DIAGNÓSTICO LABORATORTIAL DIAGNÓSTICO LABORATORTIAL DA ESQUISTOSSOMOSE: DA ESQUISTOSSOMOSE:

métodosmétodos, , vantagens e limitaçõesvantagens e limitações

Herminia Yohko KanamuraCoordenação dos Institutos de Pesquisa (CIP)

Superintendência de Controle de Endemias (SUCEN)

Universidade de Taubaté (UNITAU)

DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DA ESQUISTOSSOMOSE MANSÔNICAESQUISTOSSOMOSE MANSÔNICA

Fonte:CDC DPDx

PARASITOLÓGICO Sedimentação espontânea

Ritchie (centrifugação formol-éter) fezes (ovos) Eclosão de miracídios

Pesquisa do parasita Kato biópsia retal tecidos (ovos, vermes, larvas) biópsia hepática

Esquema do processamento das fezes através da sedimentação espontânea (método de Lutz ou método de Hoffman, Pons & Janer.

a) Frasco contendo amostra fecal b) Tomar 2 a 4 gramas de fezes, colocar em frasco e desmanchar em água com um bastão de vidro

ou madeirac) Coar a emulsão através de gaze ou de uma tela para dentro de um cálice cônicod) Completar o volume do cálice juntando mais água e misturando bem o conteúdo. Deixar

sedimentar por uma hora ou mais; derramar o líquido sobrenadante e substituir por água limpa, ressuspendendo o sedimetno.Repetir a operação até que o sobrenadante fique claro

e) Com uma pipeta Pasteur, retirar uma pequena amostra de sedimento do vértice do cálice, colocar sobre uma lâmina, cobrir com lamínula e examinar ao microscópio.

(a) (b) (c) (d) (e) (f)

(a)

(b)

(g) (i)

(e) (f) (h)

Lâminas preparadas com alíquotas de 50L do material processado (vide item 2.1.3)

7mL 7mL

3mL

(d)

(c)

1mL

Suspensão fecal

(j)

Esquema do processamento das fezes através do Sistema Coprotest®a) homogeneização do material fecal, que neste estudo foi realizada com o auxílio de agitador de tubo, por 20 segundos; b) transferência de 7mL da suspensão obtida para um tubo de centrífuga de 10mL; c) adição de 1 gota de detergente doméstico; d) adição de 3mL de acetato de etila comercial;e) homogeneização através de agitação manual vigorosa; f) centrifugação durante 2 minutos a 1500 rpm; g) descarte do sobrenadante e ressuspensão do sedimento a 7mL, com água destilada; h) nova centrifugação por 2 minutos a 1500 rpm e descarte do sobrenadante;i) ressuspensão do sedimento a 1mL, com água destilada (procedimento adotado para ajustar o volume da suspensão fecal das diferentes amostras)j) Preparo de lâminas para observação ao microscópio.

(a)

(b)(c) (d)

(e)

Esquema do processamento de amostras pelo método de Kato-Katza) Frasco contendo fezes: homogeneização do material fecal;b) Transferência de uma porção de fezes para uma folha de papel e tamisação em tela de 105 malhas por polegada quadrada, recolhendo o material tamisado com uma espátula limpa;c) Transferência das fezes tamisadas para um cartão perfurado disposto sobre uma lâmina de vidro, preenchendo todo o espaço (volume fecal correspondente a cerca de 0,045g);d) Retirada do cartão e encobrimento da alíquota de fezes com uma lamínula de celofane previamente embebida em solução glicerinada de verde malaquita; e) Inversão da lâmina sobre uma superfície lisa e compressão das fezes de forma a se obter um esfregaço uniforme com cerca de 22mm de diâmetro.

Schistosoma mansoni eggs in Kato-Katz preparations are easily identified on the basis of size, shape and presence of the lateral spine.

Ovos de Schistosoma mansoni

S. mansoni eggs are large, measuring 114-175 µm by 45-70 µm, have a thin, transparent shell, a prominent lateral spine and contain a miracidium. Occasionally, the lateral spine may be hidden from view. Gentle tapping on the coverslip usually will reorient the egg exposing the spine to view. Viable eggs have the same appearance in faeces and in rectal biopsies.

Appearance of A. lumbricoides, T. trichuria and hookworm eggs in Kato-Katz preparations

A. lumbricoides, fertile and infertile eggs with a T. trichuria egg in the middle.

Normal and decorticated A. lumbricoides egg in a Kato-Katz preparation. Decorticated eggs may be slightly smaller than normal eggs due to the absence of the mamillated layer.

A. lumbricoides and hookworm egg.

A. lumbricoides and T. trichuria eggs. Characteristic features of both are preserved in this preparation

Ocorrência de variações nos resultados do exame parasitológico (Kato-Katz) em 6 pacientes com infecções baixas (menos de 100 ovos por grama de fezes) e teste sorológico positivo.

Diagnóstico laboratorial da esquistossomose

Amostras coletadas (A) e lâminas examinadas (L)Paciente A1 A2 A3 A4 A5 A6

L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3 L1 L2 L3

1 - - - - - - + - - + - - - - - - - -

2 - - - + + + + - - - - - - - - - - -

3 - - - - - - - - + + - - - - - - - -

4 - - - - + + + - - + - + + + + - - -

5 - - - - - - - - - - - - - - - + - -

6 - - - - - - - - - - - - - - - - - -

IMUNOLÓGICO

Detecção de anticorposReação intradérmica (hipers.imediata)

heterólogos - KLH Antigeno ovo

homólogos cercária

verme

Soro - diferentes técnicas sorológicas

Extrato TotalFrações purificadasDNA recombinantes

Detecção de antígenos circulantes

no SORO CCA

anticorpos monoclonais e policlonais CAA P30-32

na URINA

Reação de imunofluorescênciaELISAWestern blot

Diagnóstico laboratorial da esquistossomose

-Diferenciar infecção aguda da crônica

-Verificar cura parasitológica

-Diferenciar infecção ativa da passada

-Inquéritos epidemiológicos

-Programa de Vigilância Epidemiológica

ALGUMAS APLICAÇÕES IMPORTANTES PARA OS MÉTODOS SOROLÓGICOS

Diagnóstico laboratorial da esquistossomose

Diagnóstico laboratorial da esquistossomose

Dinâmica de resposta imune humoralna esquistossomose

Reação de imunofluorescência para Reação de imunofluorescência para detecção de anticorpos IgM (RIF-IgM)detecção de anticorpos IgM (RIF-IgM)

Antígeno:Antígeno: cortes de vermes fixados em solução de cortes de vermes fixados em solução de Rossman e incluídos em parafinaRossman e incluídos em parafina

Conjugado fluorescente:Conjugado fluorescente: anticorpos anti-IgM marcados com anticorpos anti-IgM marcados com isotiocianato de fluoresceínaisotiocianato de fluoresceína

Imunofluorescência Indireta

Lâmina com Ag. fixado

Adição do soro des-conhecido

Visualização ao microscópio

Incubação e lavagem

Adição do con-jugado anti-hu-mano, incubar e lavar

Reação de imunofluorescência indireta (RIF-IgM) com soro de paciente com forma aguda da esquistossomose

Diagnóstico laboratorial da esquistossomose

Reação de imunofluorescência indireta (RIF-IgG) com soro de paciente com forma aguda da esquistossomose

Reação de imunofluorescência indireta (RIF-IgG) com soro de paciente com forma crônica da esquistossomose

Diagnóstico laboratorial da esquistossomose

Diagnóstico laboratorial da esquistossomose

RIF-IgM (cortes de vermes parafinados) RIF-IgM (cortes de vermes parafinados) PARA VIGILÂNCIA PARA VIGILÂNCIA

EPIDEMIOLÓGICA E CONTROLE EPIDEMIOLÓGICA E CONTROLE DA ESQUISTOSSOMOSE EM ÁREA DA ESQUISTOSSOMOSE EM ÁREA

DE BAIXA TRANSMISSÃODE BAIXA TRANSMISSÃO

Prevalência parasitológica (Kato-Katz) e sorológica (RIF-IgM) nas populações estudadas das diferentes

regiões (dados do primeiro inquérito)

regiões

% p

ositiv

idade

VRibeira GSPaulo Campinas VParaíba-1 VParaíba-20

10

20

30

40

50

60

Kato-KatzRIF-IgM

Número e porcentagem (%) de casos para cada combinação de resultados do teste sorológico (RIF-IgM), entre os indivíduos que submeteram amostras de sangue nos cinco inquéritos realizados, nas diferentes regiões estudadas.

Resultado da RIF-IgMem cada inquérito

Número ( %) de casos p/ cada combinação de resultadosda RIF-IgM, em cada uma das regiões estudadas

1 2 3 4 5Vale doRibeira

GrandeSão Paulo Campinas

Vale do Paraíbalocalidade-1 localidade-2

N N N N N 65 (21,8%) 151(93,2%) 69 (95,8%) 41 (56,9%) 54 (79,4%) P P P P P 121(40,5%) 6 (3,7%) 0 14 (19,4%) 6 (8,8%)

N P P P P 6 (2,0%) 2 (1,2%) 0 2 (2,8%) 6 (8,8%)N N P P P 32 (10,7%) 0 0 1 (1,4%) 0N N N P P 3 (1,0%) 0 0 0 1 (1,5%)N N N N P 22 (7,4%) 0 0 0 0

P N N N N 1 (0,3%) 1 (0,6%) 0 1 (1,4%) 0P P N N N 0 0 0 0 0P P P N N 0 0 0 0 0P P P P N 2 (0,7%) 1 (0,6%) 0 1 (1,4%) 0

P P P N P 15 (5,0%) 0 0 0 0P N P P P 11 (3,7%) 0 0 0 0P N P N P 6 (2,0%) 0 0 0 0P N N N P 4 (1,3%) 0 0 0 0P P N P P 2 (0,7%) 0 2 (2,8%) 4 (5,6%) 0P P N N P 1 (0,3%) 0 0 0 0P P N P N 0 0 0 0 1 (1,5%)

N N P N P 4 (1,3%) 0 0 0 0N N P N N 2 (0,7%) 0 0 0 0N N P P N 1 (0,3%) 0 0 0 0N P N N P 1 (0,3%) 0 0 0 0N P P P N 0 1 (0,6%) 0 0 0N P P N P 0 0 1 (1,4%) 1 (1,4%) 0N P N P P 0 0 0 3 (4,2%) 0N P N N N 0 0 0 4 (5,6%) 0

TOTAL 299 (100%) 162 (100%) 72 (100%) 72 (100%) 68 (100%)

Resultado da RIF-IgMem cada inquérito

Número ( %) de casos p/ cada combinação de resultadosda RIF-IgM, em cada uma das regiões estudadas

1 2 3 4 5Vale doRibeira

GrandeSão Paulo Campinas

Vale do Paraíbalocalidade-1 localidade-2

N N N N N 65 (21,8%) 151(93,2%) 69 (95,8%) 41 (56,9%) 54 (79,4%) P P P P P 121(40,5%) 6 (3,7%) 0 14 (19,4%) 6 (8,8%)

N P P P P 6 (2,0%) 2 (1,2%) 0 2 (2,8%) 6 (8,8%)N N P P P 32 (10,7%) 0 0 1 (1,4%) 0N N N P P 3 (1,0%) 0 0 0 1 (1,5%)N N N N P 22 (7,4%) 0 0 0 0

TOTAL 299 (100%) 162 (100%) 72 (100%) 72 (100%) 68 (100%)

Número e porcentagem (%) de casos para cada combinação de resultados do teste sorológico (RIF-IgM), entre os indivíduos que submeteram amostras de sangue nos cinco inquéritos realizados, nas diferentes regiões estudadas.

Resultado da RIF-IgMem cada inquérito

Número ( %) de casos p/ cada combinação de resultadosda RIF-IgM, em cada uma das regiões estudadas

1 2 3 4 5Vale doRibeira

GrandeSão Paulo Campinas

Vale do Paraíbalocalidade-1 localidade-2

P N N N N 1 (0,3%) 1 (0,6%) 0 1 (1,4%) 0P P N N N 0 0 0 0 0P P P N N 0 0 0 0 0P P P P N 2 (0,7%) 1 (0,6%) 0 1 (1,4%) 0

P P P N P 15 (5,0%) 0 0 0 0P N P P P 11 (3,7%) 0 0 0 0P N P N P 6 (2,0%) 0 0 0 0P N N N P 4 (1,3%) 0 0 0 0P P N P P 2 (0,7%) 0 2 (2,8%) 4 (5,6%) 0P P N N P 1 (0,3%) 0 0 0 0P P N P N 0 0 0 0 1 (1,5%)

Resultado da RIF-IgMem cada inquérito

Número ( %) de casos p/ cada combinação de resultadosda RIF-IgM, em cada uma das regiões estudadas

1 2 3 4 5Vale doRibeira

GrandeSão Paulo Campinas

Vale do Paraíbalocalidade-1 localidade-2

N N P N P 4 (1,3%) 0 0 0 0N N P N N 2 (0,7%) 0 0 0 0N N P P N 1 (0,3%) 0 0 0 0N P N N P 1 (0,3%) 0 0 0 0N P P P N 0 1 (0,6%) 0 0 0N P P N P 0 0 1 (1,4%) 1 (1,4%) 0N P N P P 0 0 0 3 (4,2%) 0N P N N N 0 0 0 4 (5,6%) 0

TOTAL 299 (100%) 162 (100%) 72 (100%) 72 (100%) 68 (100%)

Positividade (%) por método parasitológico (Kato-Katz) e sorológico (RIF-IgM), de acordo com a condição “tratamento anterior para esquistossomose” (população de Itariri, Vale do Ribeira)

Kato-Katz RIF-IgMTratamento Total Total Positivos Total Positivos

anterior No. % No. %Sim 122 112 10 8,9

(4,6 - 16,2)122 104 85,2

(77,4 - 90,8)

Não 506 401 34 8,5(6,0 - 11,8)

505 250 49,5( 45,1 - 53,9)

Substrato incolor

Substrato colorido

ELISA ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay)(Enzyme linked immunosorbent assay)

AVALIAÇÃO DE MÉTODO IMUNOENZIMÁTICO AVALIAÇÃO DE MÉTODO IMUNOENZIMÁTICO

PARA DETECÇÃO DE ANTICORPOS IgM CONTRPARA DETECÇÃO DE ANTICORPOS IgM CONTRA A

ANTÍGENOS CIRCULANTES DE ANTÍGENOS CIRCULANTES DE S. mansoniS. mansoni

ELISAIgM OutrosMétodos Posi t ivo Negat ivo T otal Ind ice Kappa

Posi t ivo 193 5 198

0,89

RIF I - IgM

N=591

Negat ivo 25 368 393 ( 0 , 8 4 5 - 0 , 9 2 5 )

Posi t ivo 177 19 196

0,78

RIF I - IgG

N=591

Negat ivo 41 354 395( 0 , 7 4 0 - 0 , 8 2 0 )

Posi t ivo 200 105 305

0,59

ELISA- IgG

N=591

Negat ivo 18 268 286( 0 , 525- 0 , 650 )

Posi t ivo 8 3 11

0,04

Kato-Katz

N=481

Negat ivo 171 299 470( 0 , 0 3 8 - 0 , 0 4 2 )

Análise comparativa dos resultados obtidos pelo ELISA-IgM em relação aos outros testes

Análise dos dados preliminares com relação ao Projeto de Pesquisa em desenvolvimento no município de Holambra

“Implantação de método imunoenzimático para detecção de anticorpos IgM contra antígenos circulantes do S. mansoni (ELISA-IgM), e avaliação para incorporação no

programa de controle da esquistossomose em área de baixa endemicidade”

• Total de amostras séricas encaminhadas ao Instituto Adolfo Lutz = 93

• Total de amostras já submetidas a IgM-RIF = 73• Total de amostras já submetidas a IgM-ELISA = 71• Positividade sorológica pela IgM-RIF = 35,6% (26/73)• Casos positivos pelo Kato Katz:

- 7 casos – com 9 lâminas (3 amostras x 3 lâminas) - 3 casos – com 3 lâminas (1 amostra x 3 lâminas)- 2 casos – com 2 lâminas (1 amostra x 2 lâminas)

Comparação de resultados entre IgM-RIF e IgM-ELISADados preliminares de Holambra

IgM -ELISA

+ -

IgM-RIF

+ 21 5 26

- 8 37 45

29 42 71

RIFI-IgM ELISA-IgM

Resultados das lâminas de Kato-Katz Resultado

A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 POS NEG

01 2+ + N N N N N N 1 N N X

02 3+ + N N N N N N N N N

03

3+ + N N N N N N N N N

04

3+ + N N N N N N 3 2 4 X

05

1+ + N N N N N N N N N

06

2~3+ + N N N N N N N N N

07

3+ + N N 1 N N 1 N N N X

08

2~3+ + 2 4 15 2 2 14 N N 16 X

09

2~3+ + N N N

Resultados Preliminares - Estudo em Holambra

RIFI-IgM ELISA-IgM

Resultados das lâminas de Kato-Katz Resultado

A1 A2 A3 B1 B2 B3 C1 C2 C3 POS NEG

10

3~4+ + N N N

11

2+ + 3 4 11 2 1 5 1 5 19 X

12

1+ neg N N N N N N N N N

13

1+ neg N N N N N N N N N

14

3+ + N N N N N N N N 1 X

15

1~2 neg N N N N N N N N N

16

1+ neg N N N N N N N N N

17

3+ + N N N - N N

18

2~3 + N N 1 1 N N X

Resultados Preliminares - Estudo em Holambra continuação

Freqüência de anticorpos anti-Freqüência de anticorpos anti-T.canisT.canis e anti- e anti-S.mansoniS.mansoni, , de acordo com a faixa etária.de acordo com a faixa etária.

Peruíbe - SPfaixa etária (anos)

Po

siti

vid

ade

(%)

1-5 6-10 11-15 16-20 21-30 31-40 41-50 51-60 >600

10

20

30

40

50

60

70

anti-T.canis

anti-S.mansoni