Deyse de Souza Dantas Orientador: Prof. Dr. Gonçalo A. Guimarães Pereira Pesquisador do...

Deyse de Souza DantasDeyse de Souza Dantas

Orientador: Prof. Dr. Gonçalo A. Guimarães PereiraPesquisador do Departamento de Genética e Evolução

Instituto de Biologia da UNICAMP

Co-orientador: Dr. Francisco Javier Medrano MartínPesquisador Visitante do LGE

Estudos de relação estrutura-Estudos de relação estrutura-função da Hipoxantina-Guanina-função da Hipoxantina-Guanina-Xantina Fosforibosiltransferase Xantina Fosforibosiltransferase

(HGXPRT)(HGXPRT)

http://www.unicamp.br/

HGXPRTHGXPRT - Reação

Hipoxantina

Guanina

Xantina

Xantosina 5’-monofosfato (XMP)

++

5’-Fosforibosil-pirofosfato

Inosina 5’-monofosfato (IMP)

Guanosina 5’-monofosfato (GMP)

Pirofosfato

HGXPRT

Mg2+

• Domínio Archaea.

• Isolado da fossa oceânica de Okinawa, NE do Oceano Pacífico, a 1395 m de profundidade.

• Cocos irregulares, tufo polar de flagelo, cresce em temperatura de 80ºC a 102ºC (98ºC), salinidade de 2,4% NaCl, pH entre 5,0 e 8,5.

• Genoma seqüenciado em 2001.

• Gene da HPRT: 462 nucleotídeos; proteína de 153 aminoácidos, peso molecular calculado de 15,6 kDa. www.bio.nite.go.jp/ngac/e-home/ot3-

e.html

Pyrococcus horikoshii Pyrococcus horikoshii e sua e sua HGXPRTHGXPRT

ImportImportânciaância

• Validar a proteína de Pyrococcus horikoshii como uma HGXPRT.

• Auxiliar no conhecimento dos mecanismos envolvidos na estabilidade desta proteína.

• Obter um melhor entendimento da atividade enzimática e do papel dos resíduos do sítio ativo no mecanismo de catálise.

HGPRT - HGPRT - Trypanosoma cruziTrypanosoma cruzi - Dímero - Dímero

AlinhamentoAlinhamento

Os loops estão identificados pelas caixas amarelas e as mudanças mais significativas estão assinaladas com setas

verde

Loop I

Loop II Loop III

Loop IV

Loop I

Loop II Loop III

Loop IV

Mudanças significativas no Loop IMudanças significativas no Loop I

Leu por Met que mantém o caráter hidrofóbico e o volume ocupado pela cadeia lateralLeu por Ala ambos são alifáticos, tendo uma cadeia lateral sem carga

Loop I

Loop II Loop III

Loop IV

Loop I

Loop II Loop III

Loop IV

Leu

Met

• Ser por Arg ambos são polares, mas Arg possui cadeia lateral comprida e com carga positiva

• Ser por Phe ambos são aminoácidos neutros mas Ser é polar e Phe apolar aromático

• TAMANHO

Mudanças significativas no Loop IIMudanças significativas no Loop II

Loop I

Loop II Loop III

Loop IV

Loop I

Loop II Loop III

Loop IV

Loop IIILoop III

Domínio mais conservado das PRTs

Forma uma cavidade de ligação para ribose e o 5`fosfato do PRPP ou do

nucleotídeo purínico

O Asp115, no final do loop, foi proposto como sendo a base geral da

reação enzimática. Este resíduo faz ponte de H

com o N7 da base

Loop I

Loop II Loop III

Loop IV

Loop I

Loop II Loop III

Loop IV

Loop I

Loop II Loop III

Loop IV

Loop I

Loop II Loop III

Loop IV

Mudanças significativas no Loop IVMudanças significativas no Loop IV

Aspartato por Glutamato ambos são ácidos

Arginina por Lysina ambos são básicos

MetodologiaMetodologia

PCR

Transformação bactérias

competentes (DH5)

Clonagem em

Vetor

Seleção dos clones

positivos PCR de colônia

Seqüênciamento

Transformação de bactérias competentes BL21 (DE3)

Seleção dos clones

positivos PCR de colônia

Extração em média escala

Espectroscopia de absorção,

fluorescência, CD, DLS, espectrometria de massa, proteólise

limitada e desnaturação térmica

Modelagem

Purificação

Estudos estruturais

Proteína

insolúvel

Proteína

solúvel

Ensaios de expressão


Hipoxantina

Guanina

Xantina


++



Guanosina 5’-

monofosfato (GMP) Pirofosfato

HGXPRT

Mg2+

Ligação a GMP-Ligação a GMP-agaroseagarose

• Loop I• Tem arginina, não liga a GMP.• T= 25°C• T= 75°C

• Mutações na Lys52 (T.cruzi) não compromete a estabilidade da proteína, mas tem grande efeito sobre a lig. ao GMP, reduzindo muito a afinidade da enzima por este substrato.


Hipoxantina

Guanina

Xantina


++



Guanosina 5’-

monofosfato (GMP) Pirofosfato

HGXPRT

Mg2+

Ligação do PirofosfatoLigação do Pirofosfato

0 20 40 60 80 1001,0

1,2

1,4

1,6

Fo/F

[Pirofosfato] (mM)

1 10 100

1,0

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

1,6

Fo/F

[Pirofosfato] (mM)

Kd=4,7± 0,1

1 10 100

1,0

1,1

1,2

1,3

1,4

1,5

1,6

Fo/F

[Pirofosfato] (mM)

Kd=4,7± 0,1

F.I.Máximo de emissão não sofre influênciaCada Monômero – 1 sítio de ligação – kdissoçiação do liganteWenck et al., 2004 HGPRT de T. cruzi, afinidade de ligação ao pirofosfato

320 340 360 380 400

2

4

6

Comprimento de onda (nm)

Fluo

resc

ênci

a

A

320 340 360 380 400

2

4

6


Fluo

resc

ênci

a

320 340 360 380 400

2

4

6


Fluo

resc

ênci

a


Fluo

resc

ênci

a

A

320 340 360 380 400

2

4

6


Fluo

resc

ênci

a

A

320 340 360 380 400

2

4

6


Fluo

resc

ênci

a

320 340 360 380 400

2

4

6


Fluo

resc

ênci

a


Fluo

resc

ênci

a

A

Cinética EnzimáticaCinética Enzimática

• Kcat/Km - Eficiência catalítica

• Kcat - Quantidade de reações por min – Constante catalítica dependente da temperatura

• Km - parecido com as outras

320 340 360 380 4000

1

2

3

4

5

6

Fluo

resc

ência


exc = 280 nmexc = 295 nm

320 340 360 380 400320 340 360 380 4000

1

2

3

4

5

6

0

1

2

3

4

5

6

Fluo

resc

ência


exc = 280 nmexc = 295 nmexc = 280 nmexc = 295 nmexc = 280 nmexc = 280 nmexc = 295 nmexc = 295 nm

Fluorescência intrínseca da HGXPRTFluorescência intrínseca da HGXPRT

• Máximo de emissão a 340 nm.

Apagamento de fluorescência - Apagamento de fluorescência - AcrilamidaAcrilamida

320 340 360 380 4000

2

4

6Fl

uore

scên

cia

Comprimento de onda (nm)320 340 360 380 400320 340 360 380 400

0

2

4

6

0

2

4

6Fl

uore

scên

cia


A

0 200 400 600 8001.0

1.4

1.8

2.2Fo

/F

[Acrilamida] (mM)

exc = 295 nm

0 200 400 600 800

exc = 280 nm

Fo/F

[Acrilamida] (mM)

3

5

7

10 200 400 600 800

1.0

1.4

1.8

2.2Fo

/F

[Acrilamida] (mM)

exc = 295 nm

0 200 400 600 8000 200 400 600 8001.0

1.4

1.8

2.2

1.0

1.4

1.8

2.2Fo

/F

[Acrilamida] (mM)

exc = 295 nm

0 200 400 600 800

exc = 280 nm

Fo/F

[Acrilamida] (mM)

3

5

7

10 200 400 600 8000 200 400 600 800

exc = 280 nm

Fo/F

[Acrilamida] (mM)

3

5

7

1

3

5

7

1

B C

1 + KSV [Q]FoF

=1 + KSV [Q]FoFFoF

=

Equação Stern-Volmer (Birks, 1970)

Fo = intensidade de fluorescência na ausência do apagador;

F = a intensidade de fluorescência na presença do apagador;

KSV = a constante de Stern-Volmer e

[Q] = a concentração do agente apagador.

A constante de Stern-Volmer, KSV, é um parâmetro que fornece informação sobre a acessibilidade do fluoróforo ao agente

apagador.

0 50 100 150 2001.0

1.2

1.4

1.6

Fo/F

[CsCl] (mM)0 50 100 150 200

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

Fo/F

[CsCl] (mM)


0 50 100 150 2001.0

1.2

1.4

1.6

Fo/F

[CsCl] (mM)0 50 100 150 2000 50 100 150 200

1.0

1.2

1.4

1.6

1.0

1.2

1.4

1.6

Fo/F

[CsCl] (mM)0 50 100 150 200

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

Fo/F

[CsCl] (mM)0 50 100 150 2000 50 100 150 200

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

Fo/F

[CsCl] (mM)


BA

Apagamento de fluorescênciaApagamento de fluorescência

0 50 100 150 200 250 300 3501.0

1.2

1.4

1.6

1.8

Fo/F

[KI ] (mM)0 50 100 150 200 250 300 350

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8Fo

/F

[KI ] (mM)


0 50 100 150 200 250 300 3501.0

1.2

1.4

1.6

1.8

Fo/F

[KI ] (mM)0 50 100 150 200 250 300 3500 50 100 150 200 250 300 350

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

Fo/F

[KI ] (mM)0 50 100 150 200 250 300 350

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8Fo

/F

[KI ] (mM)0 50 100 150 200 250 300 3500 50 100 150 200 250 300 350

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8Fo

/F

[KI ] (mM)


B A

CsCl

KI

Proteólise LimitadaProteólise Limitada

Quimiotripsina

Proteinase K

Subtilisina

0 h

8 h

4 h

2 h

1 h

0.5

h

Tripsina

0 h

4 h

2 h

1 h

0.5

h0.

25 h

8 h

ON

Rg = 4.3 nmMw = 103 kDaRg = 4.3 nmMw = 103 kDa

Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS)Espalhamento Dinâmico de Luz (DLS)

Hexâmero em solução

Caracterização estrutural por SAXSCaracterização estrutural por SAXS

A B C

A B C

90°90°Cr

ysta

lstr

uctu

reSA

XS m

odel

90°90°90°90°Cr

ysta

lstr

uctu

reSA

XS m

odel

90°90°90°Crys

tals

truc

ture

SAXS

mod

elCr

ysta

lstr

uctu

reSA

XS m

odel

Estrutura vs. Modelo (SAXS)Estrutura vs. Modelo (SAXS)

Denaturação QuímicaDenaturação Química

0 1 2 3 4 5 6

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0 Circular dichroismFluor. maxFluor. center of mass

Unfo

lded

fra

ction

(Ap

p.)

[GdnHCl] (M)0 1 2 3 4 5 60 1 2 3 4 5 6

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8


Circular dichroismCircular dichroismFluor. maxFluor. maxFluor. center of massFluor. center of mass

Unfo

lded

fra

ction

(Ap

p.)

[GdnHCl] (M)0 2 4 6

30

40

50

Radi

usof

gyra

tion

(Å)

[GdnHCl) (M)0 2 4 60 2 4 6

30

40

50

30

40

50

Radi

usof

gyra

tion

(Å)

[GdnHCl) (M)

A B0 1 2 3 4 5 6

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8


Unfo

lded

fra

ction

(Ap

p.)

[GdnHCl] (M)0 1 2 3 4 5 60 1 2 3 4 5 6

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8



Unfo

lded

fra

ction

(Ap

p.)

[GdnHCl] (M)0 2 4 6

30

40

50

Radi

usof

gyra

tion

(Å)

[GdnHCl) (M)0 2 4 60 2 4 6

30

40

50

30

40

50

Radi

usof

gyra

tion

(Å)

[GdnHCl) (M)0 1 2 3 4 5 6

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8


Unfo

lded

fra

ction

(Ap

p.)

[GdnHCl] (M)0 1 2 3 4 5 60 1 2 3 4 5 6

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8

1.0

0.0

0.2

0.4

0.6

0.8



Unfo

lded

fra

ction

(Ap

p.)

[GdnHCl] (M)0 2 4 6

30

40

50

Radi

usof

gyra

tion

(Å)

[GdnHCl) (M)0 2 4 60 2 4 6

30

40

50

30

40

50

Radi

usof

gyra

tion

(Å)

[GdnHCl) (M)

A B

SAXS

Resumo do andamento do projeto

Genes PCR Clonagem Expressão PurificaçãoCaracterização

Estrutural através

técnicasespectroscópicas

CaracterizaçãoEstrutural

através técnica de SAXS

Ph0095

Xf2354

Xac1335

Smhpt

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