Diagnóstico laboratorial – Brucelose

TESTE DO ANEL DO LEITE (TAL)

Universidade Federal de Pelotas

Medicina Veterinária

Zoonoses

Diagnóstico a campo de Brucelose

• Med. Veterinário (privado) HABILITADO

• Curso de treinamento – reconhecido pelo MAPA

• Padronizar diagnóstico – ações sanitárias eficácia de um programa sanitário

Testes oficiais (PNCEBT) - Brucelose

• Triagem (MV habilitado, laboratório credenciado, laboratório oficial credenciado)

▫ Teste do anel do leite

▫ Teste do antígeno acidificado tamponado

• Confirmatórios: (reagentes aos de triagem)

▫ Teste do 2-mercaptoetanol (laboratório credenciado, laboratório oficial credenciado)

▫ Teste de fixação do complemento (laboratório oficial credenciado)

Teste do Anel do Leite (TAL)

• Monitorar condição sanitária de propriedades livres (rebanhos livres)

• Identifica rebanho leiteiro (vacas em lactação) com o problema outro diagnóstico para comprovar quais vacas em lactação são infectadas

Teste do Anel do Leite (TAL)

• Leite: anticorpos contra Brucella abortus

• Teste sorológicos - Diagnóstico INDIRETO (pesquisa de anticorpos)

• Teste de aglutinação

• Antígeno usado no teste: células inteiras de B. abortus

Teste do Anel do Leite (TAL)

• Triagem: alta sensibilidade

• Capacidade do teste em fornecer resultado positivo quando a animal é infectado

• Sensível: detectar 1 animal positivo entre 150 animais testados (leite)

Teste do Anel do Leite

• Leite de mistura – rebanho em lactação

• Amostra de leite: representativa - todas vacas lactação

▫ Tarro

▫ Tanque de refrigeração

▫ Caminhão tanque / isotérmico

• Detecta rebanho infectado

• Não individualmente o animal infectado

• Evita manejo direto com animal

• Prejudica a ordenha / estresse = queda produção

Teste do Anel do Leite (TAL)

• Antígeno corado com hematoxilina

• Cor azul característica reação positiva

positivo

Anel de creme

Coluna de leite

Teste do Anel do Leite (TAL)

Anticorpos Anti B. abortus

Antígeno células de B. abortus

+ corante hamatoxilina

Aglutinação

Malha de complexo Ag - Ac

Arrastada para superfície

pelos glóbulos de gordura

(menos denso)

Anel azulado no creme

Reação positiva

Teste do Anel do Leite (TAL)

Ausência de anticorpos anti-B. abortus

Antígeno células de B. abortus

+ corante hamatoxilina

Ausência de aglutinação

Gordura do creme: anel

de creme: branca

Corante na coluna de

leite- azulada

Reação negativa

Teste do Anel do Leite (TAL)

• Limitações: resultados FALSO-POSITIVOS

• Leite ácido

• Animais com mastite

• Início de lactação – colostro

• Secagem

INSTABILIDADE interferir no resultado

Colheita de amostra de leite CRU

• Correta – resultados confiáveis

• Mistura de leite – representar o leite ordenhado de todas as vacas em lactação

• Misturar o leite suavemente: homogêneo / creme não estar separado

• Usar uma colher – tarro

• Ligar o misturador do tanque

Colheita de amostra de leite CRU

• Tamanho do rebanho x quantidade de leite usada na hora do exame (no tubo de vidro)

• Até 150 vacas lactação: 1 mL leite

• 151 até 450 : 2 mL

• 451 até 700 : 3 mL

• acima de 700 : dividir em lotes menores

• Quantidade antígeno sempre a mesma (30 µL = 0,03 mL)

Colheita de amostra de leite

• Frasco: limpo, esterilizado, tampa (100 mL / tarro, tanque)

• Conservante: evitar proliferação de microrganismos (cru): proteólise = interferir na reação Ag-Ac

• Formol 1% ou Cloreto de mercúrio 2%

• 1 mL de conservante 10 mL leite

Colheita de amostra de leite

• Refrigerar o frasco com a amostra

▫ Armazenar a 2ºC a 8ºC por até 2 semanas

• Enviar para o laboratório

• Sala no laboratório:

• T.A. controlada 22ºC ± 4ºC (ar condicionado)

• Evitar luz solar

Interferências

• Amostra mal homogeneizada – excesso ou falta de gordura (formação do anel de creme)

• Agitação excessiva (quebrar a gordura)

• Aquecimento excessivo (> 45ºC / 5 min - destruição dos anticorpos)

• Excessivo tempo e temp. de armazenamento (4ºC até 2 semanas pode usar)

Interferências

• FALSO-POSITIVO

• Leite fresco – teste realizado no mesmo dia da colheita (instável)

• Refrigeração por 24 hs – resolve esse problema (tempo para estabilizar o leite)

• Mastite: proteínas, células e bactérias

Interferências

• FALSO-NEGATIVOS

• Congelamento (quebra dos glóbulos gordura)

• Pasteurização (queda no título de anticorpos)

• Não utilizar leite pasteurizado ou congelado para o teste!

Material para o teste

• Amostra de leite

• Homogeneização correta do leite de mistura

• Conservante – 1 mL para 10 mL leite

• 2ºC a 8ºC por mín. 24 hs sob refrigeração antes do teste

Material para o teste

• Antígeno para TAL

▫ Células B. abortus + hematoxilina (corante azul)

▫ Compra: habilitado / controlado pela MAPA /

adquirido no serviço de DSA Estadual

▫ Conservados sob refrigeração (2°C a 8°C)

▫ Usados sempre dentro do prazo de validade

▫ Não podem ser congelados

Material para o teste

• Luvas látex

• Tubos de vidro: 1 cm x 7,5 cm ou 1 cm x 10 cm

• Grade para tubos

• Pipetas de 1 mL

• Micropipetador calibrado 30 µL

• Estufa ou banho-maria a 37ºC

Material para o teste

• Testar simultaneamente

• Amostras de leite controle positivo e negativo

Técnica do teste

• Equilibrar a temperatura do leite e do antígeno a temperatura ambiente – mínimo 60 min

• Misturar bem a amostra de leite (inverter)

• 1 mL leite no tubo vidro (2 cm de coluna)

• Quantidade de leite – número vacas lactação

• 30 µL do antígeno

• Tampar e homogeneizar (inverter várias vezes)

Técnica do teste

• Manter em repouso por 1 min

• Observar se está bem homogêneo – não pode sobrar antígeno na parede do tubo

• Incubar a 37ºC / 1 hora

• Retirar grade com delicadeza

• Leitura dos resultados

Técnica do teste

• RESULTADOS

Anel de creme Coluna de leite Resultado do

rebanho

AZUL BRANCA / AZULADA REAGENTE (+)

BRANCO AZUL NÃO

REAGENTE (-)

Leite = rebanho reagente: testes sorológicos individuais em todos animais do rebanho em lactação (AAT)

positivo negativo

Anel de creme

Coluna de leite

Diagnóstico laboratorial – Brucelose

TESTE DO ANTÍGENO ACIDIFICADO

TAMPONADO (AAT)

Profª Drª Fernanda de Rezende Pinto

DVP – FV – UFPel

Universidade Federal de Pelotas

Medicina Veterinária

Zoonoses

Teste do AAT

• Triagem

• Muito sensível

• Fácil execução

• MV habilitado / laboratório credenciado / oficial

credenciado

• Soro do animal

Falso-positivo: 2 fatores

• Anticorpos não específicos:

• Infecções por bactérias: Yersinia enterocolitica 0:9,

Salmonella sp, Escherichia coli 0:157,

Pseudomonas sp.

• Resultado da vacinação com B19 após a idade

recomendada (acima 8 meses)

• Conhecimento da dinâmica das imunoglobulinas

nos diferentes estágios da resposta imune

Resposta imune – infecção e vacinação

• Bactéria intracelular – macrófagos

• Resposta imune celular: fagocitárias

• Resposta imune humoral

• Acs específicos – cadeia O – LPS da B. abortus

• Imunoglobulinas em soro bovídeo:

• Classe G (IgG 1 e IgG 2) – seguidas de:

• Classe M (IgM)

• Classe A (IgA)

Infecção B. abortus ou

vacinação com B 19

Resposta dos principais isotipos de anticorpos em bovinos infectados

com amostra patogênica de Brucella abortus ou vacinados com B19.

1º = IgM

2º = IgG 1

IgG 2 e IgA = mais tarde, aumentam gradativamente, mas

permanecem níveis baixos

Pós-infecção ou pós-vacinação (a

partir da 1ª semana) (IgM)

Resposta a longo tempo dos principais isotipos de anticorpos em

bovinos infectados com amostra patogênica de Brucella abortus.

Leve decréscimo IgM

IgG 1 permanece alto, inalterado

IgG 2 e IgA permanecem níveis baixos e estáveis

Infecção crônica B. abortus

IgG

0

50

100

150

200

250

0 5 12Tempo em meses

Tít

ulo

de

An

tic

orp

os

em

UI

IgG1

IgM

IgA

IgG2

• Título de anticorpos em bovinos infectados com

Brucella abortus ao longo do tempo.

Resposta a longo tempo dos principais isotipos de anticorpos em

bovinos vacinados com a amostra B19 de Brucella abortus.

Vacinados até 8 meses (3 – 8 meses)

Títulos Acs decrescem rapidamente – depois 12 meses

Vacinação acima 8 meses

Títulos vacinais elevados por mais tempo (Falso + )

Vacinação

com B 19

• Título de anticorpos em bezerras vacinadas entre

3 e 8 meses de idade com Brucella abortus amostra B-19.

0

50

100

150

200

250

0 2 4 5 8 10 12

Tempo em meses

Tít

ulo

de

An

tic

orp

os

em

UI

IgG1

IgM

IgA

IgG2

TAAT

• Teste de aglutinação: soroaglutinação (Ag + Acs = grumos)

• Antígeno:

• Células inteiras da amostra de B. abortus 1119-3 a

concentração de 8%

• Tamponado em pH ácido (3,65) (inibe IgG)

• Corado com o Rosa de Bengala

• A maioria dos soros de animais bacteriologicamente positivos

apresenta reação a essa prova

TAAT

• Pode ocorrer alguns poucos casos de reações falso + em

decorrência da utilização da vacina B19

• Toda reação positiva nesse teste confirmada por testes

de maior especificidade para se evitar o sacrifício de

animais não infectados

• Prova qualitativa: não indica o título de anticorpos do soro

testado.

Vacina B19

• Amostra B. abortus lisa

• Brasil: obrigatória bezerras 3 – 8 meses

• Atenuada para fêmeas jovens

• Machos: orquite

• Fêmeas gestantes: aborto

• Lisa anticorpos específicos contra LPS liso

interferência diagnóstico sorológico

• Persistência dos Acs – relacionado à idade de vacinação

Vacina B19

• Fêmea vacinada > 8 meses: Acs permanecem e

interferem por mais de 24 meses

• Vacina até 8 meses: Acs desaparecem rapidamente:

animais > 24 meses são negativos ao teste

Vacina RB 51

• Amostra de B. abortus rugosa atenuada

• Proteção semelhante à B 19

• Rugosa: não induz formação Acs anti-LPS liso

• Não interfere na sorologia

• Não indutora de Acs aglutinantes

• Brasil: vacinação estratégica fêmeas adultas

• Viva: mesmos cuidados que B 19

Animais que devem ser testados

• Fêmeas igual ou > 24 meses (vacinadas 3 – 8 m)

• Machos e fêmeas não vacinadas igual ou > 8 m (exclui

castrado)

• Fêmeas vacinadas (B 19) podem ser testadas?

• Sim. Idade igual ou > 24 meses

Colheita de sangue

• Sangue soro

• Tubos com vácuo (sem anticoagulante)

• Siliconados: facilita a retração do coágulo

• Agulhas individuais e descartáveis

• Sangue: 50% tubo 10 mL

• Tubos a T.A. (2 a 3 horas), abrigo da luz – boa

coagulação

• Soro: frasco limpo e seco

• Enviar para laboratório rapidamente (resfriado ou

congelados)

• Identificação correta frascos

Protocolo

• Antígeno para AAT

• Soros a testar

• Soros controles positivo e negativo

• Pipetas de Bang

• Micropipetador de 30 µL (0,03 mL)

• Ponteiras

• Placa de vidro – quadrados delimitados 4 cm x 4 cm

• Misturador de plástico ou metal

• Caixa de luz indireta para leitura

• Agitador de placa (opcional)

Protocolo

• Antígeno para AAT

• Compra: habilitado / controlado pela MAPA / adquirido

no serviço de DSA Estadual

• Conservados sob refrigeração (2°C a 8°C)

• Usados sempre dentro do prazo de validade

• Não podem ser congelados

Cuidados na execução

• Antígeno não em uso: manter 2 a 8 ºC (perda da

sensibilidade por resfriar/aquecer

• Temperatura de execução: 22ºC ± 4ºC

• Limpar material após uso (placas, pipetas, misturadores)

• Soros muito hemolisados = desprezados Falso +

• Controle positivo e negativo da reação

Técnica

• Equilibrar soro e antígeno – T.A. (30 min)

• Soro congelado: tempo maior

• Homogeneizar soros (cuidado!)

• Identificar área da placa

• 30 µL de soro por área da placa – encostar pipeta num

ângulo 45º

• Agitar suavemente antígeno – 30 µL ao lado do soro

(sem misturar)

Técnica

• Misturar soro e Ag com misturador (círculo 2 cm

diâmetro)

• Agitar a placa – movimentos oscilatórios (30

movimentos / minuto) por 4 minutos

• Colocar placa na caixa de leitura

• Anotar resultados

• Desconsideram reações de aglutinação que ocorrem

após os 4 minutos

Técnica

• Resultado

• Presença de grumos – Reagente

• Ausência de grumos – Não reagente

Negativa Positiva

Reação

positiva

DIAGNÓSTICO de BRUCELOSE

2-ME

2-ME (RETESTE)

Fonte: Comitê Científico Consultivo do PNCEBT

Lógica de testes em propriedades livres

Propriedade

infectada

Propriedade

não infectada

teste 1 teste 2 teste 3 teste 4 teste 5

Propriedade

livre

teste 1 teste 2 teste 3

saneamento

(+) (+) (-) (-) (-)

(-) (-) (-) Propriedade

livre

saneamento

Propriedade

livre com

reinfecção teste 1 teste 2 teste 3 teste 4

Propriedade

livre

(+) (+) (-) (-)

saneamento Fonte: Comitê Científico Consultivo do PNCEBT

ETAPAS DE SANEAMENTO - BRUCELOSE

Enquanto houver animais reagentes positivos, deve-se continuar

realizando testes e sacrifício desses animais. O intervalo entre esses testes

deve ser de 30 a 90 dias, até que se obtenha resultado negativo de

TODOS os animais examinados. O procedimento até obtenção do

certificado pode ser visto no esquema seguinte:

AAT – teste do antígeno acidificado tamponado

2-ME – teste do 2-mercaptoetanol

FC – teste de fixação do complemento

Fonte: Comitê Científico Consultivo do PNCEBT