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Revisão de Literatura

DIFERENTES MÉTODOS E TÉCNICAS NA AVALIAÇÃO ESPERMÁTICA:UMA BREVE REVISÃO

Sildivane Valcácia SILVA1, André Mariano BATISTA2, Zoraide Fernandes COLETO3,

Maria Madalena Pessoa GUERRA4*

RESUMO – A fecundação é um processo que sofre interferência de fatores intrínse-cos e extrínsecos, e a utilização de biotécnicas pode tanto aprimorar ou diminuir osíndices obtidos a campo. A avaliação da amostra seminal pode contribuir para amaximização dos resultados de prenhez. Entretanto, as práticas desenvolvidas paraanálise na prática profissional subestimam o potencial fertilizante da célula esper-mática, sendo necessária a utilização de métodos e técnicas que investiguem commaior confiabilidade a capacidade fertilizante da célula espermática, como a avalia-ção objetiva da motilidade, técnicas fluorescentes para identificar membranas pre-servadas e, ainda mais precisas, como a microscopia eletrônica de transmissão.Desta forma, com esta breve revisão objetivou-se discorrer sobre métodos e técni-cas que vêm sendo desenvolvidos e utilizados na análise de espermatozóides deanimais domésticos.

Termos para indexação: Espermatozóide, fluorescência, análise computadoriza-da, microscopia eletrônica de transmissão.

DIFFERENT METHODS AND TECHNIQUES IN SPERM EVALUATION:A BRIEF REVIEW

ABSTRACT – Fertilization is a process that is influenced by intrinsic and extrinsicfactors, and use of biotechnologies can both enhance and decrease the rates foundin the field. Evaluation of semen sample can contribute to maximizing results ofpregnancy, however, practices developed for analysis in professional practice fertilizerunderestimate the potential of sperm cells, necessitating the use of methods andtechniques that more reliably investigate the fertilizing ability of sperm cell, such asobjective assessment of motility, fluorescent techniques to identify preservedmembranes and even more accurate tests such as transmission electron microscopy.Therefore, this review aims to clarify what methods and techniques have beendeveloped and used in the analysis of spermatozoa of domestic animals.

Index terms: Spermatozoon, fluorescence, computer analysis, transmissionelectron microscopy.

1 Doutoranda, Departamento de Medicina Veterinária, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Rua Dom Manoel deMedeiros, s/n. Dois Irmãos, Recife - PE. CEP: 52171-900; Recife, Pernambuco, Brasil.

2 Doutorando, Rede Nordeste de Biotecnologia - RENORBIO3 Dra Bolsista PNPD, Departamento de Medicina Veterinária, UFRPE.4 Professora Dra. Associada, Departamento de Medicina Veterinária, UFRPE. E-mail: [email protected]. * Autor

para correspondência.

Ciênc. vet. tróp., Recife-PE, v. 12, nos 1/2/3, p. 1-15 - janeiro/dezembro, 2009

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INTRODUÇÃO

Fisiologicamente, o objetivo final doespermatozóide é o de empreender suces-so na fertilização do oócito, resultando emuma concepção normal. Para tal, o esper-matozóide, após a espermiação, deve ama-durecer dentro do trato genital masculino,deslocar-se através do trato genital femini-no, sofrer capacitação e reação acrosso-mal, ligar-se e penetrar a zona pelúcida dooócito e finalizar o processo com a fusãodos pró-núcleos masculino e feminino(HAFEZ e HAFEZ, 2004).

Como a fecundação é um processoque sofre interferência de fatores intrínse-cos e extrínsecos, os resultados espera-dos em criações de animais de produçãopodem não ser alcançados, diminuindo aeficiência reprodutiva dos plantéis. Assim,técnicas de reprodução assistida, como ainseminação artificial, utilizando sêmen crio-preservado, e a transferência de embriões,foram introduzidas na indústria de produ-ção animal com o objetivo de acelerar a di-fusão de material genético de animais su-periores e minimizar obstáculos na eficiên-cia reprodutiva (LORENZO e CARNEIRO,2003).

Entretanto, a criopreservação de sê-men nas diversas espécies causa extensi-vos danos químicos e físicos às membra-nas espermáticas, atribuídos às alteraçõesna transição da fase lipídica e/ou aumentona peroxidação (PURDY, 2006) advindasdos processos de congelação/desconge-lação, que resulta em uma consequenteredução na porcentagem de espermatozói-des móveis, na velocidade e na capacida-de fertilizante (ISACHENKO et al., 2004).

Desta forma, torna-se necessário odesenvolvimento e a utilização de técnicasde avaliação que permitam atestar a capa-cidade fertilizante da célula espermáticaexposta a eventos de redução de tempera-tura. Objetivou-se com essa breve revisãodiscorrer sobre métodos e técnicas quevêm sendo desenvolvidos e utilizados naanálise de espermatozóides de animaisdomésticos.

AVALIAÇÕES LABORATORIAIS

Mocé e Graham (2008) relataram quea avaliação do sêmen, utilizando testes la-boratoriais é extremamente importante paraa indústria da inseminação artificial, porpermitir o fornecimento de produtos de qua-lidade aos clientes e potencializar a utiliza-ção do material biológico. A utilização dediferentes ensaios torna possível estimar acapacidade fertilizante de espermatozóides,da mesma forma que possibilita aprovar e/ou descartar amostras de sêmen de quali-dade inferior.

Sabe-se, porém, que nenhum teste iso-ladamente é capaz de medir a fertilidadede um ejaculado (ARRUDA et al., 2007),necessitando-se avaliar vários aspectos,para que se possa determinar a fertilidadepotencial do macho (SIQUEIRA et al., 2007).Segundo Mies Filho (1982), duas classes decaracteres devem ser levadas em conside-ração na avaliação espermática, além doexame microbiológico: os caracteres físico/químicos e os microscópicos. Na primeiraclasse, avaliações para determinar o volume,cor, aspecto, odor, pH, osmolaridade e com-posição química do ejaculado podem ser re-alizadas. Na segunda, a determinação dosíndices relativos à concentração, motilida-de, vigor, proporção de espermatozóidesvivos e morfologia espermática comple-mentam o estudo necessário a determina-ção de um material de boa qualidade.

Saacke (1982) determinou que as ba-ses gerais para a mensuração da viabilida-de espermática devem estar vinculadas aavaliações de: motilidade, velocidade, pe-netração do muco cervical, preservação doconteúdo celular (núcleo, enzimas e lipí-deos), integridade estrutural da membranaplasmática e acrossomal, habilidade paraaglutinação em presença de soro sanguí-neo (cabeça a cabeça) e habilidade empassar através de filtros como os de lã devidro e membrana Sephadex.

MOTILIDADE ESPERMÁTICA

A motilidade espermática é uma esti-

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mativa microscópica subjetiva, que consistena avaliação do porcentual (0-100%) deespermatozóides que apresentem ativida-de cinética, ou seja, avalia a qualidade e avariação de movimento de células vivas emuma amostra de determinada quantidadede sêmen (HAFEZ e HAFEZ, 2004). O va-lor da motilidade para o sêmen recém-co-lhido ou in natura deve ser igual ou superiora 70% para todas as espécies domésticas(CBRA, 1998).

Segundo Salviano e Souza (2008), osmovimentos dos espermatozóides não obe-decem a um padrão único, pois há deslo-camentos das células para frente (movi-mento progressivo), em circunferência (mo-vimento circular) ou, ainda, podem apenasse limitar a oscilar no campo microscópico(movimento oscilatório ou local). Desta for-ma, o CBRA (1998) estabeleceu que: quan-do o porcentual de espermatozóides mó-veis é superior aos de gametas com motili-dade progressiva, este parâmetro deve serexpresso separadamente, como motilida-de total e motilidade progressiva.

A motilidade progressiva é de grandeimportância para a viabilidade espermáticaapós o processo de criopreservação e, deacordo com Kumar (2000), este é o parâ-metro mais importante para a fertilização,por possibilitar o deslocamento desta célu-la masculina até o gameta feminino. Entre-tanto, outros autores não correlacionarama motilidade espermática com a fertilidade.Siqueira et al. (2007) avaliaram a correla-ção da motilidade progressiva com a taxade prenhez em fêmeas bovinas e consta-taram não haver interferência ou correlaçãoentre estas características.

Estudos desenvolvidos por Borges Jú-nior et al. (2003), relataram não haver rela-ção da motilidade progressiva com a taxade gestação em mulheres inseminadas in-trauterinamente, considerando a concentra-ção espermática mais importante nos resul-tados de fertilização do que o movimentoespermático. Xu et al. (1998) avaliaram osparâmetros seminais de motilidade, concen-tração e morfologia na inseminação de fême-as suínas, observando que a motilidade não

foi significativa para determinar o aumento nataxa de prenhez, enquanto que concentra-ções espermáticas baixas, diminuíram o ta-manho da leitegada, assim como a qualida-de morfológica dos espermatozóides confe-riram uma maior fertilidade. Verstegen et al.(2002) destacaram que a avaliação subjetivada motilidade espermática pode determinarvariações, de acordo com a experiência doavaliador, ocasionando diferenças nos va-lores para um mesmo parâmetro.

Diante da necessidade de se estabe-lecer padrões para a utilização da motilida-de como critério importante na avaliaçãoseminal, reduzindo a subjetividade, siste-mas automáticos de análise de sêmen fo-ram desenvolvidos, fornecendo maior pa-dronização, precisão, confiabilidade e ve-locidade na obtenção de resultados nasanálises (MATOS et al., 2008). Desta for-ma, o sistema CASA (Computer AssistedSemen Analysis), desenvolvido em meadosdos anos 1980, foi proposto como uma fer-ramenta que poderia substituir a avaliaçãosubjetiva e aperfeiçoar a rotina laboratorialpor apresentar velocidade em fornecer in-formações mais precisas, relativas à con-centração, morfologia e qualidade de movi-mento das células espermáticas, técnicasque geralmente exigem tempo na execu-ção (MORTIMER, 2000).

O diferencial do sistema CASA é a ca-pacidade de produzir informações sobre acinética espermática, com a utilização decampos de vídeo contendo imagens deespermatozóides eletronicamente digitali-zados, bem como a determinação da posi-ção central de cada cabeça espermática(KATZ e DAVIS, 1987). Mortimer (1990),avaliando sêmen humano e Verstegen et al.(2002), o sêmen de animais, determinaramque o sistema CASA pode analisar os se-guintes parâmetros: motilidade total (MT),motilidade progressiva (MP), linearidade(LIN), retilinearidade (STR) e índice de os-cilação ou wobble (WOB), expressos emporcentual; velocidade curvilinear (VCL),velocidade em linha reta (VSL) e velocida-de média do percurso (VAP), expressos emµm/s; frequência de batimento flagelar cru-

Avaliação espermática: diferentes ....


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zado (BCF), expresso em Hertz; amplitudedo deslocamento lateral da cabeça do es-permatozóide (ALH), expresso em micrô-metros.

Desde o início da aplicação desta téc-nica, vários questionamentos vêm sendoformulados, como por exemplo, os diferen-tes tipos de equipamentos disponíveis, ascalibrações efetuadas, as informações ofe-recidas pelos operadores ao sistema, emfunção da qualificação técnica destes ope-radores (VERSTEGEN et al., 2002). O en-trave para a maximização do uso desta téc-nica é o custo na aquisição do equipamen-to que geralmente é adquirido por clínicasespecializadas ou instituições de pesquisa,na sua maioria (AMANN e KATZ, 2004).

A célula espermática apresenta peculi-aridades entre as diversas espécies do-mésticas, variando no tamanho e formatoda cabeça, comprimento do espermatozói-de e atividade cinética (PESCH e BERG-MANN, 2006). Segundo Matos et al. (2008)faz-se necessário fornecer ao programaautomático informações específicas paracada tipo de célula, no que se refere àscaracterísticas particulares de cada espé-

cie, para que se verifique eficácia nos re-sultados. Assim, este seria outro fator limi-tante na expansão do sistema CASA. En-tretanto, por conta do interesse gerado emaprofundar estudos com respeito à fisiolo-gia dos espermatozóides, é crescente aquantidade de publicações utilizando estesistema na área veterinária, desde o anode 1987 (VERSTEGEN et al., 2002), res-saltando que cada indivíduo pode apresen-tar diferentes comportamentos cinéticos,assim como ejaculados de um mesmo in-divíduo, visto que uma amostra seminal éconstituída pela soma de subpopulaçõesespermáticas com diferentes níveis deamadurecimento (RODRÍGUEZ-MARTÍ-NEZ, 2007).

Os parâmetros VCL, VSL e VAP (Figu-ra 1) definem quantitativamente o movimen-to dos espermatozóides, enquanto que LIN,STR, WOB, ALH e BCF (Tabela 1) definema qualidade da cinética espermática. Lar-sen et al. (2000) utilizaram o sistema CASAcom o objetivo de predizer o potencial defertilidade de espermatozóides humanos edestacaram a importância dos valores deVCL, VAP, STR e BCF para a fertilidade.

FIGURA 1 – Representação gráfica dos parâmetros quantitativos expres-sos pelo sistema CASA em uma trajetória irregular. Adaptadode MORTIMER (2000, Figura 9).

Parâmetros Proporções das velocidades

Linearidade (LIN) (VSL/VCL) x 100

Retilinearidade (STR) (VSL/VAP) x 100Índice de oscilação (WOB) (VAP/VCL) x 100

TABELA 1 – Relação entre os parâmetros de velocidade qualitativa e proporções dastrês velocidades

VSL: Velocidade em linha reta; VCL: velocidade curvilinear; VAP: velocidade média do percurso.Fonte: adaptado de Mortimer (2000, Página 519).

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Em estudo de movimento, Mortimer(2000) determinou que a VCL refere-se aopercurso total que a célula espermáticapercorre em um determinado período deobservação e que é sempre a maior dastrês velocidades. A VSL, percurso deter-minado em linha reta do primeiro ao últi-mo ponto de observação, geralmente re-presenta a menor das três velocidades.A VAP é a estimativa do percurso médioque o espermatozóide desenvolveu du-rante o período de observação. Nos ca-sos em que a trajetória da cabeça do es-permatozóide é muito regular e linear,com pouco movimento lateral de cabe-ça, a VAP tem valor semelhante à VSL.Em contrapartida, em trajetórias irregula-res, não lineares ou na qual se observa um

alto grau de desvio lateral da cabeça doespermatozóide, a VAP será muito maiorem relação à VSL.

Para o estudo da cinética de sêmenovino, Cavalcante et al. (2008) avaliaramamostras de sêmen in natura, obtidas deanimais criados nas condições climáticasdo Nordeste brasileiro, sendo estes valo-res expressos na Tabela 2, demonstrandoque no primeiro quartil deve constar o valormínimo para aprovação do ejaculado e noterceiro quartil, o valor máximo para cadaparâmetro avaliado. Os resultados obtidospor estes autores demonstraram que o sê-men ovino, na condição in natura, apresen-ta características de movimento curvilinear,com VAP superior ao VSL, e menor LIN emrelação ao STR.

Entretanto, a criopreservação podeocasionar alterações na célula espermáti-ca, que vão interferir na movimentação doespermatozóide. Mortimer e Maxwell (2004)testaram diferentes diluentes para determi-nar a influência de sua composição na ci-nética espermática e observaram que oespermatozóide ovino, pós-criopreserva-ção, não apresentava movimentos clássi-cos como em outras espécies e que, ascélulas espermáticas embora tenham mo-vimentos vigorosos de cauda e menor li-nearidade, não demonstraram estar hipe-

rativadas, quando avaliadas com a sondafluorescente Clortetraciclina (CTC).

Mortimer et al. (1998), analisando amos-tras de sêmen humano, encontraram valo-res de VCLΜ150 µm/s, LINΜ 50% e ALHΜ

7,0 que definiram comportamento cinéticocompatível com a hiperativação espermá-tica. Gillan et al. (2008) avaliaram sêmenbovino pós-descongelação e determinaramvalores de VCLΜ 155 µm/s, VSLΜ 100 µm/s, LINΜ 65% e ALHΜ 5,5 µm, caracterizan-do o espermatozóide bovino hiperativado.Neste caso, estes valores seriam indese-

TABELA 2 – Média, desvio padrão (s), coeficiente de variação (CV), 1º e 3º quartis dosparâmetros cinéticos para sêmen in natura de ovinos Santa Inês avaliadosem sistema CASA

VCL VSL VAP LIN STR WOB ALH BCF(µm/s) (µm/s) (µm/s) (%) (%) (%) (µm) (Hz)

Média 141,7 97,8 120,3 67,3 79,4 83,0 3,5 7,8 s 43,9 49,3 45,9 23,8 21,0 13,7 1,4 3,0 CV (%) 31,0 50,4 38,2 35,4 26,4 16,5 40,0 39,0 1º quartil 116,7 57,4 91,4 49,7 68,2 76,0 2,6 6,0 3º quartil 172,5 135,0 152,7 88,1 95,9 93,8 4,3 10,0

VSL: Velocidade em linha reta; VCL: velocidade curvilinear; VAP: velocidade média do percurso.LIN: linearidade; STR: retilinearidade; WOB: índice de oscilação; ALH: amplitude lateral dacabeça: BCF: batimento flagelar cruzado. Fonte: Cavalcante et al. (2008, Tabela 1).

EstatísticosEstatísticos

Parâmetros cinéticos



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jados no momento da avaliação do sêmenpós-descongelação, uma vez que a hipe-rativação deveria ocorrer próximo ao localda fertilização e a ativação precoce poderádeterminar um menor tempo de vida útil àcélula espermática, reduzindo a capacida-de fertilizante das amostras.

A temperatura preconizada para a des-congelação de sêmen, independentemen-te da espécie, é de 37 ºC (CBRA, 1998),podendo variar o tempo de exposição aesta temperatura de acordo com o volumeda palheta. Entretanto, Chan et al. (1998)observaram que pequenas variações natemperatura do banho-maria, geralmentepara maior temperatura (40 ºC) no momen-to da descongelação, podem hiperativar acélula espermática, não sendo consequên-cia da congelação, e sim da descongela-ção. Desta forma, torna-se primordial re-duzir as variações deste parâmetro para queresultados confiáveis sejam alcançados naavaliação in vitro. Há necessidade da reali-zação de outros estudos, no sentido de elu-cidar as diferenças observadas na cinéticaespermática entre as espécies, e suasmodificações, determinando os procedi-mentos que as originam e sua interferên-cia no momento da fertilização.

INTEGRIDADE DE MEMBRANASESPERMÁTICAS

O espermatozóide é formado por dife-rentes estruturas necessárias ao seu per-feito funcionamento. A célula espermática,quando depositada no trato reprodutor fe-minino, adquire movimento, sem que istoateste a condição de viabilidade, podendoapresentar lesões em diferentes comparti-mentos, como nas membranas plasmáti-ca, do acrossoma e das mitocôndrias, emdetrimento da cinética apresentada (SILVAet al., 2009b). Para a avaliação da integri-dade destas estruturas, diferentes métodose técnicas foram desenvolvidos, visandodeterminar sua preservação e funções.

Estiraços úmidos de sêmen podem serexaminados por microscopia de contrastede fase após a fixação em glutaraldeído,

formol-salino ou formol-citrato, com o obje-tivo de conservar as características celula-res e permitir futuras observações, anali-sando-se 200 células, no mínimo, para umamaior confiabilidade (MIES FILHO, 1982).

Diversos corantes podem ser utiliza-dos, isoladamente ou em associação, parafacilitar a visibilização de estruturas da cé-lula espermática, e determinar sua condi-ção. Zúccari et al. (2008) determinaram queo corante eosina-nigrosina pode ser utiliza-do para identificar a preservação e/ou le-são da membrana plasmática, observandoque, ao atravessá-la, a célula cora-se derosa em diferentes pontos e de diferentesmaneiras, indicando a condição celular. Ain-da neste experimento, o corante trypan blueGiemsa pode ser usado para avaliar o sta-tus do acrossoma, sendo seu resultadoclassificado da seguinte forma: vivos (nãocorados na região pós-acrossomal eacrossoma rosa); mortos (corados em azulna região pós-acrossomal e acrossomarosa); reação acrossomal verdadeira (nãocorados na região pós-acrossomal e au-sência de acrossoma); reação acrossomalfalsa (corados em azul na região pós-acrossomal e ausência de acrossoma).

Para a avaliação da integridade nuclear,sob imersão em microscopia de campo cla-ro, o corante azul de toluidina pode ser uti-lizado e seus resultados interpretados deacordo com as variações de cor apresen-tadas no núcleo, como quando as cabeçasestão coradas em azul claro, indicando cro-matina íntegra e, as cabeças coradas emazul escuro/violeta ou magenta, indicandofalha na condensação da cromatina (ZÚC-CARI et al., 2008).

A associação de métodos e técnicasde coloração é uma prática necessária, vis-to que, alguns corantes são eficientes emsensibilizar determinadas estruturas da cé-lula espermática e ineficientes em outras. Vi-llaverde et al. (2008) utilizaram o método deKarras modificado (KA) e a coloração FastGreen FCF/Rosa Bengala (FR) e, apesar dasduas técnicas de coloração permitirem boavisibilização das estruturas espermáticas,estes autores observaram menor eficiência

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na detecção de defeitos de cabeça nas amos-tras coradas com KA, assim como menorverificação da presença de gotas citoplasmá-ticas distais na coloração com FR. Assim,ambas as colorações, usadas isoladamen-te, não foram totalmente eficientes na identi-ficação dos defeitos de morfologia encon-trados na avaliação do sêmen in natura degatos domésticos.

Rodriguez-Martinez et al. (1997) rela-taram que o desenvolvimento de técnicasde coloração celular utilizando sondas flu-orescentes para verificação do DNA, deenzimas intracitoplasmáticas, lectinas oumembranas, tem sido apontado como fer-ramenta auxiliar na determinação da funci-onalidade do espermatozóide, após a prá-tica de congelação-/descongelação. Cele-ghini et al. (2007) relataram que, as sondasfluorescentes ou fluoróforos, monitoram afuncionalidade e/ou a integridade das es-truturas espermáticas, as quais, possuema capacidade de ligar-se a pontos específi-cos das células, permitindo diagnóstico prá-tico e direto. Assim, técnicas de fluorescên-cia têm sido utilizadas com sucesso emdiferentes espécies e em diferentes estru-turas da célula espermática, podendo serempregadas de forma isolada ou em asso-

ciações nas espécies bovina (GARNER etal., 1997), equina (GRAVANCE et al., 2000),caprina (BATISTA et al., 2009) e ovina (SIL-VA et al., 2009b).

Sondas com afinidade por ácido deso-xirribonucléico (DNA) são utilizadas na ava-liação da integridade da membrana plasmá-tica, pois uma vez lesada esta estrutura, asonda atravessa-a e cora o núcleo, ondeconcentra-se o DNA. Silva e Gadella (2006)listaram diferentes sondas utilizadas comesta finalidade: Hoechst 33258, YoPro-1,Iodeto de Propídeo (IP), Etídio Homodimé-rico-1, ToPro-3 e TOTO.

Outra forma de avaliar a integridade damembrana é fazer uso de sondas classifi-cadas como anfipáticas, que conseguematravessar a membrana intacta e se ligaràs esterases, identificando a célula viável,como quando se usa o Diacetato de Car-boxifluoresceína (DCF) e do SYBR-14®(Figura 2). Segundo Medina et al. (2000), oDCF é um éster não polar, não fluorescen-te, permeável à membrana plasmática que,dentro da célula é hidrolisado por estera-ses inespecíficas, resultando em um com-posto fluorescente e impermeável à mem-brana plasmática intacta que o adsorve efluoresce em verde.

FIGURA 2 – Esquema da ação de diferentes sondas utilizadas emtestes de integridade da membrana plasmática.Fonte: Silva e Gadella (2006, Figura 1).



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Geralmente, faz-se a associação des-tas sondas com outra que tenha afinidadecom DNA, como o IP, onde são obtidos re-sultados confiáveis para identificar a pre-servação da membrana plasmática de es-permatozóides, uma vez que a membranaíntegra cora em verde, pela ligação do DCFàs esterases e a lesada cora a região nu-clear em vermelho pela ligação do IP ao nú-cleo celular (COLETO et al., 2002). Petersonet al. (2007), usando uma combinação dassondas fluorescentes SYBR-14® e IP (LIVE/DEAD, Molecular Probes Inc., Eugene, OR,USA) na avaliação de sêmen de caprinos daraça Saanen, concluíram existir correlaçãoentre a proporção de células com membra-nas intactas e a quantidade de espermato-zóides móveis armazenados a 18 ºC (r=0,77) e 4 °C (r= 0,98), sendo 4 ºC a tempe-ratura de conservação espermática indica-

da, por preservar melhor as membranas deespermatozóides caprinos.

Silva e Gadella (2006), em uma revi-são sobre a avaliação da integridade doacrossoma, destacaram que as lectinaspodem ser utilizadas, uma vez que sãocapazes de ligar-se a carboidratos existen-tes exclusivamente nas glicoproteínas damembrana acrossomal (Figura 3). Subs-tâncias geralmente derivadas da ervilha daespécie Pisum sativum (PSA) e do amen-doim da espécie Arachis hypogaea (PNA),assim como a Concanavalina A (ConA),uma lectina D-glucose/D-manose liganteextraída de sementes da forrageira Cana-

valia ensiformis, são associadas a fluoró-foros, para permitir sua visibilização ao mi-croscópio de imunofluorescência, sendomais utilizado o Isocianato de Fluoresceína(FITC).

FIGURA 3 – Esquema de ação das sondas fluorescentes nas membra-nas acrossomais externa (MAE) e interna (MAI).Fonte: adaptado de Silva e Gadella (2006, Figura 2).

As lectinas possuem diferentes locaisde atuação, como a PNA que se liga aosglicoconjugados da membrana acrossomalexterna e as PSA e ConA que apresentamafinidade pela membrana acrossomal inter-na, mais especificamente aos grupos sa-carídeos da glicoproteína pró-acrosina(HOLDEN et al., 1990). Desta forma, nocaso do uso das PSA e ConA, quando amembrana plasmática está intacta, não há

fluorescência. Entretanto, quando a mem-brana plasmática está danificada, como noscasos de fixação da célula espermática,observa-se fluorescência na região doacrossoma (SILVA e GADELLA, 2006).

Outra forma de identificar alterações namatriz acrossomal é a utilização de son-das que tenham afinidade por pH ácido, jáque o conteúdo acrossomal tem pH próxi-mo a 5 (ABOU-HAILA e TULSIANI, 2000). A

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sonda fluorescente Lysotracker Green ™®(Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA)tem afinidade por pH ácido contido em or-ganelas, e marca células vivas. Quando oacrossoma está intacto, a sonda penetra amembrana plasmática e concentra-se nointerior do acrossoma, evidenciando fluo-rescência. Se o acrossoma está reagido oulesado, o interior do mesmo tem seu pHmodificado para a neutralidade e a Lysotra-cker se perde no meio extracelular, semapresentar fluorescência (SILVA e GADEL-LA, 2006).

Diferentes sondas fluorescentes têmsido utilizadas para avaliar a função mito-condrial espermática, e Garner et al. (1997)testaram a ação dos fluoróforos Rodamina123 (R123), JC-1 e MitoTracker™ (MITO)para avaliar a função mitocondrial da célulaespermática de bovinos e identificaram quea sonda JC-1 foi eficaz na classificação dopotencial da membrana mitocondrial. Assondas que apresentam afinidade mitocon-drial são transportadas nas mitocôndriascom a respiração ativa. Portanto, célula comrespiração mitocondrial ativa acumula co-rante nesta organela (GRAHAM e MOCÉ,2005).

As sondas R123 e MITO são transpor-tadas nas mitocôndrias que apresentemrespiração ativa e o acúmulo destas subs-tâncias faz com que a peça intermediáriafluoresça na coloração verde. Todas asmitocôndrias funcionais coram-se em ver-de com R123 e MITO, não havendo dife-rença entre as taxas respiratórias exibidaspelos espermatozóides (SILVA e GADELLA,2006). Em contrapartida, o JC-1 apresentadiferenças quanto à coloração uma vezque, em concentrações mais baixas, per-manece em seu estado monomérico e fluo-resce em verde, enquanto em concentra-ções elevadas, o JC-1 forma agregadosque fluorescem na cor laranja. Portanto, oJC-1 não apenas tem a habilidade para dis-tinguir mitocôndria funcional, mas permiteque os diferentes níveis de função mitocon-drial sejam diferenciados pela intensidadeda cor apresentada na mitocôndria(GUTHRIE e WELCH, 2006).

AVALIAÇÃO ULTRAESTRUTURAL

O microscópio eletrônico foi inventadoem 1932 por Ernst Ruska (1902-1988) eMax Knoll (1897-1969) e é classificado comoum aparelho tecnológico com potencial deaumento muito superior ao de seu congê-nere óptico. A microscopia eletrônica é umaimportante técnica para determinar o tama-nho e a forma de estruturas inorgânicas ebiológicas, baseada na interação de elé-trons incidentes sobre a matéria. Muitos sãoos efeitos desta interação e o comprimen-to de onda do elétron varia entre 0,1 e 1,0nm. No entanto, não é possível observarmaterial vivo neste tipo de microscópio, poiso material a ser estudado é submetido aum complexo processo de desidratação,fixação e inclusão em resinas especiais,muito duras, que permitem cortes ultrafinosobtidos com ultramicrótomo.

Existem três tipos de microscópio ele-trônico: o de transmissão (MET), usado paraa observação de cortes ultrafinos; o de var-redura (MEV), capaz de produzir imagensde alta ampliação para a observação desuperfícies e o de tunelamento, para visua-lização de átomos (MANNHEIMER, 2002).Por conseguinte, a avaliação da ultraestru-tura dos espermatozóides de vertebradose invertebrados tem sido realizada pormeio da MET em galos (BAKST e HO-WARTH Jr, 1975), pernilongos (BÁO eSOUZA, 1992) e bovinos (LUQUE e BÁO,2006), possibilitando caracterizar as es-truturas das células espermáticas des-tas espécies. Hashida et al. (2005) avali-aram espermatozóides de caprinos nacondição in natura, após a criopreserva-ção e pós-reação acrossomal, identifican-do diferenças nas estruturas do acros-soma, membrana plasmática e mitocôn-drias em células expostas a reduzidastemperaturas. Entretanto, o axonema foipreservado em todas as células avalia-das. Estes autores ainda relacionaramalterações de redução da motilidade es-permática à pós-criopreservação do sê-men.

Chirinéa et al. (2006) estudaram a in-



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terferência de diferentes diluentes sobre acélula espermática de cães e verificaramque a MET foi utilizada como um teste des-critivo e qualitativo, que possibilitou identifi-car lesões da membrana plasmática eacrossomal de espermatozóides submeti-dos ao processo de criopreservação, dedifícil visibilização em microscopia óptica,como o rompimento da membrana plasmá-tica e a vacuolização das mitocôndrias apósa descongelação das amostras.

Segundo Kasimanickam et al. (2006),alterações na cromatina, como a descon-densação, podem interferir negativamenteno índice de fertilidade. Espermatozóidescom DNA danificado são capazes de fertili-zar o ovócito, porém, quando o materialgenético paterno é requisitado, o desenvol-vimento embrionário estaciona (HENKEL etal., 2003). Entretanto, a descondensaçãonão pode ser visibilizada em microscópioótico. Soares e Belletti (2006) avaliaram aultraestrutura espermática de galos e iden-tificaram que alterações na compactaçãoda cromatina, frequentemente não sãoacompanhadas por alterações morfológi-cas, porém as alterações morfológicas,

geralmente são acompanhadas por altera-ções na compactação da cromatina, quepodem ser determinadas pelas diferentestonalidades de cinza expressas na regiãonuclear do espermatozóide.

Silva et al. (2009a) avaliaram esperma-tozóides caninos submetidos ou não à crio-preservação através da MET e identifica-ram que o processo de congelação/descon-gelação afetou diretamente a ultraestruturadas mitocôndrias, com presença de vacuo-lizações e desorganização, sendo relacio-nados por estes autores como um proces-so degenerativo celular ocasionados pelosprocedimentos de criopreservação.

Os estudos com a MET, entretanto, têmsido realizados em menor escala, quandocomparados às demais técnicas de avalia-ção espermática, em consequência doscustos operacionais. Pode-se afirmar, en-tretanto, que embora a MET se apresentecomo procedimento de difícil acesso, estatécnica é de extrema importância, uma vezque os testes utilizados rotineiramente nãopermitem avaliar as alterações em propor-ções subcelulares ou em escala nanomé-trica (SARAIVA et al., 2009).

FIGURA 4 – Microscopia eletrônica de sêmen ovino in natura. 4A. Espermatozóide ovino, região dacabeça, visualização da membrana plasmática, acrossoma e núcleo. 4B. Peça inter-mediária de um espermatozóide ovino, visualização das mitocôndrias.

TESTES DE FERTILIDADE

Fertilidade é a capacidade de conce-ber ou gerar prole. Levando-se em consi-deração a reprodução assistida, na opinião

de Graham (1996), torna-se difícilconceituá-la, pelo fato de a fertilidade po-der resultar de uma única inseminação, deinseminações múltiplas dentro de um úni-co ciclo estral ou de muitas inseminações

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durante vários ciclos estrais. Todavia, deacordo com Mocé e Graham (2008), exis-tem diferentes meios para se determinar afertilidade, que pode ser definida como: a por-centagem de fêmeas inseminadas e os em-briões quantificados; fêmeas com prenhezdiagnosticada em um determinado períodode tempo após a inseminação; fêmeas quenão são re-inseminadas em um número de-finido de dias após a inseminação; fêmeasparidas (para as espécies multíparas, onúmero de crias deve ser incluído).

Tradicionalmente, o diagnóstico de fer-tilidade em um macho era feito de acordocom a avaliação descritiva do sêmen, comênfase no número de espermatozoides pre-sentes no ejaculado, sua motilidade e suamorfologia. No entanto, muitos estudos têmdemonstrado que esse conceito é falho e,na realidade, não é o número de esperma-tozoides móveis ou morfologicamente nor-mais que determina a fertilidade e sim, suacompetência funcional (SOARES e GUER-RA, 2009).

Estes fatores são ainda mais influenci-ados quando expostos a condições experi-mentais, ou seja, quando se utiliza diferen-tes protocolos para testar o mais indicadopara o aumento dos índices de prenhez. Coxet al. (2002) determinaram que a taxa deprenhez é uma característica binomial, in-fluenciada por diversos fatores, e exige umgrande número de fêmeas inseminadaspara exprimir as diferenças significativasentre os tratamentos estabelecidos em umdeterminado experimento.

Na espécie suína, as condições am-bientais influenciam mais as taxas de con-cepção do que a prática de monta naturalou IA, uma vez que as médias de tempera-tura máxima e mínima se correlacionaramnegativamente com a taxa de parição(CANDINI et al. 2000). Meneghetti e Vascon-celos (2008) avaliaram a inseminação arti-ficial em bovinos e observaram que a me-lhor condição corporal influenciou positiva-mente na taxa de concepção e que animaismais jovens e com menor condição corpo-ral obtiveram menores índices de prenhez.

Por outro lado, Rodríguez-Martínez

(2007) afirmou que técnicas de avaliaçãolaboratorial podem expressar resultadosconfiáveis quanto ao poder fertilizante dacélula espermática. Entretanto, estas ava-liações devem ser correlacionadas com osresultados de IA. Amann e Schanbacher(1983) relataram que os programas de IArealizados nas espécies equina, bovina lei-teira e suína são mais aprimorados, quan-do comparados aos praticados na bovino-cultura de corte e caprino-ovinocultura, de-vido ao período de tempo decorrido desdeque foram desenvolvidos e a frequênciacom que são realizados, uma vez que nes-tas últimas os programas de IA são maisescassos e ocasionados pelo manejo des-tes rebanhos. Vasconcelos e Vieira (2005),no Brasil, e mais especificamente na regiãoNordeste, relataram que esta afirmaçãopode ser constatada, justificada pelo fatode a criação de pequenos ruminantes nes-ta região ser basicamente uma exploraçãode subsistência, com ausência ou poucautilização de biotecnologias.

Como alternativa, Cox et al. (2000) afir-maram que é possível avaliar a taxa de fer-tilização utilizando a técnica de transferên-cia de oócitos homólogos colhidos em aba-tedouro, promover a IA e, a seguir, colheras estruturas para a análise. Cox et al.(2002) colheram oócitos bovinos em ani-mais de abatedouro, realizaram a transfe-rência para o sistema reprodutor de cabras,promoveram a IA com sêmen caprino ecolheram as estruturas, comprovando afertilização de oócitos heterólogos. Ressal-ta-se, entretanto, que os oócitos estavamdesnudos ao serem transferidos, não sen-do requerido o prévio reconhecimento es-pécie-específico entre espermatozóide-oócito. Desta forma, os autores validarama técnica como uma alternativa para predi-zer a capacidade fertilizante da célula es-permática ou comparar os resultados obti-dos previamente in vitro.

CONSIDERAÇÕES FINAIS

O espermatozóide é uma célula alta-mente especializada, com estruturas e fun-



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ções características. Cada estrutura temsua peculiaridade e moléculas presentesapenas em determinadas regiões, que umavez lesadas, comprometem a funcionalida-de deste gameta influenciando negativa-mente os índices de fertilidade. Tanto osdistúrbios reprodutivos quanto à manipula-ção destes gametas nos processos de crio-preservação podem provocar alterações naqualidade morfofuncional dos espermato-zóides, as quais repercutem negativamen-te na capacidade de fecundação destesgametas.

Técnicas elaboradas para análise dacélula espermática constituem grandeavanço na busca pelo conhecimento da fi-siopatologia dos gametas masculinos sub-metidos ao processo de criopreservação,através do entendimento da viabilidade es-permática pelos estudos específicos desuas estruturas com uso de sondas fluo-rescentes, do sistema computadorizado deanálise da cinética celular, da microscopiaeletrônica de transmissão, entre outrosmétodos.

Os parâmetros avaliados e as técnicasdevidamente selecionadas podem auxiliartanto na seleção de reprodutores que apre-sentem resistência aos processos de crio-preservação quanto na identificação de ani-mais portadores de deficiência reprodutivae direcionar a seleção de reprodutores ca-pacitados a serem utilizados em programasde melhoramento genético auxiliados pelareprodução assistida.

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