DIAGNÓSTICO E CARACTERIZAÇÃO ANATOMOPATOLÓGICA DA ... · Figura 10 – Microscopia e IHC para...

UNIVERSIDADE PAULISTA

Edna Cristiane da Matta

DIAGNÓSTICO E CARACTERIZAÇÃO ANATOMOPATOLÓGICA DA

PERITONITE INFECCIOSA FELINA EM GATOS.

SÃO PAULO

2018


DIAGNÓSTICO E CARACTERIZAÇÃO ANATOMOPATOLÓGICA DA


Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Patologia Experimental e Ambiental da Universidade Paulista para obtenção do título de Mestre

Orientador: Prof. Dr. Paulo Ricardo Dell´Armelina Rocha

São Paulo

2018

Ficha elaborada pela Bibliotecária Maria Aládia S. F. de Braga CRB8-2264

Matta, Edna Cristiane da.

Diagnóstico da peritonite infecciosa felina em gatos na cidade de São Paulo, SP, Brasil / Edna Cristiane da Matta. - 2018.

60 f. : il. color. + CD ROM.

Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós Graduação em Patologia Ambiental e Experimental da Universidade Paulista, São Paulo, 2018.

Área de Concentração: Patologia Veterinária. Orientador: Prof. Dr. Paulo Ricardo Dell’Armelina Rocha.

1. PIF. 2. Imuno-histoquímica. 3. Gatos. 4. Imunomediada. I. Rocha, Paulo Ricardo Dell’Armelina (orientador). II. Título.


DIAGNÓSTICO E CARACTERIZAÇÃO ANATOMOPATOLÓGICOS DA


Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Patologia Experimental e Ambiental da Universidade Paulista para obtenção do título de Mestre

Aprovado em: 18/12/2018

BANCA EXAMINADORA

_______________________________/_/__

Prof. Dr. Paulo Ricardo Dell’Armelina Rocha

Universidade Paulista - UNIP

_______________________________/_/__

Profa. Dra. Leoni Villano Bonamin

Universidade Paulista - UNIP

_______________________________/_/__

Profa Dra. Gisele Fabrino Machado

UNESP - Araçatuba

Dedicatória

Ao meu Orientador;

A minha família, em especial, à Caroline por me entusiasmar sempre, desde

pequena.

AGRADECIMENTOS

Agradeço em primeiro lugar a Deus por ser a base das minhas conquistas;

Aos Professores: Eduardo Fernades Bondan, Maria Anete Lallo, Leoni Villano

Bonamin e Gisele Fabrino Machado, e a discente de Graduação Gabriela Alkmin,

pelas colaborações e amizades.

Ode ao gato

(…)”Não há unidade como ele,

Não tem

a lua nem a flor

tal contextura:

é uma coisa

só como o sol ou o topázio,

e a elástica linha em seu contorno

firme e sutil é como

a linha da proa de uma nave.

Os seus olhos amareloa

deixaram uma só

ranhura

para jogar as moedas da noite.

(...) Eu não subscrevo.

Eu não conheço o gato.

Tudo sei, a vida e o seu arquipélago,

o mar e a cidade incalculável,

a botânica

o gineceu com os seus extravios,

o pôr e o menos da matemática,

os funis vulcânicos do mundo,

a casca irreal do crocodilo,

a bondade ignorada do bombeiro,

o atavismo azul do sacerdote,

mas não posso decifrar um gato.”

Pablo Neruda

Tradução: Elaine Zagury

LISTA DE ABREVIATURAS

AGP: Glicoproteína ácida α1

CMI: Imunidade mediada por células

CoVs: Coronavirus

CRFK: Rim felino de Grandell-Reese

CTLs : Linfócitos T citotóxicos

DCs : Células dendríticas

FCoV : Coronavirus felino

FeLV: Vírus da leucemia felina

FIPV: Vírus da peritonite infecciosa felina

FIV: Vírus da imunodeficiencia felina

FSCV: Doença associada ao coronavirus sistemico do Ferret

IFNs: Interferons

IHQ: imuno-histoquímica

IL-6: Interleucina 6

ISGs: Genes estimulados por Interferon

MAPK: kinases de proteínas ativadas por mitógeno

PIF: Peritonite infecciosa felina

Proteína S: Proteína de espícula

PRRs: Receptores de reconhecimento de padrões

RT-qPCR: Reação de cadeia em polimerase pela transcriptase reversa quantitativa

RNA: Ácido ribonucleico

RT-nPCR: nested PCR transcriptase reversa

SARS: Síndrome respiratória aguda severa

SARS-CoV: Coronavirus da SARS

SARSr-Rh-Bat-CoV

SNC: Sistema nervoso central

T CD8+: Linfócitos T CD8+

TCD4+ : Linfócitos T CD4+

TGF-β: Fator de crescimento tumoral beta

TLRs : Receptores “toll-like”

TNF: Fator de necrose tumoral

VEGF: Fator de crescimento endotelial vascular

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Ilustração da estrutura do Coronavirus felino (FCoV)

Figura 2 – Macroscopia do fígado de gato (animal nº. 8)

Figura 3 – Macroscopia dos linfonodos de gato (animal nº. 1)

Figura 4 – Macroscopia dos rins de gato (animal nº. 4)

Figura 5 – Macroscopia do baço de gato (animal nº. 2)

Figura 6 – Macroscopia dos intestinos de gato (animal nº. 3)

Figura 7 – Macroscopia do pâncreas de gato (animal nº. 2)

Figura 8 – Macroscopia do encéfalo de gato (nº. 9)

Figura 9 – Macroscopia dos olhos de gato (nº. 9)

Figura 10 – Microscopia e IHC para FIPV do rim de gato

Figura 11 – Microscopia e IHC para FIPV do intestino de gato

Figura 12 – Microscopia e IHC para FIPV do linfonodo de gato

Figura 13 – Microscopia e IHC para FIPV dos pulmões de gato

Figura 14 – Microscopia e IHC para FIPV do fígado de gato.

Figura 15 – Microscopia e IHC para FIPV da medula espinhal de gato.

Figura 16 – Microscopia e IHC para FIPV do pâncreas de gato.

Sumário

1. Capítulo 1 ..................................................................................................................................... 10

1.1. Considerações Gerais ........................................................................................................... 10

1.1.1. Vírus de RNA de fita simples ............................................................................................ 10

1.1.2. Coronavirus ......................................................................................................................... 11

1.1.3. As Coronaviroses ............................................................................................................... 12

1.1.4. A peritonite infecciosa felina (PIF) ................................................................................... 12

1.1.5. PIF x Resposta imune........................................................................................................ 21

1.1.6. PIF x Imunidade humoral .................................................................................................. 22

1.2. Referências ............................................................................................................................. 22

2. Capítulo 2 ..................................................................................................................................... 30

2.1. Diagnóstico e caracterização anatomopatológica da peritonite infecciosa felina em

gatos. ................................................................................................................................................... 30

2.1.1. Resumo ................................................................................................................................ 30

2.1.2. Abstract ................................................................................................................................ 31

2.1.3. Introdução ............................................................................................................................ 31

2.1.4. Métodos ............................................................................................................................... 32

2.1.4.1. Animais e amostras de material biológico .................................................................. 32

2.1.4.2. Necrópsia ......................................................................................................................... 32

2.1.4.3. Microscopia...................................................................................................................... 33

2.1.5. Resultados ........................................................................................................................... 35

2.1.6. Discussão ............................................................................................................................ 50

2.1.7. Conclusões .......................................................................................................................... 55

2.2. Referências ............................................................................................................................. 55

9

1 Capítulo 1

1.1 Considerações Gerais

A população de felinos vem crescendo vertiginosamente no Brasil (1) e desde

a década de 80 ultrapassou a população de cães nos EUA (2).

Assim como aconteceu na Europa, espera-se que no Brasil o gato (Felis

catus) deva se tornar o animal de estimação preferido. Isto por vários motivos, como

custo menor, comportamento independente e rápida adequação a ambientes

menores (2,3).

Após a segunda grande guerra mundial, as áreas urbana e suburbana

expandiram, assim como o número de gatos ferais e semi-ferais. À época, houve um

constante crescimento na população felina como “pets”, e gatis se popularizaram.

Nos anos seguintes, estabeleceu-se um grande número de organizações de abrigos

e resgate de gatos adultos e filhotes (4). Este quadro favoreceu a disseminação de

diversas doenças infecciosas entre gatos, como a peritonite infecciosa felina (PIF). A

PIF é uma doença progressiva, severa e fatal em gatos; sem tratamentos efetivos

(5,6). A PIF é uma importante doença infecciosa de gatos, cuja patogenia ainda não

foi totalmente esclarecida (7).

Além disso, o estudo da patogenia da peritonite infecciosa felina também

pode ser interessante como um modelo biológico, para estudos de doenças

inflamatórias e infecciosas em humanos, visto que os gatos possuem porte médio

(em comparação a outros animais) (2).

1.1.1 Vírus de RNA de fita simples

Utilizando-se a biologia molecular e a metagenômica, descobriu-se que há

uma diversidade de famílias (e grande diversidade genética) de vírus de RNA de fita

simples. Estes vírus são encontrados em diversos hospedeiros, como os morcegos e

aves (8, 9, 10, 11).

10

1.1.2 Coronavirus

A PIF é causada pelo Coronavírus felino. Os Coronavírus pertencem à família

Coronaviridae (5, 7, 12), à ordem Nidovirales, se recombinam entre si e formam

novos vírus (Figura 1). São vírus envelopados, de senso-positivo e genomas de

RNA de fita simples. Os vírus de fita simples são potencialmente mais virulentos

devido as maiores chances de mutações (8, 9, 10, 11, 13). Os Coronavírus são

bastante similares na organização genômica e estratégia de replicação, mas,

diferem consideravelmente na complexidade genética e arquitetura do virion. As

subfamílias Coronavirinae consistem de três gêneros (Alphacoronavirus,

Betacoronavirus e Gammacoronavirus) (13). Em 2008, um Coronavirus altamente

divergente foi descoberto em belugas e agrupado como Deltacoronavirus. Além dos

mamíferos, os Coronavírus também infectam aves domésticas e selvagens (13).

Figura 1 – Ilustração da estrutura do Coronavírus felino (FCoV).

Legenda: esquemático do virion (partícula viral) do Coronavírus felino (FCoV), proteínas do

nucleocapsídeo cobrem o genoma do RNA. As proteínas espículas, membrana e envelope estão

ancoradas na membrana bilipídica de origem celular. Fonte: Traduzido de Drechsler et al (2011).

Devido à facilidade de adaptação, os Coronavírus infectam hipoteticamente

todas as aves e mamíferos (14). A maioria dos novos vírus foi identificada em

morcegos e aves selvagens, isto leva à hipótese de que os Coronavírus humanos e

Genoma de RNA

Proteínas de nucleocapsídeo

Membrana bilipídica

Proteínas Espículas

Proteínas da membrana

Proteínas de envelope

11

animais tenham se originado em morcegos e aves. Até o ano 2000, o interesse da

pesquisa pelo Coronavírus era grande, mas limitado aos felinos, suínos, bovinos e

aves domésticas (15).

1.1.3 As Coronaviroses

Segundo a literatura científica, um grande número de mamíferos é suscetível

às Coronaviroses. Esses vírus geralmente causam infecção em uma diversidade de

animais, com diferentes graus de severidade, em diferentes sistemas, tendo sido

mais frequentemente associados a doenças respiratórias, neurológicas e entéricas

em humanos e em animais domésticos. Em humanos, a principal Coronavirose é a

síndrome respiratória aguda severa (SARS), uma doença intratável e fatal que foi

causada por uma nova cepa de Coronavírus (13).

A variação genética do hospedeiro é conhecida por contribuir para diferentes

mecanismos pós-infecção. Modelos em camundongos permitiram identificar os

fatores genéticos do hospedeiro responsáveis pela susceptibilidade a SARS. Há

linhagens de camundongo altamente susceptíveis a infecção pelo Coronavírus da

SARS, demonstrando, por exemplo, que a pneumonia contribui para a perda de

peso e hemorragia pulmonar (16).

1.1.4 A peritonite infecciosa felina (PIF)

Coronavírus felino (FCoV)

A ordem Nidovirales, a qual pertence o FCoV, é um grupo de grandes vírus,

de RNA de fita simples e esféricos. O FCoV possui genoma de 27 a 32 kb, que

codifica uma poliproteína de cerca de 750 kDa, até cinco proteínas não estruturais e

quatro proteínas estruturais (13,17). O Coronavirus felino possui pelo menos três

proteínas estruturais principais: espícula (S), envelope (E), e membrana (M) (Figura

1). Este vírus é resistente ao ácido e a tripsina, mas é inativado facilmente pela

maioria dos desinfetantes, incluindo solventes de lipídios (13).

12

O FCoV é um patógeno intracelular obrigatório (5). O FCoV pode causar

desde uma gastroenterite transitória, com diarreia autolimitante, até uma doença

fatal em gatos (7). Os agentes infecciosos, em geral, apresentam tropismo por

células, por tecidos e por hospedeiros (18). Os Coronavirus tem marcadamente um

tropismo pelas células epiteliais dos tratos respiratório e entérico. No caso da PIF, o

FIPV tem tropismo pelos enterócitos e macrófagos (13). Além disso, foram

identificadas mutações pontuais no gene S (da proteína de espícula), que tem

associação com maior virulência. Entretanto, ainda não foi esclarecido se somente

esta mutação pode causar a doença (17). Devido as maiores chances de mutações,

há diferenças genômicas entre Coronavirus felinos (7). O FIPV é um FCoV que

sofreu mutação, que pode ser de muitos genes diferentes. Além disso, duas

substituições de aminoácidos da proteína de espícula foram observadas em tecidos

de gatos com PIF. Estas possíveis mutações e a interação com a resposta imune

são responsáveis pelo desenvolvimento da PIF (19).

Devido grande variação dos sinais clínicos na PIF, é desafiante o diagnóstico

antemortem (20). Isso se deve devido ao fato de o Coronavirus felino possuir dois

sorotipos (I e II), baseados na estrutura da proteína de espícula e ambos possuírem

dois biótipos, que são muito próximos geneticamente e um deles é o vírus da PIF -

FIPV (que teoricamente sofre mutação). O FCoV causa infecção assintomática e

auto limitante em gatos (20,21) e o FIPV, causa a PIF, uma doença fatal associada

aos gatos que vivem em ambientes com múltiplos gatos (20,21).

Doença

A peritonite infecciosa felina (PIF) é uma doença severa imunomediada, para

a qual os tratamentos atuais não são efetivos (5). A PIF ocorre em felídeos (19,22).

O desenvolvimento da PIF é dependente da relação hospedeiro/vírus (17). Esta

doença tem uma patogenia complexa e ainda não completamente elucidada, que

envolve a replicação do FCoV nos macrófagos, além dos enterócitos, provavelmente

devido a mutação (13,14). Por se tratar de um vírus envelopado, na fase de

constituição do envelope viral, ocorre a incorporação de proteínas adquiridas de

vários compartimentos de células do hospedeiro parasitadas. Estes constituintes do

hospedeiro adicionados podem ajudar a sobrevivência do vírus em face às defesas

13

do hospedeiro. As células alvo do FIPV são monócitos/macrófagos, que tem uma

afinidade específica pelo endotélio de veias no omento, pleura, serosa, meninges e

trato uveal, provavelmente por se localizarem em locais pelos quais o vírus tem

maior tropismo, que são o trato gastrointestinal, respiratório e sistema nervoso

central (SNC) (13,14), sendo necessários mais estudos a respeito. E, de forma

importante, estes macrófagos quando ativados, induzem a vasculite, efusões em

cavidade do corpo e lesões inflamatórias fibrinosa e granulomatosa (7,23-28).

Susceptibilidade

Todos os gatos domésticos são hipoteticamente susceptíveis à PIF,

independente da idade e gênero. Os filhotes são o grupo de gatos mais susceptíveis

a PIF (29). Esta maior ocorrência da doença em gatos jovens, além de idosos, está

relacionada a imunidade adaptativa e o seu papel protetivo e, em animais jovens, a

imunidade adaptativa é menos eficiente (30).

Além disso, também existe uma predisposição genética para desenvolvimento

da PIF, conforme já demonstrado em gatos da raça sagrado da birmânia, pêlo curto

britânico, devon rex e abissínio (29, 31, 32).

Distribuição

O FCoV é um vírus entérico e ubíquo, ou seja, ocorre no mundo todo

(4,5,13,20). Ocorre mais onde há condições de maior estresse e contato entre os

gatos, (4), ou seja, são agentes que comumente afetam gatos de abrigo (30). As

exceções são somente áreas isoladas, como as Ilhas Galápagos e Falkland (33).

Reservatório

As fontes de infecção do FCoV estão relacionadas a persistência subclínica

por mais de um ano, e gatos portadores infectados persistentemente, são

considerados reservatórios dos vírus (13).

14

Transmissão

O FCoV dissemina-se eficientemente pela via oro-fecal (13); o patógeno

infecta os gatos principalmente nas caixas de areia coletivas de gatis (4).

Morbidade e mortalidade

Sobre a morbidade da doença, sabe-se que cerca de 5 a 10% dos animais

positivos nos testes diagnósticos para FCoV desenvolvem PIF (20,34,35,36). A

mortalidade é de 100% (5).

Patogenia e Patologia

A PIF é uma doença viral imunomediada (13). De fato, a inflamação

granulomatosa e/ou piogranulomas em ambas as formas (seca ou úmida),

juntamente com linfopenia de células T, contribuem para a mortalidade dos gatos

com PIF. Na PIF, ocorre diminuição de linfócitos no sangue e nos linfonodos

(14,15,16), e a depleção linfoide tem sido a característica desta doença, sendo

induzida principalmente pela produção excessiva da citocina TNFα. Os macrófagos

de gatos infectados com FIPV aumentam a produção de TNF-α in vitro (22). O TNF-

α produzido pelos macrófagos infectados pelo FIPV é responsável pela indução de

apoptose de células T não infectadas, primariamente células TCD8+ in vitro, em

felinos (37). Além disso, ocorre aumento anormal da resposta imune inata, devido a

infecção de células, como monócitos e macrófagos (4). O FIPV se replica com maior

eficiência em macrófagos, ocorrendo deposição de imunocomplexos em diversos

órgãos, inclusive no SNC (17).

Os abrigos de gatos (gatis) favorecem o estresse, com a liberação de

mediadores imunossupressores, como a costicosterona, diminuindo a imunidade

inata e adaptativa, com neutropenia, monocitose, eosinopenia e linfopenia (20),

aumentando a susceptibilidade a PIF. Além disso, por ter havido mais contato, os

gatos podem ter sido infectados por outros agentes (18,19,21).

15

A patogenia da PIF é complexa e os sinais clínicos são associados à

replicação viral, que é geralmente secundária a algum evento imunossupressor. O

aumento da replicação viral resultou na emergência da variante vírus da peritonite

infecciosa felina (FIPV), que se replica com mais eficiência nos macrófagos (13).

Dentre os componentes estruturais do FIPV, a proteína espícula é considerada o

regulador para ligação e entrada do vírus na célula. Ela também está envolvida no

tropismo e virulência, assim como na mudança da doença entérica para PIF (22). Há

a teoria de que qualquer coronavirus felino (FCoV) possa causar a PIF (23-28).

Estudos recentes revelaram funções de muitas proteínas virais, bem como

diferentes especificidades de receptores para FCoV tipo I e tipo II. FECV e FIP

também possuem diferenças funcionais, uma vez que a replicação dos FECVs

ocorre principalmente no epitélio intestinal e são eliminados nas fezes, e os FIPVs

replicam-se nos monócitos/macrófagos. Além disso, os principais eventos na

patogenia da PIF são: infecção sistêmica com FIPV, replicação viral efetiva e

sustentável, e ativação de monócitos infectados. Adicionalmente, a genética do

hospedeiro e o sistema imunológico também desempenham papéis importantes.

Interessantemente, é a ativação de monócitos e macrófagos que ocasiona as

alterações anatomopatológicas características da PIF (7,23-28).

No desenvolvimento da PIF, formam-se piogranulomas em ambas as formas

(seca ou úmida) (13,14,38), com a aglomeração de imunocomplexos (FIPV e

anticorpos), que se depositam na parede dos vasos. Estes piogranulomas podem

ocorrer principalmente no baço, fígado, pulmões, olhos, linfonodos e SNC, e são

mais frequentemente encontrados nas serosas das vísceras abdominais (13). A

forma úmida da PIF é a mais comumente reportada, devido à observação do sinal

clínico de efusão peritoneal. A forma não efusiva está associada com resposta da

imunidade mediada por células (IMC), para diminuir a replicação viral através da

formação de um (pio)granuloma (39,40). Gatos com a forma seca da PIF tem uma

maior resposta imune pró-inflamatória, com importante participação da resposta da

IMC. Já em gatos com a apresentação da forma úmida, também foi identificado

envolvimento da resposta imune anti-inflamatória (41,42).

A PIF é uma doença viral imunomediada, por isso tem-se feito a abordagem

imunológica da doença. O conhecimento dos complexos papéis dos mediadores

16

inflamatórios na imunopatogenia ainda não foram completamente elucidados. O

vírus causa uma doença auto-limitante, embora esteja relacionada a magnitude ou

aumento da resposta imune. Os gatos com resposta imune robusta mediada por

células parecem ser mais resistentes à doença (43), ao contrário daqueles com

resposta adaptativa, com deposição de imunocomplexos e vasculite associada à

hipersensibilidade do tipo III (20). Isto leva a forma efusiva da doença, que é a mais

comum. A forma seca tem sido associada à resposta mediada por células no

indivíduo, com formação de (pio) granulomas, compostos principalmente por

macrófagos, linfócitos B e T, plasmócitos e neutrófilos (13,20,39,40).

Os mediadores inflamatórios são substâncias que facilitam a comunicação

entre as células, entre eles as citocinas, quimiocinas e metaloproteinases, que estão

relacionados à patogenia em doenças infecciosas. Por exemplo, a expressão

relativa de genes da quimiocina CXCL10 (proteína induzida por IFNγ 10) em células

infectadas de rim felino de Crandell-Reese (CRFK) aumentou cerca de 8,8 milhões

de vezes em 72 horas de infecção pelo vírus da PIF. A CXCL10 é secretada por

monócitos, macrófagos, células endoteliais e fibroblastos e atrai células T, NK e

dendríticas (20,44).

As infecções pelo Coronavírus não tem um marcador imune para distinguir

possíveis diferenças entre FECV e FIPV vírus antemortem, já que, de acordo com a

literatura, o Coronavírus sofre mutação da forma entérica para a

macrofágica/sistêmica. Quando o antígeno viral é fagocitado, ele é apresentado às

células “naïve“ (linfócitos), desencadeando a resposta adaptativa ao FIPV. Além

disso, o padrão de citocinas difere entre gatos assintomáticos e aqueles com PIF.

Em gatos infectados pelo FCoV sem sintomatologia, foi observado aumento de IL-10

no baço, o que sugere habilidade no controle da inflamação desencadeada pelos

macrófagos, ou seja, resposta anti-inflamatória (20,44). A depleção linfoide tem sido

a principal característica da PIF, e a resposta inflamatória é induzida principalmente

pela produção excessiva da citocina TNFα (20). Em contraste, embora as citocinas

pró-inflamatórias (IL-1β, IL-6 e IFNγ) tenham aumentado em gatos infectados

experimentalmente com FIPV, pode ser que haja proteção contra a PIF associada as

citocinas IFNγ e IL-1β, (20). Neste experimento (in vitro e in vivo), foi observado um

aumento de citocinas do tipo pró-inflamatórias, como IL-12/p40, que junto ao IFNγ,

foram associadas à diminuição de IL-4 no tecido linfoide (20). Além disso, um estudo

17

recente que utilizou a abordagem transcriptômica de células CRFK infectadas com

FIPV, mostrou que houve maior produção de outras citocinas pró-inflamatórias como

IL-6, TNFα e quimiocinas M1P1α e RANTES em casos clínicos de PIF (20). Ainda, o

mesmo estudo demonstrou que ao menos 96 transcrições gênicas (1) da resposta

imune (exemplos MX1, TRIM25), (2) da apoptose (por exemplo, TNFα) e (3) da

resposta inflamatória (por exemplo CXCL10, CCL-8 e CCL-17) aumentaram (20).

Por último, adicionalmente, como esperado, este estudo detectou alta expressão de

citocinas pró-inflamatórias e quimiocinas, principalmente GM-CSF, IFNγ, IL-8, KC,

RANTES e MCP1, as quais são secretadas principalmente por

monócitos/macrófagos. Portanto, em gatos o FIPV causa dano celular e tecidual,

com a participação de diferentes fatores de inflamação, como citocinas e

quimiocinas. Baseada na patogenia da PIF, o acúmulo de fluidos na cavidade

peritoneal destes gatos é mais provável que seja devido o acúmulo de macrófagos

infectados no espaço entre a parede dos vasos sanguíneos (39). Monócitos ativados

e infectados pelo FIPV podem induzir a flebite através de ação parácrina e autócrina

de CD18, IL-1β e TNFα (40). Adicionalmente, a maior secreção de fator de

crescimento endotelial vascular – (VEGF) foi associada ao incremento das efusões

abdominal e pleural em gatos com PIF (21).

Em trabalho experimental com células renais, ocorreu aumento de várias

citocinas inflamatórias e quimiocinas (19). A CXCL8 (IL-8), por exemplo, é um

potente quimiotático de neutrófilos, produzida por macrófagos (44,45). Isto indica

que além do tropismo, o FPIV causa dano celular ao órgão acometido.

Diagnóstico

Diagnóstico clínico da PIF

A PIF é uma doença de difícil diagnóstico clínico, e é fatal, sendo quase

impossível a prevenção em locais com muitos gatos (5, 7, 46, 47).

Os principais sinais clínicos da PIF são: febre persistente (flutuante), perda de

peso, letargia, dispneia, distensão abdominal (embora altamente variáveis devido a

refletirem o tecido afetado pela doença) (13). Além disso, sinais neurológicos (como

18

anisocoria) e uveíte, lesões granulomatosas (ao exame ultrassonográfico) e fluído

torácico e abdominal (ao exame ultrassonográfico e radiográfico) (17). O

envolvimento ocular é menos comum na forma puramente efusiva e a forma

neurológica pode ocorrer em combinação com a doença ocular ou cada

manifestação pode ocorrer de forma isolada (42). É uma vasculopatia com efusões

(acima de 80% dos casos), lesões com massas (seca) ou a combinação de ambas.

Os sinais de PIF também incluem anorexia, falha em ganhar peso em gatos jovens,

a pirexia não responde a antibióticos ou antiinflamatórios não-esteroidais, icterícia e

linfadenomegalia (33).

Até o presente momento, não existe um manejo efetivo da PIF no longo

prazo. O diagnóstico sensível e específico é muito importante, e o diagnóstico

antemortem é extremamente desafiante. Deve-se em primeiro lugar analisar a

efusão de um gato com suspeita de PIF, porque é um método minimamente invasivo

e muito mais sensível que os testes de sangue. Nos gatos sem efusão, que vieram

de gatis, devem ser considerados alguns parâmetros, como o histórico, sinais

clínicos, alterações laboratoriais e a titulação de anticorpos, para auxiliar na tomada

de decisão sobre métodos mais invasivos para confirmação do diagnóstico etiológico

(17). Adicionalmente, recomenda-se que os gatos sejam testados para possíveis

coinfecções com outros vírus, como o vírus da imunodeficiência felina (FIV) e o vírus

da leucemia felina (FeLV), através da sorologia com o uso de testes diagnósticos

rápidos (IDEXX Labs., USA) (20).

Diagnóstico Laboratorial da PIF

Exame antemortem e post-mortem: microscópico, macroscópico,

diagnóstico por imagem e biologia molecular

Antemortem

Diversas metodologias de laboratório podem ser utilizadas para a detecção do

Coronavírus felino em gatos. Os tecidos apropriados para colheita e diagnóstico

variam de acordo com os sinais clínicos de cada gato, podendo ser utilizados desde

a citologia até o diagnóstico por imagem (37,48,49). As efusões podem ser

19

constatadas por técnicas relativamente fáceis e minimamente invasivas. Das

amostras de sangue, podem ser usados sangue total, plasma ou soro (50). Estes

incluem imagem de ressonância magnética, em animais com sinais clínicos

neurológicos. Além disso, a reação em cadeia de polimerase (ou biologia molecular)

pela transcriptase reversa (RT-PCR) para o FCoV pode ser feita em amostras de

tecido, efusão, sangue, líquido cérebro espinhal - LCE (37,51) e humor aquoso para

detecção do FPIV (33).

Ainda, sugere-se que a RT-PCR possa ser utilizada como teste adicional em

gatos com sinais neurológicos, e o resultado positivo suporta o diagnóstico de PIF.

Esta última pode ser realizada em amostras de tecido lesionado, como fígado, rins

ou linfonodos mesentéricos, que podem ser colhidos por biópsia percutânea guiada

por ultrassom. Reação de cadeia em polimerase pela transcriptase reversa

quantitativa (RT-qPCR, em inglês) pode ser feita em amostras de tecido embebido

em parafina (33,52).

Adicionalmente, a imuno-citoquímica é uma metodologia recomendada para o

diagnóstico antemortem da PIF em gatos com efusões (53).

Postmortem

Recomenda-se a necrópsia, histopatologia, imuno-histoquímica (IHC). A RT-

qPCR só é recomendada se o animal for necropsiado algumas horas após o óbito,

pois o FIPV pode morrer com a autólise do corpo do gato, gerando um resultado

falso negativo (33,54).

Biologia molecular

Os métodos mais recomendados para o diagnóstico etiológico da PIF são os

testes de biologia molecular. Em amostras de gatos com PIF, a biologia molecular se

mostrou altamente sensível e específica para confirmação da doença (22,24).

Quando possível, o uso complementar da IHC permite maior sensibilidade no

diagnóstico (52), principalmente quando o RT-qPCR for negativo, mesmo com

anatomopatologia característica da PIF (47). Além disso, devido as constantes

mutações dos Coronavírus, em casos onde o resultado para a RT-qPCR for negativo

20

para FIPV, recomenda-se o uso de outros pares de oligonucleotídeos e sondas para

detecção do FIPV em gatos (55,56). As alternativas aos testes que precisam de

ciclos de temperatura são os métodos isotérmicos (57).

Tratamentos

As principais substâncias utilizadas na terapia contra o FCoV, antivirais são:

ribavirina, um análogo de nucleosídeo (58), neste tratamento os animais morreram

de PIF; melfalan junto com predinisona, amplicilina e estreptoquinase em que o

animal respondeu bem, morrendo 9 meses após, por doença mieloproliferativa. Além

disso, já se utilizou: IFNα, e IFNβ felino não reduzindo a mortalidade, IFNα em

combinação com Propionibacterium acnes prolongou significativamente a média de

tempo de sobrevivência e por fim IFN ω felino, que pode ser usado por longos

períodos (IFN é espécie-específico), com resultados promissores em ensaio não

controlado. Para diminuir a inflamação (moduladores imunológicos) se utilizam a

tilosina junto com a prednisolona, tendo o gato sobrevivido até 210 dias. Além disso,

gatos que receberam ampicilina, prednisolona e ciclofosfamida ou dexametasona e

ampicilina ou IFNα humano ou um indutor de paraimunidade, puderam sobreviver 3

anos (de 29 a 80%) dependendo de qual combinação de tratamentos (17). Apesar

dos recentes avanços com relação ao tratamento da PIF com antivirais, o FPIV pode

causar a encefalite, porém, até o presente momento, os tratamentos de gatos não

foram eficazes para eliminar o vírus do SNC, como por exemplo, o inibidor de

protease tipo 3C (59).

1.1.5 PIF x Resposta imune

Os vertebrados têm as duas maiores defesas contra patógenos: a imunidade

inata e a adaptativa. A imunidade inata é composta por inúmeros fatores humorais

circulantes no sangue, como as citocinas, quimiocinas e complemento, e uma

variedade de leucócitos, incluindo macrófagos, neutrófilos e células matadoras

naturais (Natural Killer, em inglês, NK), assim a resposta é rápida e diversa, o que é

considerado em geral vantajoso (60).

21

Os receptores “Toll-like” (TLRs) são receptores da imunidade inata capazes

de reconhecer a infecção viral e induzir a produção de interferons (IFNs) do tipo I,

além de outras citocinas e quimiocinas. O reconhecimento viral pelos TLRs e outros

receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) são específicos para diferentes

linhagens celulares. Os TLRs tem papel chave na ligação entre a imunidade inata e

a imunidade adaptativa (60). As células dendríticas (CDs) são a ligação crítica entre

a imunidade inata e a imunidade adaptativa. Elas apresentam os antígenos aos

linfócitos TCD4+, ação necessária ao reconhecimento de antígenos e essencial para

a resposta imune adaptativa. As CDs são ativadas pelos TLRs. Quando a infecção

ocorre pela primeira vez, estima-se que um em cada 100 mil linfócitos T citotóxicos -

CTLs - reconheça e responda ao antígeno viral (60). Como isto ocorre em outras

infecções, sugere-se que ocorra com o FIPV.

Na SARS, o TLR3 reconhece padrões moleculares associados a patógenos

virais e inicia programas de sinalização antivirais de IFNs, citocinas, e quimiocinas. A

sinalização dos TLRs leva a ativação de Interferons tipo I (α e β), citocinas pró-

inflamatórias (IL-6, TNF, IFN- γ, e CCL5), e genes estimulados por Interferon (ISGs)

na infecção pelo Coronavirus da SARS - SARS-CoV (61).

A MAPK p38 é uma família de proteínas componentes de vias de sinalização

internas, que respondem a estímulos externos às células. Um estudo sobre esta

família de proteínas identificou que células infectadas com o FCoV aumentam a

produção de mediadores inflamatórios, como o TNFα (38). Além disso, perfil de

resposta imune pró-inflamatória é teoricamente protetivo contra a PIF (62). O IFN-γ é

um dos principais mediadores inflamatórios da resposta mediada por células (63). O

IFN-γ induz quimiotaxia e resposta pró-inflamatória, com consequente aumento da

resposta imune citotóxica devido à ativação dos macrófagos e células T CD8+. Esta

ativação protege o hospedeiro do desenvolvimento da doença ou até mesmo da

infecção de novos gatos (63,64).

22

1.1.6 PIF x Imunidade humoral

Na PIF, a imunidade humoral parece aumentar a severidade da doença, isso

geralmente ocorre quando há uma depressão da resposta mediada por células, e os

gatos desenvolvem a forma efusiva da doença (65).

23

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30

2 Capítulo 2

2.1 Diagnóstico e caracterização anatomopatológica da peritonite infecciosa

felina em gatos.

2.1.1 Resumo

A peritonite infecciosa felina (PIF) é uma doença severa e imunomediada, sem

tratamento eficaz até o presente momento, e causada pelo Coronavirus felino

(FIPV). Causa vasculite imunomediada, hepatite, nefrite, meningoencefalite,

serosite, uveíte, pericardite, linfoadenite, esplenite e pneumonia. Quando há

suspeita de PIF, as amostras de tecidos devem ser colhidas para exame

histopatológico. A metodologia imuno-histoquímica (IHQ) pode ser utilizada para

diagnóstico etiológico post-mortem em amostras de tecido, localizando os antígenos

do FIPV, associados às lesões inflamatórias. O objetivo deste trabalho foi realizar a

caracterização anatomopatológica e diagnóstico da PIF em gatos. Foram incluídos

no estudo 12 gatos, que vieram a óbito. Os animais foram submetidos à necropsia,

avaliação histopatológica e IHQ para FIPV. Foram observadas lesões

anatomopatológicas características de PIF, principalmente no fígado (92%), pulmões

(75%), intestinos (75%), linfonodos mesentéricos (67%), rins (58%), baço (58%),

pâncreas (58%), encéfalo (58%) olhos (50%), e coração (8%) dos gatos. Na

histopatologia, foi observado infiltrado inflamatório misto, composto por macrófagos,

linfócitos, plasmócitos e neutrófilos, multifocal, com intensidade variada, por vezes

associados à necrose e exsudato fibrinoso em diferentes órgãos e sistemas. Neste

trabalho, a IHQ demonstrou associação das lesões anatomopatológicas com a

marcação do FIPV. O diagnóstico da PIF tem sido negligenciado no Brasil. Portanto,

estudos que identifiquem a doença são fundamentais para a qualidade do serviço

Médico Veterinário no Brasil.

Palavras chave: PIF, gatos, anatomopatologia, diagnóstico, IHQ

31

2.1.2 Abstract

Feline Infectious Peritonits (FIP) is a severe and immunomediated disease, without

an effective treatment to date, caused by Feline coronavirus (FIPV). It causes

immune-mediated vasculitis, hepatitis, nephritis, meningoencephalitis, serositis,

uveitis, pericarditis, lymphadenitis, splenitis and pneumonia. When FIP is suspected,

tissue samples should be collected for histopathological examination.

Immunohistochemistry (IHC) is recommended for post-mortem etiological diagnosis

from tissue samples, locating the FIPV antigens associated with inflammatory

lesions. The objective of this work was the anatomopathological analysis and

diagnosis of FIP in cats. The study included 12 cats that died naturally. The animals

were submitted to necropsy, histopathological evaluation and IHC for FIPV. The

anatomopathological lesions in the animals of the present study were characteristic

of PIF, mainly in the liver (92%), lungs (75%), intestines (75%), mesenteric lymph

nodes (67%), kidneys (58%), spleen (58%), pancreas (58%), brain (58%), eyes

(50%), and heart (8%) of the cats. Hitopathology showed a mixed inflammatory

infiltrate, composed mainly by macrophages, lymphocytes, plasmocytes and

neutrophils, with varying intensity, sometimes associated with necrosis and fibrinous

exudate in different organ and systems. In the present study, IHC showed an

association of anatomopatological lesions with FIPV immunolabeling. The diagnosis

of FIP has been neglected, and therefore, studies that identify the disease are

fundamental to the quality of the veterinary medical service in Brazil.

Key words: PIF, cats, anatomopathology, diagnosis, IHC

32

2.1.3 Introdução

A PIF é uma doença severa e imunomediada, sem tratamento até o presente

momento (1). Esta doença ocorre em felídeos domésticos e selvagens (2,3). Além

disso, é uma doença causada pelo Coronavirus felino (cepa FIPV), que causa

vasculite imunomediada, hepatite, nefrite, meningoencefalite, serosite, uveíte,

pericardite, linfoadenite, esplenite e pneumonia (1,4).

Após a eutanásia de animais com suspeita de PIF, na necrópsia, as amostras

de tecidos devem ser colhidas para exame histopatológico (5).

A imuno-histoquímica (IHC, do inglês) é útil para marcar o Coronavirus em

mamíferos (5,6,7). A IHC pode ser utilizada para o diagnóstico etiológico post-

mortem em amostras de tecido. Através dela, se faz a detecção do complexo

antígeno-anticorpo (5,8), podendo ser realizada em tecido fixado em formalina. Esta

técnica permite visualizar os antígenos do FIPV, associados às lesões inflamatórias

(5).

No Brasil, o diagnóstico da PIF tem sido negligenciado, portanto, estudos que

identifiquem a doença são fundamentais para o avanço da qualidade do serviço

médico veterinário no Brasil e consequente saúde dos gatos (9,10,11). Logo, o

objetivo deste trabalho foi diagnosticar a PIF em gatos da cidade de São Paulo,

através da realização da necropsia (análise macroscópica), avaliação

histopatológica, e identificação do FIPV, utilizando a IHC, com a finalidade de

localizar e categorizar as alterações anatomopatológicas, e correlacionar as lesões

com a marcação para o FIPV.

33

2.1.4 Métodos

Animais e amostras de material biológico

Foram incluídos neste estudo 12 gatos, que vieram de abrigos, da cidade de

São Paulo, SP, Brasil (protocolo de Aprovação da Comissão de Ética no Uso de

Animais – CEUA da Universidade Paulista – UNIP sob número: 035/18). Os animais

foram recebidos congelados ou refrigerados, para posterior realização da necropsia.

Necrópsia

Os animais foram submetidos à necrópsia de rotina com documentação

fotográfica para avaliação das alterações macroscópicas e colheita de material.

Foram descritas as lesões macroscópicas e microscópicas em todos os

órgãos com alterações, como fígado, rins, pulmões, baço, coração, intestinos

delgado e grosso, pâncreas, encéfalo e olhos. Estes foram colhidos, submergidos e

fixados em formol 10% tamponado por até 48 horas.

Microscopia

Histopatológico

As seções fixadas em formol foram processadas rotineiramente, diafanizadas,

e incluídas em blocos de parafina. Posteriormente, foram realizados cortes de 4 µm

dos tecidos, que foram em seguida corados pela coloração Hematoxilina Eosina

(HE).

O exame histopatológico permitiu a classificação das lesões segundo a

intensidade do infiltrado inflamatório, cada uma das seções (12) e realização do

diagnóstico morfológico.

34

Imuno-histoquímica

Foi executada a IHC para identificação ou localização do complexo antígeno -

anticorpo (5), com a finalidade de localizar o Coronavirus felino nos tecidos com

lesões (5,7,8).

Foram realizados cortes de 4 µm de tecidos com lesões microscópicas. A IHC

foi realizada através da incubação com anticorpo (Ac) primário monoclonal anti-FIPV

de camundongo (anticorpo monoclonal contra Pan-Coronavirus (FIPV3-70,

Thermofisher Scientific, Cat. No. MA1-82189). As secções foram desparafinizadas

em xilol. A recuperação antigênica foi efetuada com tampão citrato pH 6,0 em panela

à vapor por 15 minutos. Para inibir a peroxidase endógena, as seções foram

incubadas com peróxido de hidrogênio a 3% por 10 minutos duas vezes e lavadas

três vezes com PBS 1x pH 7,4. Os anticorpos primários contra o FIPV (1:100) foram

incubados pelo período de 18-20h a 4ºC. As seções foram lavadas três vezes em

PBS 1x pH 7,4, incubadas com o anticorpo secundário produzido em coelho anti-

camundongo, ligado ao polímero e a peroxidase (kit de detecção de polímero

Superpicture™, HRP, ThermoFisher Scientific, Número de catálogo 878963;

ImmPRESS™ Universal Reagent Anti-Mouse/Rabbit IgG, Vector Laboratories,

Peroxidase, Número de catálogo MP-7500) por 10 minutos em câmara úmida. A

reação foi revelada com a diaminobenzidina (DAB, DAKO, Denmark). Os cortes

foram corados com hematoxilina de Harris, e montadas com cola Entelam®. Para

controle interno da IHC, os mesmos tecidos que foram incubados com o anticorpo

primário também foram incubados com solução PBS 1x pH 7,4. Além disso, cortes

histológicos de tecidos de gatos sem lesões microscópicas também foram incluídos

e incubados com o anticorpo primário. Por último, todas as lâminas foram

examinadas pela microscopia de luz em microscópio e fotografadas (Nikon Eclipse

E200) nas objetivas de 4x, 10x, 20x e 40x.

35

2.1.5 Resultados

2.1.5.1 - Necrópsia

Os resultados de anatomopatologia, tanto da macroscopia quanto da

microscopia e IHC, mais significativos e representativos, estão nas figuras e tabelas

a seguir.

Figura 2 – Macroscopia do fígado de gato (animal nº. 8). Legenda. Figura 2 – Gato 8. Fígado, aumento de volume, com bordos arredondados e superfície capsular recoberta com exsudato fibrinoso difuso.

36

Figura 3 – Macroscopia dos linfonodos mesentéricos de gato (animal nº. 1).

Legenda. Figura 3 – Gato 1. Cadeia de linfonodos mesentéricos, com linfadenomegalia (centro em destaque medindo 3,0x1,5cm), associada a nódulos esbranquiçados multifocais na cápsula, além de edema difuso do mesentério. Figura 4 – Macroscopia dos rins de gato (animal nº. 4).

Legenda. Figura 4 – Gato 4. Rins. A: Superfície subcapsular. Nódulos macios, esbranquiçados e glomerulonefrite intersticial. B: superfície de corte: nódulos macios, esbranquiçados por vezes coalescentes, multifocais no córtex e medula.

37

Figura 5 – Macroscopia do baço de gato (animal nº. 2).

Legenda. Figura 5 – Gato 2. Baço. Superfície subcapsular. Nódulos multifocais. Nódulo multifocal medindo cerca de 1 cm de diâmetro (seta).

Figura 6 – Macroscopia dos intestinos de gato (animal nº. 3). Legenda. Figura 6 – Gato 3, enterite. Intestinos. Granulomas multifocais branco-bege (setas), friáveis, distribuídas por toda a serosa intestinal e associadas a maior evidenciação dos vasos sanguíneos.

38

Figura 7 – Macroscopia do pâncreas de gato (animal nº. 2). Legenda. Figura 7 – Gato 2. Pâncreas, pancreatite multifocal. Observam-se nódulos branco-bege (setas), macios, multifocais. Na microscopia foram observados piogranulomas e necrose. Figura 8 – Macroscopia do encéfalo de gato (animal nº. 9). Legenda. Figura 8 – Gato 9. Encéfalo, meningite. Hiperemia, difusa. Na microscopia foi constatada meningite mononuclear multifocal.

39

Figura 9 – Macroscopia dos olhos de gato (animal nº. 9). Legenda. Figura 9 – Gato 9. Olho. Uveíte difusa e acentuada no olho direito.

2.1.5.1 – Microscopia - Histopatológico e IHC para FIPV

40

A Tabela 1 resume os principais achados macroscópicos dos gatos necropsiados.

Nesta pesquisa foram realizados exames histopatológicos de 12 gatos com alterações anatomopatológicas compatíveis com

PIF. Foram selecionados órgãos com (pio) granulomas, que são as principais lesões que ocorrem na PIF (13,14,15,16)

Tabela 1. Resumo dos órgãos com lesões macroscópicas dos gatos necropsiados, com o total e porcentagem das lesões sugestivas de PIF.

Órgãos Fígado Rins Pulmões

Linfonodos

mesentéricos Intestinos Pâncreas Coração Encéfalo Olhos Baço

Gato 1 + + + - - - - - - -

Gato 2 + + + - + - + - - +

Gato 3 - - - - - - - - - -

Gato 4 - - - - - - - - - -

Gato 5 - - - - - - - - - -

Gato 6 - - - - - - - - - -

Gato 7 + - - + + - - - - +

Gato 8 + - - + + - - - + +

Gato 9 - - - - - - - + + -

Gato 10 + - - + + - - - - +

Gato 11 + - + - - - - - - -

Gato 12 - + - + - - - - - +

Total 6 3 3 4 4 0 1 1 2 5

% 50 25 25 33 33 0 8 8 17 42

41

As lesões anatomopatológicas nos animais do presente estudo foram

características, o que sugeriu que o animal estivesse com a PIF. A IHC confirmou a

doença PIF. Os resultados representativos do estudo estão ilustrados nas figuras a

seguir:

Figura 10 – Microscopia e IHC para FIPV do rim de gato.

Legenda. Figura 10 – Gato, rins. A, B, C (1) observar piogranulomas e infiltrado inflamatório misto, predominantemente linfoplasmocitário acentuado, por vezes associado à necrose com fibrina (setas), em glomérulos e interstício, em córtex e medula. Distribuição: multifocal. A1: microscopia 40 x, B1: microscopia 100 x e C1: microscopia 400 x. HE. A, B, C (2) Imuno-histoquímica para FIPV, positividade multifocal na cor marrom (cabeças de seta) no citoplasma de macrófagos, bem com nas áreas de inflamação, degeneração e necrose adjacentes. Complexo peroxidase com DAB, e hematoxilina d e Harry´s. A2: microscopia x40, B2: microscopia x100 e C2: microscopia x400.

42

Figura 11 – Microscopia e IHC para FIPV do intestinos delgado e grosso de gato.

Legenda. Figura 11 – Gato, intestino. A, B, C (1) Observar piogranulomas e infiltrado inflamatório misto, predominantemente linfoplasmocitário (setas), multifocal e acentuado, por vezes associado à necrose na serosa, com fibrina. A1: microscopia 40 x, B1: microscopia 100 x e C1: microscopia 400 x. HE. A, B, C (2) Imuno-histoquímica para FIPV, positividade multifocal na cor marrom (cabeças de seta) no citoplasma de macrófagos, bem com nas áreas de inflamação, degeneração e necrose adjacentes. Complexo peroxidase com DAB, e hematoxilina de Harry´s. A2: microscopia x40, B2: microscopia x100 e C2: microscopia x400.

C2

43

Figura 12 – Microscopia e IHC para FIPV do linfonodo de gato.

Legenda. Figura 12 – Gato, linfonodo. A, B, C (1) Observar piogranulomas e infiltrado inflamatório misto, predominantemente linfoplasmocitário (setas), difuso e acentuado, por vezes associado à necrose, com fibrina na cápsula. A1: microscopia 40 x, B1: microscopia 100 x e C1: microscopia 400 x. HE. A, B, C (2) Imuno-histoquímica para FIPV, positividade multifocal na cor marrom (cabeças de seta) no citoplasma de macrófagos, bem com nas áreas de inflamação, degeneração e necrose adjacentes. Complexo peroxidase com DAB, e hematoxilina de Harry´s. A2: microscopia x40, B2: microscopia x100 e C2: microscopia x400.

C2

44

Figura 13 – Microscopia e IHC para FIPV dos pulmões de gato.

Legenda. Figura 13 – Gato, pulmões. A, B, C (1) Observar piogranulomas e infiltrado inflamatório misto, predominantemente linfoplasmocitário, multifocal acentuado em brônquios, bronquíolos, parênquima e pleura (setas). A1: microscopia 40 x, B1: microscopia 100 x e C1: microscopia 400 x. HE. A, B, C (2) Imuno-histoquímica para FIPV, positividade multifocal na cor marrom (cabeças de seta) no citoplasma de macrófagos, bem com nas áreas de inflamação, degeneração e necrose adjacentes. Complexo peroxidase com DAB, e hematoxilina de Harry´s. A2: microscopia x40, B2: microscopia x100 e C2: microscopia x400.

C2

45

Figura 14 – Microscopia e IHC para FIPV do fígado de gato.

Legenda. Figura 14 – Gato, fígado. A, B, C (1) Observar piogranulomas e infiltrado inflamatório misto, predominantemente linfoplasmocitário, multifocal, acentuado (setas). A1: microscopia 40 x, B1: microscopia 100 x e C1: microscopia 400 x. HE. A, B, C (2) Imuno-histoquímica para FIPV, positividade multifocal na cor marrom (cabeças de seta) no citoplasma de macrófagos, bem com nas áreas de inflamação, degeneração e necrose adjacentes. Complexo peroxidase com DAB, e hematoxilina de Harry´s. A2: microscopia x40, B2: microscopia x100 e C2: microscopia x400. Animal com diagnóstico morfológico de colangiohepatite piogranulomatosa, multifocal acentuada.

C2

46

Figura 15 – Microscopia e IHC para FIPV da medula espinhal de gato.

Legenda. Figura 15 – Gato, medula espinhal. A, B, C (1) Observar piogranulomas e infiltrado inflamatório misto, predominantemente linfoplasmocitário, multifocal, acentuado associado a necrose e com fibrina (setas). A1: microscopia 40 x, B1: microscopia 100 x e C1: microscopia 400 x. HE. A, B, C (2) Imuno-histoquímica para FIPV, positividade multifocal na cor marrom (cabeças de seta) no citoplasma de macrófagos (seta), bem com nas áreas de inflamação, degeneração e necrose adjacentes. Complexo peroxidase com DAB, e hematoxilina de Harry´s. A2: microscopia x40, B2: microscopia x100 e C2: microscopia x400. Animal com diagnóstico morfológico de mengite piogranulomatosa, multifocal acentuada.

47

Figura 16 – Microscopia e IHC para FIPV do pâncreas de gato.

Legenda. Figura 16 – Gato, pâncreas. A, B, C (1) Observar piogranulomas e infiltrado inflamatório predominantemente mononuclear, multifocal, acentuado associado a necrose e com fibrina (setas). A1: microscopia 40 x, B1: microscopia 100 x e C1: microscopia 400 x. HE. A, B, C (2) Imuno-histoquímica para FIPV, positividade multifocal na cor marrom (cabeças de seta) no citoplasma de macrófagos, bem com nas áreas de inflamação, degeneração e necrose adjacentes. Complexo peroxidase com DAB, e hematoxilina de Harry´s. A2: microscopia x40, B2: microscopia x100 e C2: microscopia x400. Animal com diagnóstico morfológico de pancreatite necrosante, multifocal acentuada.

48

A tabela 2 resume os principais achados microscópicos.

Tabela 2. Resumo dos órgãos com lesões microscópicas dos gatos necropsiados, com o total e porcentagem das lesões sugestivas de PIF.

Órgãos Fígado Rins Pulmões Linfonodos Intestinos Pâncreas Coração Encéfalo Olhos Baço

Gato 1 + + + + - - - + + -

Gato 2 + - + + + + + + - +

Gato 3 + + - + + - - + - +

Gato 4 + + + - + + - + + +

Gato 5 + + + - + + - + + +

Gato 6 + + + + + - - - + -

Gato 7 + + + + + + - - - +

Gato 8 + - + + + + - - - +

Gato 9 - - - - - - - + + -

Gato 10 + - - + + + - + + +

Gato 11 + - + - - - - - - -

Gato 12 + + + + + + - - - -

Total 11 7 9 8 9 7 1 7 6 7

% 92 58 75 67 75 58 8 58 50 58

49

A tabela 3 resume os principais achados de IHQ.

Tabela 3. Tabela relacionando os gatos aos órgãos com lesões microscópicas que foram selecionados para a IHC e foram positivos para o FIPV na imuno-

histoquímica.

Órgãos Fígado Rins Pulmões Linfonodos Intestinos Pâncreas Coração Encéfalo Olhos Baço

Gato 1 - + + + - - - - - -

Gato 2 - - + - - - + - - +

Gato 3 - + - - - - - - - -

Gato 4 - - + - - - - - - -

Gato 5 + - - - - - - - - -

Gato 6 - + - + - - - - - -

Gato 7 - - - - + - - - - -

Gato 8 - - - - + + - - - -

Gato 9 - - - - - - - - + -

Gato 10 + - - - + - - - - -

Gato 11 - - + - - - - - - -

Gato 12 - - + - - - - - - -

- = Não foi realizada IHQ.

50

2.1.6 Discussão

Foram examinados macroscopicamente e microscopicamente 12 gatos, a fim

de confirmar o diagnóstico etiológico e descrever as lesões anatomopatológicas. Os

resultados confirmaram a infecção pelo FIPV nos animais que apresentaram lesões

macroscópicas e microscópicas, através da análise histopatológica e de IHC (5,7,8).

Neste estudo, os animais também apresentaram vasculite, e pode ser que estes

desenvolveram sinais de acordo com (1) órgão-alvo afetado por estas lesões

piogranulomatosas e (2) vasculite, que pode causar ascite e efusão torácica (17).

Os gatos eram provenientes de abrigos, o que corrobora com a hipótese da

superpopulação de felinos favorecer a disseminação do FCoV, aumentando a

susceptibilidade no desenvolvimento da PIF (18).

Com relação ao processo inflamatório na PIF, a citocina TNFα já foi

evidenciada como importante e associada à inflamação no fígado (18), pâncreas

(19), nos linfonodos mesentéricos, baço (20) e no SNC (21).

A linfopenia é provavelmente a resposta leucocitária mais comum à maioria

das doenças sistêmicas. O estresse fisiológico é uma resposta do corpo mediada

pela liberação de hormônio adrenocorticotrófico pela glândula pituitária (hipófise),

que resulta na liberação de cortisol pela glândula adrenal. Isso ocorre em resposta à

maioria das condições como a doença inflamatória, com alterações nos vários tipos

celulares (22). Sugere-se que ocorra na PIF, doença inflamatória causada pelo

FIPV.

No presente estudo, em 92% dos gatos houve lesões no fígado, sendo o

órgão mais acometido. Observou-se hepatite multifocal, predominantemente

linfoplasmocitária, por vezes associada à deposição de fibrina e necrose,

principalmente na cápsula e tríade portal. Outros achados microscópicos incluíram

colangite linfoplasmocitária, colangio-hepatite e peri-hepatite. Estes achados

microscópicos estão de acordo com a literatura cientifica da PIF (17,23,24,25,26).

Nos gatos com icterícia, o FIPV provavelmente induza a hiperbilirrubinemia,

diminuindo o transporte transmembrana, o metabolismo e excreção de bilirrubinas

no sistema biliar e a necrose hepática por hipóxia (causada por anemia severa e

efusões) (18,26). Quando ocorre inflamação no fígado, a PIF é fatal ou o prognóstico

51

é pobre (27,28). Com relação à hepatite, podem ser considerados os seguintes

diagnósticos diferenciais: toxoplasmose (Toxoplasma gondii), colangite linfocítica

(com efusão abdominal e às vezes há icterícia) (5) icterícia hepática causada por

linfoma hepático, e lipidose ou necrose hepática focal, devido a infecção pelo

FeLV.(29)

Nos intestinos, delgado e grosso, foram observadas alterações

anatomopatológicas em 75% dos gatos. Na maioria dos casos, na camada serosa,

observou-se serosite mista, focalmente extensiva e multifocal, acentuada associada

ao exsudato fibrinoso. Os achados anatomopatológicos estão de acordo com

estudos anteriores, com formação de piogranulomas perivasculares em vários

órgãos (4,23,24,30). As inflamações nos intestinos são predominantemente

linfoplasmocitárias, porém podem também ser piogranulomatosas, associadas às

efusões multicavitárias e polisserosite fibrinosa (26).

Nos pulmões dos gatos do presente estudo (75% dos gatos), observou-se

pneumonia, broncopneumonia e pleurite piogranulomatosa multifocal, concordando

com estudos anteriores (4,30). Os alvéolos pulmonares são compostos pela lamina

basal, células endoteliais e pelos pneumócitos tipo I (43). O FIPV, assim como

outros Coronavirus, são agentes epiteliotrópicos, que infectam os pulmões,

estimulando a produção de fatores de inflamação, como VEGF, em diferentes

órgãos e sistemas, incluindo os pulmões (15,44,45). A tuberculose é uma das

doenças consideradas no diagnóstico diferencial da pneumonia na PIF, e é causada

pelo Mycobacterium tuberculosis. Nas infecções com micobactérias, os gatos

apresentam lnfoadenopatia, sinais respiratórios e/ou uveíte, feridas, podem ficar

relativamente bem até um episódio de dispneia, por exemplo. Além disso, as

micobactérias afetam o parênquima pulmonar, diferentemente da PIF onde há

efusões pleurais. No diagnóstico da PIF, nota-se severa hiperglobulinemia ou razão

albumina:globulina reduzida e nas infecções por micobacteriais isso geralmente não

ocorre (5). Com relação à pneumonia, podem ser considerados os seguintes

diagnósticos diferenciais: toxoplasmose (Toxoplasma gondii), piotórax

(possivelmente bacteriano) (5) e pneumonia (infecções secundárias) em gatos

infectados por FeLV (29).

Foram observadas lesões em 67% dos linfonodos mesentéricos dos gatos,

apresentando depleção linfoide e linfopenia, provavelmente associados aos

52

macrófagos infectados, que leva a apoptose das células T (20), assim como

linfoadenite linfoplasmocitária multifocal acentuada. Estes achados microscópicos

estão de acordo com a literatura cientifica (17,23,24,25,26).

Os rins foram acometidos em 58% dos casos. Nos rins, na maioria dos casos

foi observado infiltrado inflamatório predominantemente linfoplasmocitário, por vezes

associado à necrose, exsudato fibrinoso, multifocal e acentuado. O diagnóstico

morfológico de glomerulonefrite piogranulomatosa multifocal corrobora com a

literatura científica (1,4,17,18,23,24). O Coronavírus felino (FIPV) infecta células

renais de gato, ocorrendo significativa modulação na expressão de citocinas (23). A

glomerulopatia pode ter ocorrido devido à deposição de imunocomplexos. A

estimulação de células B pela interleucina 6, produzida na PIF pode ser que

contribua para o aumento de γ-globulinas (28). Além disso, relaciona-se a formação

de complexos em presença do FIPV e anticorpos, que se depositam seletivamente

na membrana basal dos capilares glomerulares, estimulando a fixação de

complemento. A continuidade das lesões ocorre com a infiltração de monócitos nos

glomérulos (31).

No presente estudo, verificamos presença de linfócitos B nas lesões

microscópicas de inflamação mista dos gatos diagnosticados com PIF. Sabe-se que

a citocina IL-1 é produzida por linfócitos B, e provavelmente a partir da chegada do

antígeno do FIPV no linfonodo haja estímulo destas células B, que se diferenciam

em plasmócitos, produzindo IL-1. Essa citocina induz a febre, liberação de

histamina, vasodilatação e inflamação local (22), ou seja, tem consequências em

diferentes sistemas. Além disso, TNFα e IL-17, as quimiocinas CXCL1, CXCL2,

CXCL5 e a deposição de imunocomplexos induzem, conjuntamente, a infiltração de

monócitos, linfócitos e neutrófilos, pois induzem a vasodilatação e aumentam a

permeabilidade vascular (32).

No presente estudo, foram encontradas lesões microscópicas no pâncreas

em 58% dos casos, com diagnóstico morfológico de pancreatite piogranulomatosa. A

histopatologia é o padrão-ouro para o diagnóstico de pancreatite (19). Como o FIPV

se espalha sistemicamente, formam-se complexos antígeno-anticorpo no endotélio

dos pequenos vasos. Subsequentemente, ocorre edema e necrose. Na forma

efusiva, a inflamação granulomatosa é comum em serosa de vísceras abdominais

(órgãos parenquimatosos), como o pâncreas (7,17,18,23,25). De fato, a pancreatite

53

é uma consequência da infecção pelo FIPV em gatos e furões (33,34). Além disso, a

pancreatite aguda resulta da liberação e ativação inadequada de enzimas

pancreáticas que destroem o tecido pancreático e estimula uma reação inflamatória

aguda, e lesão reversível (35).

Nos gatos, mesmo a pancreatite leve pode levar a resposta inflamatória

sistêmica, associada ao FIPV, provavelmente a causa primária seja a ativação de

neutrófilos e a liberação de citocinas (19), (p. ex., fator de ativação plaquetária, óxido

nítrico) liberadas sistemicamente (19). Em envolvimento pancreático, podem ser

considerados os seguintes diagnósticos diferenciais: toxoplasmose (Toxoplasma

gondii) (5), parasitose por trematódeo (família Opisthorchidae e Dicrocoelidae) (36),

Hipertrigliceridemia, Dieta, trauma e causa idiopática (90%) (19)

Foram observadas lesões do baço em 58% dos casos, principalmente

esplenomegalia, e exsudato fibrinoso na cápsula, com diagnóstico morfológico de

esplenite linfoplasmocitária, com depleção linfoide. Estes achados microscópicos

estão de acordo com a literatura cientifica (17,23,24,25,26). Estes achados podem

estar associados, dentre outros, aos macrófagos infectados, que levando à apoptose

das células T (20). Com relação a esplenite e periesplenite, podem ser considerados

os seguintes diagnósticos diferenciais: toxoplasmose (Toxoplasma gondii) (5). Além

disso, aspergilose (Aspergillus spp.), leishmaniose (Leishmania spp.) e peritonite

pós-cirúrgica (periesplenite) (37).

No encéfalo (58%), observou-se meningoencefalite, multifocal e acentuada,

associada a plexo coroidite e ependimite (15,30,25). A PIF é a doença infecciosa

mais comum do sistema nervoso central (SNC) causadora de óbitos em gatos (40).

A infecção pelo FIPV causa inflamação no plexo coroide e epêndima, estruturas

onde lesões são raras. Estas lesões inflamatórias podem causar obstrução e

hidrocefalia não comunicante hipertensiva. A plexo-coroidite e a ependimite são os

achados microscópicos mais comumente associados a infecção do SNC pelo FIPV

em gatos. De fato, o vírus tem predileção pelo epêndima de todo o sistema

ventricular, incluindo o plexo coróide (40). Na infecção pelo FIPV, pode ocorrer

obstrução do aqueduto mesencefálico e a expansão do terceiro ventrículo e

ventrículos laterais (35). Interessantemente, macrófagos residentes do SNC

(micróglia) podem ser infectados por Coronavírus neurotrópicos, como o vírus da

hepatite murina (MHV). Adicionalmente, o mesmo estudo comprovou que a

54

supressão da micróglia não evita a migração de células inflamatórias para o SNC

(41). A infecção do SNC pelo FIPV provavelmente esteja relacionada ao tropismo

viral determinado pela citocina IFN tipo I, que já foi demostrado e cujo mecanismo

antiviral é desconhecido (42). Além disso, esta citocina, ao contrário de outras

citocinas, regula a atividade de quimiocinas que atraem células T para o SNC (21).

Com relação à encefalite, meningite, plexo-coroidite e ependimite, podem ser

considerados os seguintes diagnósticos diferenciais: toxoplasmose (Toxoplasma

gondii), raiva (vírus da raiva) (5) e alterações comportamentais em co-infecção por

FIV e Cryptococcus neoformans, ou FIV e FeLV. Além disso, polineuropatia ou

linfomas que levam a anisocoria, ataxia e alterações comportamentais por infecção

por FeLV (29).

Em 50% dos gatos, foi observada uveíte mononuclear focal acentuada,

predominantemente linfohistiocitária. O FPIV pode ter alcançado os olhos pela via

hematógena (12,24,25,26). Também foi observada associação entre uveíte e neurite

do nervo óptico. Essa manifestação é conhecida como PIF neuro-ocular e pode

ocorrer sem manifestação sistêmica, ou combinada com a forma seca. A inflamação

pode ocorrer em conjunto com o SNC ou isoladamente (38). Com relação ao

diagnóstico diferencial de uveítes em felinos, a infecção pelo FIPV, vírus da

imunodeficiência felina (FIV, feline immunodeficiency vírus, do inglês) e herpesvírus

felino tipo 1 (29) constituem-se as principais causas diferencias de uveíte (39). Em

envolvimento ocular, podem ser considerados os seguintes diagnósticos diferenciais:

doença conjuntival (Chlamydia felis) e tuberculose (Mycobacterium tuberculosis) (5,

29).

Com relação ao coração, há apenas relato de um caso de epicardite causada

pelo FIPV na literatura (26). No presente estudo, em um gato (8%) foi observado no

epicárdio, infiltrado inflamatório misto. As lesões foram compostas principalmente

por macrófagos, plasmócitos e linfócitos, depósito de fibrina e neutrófilos,

associados à necrose e fibrina, com diagnóstico morfológico de epicardite mista

acentuada. Além da PIF, outras doenças podem causar cardiopatias, como

pericardite granulomatosa, embora a literatura seja escassa. Estas doenças incluem:

botriomicose (causada pelo Staphylococcus aureus em processo de infecção

sistêmica); coccidiomicose que algumas vezes pode se estender dos pulmões

(piogranulomas) ao coração, causada pelo fungo Coccidioides immitis (46).

55

2.1.7 Conclusões

O FIPV causou lesões nos fígado (92%), pulmões (75%), intestinos (75%),

linfonodos mesentéricos (67%), rins (58%), baço (58%), pâncreas (58%), encéfalo

(58%), olhos (50%), e coração (8%) dos gatos. A variedade de tecidos submetidos à

IHC para o FPIV constatou a disseminação da doença sistêmica causada pelo vírus

em gatos.

O diagnóstico da PIF tem sido negligenciado, não se tem conhecimento a

respeito, portanto, estudos que identifiquem a doença são fundamentais para a

qualidade do serviço médico veterinário, incluindo o Brasil. Além disso, tem crescido

o interesse pelos felinos e é importante aprimorar o diagnóstico desta enfermidade

na Medicina Veterinária. Essas pesquisa poderão contribuir para o desenvolvimento

de tratamentos efetivos contra a PIF em felídeos.

56

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DIAGNÓSTICO E CARACTERIZAÇÃO ANATOMOPATOLÓGICA DA ... · Figura 10 – Microscopia e IHC para...

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