DETERMINACION DE MISOPROSTOL EN LIQUIDOS BIOLOGICOS
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Universidad Nacional Mayor de San Marcos Universidad del Perú. Decana de América Dirección General de Estudios de Posgrado Facultad de Farmacia y Bioquímica Unidad de Posgrado Desarrollo de un método cuali-cuantitativo utilizando el equipo UPLC MS-MS, para la determinación de misoprostol ácido en orina TESIS Para optar el Grado Académico de Magíster en Toxicología AUTOR Luis Alberto LÓPEZ AVILA ASESOR César Máximo FUERTES RUITÓN Lima, Perú 2016
Transcript of DETERMINACION DE MISOPROSTOL EN LIQUIDOS BIOLOGICOS
Universidad Nacional Mayor de San Marcos Universidad del Perú. Decana de América
Dirección General de Estudios de Posgrado
Facultad de Farmacia y Bioquímica Unidad de Posgrado
Desarrollo de un método cuali-cuantitativo utilizando
el equipo UPLC MS-MS, para la determinación de
misoprostol ácido en orina
TESIS
Para optar el Grado Académico de Magíster en Toxicología
AUTOR
Luis Alberto LÓPEZ AVILA
ASESOR
César Máximo FUERTES RUITÓN
Lima, Perú
2016
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Referencia bibliográfica
Lopéz L. Desarrollo de un método cuali-cuantitativo utilizando el equipo UPLC MS-
MS, para la determinación de misoprostol ácido en orina [Tesis de maestría]. Lima:
Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Facultad de Farmacia y Bioquímica,
Unidad de Posgrado; 2016.
II
Dedicatoria
A nuestro Padre Eterno
A mi Rosa eterna : Sofia Ariana
A mis padres, mi esposa, mis familiares vivos y muertos…siempre presentes
A mis profesores por sus ejemplos.
A mis colegas por sus ejemplos y enseñanzas
III
Agradecimientos A mi asesor Mg. César Máximo Fuertes Ruitón por su constante apoyo y consejos en el logro de la presente tesis. A todas aquellas personas que en algún momento colaboraron en el logro de éste estudio A los distinguidos miembros del Jurado, por sus valiosos aportes y tiempo empleados en la corrección, para mejorar y culminar satisfactoriamente la presente tesis. A todos mis profesores que me enseñaron, cada uno desde su punto de vista, a ser mejor. A mi familia por su constante apoyo. A nuestro Creador, por tantas cosas que agradecer y tan poco que pedir.
IV
ÍNDICE Listado de figuras…………………………………………………………………………....
Listado de tablas……………………………………………………………………………..
Resumen……………………………………………………………………………………….
Abstract………………………..………………………………………………………….......
VI
VII
VIII
IX
I. Introducción…………………………………………………………………………….. 1
II. Generalidades…………………………………………………………………………..
Antecedentes del misoprostol………………………………………………………….
Aplicación clínica y estructura química del misoprostol ester…………………...
3
3
4
Propiedades fisicoquímicas…………………………………………………………….... 5
Aplicaciones no oficiales…………………………………………………………………. 5
Modo y Mecanismo de Acción………………………………………………………... 6
Vías de ingreso y propiedades farmacocinéticas de varias rutas de administración
Absorción……………………………………………………………………………………
9
9
Biotransformación…………………………………………………………………………. 16
Eliminación…………………………………………………………………………………. 17
Acumulación……………………………………………………………………………….. 17
Farmacocinética en la leche materna humana…………………………………….... 17
Efectos sobre el útero y cuello uterino………………………………………………….. 18
Toxicocinética, Sintomatología, Efectos Secundarios y Teratogenicidad…………... 22
Espectrometría de Masas………………………………………………………………… 27
III. Materiales y Métodos…………………………………………………………………
3.1. Materiales……………………………………………………………………………..
30
31
V
3.2. Métodos………………………………………………………………………………. 31
IV. Resultados……………………………………………………………………………….. 38
V. Discusión………………………………………………………………………………… 47
VI. Conclusiones……………………………………………………………………………. 51
VII. Recomendaciones……………………………………………………………………… 53
VIII. Referencias Bibliográficas……………………………………..…………………… 50
VI
LISTADO DE FIGURAS Figura 1…………………………………………………………………………….......... 4 Figura 2 ……………………………………………………………………………........ 30 Figura 3…………………………………………………………………………….......... 30 Figura 4 …………………………………………………………………………………. 31 Figura 5………………………………………………………………………………….. 39 Figura 6 …………………………………………………………………………………. 40 Figura 7………………………………………………………………………………….. 45
VII
LISTADO DE TABLAS Tabla 1 …………………………………………………………………………………….. 36 Tabla 2 …………………………………………………………………………………….. 38 Tabla 3 …………………………………………………………………………………….. 39 Tabla 4……………………………………………………………………………….......... 41 Tabla 5…………………………………………………………………………………….. 43 Tabla 6…………………………………………………………………………………….. 46
VIII
RESUMEN
Se ha desarrollado un método, altamente selectivo y específico, usando el equipo
Cromatógrafo Líquido de Ultraperformance con detector Masa – Masa (UPLC – MS
– MS) para la determinación de misoprostol éster a través de su metabolito
misoprostol ácido en veinte muestras de orina provenientes de las Divisiones Médico
Legales del Perú de mujeres gestantes que presumiblemente habían ingerido
tabletas de misoprostol. Se ensayaron procedimientos de extracción líquido –
líquido, cuyos resultados, en el presente estudio; no fueron reproducibles. Debido a
ello se ensayaron procedimientos de extracción en fase sólida (SPE) con cartuchos
especiales HLB cuyos resultados fueron reproducibles. Este método logra cuantificar
concentraciones hasta partes por billón (ppb), con una concentración promedio de
40,23 y demás valores que están dentro de los límites 11,5 y 81,6 ppb. El método es
de gran utilidad para demostrar el uso de misoprostol como abortivo en
investigaciones judiciales.
Palabras clave: Misoprostol ácido, muestras de orina, cromatografía líquida,
metabolito, extracción en fase sólida (SPE)
IX
ABSTRACT
A method highly selective and specific has been developed using the UPLC MS-MS
Waters, for the quali-quantitation of esther misoprostol throught its metabolite acid
misoprostol in twenty urine samples from the Divisiones Medico Legales of Perú from
pregnant women that maybe have ingested misoprostol tablets. It has been essayed
liquid – liquid extractions but the results could not be reproducibles. Then it has been
essayed a solid phase extraction (SPE) pre-treatment with HLB cartridges and the
results could be reproducibles. This method attains the quantitation of parts per
billion (ppb) with an average concentration of 40,23 and the others between 11,5 and
81,6ppb. This method is very usefulness in case of abortion in judgment
investigations.
Key words: Acid misoprostol, urine samples, liquid chromatography, metabolite,solid
phase extraction (SPE).
1
I. INTRODUCCION
El presente trabajo tiene como objetivo desarrollar un método cuali-cuantitativo
utilizando el equipo cromatógrafo líquido de ultraperformance con espectrómetro
masa-masa (UPLC MS-MS), para la determinación de misoprostol ácido, en
muestras de orina de personas que hayan consumido el misoprostol éster con fines
abortivos. Este estudio se realizó en el Laboratorio de Toxicología del Instituto de
Medicina Legal del Ministerio Público. A nivel nacional no existe método e
internacionalmente existen métodos en equipos similares como el estudio llevado a
cabo por Zou et al. (2007)
El presente método cuali-cuantitativo, altamente selectivo y específico, se ha
desarrollado utilizando el equipo UPLC MS-MS, el cual puede determinar
misoprostol ácido en muestras biológicas, por ejemplo muestras de orina, de madres
gestantes que hayan ingerido el misoprostol éster en dosis abortivas.
2
HIPÓTESIS
El método cuali-cuantitativo, desarrollado en el equipo UPLC MS-MS es altamente
selectivo y específico para la determinación de misoprostol ácido en orina.
OBJETIVOS
General
Desarrollar un método cuali-cuantitativo,altamente selectivo y específico, para la
determinación de misoprostol ácido en orina utilizando el equipo UPLC MS-MS,
marca Waters, modelo Acquity.
Específicos
1. Desarrollar una técnica de extracción en fase sólida para aislar el misoprostol
ácido
de la orina.
2. Desarrollar una técnica para la determinación de misoprostol ácido en orina
mediante el equipo UPLC MS-MS
3
II. GENERALIDADES
Antecedentes del Misoprostol
El misoprostol éster (15-deoxi-16-hidroximetil prostagladina E1), fig.1, es una
prostaglandina sintética E1 análoga. Fue desarrollada para la prevención y
tratamiento de úlceras pépticas debido a sus propiedades anti-secretorias y de
protección de la mucosa (Watkinson,Hopkins y Akbar, 1988;). Se ha convertido en
una droga importante en prácticas obstétricas y ginecológicas debido a sus acciones
de inicio cervical y uterotónica, maduración cervical e inducción de la labor del parto,
pero es ampliamente utilizado como abortivo (Mousa y Walkinshaw,2001). En
comparación a otras prostaglandinas análogas, el misoprostol éster tiene las
siguientes ventajas:
1. El misoprostol se usa fuera del contexto médico con fines abortivos.
2. Es económico,
3. Siendo un análogo E1, no tiene efecto en los bronquios o vasos sanguíneos
4. Puede ser usado por vía oral, vaginal, sublingual o rectal (Andrew,Fiala y
Safar,2005)
5. Sus aplicaciones clínicas incluyen aborto medicamentoso, evacuación médica en
aborto involuntario, inducción cervical antes del procedimiento de aborto quirúrgico,
inducción del parto, manejo de la hemorragia postparto (Watkinson et al., 1988) y
maduración cervical (Tang,Gemzell y Hi, 2007)
6. Es estable, puede ser almacenado por largos períodos a temperatura ambiente
7. Tiene pocos efectos colaterales (por ejemplo diarrea y escalofríos, los que
dependen de la dosis y de la persona)
4
(11R,16S) Misoprostol éster (ME)
(11R,16S) Misoprostol ácido (MA)
Figura.1 Misoprostol éster(ME) y Misoprostol ácido(MA) (Watkinson et al.,1988)
Aplicación clínica y estructura química del misoprostol
Robert, Nezamis y Phillips (1967) demostraron que las series de prostaglandinas
naturales inhiben la secreción del ácido gástrico. Sin embargo, las prostaglandinas
naturales tienen tres desventajas que dificultan su aplicación clínica. Estas
desventajas son:
1. El metabolismo rápido que resulta en actividad nula o disminuida cuando es
usado por vía oral y corta duración de acción cuando es administrada por la vía
parenteral.
2. Tiene numerosos efectos colaterales.
3. Presenta inestabilidad clínica, por lo tanto tiene una vida útil corta.
El misoprostol éster difiere estructuralmente de las prostaglandinas E1 por la
presencia de un grupo metil éster en carbono uno, un grupo metilo en el carbono
dieciseis y un grupo hidroxilo en carbono dieciseis en vez de carbono quince. El
éster metílico en el carbono uno incrementa la potencia antisecretora y la duración
5
de la acción del misoprostol, mientras que el cambio del grupo hidroxilo desde
carbono quince al carbono dieciseis y la adición de un grupo metilo al carbono
dieciseis mejora la actividad oral, aumenta la duración de la acción y mejora la
seguridad de la droga (Tang et al., 2007)
Propiedades fisicoquímicas (Sigma-Aldrich, 2006)
Nombre del producto: misoprostol ácido
Número de producto: M6932
Marca Sigma
Nº CAS : 112137 – 89 – 0
1 Apariencia Forma líquida viscosa
2 Color Amarillo
3 Olor Sui generis
4 Solubilidad Soluble en agua
5 pH en agua solución al 0,1% 3,5
Aplicaciones no oficiales.
Aunque en todo el mundo se usa en aplicaciones obstétricas y ginecológicas estos
usos no son oficiales, debido a que esta patente nunca fue aprobada para
aplicaciones obstétricas ni ginecológicas. Sin embargo, aún la British National
Formulary (BNF), recomienda su uso no oficial para algunas aplicaciones (Fiala,
Arinsson, Granath, Stephansson, Seyberth, Watzer y Genzell, 2005). Existen
principios activos que rápidamente son integrados a las practicas obstétricas y
ginecológicas. El misoprostol es una excepción; a pesar de las extensas
investigaciones que existen, sólo es incorporado lentamente a la práctica. Esto se
debe a que no tiene licencia para su uso en salud reproductiva; sin embargo, la Food
6
and Drug Administration (FDA) recientemente ha otorgado licencia al mifepristone
para ser usado con misoprostol para término del embarazo (FDA, 2000), aunque el
misoprostol sólo aún no tiene licencia para uso en embarazo. Esta decisión ha
iniciado el debate acerca de las drogas que no tienen licencia y deja a muchos
médicos especialistas inseguros acerca de su posición legal y profesional al
prescribir medicamentos no oficiales o sin licencia.
Sin embargo, el mayor obstáculo para permitir su libre uso en obstetricia y
ginecología ha sido su fabricante y poseedor de la patente, Searle (ahora
incorporado a Pfizer). La empresa americana no ha solicitado licencia para alguna
aplicación reproductiva, a pesar de la abundante literatura acerca de su uso seguro y
efectivo. El probable motivo de tal decisión es para evitar discusiones polémicas
acerca del uso del medicamento como inductor abortivo, resultando en una
prohibición del acceso a un tratamiento potencialmente salvador de millones de
vidas de mujeres en todo el mundo (Andrew et al., 2005).
Modo y mecanismo de Acción
Los derivados de prostaglandinas son producidos normalmente a partir de ácidos
grasos en el organismo y se encuentran en muchos tejidos. En general, los
derivados de prostaglandina E1, como el caso de misoprostol, causan contracción
miometrial interactuando con receptores específicos localizados en las células
miometriales. Esta interacción inicia una cascada de eventos, incluyendo cambios en
la concentración de calcio, desencadenando la contracción muscular (Baird 2000).
El complejo proceso bioquímico de maduración cervical y de mediadores asociados
con este mecanismo son hasta ahora desconocidos. No se ha establecido
concretamente cómo las prostaglandinas producen la maduración cervical. La
maduración del cervix uterino está relacionado a cambios en la actividad del
7
colágeno, glucosaminoglicanos y la actividad colagenolítica. Las muestras de biopsia
del tejido conectivo a partir de la parte baja del cervix uterino en mujeres
embarazadas en varias etapas gestacionales han demostrado que las
concentraciones de colágeno, glicosaminoglicano sulfatado y ácido hialurónico
disminuyen durante el embarazo.
Cuando se compara las concentraciones de colágeno entre mujeres no gestantes,
éstas son aproximadamente iguales al 70% a 10 semanas de gestación, y a 30% al
término. La actividad colagenolítica se incrementa con la edad gestacional
avanzada. La actividad hidrolítica de la 2,4-dinitrofenil-Pro-Gln-Gly-Ile-Ala-Gly-Gin-D-
Arg (colagenasa) y la concentración de la elastasa leucocitaria aumenta
gradualmente por un factor de 10. Un estudio encontró que el tiempo de dilatación
cervical durante la gestación espontánea fue mayor en mujeres con altas
concentraciones de colágeno y menores en mujeres con bajas concentraciones de
colágeno (Uldbjerg, Ekman, Mamstrom, Olsson y Ulmsten,1983)
El Refaey, Calder,Wheatley y Templeton, (1994) demostraron una alteración similar
al de Uldbjerg et al (1983) en el tejido conectivo cervical luego de administración
vaginal de misoprostol o gemeprost (una prostaglandina alopostadil análoga).
Estudios en microscopia electrónica e histoquímica del tejido cervical revelaron que
la incorporación promedio de prolina por microgramo de proteína (en el metabolismo
de colágeno) aumenta significativamente, donde la densidad del colágeno estimada
usando la intensidad de luz, disminuye significativamente. Además, el diámetro de
las fibras de colágeno fue menor luego de aplicación de prostaglandina E1. La
dilatación del cervix durante el alumbramiento en cerdos de guinea implica además
degradación mediada por colagenasa del colágeno cervical (Rajabi, Solomon y
Poole, 1991)
8
Las prostaglandinas son capaces de inducir la producción de ácido hialurónico por
fibroblastos cervical, causando aumento de hidratación y alteración de la
composición de glicosaminoglicanos y proteoglicanos (Murota, Abe y Otsuka, 1977).
Las prostaglandinas actúan como agentes quimiotácticos, promoviendo la infiltración
de leucocitos y macrófagos dentro del estroma cervical. Estas células inflamatorias
pueden ser la fuente de enzimas degradativas específicas que causan los cambios
en la matriz extracellular que están asociadas con la maduración de la cérvix (Arias,
2000)
Las prostagladinas actúan sinérgicamente con el óxido nítrico (NO) y tienen un rol
importante en la maduración cervical al causar cambios en la matriz extracellular que
está asociada con la maduración de la cérvix (Chwalisz y Garfield, 1998). El óxido
nítrico regula la actividad de metaloproteinasas responsables de la degradación del
colágeno e induce la producción de prostaglandinas al estimular la actividad de la
ciclooxigenasa (Salvemini, Misko, Masferrer, Seibert, Currie y Needleman, 1993)
La prostaglandina E1 puede inducir la liberación de óxido nítrico cervical. El nivel de
metabolitos del óxido nítrico se incrementa significativamente por 1 a 3 horas luego
de la administración de 400 y 25 μg de misoprostol vaginal en etapa temprana y final
del embarazo. Sin embargo, el mismo estudio demostró que 400 μg de misoprostol
vaginal no tuvo efecto sobre los metabolitos de óxido nítrico del fluido cervical en
mujeres no embarazadas. No hay información si una dosis más elevada o un tiempo
mayor podrían haber resultado en la liberación de óxido nítrico cervical en mujeres
no embarazadas. Sin embargo, se ha demostrado la maduración cervical luego de
10 horas(h) de administración de misoprostol en varios estudios (Choksuchat,
Cheewadhanaraks, Getpook, Wootipoom y Dhanavoravibul, 2006)
Las prostaglandinas tienen una potente actividad uterotónica debido a su efecto de
9
incrementar el calcio intracellular y la activación de la protein quinasa específica
serina/treonina que fosforila la cadena ligera reguladora de la miosina II, conllevando
a que la actina y la miosina sufran cambios conformacionales que las capacitan a
deslizarse entre ellas, causando acortamiento de las células musculares e
induciendo las contracciones uterinas (Choksuchat, 2010)
Vías de ingreso y propiedades farmacocinéticas de varias rutas de
administración del misoprostol éster.
Absorción
Las tabletas de misoprostol éster fueron desarrolladas para ser usadas oralmente.
Sin embargo, se han utilizado otras rutas de administración, que incluyen vaginal,
sublingual, bucal y rectal, en aplicaciones obstétricas y ginecológicas. Desde hace
varios años existen numerosos estudios acerca del perfil farmacocinético de varias
rutas de administración del misoprostol éster (Tang et al., 2007).
Se han estudiado tres propiedades farmacocinéticas, como la concentración pico, el
tiempo de aparición de la concentración pico y el área bajo la concentración sérica
versus la curva de tiempo (Meckstroth, Whitaker, Bertisch, Goldberg, y Darney,
2006). El tiempo de la concentración pico (Tmax) representa cuan rápido la droga
puede ser absorbida; la concentración pico máxima (Cmax) refleja que tan bien la
droga esta siendo absorbida mientras que el área bajo la concentración sérica
versus la curva de tiempo (AUC, equivalente a biodisponibilidad) denota la
exposición total a la droga (Tang et al., 2007)
Vía oral
Los primeros estudios se centraron en las propiedades farmacocinéticas. Luego de
la administración oral, el misoprostol éster es rápido y casi completamente absorbido
a partir del tracto gastrointestinal. Sin embargo, la molécula sufre rápido
10
metabolismo y des-esterificación para formar misoprostol ácido (Hofmeyr y
Gulmezoglu, 2008) debido al potencial de hidrogeniones (pH) del estómago y a la
presencia de esterasas a nivel bucal (nota del autor). Luego de una dosis de 400
microgramos de misoprostol éster por vía oral, los niveles de misoprostol éster en
plasma aumentan rápidamente y alcanzan picos alrededor de 30 minutos,
disminuyendo rápidamente a los 120 minutos, manteniendo niveles bajos en
adelante
(Meckstroth, et al., 2006). La concentración plasmática de misoprostol éster alcanza
picos a los 20 minutos de ingesta (Bentov, Sheiner y Katz, 2004). Misoprostol
inalterado (éster) no puede ser detectado en el plasma aún a los cinco minutos luego
de dosis oral (Zou et al., 2007)
Vía vaginal
En los estudios clínicos realizados se encontró que la administración vaginal fue más
efectiva que la administración oral en el aborto con medicamentos (Ho, Ngai, Liu,
Wong y Lee, 1997). Zieman, Fong et al. (1997) realizaron los primeros estudios
farmacocinéticos de comparación entre la administración oral y vaginal.En contraste
con la vía oral, la concentración plasmática aumenta gradualmente después de la
administración vaginal, alcanzando su nivel máximo después de 70 a 80 minutos
antes de comenzar a disminuir poco a poco con niveles detectables de droga hasta
después de 6 horas (Tang et al., 2007). Aunque la concentración máxima después
de la administración oral es superior a la de la administración vaginal, el "área bajo la
curva" es mayor cuando se administra por vía vaginal. La mayor biodisponibilidad
del misoprostol éster por vía vaginal puede ayudar a explicar por qué es más eficaz
en el aborto con medicamentos (Tang et al., 2007). Esto se explica mejor con el
ejemplo del medicamento de liberación sostenida (los comprimidos o tabletas de
11
liberación controlada), además puede deberse a la formula farmacéutica que posee
cada marca comercial, esto es, a los diferentes excipientes usados en la fabricación
de las especialidades farmacéuticas del misoprostol, siendo preciso indicar que no
se ha podido encontrar ningún estudio de bioequivalencia a nivel internacional. Se
ha demostrado que el coeficiente de variación del área bajo la curva (AUC) luego de
la administración vaginal es mayor que el obtenido después de la administración oral
del misoprostol éster (Zieman et al, 1997). Esto significa que la absorción vaginal del
misoprostol éster es inconsistente. En la práctica clínica, algunas veces se ven
restos de las tabletas varias horas después de administración vaginal, lo que indica
que la absorción es variable e incompleta. Esto puede deberse a la variación de
volumen y pH de descarga vaginal entre mujeres. La variación en la cantidad de
sangrado durante el aborto con medicamentos también puede afectar la absorción
de misoprostol éster a través de la mucosa vaginal. Se han realizado varios intentos
para mejorar la absorción de misoprostol éster por vía vaginal. La adición de agua a
las tabletas de misoprostol es una práctica común. Sin embargo, esto no ha
demostrado mejorar la biodisponibilidad vaginal del misoprostol (Tang et al., 2002).
Los estudios acerca de la farmacocinética del misoprostol ácido han demostrado lo
siguiente:
1. Un modelo farmacocinético dependiente de la vía de administración
2. Que el misoprostol éster administrado vía vaginal parece tener una
biodisponibilidad tres veces mayor que el equivalente con la dosis oral (Khan, el
Refaey, Sharma, Sooranna y Stafford, 2004)
Esto se explica por el primer gran metabolismo del misoprostol éster oral a través del
tracto gastrointestinal y el hígado. El misoprostol éster es transformado a misoprostol
ácido por el pH del estómago y las esterasas que encuentra a lo largo del tracto
12
gastrointestinal y en mayor proporción en el hígado de acuerdo a los datos de
laboratorio obtenidos durante la realización de éste estudio. En consecuencia, la
efectividad del misoprostol éster por vía oral depende de la dosis. Como se
esperaba, el misoprostol éster por vía oral fue menos efectivo que por vía vaginal
(Bartusevicius, Barcaite y Nadisauskiene, 2005)
Vía Sublingual
Recientemente, se ha estudiado la administración sublingual del misoprostol éster en
relación al aborto con medicamentos y maduración cervical. La tableta de
misoprostol éster es muy soluble y puede disolverse en 20 minutos cuando es
colocada debajo de la lengua. Un estudio farmacocinético comparó la cinética de
absorción de las vías de administración oral, vaginal y sublingual del misoprostol
éster (Tang et al., 2002). Se encontró que el misoprostol éster vía sublingual
presenta menor tiempo para alcanzar la concentración máxima y la mayor
biodisponibilidad en comparación con las demás rutas (Tang et al., 2007)
La concentración máxima se alcanza alrededor de 30 minutos después de la
administración sublingual y oral, mientras que después de la administración vaginal,
el tiempo es 75 minutos (Tang et al., 2002). Por lo tanto, parece que las vías de
administración oral y sublingual tienen inicio de acción más rápido. Después de
administrar una dosis sublingual de 400 microgramos de misoprostol éster, se
alcanza una concentración pico superior a la administración oral y vaginal. Esto se
debe a la absorción rápida a través de la mucosa sublingual, así como el evitar sufrir
metabolismo de primer paso a través del hígado.
La abundante irrigación sanguínea debajo de la lengua y el pH relativamente neutro
de la cavidad bucal pueden ser factores contribuyentes. El rápido inicio y la elevada
concentración pico promedio significa que de todas las rutas posibles, la
13
biodisponibilidad sistémica, medida por la AUC en las primeras 6 horas, es mayor
para la administración sublingual. En contraste con el estudio previo realizado por
Zieman et al, el AUC 360 minutos después de administración oral y vaginal son
similares, pero sólo el 54% y 58%, respectivamente comparados con la
administración sublingual (Tang et al., 2002). La diferencia de estos hallazgos acerca
de la biodisponibilidad en estos dos estudios puede deberse a la amplia variación en
la absorción del misoprostol éster a través de la mucosa vaginal entre las mujeres.
Por otra parte, aunque la absorción vaginal ha demostrado ser más lenta y la
concentración máxima, inferior a la de las demás rutas, la concentración sérica de
misoprostol éster se mantiene a ese nivel bajo durante un período de tiempo más
largo. De hecho, al final de la sexta hora, los niveles séricos del misoprostol ácido,
luego de la administración por vía vaginal, son más altos que aquellos encontrados
por vía sublingual y oral. Por lo tanto, el efecto del misoprostol éster puede persistir
por más de 6 horas después de una dosis única, a pesar que el nivel umbral sérico
de acción clínica sea desconocido. Recientemente, luego que se describió un
transporte directo utero-vaginal para la absorción de progesterona se propuso que
un mecanismo similar puede existir para la absorción del misoprostol y éste
mecanismo podría explicar el mejor desempeño clínico de la administración
vaginal(Cicinelli, de Ziegler, Bulletti, Matteo, Schonauer y Galantino, 2000).
La administración sublingual en dosis de 800µg fue asociada con mayores síntomas
y menor aceptación comparado con la administración bucal. Mayores
investigaciones son necesarias para confirmar estos hallazgos y determinar si las
diferentes farmacocinéticas reflejan diferencias clínicas y la necesidad de administrar
misoprostol éster sublingual a menores dosis (Schaff, DiCenzo y Fielding, 2005)
14
Vía Bucal
La vía bucal es otra vía de administración del misoprostol éster. El medicamento se
coloca entre los dientes y la mejilla y se deja que sea absorbido por la mucosa bucal.
Los estudios clínicos, aunque limitados en comparación con otras rutas, han
demostrado que la vía bucal es también eficaz para el aborto con medicamentos, la
maduración cervical y la inducción del parto (Castleman, Oanh, Hyman, Thuy y
Blumenthal, 2006). La forma de la curva de absorción de la ruta bucal es muy similar
a la absorción vaginal, pero los niveles séricos del medicamento alcanzados son
más bajos durante todo el período de estudio de 6 horas (Meckstroth et al., 2006).
Después de la administración bucal el tiempo máximo (Tmax) es de 75 minutos, lo
que es similar a la obtenida luego de la administración vaginal, pero el AUC de la
administración bucal es apenas la mitad que de la administración vaginal. Otro
estudio que comparó la administración bucal a la sublingual también ha demostrado
que el AUC de la administración sublingual de misoprostol es 4 veces mayor que el
de la administración bucal siendo las dos dosis administradas, dosis bucal y
sublingual, iguales. La ruta bucal es una vía de administración prometedora y deben
realizarse mayores estudios para compararla con las otras vías de administración.
En el estudio de Schaff et al. (2005) la dosis fue de 800µg y se encontró que las
concentraciones vía sublingual fueron aproximadamente 4 veces mayor que para la
vía bucal.
Vía rectal
La ruta rectal de administración se ha estudiado recientemente para el tratamiento
de la hemorragia posparto. Esta vía de administración es poco utilizada para otras
aplicaciones.
15
La forma de la curva de absorción después de la administración rectal es similar al
de la administración vaginal, pero su AUC es sólo un tercio que el de la
administración vaginal. El Tmax promedio después de la administración rectal es de
40 a 65 minutos (Meckstroth et al., 2006), aunque un estudio reciente reportó una
cantidad menor de Tmax : 20 minutos (Tang et al., 2007).
Varios reportes han descrito el uso de tabletas de misoprostol éster para detener la
hemorragia posparto vía rectal. La mayor vida media del misoprostol éster
administrado rectalmente puede prolongar la contracción uterina previniendo de esta
manera hemorragias retardadas, y quizás sea más importante que los niveles de
concentración pico. En un estudio el misoprostol fue detectado a los 7,5 minutos en
algunos pacientes cuando las vías de administración fueron las vías rectal y oral
(Khan y el Refaey, 2003)
Biotransformación
Los primeros estudios se centraron en las propiedades farmacocinéticas. Luego de
la administración oral, el misoprostol éster es rápida y casi completamente absorbido
a partir del tracto gastrointestinal. Sin embargo, el medicamento sufre rápido
metabolismo y una primera gran des-esterificación para formar misoprostol ácido.
Luego de una dosis de 400 microgramos de misoprostol éster por vía oral, los
niveles de misoprostol éster en plasma aumentan rápidamente y alcanzan picos
alrededor de 30 minutos, disminuyendo rápidamente a los 120 minutos,
manteniendo niveles bajos en adelante (Tang et al., 2007). La concentración
plasmática de misoprostol éster alcanza máximos a los 20 minutos de ingesta
(Bentov et al., 2004). En un estudio misoprostol inalterado (éster) no puede ser
detectado en el plasma aún a los cinco minutos luego de dosis oral (Zou et al., 2007)
16
Se ha podido comprobar que el misoprostol éster ya se transforma gracias a las
esterasas presentes en la boca a misoprostol ácido. Esta transformación es mayor a
nivel gástrico debido al pH y finalizará a nivel hepático por la mayor cantidad de
esterasas presentes, datos obtenidos durante la realización de éste trabajo de
investigación.
Eliminación
Según referencias bibliográficas, a los cinco minutos de haber ingerido misoprostol
éster es metabolizado a misoprostol ácido por estearasas presentes en el organismo
(Zou et al., 2007). La eliminación del misoprostol ácido se realiza a través de la
orina. Para fines de éste estudio se buscó infructuosamente trabajos de
investigación en muestras de orina.
Acumulación
De la misma manera que estudios de misoprostol en orina, no se hallaron estudios
de acumulación del misoprostol ácido en el organismo.
Farmacocinética en la leche materna humana
En la administración de misoprostol a mujeres, en período de lactancia para
tratamiento y prevención de hemorragia posparto, es importante tener en cuenta sus
posibles efectos sobre el feto. Sin embargo, existen pocos estudios sobre la
farmacocinética del misoprostol éster por vía oral en la leche materna. Se detectó
misoprostol en la leche materna a los 30 minutos de su administración oral. La
concentración máxima se alcanzó en una hora, lo que es ligeramente más lento que
el nivel plasmático (30 minutos). El nivel en la leche materna disminuye rápidamente
después y es indetectable entre 4 a 5 horas después de la ingestión. El nivel de
misoprostol ácido en la leche materna es sólo un tercio del nivel alcanzado en el
plasma (Vogel, Burkhardt, Rentsch, Schwee, Watzer y Zimmermann, 2004). No hay
17
datos sobre la farmacocinética del misoprostol en la leche materna para rutas no
orales. Sin embargo, sería de esperar que la concentración de la leche materna
fuese menor después de la administración vaginal en comparación con la
administración oral, pero puede durar más tiempo. El efecto de corto tiempo de
exposición a bajos niveles de misoprostol en el feto es desconocido (Tang et al.,
2007).
Efectos sobre el útero y cuello uterino
El efecto uterotónico y de ablandamiento del cuello uterino en el tracto genital de la
mujer fueron considerados como efectos secundarios en lugar de efectos
terapéuticos, cuando se introdujo el uso del misoprostol por primera vez. Sin
embargo, es debido a estos efectos que el misoprostol es tan ampliamente utilizado
en la práctica obstétrica y ginecológica hoy en día (Tang et al., 2007).
Sobre el útero
El efecto del misoprostol sobre la contractilidad uterina fue estudiado por Gemzell-
Danielsson, Marions, Rodriguez, Spur, Wong y Bygdeman (1999) y Aronsson
Bygdeman y Gemzell-Danielsson (2004). Después de una dosis única de
misoprostol por vía oral hay un aumento del tono uterino (Aronsson et al., 2004) para
producir las contracciones regulares, sin embargo, se requiere mantener la
concentración plasmática del misoprostol y esto requiere repetir las dosis orales.
El efecto de la administración vaginal de una sola dosis de misoprostol sobre la
contractilidad uterina es inicialmente similar al de la administración oral: un aumento
del tono uterino. Sin embargo, después de 1 a 2 horas, aparecen contracciones
uterinas regulares y duran por lo menos hasta 4 horas después de la administración
de misoprostol (Demzell-Danielsson et al., 1999). El desarrollo de las contracciones
18
regulares tras la administración vaginal puede explicar la mejor eficacia clínica de la
administración vaginal en comparación con la administración oral (Ho et al., 1997).
El tiempo promedio del tono máximo es significativamente más corto para
misoprostol por vía oral y sublingual en comparación con el nivel alcanzado por el
tono luego de la administración vaginal. Una o dos horas después de la
administración de misoprostol, el tono comienza a disminuir en todas las vías. En el
caso del misoprostol por vía oral, este es el final de la actividad. Para el tratamiento
vaginal, sin embargo, el tono poco a poco es sustituido por contracciones uterinas
regulares. Estas contracciones uterinas regulares se mantienen durante un período
más largo después de la administración vaginal comparado con la encontrada
después del tratamiento sublingual, disminuyendo su actividad sólo después de 4
horas (frente al de la administración sublingual de 3 horas).
Los estudios acerca de la contractilidad uterina han demostrado que se requiere
alcanzar niveles sostenidos, en vez de niveles séricos elevados para el desarrollo de
contracciones uterinas regulares. Los estudios no han logrado definir el nivel umbral
sérico para la contractilidad uterina. Parece que un nivel sérico muy bajo de
misoprostol es necesario para el desarrollo de contracciones uterinas regulares.
Esto se complica aún más por el hecho que la sensibilidad del útero a las
prostaglandinas aumenta con la gestación. Los efectos clínicos o acciones
necesarias para diferentes indicaciones de uso también varían. La fuerza de
contracción que se requiere para alcanzar los efectos clínicos generalmente
aumenta con la gestación. Por ejemplo, contracciones más fuertes se requieren para
la inducción del parto que para el aborto. Para el aborto con medicamentos, la
adición de la mifepristona podría modificar la acción del misoprostol y disminuir el
nivel umbral de la contractilidad uterina. Además de la contracción uterina, el efecto
19
de ablandamiento del misoprostol sobre el cuello uterino contribuye también a su
acción clínica (Tang et al., 2007).
Sobre el cervix
Se han realizado muchos estudios clínicos que han demostrado el efecto de inicio
cervical del misoprostol durante la gestación. El misoprostol ha sido utilizado
ampliamente por su efecto de ablandamiento del cuello uterino antes de la inducción
del trabajo y la evacuación quirúrgica del útero. Los estudios han demostrado que
menos fuerza fue necesaria para la dilatación mecánica del cuello del útero si el
misoprostol se aplicó antes del procedimiento (Ngai, Tang, Lao, Ho y Ma, 1995)
.Aunque este efecto de ablandamiento del cuello del útero puede ser un efecto
secundario a las contracciones uterinas inducidas por el misoprostol, es más
probable que se deba al efecto directo del misoprostol en el cuello uterino. El cuello
uterino es esencialmente un órgano de tejido conjuntivo. Células musculares lisas
representan menos del 8% de la parte distal del cuello uterino. No se conoce el
mecanismo exacto que conduce a la maduración cervical fisiológica. Los eventos
bioquímicos que están implicados en la maduración cervical son los siguientes:
1. Un aumento de la solubilidad del colágeno,
2. Un aumento de la actividad colagenolítica y
3. Una disminución en el contenido de colágeno total.
Los cambios en componentes de la matriz extracelular durante la maduración del
cuello uterino fueron descritos como similares a una respuesta inflamatoria (Liggins,
1981). De hecho, durante la maduración del cuello uterino hay un flujo de células
inflamatorias dentro del estroma cervical, lo que aumenta las metaloproteinasas de
la matriz y por lo tanto conduce a la degradación del colágeno y ablandamiento del
cuello uterino (Aronsson, Ulfgren, Stabi, Stavreus-Evers y Gemzell-Danielsson,
20
2005). Se ha propuesto que estas células producen citoquinas y prostaglandinas que
tienen un efecto sobre el metabolismo de la matriz extracelular. También se ha
demostrado que los análogos de prostaglandina podrían disminuir el contenido de
hidroxiprolina del cuello uterino de la gestante (Rath, Theobald, Kuhnle, Kuhn,
Hilgers y Weber, 1982).
Los cambios histoquímicos en el cuello uterino después de la administración de
misoprostol a mujeres embarazadas fueron estudiados con microscopia electrónica y
determinación de la captación de prolina. La incorporación promedio de prolina por
microgramo (µg) de proteína y la densidad del colágeno, que se estima por la
intensidad de luz, fue significativamente menor que el del control. Esto indicó que la
acción del misoprostol parece ser principalmente en el estroma del tejido conectivo
con evidencias de desintegración y disolución del colágeno (El Refaey et al., 1994)
La mayoría de los estudios sobre la contractilidad uterina y ablandamiento cervical
después de administración de misoprostol se han realizado en mujeres
embarazadas. Hay, sin embargo, evidencia que sugiere que estos cambios también
se producen en el útero de mujeres que no están embarazadas. Algunas mujeres no
embarazadas experimentan calambres uterinos después de la ingesta de
misoprostol y éste (misoprostol) ha demostrado tener también un efecto de inicio
cervical en el estado no gestacional (Crane y Healey, 2006)
Toxicocinética, Sintomatología, Efectos Secundarios y Teratogenicidad
El misoprostol éster es un medicamento seguro y bien tolerado. Los estudios
toxicológicos pre-clínicos indican un margen de seguridad al menos de 500 - 1000
veces entre las dosis letales en animales y dosis terapéuticas en humanos (Kotsonis,
Dodd, Regnier y Kohn, 1985).
21
Ningún efecto adverso significativo no-clínico, hematológico, bioquímico, endocrino,
inmunológico, respiratorio, oftálmico, plaquelario o cardiovascular ha sido encontrado
con el uso del misoprostol. La diarrea es la reacción adversa más importante y
consistente que se ha reportado con la ingesta de misoprostol, pero por lo general
es leve y limitada. Pueden ocurrir náuseas y vómitos que desaparecen entre 2 a 6
horas.
Algunas mujeres encuentran un sabor desagradable cuando la administración es
sublingual o bucal. Una sensación de entumecimiento en la boca y la garganta
también sucede cuando se administra por vía sublingual. La dosis tóxica de
misoprostol es desconocida, pero es considerada como una droga muy segura. Sin
embargo, Henriques, Lourenco, Ribeirinho, Ferreira y Graca (2007) describen el
caso de una mujer que murió de falla multiorgánica tras una sobredosis de
misoprostol (60 comprimidos durante 2 días) .
Se ha reportado el caso de una mujer que ingirió 42 tabletas de 200 microgramos de
misoprostol, quien presentó sólo dolor abdominal, vomito, diarrea y confusión. Sólo
se le aplicó lavado gástrico y carbón activado (Bentov et al., 2004).
Fiebre y escalofríos también se han informado y son comunes después de dosis
altas en el tercer trimestre o el período posparto inmediato. La situación típica en la
que se observó fue cuando el misoprostol fue usado para la prevención o
tratamiento de la hemorragia posparto. En los estudios de misoprostol para la
prevención de hemorragia posparto, se informó de escalofríos en el 32% a 57% de
mujeres que recibieron misoprostol (Derman, Kodkany, Goudar, Geller, Naik, Bellad,
2006). Hiperpirexia (mayor a 40 ° C) ha sido reportada en varios casos luego de la
administración de 600 µg, e hiperpirexia con delirio y/o ingreso a la unidad de
cuidados intensivos han sido informados luego de ingesta de 800 µg (Chong, Chua,
22
El-Refaey, Choo, Chanrachakul y Tai, 2001). Otra de las implicancias acerca del uso
de misoprostol es el riesgo de ruptura uterina, especialmente en mujeres con una
cicatriz uterina anterior. Informes de ruptura uterina son raros en el primer trimestre
del aborto con medicamentos (Kim, Han, Choi, Ahn, Yang y Kang, 2005), pero el
riesgo parece aumentar con la gestación. Existe evidencia, a partir de la literatura,
que la mayoría de rupturas uterinas que se producen tienen lugar durante la
inducción de labor en el tercer trimestre, cuando está asociada con cicatriz uterina
previa y otros factores de riesgo para la ruptura uterina (Plaut, Schwartz y Lubarsky,
1999). La infección no es común después de un aborto con medicamentos inducido
por misoprostol. Se ha reportado que la incidencia es sólo 0,92% (Shannon,
Brothers, Philip y Winikoff, 2004). Sin embargo, recientes informes sobre infección
fatal con Clostridium sordellii, después de usar misoprostol por vía vaginal para el
aborto, han suscitado la preocupación sobre el uso de este método. Sin embargo,
después de una amplia investigación aún no hay consenso sobre el mecanismo de
infección en estos casos (Fischer, Bhatnagar, Guarner, Reagan, Hacker y Van
Meter, 2005). Se cree que a medida que la incidencia global de infección sigue
siendo baja, el aborto con medicamentos no debe considerarse como un método
que se asocia con una tasa de infección más alta en comparación con el método
quirúrgico (Tang et al.,2007).
La exposición al misoprostol en el embarazo temprano se ha asociado con múltiples
defectos congénitos. La FDA lo clasifica como medicamento Categoria X en función
de su Riesgo Teratogénico (FDA, 2016)
a) Los efectos sobre la gestante son los siguientes:
Los efectos adversos son, en general, una prolongación de la acción farmacológica.
Las reacciones adversas más frecuentes son:
23
Trastornos gastrointestinales: náuseas, vómitos y diarrea.
Algunos de las siguientes reacciones adversas han sido descritas de forma
ocasional o rara:
Trastornos cardiovasculares: hipertensión, hipotensión, arritmia, flebitis,
edema y dolor en el pecho.
Trastornos del sistema nervioso: mareo, confusion, somnolencia, síncope,
cefalea, temblores, ansiedad, neurosis.
Trastornos respiratorios, torácicos y mediastínicos: tos, disnea, bronquitis y
neumonía.
Trastornos musculoesqueléticos: artralgia, mialgia, calambres y paralisis
musculares, dolor de espalda.
Embarazo, puerperio y enfermedades perinatales: contractilidad uterina
anormal (aumento de la frecuencia, tono o duración) con o sin bradicardia
fetal, ruptura uterina, ruptura prematura de membranas, desprendimiento
prematuro de placenta, infección amniótica, embolia pulmonar por líquido
amniótico y hemorragia vaginal.
Trastornos del aparato reproductor: dilatación cervical rápida.
Trastornos generales: hipertermia transitoria y escalofríos.
Trastornos del sistema inmunológico: reacciones de hipersensibilidad.
Trastornos de la piel: rash.
b) Efectos sobre el feto:
Alteración del ritmo cardiaco fetal, acidosis fetal (pH de la arteria umbilical por
debajo de 7,15), sepsis fetal intrauterina, sufrimiento fetal, síndrome de
aspiración de meconio.
c) Efectos teratogénicos:
24
El uso indiscriminado y la falta de información sobre los límites en la edad
gestacional cuando es utilizado para la interrupción de embarazos no
deseados nos enfrenta a otra cara del problema del aborto clandestino. Se ha
detectado la aparición de malformaciones en fetos expuestos prenatalmente
al misoprostol (abortos frustrados) entre las que se encuentran:
Defectos de reducción de miembros
Síndrome de Moebius
Artrogrifosis
Pie bot
Hidrocefalia
Hipoglosia e hipodactilia
Anomalías en los huesos del cráneo
Anillos de constricción tipo brida (Alemany, 2011).
Estas malformaciones pueden deberse a un suministro anormal de sangre al
embrión en desarrollo durante las contracciones inducidas por misoprostol. Se
estima que el riesgo absoluto de malformaciones después de exposición al
misoprostol es relativamente bajo, del orden de 1% en los fetos expuestos. Una
amplia gama de defectos es posible en función del tiempo de exposición al
misoprostol. Los defectos en el sistema nervioso central y las extremidades son los
más frecuentes. El síndrome de Mobius, que se caracteriza por parálisis facial
congénita con o sin defectos en las extremidades, se ha asociado a la exposición al
misoprostol (Orioli y Castilla, 2000). Otras anormalidades como defectos de las
extremidades transversales, en forma de anillo de constricción de las extremidades,
artrogriposis, hidrocefalia, holoprosencefalia y exostrofia de la vejiga también han
sido reportados. La malformación fetal es asociada más comúnmente con el régimen
25
exclusivo de misoprostol para el aborto en comparación con el régimen secuencial
utilizando la mifepristona y el misoprostol. Puede deberse a la fuerte contracción
uterina asociada con altas dosis repetidas de misoprostol. Por lo tanto, el aborto
inducido por el misoprostol debe ser realizado bajo supervisión médica (Tang et al.,
2007). Es importante contar con el consentimiento informado de la paciente antes
del aborto y aconsejarla sobre el riesgo de anomalía fetal si el embarazo continúa
aún después de la exposición al misoprostol (Tang et al., 2007).
Existe evidencia que la exposición prenatal al misoprostol está asociada a riesgo de
presentar defectos en las terminaciones de las piernas y secuencia Mobius (Dal
Pizzol, Pozzobon y Serrate, 2006)
Espectrometría de Masas
Ionización por Electrospray (ES)
Fue desarrollado por Yamashita y Fenn. Alcanza muy alta sensibilidad y es fácil de
ser acoplado a sistemas de cromatografía líquida, microcromatografía líquida y
electroforésis capilar.
La ES se produce al aplicar un fuerte campo eléctrico bajo presión atmosférica, a un
líquido que viaja a través de un tubo capilar con flujo lento (aproximadamente 1 – 10
µL/min).El campo eléctrico es obtenido al aplicar una diferencia de potencial de 3 – 6
kV entre este capilar y el electrodo contrario, separado por 0,3 – 2 cm, que produce
campos eléctricos del orden de los 106 V/m (fig. 2). Este campo induce una
acumulación de carga en la superficie líquida localizada al final del capilar, el cual se
romperá para formar gotas con carga elevada. Un gas inyectado coaxialmente a flujo
lento permite la dispersión del spray limitada en espacio. Luego estas gotas pasan
ya sea a través de una cortina de gas inerte caliente, frecuentemente nitrógeno, o a
través de capilar caliente para remover las últimas moléculas del solvente.
26
El spray inicia un “primer voltaje” que, para una determinada fuente, depende de la
superficie de tensión del solvente. En una fuente que tiene un primer voltaje de 4kV
para el agua (tensión superficial 0.073 N m-2), 2.2kV para metanol (0.023 N m-2),
2.5kV para acetonitrilo (0.030 N m-2) y 3 kV para dimetilsulfóxido (0.043 N m-2).Si se
examina con un microscopio la gota naciente que se forma en la punta del capilar
mientras se incrementa el voltaje, como se observa en la figura 3., a bajos voltajes la
gota parece esférica, luego se alarga bajo la presión de las cargas acumuladas en la
punta en el campo eléctrico más elevado; cuando la tensión superficial se rompe la
forma de la gota cambia a un “cono Taylor” y aparece el spray.
Gomez y Tang (1994) fueron capaces de fotografiar las gotas formadas y divididas
en una fuente ES. Un dibujo de una gota descompuesta es mostrado en la figura 4.
A partir de sus observaciones, concluyeron que la ruptura de las gotas puede ocurrir
antes que se alcance el límite dado por la ecuación de Rayleigh debido a que las
gotas son deformadas mecánicamente reduciendo así la repulsión necesaria para
romper las gotas.
El solvente que se encuentra dentro de la gota se evapora, lo cual le causa
contracción y su carga por unidad de volumen se incrementa. Bajo la influencia del
campo eléctrico elevado, ocurre la deformación de la gota. La gota se alarga bajo la
fuerza resultante de la acumulación de carga, similar a lo que ocurre en la punta de
prueba, y finalmente produce un nuevo cono Taylor. De este cono Taylor, se liberan
cerca de 20 gotas más pequeñas. Típicamente una primera generación de gotas a
partir del capilar tendrán un diámetro de aproximadamente 1,5 µm y transportarán
cerca de 50 000 cargas elementales o casi 10-14Coulombs (C). Las gotas formadas
tienen un diámetro de 0,1 micrometros y conllevan de 300 a 400 cargas elementales.
El volumen total de las gotas formadas es cerca del 2% de la gota precursora pero
27
contiene 15% de la carga.. La carga por unidad de volumen es así multiplicada por
una factor de siete. La gota hija se contraerá más debido a la evaporación del
solvente y producirá otra generación de gotas.
Estas pequeñas gotas altamente cargadas seguirán perdiendo solvente, y cuando el
campo eléctrico sobre su superficie devenga lo suficientemente amplio, acontece la
deserción de iones de la superficie. Cargas en exceso se acumulan en la superficie
de la gota. En el volumen, los analitos y electrolitos, de los cuales las cargas
positivas y negativas son iguales en número, están presentes en un número mayor
que en la gota precursora. La deserción de las moléculas cargadas ocurre desde la
superficie. Esto significa que la sensibilidad es mayor para compuestos cuya
concentración en la superficie es mayor, los más lipofílicos. Cuando se analiza
mezcla de compuestos, aquellos presentes en la superficie de las gotas pueden
enmascarar, casi completamente, la presencia de compuestos que son más solubles
en el volumen. Cuando la gota contiene gran cantidad de moléculas, como proteínas
por ejemplo, las moléculas no se desorben, pero son liberadas por evaporación del
solvente. Esto parece suceder cuando el peso molecular de los compuestos excede
los 5 000 a 10 000 Daltons (D).
Los iones obtenidos de grandes moléculas conllevan un mayor número de cargas si
varias zonas ionizables están presentes. Típicamente, una proteína conlleva una
carga por mil daltons aproximadamente, a menos si hay pocos grupos amino (de
Hoffmann E y Stroobant V (2007). Mass Spectrometry, Principles and Applications. ,
The Atrium, Southern Gate, Chichester, West Sussex PO19 8SQ, England:John
Wiley & Sons).
28
Figura 2. Diagrama de la fuente de electrospray, usando espumaderas para
focalización del ion y una cortina de gas nitrógeno caliente para la desolvatación
(arriba), o con un capilar caliente para desolvatación (abajo).
Figura 3. Efecto del potencial de electrospray en la gota en la punta del capilar, lo
que se observa con binoculares mientras se incrementa el voltaje.
Izquierda: a bajo voltage , la gota es casi esférica.
Centro: cerca de 1 o dos kilovoltios, pero debajo del potencial inicial, la gota se
alarga bajo la presión de las cargas acumuladas en la punta.
Derecha: en el potencial inicial, la presión es mayor que la tensión superficial, la
forma de la gota cambia de una vez al cono Taylor y pequeñas gotas son liberadas.
Las gotas se dividen y explotan, produciendo el spray.
29
Figura 4. Una gota descomponiéndose en una fuente de electrospray, de acuerdo a;
q, carga; Eo permitividad del ambiente; γ, tensión superficial y D, diámetro de una
gota supuestamente esférica.
30
III. MATERIALES Y MÉTODOS
3.1 Materiales
Material Biológico
Muestras de orina de mujer gestante que presumiblemente haya ingerido el
medicamento denominado misoprostol con fines abortivos.
Materiales de Laboratorio
Probetas de 50mL de vidrio borosilicato
Cartuchos de Extracción en Fase Sólida (SPE)
Tubos Falcon de 15 y 50mL de polipropileno
Espátulas de acero inoxidable de 5 mg de capacidad
Micropipetas automáticas de 1 microlitros ( L) a 20 L de capacidad
Micropipetas automáticas de 20 L a 200 L de capacidad
Micropipetas automáticas de 10 L a 5000 L de capacidad
Columna UPLC BEH C18 (1,7 micrometros ( m), 2,1 mm x 50 mm)
Pipetas Pasteur de polietileno de 3mL
Equipos
Cromatógrafo líquido de ultraperformance con spectrómetro de Masa-Masa(Detector
Fotomultiplicador) marca Waters, modelo Acquity
Equipo de extracción en fase sólida (SPE) , J.T.Baker
Balanza analítica, Sartorius, sensibilidad 0,00010 g, modelo BL 210S
Sonicador Amsco modelo Reliance Sonic 250
Bombas de vacío Emerson modelo SA55JXHTP - 4698
Equipo soxhlet automático Heidolph Loborota 4003 Control
Sistemas informáticos: computadora compatible pentium 4
Centrifugadora Sigma modelo 201
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Reactivos y fármacos
Misoprostol ácido y misoprostol éster Sigma Aldrich, Alemania.
Metanol grado cromatografía líquida (o grado HPLC) Merck
Agua grado HPLC Merck
3.2 Métodos
3.2.1. Diseño del Método
Muestras y pre-tratamiento
Se ensayaron métodos utilizando extracción líquido-líquido con solventes orgánicos
como hexano, dietiléter y acetato de etilo, clorometano y sus mezclas, los cuales
dieron resultados no reproducibles. Luego, se ensayaron técnicas utilizando
Cartuchos de Extracción en Fase Sólida (SPE) para el pre-tratamiento de muestras
biológicas. Se ensayaron cartuchos LC-18, LC-8 y cartuchos de balance hidrofílico-
lipofílico, intercambio catiónico y aniónico (HLB) para cuyo ensayo se utilizaron
protocolos Oasis y los recomendados por cada fabricante, cada uno de 3 mililitros
(mL) y 30 miligramos (mg) con varias diluciones, condiciones, reactivos de lavado y
elusión. Los cartuchos HLB Oasis ofrecieron resultados consistentes en términos de
recuperación de misoprostol ácido además de obtenerse un blanco más limpio. Los
cartuchos SPE HLB Oasis fueron pre-acondicionados con 1 mL de solución de
metanol:agua (1:1) , luego se cargó la muestra. Como solución de lavado se utilizó
solución agua-metanol(9:1) luego se eluyó el analito con 1 mL de metanol puro al
cual se agregó un mililitro de agua, colocándose la mezcla en vial de 1,5 mL del cual
se inyectó sólo 0,1 µL en el LC-MS/MS.
32
3.2.2.Toma de Muestra (Muestreo)
Se recepcionan las muestras de orina tomadas en las diferentes sedes del Instituto
de Medicina Legal del Perú a nivel nacional. Estas muestras de orina fueron
mantenidas en refrigeración. Las muestras aceptadas fueron aquellas de apariencia
traslúcida sin ningún precipitado, las cuales están listas para análisis (pre-
tratamiento).
3.2.3.Desarrollo del Método
El método se desarrolló probando muestras de orina de personas que previamente
habían ingerido misoprostol ester 600 µg por vía oral. La extracción en fase sólida se
realiza con cartuchos HLB, con los cuales se obtuvieron los mejores resultados.
Cromatografía Líquida
Para obtener un pico simétrico y un tiempo de retención de aproximadamente 2.2
minutos, ver figura 5, se ensayaron varias mezclas de solventes tales como agua y
metanol usando diferentes proporciones, con flujos promedios ( de 0,3 a 0,6
mL/min). Dando mejores resultados la mezcla de metanol: agua (tabla N°1)
Espectrofotometria de Masas
Para optimizar las condiciones ionización por electrospray (ESI) negativo para el
misoprostol ácido, se realizaron escaneos en el cuadrupolo en modo ión negativo.
Durante un experimento de infusión directa, la masa espectral para el misoprostol
ácido reveló un pico a m/z 367.1 atomic mass unit (amu)
Cuando se experimentó con el misoprostol ácido m/z 367.1 amu en modo MRM, la
energía de colisión originó un ion hijo (daughter ion) de m/z 249.0 amu.
Selectividad
Se inyectaron extractos obtenidos a partir de muestras de orina blanco (orina control,
esto es libre de analito) y orina inoculada con misoprostol ácido. Para ello estas
33
muestras sufrieron el proceso de SPE descrito anteriormente. Ningún pico de
interferencia de compuestos endógenos fueron observados en el tiempo de
retención de la muestra con analito comparado con la muestra blanco. El tiempo de
retención del misoprostol ácido fue de 2,2 minutos. El tiempo de corrido
cromatográfico fue de 5 minutos.
Curva de Calibración
La curva de calibración fue construida usando estándares de calibración de 10,
25,50,75 y 100 partes por billón. La curva de calibración fue preparada determinando
la mejor respuesta promedio pico – área vs. la concentración, y adecuado a la
ecuación de la recta y = mx + c .
Preparación de las muestras
Las muestras de orina recolectadas, correspondientes a casos de posible abortos,
fueron procesadas de la siguiente manera:
1. Se obtiene un mililitro de muestra de orina, éste mililitro es sometido a extracción
en fase sólida con cartucho HLB marca Oasis de 3 mL, preacondicionado con 1 mL
de solución de agua : metanol (1:1), lavado con 1mL de solución agua : metanol
(9:1) y el analito eluído con 1mL de metanol, se agrega al final 1mL de agua y se
inyectó 0,1 µL en el sistema LC-MS/MS.
Criterios de inclusión
Muestras de personas de sexo femenino, entre los 15 y 35 años, que hayan
consumido el misoprostol con fines abortivos.
Criterios de exclusión
Muestras de personas de sexo femenino que no hayan consumido el misoprostol
con fines abortivos.
Muestras de orina que estén turbias al momento del análisis.
34
Identificación y cuantificación de misoprostol en muestras de orina
Se usa un sistema UPLC Waters Acquity equipado con desgasificador isobomba con
autosampler para inyectar alícuotas de 0,1 µL de muestra procesada, el sistema
trabaja con una columna Acquity UPLC BEH C18 ( 1.7 µm,2,1 X 50 mm ), mantenida
a temperatura ambiente (24±2°C ). La fase móvil en gradiente, según la siguiente
tabla:
Tabla N°1. Fase móvil en gradiente utilizada en el UPLC MS-MS
Tiempo
(minutos)
Flujo (mL/minutos) %A(agua) %B(metanol)
0,40 95 5
3,00 0,40 5 95
3,50 0,40 5 95
3,6 0,40 95 5
5,50 0,40 95 5
con espectrómetro de masas con ionización por electrospray (ESI).
La cuantificación se realizó por detección MS-MS en modo ión negativo (ESI
negativo) para el misoprostol ácido. El voltaje del cono fue de 25 voltios y gas de
colisión fue de 20 voltios.
La detección de los iones fue realizada en el modo de monitoreo de reacción
múltiple (MRM), los pares de transición del misoprostol ácido m/z 367.1 amu y como
ion hijo (daughter ion) m/z 263.0 amu. Los datos analíticos fueron procesados por el
programa estadístico SPSS versión 22
35
Soluciones estándar
Se prepara la solución stock primaria (1mg/mL) de misoprostol ácido en una mezcla
de agua:metanol (1:1), grado cromatografía líquida, y se almacena a – 4°C.
Diluciones apropiadas fueron realizadas con mezcla de metanol : agua, a la cual se
añadió soluciones stock de trabajo de 10, 25, 50, 75 y 100 partes por billón en el día
de análisis y estas soluciones fueron usadas para preparar la curva.
Las soluciones de trabajo fueron almacenadas aproximadamente a -4°C por una
semana. Estas muestras fueron realizadas por duplicado y cada una fue leída tres
veces.
36
IV. RESULTADOS
La parte experimental se inició con la determinación de la curva de calibración
presentada en la tabla 4.
Tabla 2. Lecturas obtenidas con la curva de calibración construída.
Lecturas(ppb) Áreas
1 12,1 168,501
2 20,3 278,425
3 35,3 436,568
4 50.2 604,326
5 25,8 306,102
6 18,5 243,647
7 14,5 173,489
8 21,5 294,556
9 40,6 547,489
10 47,9 501,568
11 70,2 883,459
12 60,5 742,546
13 56,4 701,523
14 26,8 309,780
15 34,7 412,784
16 76,9 891,547
17 45,9 589,841
18 53,4 635,541
19 81,6 913,110
20 11,5 154,852
37
En la tabla Nº 2 se observa que la concentración menor es 11,5 correspondiendo un
área de 154,852 , la concentración mayor 81,6 corresponde 913,110 , con una
concentración promedio de 40,23
Figura 5.Cromatograma UPLC de Misoprostol ácido.
En la figura 5 se puede apreciar el cromatograma del misoprostol ácido con el pico
desarrollado a los 2,2 minutos.
Tabla Nº3 Correlación de Pearson entre concentración de Misoprostol ácido y el
área bajo la curva
área bajo la curva
concentración de
Misoprostol
ácido
Correlación
de Pearson
0.997(**)
** La correlación es significativa al nivel 0,01 (bilateral).
En la tabla Nº 3 se observa que existe una correlación alta positiva y significativa
(0.99, P = 0.00 < 0.05) entre concentración de Misoprostol ácido y el área bajo la
curva
38
Figura 6. Concentración en ppb de misoprostol ácido (muestras) y área bajo la
curva
En la figura 6 se puede observar que la concentración de misoprostol ácido en
muestras y el área bajo la curva presentan una relación lineal.
39
Tabla Nº4 Concentraciones promedio y coeficiente de varianza hallados para la
curva de calibración.
concentrac
ión
ppb área ppb
promedio
s %CV
1 10 9,7 147,157 9,9167 0,16021 1,6156
2 10 10,1 150,547
3 10 9,9 148,489
4 10 10,1 150,547
5 10 9,9 148,785
6 10 9,8 147,985
7 25 25,2 303,102 25,15 0,10488 0,417
8 25 25,1 301,563
9 25 25,1 301,578
10 25 25 301,045
11 25 25,2 303,155
12 25 25,3 304,568
13 50 50,1 601,231 50,0833 0,1169 0,2334
14 50 50,2 604,326
15 50 50,1 601,354
16 50 50 600,456
17 50 50,2 604,156
18 50 49,9 598,654
19 75 75,1 889,547 75,05 0,18708 0,2493
20 75 75,2 889,102
40
21 75 75 889,578
22 75 74,9 888,954
23 75 75,3 889,125
24 75 74,8 888,105
25 100 100,1 981,125
100,05
0,18708 0,187
26 100 100 981,056
27 100 100,2 981,156
28 100 99,8 981,001
29 100 99,9 981,010
30 100 100,3 981,689
En la tabla Nº 4 se observa que los coeficientes de variación para las
concentraciones promedio son menores que 7% se considera que los valores son
precisos.y existe mayor homogeneidad entre los valores de las concentraciones.
41
Tabla Nº5 Comparación de medias del área bajo la curva y la concentración de
Misoprostol ácido
ANOVA Prueba de Tukey
Medi
a
Desviaci
ón
estánda
r
10 25 50 75 100
Área bajo
la curva
Diez 6 148,9
1833
1,37699
8
0,00* 0,0
0*
0,0
0*
0,0
0*
0,00
*
Veinticinco 6 302,5
0183
1,33514
9
0,0
0*
0,0
0*
0,00
*
Cincuenta 6 601,6
9617
2,19513
3
0,0
0*
0,00
*
Setenticinco 6 889,0
6850
0,53559
5
0,00
*
Cien 6 981,1
7283
0,26026
6
Concentr
ación de
Misoprost
ol ácido
Diez 6 9,916
7
0,37699
8
0,00* 0,0
0*
0,0
0*
0,0
0*
0,00
*
Veinticinco 6 25,15 0,10488 0,0
0*
0,0
0*
0,00
*
Cincuenta 6 50,08
33
0,11690 0,0
0*
0,00
*
Setenticinco 6 75,05
00
0,18708 0,00
*
Cien 6 100,0
500
0,18708
*P<0.05 significativo
42
En la tabla Nº 5 se observa que al comparar las medias del área bajo la curva y la
concentración de misoprostol ácido mediante el ANOVA y la prueba de Tukey no se
presenta una diferencia significativa con un P < 0,05 y una desviación estándar
menor que 3.
43
Figura 7. Grafico de líneas de concentración de Misoprostol ácido según el
área bajo la curva
En la figura 7 se puede observar que la desviación estándar de los valores promedio
de la concentración no difieren y su relación es lineal.
44
Tabla N°6.Tabla comparativa de sistemas de extracción utilizados en dos estudios.
Item Metodo extractivo Fase móvil Referencia
1 Dietil eter:diclorometano (3:2,v/v) Método isocrático,
Metanol:agua(55:45) ,
más solución de
amoniaco 1%
(Zou et al.,
2007)
2 Cartucho Oasis MAX, eluído con
solución de acetonitrilo
tamponado con ácido fórmico al
0.2%
Método isocrático,
solución de acetonitrilo
tamponado con ácido
fórmico al 0.2%
(20:80,v/v)
(Vijava et
al.,2011)
En el estudio de la tabla N°6, ítem 1, se realizaron varias pruebas con solventes, al
final se obtuvieron los mejores resultados con la solución de dietil eter:diclorometano
(3:2,v/v), (Zou et al., 2007). En la misma tabla según ítem 2, se presenta como
alternativa a la extracción líquido-líquido tradicional, un método extractivo por SPE
utilizando el cartucho Oasis Max (Vijava et al.,2011).En el ítem 1 de la tabla N°6 los
extractos fueron secados a 30°C en atmósfera de nitrógeno y reconstituídos con la
fase móvil. En nuestro estudio utilizamos cartuchos HLB Oasis, 300mg x3mL, con el
cual se extrajo el analito, eluyéndose con metanol al cual se agrega agua dando una
mezcla metanol:agua (1:1) lista para ser inyectada en el sistema LC.
45
V. DISCUSIÓN
A pesar que el uso del Misoprostol éster en aplicaciones definidas y estudiadas por
sus fabricantes es seguro, el uso clandestino para producir aborto en caso de
embarazos no deseados es una realidad, por lo que su determinación en el ámbito
legal es importante.
El equipo, en el cual se ha desarrollado un método cuali-cuantitativo para su
determinación, es de última generación, ya que es un cromatógrafo líquido con una
performance muy superior al HPLC convencional (Zou et al., 2007), por lo que
trabajos similares con este tipo de equipos son escasos a nivel internacional e
inexistentes a nivel nacional
Es importante indicar que la dosis con fines de terapia antiácido es de 1 tableta via
oral (200µg), cuya ingesta da como resultados niveles mucho menores a los
presentados en éste estudio.
En cambio para con fines abortivos se utiliza tres tabletas (600µg) vial oral y dos
tabletas vía vaginal (400 µg), haciendo un total de 1000 µg, cuyos resultados son
presentados en éste estudio.
1.La curva obtenida tiene concentraciones de 10,25,50,75 y 100 ppb
(x 10-3µg/ml) en medio metanol:agua.
2. En la tabla Nº 2 se observa que la concentración menor es 11,5 correspondiendo
un área de 154,852 , la concentración mayor 81,6 corresponde 913,110 , con una
concentración promedio de 40,23
3. En la figura 5 se puede apreciar el cromatograma del misoprostol ácido con el pico
desarrollado a los 2,2 minutos.
4. En la tabla Nº 3 se observa que existe una correlación alta positiva y significativa
46
(0.99, P = 0.00 < 0.05) entre concentración de Misoprostol ácido y el área bajo la
curva
5. En la tabla Nº 4 se observa que los coeficientes de variación para las
concentraciones promedio son menores que 7% se considera que los valores son
precisos y existe mayor homogeneidad entre los valores de las concentraciones.
6.Según la referencia bibliográfica, Zou et al., 2007; los valores obtenidos están en el
rango de pg/mL. Las principales diferencias entre el método de Zou et al (2007) y el
método desarrollado en el presente trabajo son las siguientes:
6.1. La dosis fue de 0,6mg, en cambio en nuestro método fue 1 mg (03 tabletas vía
oral y 02 tabletas vía vaginal)
6.2. Las muestras fueron sangre con heparina, esto es plasma, en cambio en el
presente trabajo se trabajó con muestras de orina
6.3.Las muestras fueron obtenidas de un universo controlado, 20 individuos sanos,
en cambio en el presente estudio es un universo no-controlado.
6.4. En el estudio de Zou et al.(2007) se inyectaron alícuotas de 20 L al
cromatógrafo, en cambio en el presente estudio fueron alícuotas de 0,1 L.
6.5. El equipo utilizado por Zou et al. (2007) fue un equipo LC-MS-MS híbrido con
bomba cuaternaria marca Agilent y detector marca Applied Biosystem, en cambio en
el presente trabajo fue un equipo UPLC MS-MS marca Waters modelo Acquity.
6.6. Las muestras de sangre, en el estudio de Zou et al.(2007), fueron tomadas a los
tiempos de : 7,5, 15, 30, 45, 60, 90, 120, 180, 240 y 360 minutos luego de la dosis,
en cambio en el presente estudio no puede determinarse los tiempos en los cuales
son las tomas de muestras debido a imposibilidades de origen, por ejemplo personal
no capacitado para llenar estos datos en las solicitudes en las sedes regionales
47
desde donde son enviadas las muestras, imposibilidad de saber la hora de toma de
las tabletas abortivas (hora y fecha del suceso) por parte de la gestante.
6.7 Los valores de concentraciones en el estudio de Zou et al. (2007) fueron valores
promedios en pg/mL en cada uno de los tiempos indicados en 6.6. En cambio en el
presente estudio fue una toma con una lectura a tiempo desconocido, estos valores
se encuentran entre 11,5 hasta 81,6 ppb.
7. En la figura 6 se puede observar que la concentración de misoprostol ácido en
muestras y el área bajo la curva presentan una relación lineal.
8. En la tabla Nº 5 se observa que al comparar las medias del área bajo la curva y la
concentración de misoprostol ácido mediante el ANOVA y la prueba de Tukey no se
presenta una diferencia significativa con un P < 0,05 y desviación estándar menor
que 3.
9.En la Tabla Nº 5 se observa que a medida que aumenta la cantidad de misoprostol
ácido, la media del área bajo la curva aumenta, estadísticamente significativo
10.En la tabla Nº 5 se observa que a medida que aumenta la cantidad de
misoprostol ácido, la media de la concentración de Misoprostol aumenta,
estadísticamente significativo
11. En la figura 7 se puede observar que la desviación estándar de los valores
promedio de la concentración no difieren y su relación es lineal.
12. En voluntarios normales, el misoprostol es rápidamente absorbido luego de
administración oral con un Tmax de misoprostol ácido de 12 ±3min y una vida media
de 20-40 min..Existe una gran variabilidad de niveles plasmáticos de misoprostol
ácido entre y dentro de estudios pero valores promedios luego de una sola dosis
muestra una relación linear con dosis mayores de 200 a 400 µg. Las
concentraciones de misoprostol ácido en plasma disminuyen en 50% cuando la
48
dosis es tomada con alimentos y la disponibilidad de misoprostol ácido se reduce.
Los estudios de interacción entre el misoprostol y varias drogas no-esteroideas anti-
inflamatorias no mostraron efecto en la cinética del ibuprofeno o ketorolaco
(Vijava,Jagadeesh,Kumar,Patil y Bhushan, 2011)
13. El Misoprostol inalterado (éster) no puede ser detectado en el plasma aún a los
cinco minutos luego de dosis oral (Zou et al., 2007)
49
VI.CONCLUSIONES
1. Se desarrolló un método cuali-cuantitativo para la determinación de misoprostol
ácido utilizando muestras de orina humana, las cuales fueron sometidas a extracción
SPE con cartuchos HLB Oasis 300mg x 3mL, cuyo eluato metanólico fue inyectado
en el equipo Cromatógrafo Líquido de Ultraperformance con detector Masa-Masa
(UPLC MS-MS), marca Waters, modelo Acquity, en el cual las corridas
cromatográficas son desarrolladas en menor tiempo, utilizando menor cantidad de
solventes y es mucho más específica que la cromatografía líquida de alta
performance conocida como HPLC.
2. Se desarrolló un método de extracción SPE con cartuchos HLB Oasis 300mg x
3mL de misoprostol ácido utilizando muestras de orina humana de mujeres
embarazadas que ingirieron misoprostol en dosis abortiva, cuyo eluato metanólico
fue inyectado en el equipo Cromatógrafo Líquido de Ultraperformance con detector
Masa-Masa (UPLC MS-MS), marca Waters, modelo Acquity, obteniéndose una
concentración promedio de 40,23 ppb, con valores entre 11,5 y 81,6 ppb.
50
VII.RECOMENDACIONES
1.Se recomienda realizar estudios de metabolitos en líquidos biológicos debido a la
necesidad de ajustar las dosis, en caso pacientes adultos mayores y niños, y en
casos de medicamento con ventana terapéutica estrecha.
2.Debe realizarse mayores estudios para poder mejorar la relación dosis-respuesta
para el misoprostol como inductor del parto.
3. Es preciso indicar que la dosis de misoprostol éster utilizado como abortivo es de
tres tabletas por vía oral y dos ó tres tabletas por vía vaginal.
51
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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