeptide biosurfactants in whole cells and culture filtrates of Bacillus subtilis C-1 isolated from petroleum sludge. Applied and


VOLKERING, F., BREURE, A.M., VAN ANDEL, J.G. & RULKENS, W.H. 1995. Influence of non-ionic surfactants on bioavailability and biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbons. Applied


WEI, Y.H. & CHU, I.M. 1998. Enhancement of surfactin production in iron-enriched media by Bacillus subtilis ATCC 21332. Enzyme and Microbial Technology, 22, 724-728.

WILLUMSEN, P. A. & KARLSON, U. 1997. Screening of bacteria, isolated from PAH-contaminated soils, for production of biosurfactant and bioemulsifiers. Biodegradation, 7, 415 – 423.

YAKIMOV, M.M., K.N. TIMMIS, V. WRAY, & H.L. FREDRICKSON. 1995. Characterization of a new lipopeptide surfactant produced by thermotolerant and halotolerant subsurface Bacillus licheniformis

BAS50. Applied and Environmental Microbiology, 61, 1706-1713.

Capítulo 3. Resumo

92

CAPÍTULO 3 AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE DE SURFACTANTES BACTERIANOS PARA

MICRORGANISMOS DEGRADADORES DE PETRÓLEO

3.1. RESUMO

Além de serem úteis em diversas aplicações industriais, os surfactantes são de grande importância em

processos de remediação de águas e de solos contaminados com poluentes orgânicos hidrofóbicos. A

aplicação ambiental desses compostos tem sido limitada pela falta de conhecimento sobre o destino

desses compostos no ambiente e sobre a toxicidade dos mesmos quando aplicados in situ. Há indícios

na literatura de que os biossurfactantes são menos tóxicos do que os surfactantes sintéticos. Neste

trabalho, a toxicidade de biossurfactantes produzidos por bactérias isoladas de ambientes

contaminados com hidrocarbonetos foi avaliada. A toxicidade aguda dos surfactantes bacterianos

produzidos por Bacillus sp. LBBMA 111A, B. subtilis LBBMA 155, Flavobacterium sp. LBBMA 168,

Dietzia maris LBBMA 191 e Arthrobacter oxydans LBBMA 201 e do sintético Dodecil Sulfato de Sódio

(SDS®) sobre a bactéria bioluminescente Vibrio fischeri foi avaliada por meio da medida da redução da

luz emitida por este microrganismo quando exposto a diferentes concentrações dos surfactantes. Além

disso, foram avaliados os efeitos tóxicos de diferentes concentrações (2CMC, 4CMC e 8CMC) dos

surfactantes sobre o crescimento de culturas puras de Acinetobacter baumannii LBBMA 04,

Acinetobacter junni LBBMA 36, Pseudomonas sp. LBBMA 101B e Acinetobacter baumanni LBBMA

ES11, em meio mineral suplementado com glicose. Com base na avaliação da CE50 (concentração

efetiva em que ocorre redução de 50% na emissão de luz por Vibrio fischeri), é demonstrado que os

biossurfactantes não são tóxicos ao organismo-teste. A máxima inibição da emissão de luz (32%) foi

obtida com o biossurfactante produzido por A. oxydans LBBMA 201, em concentração equivalente a

2,2 CMC. A emissão de luz pela bactéria foi quase que completamente inibida (84,5 %) pelo SDS® na

Capítulo 3. Resumo

93

concentração de 4.710 mg L-1 (equivalente a 2,2CMC). A redução do crescimento de culturas

bacterianas puras, causada pela adição dos biossurfactantes ao meio de crescimento, foi menor do

que a causada pelo surfactante sintético SDS®. Em relação ao surfactante sintético SDS®, os dados

permitem concluir que os biossurfactantes avaliados são menos tóxicos, característica que lhes

confere potencial para aplicação em processos de remediação in situ de ambientes contaminados e

em outras aplicações ambientais onde a manutenção das populações microbianas autóctones é

desejável.

Palavras-chave: Biorremediação; descontaminação; bioluminescência; poluentes.


94

3.2. INTRODUÇÃO

Dadas as suas propriedades físico-químicas favoráveis, os surfactantes ou biossurfactantes

são usados em processos de remediação de solos e de ambientes aquáticos para melhorar a taxa de

degradação de poluentes orgânicos hidrofóbicos. Uma das principais limitações à ampliação do uso de

surfactantes em remediação é a falta de conhecimento sobre o destino ambiental e a toxicidade

desses surfactantes, principalmente para aplicações in situ (HAIGH, 1996).

A freqüente presença de surfactantes sintéticos no ambiente aquático, principalmente como

resultado do uso de detergentes e produtos de limpeza, tem resultado numa toxicidade extensiva

durante os últimos 30 anos. Conseqüentemente, dispõe-se de um extenso banco de dados de testes

de toxicidade em laboratório e publicações de avaliações de riscos de vários surfactantes comerciais.

Por outro lado, a toxicidade de biossurfactantes no ambiente é pouco conhecida. EDWARDS et al.

(2003), ao compararem os dados de toxicidade de três surfactantes sintéticos e três surfactantes

microbianos, concluíram que os biossurfactantes são menos tóxicos que os surfactantes sintéticos

para algumas espécies de invertebrados. Contudo, os riscos ambientais dos biossurfactantes,

avaliados por meio de análise da composição de comunidades microbianas, não foram

suficientemente explorados.

A proposta geral dos testes de toxicidade é estabelecer o impacto potencial de substâncias

químicas sobre a biota de um dado ambiente. A informação adquirida pode ser usada para administrar

o tratamento ou a liberação do uso de substâncias químicas.

Para interpretar os dados de toxicidade de surfactantes, é necessário um entendimento dos

fatores que contribuem para a toxicidade dessa classe de compostos. O principal dentre esses fatores

é a estrutura química. A toxicidade de surfactantes aniônicos e não-iônicos é uma função do

comprimento da cadeia alquil. Um aumento no comprimento da cadeia alquil corresponde a uma maior

toxicidade do surfactante aniônico Alquilbenzeno Sulfonado Linear (LAS) (MORENO-DANVILLA, 1983;

KIMERLE & SWISHER, 1977 citados por MANN, 2000).

Microrganismos são úteis nos testes de ecotoxicidade, pois podem ser avaliados em um curto

tempo e ocupam níveis tróficos onde a bioacumulação e/ou a bioconcentração são problemas

potenciais (VAN BEELEN & DOELMAN, 1997). Os testes bacterianos de toxicidade medem uma


95

ampla variedade de “endpoints” e incluem testes de mutagenicidade (AMES et al., 1988 citado por

LAYTON et al., 1999), crescimento populacional (NENZDA & SEYDEL, 1988), produção de CO2

(JARDIN et al., 1990), biossíntese enzimática, mineralização da glicose (RETEUNA et al., 1989) e a

inibição da bioluminescência (RIBO & KAISER, 1987 citado por LAYTON et al., 1999). Entre os bancos

de dados de toxicidade bacteriana, o mais amplo refere-se à inibição da bioluminescência em Vibrio

fischeri ou ao ensaio MICROTOX (KAISER & DEVILLERS, citados por LAYTON et al., 1999).

Neste trabalho, foi avaliada a toxicidade de biossurfactantes produzidos por bactérias isoladas

de ambientes contaminados com hidrocarbonetos.


96


3.3.1. Surfactantes

Foram testados seis tipos de surfactantes, sendo um sintético (SDS®) e cinco microbianos,

produzidos pelos isolados bacterianos Bacillus sp. LBBMA 111A, Bacillus subtilis LBBMA 155,

Flavobacterium sp. LBBMA 168, Dietzia maris LBBMA 191 e Arthrobacter oxydans LBBMA 201. Os

biossurfactantes foram produzidos no laboratório de Biotecnologia e Biodiversidade para o Meio

Ambiente (LBBMA) e o isolamento foi realizado utilizando-se as técnicas de precipitação ácida,

ultra-filtração e cromatografia de camada fina (TLC). As propriedades ativas de superfície de cada

surfactante estão descritas na Tabela 3.1.


SURFACTANTE γCMC (mN m-1) CMC (mg L-1)

LBBMA 111A 33,9 150

LBBMA 155 34,6 180

LBBMA 168 38,8 200

LBBMA 191 35,0 150

LBBMA 201 36,6 200

SDS® 39,0 2120

LBBMA 111A= Surfactante produzido por Bacillus sp. LBBMA 111A; LBBMA 155= Surfactante produzido por Bacillus subtilis LBBMA 155; LBBMA 168= Surfactante produzido por Flavobacterium sp. LBBMA 168; LBBMA 191= Surfactante produzido por Dietzia maris LBBMA 191; LBBMA 201= Surfactante produzido por Arthrobacter oxydans LBBMA 201; SDS®= Surfactante Sintético Dodecil Sulfato de Sódio.

Surfactina, Iturina e Fengicina de Bacillus sp. LBBMA 111A, Surfactina de B. subtilis

LBBMA 155 e Artrofactina de A. oxydans LBBMA 201 foram produzidos em meio mineral

suplementado com glicose a 2% (p v-1) e hexadecano a 2% (v v-1) (adicionado após o esgotamento

da glicose). Flavolipídeos de Flavobacterium sp. LBBMA 168 foram produzidos no meio mineral


97

descrito por BODOUR & MILLER-MAIER (1998) contendo somente glicose a 2% (p v-1) como fonte

de carbono. O cultivo foi realizado em frascos erlenmeyer a 30°C em agitador orbital (New

Brunswick Scientific) com agitação de 200 rpm, por sete dias.



em membrana de 0,45 ·μm. A extração primária dos surfactantes LBBMA 111A, LBBMA 155 e

LBBMA 201 foi realizada por precipitação ácida, ajustando-se o pH do meio para 2,0 com HCl a 12

mol L-1. Os biossurfactantes precipitados foram recuperados por centrifugação (12.000 g, 20

minutos, 20 °C) (VATER et al., 2002) e dissolvidos em água pH 7,0. Os produtos foram extraídos

com clorofórmio e metanol, filtrados em papel de filtro comum e, após evaporação dos solventes,

submetidos à cromatografia de camada delgada comparativa (CCDC) em placas de sílica gel 60

F254 (VETEC) e quantificados. O biossurfactante LBBMA 168 foi recuperado com o uso de célula de

ultra-filtração (modelo Amicon) munida de membrana com limite de exclusão de 500 e 1000

Daltons (LIN et al. 1998), seguido da CCDC e quantificação. Os componentes plotados nas placas

de CCDC foram visualizados sob lâmpada UV (254 nm) e revelados pela aplicação de ninhidrina a

0,2% ou H2SO4 a 3 mol L-1, seguida do aquecimento das placas a 100°C por 5 minutos

(HOROWITZ et al., 1990). As frações impuras foram fracionadas em cromatografia de camada

delgada preparativa (CCDP) e eluídas em misturas de clorofórmio e metanol, para separação dos

compostos presentes nas misturas. Para isso, utilizou-se placa de sílica gel 60 F254 (VETEC), com

revelação sob luz UV.

As soluções de surfactantes foram preparadas com o uso de água ultra-pura milliQ

Millipore®, sendo o pH da solução ajustado para 6,8 com solução de NaOH a 1 mol L-1. As

concentrações testadas estão listadas na Tabela 3.2.


98

Tabela 3.2. Concentrações dos surfactantes utilizados no ensaio de toxicidade aguda com Vibrio fischeri

SURFACTANTE Concentração (mg L-1)

LBBMA 111A *330

LBBMA 155 *400

LBBMA 168 **500

LBBMA 191 ***440

LBBMA 201 *440

SDS® *4710


*Concentração equivalente a 2,22 CMC.

**Concentração equivalente a 2,5 CMC.

***Concentração equivalente a 2,9 CMC.

3.3.2. Avaliação da Toxicidade Aguda de Biossurfactantes para a Bactéria

Luminescente Vibrio fischeri

Os ensaios de toxicidade aguda dos surfactantes foram executados segundo o protocolo

Microtox (Azur Environmental Corp.) para o teste básico. As medidas de resposta bioluminescente

foram realizadas em um analisador Microtox M500®.

O organismo-teste foi a bactéria bioluminescente Vibrio fischeri. Para realização do teste,

foram usadas culturas liofilizadas contendo 108 células da bactéria por ampola.

Para o teste de Toxicidade Aguda, a rehidratação da bactéria liofilizada foi efetuada com

água ultra-pura. A solução usada como diluente, cloreto de sódio (NaCl) a 2%, também foi

preparada com água ultra-pura, para fornecer proteção osmótica ao microrganismo-teste.

A solução de ajuste osmótico (OAS) foi uma solução de NaCl a 22%, também preparada

com água ultra-pura para o ajuste da osmolaridade das amostras em teste.


99

- Determinação da CE50 dos biossurfactantes

A determinação da concentração efetiva em que ocorre a inibição de 50% da emissão de luz

por V. fischeri (CE20) foi determinada com o uso do software OmniTM (Azur Corp.), acoplado ao

equipamento Microtox M500®.

Não sendo observada inibição na emissão de luz pelo microrganismo-teste, o resultado foi

relatado como ausência de efeito tóxico da amostra analisada, nas condições do teste.

3.3.3. Avaliação da Toxicidade de Biossurfactantes Para Isolados Bacterianos

Foram utilizados quatro isolados bacterianos (Tabela 3.3) pertencentes à coleção de

culturas do LBBMA, previamente selecionados quanto ao potencial de degradação de petróleo.

Tabela 3.3. Isolados microbianos utilizados para a avaliação da toxicidade de surfactantes

Isolado Tipo de Isolamento Origem

Acinetobacter baumannii LBBMA 04 Plaqueamento direto solo de “landfarming” – REGAP1

Acinetobacter junni LBBMA 36 Cultura de enriquecimento em petróleo

solo de “landfarming” – REGAP

Pseudomonas sp. LBBMA 101B Plaqueamento direto solo contaminado com óleo de motor da oficina da UFV2

Acinetobacter baumanni LBBMA ES11

Cultura de enriquecimento em petróleo

solo de “landfarming” – REGAP

1REGAP – Refinaria de Gabriel Passos, Betim, Minas Gerais. 2UFV – Universidade Federal de Viçosa, Viçosa, Minas Gerais.

Os efeitos tóxicos dos surfactantes biológicos LBBMA 111A, LBBMA 155, LBBMA 168,

LBBMA 191 e LBBMA 201 sobre culturas puras de A. baumanniii LBBMA 04, A. junni LBBMA 36,

Pseudomonas sp. LBBMA 101B e A. baumannii LBBMA ES11 (Tabela 3.3), foram avaliados mediante

o acompanhamento do crescimento dos isolados na presença dos biossurfactantes, em

concentrações equivalentes a 2, 4 ou 8 vezes a concentração micelar crítica (CMC). Um volume de

inóculo suficiente para se obter uma densidade ótica a 600 nm correspondente a 0,05 foi


100

adicionado a poços de microplacas contendo 150 µL de meio mineral (NMP) suplementado com

glicose (2%) e o surfactante sob avaliação. As microplacas foram incubadas a 30 °C, sem agitação.

O crescimento microbiano foi acompanhado por meio da medida da densidade ótica a 560nm. Como

controle, foi utilizado frasco contendo meio mineral NMP inoculado sem a adição do biossurfactante

e suplementado com glicose.


101


3.4.1. Toxicidade Aguda de Biossurfactantes para a Bactéria Luminescente Vibrio

fischeri

Vibrio fischeri é uma bactéria Gram negativa marinha e sua luminescência é a base para

vários bioensaios de toxicidade, onde é utilizada para avaliar desde água contaminada, sedimentos

de solo, água pluvial, entre outros. Em todos esses sistemas, a toxicidade é avaliada medindo-se

até que ponto a substância causa inibição da emissão de luz pela bactéria (JENNINGS, 2001). A

produção de luz é diretamente proporcional à atividade metabólica da bactéria e a inibição da

atividade enzimática causa uma diminuição na quantidade de luz emitida.

A bioluminescência de V. fischeri é um fenômeno cuja regulação é complexa. Existem

vários circuitos de regulação da quantidade de luz emitida, sendo que três principais fatores são

conhecidos: toda luminescência é dependente do status de energia da célula, o qual está

relacionado com a disponibilidade de ATP e de FMNH2; a bioluminescência, sendo um processo

catalítico enzimático, é dependente do processo biossintético; a bioluminescência é regulada pela

concentração externa de uma pequena molécula orgânica, o autoindutor (BACKHAUS et al., 1997

citados por HARMEL, 2004). A emissão de luz pelas bactérias é influenciada pelo fenômeno

chamado de “quorum sensing”, que se traduz em um sinal de concentração celular. Muitas

bactérias são capazes de monitorar suas densidades populacionais utilizando-se para isso de

moléculas sinalizadoras, como por exemplo a N-acilhomoserina lactona. Essas moléculas

sinalizadoras são responsáveis por induzir a emissão da biolumenescência por V. fischeri (ZHANG,

2002, citado por HARMEL, 2004).

CE50 foi definida como a concentração da amostra-teste que causa uma redução de 50%

na quantidade de luz emitida pela suspensão bacteriana utilizada no ensaio. Nas concentrações

testadas, nenhum dos biossurfactantes foi tóxico a V. fischeri (Figura 3.1). No maior tempo de

exposição (30 minutos), a máxima inibição foi obtida com o biossurfactante produzido por

Arthrobacter oxydans LBBMA 201, que na maior concentração avaliada (440 mg L-1, equivalente a

2,2 CMC) foi de apenas 32% (Figura 3.1 E).


102

Concentração de Surfactante (mg L-1)0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500

Inib

ição

de L

umin

escê

ncia

(%)

5

10

15

20

25

30

35

40


Inib

ição

de L

umin

escê

ncia

(%)

5

10

15

20

25

30

35

40

LBBMA 111A


Inib

ição

de L

umin

escê

ncia

(%)

5

10

15

20

25

30

35

40

Concentração de Surfactante (mg L-1)0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500

Inib

ição

de L

umin

escê

ncia

(%)

0102030405060708090

100


Inib

ição

de L

umin

escê

ncia

(%)

5

10

15

20

25

30

35

40


Inib

ição

de L

umin

escê

ncia

(%)

5

10

15

20

25

30

35

40LBBMA 155

LBBMA 168 LBBMA 191

LBBMA 201 SDS

5 min 15 min 30 minTempo de exposição:

Figura 3.1. Inibição da luminescência da bactéria Vibrio fischeri após exposição de diferentes

concentrações dos biossurfactantes (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D)

LBBMA 191, (E) LBBMA 201 e (F) do surfactante sintético SDS®. Dados relativos à média de três

repetições com as barras de erros representando ± o desvio-padrão.

A

C

E

D

F

B


103

SDS® foi tóxico para V. fischeri. Como mostrado na Figura 3.1, a inibição na emissão de luz

ou a toxicidade de SDS® para a bactéria, aumentou com o aumento de sua concentração. A CE50

aos 5 minutos de exposição foi alcançada com uma concentração em torno de 560 mg L-1,

equivalente a apenas 0,27 CMC (Figura 3.1 F). Aos 30 minutos de exposição, a CE50 foi obtida na

concentração de 450 mg L-1, equivalente a 0,21 CMC. Nesse mesmo tempo de exposição, a

emissão de luz pela bactéria foi altamente inibida (inibição= 84,52 %) pelo SDS® na concentração

de 4.710 mg L-1, equivalente a 2,2 CMC. Comparativamente, os biossurfactantes, em

concentrações equivalentes a 2,2 CMC (LBBMA 111A, LBBMA 155 e LBBMA 201), 2,5 CMC

(LBBMA 168) ou 2,9 CMC (LBBMA 191) (Tabela 3.2) não provocaram efeito tóxico.

Os efeitos tóxicos de surfactantes sobre bactérias podem ser explicados por dois principais

fatores: (1) rompimento da membrana celular pela interação do surfactante com os componentes

lipídicos e (2) reação da molécula de surfactante com proteínas essenciais para o funcionamento

da célula (JENSEN, 1999). Em pH igual ou superior a 7,0, surfactantes catiônicos são mais tóxicos,

enquanto que os aniônicos demonstram um comportamento mais tóxico em valores de pH abaixo

de 7,0. Em geral, surfactantes não-iônicos são menos ativos contra bactéria que surfactantes

iônicos (VOLKERING et al., 1998).

Os resultados obtidos neste trabalho confirmam que os biossurfactantes aniônicos LBBMA

111A, LBBMA 155, LBBMA 168, LBBMA 191 e LBBMA 201 não apreesentam toxicidade significava

a V. fischeri, comparativamente ao SDS.


104

3.4.2. Efeitos de surfactantes no Crescimento de Acinetobacter baumannii LBBMA

04, Acinetobacter junni LBBMA 36, Pseudomonas sp. LBBMA 101B e

Acinetobacter baumanni LBBMA ES11 em meio mineral com glicose

As Figuras 3.2 a 3.5 ilustram os efeitos de diferentes concentrações (2CMC, 4CMC e

8CMC) dos surfactantes bacterianos LBBMA 111A, LBBMA 155, LBBMA 168, LBBMA 191, LBBMA

201 e do sintético SDS® no crescimento de culturas puras de A. baumanniii LBBMA 04, A. junni

LBBMA 36, Pseudomonas sp. LBBMA 101B e A. baumannii LBBMA ES11, em meio mineral

suplementado com glicose.

Na concentração equivalente a 2CMC, não houve mudança significativa no crescimento

dos isolados bacterianos na presença dos biossurfactantes, indicando que esses compostos não

causaram efeitos de toxicidade para as bactérias utilizadas (Figuras 3.2 a 3.5).

Na concentração equivalente a 8CMC, todos os surfactantes avaliados causaram inibição

total no crescimento dos isolados bacterianos utilizados, comprovando a toxicidade desses

surfactantes em altas concentrações. Esses dados dão suporte a estudos que sugerem maior

efetividade de surfactantes em promover a degradação de compostos orgânicos hidrofóbicos

quando em baixas concentrações (ARONSTEIN et al., 1991; HERMAN et al., 1997).

Os surfactantes LBBMA 155, LBBMA 191 e SDS®, em concentração referente a 4CMC,

afetaram o crescimento do isolado A. junni LBBMA 36 em meio mineral com glicose, causando

inibição total do seu crescimento (Figuras 3.5). GRIMBERG & AITKEN (1995) e GUHA & JEFFE

(1996), ao avaliarem o efeito da concentração de surfactante sobre adegradação de fenantreno por

culturas puras, em meio líquido, observaram que os surfactantes, em concentrações acima da sua

CMC, inibiram completamente a degradação do composto.

O SDS® causou inibição parcial do crescimento de A. baumannii LBBMA 04, A. junni

LBBMA 36 e Pseudomonas sp. LBBMA 101B, quando presente na concentração equivalente a

2CMC (Figuras 3.2 a 3.4). Esse resultado é coerente com a observada redução de emissão de luz

por V. fischeri, quando na presença de igual concentração desse surfactante (Figura 3.1). Em altas

concentrações (4CMC e 8CMC), o SDS® causou inibição total do crescimento bacteriano. A


105

observada toxicidade de surfactantes, em altas concentrações, é atribuída ao efeito tóxico sobre as

membranas bacterianas (BRANDT et al., 2001).

Os resultados mostram que, na presença de glicose, a redução da atividade microbiana de

A. baumannii LBBMA 04, A. junni LBBMA 36, Pseudomonas sp. LBBMA 101B e A.baumanni

LBBMA ES11, na presença de biossurfactantes, foi muito menos significativa do que na presença

do surfactante sintético SDS® (Figuras 3.2-3.5).

Em estudos que avaliaram o efeito do surfactante sintético TRITON X-100 na mineralização

de glicose por duas linhagens de Sphingomonas sp., demonstrou-se que o surfactante causou

efeitos negativos no seu crescimento (WILLUMSEN et al., 1998). Em outros estudos, foi

demonstrado que a presença dos surfactantes LAS, TWEEN-80 e TDTMA resultou em inibição

significativa do crescimento de Mycobacterium sp. em meio R2A (REASONER & GELDREICH,

1985), sendo o seu crescimento inibido somente em altas concentrações (ZIQING OU, 2000).


106

Figura 3.2. Efeitos da concentração dos biossurfactantes (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191, (E) LBBMA 201 e (F) do surfactante sintético SDS® no crescimento de Acinetobacter baumannii LBBMA 04, em meio mineral com glicose a 2%. Os dados representam as médias de três repetições.

Tempo (horas)

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40

DO60

0 nm

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Tempo (horas)

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40

DO60

0 nm

0,0

0,2

0,4

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1,0

1,2

Tempo (horas)

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40

DO60

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0,0

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1,2

Tempo (horas)

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40

DO60

0 nm

0,0

0,2

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1,0

1,2

Tempo (horas)

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40

DO60

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0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

Tempo (horas)

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40

DO60

0 nm

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

LBBMA 111A LBBMA 155

LBBMA 191LBBMA 168

LBBMA 201 SDS

ausência de surfactante 2CMC 4CMC

A B

C D

E F


107

Figura 3.3. Efeitos da concentração dos biossurfactantes (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191, (E) LBBMA 201 e (F) do surfactante sintético SDS® no crescimento de Acinetobacter baumanni LBBMA ES11, em meio mineral com glicose a 2%. Os dados representam as médias de três repetições.

Tempo (horas)

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40

DO60

0 nm

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

Tempo (horas)

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40

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Tempo (horas)

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40

DO60

0 nm

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0,2

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0,8

1,0


LBBMA 191LBBMA 168

LBBMA 201 SDS


A B

C D

E F


108

Figura 3.4. Efeitos da concentração dos biossurfactantes (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191, (E) LBBMA 201 e (F) do surfactante sintético SDS® no crescimento de Pseudomonas sp. LBBMA 101B, em meio mineral com glicose a 2%. Os dados representam as médias de três repetições.

Tempo (horas)

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36

DO60

0 nm

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

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0 4 8 12 16 20 24 28 32 36

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1,0

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2CMC 4CMC


LBBMA 168 LBBMA 191

SDSLBBMA 201

ausência de surfactante

A B

C D

E F


109

Figura 3.5. Efeitos da concentração dos biossurfactantes (A) LBBMA 111A, (B) LBBMA 155, (C) LBBMA 168, (D) LBBMA 191, (E) LBBMA 201 e (F) do surfactante sintético SDS® no crescimento de Acinetobacter junni LBBMA 36, em meio mineral com glicose a 2%. Os dados representam as médias de três repetições.

Tempo (horas)

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40

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0 nm

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0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40

DO60

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Tempo (horas)

0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40

DO60

0 nm

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2


LBBMA 111A

LBBMA 168 LBBMA 191

LBBMA 155

LBBMA 201 SDS

A B

C D

E F


110

3.5. CONCLUSÕES


não apresentam toxicidade significativa para V. fischeri em concentrações próximas a 2 CMC.

Nessa concentração, o surfactante sintético SDS® inibe em cerca de 84% a emissão de luz por

essa bactéria.

Quando presentes em altas concentrações (8CMC), todos os surfactantes demonstraram

efeitos negativos no crescimento dos isolados Acinetobacter baumannii LBBMA 04, A. junni LBBMA

36, Pseudomonas sp. LBBMA 101B e A. baumanni LBBMA ES11.

Os biossurfactantes, em concentrações de 2CMC e 4CMC, não provocaram alteração no

crescimento dos isolados bacterianos.

Em concentração de 2CMC, o surfactante sintético SDS® é parcialmente tóxico aos

isolados bacterianos; em concentração acima de 4CMC, esse surfactante sintético inibe

completamente o crescimento dos isolados.


111


ARONSTEIN, B.N., CALVILLO, Y.M. & ALEXANDER, M. 1991. Effects of surfactants at low concentrations on the desorption and biodegradation of sorbed aromatic compounds in soils. Environmental Science and Technology, 25, 1728-1731.

AZUR 1997 Microtox Manuals, Volumes 1-4. Microbics Corporation, 2232 Rutherford Road, Carlsbad, CA, USA.

BODOUR, A.A. & MAIER, R.M. 1998. Application of a modified drop-collapse technique for surfactant quantitation and screening of biosurfactant-producing microrganisms. Journal of


BRANDT, K.K., HESSELSØE, M., ROSLEV, P., HENRIKSEN, K. & SØRENSEN, J. 2001. Toxic effects of linear alkylbenzene sulfonate on metabolic activity, growth rate, and microcolony formation of Nitrosomonas and Nitrosospira strains. Applied and Environmental Microbiology, 66, 3262-3268.

EDWARDS, K.R., LEPO, J.E. & LEWIS, M.A. 2003. Toxicity comparison of biosurfactants and synthetic surfactants used in oil spill remediation to two estuarine species. Marine Pollution Bulletin, 46, 1309-1316.

GUHA, S. & JAFFE, P. 1996. Biodegradation kinetics of phenanthrene partitioned into the micellar phase of non-ionic surfactants. Environmental Science and Technology, 30, 605-611.

HAIGH, S.D. 1996. A review of the interaction of surfactants with organic contaminants in soil. Science Total Environmental, 185, 161-170.

HERMAN, D.C., ZHANG, Y. & MILLER, R.M.1997. Rhamnolipid (biosurfactant) effects on cell aggregation and biodegradation of residual hexadecane under satured flow conditions. Applied and


HARMEL, V. C. 2004. Padronização de um teste de toxicidade crônica com a Bactéria luminescente Vibrio fischeri para análise de qualidade de águas superficiais. Dissertação de

Mestrado. Universidade Regional de Blumenau, Blumenau, Santa Catarina.

JARDIN, W. F., PASQUINI, C., GUIMARAES, J. R., DEFARIA, L. D. 1990. Shortterm toxicity test using Escherichia coli: Monitoring CO2 production by flow injection analysis. Water Environmental Resource, 24, 351-354.

JENSEN, J., 1999. Fate and effects of linear alkylbenzene sulphonates (LAS) in the terrestrial environment. Science Total Environmental, 226, 93-111.


112

LAYTON, A.C., GREGORY, B, SCHULTZ, T.W., SAYLER, G.S. 1999. Validation of genetically engineered bioluminescent surfactant resistant bacteria as toxicity assessment tools. Ecotoxicology

and Environmental Safety 43, 222–228.

MANN, R.M. 2000. Toxicological impact of agricultural surfactants on Australian Frogs. Tese de

Doutorado, Curtin University of Technology.

NENDZA, M. & SEYDEL, J. K. 1988. Quantitative structure}toxicity ralationships for ecotoxicologically relevant biotest systems and chemicals. Chemosphere, 17, 1585-1602.

REASONER, D.J. & GELDREICH, E.E., 1985. A new medium for the enumeration and subculture of bacteria from potable water. Applied and Environmental Microbiology, 49, 1-7.

RETEUNA, C., VASSEUR, P., CABRIDENC, R. 1989. Performances of three bacterial assays in toxicity assessment. Hydrobiologia, 188, 149-153.

VAN BEELEN, P. & DOELMAN, P. 1997. Significance and application of microbial toxicity tests in assessing ecotoxicological risks of contaminants in soil and sediments. Chemosphere, 34, 455-499.

VATER, J., KABLITZ, B., WILDE, C., FRANKE, P., MEHTA, N., CAMEOTRA, S.S. 2002. Matrix-assisted laser desortion ionization-time of flight mass spectrometry of lipopeptide biosurfactants in whole cells and culture filtrates of Bacillus subtilis C-1 isolated from petroleum sludge. Applied and


VOLKERING, F., BREURE, A.M. & RULKENS, W.H. 1998. Microbiological aspectsof surfactant use for biological soil remediation. Biodegradation, 8, 401-417.

ZIQING OU. 2000. Separate and combined environmental behaviour of surfactants and polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH’s). Tese de Doutorado. Institute of Ecological Chemistry, GSF-Research Center for Environment and Health, Neuherberg, Germany.

WILLUMSEN, P. A. & KARLSON, U. 1997. Screening of bacteria, isolated from PAH-contaminated soils, for production of biosurfactant and bioemulsifiers. Biodegradation, 7, 415 – 423.

Capítulo 4. Resumo

113

CAPÍTULO 4 AVALIAÇÃO DA BIODEGRADABILIDADE DE BIOSSURFACTANTES

BACTERIANOS

4.1. RESUMO

Os surfactantes de origem biológica, biossurfactantes, têm sido intensamente estudados para

aplicações em diferentes segmentos industriais e em processos de remediação de ambientes

contaminados. As principais vantagens atribuídas aos biossurfactantes, comparativamente aos

surfactantes sintéticos, são a sua menor toxicidade, maior degradabilidade, produção a partir de

substratos renováveis e estabilidade em condições extremas de pH, salinidade e temperatura.

Neste trabalho, foi avaliada a biodegradabilidade de diferentes surfactantes bacterianos, em meio

líquido e em microcosmos de solo. A biodegradabilidade dos biossurfactantes por culturas puras e

por uma cultura mista foi avaliada por meio da evolução de CO2. Em fase líquida, a capacidade de

utilização dos biossurfactantes produzidos por Bacillus sp. LBBMA 111A, B. subtilis LBBMA 155,

Flavobacterium sp. LBBMA 168, Dietzia maris LBBMA 191 e Arthrobacter oxydans LBBMA 201

como fonte de carbono, foi demonstrada por todos os isolados testados (Acinetobacter baumanni

LBBMA ES11, Acinetobacter haemolyticus LBBMA 53 e Pseudomonas sp. LBBMA 101B). A

capacidade de degradação dos biossurfactantes por Pseudomonas sp. LBBMA 101B foi cerca de

54 vezes superior à de A. baumanni LBBMA ES11 e de 60 vezes à de A. haemolyticus LBBMA 53.

A capacidade de degradação do surfactante sintético SDS® por Pseudomonas sp. LBBMA 101B foi

também maior do que a obtida com A. baumanni LBBMA ES11 (12 vezes) e A. haemolyticus

LBBMA 53 (9 vezes). A produção de CO2 nos microcosmos de solos contaminados com os

biossurfactantes LBBMA 111A (2,31 μmol de CO2), LBBMA 155 (2,16 μmol de CO2), LBBMA 168

(1,48 μmol de CO2), LBBMA 191 (1,48 μmol de CO2) e LBBMA 201 (1,96 μmol de CO2) foi superior

Capítulo 4. Resumo

114

à obtida no microcosmo que continha o surfactante sintético SDS® (0,63 μmol de CO2). Após 166

horas de incubação, a cultura mista formada pelos isolados Acinetobacter baumannii LBBMA 04,


ES11A, presente nos microcosmos de solo, foi capaz de utilizar 68,3% do biossurfactante LBBMA

111A, 69,1% do biossurfactante LBBMA 155, 42,5% do biossurfactante LBBMA 168, 59,6% do

biossurfactante LBBMA 191, 73,4% do biossurfactante LBBMA 201 e 24,8% do surfactante

sintético SDS®, indicando que a cultura mista foi capaz de mineralizar os biossurfactantes. A

mineralização dos biossurfactantes, em fase líquida e em solo, foi confirmada pelo aumento da

tensão superficial nas soluções, comparativamente aos valores obtidos no início da incubação.

Palavras-chave: Biossurfactante; biodegradação; respirometria; biorremediação.

Capítulo 4. Intordução

115

4.2. INTRODUÇÃO

Surfactantes são compostos orgânicos que possuem comportamento anfifílico, isto é,

possuem duas regiões, hidrofóbica e hidrofílica. A parte hidrofóbica do tensoativo geralmente é

composta de cadeias alquílicas ou alquilfenílicas, contendo de 10 a 18 átomos de carbono. A

região hidrofílica é constituída por grupos iônicos ou não-iônicos ligados à cadeia carbônica

(ZIQING OU, 2000).

A degradação biológica de surfactantes é o mais importante mecanismo para a remoção

irreversível destas substâncias de ambientes aquáticos e terrestres e, por isso, a

biodegradabilidade é considerada como uma característica importante em processo de avaliação

quanto ao risco ambiental associado ao seu uso. A biodegradacão de moléculas tensoativas ocorre

quando microrganismos utilizam esses compostos como fonte de carbono e energia e envolve duas

etapas. Na primeira, ocorre a quebra da cadeia hidrocarbônica da molécula, causando modificação

estrutural do surfactante e perda imediata da sua anfifilicidade. Na segunda etapa, os produtos

resultantes da degradação primária são transformados em CO2, água e sais minerais

(SCHLEHECK, 2003).

A característica de biodegradabilidade de surfactantes pode ter efeitos positivos e

negativos no seu uso em processos de biorremediação. Os efeitos negativos podem ser causados

pelo esgotamento de minerais e oxigênio, pela potencial toxicidade dos intermediários da via de

degradação ou pela degradação preferencial do surfactante, em detrimento da degradação do

poluente (TIEHM, 1994). O efeito positivo mais óbvio da degradação de um surfactante é a sua

remoção do local tratado com o composto.

Embora muitos destes compostos possam ser degradados por microrganismos, alguns

surfactantes sintéticos aplicados em processos de remediação, como os sulfonatos alquilbenzenos

lineares (LAS), são persistentes sob condições anaeróbias. Em um estudo sobre a

biodegradabilidade de surfactantes, um biodegradável (Ramnolipídeo) e um recalcitrante (Triton X-

100®), sob condições aeróbias, de redução de nitrato, de redução de sulfato e em condições de

fermentação, demonstrou-se que o ramnolipídeo é biodegradável em todas as condições, enquanto

Capítulo 4. Intordução

116

que o Triton X-100 é parcialmente biodegradável sob condição aeróbia e não-biodegradável nas

demais condições (MOHAN et al., 2006).

Os biossurfactantes são considerados, de modo geral, como compostos menos tóxicos e

mais biodegradáveis que os surfactantes sintéticos. Contudo, na literatura disponível, os dados de

biodegradação para biossurfactantes são limitados (TIEHM, 1994). Neste trabalho, foi avaliada a

biodegradabilidade de biossurfactantes produzidos por diferentes espécies bacterianas em fase

líquida e em solo, em condições aeróbias.


117


4.3.1. Surfactantes

Foram avaliados seis tipos de surfactantes, sendo um sintético (SDS®) (MERCK) e cinco

microbianos, produzidos pelos isolados bacterianos Bacillus sp. LBBMA 111A, Bacillus subtilis

LBBMA 155, Flavobacterium sp. LBBMA 168, Dietzia maris LBBMA 191 e Arthrobacter oxydans

LBBMA 201. Os biossurfactantes foram produzidos no Laboratório de Biotecnologia e

Biodiversidade para o Meio Ambiente (LBBMA) e o isolamento foi realizado utilizando-se as

técnicas de precipitação ácida, ultra-filtração e cromatografia de camada fina (TLC). As

propriedades ativas de superfície de cada surfactante estão descritas na Tabela 4.1.


SURFACTANTE γCMC (mN m-1) CMC (mg L-1) EQUAÇÕES*

LBBMA 111A 33,9 150 26,53**e (94,28*/(x+79,6*))

LBBMA 155 34,6 180 27,69**e (86,04*/(x+77,1*))

LBBMA 168 38,8 200 37,98 – 2290,15o/x + 599127,5**/x2 - 22386626**/x3

LBBMA 191 35,0 150 29,75**e (52,2*/(x+45,76*))

LBBMA 201 36,6 200 27,25**e (118,18*/(x+110,08*))

SDS® 39,0 2120 29,26**e (397,4**/(x-703,13**))


* significativo a *5% e a **1%.




da glicose). Flavolipídeos de Flavobacterium sp. LBBMA 168 foram produzidos em meio mineral


118

utilizado por BODOUR & MILLER-MAIER (1998) contendo somente a glicose a 2% (p v-1) como

fonte de carbono. O cultivo foi realizado em frascos erlenmeyer a 30°C em agitador orbital (New

Brunswick Scientific), com agitação constante de 200 rpm por sete dias.


















As soluções de surfactantes foram preparadas com o uso de água ultra-pura milliQplus

(MILLIPORE), sendo o pH da solução ajustado para 6,8 com solução de NaOH a 1 mol L-1. A

concentração dos surfactantes nos ensaios de degradação foi a equivalente a 2 vezes sua

concentração micelar crítica (CMC) (Tabela 4.1).

4.3.2. Microrganismos Utilizados nos Ensaios de Degradação

As culturas puras de Acinetobacter haemolyticus LBBMA 53, Acinetobacter baumanni

LBBMA ES11 e Pseudomonas sp. LBBMA 101B, isoladas de amostras de solo e água coletadas


119

em diferentes áreas com histórico de contaminação por petróleo e derivados e com reconhecida

capacidade de degradação de hidrocarbonetos de petróleo, foram utilizadas nos ensaios de

degradação de surfactantes em fase líquida.

Os estudos de degradabilidade dos surfactantes em microcosmos de solo foram

conduzidos com o uso de uma cultura mista contendo os isolados bacterianos Acinetobacter

baumannii LBBMA 04, Acinetobacter junni LBBMA 36, Pseudomonas sp. LBBMA 101B e

Acinetobacter baumanni LBBMA ES11, obtidos de amostras de solo e água coletadas em

diferentes áreas com histórico de contaminação por petróleo e derivados. Esses isolados, em

estudos anteriores de caracterização de isolados pertencentes ao banco de culturas do Laboratório

de Biotecnologia e Biodiversidade Aplicada ao Meio Ambiente (LBBMA), demonstraram habilidade

em degradar distintos hidrocarbonetos de petróleo.

4.3.3. Avaliação da biodegradabilidade de surfactantes bacterianos

4.3.3.1. Ensaio de Biodegradabilidade em Fase Líquida

A degradabilidade dos biossurfactantes em fase líquida por culturas puras de bactérias foi

determinada por meio de técnica de respirometria (FRANZETTI et al., 2006). O volume de inóculo

do isolado em teste, suficiente para se obter DO600 correspondente a 0,05, foi adicionado a frascos

respirométricos de 125 mL (GibcoBRL, Life Technologies) contendo 10 mL de uma solução de

biossurfactante (2CMC) em meio mineral NMP (MARGESIN & SCHINNER, 1997). Os frascos

foram acoplados a um respirômetro dotado de um leitor de infravermelho (Sable Systems

International, NE, USA). A liberação do CO2 produzido pelas células bacterianas foi registrada ao

longo de 7 dias. Como controle, foi utilizado frasco contendo o meio mineral sem a adição de

biossurfactante, porém inoculado com as bactérias em estudo.

Ao final do período de incubação, a concentração de biossurfactante residual em solução

foi determinada após a centrifugação das amostras a 10.000 g por 20 minutos. O extrato foi

submetido à medição da tensão superficial pelo método do anel de du Nouy em tensiômetro (Fisher

Scientific, Pittsburgh, EUA) (COOPER et al., 1979).


120

O experimento foi conduzido segundo um esquema fatorial (7 X 3) correspondente a sete

surfactantes e a três bactérias, com duas repetições. Foi realizada uma análise de variância

(ANOVA), a 5% de probabilidade. Posteriormente, as médias foram comparadas pelo teste de

Tukey a 5% de probabilidade.

4.3.3.2. Ensaio de Biodegradabilidade em Microcosmos de Solo

Um volume de inóculo de cada isolado bacteriano componente da cultura mista, suficiente

para se obter uma concentração final de 106 UFC g-1 de solo, foi adicionado a frascos

respirométricos com capacidade para 125 mL (GibcoBRL, Life Technologies). Os frascos

continham 10g de solo seco previamente peneirado a 2 mm de diâmetro e esterilizado por radiação

gama. A umidade foi ajustada para 60% da capacidade máxima de retenção pela adição de 4,06

mL de uma solução de surfactante cuja concentração final, nas 10 g de solo, foi de 2CMC. Os

frascos foram acoplados a um respirômetro dotado de um leitor de infravermelho (Sable Systems

International, NE, USA). A liberação do CO2 produzido pelas células bacterianas foi registrada ao

longo de 166 horas. Como controle foi utilizado frasco contendo solo esterilizado sem a adição de

biossurfactante, porém inoculado com a bactéria em estudo (FRANZETTI et al., 2006). Como

controle foi utilizado frasco contendo solo esterilizado sem a adição de biossurfactante inoculado e

frasco contendo solo esterilizado com a adição de surfactante e não-inoculado.

Ao final do período de incubação, o biossurfactante residual foi recuperado adicionando-se

25 mL de água destilada aos frascos, seguindo-se agitação a 200 rpm por uma hora e

centrifugação a 10.000 g. por 20 minutos, JOUAN modelo B4i. O sobrenadante foi filtrado através

de membrana Millipore 0,45µm, para medição da tensão superficial pelo método do anel de du

Nouy em tensiômetro (Fisher Scientific, Pittsburgh, EUA) (COOPER et al., 1979). O valor

encontrado foi usado para calcular a concentração do surfactante relativa à sua CMC, utilizando-se

equações de regressão da concentração do surfactante e tensão superficial. Estimou-se, então, a

concentração de cada surfactante no solo, nos tempos inicial e final do período de incubação. A

redução na concentração de cada surfactante foi calculada e expressa em %/100 da CMC.


121

Foi realizada uma análise de variância (ANOVA), a 5% de probabilidade. Posteriormente, as

médias foram comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.


122


4.4.1. Potencial de Culturas Puras em Degradar os Biossurfactantes

Os isolados bacterianos A. haemolyticus LBBMA 53, A. baumanni LBBMA ES11 e

Pseudomonas sp. LBBMA 101B foram capazes de utilizar todos os surfactantes avaliados no

metabolismo respiratório, quando cultivados em meio mineral (Tabela 4.2).

Os isolados A. haemolyticus LBBMA 53 e A. baumanni LBBMA ES11 não diferiram quanto

à degradação dos biossurfactantes aniônicos e do surfactante sintético SDS®. A capacidade de

degradação dos biossurfactantes por Pseudomonas sp. LBBMA 101B foi cerca de 54 vezes

superior à de A. baumanni LBBMA ES11 e de 60 vezes superior à de A. haemolyticus LBBMA 53.

A capacidade de degradação do surfactante sintético SDS® por Pseudomonas sp. LBBMA 101B foi

também maior do que a obtida com A. baumanni LBBMA ES11 (12 vezes) e A. haemolyticus

LBBMA 53 (9 vezes) (Tabela 4.2).

Não houve diferença significativa entre a intensidade de degradação dos diferentes

biossurfactantes pelos três isolados bacterianos avaliados. Também não houve diferença

significativa entre a intensidade de degradação dos biossurfactantes LBBMA 111A, LBBMA 155,

LBBMA 168 E LBBMA 201 e a do surfactante sintético SDS® pelos isolados A. haemolyticus

LBBMA 53 e A. baumanni LBBMA ES11 (Tabela 4.2). Por outro lado, trealolipídeo produzido por

Dietzia maris LBBMA 191 propiciou uma atividade respiratória desses isolados significativamente

maior do a obtida com o SDS®.

A intensidade de degradação do SDS® por Pseudomonas sp. LBBMA 101B foi

significativamente menor (cerca de 10 vezes) do que a dos biossurfactantes. Esse efeito pode estar

relacionado a um efeito tóxico do composto ou de algum intermediário formado durante sua

degradação. Segundo VAN GINKEL (1996), a degradação de alguns surfactantes sintéticos por

atividade microbiana leva à geração de metabólitos tóxicos. Ao avaliarem a degradação de SDS®

por culturas puras, SINGH et al. (1998) relataram que o crescimento de Pseudomonas aeruginosa

foi completamente inibido pela presença do SDS®, mesmo em concentrações abaixo da CMC.


123

Em trabalhos recentes realizados no LBBMA, foi avaliado o efeito de diferentes

concentrações de SDS® (2CMC, 4CMC e 8CMC) sobre o crescimento dos isolados A. baumanni

LBBMA ES11 e Pseudomonas sp. LBBMA 101B em meio mineral adicionado de glicose. A

presença de SDS® na concentração de 2CMC inibiu parcialmente o crescimento dessas bactérias e

totalmente nas concentrações de 4CMC e 8CMC, confirmando o efeito tóxico do composto.

A atividade respiratória nos tratamentos com surfactantes foi significativamente maior do

que em meio mineral sem surfactantes (Tabela 4.2). Esse resultado indica que a atividade

respiratória naqueles tratamentos está ligada à utilização dos surfactantes no metabolismo

respiratório, e não ao consumo de reservas celulares (metabolismo endógeno). Embora a

confirmação de que o CO2 emitido nos tratamentos com surfactantes é originado da degradação de

suas moléculas requeira o uso de outras técnicas, como a de marcação dos surfactantes com 14C,

a maior atividade respiratória na sua presença é um indício de que esses compostos são

efetivamente a fonte do CO2 emitido.


124

Tabela 4.2. Produção de CO2 durante o cultivo de Acinetobacter haemolyticus LBBMA 53,

Acinetobacter baumanni LBBMA ES11 e Pseudomonas sp. LBBMA 101B em meio

mineral suplementado com biossurfactantes e com o surfactante sintético SDS®

A. haemolyticus LBBMA 53

A. baumanni LBBMA ES11

Pseudomonas sp. LBBMA 101B TRATAMENTO

CO2 (μmol mL-1)*

1: LBBMA 111A 3,31 ABb 3,99 ABb 226,71 A

2: LBBMA 155 3,15 ABb 4,22 ABb 233,67 A

3: LBBMA 168 3,24 ABb 4,04 ABb 208,19 A

4: LBBMA 191 5,12 Ab 4,40 Ab 209,15 A

5: LBBMA 201 3,68 ABb 4,09 ABb 234,73 A

6: SDS® 2,86 Bb 2,09 Bb 24,78 B

7: Controle 0,16 Ca 0,12 Ca 2,00 C

LBBMA 111A= Surfactante produzido por Bacillus sp. LBBMA 111A; LBBMA 155= Surfactante produzido por Bacillus subtilis LBBMA 155; LBBMA 168= Surfactante produzido por Flavobacterium sp. LBBMA 168; LBBMA 191= Surfactante produzido por Dietzia maris LBBMA 191; LBBMA 201= Surfactante produzido por Arthrobacter oxydans LBBMA 201; SDS®= Surfactante sintético SDS®. Os dados representam a média de duas repetições. Médias seguidas da mesma letra maiúscula, na coluna, e minúscula, na linha, não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade. *Os dados referem-se ao CO2 acumulado durante 166 horas de incubação estática a 30oC.

A elevação da tensão superficial dos meios contendo os surfactantes, após 166 horas de

incubação na presença dos isolados A. haemolyticus LBBMA 53, A. baumanni LBBMA ES11 e

Pseudomonas sp. LBBMA 101B (tabela 4.3), consubstancia a indicação de que as moléculas de

surfactantes foram metabolizadas e convertidas, em parte, a CO2. Os surfactantes foram

acrescentados ao meio em uma concentração equivalente a 2CMC. Quando a concentração de

surfactantes em uma solução aquosa atinge valores acima de sua CMC, a maior parte das

moléculas se encontra na forma de micelas, e o valor de tensão superficial não varia com o

aumento da concentração (ROSEN, 2004). Porém, à medida que a concentração diminui numa

faixa abaixo da CMC, a tensão superficial entre o meio aquoso e o ar aumenta, até um valor-limite


125

que, da água pura a 25oC, está em torno de 72 mN m-1 (ROSEN, 2004). Conclui-se, portanto, que a

elevação dos valores de tensão superficial dos meios, após a incubação, está necessariamente

relacionada à redução da concentração dos surfactantes para valores abaixo da CMC.

Tabela 4.3. Tensão superficial (γ) nos sobrenadantes dos meios de cultura inoculados e

suplementados com surfactantes, após cultivo de 166 horas, a 30 ºC

A. haemolyticus LBBMA 53

A. baumanni LBBMA ES11

Pseudomonas sp. LBBMA 101B SURFACTANTE (γCMC Inicial )*

γ FINAL (mN m-1)

LBBMA 111A / 32,7 47,7 C 48,8 B 60,6 A

LBBMA 155 / 33,1 42,6 C 46,2 B 62,6 A

LBBMA 168 / 34,2 45,7 C 47,6 B 62,3 A

LBBMA 191 / 34,4 50,6 B 50,9 B 61,2 A

LBBMA 201 / 36,5 49,9 C 51,2 B 64,1 A

SDS® / 37,9 42,4 C 49,0 B 52,6 A

LBBMA 111A= Surfactante produzido por Bacillus sp. LBBMA 111A; LBBMA 155= Surfactante produzido por Bacillus subtilis LBBMA 155; LBBMA 168= Surfactante produzido por Flavobacterium sp. LBBMA 168; LBBMA 191= Surfactante produzido por Dietzia maris LBBMA 191; LBBMA 201= Surfactante produzido por Arthrobacter oxydans LBBMA 201; SDS®= Surfactante sintético Dodecil Sulfato de Sódio. Os dados representam a média de duas repetições. Médias seguidas da mesma letra, na linha, não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade. * Tensão superficial nos meios de cultura no início do cultivo. O valor corresponde à tensão superficial na CMC.

A tensão superficial nos meios de cultura inoculados com Pseudomonas sp. LBBMA 101B

foi significativamente mais elevada do que nos meios em que foram cultivados os isolados A.

haemolyticus LBBMA 53 e A. baumanni LBBMA ES11 (4.3), o que representa uma menor

concentração dos surfactantes ao final do período de incubação. Esses resultados são condizentes

com a maior atividade respiratória nos tratamentos inoculados com Pseudomonas sp. LBBMA 101B

(Tabela 4.2), o que mais uma vez sugere que a atividade respiratória está ligada à degradação dos

surfactantes presentes no meio de crescimento. As tensões superficiais nos meios inoculados com


126

A. baumannii LBBMA ES11 foram significativamente mais elevadas do que as obtidas nos meios

inoculados com A. haemolyticus LBBMA 53, exceto na presença do biossurfactante produzido por

Dietzia maris LBBMA 191 (Tabela 4.3). Embora estatisticamente diferentes, as médias das tensões

superficiais nos meios inoculados com esses dois isolados foram muito próximas. Como exemplo, a

diferença entre a tensão superficial nos meios que continham o biossurfactante LBBMA 111A e

inoculados com A. haemoliticus ou A. baumannii foi de 1,1 mN m-1. Essa diferença representa uma

variação de apenas 2%, e é coerente com a observação de que não houve diferenças significativas

entre esses dois isolados quanto à atividade respiratória (Tabela 4.2).

4.4.2. Degradação de Biossurfactantes por Cultura Bacteriana Mista em Solo

Os biossurfactantes introduzidos em amostras de solo inoculado com uma cultura

bacteriana mista estimularam a emissão de CO2 (Tabela 4.4). Nos microcosmos de solo contendo

biossurfactantes, a emissão de CO2 foi significativamente maior (P<0,05) do que a obtida nos

microcosmos que não receberam esses compostos (Tabela 4.4).

Não houve diferença significativa entre a atividade respiratória nos microcosmos que

receberam os diferentes biossurfactantes (Tabela 4.4). Esse resultado é condizente com os obtidos

nos ensaios conduzidos em meio mineral inoculado com culturas puras (Tabela 4.2), e indicam que

os biossurfactantes avaliados são igualmente biodegradáveis pelas culturas bacterianas utilizadas

neste trabalho.

A evolução de CO2 nos microcosmos de solos contendo os biossurfactantes foi

significativamente superior à do microcosmo que continha o surfactante sintético SDS® (Tabela

4.4). Nas avaliações em meio mineral, foi demonstrado que diferenças significativas entre a

emissão de CO2 nos tratamentos com biossurfactantes e com SDS® foram encontradas,

invariavelmente, apenas nos inoculados com Pseudomonas sp. LBBMA 101B (Tabela 4.2).

Demonstrou-se, ainda, que a emissão de CO2 nos meios inoculados com essa bactéria foi quase

duas ordens de magnitude superior à obtida com os dois isolados de Acinetobacter. Com base nos

dados obtidos em meio líquido, especula-se que a maior parte do CO2 emitido pelos microcosmos


127

de solos contendo surfactantes tenha se originado da atividade de Pseudomonas sp. LBBMA 101B,

um dos componentes da cultura mista utilizada como inóculo. Isso explicaria a diferença

significativa entre os tratamentos com biossurfactantes e o tratamento que recebeu o surfactante

sintético SDS® (Tabela 4.4), uma vez que essa diferença é similar ao resultado obtido em meio

líquido.

Uma comparação entre atividade respiratória nos microcosmos de solo (Tabela 4.4) e em

meio líquido (Tabela 4.2) demonstra que a atividade microbiana, em solo, foi similar à observada

nos meios líquidos inoculados com os isolados de Acinetobacter. Porém, comparativamente ao

resultado obtido em meio líquido inoculado com Pseudomonas sp. LBBMA 101B, a atividade

respiratória, em solo, foi quase duas ordens de magnitude mais baixa. Esse resultado poderia

indicar que esse isolado, adicionado ao solo juntamente com outros isolados constituintes da

cultura mista, não se estabeleceu eficientemente. No entanto, dada a elevada capacidade das

Pseudomônades de habitarem o solo e diversos outros ambientes (OTENIO et al., 2005), a menor

atividade respiratória nessa matriz, comparativamente ao obtido em meio líquido, parece ser

atribuída a outra causa.

Os valores (calculados) de tensão superficial nas soluções dos solos contendo

surfactantes, ao final do período de incubação, foram apenas ligeiramente mais elevados do que os

de tensão ao início do período de incubação (Tabela 4.4). Esse aumento foi bem menos expressivo

do que o observado em meio líquido, o que representa uma concentração residual maior nas

soluções dos microcosmos de solo. Esse resultado pode indicar que tanto os biossurfactantes

quanto o surfactante sintético SDS foram adsorvidos às partículas do solo, o que pode lhes conferir

uma maior resistência à degradação pelas populações microbianas (URUM & TURGAY et al.,

2004). A menor diferença entre a tensão superficial ao início e ao final do período de incubação foi

obtida no tratamento que continha o SDS®, o que é condizente com a menor atividade respiratória

nesse tratamento e aponta para a baixa biodegradabilidade desse surfactante sintético no solo

(24,8%). Altos valores de tensão superficial final foram obtidos nas soluções dos solos contendo

biossurfactantes, o que resultou da degradação, pela cultura mista, de 68,33% do biossurfactante


128

LBBMA 111A, 69,1% do biossurfactante LBBMA 155, 42,5% do biossurfactante LBBMA 168, 59,6%

do biossurfactante LBBMA 191 e 73,4% do biossurfactante LBBMA 201.

Os surfactantes utilizados neste estudo são aniônicos e categorizados como de alto peso

molecular. Em função de sua estrutura, as vias de degradação desses compostos podem ser

divididas em duas etapas. Na primeira, ocorre a quebra da cadeia hidrofóbica do surfactante,

provocando um aumento na concentração micelar crítica (CMC). Essa modificação estrutural do

surfactante altera suas propriedades tensoativas, diminuindo alguns de seus efeitos indesejáveis

no meio, tais como a formação de espumas. Na segunda etapa, os produtos resultantes da

degradação primária são transformados em CO2, água e sais minerais, representando assim a

degradação completa do surfactante (mineralização). O principal mecanismo de biodegradação

aeróbia de surfactantes envolve a degradação da cadeia alquílica, seguida do grupo hidrofílico. A

quebra da cadeia alquílica é iniciada com a oxidação do grupo metil terminal, transformando-se

através da oxidação enzimática (ω-oxidação) em álcool, aldeído e, posteriormente, em ácido

carboxílico. Por sua vez, o ácido carboxílico é submetido à β-oxidação, a qual é catalisada por

enzimas alcano monooxigenase e desidrogenases. Esse mecanismo de degradação ocorre

predominantemente na natureza. Em decorrência de efeitos estéricos, a biodegradação aeróbia é

mais rápida quanto mais linear for o surfactante (SCHLEHECK, 2003).


129

Tabela 4.4. Emissão de CO2 e tensão superficial (γ) em microcosmos de solos estéreis e

inoculados com uma cultura bacteriana mista, na presença de surfactantes, após 166

horas de incubação estática a 30°C

γCMC (m Jm-2) Nº

MICROCOSMO

EVOLUÇÃO DE CO2 (μmol g-1)

*γCMC INICIAL γCMC FINAL

Redução do surfactante (%)

1 LBBMA 111A 2,31 A 37,9 54,3 68,33 A

2 LBBMA 155 2,16 A 36,7 52,6 69,07 A

3 LBBMA 168 2,15 A 37,3 51,4 42,5 C

4 LBBMA 191 1,97 A 37,7 52,6 59,6 B

5 LBBMA 201 1,49 A 36,8 51,2 73,4 A

6 SDS® 0,63 B 39,5 48,9 24,8 D

7 Controle 0,18 B - - -

LBBMA 111A= Surfactante produzido por Bacillus sp. LBBMA 111A; LBBMA 155= Surfactante produzido por Bacillus subtilis LBBMA 155; LBBMA 168= Surfactante produzido por Flavobacterium sp. LBBMA 168; LBBMA 191= Surfactante produzido por Dietzia maris LBBMA 191; LBBMA 201= Surfactante produzido por Arthrobacter oxydans LBBMA 201; SDS®= Surfactante sintético Dodecil Sulfato de Sódio. Os dados representam a média de duas repetições. * Tensão superficial na solução do solo, no início do cultivo. O valor corresponde à tensão superficial na CMC.

Conquanto a biodegradação de quaisquer compostos utilizados nos ambientes seja

desejável do ponto de vista da segurança ambiental, uma degradação muito intensa pode resultar

em problemas potenciais para sua aplicação. Os surfactantes, incluindo os de origem biológica, são

amplamente utilizados em aplicações industriais e ambientais (NITSCHKE & PASTORE, 2002).

Dentre as aplicações ambientais mais relevantes, mencionam-se seu papel como dispersantes de

manchas de óleo em ambientes aquáticos, como componentes de soluções de lavagem de

resíduos sólidos, incluindo solos, contaminados com poluentes orgânicos hidrofóbicos e metais

pesados e em vários processos de biorremediação, com o propósito de aumentar a solubilidade de

moléculas hidrofóbicas e, consequentemente, sua biodisponibilidade para as populações

microbianas responsáveis por sua biodegradação (DESAI & BANAT, 1997; SINGH et al., 2006).


130

Nesses casos, uma certa estabilidade dos surfactantes é desejável, para que os mesmos possam

desempenhar a atividade para a qual foram introduzidos. Neste contexto, os biossurfactantes

avaliados neste trabalho apresentaram uma característica que lhes confere um elevado potencial

para aplicações ambientais, uma vez que conciliam um grau aparentemente razoável de

estabilidade com a possibilidade de serem degradados pelas populações microbianas, tanto em

meio líquido quanto em solo.


131

4.5. CONCLUSÕES

Os biossurfactantes Surfactina, Iturina e Fengicina produzidos por Bacillus sp. LBBMA

111A, Surfactina produzida por B. subtilis LBBMA 155, trealolipídeo produzido por Dietzia maris

LBBMA 191, Artrofactina produzida por Arthrobacter oxydans LBBMA 201 e Flavolipídeos

produzidos por Flavobacterium sp. LBBMA 168 foram utilizados como substrato por culturas puras

de Acinetobacter haemolyticus LBBMA 53, Acinetobacter baumanni LBBMA ES11 e Pseudomonas

sp. LBBMA 101B em meio mineral.

Em meio líquido, Pseudomonas sp. LBBMA 101B apresentou uma capacidade de

degradação dos biossurfactantes cerca de duas ordens de magnitude maior do que A.

haemolyticus LBBMA 53 e A. baumanni LBBMA ES11.

A intensidade de biodegradação do surfactante sintético SDS em meio líquido, por

Acinetobacter haemolyticus LBBMA 53 e Acinetobacter baumanni LBBMA ES11, não difere da

intensidade de biodegradação dos biossurfactantes, mas é uma ordem de magnitude menor do que

a degradação dos biossurfactantes por Pseudomonas sp. LBBMA 101B.

Em solo, uma cultura mista composta dos isolados Acinetobacter baumannii LBBMA 04,


ES11 foi capaz de utilizar os biossurfactantes como substrato. Os biossurfactantes não diferiram

entre si quanto à capacidade de estimular a atividade respiratória da cultura mista.

Não houve degradação significativa do surfactante sintético SDS® em solo inoculado com a

cultura mista, durante sete dias de incubação.

Em análise comparativa, os surfactantes biológicos apresentaram um potencial de

degradabilidade superior ao do surfactante sintético. Em solo, apresentaram uma estabilidade que

pode ser compatível com aplicações ambientais, e ao mesmo tempo, uma biodegradabilidade que

reduz o risco de acumularem-se no ambiente indefinidamente. Conclui-se assim que, do ponto de

vista da biodegradabilidade e da segurança ambiental, esses compostos são mais indicados para

aplicações ambientais do que o surfactante sintético SDS®.


132


BODOUR, A.A. & MAIER, R.M. 1998. Application of a modified drop-collapse technique for

surfactant quantitation and screening of biosurfactant-producing microrganisms. Journal of


COOPER. D.G., ZAJIC. J.E., GERSON, D.F. 1979. Production of surface-active lipids by

Corynebacterium lepus. Applied and Environmental Microbiology, 37, 4-10.

DESAI, J. D. & BANAT, I. M. 1997. Microbial production of surfactants and their commercial

potential. Microbiology Molecular Biology Reviews, 61, 47-64.

FRANZETTI, A., DI GENNARO, P., BEVILACQUA, A., PAPACCHINI, M. & BESTETTI, G. 2006.

Environmental features of two commercial surfactants widely used in soil remediation

Chemosphere, 62, 1474–1480.

HOROWITZ, S., GILBERT, J. N. & GRILFIN, W.M. 1990. Isolation and characterization of a

surfactant produced by Bacillus licheniformis 86. Journal of Industrial Microbiology, 6, 243-248.

LIN, S.-C., CHEN, Y.-C., LIN, Y.M. 1998. General approach for the development of high-

performance liquid chromatography methods for biosurfactant analysis and purification. Journal of

Chromatografy A, 859, 149-159.

MOHAN, P.K., NAKHLA, G. & YANFUL, E.K. 2006. Biokinetics of biodegradation of surfactants

under aerobic, anoxic and anaerobic conditions. Water Research, 40, 533-540.

NITSCHKE, M. & PASTORE, G. 2002. Biossurfactantes: Propriedades e Aplicações. Química

Nova, 25, 772-776.

OTÊNIO, M.H., SILVA, M.T.L., MARQUES, M.L.O., ROSEIRO, J.C., BIDOIA, E.D. 2005. Benzene,

toluene and xylene biodegradation by Pseudomonas putida CCMI 852. Brazilian Journal of


ROSEN, M.J. 2004. Surfactants and interface phenomena. 2nd Ed. John Wiley & Sons, Inc.,

Hoboken, New Jersey, NY.


133

SCHLEHECK, D. 2003. Biodegradation of synthetic surfactants: linear alkylbenzenesulfonates

(LAS) and related compounds. Tese de doutorado. University of Konstanz, Germany.

SINGH, A., VAN HAMME, J.D. & WARD, O.P. 2006. Surfactants in icrobiology and biotechnology:

Part 2. Application aspects. Biotechnology Advances, 25, 99–121.

TIEHM, A.1994. Degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons in the presence of synthetic

surfactants. Applied and Environmental Microbiology, 60, 258–263.

URUM, K., TURGAY, P. 2004. Evaluation of biosurfactants for crude oil contaminated soil washing.

Chemosphere, 57, 1139-1150.

VAN GINKEL, C.G. 1996. Complete degradation of xenobiotic surfactants by consortia of aerobic

microorganisms. Biodegradation, 7, 151-164.

VATER, J., KABLITZ, B., WILDE, C., FRANKE, P., MEHTA, N., CAMEOTRA, S.S. 2002. Matrix-

assisted laser desortion ionization-time of flight mass spectrometry of lipopeptide biosurfactants in

whole cells and culture filtrates of Bacillus subtilis C-1 isolated from petroleum sludge. Applied and


ZIQING OU. 2000. Separate and combined environmental behaviour of surfactants and polycyclic

aromatic hydrocarbons (PAH’s). Tese de Doutorado. Institute of Ecological Chemistry, GSF-

Research Center for Environment and Health, Neuherberg, Germany.


134

CAPÍTULO 5 REMOÇÃO SIMULTÂNEA DE FENANTRENO E CÁDMIO DE SOLO

CONTAMINADO POR UMA SOLUÇÃO LIGANTE/BIOSSURFACTANTE

5.1. RESUMO

Surfactantes são eficientes como agentes de remediação de solos e sedimentos contaminados

com alguns tipos de metais pesados e de poluentes orgânicos hidrofóbicos. No entanto, dada a

distinta natureza desses contaminantes, sua remoção simultânea por soluções de surfactantes não

é eficiente. Neste trabalho, foi investigada a eficiência de combinações do ligante iodeto (I-) e

surfactantes produzidos por diferentes espécies de bactérias na remoção simultânea de cádmio

(Cd2+) e fenantreno de um latossolo vermelho-amarelo. Foram testados quatro surfactantes

microbianos produzidos pelos isolados Arthrobacter oxydans LBBMA 201, Bacillus sp. LBBMA

111A, Bacillus subtilis LBBMA 155 e Flavobacterium sp. LBBMA 168 e o sintético Triton X-100®,

com diferentes concentrações do ligante. Amostras de solo contaminadas com Cd2+ e fenantreno

foram agitadas durante 24 horas com uma solução de lavagem contendo surfactante/ligante. Após

cinco lavagens consecutivas, os teores de Cd2+ removido foram determinados por

espectrofotometria de absorção atômica e os de fenantreno por espectrofotometria UV. A remoção

de Cd2+ aumentou com o aumento da concentração do ligante, principalmente nas soluções

contendo os biossurfactantes produzidos pelos isolados LBBMA 155 e LBBMA 168 e o surfactante

Triton X-100®. As máximas eficiências de remoção de Cd2+ foram de 99,2% para os

biossurfactantes produzidos por LBBMA 201 e por LBBMA 111A, na presença de 0,336 mol L-1 de

I-. Já a eficiência máxima de remoção do Cd2+ pelo surfactante sintético Triton X-100® foi de 65,0%.

As soluções de biossurfactantes removeram entre 80% a 88% do fenantreno presente no solo, não


135

sendo a remoção influenciada pela presença do ligante. A solução do surfactante Triton X-100®,

removeu entre 73% e 88% do fenantreno e, diferentemente do observado com os biossurfactantes,

a presença do ligante I- influenciou significativamente a eficiência de remoção do contaminante

hidrofóbico. O trabalho permite concluir que o uso de um único reagente de lavagem, denominado

de surfactante-ligante, propicia a remoção simultânea de um metal pesado e de um composto

orgânico hidrofóbico.

Palavras-chave: Poluentes; remediação; descontaminação; metais pesados; PAH’s.


136

5.2. INTRODUÇÃO

Metais pesados e poluentes orgânicos hidrofóbicos, como os hidrocarbonetos

poliaromáticos (PAH’s), são dois dos mais importantes e freqüentes contaminantes de sedimentos

e solos. Quantidades significativas de metais pesados, incluindo zinco (Zn), chumbo (Pb), cádmio

(Cd), cromo (Cr) e cobalto (Co), juntamente com PAH’s e hidrocarbonetos clorados, são

encontrados em sedimentos marinhos (JAFFE et al., 2003) e em áreas urbanas industrializadas

(HO & HUI, 2001). A existência de correlações positivas entre Cd e Pb e bifenilas policloradas

(PCB’s) e PAH’s pode ser atribuída à existência de uma fonte comum de poluição do solo em áreas

de indústrias químicas e siderúrgicas (WEISS et al., 1994).

Metais pesados e compostos orgânicos hidrofóbicos exibem características químicas

distintas. Os metais pesados são relativamente móveis no solo, principalmente em condições de

pH baixo, onde encontram-se na forma iônica (SHIN et al., 2005). Os compostos orgânicos

hidrofóbicos, como os PAH’s, são relativamente insensíveis a mudanças de pH e exibem

propriedades lipofílicas (SHIN et al., 2005). Essas diferenças nas características químicas tornam

difícil o uso de um único reagente para remover, simultaneamente, os dois grupos de

contaminantes.

Em processos de remediação de solos, normalmente se utilizam ácidos orgânicos ou

inorgânicos e agentes quelantes para remover metais pesados (PETER et al., 1999; REDDY et al.,

2000; WASAY et al., 2000) e solventes ou surfactantes como agentes mais apropriados para a

remediação de poluentes orgânicos hidrofóbicos (FAVA et al., 1998; CHU et al., 2003).

Atualmente, a estratégia para remover simultaneamente os metais pesados e

contaminantes orgânicos hidrofóbicos em solo utiliza como agentes lixiviantes, entre outros, a água

destilada, ácido húmico, fosfolipídeos e dodecil sulfato de sódio (SDS®) (SCHMELLING et al., 1998;

HIRNER et al., 1998; ABRAMOVITCH et al., 2003). De todos eles, o SDS® é considerado como o

mais adequado para a solubilização dos contaminantes orgânicos, dada sua habilidade para

interagir com compostos hidrofóbicos e cadeias de hidrocarbonetos. Contudo, a capacidade do

SDS® de remover metais pesados (contaminantes hidrofílicos) não foi demonstrada (HIRNER et al.,

1998).


137

SHIN et al. (2000) demonstraram que o surfactante não-iônico Triton X-100®, em

combinação com um ligante inorgânico [iodeto (I-) ou tiocianato (SCN-)], propiciou a remoção de

Cd, Cu e Zn de um solo contaminado com metais pesados e PCB’s. Os autores propuseram que o

ligante forma um complexo com o íon metálico na solução de surfactante, reduzindo seu caráter

hidrofílico e permitindo sua adsorção no interior da micela do surfactante. Esse comportamento

pode levar à dessorção simultânea de metais pesados e compostos orgânicos hidrofóbicos

adsorvidos às partículas de solos e sedimentos.

Biossurfactantes e ligantes são potencialmente menos tóxicos a organismos do solo,

comparativamente a outros agentes químicos, como surfactantes sintéticos, ácidos fortes e agentes

quelantes. Contudo, não há relatos na literatura consultada de avaliação da eficiência da

combinação de biossurfactantes e ligantes na mobilização simultânea de compostos orgânicos

hidrofóbicos e metais pesados. Neste trabalho, combinações do ligante (I-) e biossurfactantes

produzidos por diferentes espécies bacterianas foram avaliadas quanto à eficiência de remoção

simultânea de fenantreno e cádmio de solo.


138


5.3.1. Surfactantes

Foram testados cinco tipos de surfactantes, sendo um sintético não-iônico Triton X-100®

(C8H17C6H4(OC2H4)10OH) e quatro biológicos produzidos pelos isolados bacterianos Bacillus sp.

LBBMA 111A, Bacillus subtilis LBBMA 155, Flavobacterium sp. LBBMA 168 e Arthrobacter oxydans

LBBMA 201. Os biossurfactantes foram produzidos no laboratório de Biotecnologia e

Biodiversidade para o Meio Ambiente (LBBMA) e o isolamento foi realizado utilizando as técnicas

de precipitação ácida, ultra-filtração e cromatografia de camada fina. As propriedades ativas de

superfície de cada surfactante estão descritas na Tabela 5.1.

Tabela 5.1. Caracterização dos surfactantes utilizados neste estudo

SURFACTANTE 1γCMC (mN m-1) CMC (mg L-1)

LBBMA 111A 33,9 150

LBBMA 155 34,6 180

LBBMA 168 38,8 200

LBBMA 201 36,6 200

Triton X-100® 39,0 268

Água 72,0 -

LBBMA 111A= Surfactante produzido por Bacillus sp. LBBMA 111A; LBBMA 155= Surfactante produzido por Bacillus subtilis LBBMA 155; LBBMA 168= Surfactante produzido por Flavobacterium sp. LBBMA 168; LBBMA 201= Surfactante produzido por Arthrobacter oxydans LBBMA 201. 1Tensão superficial referente à Concentração Micelar Crítica (CMC)




da glicose). Flavolipídeos de Flavobacterium sp. LBBMA 168 foram produzidos em meio mineral

descrito por BODOUR & MILLER-MAIER (1998) contendo somente a glicose a 2% (p v-1) como


139

fonte de carbono. O cultivo foi realizado em frascos erlenmeyer a 30°C em agitador orbital (New

Brunswick Scientific), com agitação constante de 200 rpm por sete dias.


















A concentração de surfactantes nas soluções de lavagem foi equivalente a 2CMC (Tabela

5.1), exceto para o surfactante Triton X-100®, que foi utilizado numa concentração (0,05 mol L-1)

muito acima da sua CMC (Tabela 5.1). O Iodeto de Potássio (KI) foi o composto utilizado como

fonte do ligante I- e o fenantreno como composto modelo de PAH. Os agentes de lavagem,

incluindo o surfactante e o ligante, foram preparados em água destilada.

5.3.2. Solo

O solo utilizado neste estudo foi coletado da camada de 0 a 20 cm de profundidade, no

município de Viçosa, MG e é classificado como Latosolo Vermelho-amarelo. A sua caracterização


140

físico-química foi realizada no Laboratório de Análises de Rotina do Departamento de Solos da

Universidade Federal de Viçosa (UFV). O conteúdo de carbono orgânico foi quantificado por

oxidação úmida da matéria orgânica, empregando-se solução de dicromato de potássio em meio

ácido (YEOMANS & BREMNER, 1988). A capacidade de troca catiônica (CTC) foi determinada

pela quantificação de Ca2+, Mg2+ e Al3+ dessorvidos do solo, após saturação com uma solução de

BaCl2 a 0,1 mol L-1 (HENDERSHOT et al., 1993). Este solo apresenta elevado teor de argila, teor

médio de matéria orgânica e elevada acidez (Tabela 5.2). Solos caracterizados por teores elevados

de argila tendem a reter mais fortemente contaminantes como metais pesados e PAH’s, o que

dificulta sua remoção pelos tratamentos físico-químicos atualmente em uso (DENNIS et al., 1992).

Além da argila, o teor de matéria orgânica é outra característica associada à retenção de

contaminantes (MULLIGAN et al., 2001).

Tabela 5.2. Caracterização físico-química do solo experimental

Parâmetro Valor

Areia grossa (%) 18,00

Areia fina (%) 17,00

Silte (%) 3,00

Argila (%) 62,00

pH (H2O) 4,30

Al3+ (Cmolc dm-3) 1,24

Ca2+ (Cmolc dm-3) 0,10

Mg2+ (Cmolc dm-3) 0,10

Matéria orgânica (dag kg-1) 3,32

P (mehlich-1) (mg dm-3) 2,00

K (mehlich-1) (mg dm-3) 29,00

P remanescente (mg L-1) 11,00


141

5.3.3. Procedimento de Contaminação do Solo

Amostras de 2,5 g de solo foram contaminadas com Cd2+ e fenantreno. A contaminação do

solo com Cd2+ foi realizada conforme protocolo descrito por MULLIGAN et al. (1999). O

procedimento de contaminação consistiu na agitação das amostras de solo durante 72 horas, após

adição de 10 mL g-1 de solo de uma solução contendo 1 mmol L-1 de nitrato de cádmio

tetrahidratado (Cd(NO3)2.4H2O). O solo foi removido da solução por centrifugação (1350 g, 30

minutos). Em seguida, as amostras de solo foram contaminadas com fenantreno dissolvido em

acetona a 1 mg mL-1 ( YANG et al., 2006). O solo contaminado, com concentração final de 200 mg

kg-1 de fenantreno, foi revolvido vigorosamente por 30 minutos para promover uma distribuição

homogênea do fenantreno. Para eliminação da acetona, as amostras de solo foram deixadas em

repouso durante 48 horas, sob temperatura de 28°C.

5.3.4. Procedimento de Lavagem do Solo

O reagente de lavagem foi preparado pela mistura do surfactante com o iodeto (I-), para

formar uma pseudo-fase única e o pH foi ajustado entre 7,0 e 8,0. As concentrações do ligante (I-)

foram de 0, 0,168 ou 0,336 mol L-1. Como controle, foi utilizada água destilada.

Amostras de solo (2,5 g) foram saturadas com 25 mL de solução de lavagem (pH entre 7,0

e 8,0), e a mistura foi mantida sob agitação orbital a 150 rpm durante 24 horas. A amostra de solo

foi removida da solução por centrifugação a 1350 g por 30 minutos. Para se determinar a

quantidade de Cd2+ removido das amostras, a concentração de Cd2+ no sobrenadante foi analisada

por espectrofotometria de absorção atômica (AAS) (SHIN et al, 2005). O percentual de Cd2+

removido foi determinado com a seguinte equação:

Uma série de cinco lavagens consecutivas, em batelada, foi realizada em cada amostra de

solo, empregando-se novas soluções de lavagem. Em cada etapa de lavagem, a mistura solo-

(Quantidade de Cd2+ na solução)

Quantidade total de Cd2+ no solo % de remoção do Cd2+ = x 100


142

solução foi equilibrada durante 24 horas sob agitação, seguindo-se centrifugação (1350 g, 30

minutos) e análise da concentração de Cd2+ no sobrenadante.

5.3.5. Análise de Fenantreno Residual

Para se determinar a quantidade de fenantreno removido das amostras, a concentração de

fenantreno no sobrenadante foi analisada por espectrofotometria a 254 nm. O percentual de

fenantreno removido das amostras foi calculado com base no conteúdo inicial de fenantreno

aplicado ao solo e no conteúdo final removido após as cinco etapas de lavagem. Amostras de solo,

sem fenantreno e Cd2+, lavadas com as mesmas soluções de surfactante-ligante, foram utilizadas

como branco.

5.3.6. Análises Estatísticas

O experimento foi conduzido segundo um esquema fatorial [(5 X 3) + 1], em delineamento

inteiramente casualizado, correspondente a cinco surfactantes e a três concentrações do ligante

(KI), além de um controle (água destilada), com três repetições. Os dados foram submetidos à

análise de variância (ANOVA) a 5% de probabilidade. Posteriormente, as médias foram

comparadas pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.


143


5.4.1. Remoção de Cd2+ de um Latossolo por Soluções de Surfactantes-Ligante

Soluções puras de biossurfactantes foram capazes de remover cerca de 70% do Cd2+

presente no solo, valor significativamente maior do que o obtido com a solução do surfactante

sintético Triton X-100®, que propiciou a remoção de apenas 28,7% do Cd2+ (Tabela 5.3). Os dados

demonstram que a eficiência do surfactante Triton X-100® em remover Cd2+, na ausência de um

ligante, é baixa, comparativamente à eficiência de remoção por soluções puras dos

biossurfactantes avaliados (Figura 5.1 e Tabela 5.3).

A remoção do Cd2+ aumentou significativamente com o número de lavagens e com a

concentração do ligante, para a maioria dos surfactantes avaliados (Figuras 5.1 e 5.2). Em

combinação com a maior concentração do ligante, a remoção total de Cd2+ obtida após as cinco

etapas de lavagem atingiu valores de 99,2% (LBBMA 111ª e LBBMA 201), 84,4% (LBBMA 155),

74,0% (LBBMA 168) e 65,0% (Triton X-100®) (Figura 5.1 e 5.2 e Tabela 5.3).

O mecanismo sugerido para o aumento da eficiência de remoção de Cd2+ pela presença do

I- na solução de lavagem é o da formação de uma molécula resultante da complexação do metal-

alvo com o ligante, seguida da sua solubilização na micela de surfactante (UMEBAYASHI et al.,

1997).

A presença do íon ligante aumentou a remoção do íon metálico do solo, exceto quando se

utilizaram os flavoliídeos produzidos por Flavobacterium sp. LBBMA 168, cuja capacidade de

remoção não foi significativamente influenciada pelo ligante (Figuras 5.1 e 5.3 e Tabela 5.3).

BODOUR et al. (2004) reportam que os flavolipídeos são surfactantes com habilidade para

complexar cádmio.

Alta eficiência de remoção de Cd2+, após as cinco lavagens, foi obtida com os surfactantes

LBBMA 111A e LBBMA 201 (99,2%) (Figuras 5.1 e 5.2 e Tabela 5.3). O surfactante sintético Triton

X-100® atingiu valores de eficiência de remoção correspondentes a 59,0 e 65,0% quando em

combinação com 0,168 e 0,336 mol L-1 de I-, respectivamente (Figura 5.1 e Tabela 5.3).

Comparativamente, a remoção de Cd2+ por água pura foi menor que 15% (Tabela 5.3).


144

Quando o solo foi lavado com solução contendo Triton X-100, na presença de 0, 0,168 e

0,336 mol L-1 de ligante, a remoção total de Cd2+ foi de 28,7%, 59,0% e de 65,0%, respectivamente,

após cinco lavagens (Figura 5.1 e Tabela 5.3). Conclui-se que, na ausência do ligante, o Triton X-

100 não é efetivo em remover Cd2+ do solo. Porém, na presença do ligante, a remoção de Cd2+

aumentou significativamente (Figura 5.2 e Tabela 5.3). Este efeito também foi observado por SHIN

& BARRINGTON (2003). Naquele trabalho, a remoção de Cd2+ por Triton X-100 de um solo

contaminado, na ausência do ligante I-, foi de apenas 10% do Cd2+ presente no solo.

Biossurfactantes aniônicos têm alta habilidade para complexar-se com metais pesados, a

exemplo dos ramnolipídeos, que apresentam uma afinidade com Cd2+ superior à afinidade por

outros cátions comuns do solo, como Mg2+ e K+ (MULLIGAN, 2005). Essa característica é

importante para a aplicação desses compostos em processos de lavagem de solos contaminados

com metais pesados, porque preserva, em parte, nutrientes essenciais às plantas e aos

microrganismos do solo.


145

Tabela 5.3. Remoção de Cd2+ de um latossolo vermelho-amarelo por surfactantes combinados com

diferentes concentrações do ligante iodeto (I-)

Cd2+ removido (mg g-1 de solo) Lavagem Surfactante

Ligante (mol L-1)

1 2 3 4 5

Cd2+

inicial (mg g-1)

Total de Cd2+

removido (mg g-1)

Total de Cd2+

removido (%)

111A1 0 0,076 0,276 0,156 0,148 0,156 1,124 0,808 cd 71, 9 111A 0,168 0,112 0,232 0,192 0,180 0,212 1,124 0,928 b 82, 6 111A 0,336 0,164 0,208 0,232 0,292 0,220 1,124 1,115 a 99,2

1551 0 0,088 0,184 0,168 0,168 0,184 1,124 0,793 cd 70,6 155 0,168 0,108 0,188 0,208 0,208 0,220 1,124 0,933 b 83,0

155 0,336 0,104 0,212 0,216 0,220 0,200 1,124 0,949 b 84,4

1681 0 0,064 0,216 0,212 0,140 0,120 1,124 0,752 cd 66,9 168 0,168 0,088 0,144 0,188 0,176 0,196 1,124 0,793 cd 70,6

168 0,336 0,076 0,160 0,216 0,184 0,196 1,124 0,832 c 74,0

2011 0 0,096 0,176 0,148 0,184 0,164 1,124 0,767 cd 68,2 201 0,168 0,192 0,168 0,232 0,236 0,236 1,124 1,067 a 94,9

201 0,336 0,188 0,232 0,244 0,216 0,236 1,124 1,116 a 99,2 Triton X-1002 0 0,040 0,064 0,060 0,096 0,064 1,124 0,323 f 28,7

Triton X-100 0,168 0,084 0,148 0,128 0,152 0,152 1,124 0,663 e 59,0

Triton X-100 0,336 0,104 0,168 0,132 0,168 0,160 1,124 0,731 de 65,0

Água - 0,024 0,036 0,024 0,036 0,044 1,124 0,162 g 14,4

1LBBMA 111A= Surfactante produzido pelo isolado Bacillus sp. LBBMA 111A; LBBMA 155= Surfactante produzido pelo isolado Bacillus subtilis LBBMA 155; LBBMA 201= Surfactante produzido pelo isolado Arthrobacter oxydans LBBMA 201; LBBMA 168= Surfactante produzido pelo isolado Flavobacterium sp. LBBMA 168. 2Surfactante sintético Triton X-100®. Médias seguidas da mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.


146

S1C2

1 2 3 4 5

Cd re

mov

ido

(mg

g-1)

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

S2C1

Cd re

mov

ido

(mg

g-1)

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40S1C3

Cd re

mov

ido

(mg

g-1)

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

y = 0,2072**(1-0,3334**x) r2= 0,5580

y = 0,2527** (1-0,3694**x) r2= 0,6264

y = 0,1848** (1-0,4103**x) r2= 0,6894

S1C1Cd

rem

ovid

o (m

g g-1

)

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

S2C3

Lavagens (no)1 2 3 4 5

Cd re

mov

ido

(mg

g-1)

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

y= 0,4773 - 2,8875**/x + 7,4516**/x2 - 4,9653**/x3

r2= 0,9879

S2C2

Lavagens (no)1 2 3 4 5

Cd re

mov

ido

(mg.

)

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

y = 0,2265** (1-0,4720**x) r2= 0,9249

y = 0,2230** (1-0,4171**x) r2= 0,7845

Figura 5.1a. Efeito de lavagens sucessivas na remoção de Cd2+ do solo. S1 (Surfactante LBBMA 111A); S2 (Surfactante LBBMA 155); C1 (0,0 mol L-1 de I-); C2 (0,168 mol L-1 de I-); C3 (0,336 mol L-1 de I-). ***, *, ** = significativos a 10, 5 e 1 % de probabilidade, respectivamente.


147

Cd re

mov

ido

(mg

g-1)

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

Cd re

mov

ido

(mg

g-1)

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

1 2 3 4 5

Cd re

mov

ido

(mg

g-1)

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

1 2 3 4 5

Cd re

mov

ido

(mg

g-1)

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

y = 0,2159** (1-0,5383**x) r2= 0,7977

y = 0,1747** (1-0,3732**x) r2= 0,7047

y = 0,2353** (1-0,1848**x) r2= 0,9182

y = 0,2337** (1-0,1828**x) r2= 0,7241

S3C1Cd

rem

ovid

o (m

g g-1

)

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40 S3C2

Cd re

mov

ido

(mg

g-1)

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

y= -0,2056 + 2,2496**/x - 3,6298**/x2

+ 1,6497**/x3

r2

= 0,9564

y = 0,2051** (1-0,5421**x) r2 = 0,9284

S3C3 S4C1

S4C2 S4C3

Lavagem (nº) Lavagem (nº)

Figura 5.1b. Efeito de lavagens sucessivas na remoção de Cd2+ do solo. S3 (Surfactante LBBMA 168); S4 (Surfactante LBBMA 201); S5 (Surfactante Triton X-100); C1 (0,0 mol L-1 de I-); C2 (0,168 mol L-1 de I-); C3 (0,336 mol L-1 de I-). ***, *, ** = significativos a 10, 5 e 1 % de probabilidade, respectivamente.


148

S5C1

Lavagem (nº)1 2 3 4 5

Cd re

mov

ido

(mg

g-1)

0.00

0.05

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40


Cd re

mov

ido

(mg

g-1)

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

S5C3


Cd re

mov

ido

(mg

g-1)

0.10

0.15

0.20

0.25

0.30

0.35

0.40

y = 0,1527** (1-0,3937**x) r2= 0,7857

y = 0,1605** (1-0,3033**x)r2= 0,5889

S5C2

Figura 5.1c. Efeito de lavagens sucessivas na remoção de Cd2+ do solo. S5 (Surfactante Triton X-100); C1 (0,0 mol L-1 de I-); C2 (0,168 mol L-1 de I-); C3 (0,336 mol L-1 de I-). ***, *, ** = significativos a 10, 5 e 1 % de probabilidade, respectivamente.


149

S1

[I-, mol L-1]0.000 0.168 0.336

Cd re

mov

ido

(mg

g-1)

0.20.30.40.50.60.70.80.91.01.1

0.000 0.168 0.336

Cd re

mov

ido

(mg

g-1)

0.20.30.40.50.60.70.80.91.01.1

S3

[I-, mol L-1]0.000 0.168 0.336

Cd re

mov

ido

(mg

g-1)

0.20.30.40.50.60.70.80.91.01.1

S2

S4

0.000 0.168 0.336

Cd re

mov

ido

(mg

g-1)

0.20.30.40.50.60.70.80.91.01.1

S5

0.000 0.168 0.336

Cd re

mov

ido

(mg

g-1)

0.20.30.40.50.60.70.80.91.01.1

[I-, mol L-1]

[I-, mol L-1]

[I-, mol L-1]

Y= 0,7994 + 0,9141**x r2=0,9816

Y= 0,7957 + 1,1781*x - 2,1466***x2

r2=0,7913

Y= 0,7526 + 0,2367**x r2= 0,7557

Y= 0,7693 + 2,5210**x - 4,4006**x2 r2=0,9847

Y= 0,3240 + 2,8564**x - 4,8849**x2 r2=0,9873

Figura 5.2. Efeito da concentração do ligante (I-) na remoção de Cd2+ do solo. S1 (Surfactante LBBMA 111A); S2 (Surfactante LBBMA 155); S3 (Surfactante LBBMA 168); S4 (Surfactante LBBMA 201); S5 (Surfactante Triton X-100). ***, *, ** = significativos a 10, 5 e 1 % de probabilidade, respectivamente.


150

5.4.2. Remoção de Fenantreno de um Latossolo por Soluções de Surfactantes-

Ligante

Soluções puras de biossurfactantes removeram entre 79% e 87%% do fenantreno presente

no solo. Esses valores foram significativamente maiores do que a remoção pelo Triton X-100®, o

qual propiciou a remoção de cerca de 73% do contaminante (Tabela 5.4 e Figura 5.4). A maior

parte do fenantreno (acima de 92% do total removido) foi removida do solo na primeira etapa de

lavagem. O resultado indica que, em aplicações comerciais, uma única lavagem do solo com uma

solução de biossurfactantes, em concentração equivalente a 2CMC, é suficiente para remover a

maior parte do fenantreno contaminante e, possivelmente, de outros compostos orgânicos

hidrofóbicos.

A inclusão do ligante I- às soluções de surfactantes não influenciou significativamente a

remoção de fenantreno, exceto para o Triton X-100® (Tabela 5.4 e Figura 5.5). Não houve remoção

detectável de fenantreno pela água, enfatizando-se a necessidade da inclusão de surfactantes para

a remediação de solos contaminados com poluentes hidrofóbicos.

Figura 5.3. Efeito de lavagens sucessivas na remoção de fenantreno de solo. S1 (Surfactante LBBMA 111A); S2 (Surfactante LBBMA 155); S3 (Surfactante LBBMA 168); S4 (Surfactante LBBMA 201); S5 (Surfactante Triton X-100); C1 (0,0 mol L-1 de I-); C2 (0,168 mol L-1 de I-); C3 (0,336 mol L-1 de I-). ***, *, ** = significativos a 10, 5 e 1% de probabilidade, respectivamente.

S1C1: y=11,5769* e (-3,3703**x); r2=0,9976 S1C2: y=9,0112** e (-2,9887**x); r2=0,9984 S1C3: y=8,0098** e (-2,9887**x); r2=0,9973 S2C1: y=15,2775** e (-3,6966**x); r2=0,9991 S2C2: y=12,7988* e (-3,5039**x); r2=0,9979 S2C3: y=15,2920 e (-3,6436**x); r2=0,9890 S3C1: y=15,8839 e (-3,6824**x); r2 =0,9840 S3C2: y=19,8482*** e (-3,8986**x); r2=0,9982 S3C3: y=17,6163* e (-3,7777**x); r2=0,9988 S4C1: y=14,3442 e (-3,5648**x); r2=0,9952 S4C2: y=9,3861* e (-3,1333**x); r2=0,9952 S4C3: y=7,4380** e (-2,8950**x); r2=0,9984 S5C1: y=3,9932** e (-2,4782**x); r2=0,9916 S5C2: y=9,2238** e (-3,1183**x); r2=0,9996 S5C3: y=7,0527** e (-2,8353**x); r2=0,9984

Lavagem(Nº)1 2 3 4 5

Fena

ntre

no re

mov

ido

(ug

g-1 d

e sol

o)

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5200

160

120

80

40

0.0


151

Tabela 5.4. Eficiência de remoção de fenantreno, após tratamento do solo com surfactantes, na

presença/ausência do ligante

PHE removido (μg g-1) Lavagem

Surfactante Ligante (mol L-1)

1 2 3 4 5

PHE inicial (μg g-1)

Total de PHE removido

(μg g-1)

Total de PHE removido (%)

111A1 [0] 159,2 5,2 4,0 2,8 2,0 200 173,2 abc 86,6 111A [0,168] 160,4 6,8 4,0 1,6 0,0 200 174,0 abc 87,0 111A [0,336] 161,2 7,6 5,6 0,0 0,0 200 174,4 abc 87,2

1551 [0] 151,6 3,6 3,2 0,0 0,0 200 158,4 d 79,2 155 [0,168] 154,0 4,4 0,4 0,0 0,0 200 162,4 cd 81,2 155 [0,336] 160,0 4,0 3,6 1,2 0,0 200 168,8 abcd 84,4

1681 [0] 159,6 4,0 0,4 0,4 0,0 200 164,4 bcd 82,20 168 [0,168] 160,8 3,2 1,6 0,0 0,0 200 165,6 abcd 82,8 168 [0,336] 161,2 3,6 2,0 0,0 0,0 200 166,8 abcd 83,4

2011 [0] 162,4 4,4 3,6 0,0 0,0 200 170,4 abc 85,2 201 [0,168] 163,6 6,8 4,0 1,2 0,0 200 175,6 ab 87,8 201 [0,336] 164,4 8,8 3,2 0,0 0,0 200 176,4 ab 88,2

Triton X-1002 [0] 134,0 11,2 1,2 0,0 0,0 200 146,4 e 73,2 Triton X-100 [0,168] 163,2 7,2 0,4 0,0 0,0 200 170,8 abc 85,4 Triton X-100 [0,336] 165,6 9,6 1,6 0,0 0,0 200 176,8 a 88,4

Água - 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 200 0,000 f 0,00

1LBBMA 111A= Surfactante produzido pelo isolado Bacillus sp. LBBMA 111A; LBBMA 155= Surfactante produzido pelo isolado Bacillus subtilis LBBMA 155; LBBMA 201= Surfactante produzido pelo isolado Arthrobacter oxydans LBBMA 201; LBBMA 168= Surfactante produzido pelo isolado Flavobacterium sp. LBBMA 168. 2Surfactante sintético Triton X-100®. Médias seguidas da mesma letra, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey, a 5% de probabilidade.


152

S2

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4

Rem

oção

de P

he (u

g g-1

)

0.320.340.360.380.400.420.440.460.48

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4

0.320.340.360.380.400.420.440.460.48

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4

0.320.340.360.380.400.420.440.460.48

S3

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4

0.320.340.360.380.400.420.440.460.48

[I-, mol L-1] [I-, mol L-1]

[I-, mol L-1] [I-, mol L-1]

Rem

oção

de P

he (u

g g-1

)

Rem

oção

de P

he (u

g g-1

)

Rem

oção

de P

he (u

g g-1

)

S4 S5

y=0,3956 + 0,753**x r2= 0,892

y=0,4092 + 0,0149***xr2= 0,6359

y= 0,4284 + 0,0426**xr2= 0,6493

y= 0,3675 + 0,2258**xr2=0,8903

Figura 5.4. Efeito da concentração de ligante (I-) na remoção de fenantreno de solo. S2 (Surfactante LBBMA 155); S3 (Surfactante LBBMA 168); S4 (Surfactante LBBMA 201); S5 (Surfactante Triton X-100). ***, *, ** = significativos a 10, 5 e 1 % de probabilidade, respectivamente. S1(Surfactante LBBMA 111A)= sem modelo, pois o coeficiente angular da reta é igual a zero, ou seja, não varia com a concentração do ligante.


153

5.4.3. Eficiência de Soluções Surfactantes-Ligante na Remoção Simultânea de

Cd2+ e Fenantreno

O fenantreno foi removido com eficiência por soluções contendo apenas biossurfactantes

numa concentração equivalente a 2CMC (Tabela 5.4 e Figura 5.5). A adição do ligante I- às

soluções de biossurfactantes não afetou a sua capacidade de remover fenantreno. Se por um lado

a adição do ligante não resultou em maior eficiência de remoção do composto hidrofóbico,

tampouco a comprometeu. Para a remoção de Cd2+ e, possivelmente, de outros metais pesados,

uma elevada concentração do ligante aumenta a eficiência dos surfactantes, principalmente os

surfactantes LBBMA 111A, LBBMA 168 e o surfactante Triton X-100® (Figura 5.3 e Tabela 5.3).

Com base nos resultados deste trabalho, pode-se concluir que soluções contendo uma

combinação surfactante-ligante removem eficientemente Cd2+ e fenantreno de solo contaminado.

Um esquema mecanístico plausível para o processo de remoção envolve uma complexação inicial

ligante-metal para formar espécies iônicas, seguida pela internalização do complexo Cd-I e do

fenantreno no núcleo hidrofóbico das micelas de surfactantes (SHIN et al., 2005). Propõe-se que

soluções de surfactantes-ligantes sejam igualmente capazes de remover simultaneamente outros

poluentes hidrofóbicos e metálicos de solos e de sedimentos contaminados.


154

5.5. CONCLUSÕES

A presença do ligante I- em soluções de biossurfactantes produzidos pelos isolados

bacterianos Bacillus sp. LBBMA 111A, Bacillus subtilis LBBMA 155, Flavobacterium sp. LBBMA

168 e Arthrobacter oxydans LBBMA 201 aumenta a remoção de Cd2+ de solo argiloso.

Soluções de biossurfactantes removem eficientemente fenantreno de solo argiloso, sendo o

efeito independente da presença do ligante I-.

Os biossurfactantes são mais eficientes na remoção de Cd2+ de solo argiloso do que o

surfactante sintético Triton X-100®. A eficiência de remoção do fenantreno é similar entre essas

duas classes de surfactantes.

Cd2+ e fenantreno podem ser removidos simultaneamente de solos empregando-se uma

solução de surfactante-ligante.

Apêndice 155


ABRAMOVITCH, R.A., CHANG-QING, L., HICKS, E., SINARD, J. 2003. In situ remediation of soils

contaminated with toxic metal ions using microwave energy. Chemosphere. 53, 1077-1085.

CHU, W. & KWAN, C.Y. 2003. Remediation of contaminated soil by a solvent/surfactant system.

Chemosphere, 53, 9-15.

BODOUR, A.A. & MAIER, R.M. 1998. Application of a modified drop-collapse technique for

surfactant quantification and screening of biosurfactant-producing microrganisms. Journal of


BODOUR, A.A., GUERRERO-BARAJAS, C., JIORLE, B.V., MALCOMSON, M.E., PAUL, A.K.,

SOMOGYI, A., TRINH, L.N., BATES, R.B. & MAIER, R.M. 2004. Structure and characterization of

flavolipids, a novel class of biosurfactants produced by Flavobacterium sp. MTN11. Applied and


DENNIS, R.M., DWORKING, D., LOWE, W.L. & ZUKPO, A.J. 1992. Evaluation of commercially

available soil-washing processes for site remediation, Journal of Hazardous Industrial Wastes, 24,

515-525.

FAVA, F. & DI GIOIA, D. 1998. Effects of Triton X-100 and quillaya saponin on the ex situ

bioremediation of a chronically polychlorobiphenyl-contaminated soil. Applied Microbiology and


HIRNER, A.V., PESTKE, F.M., BUSCHE, U. & ECKELHOFF, A. 1998. Testing contaminant mobility

in soils and waste materials. Journal of Geochemical Exploration, 64, 127-132.

HENDERSHOT, W.H., LALANDE, H. & DUQUETTE, M. 1993. Soil sampling and methods of

analysis, Lewis Publishers, Boca Raton, Florida.

HO, K.C. & HUI, K.C.C. 2001. Chemical contamination of the east river (Dongjiang) and its

implication on sustainable development in the Pearl River Delta. Environmental International, 26,

303-308.

Apêndice 156

HOROWITZ, S., GILBERT, J. N. & GRILFIN, W.M. 1990. Isolation and characterization of a

surfactant produced by Bacillus licheniformis 86. J. Industr. Microbiol., 6, 243-248.

JAFFE, R., GARDINALI, P.R., CAI, Y., SUDBURRY, A., FERNANDEZ, A. & HAY, B.J. 2003.

Organic compounds and trace metals of anthropogenic origin in sediments from Montego Bay,

Jamaica: assessment of sources and distribution pathways. Environmental Pollution, 123, 291-299.

MULLIGAN, C.N., YONG, R.N., GIBBS, B.F., JAMES, S. & BENNETT, H.P.J. 1999. Metal removal

from contaminated soil and sedimentsby the biosurfactant surfactin. Environmental Science &

Technology, 33, 3812-3820.

MULLIGAN, C.N., YONG, R. N. & GIBBS, B.F. 2001. Heavy metal removal from sediments by

biosurfactants. Journal of Hazardous Materials, 85, 111-125.

MULLIGAN, C.N. 2005. Environmental applications for biosurfactants. Environmental Pollution, 133,

183-198.

PETER, R.W. 1999. Chelant extraction of heavy metals from contaminated soils. Journal of

Hazardous Materials, 166, 151-210.

REDDY, K.R. & CHINTHAMREDDY, S. 2000. Comparison of extractants for removing heavy metals

from contaminated clayey soils. Soil and Sediment Contamination, 9, 449-462.

SCHMELLING, D., POSTER, D., CHAYCHIAN, M., NETA, P., MCLAUGHLIN, W., SILVERMAN, J.

& AL-SHEIKHLY, M. 1998. Application of ionizing radiation to the remediation of materials

contaminated with heavy metals and polychlorinated biphenyls. Radiation Physics and Chemistry,

52, 371-377.

SHIN, M., UMEBAYASHI, Y., KANZAKI, R. & ISHIGURO, S.-I. 2000. Formation of copper(II)

thiocyanato and cadmium(II) iodo complexes in micelles of nonionic surfactants with varying

poly(ethylene oxide) chain lengths. Journal of Colloid and Interface Science, 225, 112-118.

Apêndice 157

SHIN, M., BARRINGTON, S.F., MARSHALL, W.D. & KIM, J.-W. 2005. Simultaneous soil Cd and

PCB decontamination using a Surfactant/ligand solution. Journal of Environmental Science and

Health, 39, 2783-2798.

UMEBAYASHI, Y., SHIN, M. & ISHIGURO, S.-I. 1997. Thiocyanato and iodo complexation of

cadmium(II) ions in micellar solutions of a nonionic surfactant Triton X-100. Journal of Colloid and

Interface Science. 191, 391-397.

VATER, J., KABLITZ, B., WILDE, C., FRANKE, P., MEHTA, N. & CAMEOTRA, S.S. 2002. Matrix-

assisted laser desortion ionization-time of flight mass spectrometry of lipopeptide biosurfactants in

whole cells and culture filtrates of Bacillus subtilis C-1 isolated from petroleum sludge. Applied and


WASAY, S.A., BARRINGTON, S. & TOKUNAGA, S. 2000. Organic acids for the in situ remediation

of soils polluted by heavy metals: soil flushing in columns. Water, Air & Soil Pollution, 127, 301-314.

WEISS, P., RISS, A., GSCHMEIDLER, E. & SCHENTZ, H. 1994. Investigation of heavy metal, PAH,

PCB patterns and PCDD/F profiles of soil samples from an industrialized urban area (Linz, upper

Austria) with multivariate statistical methods. Chemosphere, 29, 2223-2236.

YANG, K., ZHU, L. & XING, B. 2006. Enhanced soil washing of phenanthrene by mixed solutions of

TX100 and SDBS. Environmental Science & Technology, 40, 4274-4280.

YEOMANS J.C. & BREMNER J.M. 1988. A rapid and precise method for routine determination of

organic carbon in soil. Communications in Soil Science and Plant Analysis, 19, 1467–1476.

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