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Departamento de Química

DINÂMICA MOLECULAR DA ADSORÇÃO DA CLARITROMICINA EM UM

MODELO DE SURFACTANTE PULMONAR

Aluno: Lucas Miguel Pereira de Souza

Orientador: André Silva Pimentel

Introdução

A claritromicina é um antibiótico da classe dos macrólidos utilizado no tratamento da

pneumonia e de infecções causadas por Helicobacter Pylori, sendo efetiva contra infecções no

trato respiratório superior e inferior[1]. Além disso, é um dos fármacos mais efetivos e

essenciais com um custo moderado. Entretanto, sua aplicação intravenosa causa diversos efeitos

colaterais como vômito, náusea, diarreia, dores abdominais e ainda suspeitas de falência

cardíaca e doenças de fígado[2], [3]. Isso implica a necessidade de vias alternativas de

administração do fármaco no organismo. A utilização do surfactante pulmonar como carreador

de fármacos é uma alternativa que tem sido estudada recentemente[4]–[6].

Os surfactantes pulmonares são monocamadas fosfolipídicas que atuam reduzindo a

tensão superficial dos pulmões. São produzidos por seres humanos nas últimas semanas de vida

uterina, e podem também ser extraídos de animais. Os surfactantes podem ser sintéticos,

naturais-modificados ou naturais. São compostos principalmente por DPPC

(Dipalmitoilfosfatidilcolina) e POPC (1-Palmitoil-2-oleoilfosfatidilcolina). Em menores

quantidades se encontram POPG (1-palmitoil-2-oleoilglicero-3-fosfoglicerol), POPE (1-

palmitoil-2-oleoilfosfatidiletanolamina), PI (Fosfatidilinositol), PS (Fosfatidilserina), SM

(Esfingomielina), LPC (Lisofosfatidilcolina), colesterol e proteínas SP (surfactant-associated

protein). A proporção dos componentes varia para cada surfactante [7], [8].

A dinâmica molecular é uma ferramenta computacional que auxilia no estudo de sistemas

biomoleculares. O campo de força em coarse-grained MARTINI[9] é amplamente utilizado

nesse tipo de estudo por sua versatilidade e por permitir simulações de sistemas maiores em

tempos maiores quando comparado com campos de força atomísticos. Possuindo uma ampla

variedade de parametrizações para lipídeos, proteínas e açúcares[10]–[13], o campo de força

também permite que outras moléculas possam ser parametrizadas, como é o caso da

claritromicina.

Objetivos

O objetivo deste projeto é parametrizar dois modelos da claritromicina para o campo de

força MARTINI, validá-los e realizar a dinâmica molecular coarse-grained do fármaco em um

modelo de surfactante pulmonar. Os modelos devem ser capazes de simular o fármaco em seu

estado neutro ou carregado positivamente devido à protonação. Este projeto pretende verificar

a viabilidade de utilizar o surfactante pulmonar como carreador do fármaco para o pulmão e

analisar a interação do fármaco com a monocamada.

Metodologia

No campo de força MARTINI, em média, quatro átomos pesados são transformados em

um grão (mapeamento de quatro para um). Os parâmetros para os lipídeos, água, íons e

aminoácidos são padrões e disponibilizados pelo campo de força. A figura 1 mostra as

moléculas ou resíduos parametrizados em coarse-grained que foram utilizados no estudo.


(A) (B) (C) (D)

(E) (F) (G) (H)

(I)

(K)

(L) (M)

(J)

Figura 1: Moléculas ou grupos de moléculas no campo de força MARTINI. (A) representa a molécula

de DPPC, (B) POPC, (C) POPG, (D) POPE, (E) DPPI, (F) DPPS, (G) LPC e (H) DPSM. (I)

Representa a água (cada grão representa 4 moléculas de água) e (J) o octanol. (K) Representa a

proteína SP-B. (L) Representa o íon cloreto, e (M), o cátion sódio (cada grão representa 4 íons).

O mapeamento de quatro para um estabelece quatro tipos principais de grãos, o que vai

determinar as interações não-ligadas (Lennard Jones). Esses tipos são: C (apolar), N (não-

polar), P (polar) e Q (carregado). Isso permite que uma grande variedade de moléculas possa

ser parametrizada em coarse-grained. Para parametrizar uma nova molécula, é necessário fazer

o mapeamento de quatro para um e estabelecer informações específicas, como comprimento de

ligações, ângulos entre três grãos e restrições. O programa PyCGTOOL[14] é utilizado para a

segunda etapa, criando os parâmetros a partir de uma simulação com um campo de força

atomístico. Dessa forma, foram propostos dois modelos para a claritromicina, que se diferem

apenas pelo tipo de grão que representa o grupo amina para considerar a possível protonação

nessa região devido ao pH ácido ou neutro do meio. A figura 2 mostra o mapeamento da

claritromicina.


Figura 2: Mapeamento de quatro para um da claritromicina. O grão azul representa o grupo amina.

Deste modo, uma simulação atomística da claritromicina foi realizada para parametrizar

a molécula do fármaco em coarse-grained. Uma simulação bifásica foi feita para validar os

modelos propostos. Após isso foi possível simular a adsorção do fármaco em um modelo de

surfactante pulmonar. Cada uma destas etapas exige um sistema diferente, cuja construção é

detalhada mais adiante. Todas as simulações foram executadas pelo programa Gromacs 5.0.6.

A dinâmica molecular é realizada apenas após uma série padrão de etapas, a saber: i) construção

do sistema, ii) minimização de energia e iii) equilíbrio termodinâmico. Com o sistema já

construído, a energia do sistema é minimizada usando o algoritmo steepest descent. A

minimização de energia é um passo necessário para evitar sobreposição de átomos e para relaxar

o sistema. Normalmente a energia do sistema deve atingir o valor de 100 kJ mol-1, que é um

valor padrão e bem testado. Logo após, o sistema é equilibrado termodinamicamente utilizando

o algoritmo leap frog, com um tempo de simulação de 100 ns. Normalmente esse passo é

dividido em NVT e NpT, que são responsáveis por equilibrar respectivamente a temperatura e

a pressão do sistema.

As etapas de construção envolvem o uso dos programas g_editconf para modificação de

arquivos e g_solvate para a solvatação. Para a simulação atomística, uma caixa de 4 x 4 x 4 nm3

contendo uma molécula de claritromicina foi construída. O campo de força utilizado foi o

GROMOS 54a7[15] modificado pelo automated topology builder[16], [17] (ATB). O sistema

foi solvatado com aproximadamente 2100 moléculas de água do tipo SPC (simple point

charge). O sistema foi minimizado a 100 kJ mol-1 e equilibrado a 298 K e 1 bar. A dinâmica

molecular simulou um tempo de 100 ns. A trajetória dessa simulação foi coletada para a criação

dos dois modelos de claritromicina com o PyCGTOOL.

Para a utilização adequada dos modelos propostos, é necessário que eles sejam validados.

O critério de validação que mais interessa é a lipofilicidade do modelo, que deve estar de acordo

com a literatura[18], [19]. Esta propriedade determina a solubilidade do fármaco, sua absorção,

penetração em membranas, ligação à proteínas plasmáticas e distribuição no organismo. O

parâmetro que descreve a lipofilicidade de um fármaco é o coeficiente de partição (logP), que

é a razão entre as concentrações do fármaco em uma fase hidrofóbica e em uma fase aquosa. A

fase hidrofóbica é geralmente constituída de octanol e a lipofilicidade também pode ser

expressa em termos de logP. Para calcular o logP dos modelos de claritromicina neutra e

protonada, um sistema bifásico de água e octanol foi construído como mostra a figura 3A. O

modelo é posicionado na fase aquosa e após as etapas de minimização de energia (100 kJ mol-

1) e equilíbrio termodinâmico (298 K, 1 bar), a dinâmica molecular deve simular a sua

transferência para a fase hidrofóbica. A simulação desse processo é coletada para o cálculo da

energia livre de Gibbs (ΔG) através do método Umbrella Sampling[20]. O logP é dado por –

ΔG/R∙T, onde T é a temperatura e R a constante universal dos gases perfeitos.


(A)

(B)

Figura 3. Dinâmica molecular da transferência da claritromicina da fase aquosa (A) para a fase

hidrofóbica (B).

Já o modelo de surfactante pulmonar construído pretende simular o CUROSURF®, com

os lipídeos descritos na figura 1 e segundo a proporção correspondente na literatura[7]. O script

INSANE foi utilizado para a construção de um sistema constituído por duas monocamadas

fosfolipídicas concatenadas com uma caixa d’água de 6 nm de altura entre elas, como mostra a

figura 4. Cada monocamada possui 1024 fosfolipídeos com as cabeças polares orientadas para

a fase aquosa. Além disso, foram adicionados íons para neutralizar o sistema, que possui

lipídeos com carga negativa. O sistema foi configurado em uma caixa de dimensões 25 x 25 x

40 nm3, que permitiu 15 nm de vácuo na parte superior e inferior.


Figura 4: Modelo de surfactante pulmonar com o fármaco (vermelho) acima das caudas apolares

dos lipídeos (verde), no vácuo, e a proteína SP-B (amarelo) entre a fase aquosa (azul) e as cabeças

polares.

O modelo de surfactante pulmonar construído também possui um modelo para a proteína

SP-B (surfactant protein B) que foi obtido por homologia através do servidor Swiss-Model[21].

Este modelo foi gerado no campo de força OPLS-AA (atomístico) e foi utilizado em uma

simulação em água no modelo TIP4P. O sistema possuía dimensões 7 x 7 x 7 nm3 e foi

submetido às etapas de minimização de energia (100 kJ mol-1), equilíbrio termodinâmico (298

K, 1 bar) e dinâmica molecular. Essa simulação foi utilizada para a geração do modelo da SP-

B no campo de força MARTINI, obtido através do script MARTINIZE.

Com o modelo de surfactante pronto e devidamente equilibrado, o modelo da

claritromicina é colocado no vácuo, como mostra a figura 4. A partir disso, seguiram-se as

mesmas etapas de minimização de energia, equilíbrio termodinâmico e dinâmica molecular.

Todas se seguiram de maneira idêntica às anteriores, exceto pelo tipo de acoplamento de

pressão ser do tipo surface-tension, que permite que a simulação possa ser realizada em tensões

superficiais específicas. Portanto, foram realizadas duas simulações com a tensão superficial de

30 mN m-1 utilizando o modelo neutro (durante 1.2 μs) e o protonado (durante 2 μs). O sistema

e sua mudança com o tempo foram visualizados utilizando o programa VMD.

Resultados

Os primeiros resultados dizem respeito à validação dos modelos. O Umbrella Sampling

utiliza o método de análise de histogramas ponderados (wham) para a produção de gráficos de

perfis energéticos e histogramas. Foram obtidos perfis energéticos com baixo desvio padrão e

histogramas bem sobrepostos (Figura 5), o que indica que o resultado é confiável.

(A)


(B)

Figura 5. Perfil energético e histograma do modelo neutro (A) e carregado (B).

A Tabela 1 mostra os valores de energia e log P dos modelos. Como o log P considera o

fármaco neutro, o log D é o parâmetro correspondente para avaliar a lipofilicidade quando a

carga é diferente de zero. O log D varia com o pH, portanto, o valor de referência utilizado para

a claritromicina protonada corresponde ao pH igual a 7, uma vez que, a fase aquosa simulada é

neutra e nessas condições a claritromicina já está protonada (pKa = 8.99).

Go

(kCal mol-1)

Gw

(kCal mol-1)

ΔGow

(kCal mol-1)

Log P ou

log D

(calculado)

Log P ou

log D

(referência)

Erro (%)

Neutro -5.06 0.00 -5.06 3.71 3.18 16.75

Carregado 0.00 2.32 -2.3 1.70 1.84 −7.62

Tabela 1: Valores de ΔG da transferência de fases e de log P correspondentes. O índice “w” indica a

fase aquosa, enquanto que o índice “o” indica a fase do octanol.

Os valores indicam que os modelos propostos são apropriados para o estudo em dinâmica

molecular. Ambos foram estudados no modelo de surfactante. Primeiro, observou-se, durante

a dinâmica, que o fármaco entra naturalmente na monocamada, se localizando

preferencialmente entre as cabeças polares e as caudas carbônicas durante a maior parte do

tempo, como mostra a figura 6. Esse resultado foi observado tanto com o modelo neutro quanto

com o carregado. Também é importante destacar que em todo o tempo de simulação, o filme

fosfolipídico não apresenta colapso após a adsorção fármaco.


Figura 6. Configuração final do sistema após a adsorção da claritromicina no filme.

Essse resultado pode ser expresso quantitativamente através das análises dos perfis de

densidade relativa (Figura 7-I) e das coordenadas no eixo Z dos centros de massa (COM) do

fármaco e do filme (Figura 7-II). O gráfico das coordenadas mostra que o COM da

claritromicina coincide com o COM das cabeças polares mas oscila bastante durante a

simulação, se encontrando também acima destas. O gráfico de densidade relativa corrobora com

este resultado, mostrando que o fármaco se encontra livre pela monocamada, distribuído entre

as cabeças polares e a região das caudas. Nota-se também que não há diferença significativa

entre os dois resultados.

(A) (I) (II)

(B) (I) (II)


Figura 7. Os gráficos à esquerda (I) mostram as coordenadas (Z) do centro de massa da claritromicina

(amarelo) neutra (A) e protonada (B), das cabeças polares da monocamada superior (vermelho) e

inferior (azul). Os gráficos à direita mostram os perfis de densidade relativa da claritromicina

(amarelo) neutra (A) e protonada (B), das cabeças polares (vermelho) das caudas hidrocarbônicas

(verde).

Os parâmetros de ordem para todos os fosfolipídeos também foram obtidos. Na figura 8

são comparados os valores para o filme com e sem a claritromicina (carregada). Há uma

alteração significativa no parâmetro de ordem da primeira cauda do DPPI. Quanto aos outros

lipídeos, nenhuma alteração significativa foi verificada. Isso mostra que existe uma interação

da claritromicina com o fosfolipídeo DPPI. Importante ressaltar que o fosfolipídeo DPPI possui

resíduos com carga negativa, enquanto que a claritromicina possui carga positiva.

(A) (B)

Figura 8: Parâmetros de ordem do DPPI para o filme puro (A) e para o filme com claritromicina

protonada (B).

Um dos parâmetros analisados foi a área por lipídeo da monocamada nas simulações. A

tabela 2 compara a área por lipídeo do filme puro, contendo apenas a SP-B, com o filme

contendo a SP-B e a claritromicina. Nota-se que não há diferença significativa. Isso ocorre pois

a claritromicina possui fração em massa pequena quando comparada com todo o filme.

Sistema Área por Lipídeo

(Ǻ2 por molécula)

Filme 56.8 ± 0.1

Filme + Claritromicina 56.7 ± 0.1

Tabela 2: Área por lipídeo.

Conclusões

A parametrização e a dinâmica molecular coarse grained da claritromicina interagindo com o

modelo de surfactante pulmonar foram feitas com sucesso. Os modelos construídos para a

claritromicina no campo de força MARTINI são adequados para simulações. Verificou-se que o

modelo de surfactante pulmonar não apresenta colapso com a presença da claritromicina. Também

foi constatado que a carga do fármaco não interfere em sua adsorção no filme ou em sua localização

e interação com os fosfolipídeos. As implicações disto é que existe uma grande chance do surfactante

pulmonar poder ser utilizado como carreador da claritromicina para ser administrada localmente nos

alvéolos do pulmão.

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