Disciplina: Regulação da Expressão Gênica

Sarah Ribeiro Milograna

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto -USP

Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Molecular

A formação de estruturas de RNA cataliticamente ativas no spliceossomo requer a assistência de proteínas,

pouco conhecidas

1) Purificação dos complexos C – ocorre a ligação de exon durante o splicing?

2) Transição do complexo B para o C - a composição protéica pré-catalítica e catalítica varia no spliceossomo?

3) Identificação da estrutura central do complexo C por isolamento de ribonucleoproteínas (RNP)

Insights sobre o domínio RNP catalítico do spliceossomo – papel de proteínas centrais na sustentação da estrutura cataliticamente ativa.

RESUMO

INTRODUÇÃO

Spliceossomo

Proteínas que o constituem: principalmente as snRNPs U1, U2, U4/U6 e U5

Fonte: http://www.eurasnet.info/alternative-splicing/what-is-alternative-splicing

O sliceossomo se alinha, reconhecendo sequencialmente curtas sequências conservadas

-sítios de splicing 3’e 5’-branch point - BPS

INTRODUÇÃOSplicing do RNA-mensageiro

Fonte: http://ecg.bio.wvu.edu/courses/bioinf2012/class14.html

snRNPs U1 e U2 se ligam – Complexo A

U4-U6.U5 tri-snRNP – Complexo B pré-catalítico

Ativação do sliceossomo: - Desligamento do U1 e do U4-Rearranjo conformacional

INTRODUÇÃOSplicing do RNA-mensageiro

Fonte: http://ecg.bio.wvu.edu/courses/bioinf2012/class14.html

O Complexo B ativo catalisa o passo 1 do splicing: a adenosina no branch-point ataca o sítio 5’ do splicing gerando os intermediários -exon 5’ clivado -intron- 3’-exon

O complexo C é formado e catalisa o passo 2 do splicing:-intron é removido-exons 5’e 3’ são ligados

Fonte: http://www.nature.com/nrn/journal/v2/n1/box/nrn0101_043a_BX1.html

INTRODUÇÃO

U1 sítio 5’U2 BPS

U6 (U1) sítio 5’/U2 + U5/exon

Estrutura pre-mRNA/U2/U5/U6

Passo 1 splicing

Principais small nuclear RNPs envolvidas

O centro catalítico do spliceossomo

A catálise é baseada no RNA

Envolve muitas proteínas:

1) Prp8 (sítios 5’ e 3’, BPS)2) Prp19-CDC5 (humanos) ou Prp19-NTC em levedura3) Complexo SF3a/SF3b de proteínas heterotriméricas

(estabilizam interação U2-BPS)

Pouco ainda se sabe sobre o número e natureza das proteínas que mantêm a estrutura cataliticamente ativa no centro do spliceossomo

INTRODUÇÃO

A proteína Prp8

Fonte: Grainger and Keggs 2005, RNA 2005 11: 533-557

INTRODUÇÃO

Fonte: Grainger and Keggs 2005, RNA 2005 11: 533-557

INTRODUÇÃO

Fonte: Grainger and Keggs 2005, RNA 2005 11: 533-557

INTRODUÇÃO

Purificação de complexos B e C

Identificação de proteínas do centro RNP do spliceossomo:- Isolamento de spliceossomos que catalisam splicing por si. Anderson & Moore, 1997 e 2000 – pré-mRNA derivado de adenovirus -

sem o sítio de splicing 3’ e exon 3’ - catalisa a ligação bimolecular de exon (passo II do splicing) em extrato nuclear, quando é fornecido um RNA in trans contendo sítio splice 3’

Experimento: Isolamento do complexo C - splicing in vitro por incubação de pré-mRNA PM5 com extrato nuclear de HeLa

Fig 1. a, Diagrama do PM5 pre-mRNA

Fig1. b e c, cinética do splicing in vitro e formação complexos com o pré-mRNA PM5 (extrato nuclear de HeLa seguido por digestão com RNase H - RH)b, Análise de RNA por desnaturação PAGEc, complexos de splicing analisados por gel de agarose

-PM5 sofreu clivagem do sítio de splice 5’ e formou a alça de intron, mas não a ligação com o exon (Fig 1.b)-Complexos B foram formados inicialmente (Fig 1.c.)-Complexos C foram formados tardiamente (Fig 1.c.)

Após formação de complexos C – adição de RNA com sequência 5’-GAGAG-3’ (AG representa o sítio de splice 3’) associada a um exon 3’ de 55 nucleotídeos derivado de um adenovírus

Controle do reconhecimento do sítio de splice 3’: um RNA idêntico, mas com uma mutação GG substituindo AG (exon 5’-GACGG-3’) foi alternativamente adicionado

Purificação de complexos B e C

Fig 2. a, Complexos C purificados por afinidade catalisam a ligação bimolecular (dos exons) por si. a, diagrama dos substratos 3’ de RNA e dos produtos da ligação dos exons. Seta mostra o sítio 3’ de splice esperado.

Fig 2. b, Complexos C purificados por afinidade catalisam a ligação bimolecular por si. b, ligação bimolecular do exon com o pré-mRNA PM5 em extrato nuclear (NX).

Northern Blotting: geração de produtos de mRNA do tamanho esperado, com ambos RNAs contendo os sítios 3’ – os spliceossomos formados no substrato PM5 podem catalisar a ligação bimolecular de exon.

Obs: nenhum produto de mRNA foi observado quando não houve formação prévia do complexo C (ainda que o splicing nos sítios 3’ tenha ocorrido)

Purificação de complexos B e C

A proteína MS2 da cápsula colifago foi usada para purificar por afinidade os complexos B e C formados no substrato PM5.

Os complexos B: snRNPs U1, U2, U4, U5 e U6 junto a pré-mRNA “non-spliced”

Os complexos: U2, U5 e U6, intermediários do passo I de splicing (o exon 5’ excisado e o intron lariat) e apenas alguns fragmentos de pré-mRNA non-spliced.

Fig. 3

Os complexos C purificados são ativos Para determinar se os complexos C

purificados por afinidade são ativos: ensaios de ligação bimolecular de exon em extratos nucleares tratados e não-tratados com nuclease micrococal (NM) – hidrolisa pontes 5’ fosfodiesterases

A ligação de exon foi observada a uma eficiência comparável à dos complexos não purificados em ambos os extratos (tratado e não-tratado) e até mesmo na ausência de extrato Nas amostras com mutantes GG, foi observado uma diferença no uso do sítio 3’

Fig2. c, complexos C purificados ou centro RNP precipitados com sal com ou sem tratamento MN, e RNAs com sítio 3’AG ou CG.

A ligação bimolecular do exon com os complexos C foi mais eficiente na presença do ATP do que na de outros NTPs testados, e menos eficiente ainda na presença de análogos de ATP não-hidrolisáveis e lentamente hidrolizáveis (AMP-PNP, ATP-γS)

Fig2. c, complexos C purificados, indicação dos nucleotídeos mais o RNA AG sítio 3’.

Os complexos de spliceossomo purificados e não-imobilizados possuem uma atividade catalítica intríseca

Os complexos C purificados contêm todos os fatores

necessários para que ocorra o passo II do splicing

As RNP centrais não são suficientes para desencadear a atividades catalítica

Os complexos C purificados são ativos

Dinâmica de proteínas da transição entre complexos B e C

As proteínas presentes nos complexos B e C purificados por afinidade foram separadas por SDS-PAGE e identificadas por espectrofotometria de massa (MS)

Espectrofotometria de massa:- 130 proteínas de complexo B (a maioria já havia sido encontradas

no complexo B do pré-mRNA de adenovirus)- 150 proteínas do complexo C – 105 eram as mesmas encontradas

no complexo B- Proteínas comuns a B e C: maioria das proteínas associadas a U5

e a U2 (complexo Prp19-CDC5 e proteínas relacionadas; componentes do complexo RES - retenção e splicing)

Sequenciamento por MS:

- Proteínas perdidas durante a transição de B para C:• quase todas as U1 e U4• proteína U6 Lsm • outras que não são snRNP

Chen et al, 2003: Imunoprecipitação em levedura - proteínas Lsm são desativadas durante a ativação do spliceossomo, permitindo a terminação 3’de U6 parear com o sítio 5’de splice

Os dados aqui encontrados evidenciam que proteínas Lsm humanas também são desativadas ou perdidas durante a transição de B para C – indicação de que esse evento de remodelamento é conservado em eucariotos.

Dinâmica de proteínas da transição entre complexos B e C

Identificação de proteínas encontradas somente ou predominantemente nos complexos C (recrutadas durante ativação catalítica ou o passo I do splicing)

Dinâmica de proteínas da transição entre complexos B e C

- Fatores do passo II (facilitadoras de mudança conformacional ): •helicases DEAD-box Abstrakt e DDX35•peptidyl-prolyl isomerases (PPIs) PPIL3b, PPWD1 e PPIG

Fonte: http://wires.wiley.com/WileyCDA/WiresArticle/wisId-WRNA50.htmlF

Proteínas do complexo C

A maioria dos componentes centrais do complexo de junção do exon

- eIF4A3- Magoh - Y14

Fonte: http://www.genecards.org/cgi-bin/carddisp.pl?gene=EIF4A3

Identificação de proteínas encontradas somente ou predominantemente nos complexos C (recrutadas durante ativação catalítica ou o passo I do splicing)

Imunoblotting:detecção de proteínas selecionadas

- U5-116K (componente central de B e C) - Proteínas de fusão de MS2 com proteína ligante de maltose

(MBP) – encontradas em quantidades similares em ambos os complexos

- Lsm4 foi detectada somente em complexos B- Fatores humanos de passo II hPrp22 e hSlu7, DDX35 e Abstrakt

foram detectadas no complexo C- Pequenos traços de Prp16 foram encontradas no Complexo C –

necessária apenas antes da formação do complexo C ou em pequenas quantidades durante o passo II.

Proteínas do complexo C

Proteínas do complexo Prp19-CDC5 (e relacionadas) predominaram no complexo C

Consistentemente, foram identificadas mais intensamente as proteínas Prp19, RBM22, AD002, PRL1, SKIP, Cyp-E e KIAA0560 no complexo C– parecem estar mais estavelmente associadas neste estágio.

Em contraste, peptídeos como SF3a e SF3b predominaram no complexo B (MS e immunoblotting) - – parecem ser desestabilizadas durante a transição B-C

- A aparente desestabilização ou perda de proteínas SF3a/b, e a estabilização de proteínas Prp19-CDC5 indicam que mecanismo de contato proteína-proteína e proteína-RNA estão envolvidos no remodelamento que ocorre antes e durante o passo I do splicing.

Proteínas do complexo C

Proteínas no centro RNP do spliceossomo

Identificação de proteínas requeridas para a manutenção da rede de RNA cataliticamente ativa no passo I do spliceossomo - purificação dos complexos C por precipitação com ˃ 1M NaCl seguido por centrifugação com glicerol

- Os complexos tratados com sal sedimentam em um único pico ribonucleoprotéico, como determinado pela distribuição de RNA marcados com P ao longo de um gradiente

- Apenas traços de RNA radioativamente marcados foram detectados no topo do gradiente, indicando que quase todos os exons 5’ removidos e o intron lariat permaneceram associados ao complexo RNP

- Um gradiente de frações de 13-15 (o pico RNP) continha quase quantidades equimolares de ambos os intermediários do passo I, assim como dos snRNPs U2, U5 e U6 sugerindo que partículas RNP intactas permanecem intactas após tratamento com sal

Fig 4. Proteínas U5- e Prp19-CDC5 permanecem associadas ao centro RNP do complexo C. b, c, frações em gradiente de RNA do complexo C tratado com sal, detectado por marcação de prata (b) ou autoradiografia.

A vasta maioria dos complexos B tratados com sal sedimentaram lentamente em relação aos complexos C

• dissociação do complexo B• a ativação catalítica do spliceossomo parece levar a uma conformação

central de RNP mais estável, sugerindo que os complexos proteína-RNA e proteína-proteína do complexo B e do complexo C são aparentemente diferentes.

Proteínas no centro RNP do spliceossomo

Fig 4. Proteínas U5- e Prp19-CDC5 permanecem associadas ao centro RNP do complexo C. a, Complexos C ou B purificados tratados com 1M NaCl e separados em gradientes de glicerol contendo 1M de NaCl

RNA

mar

cado

com

P

Composição de proteínas:- fração de 13-15: complexo RNP - frações 1-5: proteínas dissociadas

SDS-PAGE e MS: As comparações visuais dos padrões de bandas dos picos de RNP com as frações dos gradientes revelam claras diferenças de composição.

Pico: predominantemente proteínas do complexo Prp19 e fatores relacionados (hPrp, CDC5, hSyf3 SKIP, Prl 1, RBM22, AD002 e G10), assim como U5-220, U5-116 e U5-40K, que formam um complexo heterotrimérico altamente estável.

Proteínas no centro RNP do spliceossomo

Fig 4. Proteínas U5- e Prp19-CDC5 permanecem associadas ao centro RNP do complexo C. d, proteínas do complexo C tratado com sal , separadas por SDS-PAGE e marcadas com prata. Um conjunto do proteínas exclusivamente ou predominantemente dissociadas (direita) ou presentes no centro de RNP (esquerda) são indicadas.

Complexo central de RNP resistente a sal: 37 proteínas predominantemente ou exclusivas (intensidade das bandas e o número de peptídeos sequenciados por MS) – componentes centrais do complexo C cruciais para a manutenção da rede do RNA cataliticamente ativa.

Algumas proteínas foram encontradas em quantidades ≈ em ambas as frações.

Proteínas no centro RNP do spliceossomo

Outras, como o complexo de junção de exon e fatores do passo II como as hPrp22 e hSlu7, ou componentes de SF3a/b, foram encontrados exclusivamente no topo do gradiente. Essas proteínas não parecem ser fundamentais para a manutenção do centro RNP do complexo C.

Em contraste com os complexos C isolados em condições fisiológicas, os complexos C tratados com sal não suportam per se a ligação bimolecular de exon. Entretanto, quando suplementado com extrato nuclear MN apresentam ligação de exon, embora a uma eficiência menor do que a observada com os complexos C naturais. A rede central RNP provavelmente carece de uma ou mais proteínas requeridas para a ligação do exon, mas sua estrutura de RNA e RNP permanece intacta.

Proteínas no centro RNP do spliceossomo

Os complexos C incubados com extrato nuclear MN-treated sedimentam mais rápido do que os tratados com sal, com valores S apenas um pouco menores do que os complexos C nativos, indicando que muitas proteínas se reassociam.

Proteínas no centro RNP do spliceossomo

Fig 4. Proteínas U5- e Prp19-CDC5 permanecem associadas ao centro RNP do complexo C. e, sedimentação de Complexos C purificados, centro RNP do complexo C, e de complexos C reorganizados em gradientes de glicerol RN

A m

arca

do c

om P

Conclusões Purificação de spliceossomos de mamíferos que são naturalmente

cataliticamente ativos

Troca de proteínas durante a transição do complexo B para o C quando o sítio ativo do spliceossomo é formado

Os complexos proteícos heterotriméricos SF3a/b estão mais abundantemente presentes nos complexos B do que no C, indicando que aparentemente são desestabilizados antes ou durante o primeiro passo catalítico do splicing – o que estabiliza a ligação de U2 com este complexo?

Em contraste com a SF3a/b, Prp19-CDC5 e proteínas relacionadas parecem ser mais estavelmente associadas com os complexos C. Ligada a U5, permanecem associadas com os intermediários de splicing do pré-mRNA e as snRNAsU2 e U6

A presença de homólogos humanos de proteínas NTC, assim como em leveduras, mostra a importância dessas proteínas para a estabilização da associação de U5 e U6 com o pré-mRNA após a dissociação U1 e U4 – conservação em eucariotos.

Sugerida a participação de outras Prp19, além das que fazem parte do complexo central Prp19-CDC5, na estabilização de estruturas de RNA cataliticamente ativas no passo I do spliceossomo.

A presença de hPrp8 no complexo C corrobora evidências de que esta proteína se associa a grupos reativos no pré-RNA, agindo como um co-fator durante a catálise do splicing

A composição protéica do complexo C central é altamente similar à do snRNP 35S U5, confirmando a hipótese prévia de que esta representa uma forma remodelada de U5 gerada durante a ativação do spliceossomo, que é liberada após a ligação do exon como um complexo pós-spliceossomo

Conclusões

A habilidade de isolar o complexo C humano ativo e seu complexo protéico central de RNP é um passo importante para estabelecer a estrutura tridimensional da rede central do spliceossomo

Os complexos C purificados podem ser usados para determinar a estrutura do spliceossomo cataliticamente ativo preparado para o passo II do splicing

As proteínas do complexo C estabilizadas com sal podem ser usadas no futuro para identificar proteínas envolvidas no passo catalítico II e outras proteínas parceiras de interação com o spliceossomo.

Conclusões

Obrigada!!