Diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina: …A todos os que fazem o Departamento de Imunologia...

Fundação Oswaldo Cruz Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães

Departamento de Saúde Coletiva

Mestrado em Saúde Pública

Diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina: Avalia ção do Desempenho dos Kits EIE-Leishmaniose-Visceral-Canina-Bio-Manguinhos e IFI-Leishmaniose-Visceral-

Canina-Bio-Manguinhos

Recife, 2005

Rodrigo Alves de Lira

Rodrigo Alves de Lira

Diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina: Avaliação do Desempenho dos Kits EIE-

Leishmaniose-Visceral-Canina-Bio-Manguinhos e IFI-Leishmaniose-Visceral-Canina-Bio-Manguinhos

Dissertação apresentada ao Departamento de Saúde Coletiva do Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães da Fundação Oswaldo Cruz, como requisito para obtenção do Título de Mestre em Saúde Pública.

Orientadores: Yara de Miranda Gomes, BSc, MSc, PhD Wayner Vieira de Souza, MSc, PhD

RECIFE, 2005

L 768d Lira, Rodrigo Alves de Diagnóstico da Leismaniose Visceral Canina: Avaliação do Desempenho

dos Kits EIE-Leishmaniose-Visceral-Canina-Bio-Manguinhos e IFI-Leishmaniose-Visceral-Canina-Bio-Manguinhos / Rodrigo Alves de Lira, orientadores: Yara de Miranda Gomes e Wayner Vieira de Souza.

43f.: il., tabs; figs.

Dissertação (Mestrado em Saúde Pública) -Departamento de Saúde Coletiva, Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães, Fundação Oswaldo Cruz – NESC/CPqAM/FIOCRUZ.

Inclui referências bibliográficas, apêndices e anexos.

1. Leishmaniose visceral canina. 2. Diagnóstico. 3. ELISA. 4. Imunofluorescência indireta. 5. Validação. I. Gomes, Yara de Miranda. II. Souza, Wayner Vieira de (orients). III. Título.

CDU 616.993.161 Biblio/CPqAM

DEDICO ESTE TRABALHO

À minha esposa, Juliana F. Vilela de Lira, por

todo amor, estímulo e dedicação durante realização

deste trabalho.

Ao meu pai, Reginaldo de O. Lira, que foi um

exemplo de homem, em quem quando me espelhei tomei

minhas mais sábias decisões.

À minha mãe, Tereza A. Lira, que me deu força e

sem a qual talvez nem tivesse tido a oportunidade de

estar concluindo este curso de pós-graduação.

Ao meu filho, Caio, que estará chegando ao

mundo numa fase muito especial da minha vida.

i

AGRADECIMENTOS

A Deus, por ter me dado a oportunidade e colocado em meu caminho

pessoas com quem pude contar sempre que tive necessidade.

A Porfª Drª Yara de Miranda Gomes, Pesquisadora Titular do Centro de

Pesquisas Aggeu Magalhães/CPqAM/FIOCRUZ, que tive não só como

orientadora, mas também como uma grande amiga. Através dela, pude aprender

o significado de valores como dedicação, profissionalismo, competência e

compreensão.

Ao Prof. Dr. Wayner Vieira de Souza, Tecnologista Sênior do Centro de

Pesquisas Aggeu Magalhães/CPqAM/FIOCRUZ, pela orientação na área de

estatística e pela sua notável disponibilidade nas discussões.

Ao Dr. Rômulo Maciel Filho, Diretor do Centro de Pesquisas Aggeu

Magalhães, onde o trabalho foi realizado.

Ao Prof. Dr. Eduardo Freese, Diretor de Ensino do CPqAM, pela dedicação

e atenção dispensadas no decorrer do presente trabalho.

Ao Prof. Dr. Sinval Brandão Filho, Chefe do Departamento de Imunologia

do CPqAM, pela atenção que me foi dada durante a realização deste trabalho.

Ao Prof. Dr. Frederico Guilherme Coutinho Abath, Pesquisador Titular do

CPqAM, pelas críticas e sugestões emitidas ao projeto do qual originou o

presente trabalho.

Ao Profº Dr. Leucio Câmara Alves, Professor Adjunto do Departamento

de Medicina Veterinária da UFRPE, que me deu a oportunidade de participar de

ii

sua equipe em alguns trabalhos de campo para coleta de material, bem como

pelas críticas e sugestões ao projeto que resultou na presente dissertação.

Ao Mestre Antônio P. G. Ferreira, Chefe do Laboratório de Reativos de

Bio-Manguinhos/FIOCRUZ, pelo fornecimento dos “kits” EIE-Leishmaniose-

Visceral-Canina-Bio-Manguinhos e IFI-Leishmaniose-Visceral-Canina-Bio-

Manguinhos assim como, pela discussão dos resultados do presente trabalho.

Ao Mestre Edimilson Domingos da Silva, pelas informações sobre os kits

utilizados no presente trabalho.

A Mestre Maria Edileuza F. Brito, Pesquisadora do CPqAM, pela

colaboração na execução do teste parasitológico do cão Pimpolho (registro 057).

A Médica Veterinária Milena de Paiva Cavalcanti, Mestre em Medicina

Veterinária, pela sua contribuição no exame clínico e parasitológico dos cães e

pelas informações sobre a leishmaniose visceral canina.

Aos amigos Alinne Verçosa, Virginia Lorena, Valéria Pereira, Raquel Assis,

Myllena Melo e Lucas Moitinho pelo apoio, ajuda e principalmente amizade nas

horas difíceis.

A Mineo Nakazawa pelo apoio técnico na realização dos testes, pelos

sábios conselhos fornecidos e, acima de tudo, pela amizade desenvolvida no

decorrer do trabalho.

A todos que fazem parte do Laboratório de Reativos de Bio-Manguinhos,

pelo apoio me dado durante o período do estágio realizado em suas instalações.

A todos que trabalham no Laboratório de Doenças Parasitárias da UFRPE,

pela colaboração na coleta de amostras de cães e diagnósticos parasitológicos.

iii

A todos os que fazem o Departamento de Imunologia do CPqAM, pelos

incentivos recebidos.

A Nilda Lima e Nalva Menezes, da Secretaria Acadêmica do

NESC/CPqAM, pela atenção que me foi dispensada durante a realização do curso

de mestrado.

Aos bibliotecários do CPqAM, Adagilson B. B. da Silva, Mégine C. C. da

Silva, Romero E. da Silva e Virgínia Guimarães, pela ajuda na obtenção das

referências bibliográficas.

Aos proprietários dos cães que participaram desta pesquisa.

Aos colegas de Mestrado, pela convivência e amizade firmada a partir dos

momentos que passamos juntos.

A todas as pessoas que me apoiaram direta ou indiretamente na realização

deste trabalho.

Ao Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães, pelo apoio financeiro.

E caso não tenha mencionado, devido ao grande número de colaboradores

diretos e indiretos: a você, muito obrigado.

iv

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

CEUA – Comitê de Ética em Uso com Animais

CO – Cut-off

CPqAM – Centro de Pesquisas Aggeu Magalhães

DMV – Departamento de Medicina Veterinária

DNA – Ácido Desoxirribonucléico

DO – Densidade Ótica

E – Especificidade

EIE – Ensaio Imunoenzimático

EIE-LVC – EIE-Leishmaniose-Visceral-Canina-Bio-Manguinhos

ELISA - Enzyme-Linked Immunosorbent Assay

FIOCRUZ – Fundação Oswaldo Cruz

FUNASA – Fundação Nacional de Saúde

HSP-70 - Heat shock proteins

IC – Intervalo de Confiança

IDR – Intradermoreação

IFI – Imunofluorescência Indireta

IFI-LVC – IFI-Leishmaniose-Visceral-Canina-Bio-Manguinhos

ITEP – Instituto Tecnológico de Pernambuco

LV – Leishmaniose Visceral

LVC – Leishmaniose Visceral Canina

LVH – Leishmaniose Visceral humana

OMS – Organização Mundial de Saúde

PCR – Reação em Cadeia da Polimerase

v

QBC – Quantitative Buffy Coat

RMR – Região Metropolitana de Recife

rK39 – Antígeno recombinante k39

S – Sensibilidade

TAD – Teste de Aglutinação Direta

TDR – Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases

UFRPE – Universidade Federal Rural de Pernambuco

VPP – Valor Preditivo Positivo

VPN – Valor Preditivo Negativo

WHO – World Health Organization

vi

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Combinação binária entre os resultados prováveis obtidos em um

determinado teste e o diagnóstico verdadeiro da doença........................................ 17

Tabela 2 – Combinação binária entre os resultados prováveis obtidos no EIE-

LVC por dois observadores...................................................................................... 19

Tabela 3 – Escala de concordância do indicador Kappa (ANDRADE e ZICKER,

1997)........................................................................................................................ 20

Tabela 4 – Avaliação do EIE-LVC frente ao critério clínico e

parasitológico.....…................................................................................................... 24

Tabela 5 – Avaliação do IFI-LVC frente ao critério clínico e

parasitológico........................................................................................................... 24

Tabela 6 – Avaliação do desempenho do IFI-LVC e do EIE-LVC combinados em

paralelo frente ao critério clínico e

parasitológico........................................................................................................... 25

Tabela 7 – Avaliação do desempenho do IFI-LVC e EIE-LVC combinados em

série frente ao critério clínico e

parasitológico........................................................................................................... 26

Tabela 8 – Comparação da reatividade dos soros de cães com diagnóstico

parasitológico negativos para LV portadores de outras doenças através do EIE-

LVC e do IFI-LVC..................................................................................................... 28

Pág.

vii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Ciclo biológico da Leishmania ssp............................................................ 10

Figura 2 – Áreas endêmica da Leishmaniose Visceral Humana................................ 10

Figura 3 – – Formas parasitárias visualizadas a partir de amostras de bopsia de

medula óssea.............................................................................................................. 11

Figura 4 – Representação esquemática do teste QBC para Plasmodium

falciparum (A); Visualização de um teste QBC positivo para LVC (B)........................ 11

Figura 5 – Teste de Imunofluorecência Indireta positivo (A) e negativo (B) para

LVC............................................................................................................................. 12

Figura 6 – Representação esquemática do ELISA convencional (A) e sua

visualização em placa de microtitulação..................................................................... 12

Figura 7 – Coleta de Sangue na Veia Cefálica do Cão.............................................. 21

Figura 8 – Procedimento para raspado de pele......................................................... 21

Figura 9 – Procedimento para Biopsia de Medula Óssea.......................................... 22

Figura 10 – Variação dos valores preditivos do diagnóstico clínico em função da

prevalência.................................................................................................................. 27

Figura 11 – Densidade óptica das amostras analisadas através do EIE-LVC........... 29

Pág.

viii

RESUMO

O objetivo do presente trabalho foi avaliar o desempenho do kit EIE-

Leishmaniose-Visceral-Canina-Bio-Manguinhos (EIE-LVC) e comparar com o

desempenho do kit IFI-Leishmaniose-Canina-Bio-Manguinhos (IFI-LVC), visando

sua utilização em rotina epidemiológica. Foram utilizados 114 cães atendidos no

Hospital Veterinário da UFRPE. Os animais foram submetidos inicialmente ao

exame clínico e parasitológico (biopsia de medula óssea e raspado de pele). O

sangue foi coletado e o soro armazenado a –20°C até sua posterior utilização.

Foram constituídos quatro grupos: Grupo 1 (G1), animais com sinais clínicos

sugestivos de LVC e com testes parasitológicos positivos (n=25); Grupo 2 (G2),

animais com diagnóstico apenas presuntivo de LVC (n=62); Grupo 3 (G3),

animais que nunca habitaram em área endêmica para a LVC, nunca receberam

transfusão sanguínea (n=16); e Grupo 4 (G4), animais portadores de outros

etiologias: babesiose (n=4), anaplasmose (n=6) e demodicose (n=1). A análise do

EIE-LVC no G1 apresentou uma sensibilidade de 72,0% (IC 95%: 50,4 – 87,1%) e

especificidade de 87,5% (IC 95%: 60,4 – 97,8%). Os valores de VPP e VPN foram

de 90,0% (IC 95%: 66,9 – 98,2%) e 66,7% (IC 95%: 42,5 – 84,9%),

respectivamente. O valor do índice kappa foi de 0,975 (IC 95%: 0,926 – 1,024), o

que traduz uma concordância ótima. Quando esses grupos foram analisados

através do IFI-LVC, no G1, a sensibilidade foi de 68,0% (IC 95%: 46,4 – 84,3%) e

a especificidade de 87,5% (IC 95%: 60,4 – 97,8%). Os valores de VPP e VPN

foram de 89,5% (IC 95%: 65,5 – 98,2%) e 63,6% (IC 95%: 39,1 – 83,1%),

respectivamente. Baseado na análise dos IC, foi evidenciado que os testes

sorológicos não se mostraram diferentes do ponto de vista estatístico quanto a

ix

performance para detecção de anticorpos anti-Leishmania sp. Quando as

amostras foram analisadas em paralelo a sensibilidade foi de 92,0% (IC: 72,5–

98,6%) e a especificidade de 75,0% (IC 95%: 47,4 – 91,7%). Já na análise dos

testes em série a sensibilidade foi de 48,0% (IC 95%: 28,3 – 68,2%) e a

especificidade de 100,0% (IC 95%:75,9 – 99,4%). A análise do G2 através dos

kits de IFI-LVC e EIE-LVC em paralelo, dada sua alta sensibilidade, revelou que

neste grupo 26 animais foram detectados como positivos e 36 foram

diagnosticados como negativos. A análise do diagnóstico clínico frente à

associação dos testes em paralelo apresentou um VPP de 42,0% (IC 95%: 29,7 –

55,1%). Quando os soros dos animais portadores de outras parasitoses foram

testados através do IFI-LVC, reação cruzada foi observada com demodicose e

ehrlichiose (18,2%). No EIE-LVC reação cruzada foi observada com um cão

portador de ehrlichiose (9,1%). No entanto, a elevada densidade óptica

apresentada por esse animal não descarta a possibilidade de uma co-infecção

com Leishmania. Esses resultados levam as seguintes conclusões: 1) Os

resultados obtidos com o kit EIE-LVC indicam que o seu desempenho é similar

aquele encontrado no IFI-LVC; 2) Os kits devem ser empregados em associação

para obter-se resultados mais seguros. 3) A utilização dos kits IFI-LVC e IEI-LVC

em associação concorre para a obtenção de resultados mais seguros, tendo em

vista que estas associações diminuem a possibilidade de ocorrência de resultados

falso-positivos e falso-negativos.

x

ABSTRACT

The aim of this study was to evaluate the performance of the EIE-

Leishmaniose-Visceral-Canina-Bio-Manguinhos (EIE-LVC) kit and to compare it

with that of the IFI-Leishmaniose-Visceral-Canina-Bio-Manguinhos (IFI-LVC), so

far as its use in epidemiological procedures is concerned. The study used 114

dogs being cared for by the Veterinary Hospital of the UFRPE (Federal Rural

University of Pernambuco). These animals first underwent a clinical and

parasitological examination (bone marrow aspiration and skin scrape test). Blood

was collected and the serum stored at -20ºC until used. The dogs were divided

into four groups: Group 1 (G1), dogs with clinical signs indicative of CVL and

testing positive for the parasite (n=25); Group 2 (G2), dogs with only a presumed

diagnosis of CVL (n=62); Group 3 (G3), dogs that had never lived in an area

where CVL is endemic and never received a blood transfusion (n=16); and Group

4 (G4), dogs carrying other diseases: such as babesiosis (n=4), anaplasmosis

(n=6) and demodicosis (n=1). Analysis of the EIE-CVL in G1 showed a sensitivity

of 72% (CI 95%: 50.4 – 87.1%) and a specificity of 87.5% (CI 95%: 60.4 – 97.8%).

The values for PPV and NVP were 90.0% (CI 95%: 66.9 – 98.2%) and 66.7% (CI

95%: 42.5 – 84.9%), respectively. The value of the Kappa index was 0.975 (CI

95%: 0.926 – 1.024), which represents an excellent fit. When this group was

analyzed using IFI-LVC, for the G1, the sensitivity was 68.0% (CI 95%: 46.4 –

84.3%) and the specificity 87.5% (CI 95%: 60.4 – 97.8%). The values of PPV and

NPV were 89.5% (CI 95%: 65.5 – 98.2%) and 63.6% (CI 95%: 39.1 – 83.1%),

respectively. Based on analysis of the CI, it can be seen that the serological tests

did not a show difference in terms of performance for detection of anti-leishmania

xi

antibodies. When the tests were conducted in parallel sensitivity was 92.0% (CI

95%: 72.5 – 98.6%) and specificity 75.0% (CI 95%: 47.4 – 91.7%). However, when

conducted consecutively, the tests showed a sensitivity of 48.0% (CI 95%: 28.3 –

68.2%) and a specificity of 100.0% (CI 95%: 75.9 – 99.4%). The analysis of G2

using IFI-LVC and EIE-LVC kits in parallel, because of its high sensitivity, revealed

that, of this group, 26 animals had been detected as positive and 36 had been

diagnosed as negative. The analysis of the clinical diagnosis against the

association of the tests in parallel produced a PPV of 42.0% (CI 95%: 29.7-

55.1%). When the serum of animals carrying other parasites was tested using the

IFI-LVC, cross-reaction was observed between demodicosis and ehrlichiosis. In

the EIE-LVC cross-reaction was observed in dogs carrying ehrlichiosis. However,

using high-density optics, the results for these animals did not rule out the

possibility of a co-infection with Leishmania. These results lead to the following

conclusions: 1) the results obtained using the EIE-LVC kit suggest that its

performance is similar to that found for the IFI-LVC. 2) Kits must be used in

conjunction if more reliable results are to be obtained. 3) The use of IFI-LVC and

EIE-LVC kits in combination results in more reliable results, because it reduces the

probability of the occurrence of false-positive and false-negative results.

SUMÁRIO

AGRADECIMENTOS .................................................................................................................... i

LISTA DE ABREVIATURAS ....................................................................................................... iv

LISTA DE TABELAS .................................................................................................................... vi

LISTA DE FIGURAS ..................................................................................................................... vii

RESUMO.........................................................................................................................................viii

ABSTRACT .....................................................................................................................................x

1. INTRODUÇÃ0............................................................................................................................01

1.1. Aspectos epidemiológicos da leishmaniose visceral................................................................ 01

1.2. Diagnóstico etiológico..............................................................................................................05

1.2.1. Métodos parasitológicos e moleculares.............................................................................. 05

1.2.2. Métodos imunológicos........................................................................................................06

2. OBJETIVOS................................................................................................................................09

2.1. Objetivo geral...........................................................................................................................09

2.2. Objetivos específicos................................................................................................................09

3. MATERIAIS E MÉTODOS ......................................................................................................13

3.1. Amostra do estudo....................................................................................................................13

3.1.1. Local...................................................................................................................................13

3.1.2. Casuística............................................................................................................................13

3.1.3. Aspectos éticos....................................................................................................................13

3.2. Grupos de animais....................................................................................................................14

3.3. Coleta do material....................................................................................................................14

3.3.1. Coleta de sangue.................................................................................................................14

3.3.2. Raspados de pele.................................................................................................................14

3.3.3. Biopsia de medula óssea.....................................................................................................15

3.4. Processamento das amostras....................................................................................................15

3.4.1. Teste parasitológico............................................................................................................15

3.4.2. Testes imunológicos............................................................................................................16

3.4.3. Testes de concordância.......................................................................................................16

3.5. Análise dos resultados..............................................................................................................16

4. RESULTADOS........................................................................................................................... 23

4.1. Desempenho do IFI-LVC e do EIE-LVC nos grupos 1 (G1) e 3 (G3)...........................23

4.2.Avaliação do diagnóstico clínico frente aos testes sorológicos associados................ 26

4.3.Avaliação de reação cruzada no EIE-LVC e no IFI-LVC nos animais portadores de

outras parasitoses (G4)............................................................................................................... 27

5. DISCUSSÃO................................................................................................................................30

5.1. O desempenho do EIE-LVC e do IFI-LVC.............................................................................. 33

5.2. Custos dos kits EIE-LVC e IFI-LVC....................................................................................... 36

5.3. Problemas metodológicos.........................................................................................................36

6. CONCLUSÃO.............................................................................................................................37

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................................38

APÊNDICE 1 – Termo de consentimento livre e esclarecido..................................................... 44

APÊNDICE 2 – Formulário de pesquisa (Casos).........................................................................45

APÊNDICE 3 – Formulário de pesquisa (Controles).................................................................. 46

APÊNDICE 4 – Resultados dos testes parasitológico e sorológicos...........................................47

ANEXO 1 – Parecer da Comissão de Ética em Uso com Animais.............................................50

ANEXO 2 – Protocolo de procedimento do EIE-LVC................................................................ 51

ANEXO 3 – Protocolo de procedimento do IFI-LVC.................................................................. 56ANEXO 4 – ARTIGO ..................................................................................................................... 60

Rodrigo Alves de Lira Diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina:...

1

1. INTRODUÇÃO

1.1. Aspectos epidemiológicos da leishmaniose visce ral humana e

canina

A leishmaniose visceral (LV), também conhecida como calazar, é uma

antropozoonose causada por um protozoário pertencente ao complexo

Leishmania donovani (Leishmania donovani, Leishmania infantum e Leishmania

chagasi) (ASHFORD et al., 1998). O protozoário completa seu ciclo biológico em

dois hospedeiros, um vertebrado e outro invertebrado. A transmissão natural da

Leishmania spp ocorre através da picada de um inseto infectado (exemplo,

Phlebotomus sp no Velho Mundo - Mediterrâneo, Índia, Nepal e Bangladesh, e

Lutzomyia sp no Novo Mundo - América Latina) que inocula formas promastigotas

do parasita na pele do hospedeiro vertebrado no momento do repasto sangüíneo

(GREENE e SLAPPENDEL, 1993; CIARAMELLA et al., 1997; ETTINGER e

FELDMAN, 1997) (Figura 1).

A L. donovani é o agente etiológico da LV no subcontinente Indiano e Leste

Africano, a L. infantum na região do Mediterrâneo e a L. chagasi no Novo Mundo.

O homem é o único reservatório conhecido da L. donovani (GUERIN et al., 2002).

Os canídeos, especialmente os cães domésticos e errantes são reservatórios

para L. infantum e L. chagasi (GUERIN et al., 2002). Com base nos perfis

isoenzimáticos, alguns autores consideram que a L. chagasi seja igual a L.

infantum, existindo, no momento, divergências sobre o uso do nome específico

chagasi para o agente etiológico da LV (FUNDAÇÃO NACIONAL DE SAÚDE,

1996; RIBEIRO, 2001).


2

A LV é endêmica em 62 países, com um total de 200 milhões de pessoas

expostas ao risco de infecção, uma estimativa de 500.000 novos casos por ano

no mundo (DESJEUX, 1996) (Figura 2) e segundo dados da Organização Mundial

de Saúde (OMS), divulgados em 2001, houve 41.000 mortes no ano de 2000.

Como em outras doenças tropicais, os dados epidemiológicos são incompletos, e

os dados oficiais sub-estimam o real problema da doença (THAKUR, 2000).

Cerca de 90% dos casos humanos de LV ocorrem em cinco países: Índia

(planícies de Ganges e Brahmaputra), Bangladesh, Nepal, Sudão e Nordeste do

Brasil (Figura 2). Vários fatores contribuem para essa elevada porcentagem de

casos, como por exemplo, o deslocamento da população da zona rural para

urbana que resultou na epidemia que ocorreu no Sudão causando uma letalidade

em torno de 36% (SEAMAN et al., 1996), ressurgimento da doença na Índia

(HERWALDT, 1999; THAKUR, 2000) e para sua expansão urbana no Brasil

(ARIAS et al., 1996). A Leishmania, seus vetores e reservatórios estão

amplamente distribuídos em praticamente todo território brasileiro, particularmente

nas regiões Norte e Nordeste (THOMÉ, 1999), sendo a região Nordeste a

principal zona endêmica da LV nas Américas (ACHA & SZYFRES, 1986; ALVES

et al., 1998).

Na América Latina a leishmaniose visceral canina (LVC) é causada pela

infecção com L. chagasi que é transmitida pelo flebotomíneo Lutzomyia

longipalpis (MILES et al., 1999). Em várias cidades brasileiras a LVC é

considerada um sério problema de saúde pública, e em localidades onde a

doença é endêmica cães domésticos representam o principal reservatório para

infecção por Leishmania em humanos e em outros cães (COUTINHO et al., 1985;

PARANHOS-SILVA et al., 1996; COURTENAY et al., 2002; FRANÇA-SILVA et


3

al., 2003). A prevalência da LVC varia de 1% a 36% em áreas endêmicas do

Brasil (COUTINHO et al., 1985; PARANHOS-SILVA et al., 1996; ASHFORD et al.,

1998; COURTENAY et al., 2002).

A LVC é caracterizada por hepatoesplenomegalia, lesões de borda de

orelha e focinho, acinesia e onicogrifose (CIARAMELLA et al., 1997; NOLI, 1999).

Segundo Losos (1986) a enfermidade inicia-se com lesões na pele. Já Thomé

(1999) relata a presença de nódulos cutâneos que, eventualmente, podem

ulcerar. Pocai et al. (1998) citam que, nos casos em que há ulcerações, elas são

vistas na pele do focinho, orelhas e mucosa oral e nasal. De acordo com Koutinas

et al. (1999), entre as manifestações clínicas mais comuns, estão variadas lesões

cutâneas, tais como, dermatite esfoliativa e ulcerações.

Segundo Feitosa et al. (2000), em 68% dos casos de LVC, ocorrem

alterações dermatológicas, podendo, o animal afetado, apresentar um quadro

clínico caracterizado por alopecia local ou generalizada, lesões crostosas em

geral no focinho, orelhas e nas extremidades, descamação furfurácea, entre

outros sinais. A alopecia pode ser explicada pela ação direta do parasito sobre o

folículo piloso, ou lesões hepáticas que provoquem distúrbios do ácido

pantotênico ou ainda, deposição de imunocomplexos na membrana basal da pele

(HOMMEL, 1978). A onicogrifose ocorre pela presença do parasita na matriz

ungueal, estimulando seu crescimento (LESTOQUARD e DONATIEN, 1983;

FEITOSA et al., 2000). As úlceras cutâneas dão-se, provavelmente, pela

multiplicação das formas amastigotas ou pela deposição de imunocomplexos que

levariam a uma vasculite necrotizante, já os distúrbios locomotores podem ser

justificados por poliartrite (deposição de imunocomplexos), fissuras nos coxins,

úlceras interdigitais, lesões osteolíticas ou periostite proliferativa.


4

Hepatoesplenomegalia e linfadenopatia generalizada são resultantes da

proliferação de linfócitos B, histiócitos e macrófagos (FEITOSA et al., 2000).

No entanto, existe um grande percentual de animais assintomáticos,

havendo opiniões contrárias na literatura em relação à cura espontânea. Estudos

mostram que raramente os animais curam-se espontaneamente (CORRÊA e

CORRÊA, 1992; SANTA ROSA e OLIVEIRA, 1997; SILVA et al., 1999). Enquanto

outros afirmam que em 62% dos cães assintomáticos ocorre a cura espontânea

(RIBEIRO, 2001).

Com relação à distribuição geográfica da LVC no Brasil, têm sido relatados

focos em áreas rurais e peri-urbanas (MARZOCHI e MARZOCHI, 1994). No

Nordeste do Brasil, pode-se destacar o trabalho de Aguiar et al. (2001) que

encontraram 72,73% de animais positivos concomitantemente à cultura esplênica

e ao ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay). Em 1998, a freqüência da

LVC, diagnosticada por meio de exame parasitológico, na Região Metropolitana

do Recife (RMR) foi de 18,10% (SILVA et al., 1998). Em 1999, estudo realizado

pelos mesmos autores, demonstrou um aumento significativo na freqüência da

enfermidade, encontrando 60% de animais positivos, diagnosticados por meio de

exame sorológico e parasitológico, (SILVA et al., 1999). Fato este que pode ser

explicado pela amostragem utilizada no estudo que contribuiu para elevação

deste percentual. Em 2001, diagnosticando-se a LVC apenas por exame

parasitológico, obteve-se índice de positividade de 23,91% (PAIVA CAVALCANTI

et al., 2001). No ano seguinte, também por meio de diagnóstico parasitológico, a

LVC apresentou freqüência de 34,50% (PAIVA CAVALCANTI et al., 2002), o que

mostra a expansão da doença na RMR.


5

1.2. Diagnóstico etiológico

O diagnóstico da LVC no Brasil é, sem dúvida, um enorme desafio para os

órgãos de controle de endemias, já que o cão é considerado o principal

reservatório da doença nas Américas. Pode ser feito com base nas características

clínicas apresentadas pelos animais, confirmadas por métodos laboratoriais

parasitológicos e imunológicos (BONATES, 2003).

A detecção do parasita, através de métodos parasitológicos, constitui o

requisito básico para o diagnóstico da LV. Os métodos imunológicos, onde se

detecta a presença de anticorpos contra o parasita, são úteis para uma triagem de

casos, quando for difícil demonstrar a presença de Leishmania sp, bem como em

inquéritos epidemiológicos (REY, 2001).

1.2.1. Métodos parasitológicos e moleculares

As leishmanias podem ser identificadas no interior de células fagocitárias

fixas ou livres, sendo reconhecidas por sua morfologia de amastigotas, ou

cultivadas de aspirados do baço, da medula óssea (Figura 3), do linfonodo ou do

fígado em hamsters, existindo, ainda, a prova biológica que consiste na

inoculação intraperitoneal do material suspeito em hamsters (Mesocricetus

auratus) (URQUHART et al., 1990; CORRÊA e CORRÊA, 1992; THOMÉ, 1999).

Os esfregaços de sangue podem ser examinados, no entanto, apenas

eventualmente serão encontradas formas amastigotas de Leishmania sp em

macrófagos circulantes (KLEIN et al., 2000; BONATES, 2003). É possível,

também, a identificação da Leishmania no líquido sinovial (ACHA e SZYFRES,

1986; MERCK, 1991; CORRÊA e CORRÊA, 1992; FEITOSA et al., 2000).


6

Segundo HERWALDT (1999) o diagnóstico é mais sensível (98%) nos

aspirados do baço que tem sido usado na rotina de diagnóstico no campo, por

exemplo, no Kênia e Sudão. Mas há contra indicações, precauções são

necessárias, e complicações apesar de raras, podem ser sérias.

O “Quantitative Buffy Coat” (QBC) (Figura 4), um método direto e rápido de

fluorescência utilizado na identificação de parasitas hemáticos, tem sido proposto

por Liarte et al. (2001) para o diagnóstico da LVC e LVH. Segundo esses autores,

devido à facilidade de coleta, execução e rapidez esse método deveria ser

avaliado para programas de controle de reservatórios.

O diagnóstico da LV através da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)

tem alta habilidade em detectar e identificar o DNA do parasita em qualquer

amostra clínica, produzindo um resultado confiável em poucas horas (FISA et al.,

2001; LEÔNIDAS et al., 2002; IKONOMOPOULOS et al., 2003). Segundo Feitosa

et al. (2000) esta técnica é uma prova diagnóstica altamente sensível e

específica, porém atualmente só é possível a sua realização em laboratórios

especializados não estando ainda disponível comercialmente.

1.2.2. Métodos imunológicos

A detecção no soro de anticorpos específicos contra antígenos do parasita

pode ser efetuada, através dos testes de Imunofluorescência Indireta (IFI), ELISA

ou do Teste de Aglutinação Direta (TAD), Imunocromatografia além de

Immunoblot. Os mais usados para a LVC são o IFI, o TAD e o ELISA.

Dentre estes, o teste de IFI (Figura 5) é reconhecido como “padrão-ouro”

(GRADONI, 1999), tanto para LV humana quanto canina. Apesar de apresentar

menor sensibilidade e especificidade que o ELISA (Figura 6), tem sido o método


7

mais comumente utilizado (BADARÓ et al., 1983; ACHA e SZYFRES, 1986;

ANDRADE et al., 1998; CABRAL et al., 1998), sendo a prova adotada pela

Fundação Nacional de Saúde (FUNASA). Reações cruzadas têm sido observadas

com esse teste.

O TAD tem mostrado 96,5-100% de sensibilidade e 91-95% de

especificidade. É fácil para uso no campo e de baixo custo, mas não há antígeno

comercialmente disponível e os resultados não são reprodutíveis (OSKAM et al.,

1999; BOELAERT et al., 1999b).

A Intradermorreação (IDR), também conhecida como Reação de

Montenegro, que consiste na inoculação intradérmica de antígeno padronizado

(leishmanina), com leitura após 48 a 72 horas, segundo Thomé (1999), não

apresenta bons resultados para o diagnóstico da LVC. Ela tem sido usada, porém

necessitando de estudos sobre possíveis reações cruzadas (SCHUBACH et al.,

2001).

ELISAs utilizando antígenos quimicamente definidos e específicos do

parasita têm sido propostos para o diagnóstico da LVC e LVH. O antígeno

recombinante K39 (rK39), um epitopo imunodominante repetitivo em uma proteína

relacionada a kinesina, e muito conservado entre as espécies de leishmanias

viscerotrópicas, têm se mostrado sensível e específico para o diagnóstico da LVC

e LVH (BADARÓ et al., 1996; SCALONE et al., 2002). Outro antígeno

considerado candidato para o diagnóstico da LV é o recombinante A2. Este é

expresso em amastigotas como uma família de proteínas que apresenta um

número de repetições de dez aminoácidos (ZHANG et al., 1996). Estudos

sugerem que o recombinante A2 é particularmente útil para o diagnóstico da LVC

(CARVALHO et al., 2002).


8

No Kênia, o ELISA mostrou uma sensibilidade de 98% e especificidade de

100%, mas não há kit comercialmente disponível (BOELAERT et al., 1999a). O

ELISA recombinante proposto por ANDRADE et al. (1998), utilizando a porção

carboxi-terminal (porção antigênica) da proteína recombinante HSP-70 (Heat

Shock Proteins) de L. chagasi (ANDRADE et al., 1992), demonstrou um bom

desempenho, com possibilidade de identificação específica e precoce da infecção

em cães. A empresa Biogene, incubada no Instituto Tecnológico de Pernambuco

(ITEP), desenvolveu um kit (ELISA-Recombinante) para o diagnóstico da LVC

utilizando como antígeno a proteína recombinante HSP-70 (Biogene, 2005).

Apesar de já estar comercialmente disponível no mercado, não foi, encontrado na

literatura pesquisada, nenhum dado relacionado à sensibilidade e à especificidade

do referido kit.

Estes dados mostram a necessidade do contínuo desenvolvimento de

técnicas de detecção da LVC que alcancem elevadas sensibilidade e

especificidade para que possam ser empregadas na rotina de vigilância

epidemiológica.

Sendo assim, visando encontrar uma alternativa à utilização do teste de IFI

isoladamente, para execução de inquéritos em áreas endêmicas, recentemente

um kit, EIE-Leishmaniose-Visceral-Canina-Bio-Manguinhos, para diagnóstico da

LVC foi desenvolvido por Bio-Manguinhos/FIOCRUZ (FERREIRA et al., 2000).

Uma avaliação desse kit, utilizando amostras (soro) de cães com diagnóstico

clínico presuntivo de LVC, mostrou 53,1% e 37,7% de resultados concordantes

negativos e positivos, respectivamente (FERREIRA et al., 2000). No entanto, um

estudo do referido kit utilizando amostras de cães com diagnóstico clínico e


9

parasitológico positivo, mostrou-se necessário para uma avaliação segura do

desempenho do kit.

2. OBJETIVOS

2.1. Geral

Avaliar o desempenho do kit EIE-Leishmaniose-Visceral-Canina-Bio-

Manguinhos e compará-lo com o do kit IFI-Leishmaniose-Visceral-Canina-Bio-

Manguinhos, bem como suas associações, para o diagnóstico da LVC.

2.2. Específicos

Calcular sensibilidade e especificidade do kit EIE-Leishmaniose-Visceral-

Canina-Bio-Manguinhos (EIE-LVC), em amostras de cães com sinais clínicos

sugestivos e testes parasitológicos característicos de LVC.

Avaliar a reprodutibilidade do EIE-LVC através do indicador kappa (k).

Calcular sensibilidade e especificidade do kit IFI-Leishmaniose-Visceral-

Canina-Bio-Manguinhos (IFI-LVC), em amostras de cães com sinais clínicos

sugestivos e testes parasitológicos característicos de LVC.

Avaliar a sensibilidade e especificidade do IFI-LVC e do EIE-LVC, quando

associados em série e em paralelo.


10

Figura 1 – Ciclo biológico da Leishmania spp (Fonte: WHO/TDR, 2005)

Figura 2 – Áreas endêmica da Leishmaniose Visceral Humana (Fonte: DESJEUX,

2004).


11

A B

Figura 4 – Representação esquemática do teste QBC para Plasmodium falciparum (A);

Visualização de um teste QBC positivo para LVC (B). (Fonte: Medical Diagnostic

Inventions, 2005 [A] e LIARTE et al., 2001 [B]).

Figura 3 – Formas parasitárias visualizadas a partir de amostras de biopsia de medula óssea

(Fonte: HOLLAND et al, 2002).


12

Figura 5 – Teste de Imunofluorescência Indireta positivo (A) e negativo (B) para

LVC. (Fonte: Arquivo Bio-Manguinhos)

Figura 6 - Representação esquemática do ELISA convencional (A) e sua visualização

em placa de microtitulação (B). N: Reação Negativa; P: Reação Positiva. (Fonte:

Arquivos do Laboratório de Imunoparasitologia - CPqAM/FIOCRUZ [A] e NELSON,

2004 [B]).

A B

ELISA CONVENCIONAL

+ + +

Reação positiva Reação negativa

A B

N

P


13

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Amostra do estudo

3.1.1. Local

Foram utilizados cães de raças, de idades variadas, de ambos os sexos,

domiciliados provenientes da RMR - Estado de Pernambuco, atendidos no

Hospital Veterinário da Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE).

3.1.2. Casuística

Foi adotada uma amostragem não probabilística de conveniência (COSTA

NETO, 1977; REIS, 2003) em função do número de animais com sinais cínicos

sugestivos de LVC. No período de um ano foram coletadas 114 amostras (46

foram atendidos no período agosto de 2000 a janeiro de 2001 e 68 de junho a

dezembro de 2004).

3.1.3. Aspectos éticos

Os cães que participaram da pesquisa foram avaliados pelo médico

veterinário responsável, quando os seus proprietários assinaram um

consentimento livre e esclarecido (Apêndice 1) e responderam a um questionário

(Apêndice 2 e 3) onde dados dos proprietários, informações epidemiológicas e

clínicas da LVC foram coletadas. O estudo foi submetido à Comissão de Ética no

Uso de Animais (CEUA) da FIOCRUZ tendo parecer (nº P.0220/04) favorável,

(Anexo 1).


14

3.2. Grupos de animais

Foram constituídos 4 grupos: Grupo 1 (G1), cães com sinais clínicos

sugestivos de LVC e com testes parasitológicos positivos (n=25); Grupo 2 (G2),

cães com diagnóstico apenas presuntivo de LVC (n=62); Grupo 3 (G3), cães que

nunca habitaram em área endêmica para a LVC, nunca receberam transfusão

sanguínea (n=16); e Grupo 4 (G4), cães portadores de outras doenças (n=11).

3.3. Coleta do material

Os animais foram submetidos ao exame físico pelo médico veterinário,

constando de inspeção da pele e fâneros além da palpação abdominal e dos

gânglios linfáticos regionais. Em seguida, os animais foram contidos com

mordaças de nylon adequadas para cada porte, para os procedimentos de coleta

dos materiais: sangue, raspado de pele e punção de medula óssea.

3.3.1. Coleta de sangue

Após anti-sepsia com algodão embebido em álcool iodado, 2 a 5 mL de

sangue da veia cefálica foram coletados de cada animal utilizando-se seringa

descartável acoplada a uma agulha hipodérmica 25 X 7 mm (Figura 7). O

sangue foi depositado em tubo de ensaio sem anticoagulante para posterior

centrifugação e obtenção do soro.

3.3.2. Raspados de pele

Os raspados de pele foram realizados com o auxílio de lâmina de bisturi

(Figura 8). Para diagnóstico parasitológico da LVC foram realizados raspados de

pele íntegra e/ou lesionada na região do focinho e orelhas, ou quaisquer outras


15

áreas lesionadas. Com o material obtido, foram confeccionados esfregaços em

lâminas para microscopia para realização da pesquisa das formas amastigotas

da LVC.

3.3.3. Biopsia de medula óssea

Após anti-sepsia, foi realizada biopsia na crista do osso esterno, utilizando-

se seringa descartável com capacidade para 20 mL, acoplada a uma agulha 40 x

12 mm. Com o material obtido foram confeccionados esfregaços em lâminas

(Figura 9).

3.4. Processamento das amostras

Os materiais coletados foram processados no Laboratório de

Imunoparasitologia do Departamento de Imunologia do CPqAM/FIOCRUZ e no

Laboratório de Doenças Parasitárias dos Animais Domésticos do Departamento

de Medicina Veterinária (DMV/UFRPE), e submetidos a metodologias

específicas de acordo com a natureza do material e tipo de exame, como

descritas a seguir:

3.4.1. Teste parasitológico

Parasitológico de sangue, de pele e de medula óssea

Os esfregaços em lâminas para microscopia, após secagem e fixação pelo

metanol, foram corados pelo corante panótico e examinados em microscópio

óptico com objetiva de imersão.


16

3.4.2. Testes imunológicos

Anticorpos anti-Leishmania foram detectados através dos testes de IFI e

ELISA.

ELISA – Foi utilizado o kit EIE-LVC produzido por Bio-

Manguinhos/FIOCRUZ, lote: 040EL009Z, que utiliza placa de microtitulação

sensibilizada com antígenos solúveis de Leishmania major-like

(MHOM/BR/76/JOF) (SILVA ED, comunicação pessoal). A reação foi realizada,

conforme o protocolo do fabricante (Anexo 2).

IFI – Foi utilizado o kit IFI-LVC produzido por Bio-Manguinhos/FIOCRUZ, lote

04PLC004Z, que utiliza como antígeno formas promastigotas de Leishmania

major-like (MHOM/BR/76/JOF) (SILVA ED, comunicação pessoal). A reação foi

realizada de acordo com o protocolo do fabricante (Anexo 3).

3.4.3. Teste de concordância

Um ensaio foi realizado por dois observadores que não conheciam a

identidade das amostras para verificação da reprodutibilidade do EIE-LVC e a

análise de concordância foi baseada no indicador kappa (k) (ANDRADE e

ZICKER, 1997).

3.5. Análise dos resultados

Os parâmetros sensibilidade, especificidade e valores preditivos positivo e

negativo foram estimados de acordo com Ferreira & Ávila (2001), utilizando uma

tabela de dupla entrada relacionando o diagnóstico da doença e o resultado do


17

teste (Tabela 1) empregando o programa WIN EPISCOPE 2.0 (DE BLAS et al.,

2000). Os respectivos intervalos de confiança (IC), com grau de confiança 95%,

bem como a acurácia dos testes foram calculados de acordo com Bender (2001).

Para avaliação do IFI-LVC e EIE-LVC adotou-se como padrão ouro o

seguinte critério diagnóstico: Cães portadores da LVC: cães com sinais clínicos

sugestivos de LVC e com testes parasitológicos positivos; Cães não portadores

da LVC: cães que nunca habitaram em área endêmica para a LVC e nunca

receberam transfusão sanguínea. Já para avaliação do diagnóstico clínico foi

utilizado como padrão-ouro a combinação em paralelo do IFI-LVC e EIE-LVC.

Tabela 1 - Combinação binária entre os resultados prováveis obtidos em um

determinado teste e o diagnóstico verdadeiro da doença.

DOENÇA – Diagnóstico verdadeiro TESTES

Presente Ausente

Positivo Verdadeiros positivos

A

Falsos positivos

B

Negativo Falsos negativos

C

Verdadeiros negativos

D

Segundo Ferreira & Ávila (2001)

A sensibilidade (S) do teste é dada pela porcentagem de positivos

detectados pelo teste entre os indivíduos sabidamente doentes. A especificidade

(E), pela percentagem de negativos, entre indivíduos não doentes. O valor

preditivo positivo (VPP) refere-se à probabilidade de ter a doença se o resultado


18

for positivo, enquanto que o valor preditivo negativo (VPN) refere-se à

probabilidade de não ter a doença quando o resultado for negativo. Esses

parâmetros foram determinados através das seguintes fórmulas abaixo:

A análise estatística dos testes associados em paralelo, que considera

positivo quando reagente para qualquer um dos testes, e em série, que considera

positivo quando reagente nos dois testes, foi realizada também através do

programa de estatística WIN EPISCOPE 2.0 (DE BLAS et al., 2000), que para o

cálculo de sensibilidade e especificidade utiliza as seguintes fórmulas:

Paralelo Serie

Sensibilidade 1-(1-S1)·(1-S2) S1·S2

Especificidade E1·E2 1-(1-E1)·(1-E2)

onde S1 e S2 são as sensibilidades do primeiro e segundo teste respectivamente,

e E1 e E2 as especificidades dos testes (THRUSFIELD, 1995).

DB

DE

+=

BA

AVPP

+=

DC

DVPN

+=

CA

AS

+=


19

A concordância dos resultados obtidos no ELISA pelos dois observadores

foi avaliada através do índicador Kappa (k), como demonstrado nas Tabelas 2 e

3.

Tabela 2 – Combinação binária entre os resultados prováveis obtidos no EIE-LVC

por dois observadores

EIE-LVC (Observador 1)

Positivo Negativo Total

Positivo A B A+B

Negativo C D C+D

Total A+C B+D N

A+D = número de resultados iguais

(A+D)/N = proporção de resultados iguais

B+C = número de resultados diferentes

A proporção esperada (Pe) de resultados iguais devidos ao acaso é

calculada através da fórmula abaixo:

N

DB

N

DC

N

CA

N

BAPe

)()()()( +⋅+++⋅+=

A máxima proporção de concordância não devida ao acaso é o máximo

valor encontrado para k, ou seja k =1, levando em consideração que Pe será igual

a 0,5.

EIE-LVC (Observador 2)


20

O índice Kappa se define como:

Tabela 3 – Escala de concordância do indicador Kappa (ANDRADE e ZICKER,

1997)

Kappa Concordância

<0,00 Nenhum

0,00 – 0,20 Fraco

0,21 – 0,40 Sofrível

0,41 – 0,60 Regular

0,61 – 0,80 Boa

0,81 – 0,99 Ótima

1,00 Perfeita

Pe

PeN

DA

−

−+

=1

)(

κ


21

Figura 7 – Coleta de Sangue na Veia Cefálica do Cão (Fonte: Manual de

Vigilância e Controle da Leishmaniose Visceral, Ministério da Saúde, 2003)

Figura 8 - Procedimento para raspado de pele. (Fonte: Arquivos do DMV-UFRPE)


22

Figura 9 – Procedimento para Biopsia de Medula Óssea. (Fonte: Arquivos do

DMV-UFRPE)


23

4. RESULTADOS

Os resultados dos testes parasitológicos, EIE-LVC e IFI-LVC estão

apresentados no Apêndice 4.

No presente estudo, foram diagnosticados 87 cães com sinais clínicos

sugestivos de LVC, dos quais 25 tiveram resultado positivo para o teste

parasitológico (constituindo o G1) e 62 se mostraram negativos para o teste

parasitológico (cães pertencentes ao G2). Dezesseis cães atenderam ao critério

do G3, como descrito em Materiais e Métodos, item 3.2., e onze animais

apresentaram outras parasitoses (babesiose, n=4; anaplasmose, n=6;

demodicose, n=1), constituindo o G4.

A avaliação dos parâmetros sensibilidade, especificidade e índice Kappa

está apresentada a seguir.

4.1. Desempenho do IFI-LVC e do EIE-LVC nos grupos 1 (G1) e 3 (G3)

Os valores de Densidade Ótica (DO) obtidos para o EIE-LVC estão

apresentados na Figura 11. A Tabela 4 mostra os resultados da análise do EIE-

LVC que apresentou uma sensibilidade de 72,0% (IC 95%: 50,4 – 87,1%) e uma

especificidade de 87,5% (IC 95%: 60,4 – 97,8%). Os valores de VPP e VPN foram

de 90,0% (IC 95%: 66,9 – 98,2%) e 66,7% (IC 95%: 42,5 – 84,9%),

respectivamente. A acurácia do EIE-LVC foi de 78,0% (IC 95%: 62,0 – 88,9%).

Na análise de concordância o valor do índice kappa foi de 0,975 (IC 95%: 0,926 –

1,024), o que traduz uma concordância ótima (ANDRADE e ZICHER, 1997).


24

Tabela 4 – Avaliação do EIE-LVC frente ao critério clínico e parasitológico

Clínico e parasitológicoTESTE

Positivo Negativo TOTAL

Positivo 18 2 20

Negativo 7 14 21 EIE-LVC

TOTAL 25 16 41

A Tabela 5 apresenta os resultados da análise desses grupos através do

IFI-LVC, onde foram obtidos como resultado do desempenho: sensibilidade de

68,0% (IC 95%: 46,4 – 84,3%) e especificidade de 87,5% (IC 95%: 60,4 – 97,8%).

Os valores de VPP e VPN foram de 89,5% (IC 95%: 65,5 – 98,2%) e 63,6% (IC

95%: 39,1 – 83,1%), respectivamente. A acurácia do IFI-LVC foi de 76,0% (IC

95%: 59,4 – 87,1%)

Tabela 5 – Avaliação do IFI-LVC frente ao critério clínico e parasitológico



Positivo 17 2 19

Negativo 8 14 22 IFI-LVC

TOTAL 25 16 41


25

Com base na análise dos IC, foi evidenciado que os testes sorológicos não

se mostraram diferentes do ponto de vista estatístico quanto a performance para

detecção de anticorpos para Leishmania.

Com os resultados apresentados na Tabela 6, testes sorológicos

associados em paralelo, foram obtidos os seguintes valores para análise de

desempenho: sensibilidade de 92,0% (IC: 72,5 – 98,6%), especificidade de 75,0%

(IC 95%: 47,4 – 91,7%), VPP de 85,2% (IC 95%: 65,4 – 95,1%) e VPN e 85,7%

(IC 95%: 66,0 – 95,4%), respectivamente. A acurácia encontrada para esta

associação foi de 85,0% (IC 95%: 70,1 – 93,9%)

Tabela 6 – Avaliação do desempenho do IFI-LVC e do EIE-LVC combinados em

paralelo frente ao critério clínico e parasitológico



Positivo 23 4 27

Negativo 2 12 14 IFI-LVC +EIE-LVC

PARALELOTOTAL 25 16 41

A Tabela 7 mostra os resultados quando os testes são associados em

série. A análise destes resultados mostrou uma sensibilidade de 48,0% (IC 95%:

28,3 – 68,2%), uma especificidade de 100,0% (IC 95%:75,9 – 99,4%) e valores de

VPP e VPN de 100,0% (IC 95%: 69,9 – 99,2%) e 55,2% (IC 95%: 26,1 – 81,4%),

respectivamente. A associação encontrou uma acurácia de 68,0% (IC 95%: 51,8 –

81,4%).


26

Tabela 7 – Avaliação do desempenho do IFI-LVC e EIE-LVC combinados em

série frente ao critério clínico e parasitológico



Positivo 12 0 12

Negativo 13 16 29 IFI-LVC +EIE-LVC

SÉRIETOTAL 25 16 41

4.2. Avaliação do diagnóstico clínico frente aos te stes sorológicos

associados

A análise dos resultados dos cães com diagnóstico apenas presuntivo, G2,

revelou que neste grupo 26 animais foram detectados como positivos para os

testes sorológicos em paralelo, enquanto 36 foram diagnosticados como

negativos.

Para avaliação do diagnóstico clínico procedeu-se ao cálculo do VPP do

mesmo, tomando-se como padrão-ouro a combinação dos testes em paralelo,

dada sua alta sensibilidade. O valor encontrado para o VPP foi de 42,0% (IC 95%:

29,6 – 54,2%). A figura 10 possibilita a especulação dos possíveis valores

preditivos que podem ser obtidos em função da variação de prevalência.


27

0102030405060708090

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Prevalência Verdadeira

Val

ores

Per

cent

uais %P.A.

%V.P.+

%V.P.-

Figura 10 – Variação dos valores preditivos do diagnóstico clínico em função da

prevalência. P.A. = prevelência aparente; V.P.+ = valor preditivo positivo; V.P.- =

valor preditivo negativo.

4.3. Avaliação de reação cruzada no EIE-LVC e no IF I-LVC nos animais

portadores de outras parasitoses (G4)

Quando os soros dos animais portadores de outras parasitoses, G4, foram

testados através do IFI-LVC, um resultado falso-positivo foi detectado para

demodicose e outro para anaplasmose. Nenhuma reação foi evidenciada quando

os soros dos animais com babesiose foram testados. O soro de um cão com

ehrlichiose mostrou-se positivo (falso-positivo) no EIE-LVC, os demais

apresentaram resultados negativos (Tabela 8).


28

Tabela 8 – Comparação da reatividade dos soros de cães com diagnóstico

parasitológico negativos para LV portadores de outras doenças através do EIE-

LVC e do IFI-LVC

PARASITOSES EIE-LVC IFI-LVC

Babesiose (n=4) 0 0

Anaplasmose(n=6) 1 1

Demodicose (n=1) 0 1

n =11


29

Leish NLeish Outras0.000.050.100.150.200.250.300.350.400.450.500.550.600.650.700.750.800.850.900.951.001.051.101.151.201.251.301.351.401.451.50

Amostras

DO

450

nm

CO

ZC

Figura 11 – Densidade óptica das amostras analisadas através do EIE-LVC. Leish =

cães com diagnóstico parasitológico para LVC; Nleish = animais controles; Outras =

animais portadores de outras parasitoses.


30

5. DISCUSSÃO

Os dados relativos à morbidade da LV no Brasil não são precisos. Isso

dificulta as estratégias de controle hoje empregadas nas regiões onde ocorre a

doença. Os inquéritos epidemiológicos baseados em população humana e canina

são necessários para avaliar a extensão do problema (ALVES e BEVILACQUA,

2004).

No caso da LVC - zoonose com grande influência na saúde humana - a

identificação remoção e eutanásia do cão são atividades preconizadas pelo

Ministério da Saúde para o controle da doença em humanos. Essa recomendação

está respaldada nos seguintes fatos: 1) o cão é considerado o principal

reservatório da doença para o ser humano; 2) a doença no cão precede a

infecção em humanos (ALVES e BEVILACQUA, 2004). Assim, o controle da

doença está relacionado à utilização de testes de diagnóstico que apresentem

resultados seguros, de maneira que, os cães positivos para LV não deixem de ser

removidos, o que contribui para a não propagação da doença.

As técnicas atualmente empregadas para o diagnostico da LVC são para

detecção do parasita e/ou para detecção de anticorpos contra o parasita. Dentre

as técnicas utilizadas para detecção do parasita podemos citar a punção

aspirativa de medula óssea, baço, fígado e linfonodos, para confecção de

esfregaços em lâminas, teste histopatológicos, isolamento em meio de cultura e

inoculação em animais de laboratório. Porém, estas técnicas são procedimentos

invasivos e a sensibilidade e especificidade são variáveis (GONTIJO & MELO,

2004). Além disso, o tratamento prévio de animais, pode mascarar os resultados

dos mesmos devido à diminuição do número de leishmanias circulantes


31

(RIBEIRO, 2001). O diagnóstico molecular através de testes como a PCR, por

exemplo, pode ser utilizado como uma ferramenta para auxiliar diagnósticos

imprecisos. No entanto, esta técnica para detecção de Leishmania sp necessita

de muitos ajustes para torná-la mais simples e com custo operacional mais

acessível (GONTIJO e MELO, 2004).

Dentre as técnicas utilizadas hoje para detecção de anticorpos para

leishmania, o TAD, o teste de IFI e alguns ELISAs, que utilizam antígenos brutos,

são limitados em termos de sensibilidade e especificidade (GONTIJO e MELO,

2004). O teste de IFI exerce um papel de destaque no que diz respeito ao

diagnóstico da leishmaniose no Brasil, por que este teste é recomendado pelo MS

como padrão-ouro, tanto para diagnóstico da LVC como da LVH, apesar do teste

apresentar um elevado número de resultados falso-positivos e falso-negativos

(GRADONI, 1999; ALVES e BEVILACQUA, 2004).

Na epidemia de 1993 a 1997, ocorrida em Belo Horizonte - MG, 415.683

cães foram examinados através do teste de IFI, enquanto 15.117 foram

identificados como positivos. Com base nos estudos de Alves e Bevilacqua

(2004), dos 400.556 cães diagnosticados como negativos, 2.003 seriam falso-

negativos; e dos 15.117 diagnosticados como positivos, 12.925 seriam falso-

positivos.

Segundo Edrissian et al. (2003), o ELISA elimina a subjetividade

apresentada pelos testes de IFI e TAD em virtude de sua automação. Além disso,

apresentam melhores desempenhos. A utilização de antígenos recombinantes ou

purificados como as glicoproteínas de membranas gp63, gp72, gp70, específicas

do gênero Leishmania, melhoram a sensibilidade e a especificidade dos ELISAs,


32

e surgem como promissores para melhores resultados da técnica (ALVES e

BEVILACQUA, 2004).

Os testes rápidos para detecção de anticorpos para Leishmania sp,

baseados no antígeno rK39, têm sido bastante difundidos principalmente no que

se refere ao emprego em inquéritos epidemiológicos que precisam de testes que

sejam rápidos, de fácil execução e interpretação e de baixo custo (GONTIJO &

MELO, 2004). O teste imunocromatográfico, que utiliza como antígeno o rK39,

“Teste Rápido Anticorpo Leishmania donovani” apresentou uma sensibilidade de

100% quando aplicado na Índia (SUNDAR et al., 2002), 67% quando aplicado no

Sudão (ZIJLSTRA et al., 2001) e quando aplicado no Brasil em inquéritos

epidemiológicos caninos em áreas endêmicas, a sensibilidade foi de 92% e a

especificidade foi de 99,5%, no entanto o teste não foi capaz de detectar infecção

em animais com títulos de IFI baixos (1/40 a 1/320) (GENARO et al., 1997).

No Brasil, com relação ao diagnóstico da LVC, no momento se dispõe dos

kits produzidos por Bio-Manguinhos, EIE-LVC e IFI-LVC (objeto do presente

estudo) e pela Biogene (kit para Diagnóstico do Calazar Canino ELISA/S7), não

sendo encontrado na literatura pesquisada, como salientado na Introdução,

nenhum trabalho que mostrasse o desempenho desse último.

Levando em consideração que o estudo prévio realizado por Ferreira et al.

(2000) com o kit EIE-LVC, que utilizou uma amostra com diagnóstico apenas

presuntivo, nos estimulou a avaliar o referido kit e sua associação com o IFI-LVC

como uma tentativa de justificar seu emprego em inquéritos epidemiológicos.


33

5.1 O desempenho do EIE-LVC e do IFI-LVC

No presente trabalho, a análise do EIE-LVC realizada no G1 e no G3

revelou que ele foi capaz de identificar 18 amostras positivas entre as 25 e 14

entre as 16 negativas, o que significa uma sensibilidade de 72% e uma

especificidade de 87,5%. Quando o índice kappa foi analisado observou-se uma

ótima concordância (k=0,975) em relação à reprodutibilidade do EIE-LVC. Já para

o IFI-LVC os valores encontrados para sensibilidade e especificidade foram de

68% e 87,5%, respectivamente.

Visando obter valores de sensibilidade e especificidade mais significantes,

os dois kits foram analisados associados, em série e em paralelo. O emprego dos

dois kits, com diferentes metodologias, associados, funciona como uma

ferramenta para minimizar os resultados falso-positivos e falso-negativos

(THRUSFIELD et al. 1995). Para obtenção de um resultado positivo quando a

associação é em paralelo considera-se que apenas um dos testes seja reagente.

Já para a obtenção de um resultado positivo quando a associação é em série

considera-se que os dois testes apresentem resultados concordantes, isto é,

sejam reagentes (THRUSFIELD et al. 1995).

No presente trabalho, o emprego destas associações utilizando o EIE-LVC

e o IFI-LVC resultou na elevação da sensibilidade (92%), quando a análise foi

realizada em paralelo; e da especificidade (100%) quando a análise foi realizada

em série. Como em inquéritos epidemiológicos é exigido o emprego de um teste

(ou testes combinados) que apresentem elevada sensibilidade, os resultados

obtidos no presente trabalho levam a supor que o emprego dos kits EIE-LVC e

IFI-LVC usados em paralelo, onde a positividade é considerada quando pelo

menos um teste é reagente, seria mais efetivo. No entanto, essa suposição


34

conduz a uma reflexão sobre as vantagens, desvantagens, operacionalização e

custos do emprego desses testes associados. Se por um lado há vantagens em

utilizar o EIE-LVC em virtude do mesmo apresentar automação e rapidez, por

outro, o IFI-LVC é subjetivo e acuidade visual para sua interpretação. Além disso,

em inquéritos epidemiológicos o sangue dos animais é coletado no campo e

conduzido a laboratórios que possuam equipamentos para esse fim, onde será

processado. Nesse caso, um aspecto de grande relevância, é que os resultados

obtidos são demorados (20 a 30 dias após a coleta) dificultando a ação efetiva

dos cães infectados (sorologicamente positivos) e sua eliminação. Na prática, a

ação de saúde pública que visa identificar e eliminar o cão sorologicamente

positivo é realizada de forma pouco eficaz. Assim, a busca do animal

sorologicamente positivo torna-se extremamente difícil e, muitas vezes, sua

eliminação passa a ser inócua, pois a retirada deste animal já não se traduz como

uma ação eficaz, uma vez que outros animais ao seu redor já se tornaram

infectados com potencial de transmissão da doença. Um outro fato

freqüentemente encontrado é que o proprietário do cão infectado, sabendo da

possibilidade do animal ser eutanasiado, pode dificultar a eliminação do mesmo.

Para minimizar o problema da demora dos resultados no caso de utilizar o

EIE-LVC e IFI-LVC em inquérito epidemiológico, os soros dos animais poderiam

ser inicialmente analisados através do EIE-LVC e somente aqueles animais que

se mostrassem negativos seriam submetidos ao IFI-LVC. Dessa maneira, os

resultados poderiam ser liberados em menor tempo, o que favoreceria a remoção

do cão infectado impedindo que o mesmo contribuísse para a transmissão da

doença.


35

É importante também comentar que os resultados obtidos com o emprego

do EIE-LVL e IFI-LVL em paralelo, conduziram a aplicação dessa abordagem na

análise do G2 avaliando o VPP do diagnóstico clínico, visando obter dados da

capacidade do exame clínico em diagnosticar a LVC. O fato do diagnóstico

clínico apresentar um VPP de 42%, reforça a idéia de que os animais apenas com

diagnóstico presuntivo para LVC não são adequados para realização de avaliação

de testes de diagnóstico como empregado por Ferreira et al. (2000).

Com relação à reação cruzada foi observada uma reação do animal 066,

portador de Demodex canis, evidenciada apenas no IFI-LVC. A observação de

uma elevada DO (1,163) no EIE-LVC e a reação positiva no IFI-LVC (títulos 1/40

e 1/80), apresentadas pelo soro do animal 113, cão portador de Anaplasma

platys, sugere que esta reatividade não foi devido apenas a reação cruzada,

podendo este animal apresentar também anticorpos anti-Leishmania sp. Por outro

lado, deve-se levar em consideração também o fato de que o animal poderia ser

portador assintomático ou ter passado pelo processo de cura espontânea

(RIBEIRO, 2001). Com relação a este último ponto existem controvérsias na

literatura. Uma vez que o animal foi a óbito após a coleta de soro, não foi possível

realizar uma análise através de teste molecular (PCR) para esclarecer este

resultado. Não foi possível testar soros de cães portadores de doença de Chagas

e leishmaniose tegumentar, por que não foram obtidos soros de animais

portadores destas parasitoses.


36

5.2 Custo dos kits EIE-LVC e IFI-LVC

Os kits EIE-LVC e IFI-LVC produzidos por Bio-Manguinhos não estão

comercialmente disponíveis para os laboratórios privados. No entanto, eles são

adquiridos pelo Ministério da Saúde (MS) através de um convênio firmado com

Bio-Manguinhos onde o custo de cada reação do IFI-LVC é de R$ 1,50 (USD

0.65) e de R$ 3,15 (USD 1.33) para cada reação do EIE-LVC (Departamento

Comercial, Bio-Manguinhos). Sendo assim, para obtermos resultados mais

seguros, utilizando os 2 kits em associação, o diagnóstico por animal ficaria com

um custo de R$ 4,65 (USD 1.97) (1 USD = R$ 2,36).

Como a venda desses kits para o MS não visa lucro a sua comparação

com o custo de kits oriundos de outras empresas, nesse trabalho, não tem

significado.

5.3 Problemas metodológicos

O principal problema foi conseguir um maior número de amostras de cães

com as características estabelecidas para o grupo controle. Este se justifica pela

dificuldade de encontrar cães que nunca tivessem sequer pernoitado em área

endêmica para leishmaniose, visto que, na RMR apenas o município de Recife é

considerado área não endêmica para a doença. Além disso, o proprietário de cão

sadio geralmente não colabora para esse tipo de trabalho uma vez que seu cão

não apresenta nenhum sintoma.


37

6. CONCLUSÃO

� Os resultados obtidos com o kit EIE-LVC (sensibilidade=72,0%;

especificidade = 87,5%) indicam que o seu desempenho não foi diferente

daquele encontrado no IFI-LVC (sensibilidade= 68,0%, especificidade =

87,5%) do ponto de vista estatístico.

� A avaliação dos kits de IFI-LVC e EIE-LVC em associação, mostrou uma

maior sensibilidade (92%) quando os testes foram associados em paralelo

e elevada especificidade (100%) quando associados em série. Estes

resultados indicam que as duas técnicas devem ser empregadas em

associação para inquérito epidemiológico (a positividade é considerada

quando pelo menos um teste é reagente), e para diagnóstico (a

positividade é considerada quando os dois testes são reagentes).

� A utilização dos kits IFI-LVC e IEI-LVC em associação concorre para a

obtenção de resultados mais seguros, tendo em vista que estas

associações diminuem a possibilidade de ocorrência de resultados falso-

positivos e falso-negativos.

� Cães com sinais sugestivos ou aqueles provenientes de áreas endêmicas

devem ser submetidos à pesquisa de anticorpos através do EIE-LVC e IFI

LVC associados em paralelo.

Rodrigo Alves de Lira Diagnóstico da Leishmaniose Visceral Canina:... 38

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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THAKUR, C. P. Socio-economics of visceral leishmaniasis in Bihar (India). Transactions of the Royal Society of Tropical Medic ine and Hygiene , Londres, v. 94, p. 156-157, 2000.

THOMÉ, S. M. G. Cuidado com as leishmanioses. Cães & Gatos , Porto Feliz, ano 14, n. 85, p. 46-50, set/out. 1999.

THRUSFIELD, M. V. Veterinary epidemiology . 2nd ed. Oxford: Blackwell Science, 1995.

URQUHART, G.M. et al. Parasitologia Veterinária. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1990.

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ZHANG, W. W. et al. Identification and expression of the A2 amastigote-specific protein Leishmania donovani. Molecular Biochemical and Parasitology , Amstendam, v. 78, p. 79-90, 1996.

ZIJLSTRA, E. E. et al. Diagnosing visceral leishmaniasis with the recombinant k39 strip test: experience from the Sudan. Tropical Medicine and International Health , Oxford, v. 6, n. 2, p. 108-113, 2001.


44

APÊNDICE 1

TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARESCIDO

Projeto: Avaliação do Desempenho do kit EIE-Leishmaniose-Visceral-Canina-Bio-Manguinhos frente ao teste de imunofluorescência indireta Responsáveis: Yara de Miranda Gomes e Rodrigo Alves de Lira

Eu, ___________________________________, RG ______________________,

proprietário do cão

___________________________________________________aceito que meu

animal participe desse estudo, cujo objetivo é avaliar o desempenho do teste que

utiliza a reação em cadeia da pomerase (PCR). Fui informado que o meu cão terá

seu sangue coletado para os testes de diagnóstico da leishmaniose visceral

canina (LVC) no estudo acima referido. Fui orientado em relação aos benefícios

desse estudo, que contribuirá para a busca de um diagnóstico mais seguro da

LVC. Fui informado ainda que o material coletado será incorporado ao Laboratório

de Imunoparasitologia do Departamento de Imunologia do Centro de Pesquisas

Aggeu Magalhães/FIOCRUZ, podendo ser utilizado em pesquisas posteriores. Fui

informado que tenho liberdade de recusar ou retirar o consentimento sem sofrer

nenhum tipo de penalização ou pressão e que não serei ressarcido

financeiramente para participar deste estudo.

Contatos: Dr. Yara M Gomes, CPqAM/FIOCRUZ – Tel. 2101-2559

Dr. Leucio Alves, UFRPE – Tel. 3302-1422

Recife, ______de________________de 2004.

_______________________________________

Responsável pelo cão

_______________________________________

testemunha 1

_______________________________________

testemunha 2


45

APÊNDICE 2

FORMULÁRIO DE PESQUISA CENTRO DE PESQUISAS AGGEU MAGALHÃES


1 - IDENTIFICAÇÃO

NOME DO ANIMAL: ______________________________ N0 ___________________

IDADE:___________ SEXO:____________ RAÇA: ____________________________

PROPRIETÁRIO: ________________________________________________________

ENDEREÇO: ____________________________________________________________

TELEFONE :_____________________________________________________________

2 - AVALIAÇÃO DO ANIMAL:

ESTADO NUTRICIONAL: ÓTIMO ( ) BOM ( ) REGULAR ( ) PÉSSIMO ( ) LOCAL DA LESÃO _______________________________________________________

2.1 –SINTOMAS

ALOPECIA ( )ONICOGRIFOSE ( ) INAPETÊNCIA ( ) CONJUTIVITE ( ) PERDA DE PES0 ( ) DISTENSÃO ABDOMINAL ( ) LINFADENOPATIA ( )

3 -COLHEITA DO MATERIAL:

SANGUE ( ) RASPADO DA LESÃO CUTÂNEA ( ) RASPADO DE PELE ÍNTEGRA ( ) PUNÇÃO DE MEDULA ( )

4 - OUTRAS INFORMAÇÕES IMPORTANTES

_____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5 - DADOS SOBRE O VETOR:

HÁ QUEIXA DE MOSQUITOS? (SIM) (NÂO)

PERÍODO DE MAIOR QUEIXA. (MANHÃ) (TARDE) (NOITE)

VEGETAÇÃO NAS IMEDIAÇÕES - PRIMÁRIA ( ) SECUNDÁRIA ( ).

JÁ OUVIU FALAR SOBRE A LVC? (SIM) (NÃO)

6 - RESULTADO DOS EXAMES:

IMUNOLÓGICO PARA LVC: ELISA: DO_____________ CO____________

PARASITOLÓGICO PARA LVC:______________________________________


46

APÊNDICE 3

FORMULÁRIO DE PESQUISA CENTRO DE PESQUISAS AGGEU MAGALHÃES


1 - IDENTIFICAÇÃO

NOME DO ANIMAL: ______________________________ N0 ______________________

IDADE:___________ SEXO:____________ RAÇA: ______________________________

PROPRIETÁRIO: _________________________________________________________

ENDEREÇO: ____________________________________________________________

TELEFONE :_____________________________________________________________

2 - AVALIAÇÃO DO ANIMAL:

ESTADO NUTRICIONAL: ÓTIMO ( ) BOM ( ) REGULAR ( ) PÉSSIMO ( )

JÁ TOMOU TRANSFUSÃO DE SANGUE?

JÁ HABITOU EM ZONA ENDÊMICA?

3 -COLHEITA DO MATERIAL:

SANGUE ( )

4 - OUTRAS INFORMAÇÕES IMPORTANTES

____________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________

5 - RESULTADO DOS EXAMES:

IMUNOLÓGICO PARA LVC: ELISA: DO _____________ CO ____________

IFI - 1:40 ______________ 1:80 ___________

PARASITOLÓGICO PARA LVC: ____________________


47

APÊNDICE 4

TABELA DE TESTES REALIZADOS

IFI ELISA ELISA N° ANIMAL PARASITOLÓGICO

1:40 1:80 DO CO DO CO 001 Negativo - - 0,105 0,129 0,070 0,147002 Positivo + + 0,811 0,129 0,704 0,147003 Positivo + + 0,996 0,129 0,854 0,147004 Negativo - - 0,075 0,129 0,076 0,147005 Negativo - - 0,136 0,129 0,145 0,147006* Negativo + + 0,489 0,129 0,375 0,147007 Negativo - - 0,074 0,129 0,078 0,147008 Positivo + + 1,146 0,129 1,071 0,147009 Negativo - - 0,122 0,129 0,077 0,147010 Negativo - - 0,143 0,129 0,136 0,147011 Positivo - - 0,119 0,129 0,117 0,147012 Negativo - - 0,139 0,129 0,095 0,147013 Negativo + - 0,081 0,129 0,100 0,147014 Negativo - - 0,110 0,129 0,096 0,147015 Negativo - - 0,108 0,129 0,089 0,147016 Negativo - - 0,079 0,129 0,085 0,147017 Negativo - - 0,075 0,129 0,079 0,147018 Negativo - - 0,123 0,129 0,105 0,147019 Negativo - - 0,097 0,129 0,101 0,147020 Negativo - - 0,085 0,129 0,101 0,147021 Positivo - - 0,066 0,129 0,067 0,147022 Negativo + - 0,154 0,129 0,125 0,147023 Positivo + - 1,096 0,129 1,104 0,147024 Negativo - - 0,094 0,129 0,078 0,147025 Positivo + + 1,156 0,129 0,928 0,147026 Negativo - - 0,063 0,129 0,079 0,147027 Negativo - - 0,072 0,129 0,075 0,147028 Negativo + - 0,150 0,129 0,101 0,147029 Negativo - - 0,144 0,129 0,123 0,147030 Positivo - - 0,077 0,129 0,083 0,147031 Negativo - - 0,064 0,129 0,071 0,147032 Positivo + + 0,953 0,129 0,906 0,147033 Negativo + - 0,115 0,129 0,096 0,147034 Negativo - - 0,073 0,129 0,067 0,147035 Positivo + + 0,104 0,129 0,088 0,147036 Negativo + - 0,094 0,129 0,097 0,147037 Negativo + + 0,081 0,129 0,099 0,147038 Negativo + - 0,091 0,129 0,087 0,147039 Negativo - - 0,138 0,129 0,116 0,147


48

040 Negativo + - 0,160 0,129 0,163 0,147041 Negativo + - 0,184 0,129 0,157 0,147042 Positivo + - 0,083 0,129 0,089 0,147043 Negativo + - 0,094 0,129 0,082 0,147044 Positivo - - 0,121 0,129 0,107 0,147045 Negativo - - 0,172 0,129 0,078 0,147046 Negativo + + 0,086 0,129 0,073 0,147047 Babesiose - - 0,052 0,129 0,052 0,147048 Negativo - - 0,073 0,129 0,073 0,147049* Negativo + + 0,509 0,129 0,509 0,147050 Negativo - - 0,120 0,129 0,120 0,147051 Negativo - - 0,089 0,129 0,119 0,147052 Negativo - - 0,104 0,129 0,117 0,147053 Negativo - - 0,126 0,129 0,110 0,147054 Negativo - - 0,096 0,129 0,107 0,147055 Negativo - - 0,073 0,129 0,073 0,147056 Negativo - - 0,078 0,129 0,084 0,147057 Positivo + + 0,642 0,129 0,549 0,147058 Babesiose - - 0,077 0,129 0,077 0,147059 Babesiose - - 0,099 0,129 0,105 0,147060 Ehrlichiose - - 0,097 0,129 0,148 0,147061 Negativo - - 0,054 0,129 0,062 0,147062 Ehrlichiose - - 0,112 0,129 0,151 0,147063 Positivo + + 0,563 0,129 0,591 0,147064 Negativo - - 0,081 0,129 0,113 0,147065 Ehrlichiose - - 0,103 0,129 0,114 0,147066 Demodicose + + 0,075 0,129 0,086 0,147067 Negativo - - 0,078 0,129 0,078 0,129068 Positivo + + 1,200 0,129 1,028 0,147069 Negativo - - 0,070 0,129 0,070 0,147070 Negativo - - 0,108 0,129 0,108 0,147071 Negativo - - 0,100 0,129 0,091 0,147072 Positivo + + 1,037 0,129 0,858 0,147073 Negativo - - 0,059 0,129 0,065 0,147074 Positivo - - 0,635 0,129 0,487 0,147075 Não Realizado - - 0,151 0,129 0,151 0,147076 Não Realizado - - 0,065 0,129 0,065 0,147077 Negativo - - 0,094 0,129 0,106 0,147078 Positivo + + 0,579 0,129 0,419 0,147079 Positivo + + 0,761 0,129 0,700 0,147080 Negativo - - 0,075 0,129 0,079 0,147081 Negativo - - 0,183 0,129 0,194 0,147082 Positivo + - 0,634 0,129 0,472 0,147083 Positivo - - 0,102 0,129 0,122 0,147084 Negativo - - 0,097 0,129 0,115 0,147


49

085 Não Realizado - - 0,052 0,129 0,065 0,147086 Não Realizado - - 0,081 0,129 0,096 0,147087 Negativo + + 0,056 0,129 0,070 0,147088 Negativo + + 0,078 0,129 0,084 0,147089 Negativo - - 0,123 0,129 0,089 0,147090 Negativo + + 0,130 0,129 0,096 0,147091 Positivo + + 0,482 0,129 0,558 0,132092 Positivo - - 0,540 0,129 0,556 0,132093 Negativo - - 0,078 0,129 0,103 0,132094 Negativo - - 0,109 0,129 0,118 0,132095 Negativo - - 0,093 0,129 0,122 0,132096 Negativo - - 0,061 0,129 0,084 0,132097 Negativo - - 0,102 0,129 0,124 0,132098 Negativo - - 0,087 0,129 0,134 0,132099 Negativo - - 0,060 0,129 0,070 0,132100 Negativo - - 0,081 0,129 0,092 0,132101 Não Realizado - - 0,072 0,129 0,151 0,132102 Negativo - - 0,089 0,129 0,092 0,132103 Negativo - - 0,070 0,129 0,087 0,132104 Negativo - - 0,057 0,129 0,065 0,132105 Negativo + - 0,093 0,129 0,087 0,132106 Negativo + - 0,076 0,129 0,101 0,132107 Não Realizado + - 0,076 0,129 0,079 0,132108 Negativo - - 0,055 0,129 0,065 0,132

109** Positivo - - 0,540 0,129 0,092 0,132110 Negativo - - 0,059 0,129 0,078 0,132111 Negativo - - 0,072 0,129 0,061 0,132112 Negativo - - 0,054 0,129 0,063 0,132113 Ehrlichiose + + 1,163 0,129 1,269 0,132114 Babesiose - - 0,057 0,129 0,061 0,132115 Ehrlichiose - - 0,062 0,129 0,068 0,132116 Negativo - - 0,068 0,129 0,114 0,132117 Negativo + + 0,048 0,129 0,090 0,132118 Ehrlichiose - - 0,082 0,129 0,097 0,132119 Positivo + + 0,184 0,129 0,246 0,132120 Positivo - - 0,259 0,129 0,390 0,132121 Negativo - - 0,274 0,129 0,274 0,129

Em vermelho animais positivos; Em azul animais negativos; Em verde animais com outras parasitoses; * Animais que receberam tratamento especifico para leishmaniose; ** Animal Repetido do número 092.


51

ANEXO 2

PROTOCOLO EIE-LEISHMANIOSE-VISCERAL-CANINA-BIO-ANGU INHOS


52


53


54


55


56

ANEXO 3

PROTOCOLO IFI-LEISHMANIOSE-VISCERAL-CANINA-BIO-MANG UINHOS


57


58


59

60

VETERINARY PARASITOLOGY (submetido)

Canine Visceral Leishmaniasis: A Comparative Analys is of the EIE-

Leishmaniose-Visceral-Canina-Bio-Manguinhos and the IFI-Leishmaniose-

Visceral-Canina-Bio-Manguinhos Kits

R. A. Liraa, M. P. Paiva Cavalcantia, M. Nakazawaa, A.G.P. Ferreirac, E.D.

Silvac, F. G. C. Abatha, L.C. Alvesd, W.V. Souzab, Y. M. Gomesa,*

aDepartamento de Imunologia e bDepartamento de Saúde Coletiva, Centro de

Pesquisas Aggeu Magalhães/CPqAM, Fundação Oswaldo Cruz/FIOCRUZ, Av.

Moraes Rego, s/n, Cidade Universitária, 50670-420, Recife-PE, Brazil cDepartamento de Reativos para Diagnósticos, Bio-Manguinhos, Fundação

Oswaldo Cruz/FIOCRUZ, Av. Brasil, 4365, Manguinhos, 21040-900, Rio de

Janeiro-RJ, Brazil dDepartamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal Rural de

Pernambuco/UFRPE, Av. Dom Manoel de Medeiros s/n, Dois Irmãos

52171-900 - Recife, PE-Brazil

Corresponding author. Tel.: +55-81-21012559; fax: +55-81-34532449

E-mail address: [email protected]

61

Abstract

The aim of this study was to evaluate the performance of the EIE-

Leishmaniose-Visceral-Canina-Bio-Manguinhos (EIE-LVC) kit and to compare it

with that of the IFI-Leishmaniose-Visceral-Canina-Bio-Manguinhos (IFI-LVC) kit,

so far as its use in epidemiological procedures is concerned. The animals (140

dogs) were submitted to a clinical and parasitological examination (bone

marrow aspiration and skin scrape test). Blood was collected and the serum

stored at -20ºC until used. The dogs were divided into four groups: group 1

(G1), dogs with clinical signs indicative of CVL and testing positive for the

parasite (n=25); group 2 (G2), dogs with only a presumed diagnosis of CVL

(n=62); group 3 (G3), dogs that had never lived in an area where CVL is

endemic and never received a blood transfusion (n=16); and group 4 (G4), dogs

carrying other parasites: such as babesiosis (n=4), anaplasmosis (n=6) and

demodicosis (n=1). Analysis of the EIE-LVC in G1 showed a sensitivity of 72%

(IC 95%: 50.4 – 87.1%) and a specificity of 87.5% (IC 95%: 60.4 – 97.8%). The

value of the Kappa index was 0.975 (CI 95%: 0.926 – 1.024), which represents

an excellent fit. When this group (G1) was analyzed using IFI-LVC, the

sensitivity was 68.0% (CI 95%: 46.4 – 84.3%) and the specificity 87.5% (CI

95%: 60.4 – 97.8%). When the tests were conducted in parallel, sensitivity was

92.0% (CI 95%: 72.5 – 98.6%) and specificity 75.0% (CI 95%: 47.4 – 91.7%).

However, when conducted consecutively, the tests showed a sensitivity of

48.0% (CI 95%: 28.3 – 68.2%) and a specificity of 100.0% (CI 95%: 75.9 –

99.4%). The analysis of G2 using IFI-LVC and EIE-LVC kits in parallel, because

of its high sensitivity, revealed that, of this group, 26 animals had been detected

as positive and 36 had been diagnosed as negative. The analysis of the clinical

diagnosis compared with the combination of the tests in parallel produced a

VPP of 42.0% (CI 95%: 29.7- 55.1%). Cross-reaction was observed in dogs

carrying ehrlichiosis and demodicosis. These results lead to the following

conclusions: 1) the results obtained using the EIE-LVC kit suggest that its

performance is similar to that found for the IFI-LVC. 2) the kits must be used in

conjunction if more reliable results are to be obtained, because it reduces the

probability of the occurrence of false-positive and false-negative results.

Keywords: serodiagnosis; canine visceral leishmaniasis; ELISA, IIF

62

Introduction

Visceral leishmaniasis (VL), also called kala-azar, is a zoonosis caused by

protozoan parasites of the Leishmania genus. L. donovani and L. infantum are

the etiological agents of visceral leishmaniasis in the Old World, and L. chagasi

in the Americas (Palatnik de Souza et al., 2001; Ikonomopoulos et al., 2003). In

Latin America, visceral leishmaniasis is caused by infection with Leshmania

chagasi, which is usually transmitted by the bites of infected phlebotomine sand

flies, Lutzomyia longipalps (Milles et al. 1999). Domestic dogs (Canis familiaris)

represent the main reservoir host for Leishmania infection in human and other

dogs. Thus, one of the most important approaches to controlling the incidence

of human visceral leishmaniasis is to detect the infected dogs (Ashford et al.

1998).

Diagnosis of canine visceral leishmaniasis (CVL) is confirmed by

demonstration of the presence of the parasite in stained smears of spleen, bone

marrow, lymph node, or liver (Herwaldt 1999). However, these diagnostic

methods are limited by low sensitivity and they are invasive and frequently

inconclusive. In addition, they are not efficient for use in epidemiological

surveys. Molecular methods that detect the DNA of the parasite exhibit high

sensitivity but their use is restricted to research laboratories. The current

diagnostic methods used for Leishmania mass-screening surveys are the

indirect immunofluorescence test (IIF); direct agglutination; and enzyme linked-

immunosorbent assay (ELISA) (Reithinger et al. 2002).

For canine surveys, the Brazilian Ministry of Health recommends the use of

the IIF, because of its high sensitivity and specificity. According to Alves and

Bevilacqua (2004), however, the use of IIF may decrease the effectiveness of

the Kala-Azar Control Program by not detecting, and thus failing to sacrifice,

false-negative infected animals. On the other hand, the program incorrectly

identifies and leads to the unwarranted sacrifice of false positive uninfected

animals. In addition, the long delay between sample collection and sample

analysis (30 to 80 days), and implementation of the control of infected dogs,

means that dogs continue to infect sand fly vectors during this period and these,

in turn, transmit VL to susceptible dogs and humans (Reithinger et al., 2002).

As the elimination of infected dogs is an important means of controlling

transmission of VL and given the difficulty of direct detection of the organisms,

63

rapid, inexpensive and accurate indirect diagnosis of canine infection is an

essential tool for VL surveillance programs (Scalone et al. 2002; Carvalho et al.

2002). Immunochromatographic dipstick tests for Leishmania diagnosis have

recently been developed and are all based on recombinant K39 (rK39), a

repetitive immunodominant epitope in a kinesin-related protein that is well-

preserved among viscerotropic Leishmania species (Burns et al. 1993;

Reithinger et al. 2002). A commercially available dipstick test (Leishmania

RAPYDTEST; Intersep, Workingham, United Kingdom) has been shown to

have 61 to 75% specificity and 72 to 77% sensitivity, indicating that its

performance could be improved (Reithinger et al. 2002).

In the present study, we evaluated the performance of the EIE-

Leishmaniose-Visceral-Canina-Bio-Manguinhos (EIE-LVC) kit and compared it

with that of IFI-Leishmaniose-Visceral-Canina-Bio-Manguinhos (IFI-LVC), both

produced by Bio-Manguinhos/FIOCRUZ, Brazil, so far as its use in

epidemiological procedures is concerned.

2. Materials and methods

2.1. Dogs and samples

Serum samples were obtained from 114 domestic dogs of several

breeds, male and female, between the ages of 3 months and 16 years old from

the Veterinary Hospital of the UFRPE (Federal Rural University of

Pernambuco), situated in Recife, a city in the State of Pernambuco in the

Northeast region of Brazil. An epidemiological questionnaire was filled in by the

dog owners, and all animals were subjected to physical examinations. The

study protocol was approved (nº P.0220/04) by the Animal Use Ethics

Committee (Comissão de Ética no Uso de Animais - CEUA) of the Oswaldo

Cruz foundation --Fundação Oswaldo Cruz/FIOCRUZ (Ministry of Health,

Brazil). Written informed consent was obtained from all dog owners.

The dogs were divided into four groups: group 1 (G1), dogs with clinical

signs indicative of CVL and testing positive for the parasite; group 2 (G2), dogs

with only a presumed diagnosis of CVL; group 3 (G3), dogs that had never lived

in an area where CVL is endemic and never received a blood transfusion; and

group 4 (G4), dogs carrying other diseases. Blood was collected and the serum

stored at -20ºC until used.

64

2.2. Detection of amastigotes

Bone marrow aspiration was performed on the iliac crest of the sternum,

with the animal under sedation when necessary, by way of intravenous injection

of 0.5 mg/Kg of acepromazine. Smears were produced by placing the material

collected on microscope slides stained with Panoptic, and these were examined

for Leishmania amastigotes.

2.3. Serology

The IIF was performed using the IFI-Leishmaniose-Canina-Bio-

Manguinhos (IFI-LC) kit, batch 04PLC004Z, that uses as an antigen

promastigote forms of Leshmania major-like (MHOM/BR/76/JOF).

The ELISA was carried out using the EIE-Leishmaniose-Visceral-Canina-

Biomanguinhos (EIE-LVC) kit, batch 040EL009Z, which uses soluble antigen

from promastigote forms of Leshmania major-like (MHOM/BR/76/JOF). The

ELISA was carried out by two experienced technicians, who worked in a double

blind scenario.

Both kits are produced by Biomanguinhos/FIOCRUZ, Rio de Janeiro,

Brazil, and all procedures were performed according to the manufacturer’s

instructions.

2.4. Statistical analysis

Win Episcope 2.0 software (De Blas et al., 2000) was used to calculate the

values of sensitivity and specificity for the tests, in isolation, as well as in

parallel and consecutively. The Kappa index (k) was also evaluated using the

same software to measure the concordance between the ELISA executed by

the two technicians. The confidence interval (CI) was calculated to be 95%. For

this work, a parasitological test was used as a reference for EIE-LVC validation.

3. Results

The parasitological tests revealed that, of the 87 dogs with only a

presumed diagnosis of CVL, 25 were positive (G1) and 62 were negative (G2).

G3 contained 16 dogs and 11 dogs infected with other parasites, such as

Babesia canis (n=4), Anaplasma platys (n=6) and Demodex canis (n=1), made

up G4.

65

The serological analysis of G1 by EIE-LVC (Fig. 1 and Table 1) showed a

sensitivity of 72.0% (CI 95%: 50.4 – 87.1%) and specificity 87.5% (CI 95%: 60.4

– 97.8%). The values for VPP and VPN were 90.0% (CI 95%: 66.9 – 98.2%)

and 66.7% (CI 95%: 42.5 – 84.9%), respectively. The value of the Kappa index

was 0.975 (CI 95%: 0.926 – 1.024). When this group was analyzed using IFI-

LVC, for G1, the sensitivity was 68.0% (CI 95%: 46.4 – 84.3%) and the

specificity 87.5% (CI 95%: 60.4 – 97.8%) (Table 1). The values of VPP and

VPN were 89.5% (CI 95%: 65.5 – 98.2%) and 63.6% (CI 95%: 39.1 – 83.1%),

respectively. Based on analysis of the CI, it can be seen that the serological

tests did not a show significant difference in terms of performance for detection

of anti-Leishmania antibodies.

When the tests were conducted in parallel, sensitivity was 92.0% (CI

95%: 72.5 – 98.6%) and specificity 75.0% (CI 95%: 47.4 – 91.7%). However,

when conducted consecutively, the tests showed a sensitivity of 48.0% (CI

95%: 28.3 – 68.2%) and a specificity of 100.0% (CI 95%: 75.9 – 99.4%).

The analysis of G2 using IFI-LVC and EIE-LVC kits in parallel, because

of its high sensitivity, revealed that, of this group, 26 animals had been detected

as positive and 36 had been diagnosed as negative. The analysis of the clinical

diagnosis compared with the combination of the tests in parallel produced a

VPP of 42.0% (CI 95%: 29.7- 55.1%).

When the serum of animals carrying other diseases was tested using the

IFI-LVC, cross-reaction was observed between D. canis and A. platys. In the

case of the EIE-LVC, cross-reaction was observed in dogs carrying A. platys

(Table 2). However, using high-density optics, the results for these animals did

not rule out the possibility of a co-infection with Leishmania.

Discussion

The analysis of the EIE-LVC performed with G1 and G3 identified 18

positive samples among the 25, and 14 among the negative samples. The

sensitivity was 72.0% and the specificity 87.5%. When the kappa index was

analyzed, an excellent concordance was observed (k=0.975) in relation to

reproducibility of the EIE-LVC. The values found for performance of the IFI-LVC

in terms of sensitivity and specificity were 68% and 87.5%, respectively.

66

In order to obtain higher values for sensitivity and specificity, the two kits

were analyzed in combination, in parallel and consecutively. The use of a

combination of the two tests, with different methods, minimized the false-

positive and false-negative results (THRUSFIELD et al. 1995). To obtain a

positive result when the tests are carried out in parallel only one test needs to

be reagent. When the tests are carried out consecutively, the result is

considered positive only when both tests are reagent (THRUSFIELD et al.

1995).

In the present study, the use of the combination of EIE-LVC and IFI-LVC

showed higher sensitivity (92%), when the analysis was conduced in parallel;

and higher specificity (100%), when the analyses were conducted

consecutively. As in epidemiological surveys it is necessary to employ a test (or

combined tests) that present high sensitivity, the results obtained by the present

work lead us to suppose that the use of the EIE-LVC and IFI-LVC in parallel

could be more efficient. However, the respective advantages and

disadvantages of these kits should also be taken into consideration. If there are

advantages in using the EIE-LVC in terms of automation and rapidity, there are

disadvantages in using the IFI-CVL, because it is a subjective test that needs to

be interpreted by a suitably trained technician. Moreover, in epidemiological

surveys, the blood of the animals is collected in the field and taken to be

processed in laboratories that possess the necessary equipment. In this case, a

highly significant factor is the fact that results are obtained only after a delay,

making it difficult to eliminate infected dogs (i.e. those that test positive for the

serological test). In practice, public health action that aims to identify and to

eliminate the positive dogs is carried out in an ineffective manner. The search

for positive dogs often becomes extremely difficult, and the elimination of one

animal has no effect, as this animal has already infected others around it, which

are now potential transmitters of the disease. The owners of infected dogs also

frequently put up resistance to the elimination of the animal.

The way of minimizing the problem of the delay in obtaining results, in

the case of the use of EIE-LVC and IFI-LVC for epidemiological surveys, would

be for the serum of the animals to be first analyzed using EIE-LVC and only the

animals testing positive to this test to go on to be submitted to the IFI-LVC. In

this way, the results could be released quickly, which would facilitate the

67

elimination of the infected dog and prevent it from continuing to contribute to the

transmission of the disease.

The results obtained using EIE-LVC and IFI-LVC in parallel, led us to

apply this approach to analysis of the G2 group, evaluating the predictive

positive value of clinical diagnosis, in order to obtain data on the ability of

clinical diagnosis to detect CVL. The fact that clinical diagnosis shows a PPV of

42% supports the idea that dogs with only presumed diagnosis of CVL are not

suitable for validation of diagnostic tests.

False-positive reactions were detected when serum from dogs carrying

other parasitic diseases was tested. The cross-reaction observed in a dog with

Anaplasma platys, with high OD in EIE-LVC and 1/40 and 1/80 titers in IFI-LVC,

suggests that this animal could be co-infected with Leishmania. On the other

hand, the animal could be asymptomatic or have been spontaneously cured

(Ribeiro, 2001).

Taken together, the data suggest the following conclusions: 1) the results

obtained using the EIE-LVC kit suggest that its performance is similar to that

found for the IFI-LVC. 2) Kits must be used in conjunction if more reliable

results are to be obtained, because this reduces the probability of the

occurrence of false-positive and false-negative results.

ACKNOWLEDGMENTS

This work was supported by Biomanguinhos/Fiocruz (grant Nº C.C. 239/2005)

and CNPq. Y.M. Gomes and F.G.C Abath are a research fellow of CNPq. R.A.

Lira received a CPqAM/FIOCRUZ MSc scholarship for the duration of this

study. M. Paiva Cavalcanti is receiving a PhD/CNPq scholarship.

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Table 1 – Diagnostic performance of the ELISA and IFAT test with serum from

dogs with VL and healthy dogs

ELISA IFAT

Result G1a G3b G1a G3b

Positive 18 2 17 2

Negative 7 14 8 14

Sensitivity 72.0% - 68.0% -

Specificity - 87.5% - 87.5%

G1: dogs with VL; G3: healthy dogs;

a: n = 25; b: n = 16

70

Table 2 – Reactivity of IFI-LVC and EIE-LVC kits for visceral leishmaniasis with

serum from dogs testing positive for other diseases.

PARASITES EIE-LVC IFI-LVC

Babesia canis (n=4) 0 0

Anaplasma platys (n=6) 1 1

Demodex canis (n=1) 0 1

n = 11

Leish NLeish Other0.000.050.100.150.200.250.300.350.400.450.500.550.600.650.700.750.800.850.900.951.001.051.101.151.201.251.301.351.401.451.50

Samples

OD

450

nm

Fig. 1- Distribution of optical density values for dogs with visceral leishmaniasis

(Leish), those testing negative for visceral leishmaniasis (Nleish), and animals

with other parasitic diseases (Other). The horizontal line passing through the

drops for each plate represents the cutoff (CO) value.

CO

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