Disserta o Nadia Peres

download Disserta o Nadia Peres

of 43

Transcript of Disserta o Nadia Peres

  • 1

    Nadia David Peres

    DETECO DE LISTERIA MONOCYTOGENES EM LEITE: SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE DA TCNICA DE

    REAO EM CADEIA DA POLIMERASE (PCR)

    Dissertao apresentada Universidade Federal de Minas Gerais, Escola de Veterinria, como requisito parcial para a obteno do grau de Mestre em Medicina Veterinria.

    rea de concentrao: Tecnologia e Inspeo de Produtos de Origem Animal

    Orientadora: Mnica Maria Oliveira Pinho Cerqueira

    Belo Horizonte Escola de Veterinria da UFMG

    2007

  • 2

    P437d Peres, Nadia David, 1979- Deteco de Listeria monocytogenes em leite: sensibilidade e especificidade da tcnica de

    reao em cadeia da polimerase (PCR) / Nadia David Peres. 2007. 43 p. : il.

    Orientadora: Mnica Maria Oliveira Pinho Cerqueira Dissertao (mestrado) Universidade Federal de Minas Gerais, Escola de Veterinria Inclui bibliografia

    1. Leite Anlise Teses. 2. Listeria Identificao Teses. 3. Reao em cadeia da polimerase -Teses. I. Cerqueira, Mnica Maria Oliveira Pinho. II. Universidade Federal de Minas Gerais. Escola de Veterinria. III. Ttulo.

    CDD 637

  • 3

    Dissertao defendida e aprovada em 2 de maro de 2007 pela Comisso Examinadora constituda por:

    _________________________________________

    Prfa. Mnica Maria Oliveira Pinho Cerqueira Orientadora

    _________________________________________

    Dra. Carla Christine Lange

    _________________________________________

    Prof. Marcelo Resende de Souza

  • 4

  • 5

    Aos meus queridos pais e a Deus

    AGRADECIMENTOS

    professora Mnica Maria Oliveira Pinho Cerqueira pela orientao, inspirao e amizade.

    Aos professores Marcelo Resende, Cludia Moraes e Mnica Leite por terem despertado em mim o interesse nessa rea, pelo apoio e dicas.

    Aos professores de saneamento Israel e Paulinho pela ajuda.

    Emlia, pessoa que muito ajudou em todos os sentidos, obrigada por abrir as portas de sua casa e por todos os momentos em Juiz de Fora. Agradeo tambm Dona Lcia e a Moara pelo acolhimento.

    Ao Ricardo e Paula pelo companheirismo, amizade, noites de estudos, fins de semana na EMBRAPA e por serem minha famlia durante a realizao do experimento.

    Marcela e Dbora por colaborarem em momentos difceis e decisivos sempre com muita alegria.

    Ao John, Marcinha e Ded pela simpatia.

    Aos estagirios Vitor, Lo, Shao-lin, Liana, Abiah, Alessandra, Carol e Sabrina pela ajuda no experimento.

    Jasmin, Priscila e rika por tornarem mais divertidos meus dias em Juiz de Fora.

    Ao Marcos e Arnaldo do laboratrio de Microbiologia do Leite/EMBRAPA por tudo que me ensinaram.

  • 6

    Dra. Cida, Dra. Edna e ao Dr. Renaldi, muito obrigada pelo excelente projeto e pelo apoio.

    Crisolita, FUNED e Universidade Federal de Viosa pelas amostras.

    Ao Dr. Wladimir da Silva Padilha Laboratrio de Microbiologia de Alimentos e Universidade Federal de Pelotas pelas amostras cedidas.

    Ao Instituto de Laticnio Cndido Tostes pelas amostras de leite fornecidas.

    EMBRAPA Gado de Leite pelo financiamento do projeto e oportunidade de estgio.

    Fundao Coordenao Aperfeioamento de Pessoal de Nvel Superior (CAPES), pela bolsa fornecida.

    Ao IMA e ao LANAGRO-MG por permitirem a concluso do mestrado.

    Aos meus pais pelo apoio financeiro e emocional.

    Dra. Carla, pela pacincia, ensinamentos, cobranas, orientao, ajuda e principalmente pela maneira que passou seus conhecimentos.

    A Deus, sempre, por tudo...

    A adversidade desperta em ns capacidades que, em circunstncias favorveis, teriam ficado adormecidas.

    Horcio

  • 7

    SUMRIO Pg. RESUMO ...........................................................................................................................12

    ABSTRACT ......................................................................................................................13

    1. INTRODUO ................................................................................................ 14

    2. REVISO DE LITERATURA ........................................................................................14 2.1. HISTRICO.................................................................................................... 14 2.2. O GNERO Listeria........................................................................................ 15 2.3 LISTERIOSE................................................................................................... 15 2.4 MECANISMOS DE INFECO................................................................... 16 2.5 SENSIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS E RESISTNCIA TRMICA 17 2.6 ALGUNS SURTOS E OCORRNCIAS EM ALIMENTOS........................ 17 2.7 MTODOS DE DETECO......................................................................... 18

    3. OBJETIVOS ................................................................................................. 21 3.1 OBJETIVO GERAL ...................................................................................... 21 3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS ......................................................................... 21

    4. MATERIAL E MTODOS .............................................................................................22 4.1 AMOSTRAS DE BACTRIAS..................................................................... 22 4.2 CARACTERIZAO BIOQUMICA DAS AMOSTRAS DE BACTRIA 22 4.2.1 Colorao de Gram.......................................................................................... 22 4.2.2 Tipo de hemlise.............................................................................................. 22 4.2.3 Teste de catalase.............................................................................................. 23 4.2.4 Motilidade no meio SIM.................................................................................. 23 4.2.5 Teste do vermelho de Metila (VM)................................................................. 23 4.2.6 Teste de Voges-Proskauer (VP)...................................................................... 23 4.2.7 Teste de CAMP (Christie, Atkins e Munch-Peterson).................................... 24 4.2.8 Teste de oxidase............................................................................................... 24 4.2.9 Hidrlise da esculina........................................................................................ 24 4.2.10 Hidrlise do hipurato de sdio........................................................................ 24 4.2.11 Formao de cidos a partir de carboidratos................................................... 24 4.2.12 Reduo do nitrato.......................................................................................... 25 4.3 EXTRAO DE DNA DAS CULTURAS BACTERIANAS....................... 25 4.3.1 Extrao utilizando fenol e clorofrmio (Jersek et al., 1996)........................ 25 4.3.2 Mtodo de lise trmica.................................................................................... 26 4.3.3 Mtodo de lise trmica diretamente da colnia............................................... 26 4.4 QUANTIFICAO DE DNA........................................................................ 26 4.5 PADRONIZAO DA PCR.......................................................................... 26 4.5.1 Oligonucleotdeos iniciadores......................................................................... 26 4.5.2 PCR................................................................................................................. 26 4.5.3 Eletroforese em gel de agarose....................................................................... 27 4.6 AVALIAO DA SENSIBILIDADE E ESPECIFICIDADE DA PCR

    PARA Listeria monocytogenes.......................................................................

    27 4.6.1 Avaliao da especificidade............................................................................ 27

  • 8

    4.6.2 Avaliao da sensibilidade.............................................................................. 28 4.6.2.1 Determinao da concentrao celular de um cultivo de Listeria

    monocytogenes.................................................................................................

    28 4.6.2.2 Determinao da sensibilidade da PCR em detectar Listeria monocytogenes

    em leite esterilizado a 110/10 minutos...........................................................

    28 4.6.2.3 Determinao da sensibilidade da PCR em detectar Listeria monocytogenes

    em leite cru com baixa contaminao microbiana inicial e em leite cru com alta contaminao microbiana inicial..............................................................

    29 4.7 COMPARAO DA PCR COM O MTODO

    CONVENCIONAL..........................................................................................

    29

    5. RESULTADOS E DISCUSSO ......................................................................................29 5.1 CARACTERIZAO BIOQUMICA DOS ISOLADOS.............................. 29 5.2 PADRONIZAO DA PCR.......................................................................... 30 5.3 DETERMINAO DA SENSIBILIDADE DA PCR EM DETECTAR

    Listeria monocytogenes EM LEITE ESTERILIZADO A 110/10 MINUTOS.......................................................................................................

    32 5.4 DETERMINAO DA SENSIBILIDADE DA PCR EM DETECTAR L.

    monocytogenes EM LEITE CRU COM BAIXA CONTAMINAO MICROBIANA INICIAL................................................................................

    34 5.5 DETERMINAO DA SENSIBILIDADE DA PCR EM DETECTAR L.

    monocytogenes EM LEITE CRU COM ALTA CONTAMINAO MICROBIANA INICIAL................................................................................

    36

    6. CONCLUSES ................................................................................................ 39

    7. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ................................................................39

  • 9

    LISTA DE TABELAS Tabela 1 - Agentes seletivos e indicadores em alguns meios para detectar Listeria

    monocytogenes.................................................................................................

    20 Tabela 2 - Oligonucleotdeos utilizados na reao de PCR para identificao de

    Listeria monocytogenes...................................................................................

    26 Tabela 3 - Caracterizao bioqumica e amplificao por PCR de amostras de Listeria

    spp. isoladas do ambiente, de queijo e de produtos crneos, e de amostras-padro de Listeria spp....................................................................................

    30 Tabela 4 - Comparao entre os mtodos Convencional e PCR na deteco de Listeria

    monocytogenes inoculada em leite estril..........................................

    33 Tabela 5 - Concentrao de DNA bacteriano total obtido por extrao de DNA

    utilizando fenol-clorofrmio aps 24 e 48 horas de incubao em caldo de enriquecimento (LEB).....................................................................................

    33 Tabela 6 - Comparao dos mtodos Convencional e PCR na deteco de L.

    monocytogenes experimentalmente inoculada em leite cru com baixa populao microbiana, submetido a diferentes nveis de contaminao.........................................................................................

    35 Tabela 7 - Comparao dos mtodos Convencional e PCR na deteco de L.

    monocytogenes inoculada em leite cru com alta contaminao microbiana, aps etapa de enriquecimento seletivo..............................

    37

  • 10

    LISTA DE FIGURAS Figura 1 Isolamento e identificao de Listeria spp. e Listeria monocytogenes em

    amostra de alimentos e do ambiente...............................................................

    19 Figura 2 Fluxograma de comparao dos mtodos de PCR e convencional para

    deteco de L. monocytogenes.........................................................................

    28 Figura 3 Reao de PCR multiplex com os oligonucleotdeos LMA/LMB e

    IAP1/IAP2. Canaleta 1: L. monocytogenes ATCC 19117; canaleta 2: Streptococcus uberis; canaletas 3 e 5: Streptococcus agalactiae, canaleta 4: marcador de peso molecular de 100 pb; canaletas 6 e 7: Staphylococcus aureus; canaleta 8: controle negativo...........................................................................................................

    31 Figura 4 PCR com os oligonucleotdeos LM1/LM2. Canaleta 1: L. monocytogenes

    ATCC 19117; canaleta 2: L. monocytogenes; canaleta 3: L. innocua IAL 1984; canaleta 4: L. ivanovii IAL 1983; canaleta 5: marcador de peso molecular de 100 pb; canaleta 6: L. seeligeri IAL 1985; canaleta 7: L. welshimeri; canaleta 8: controle negativo da reao de PCR..................................................................................................................

    32 Figura 5 PCR com os oligonucleotdeos LM1/LM2 aps a etapa de enriquecimento a

    30C/48 h, com diferentes diluies de L.monocytogenes. Canaletas 1,2 e 3: extrao de DNA por lise trmica do leite contaminado inicialmente com 48 UFC/ml; 4, 5 e 6: extrao de DNA por lise trmica do leite contaminado inicialmente com 8 UFC/ml; 7 e 24; marcador de peso molecular (100 pb); 8, 9 e 10: extrao de DNA por lise trmica do leite contaminado inicialmente com 1 UFC/ml; 11 e 25: controles positivos; 12 a 21: extrao de DNA por lise trmica do leite inoculado com diluies onde no foram observado crescimento bacteriano no petrifilm; 22: controle negativo no inoculado; 23: controle negativo da reao de PCR; 26, 27 e 28: extrao de DNA utilizando fenol-clorofrmio do leite contaminado inicialmente com 48 UFC/ml; 29, 30 e 31: extrao de DNA utilizando fenol-clorofrmio do leite contaminado inicialmente com 8 UFC/ml; 32,33 e 34: extrao de DNA utilizando fenol-clorofrmio do leite contaminado inicialmente com 1 UFC/ml; 15 e 35 vazio.....................................................

    34 Figura 6 PCR realizado com DNA extrado diretamente de colnias suspeitas

    crescidas nas placas de TSYEA. Canaletas 1,2 e 3: contaminao inicial de 45 UFC/ml; 4-7, 9-13: contaminao inicial de 6 UFC/ml; 14: controle positivo da reao; 8: marcador de peso molecular (100 pb).........................

    35 Figura 7 PCR com os oligonucleotdeos LM1/LM2 aps a etapa de enriquecimento a

    30C/48 h com diferentes diluies de L.monocytogenes extrados pelo mtodo utilizando fenol-clorofrmio e reao de PCR realizada com DNA extrado diretamente de colnias suspeitas. Canaletas 1 a 9: extrao de DNA do leite contaminado com nmero incontvel de L. monocytogenes; 7 e 24: marcador de peso molecular (100 pb); 10 e 11: extrao de DNA do leite contaminado com 70 UFC/ml; 12 e 13: extrao de DNA do leite contaminado com 8 UFC/ml; 14 e 25: controles positivos; 15 e 35: vazios; 16 ao 23: extrao de DNA do leite sem contaminao inicial; 26 e 27: controles negativos; 28 a 32: extrao de DNA direto da colnia/contaminao inicial incontvel; 33 e 34: extrao de DNA direto da colnia com contaminao inicial de 70 UFC/ml............................................................................................................

    37

  • 11

    LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

    AOAC Association of Official Analytical Chemists API Application Programming Interface BHI Brain Heart Infusion BPF Boas Prticas de Fabricao CAMP Christie, Atkins e Munch-Peterson CBT Contagem Bacteriana Total CDC Centro de Preveno e Controle de Doenas EDTA Sal do cido Etilenodiaminotetractico ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay FDA Food and Drug Administration HCLA gar Hemoltico Ceftazidima-cloreto IAL Instituto Adolfo Lutz IAP Invasion Associated Protein IDF International Dairy Federation LEB Listeria Enrichemiment Broach LPM Ltio-feniletanol-moxalactam PCR Reao em Cadeia da Polimerase pH Potencial Hidrogeninico RAPD-PCR Anlise do polimorfismo de fragmentos de DNA amplificados ao acaso RT-PCR Reao da Cadeia em Polimerase em Tempo Real SSC 0,15 mol/l NaCl, 0,015 mol/l citrato de sdio TE Tris-EDTA TSA Tripticase Soy Agar UFC Unidades Formadoras de Colnia VM Vermelho de Metila VP Voges-Proskauer

  • 12

    RESUMO

    O objetivo deste trabalho foi detectar Listeria monocytogenes inoculada em leite, aps um perodo de enriquecimento seletivo, por meio da tcnica de PCR. Foi feita a padronizao de uma PCR utilizando os oligonucleotdeos LM1/LM2 e de uma PCR multiplex com os oligonucleotdeos IAP1/IAP2 e LMA/LMB. Listeria monocytogenes foi inoculada em vrias concentraes em leite esterilizado desnatado e em leite cru integral com dois nveis diferentes de contaminao. A PCR padronizada foi aplicada para identificar a bactria inoculada experimentalmente e foi comparada com o mtodo convencional de deteco de L. monocytogenes. Foram comparados, tambm, os mtodos de extrao de DNA utilizando fenol-clorofrmio e por lise trmica, a partir de um caldo de cultura e diretamente da colnia suspeita. Somente foi possvel identificar L. monocytogenes por PCR no leite esterilizado desnatado, aps 48 horas de enriquecimento em meio seletivo (LEB). Neste caso, a sensibilidade do teste foi de 1 UFC/ml de leite, a mesma sensibilidade da metodologia convencional. Quando inoculada em leite cru integral com contaminao bacteriana, L. monocytogenes s foi detectada pela metodologia convencional, com uma sensibilidade de at 2 UFC/ml (leite com baixa contaminao). Foi possvel reduzir o tempo de identificao de L. monocytogenes, substituindo os testes fenotpicos de identificao pela PCR padronizada, utilizando DNA bacteriano extrado pelo mtodo de lise trmica, diretamente da colnia suspeita.

    Palavras-chave: Listeria monocytogenes, PCR, deteco, leite

  • 13

    ABSTRACT

    The aim of this work was to detect Listeria monocytogenes added in milk, after selective enrichment period, by PCR technique. A PCR technique using the primers LM1/LM2 and a multiplex PCR with IAP1/IAP2 e LMA/LMB was standardized. The conventional method of L. monocytogenes detection was compared from milk samples with different bacterial count added with various L. monocytogenes concentrations. The DNA extraction methods using phenol-chloroform and thermal split were compared. The DNA extraction and the conventional methods showed the same result in detecting the bacterium in samples of sterilized milk. In milk samples with any initial contamination, the conventional methodology was sensitive and PCR from enrichment broth can not detect L. monocytogenes added, independently of the extraction method used. The identification time of L. monocytogenes decreased using the DNA extraction by the strain split method using suspect colonies that grew in Oxford and PALCAM, in substitution of identification phenotypes tests.

    Key words: Listeria monocytogenes, PCR, detection, milk

  • 14

    1 INTRODUO

    Algumas doenas de origem alimentar so bem conhecidas, mas esto sendo consideradas emergentes porque, recentemente, se tornaram mais comuns. Listeria monocytogenes um microrganismo emergente porque foi recente o reconhecimento do papel do alimento na sua transmisso ao homem.

    Listeriose est mais freqentemente associada com o consumo de alimentos contaminados, como queijos macios e carnes processadas, que so conservados sob refrigerao, pois o microrganismo envolvido capaz de crescer em baixas temperaturas.

    Durante o processo de produo, elaborao, transporte, armazenamento e distribuio, qualquer alimento pode se contaminar por substncias txicas, bactrias, vrus e parasitos. O leite, devido ao pH prximo ao neutro e sua variedade e quantidade de nutrientes, constitui um excelente meio de cultura para o desenvolvimento de diversos microrganismos. Os cuidados higinicos para evitar contaminao devem ser iniciados na ordenha e continuados at o momento de se consumir o produto. O queijo considerado um veculo freqente de patgenos de origem alimentar e, em especial, os queijos frescos artesanais tm sido muito relatados em surtos de infeco e intoxicao alimentar. Dentre esses queijos artesanais, destaca-se o queijo de coalho por ser comumente elaborado a partir de leite cru.

    Doenas causadas pelo consumo de alimentos contaminados causam impacto sade pblica e economia mundial. O Centro de Preveno e Controle de Doenas (CDC) estima que doenas de origem alimentar so responsveis por 76 milhes de casos por ano nos Estados Unidos, resultando em 325.000 hospitalizaes e

    5.000 mortes (Food..., 2002). A listeriose se tornou uma preocupao no Brasil e no mundo a partir da dcada de 80, quando ocorreram surtos, sobretudo na Amrica do Norte.

    A emergncia da listeriose resulta de interaes complexas entre vrios fatores, refletindo em mudanas no padro social. Esses fatores incluem: progressos mdicos e mudanas geogrficas, assim como o aumento do nmero de pessoas imunossuprimidas e idosas; mudana na produo primria de alimentos (produo em larga escala), modificaes nos processos tecnolgicos, desenvolvimento da indstria agrcola e de sistemas de estocagem sob refrigerao, alm de mudanas nos hbitos alimentares, como aumento da demanda de consumo por alimentos prontos, congelados ou refrigerados, que possam ser preparados rapidamente.

    Considerando a importncia desta doena transmitida pelo consumo de produtos de origem animal, este trabalho se props a padronizar uma PCR (Polimerase Chain Reaction) para identificar Listeria monocytogenes e avaliar a sensibilidade e especificidade da reao na identificao deste patgeno inoculado experimentalmente em leite.

    2 REVISO DE LITERATURA

    2.1 HISTRICO Listeria monocytogenes foi observada em feridas de pacientes, provavelmente em 1891. A primeira observao sobre Listeria em animais provavelmente coube a Hlphers em 1911, que isolou uma bactria de focos necrticos em fgado de coelho, denominada de Bacillus hepatis (Seeliger, 1984).

    A primeira descrio de um bastonete Gram-positivo foi feita por Murray et al. em 1926. Eles descreveram uma infeco espontnea que ocorreu entre os coelhos e cobaios de

  • 15

    laboratrio no biotrio da Universidade de Cambridge e denominaram o agente de Bacterium monocytogenes, em virtude de a infeco ser caracterizada por uma monocitose (Salamano et al., 2005). No ano seguinte, Pirie (1927) estudando uma epizootia em roedores na frica do Sul, isolou de fgado uma bactria que recebeu a denominao de Listerella hepatolytica, em homenagem ao cientista e cirurgio britnico lorde Joseph Lister (1827-1912), que estudou infeco sptica ps-operatria. Finalmente, em 1940, o microrganismo foi caracterizado de forma definitiva como Listeria monocytogenes (Gray e Killinger 1966; Oliveira, 1993; Hofer e Reis, 2005;).

    2.2 O GNERO Listeria

    Espcies de Listeria esto distribudas no ambiente e podem ser isoladas do solo, plantas, vegetao em decomposio e silagem (Quinn et al., 1994). Existem seis espcies descritas, que podem ser divididas em dois grupos: hemolticas e no-hemolticas. No primeiro grupo esto: L. monocytogenes, L. ivanovii (subespcies ivanovii e londoniensis) e L. seeligeri. As no hemolticas (segundo grupo) so L. grayi, L. innocua e L. welshimeri (Bille et al., 2003).

    Listeria monocytogenes uma bactria patognica, ubiqitria, microaerbia, Gram positivo que causa infeces srias em indivduos imunossuprimidos e em mulheres gestantes (Almeida e Almeida, 2003). Ela psicrotrfica, no esporulada, se caracteriza morfologicamente por ser bastonete curto e crescer rapidamente em culturas e em tecidos animais. A L. monocytogenes catalase positiva, oxidase negativa, hidrolisa a esculina, tolera at 10% de cloreto de sdio e cresce em pH variando entre 4,1 e 9,6 (Quinn et al., 1994; Almeida e Almeida, 2003). Possui ainda, a capacidade de formar biofilme (Gandhi e Chikindas, 2007).

    Listeria ivanovii e L. monocytogenes podem causar doenas em animais e L. monocytogenes tem sido muito incriminada como causadora de doena no homem (Quinn et al., 1994). Segundo Farber e Peterkin (1991), 95% dos surtos de listeriose humana de origem alimentar foram causados por L. monocytogenes sorotipos 1/2a e 4b.

    2.3 LISTERIOSE

    Listeriose uma doena alimentar atpica devido a sua gravidade e por no possuir natureza entrica, se manifestando na forma de meningite, septicemia e aborto. Grande nmero de acometidos vai a bito (20-30%) e o perodo de incubao varia de 3 a 70 dias com mdia de 3 semanas (Doyle et al., 1997).

    A sintomatologia causada pela listeriose em humanos inclui uma sndrome parecida com a influenza em mulheres grvidas. Listeria monocytogenes pode infectar o feto e causar aborto ou nascimento prematuro. Em trs casos de meningite por L. monocytogenes, relatados no Distrito Federal, os pacientes apresentaram febre e, dois deles, quadro de convulso, cefalia e vmito (Hofer et al., 1998). A manifestao neurolgica da doena pode ocorrer nos neonatos e em adultos, principalmente nos imunossuprimidos. Mdicos veterinrios e magarefes podem adquirir infeco primria cutnea e, depois, a forma generalizada (Quinn et al., 1994).

    De um total de 3.112 amostras de Listeria spp. provenientes de regies diferentes do Brasil, e que foram estocadas durante vinte e seis anos consecutivos (1971-1997), de diferentes origens (solo, efluente de indstria de embutidos, carcaas de frango, carnes), Hofer et al. (2000) identificaram Listeria innocua como a mais prevalente (72,9%). A porcentagem de L. monocytogenes encontrada foi de 24,8% e o sorotipo 4b foi o mais presente (45,4%). Neste mesmo estudo, tambm foi constatado

  • 16

    que o sorotipo 4b predomina em amostras de humanos e de carnes; o sorotipo 4a em amostras de animais, principalmente de vacas saudveis; o sorotipo 1/2a em produtos lcteos e 1/2b em amostras do ambiente.

    Alguns relatos sobre a ocorrncia de listeriose no homem tm sido feitos no Brasil. No perodo de abril a dezembro de 1985 foram observados cinco casos de listeriose em transplantados renais em um mesmo hospital em So Paulo. A maior prevalncia, nesses casos, foi de L. monocytogenes do sorotipo 4b (Hofer et al., 1999). Tambm no Estado de So Paulo foram relatados dois casos de peritonite bacteriana espontnea por L. monocytogenes em pacientes com cirrose (Toyoshima et al., 2006).

    Em um estudo retrospectivo realizado no setor de patologia de um hospital-escola de Porto Alegre no ano 2000, foram examinados, utilizando a tcnica de imunohistoqumica, 254 blocos de parafina de placentas provenientes de aborto, parto prematuro e nascimento a termo. Dessas placentas, 148 apresentaram alteraes quando examinadas pela tcnica de hematoxilina e eosina, indicando possvel presena de L. monocytogenes. Dessas 148 placentas analisadas, 33,7% foram positivas para a bactria pesquisada, sendo o microrganismo isolado em placentas de todos os trimestres gestacionais e provenientes de pacientes de vrias idades (Schwab e Edelweiss, 2003).

    2.4 MECANISMOS DE INFECO

    Esta bactria um parasita intracelular facultativo, que invade uma extensa variedade de clulas devido capacidade de escapar da membrana de fagossomos, para se reproduzir intracelularmente no hospedeiro. Aps a replicao, L. monocytogenes se difunde diretamente nas clulas adjacentes atravs de um mecanismo

    de motilidade, baseado na polimerizao da actina da clula hospedeira (Almeida e Almeida, 2003).

    A associao da listeriose com o consumo de leite pasteurizado refora a hiptese de que a ingesto do microrganismo um dos mecanismos de infeco (Fleming et al., 1985). Entretanto, Jersek et al. (1999) sugeriram que uma minoria de L. monocytogenes presente nos alimentos pode causar infeco nos homens e nos animais. Listeria pode ultrapassar a barreira epitelial e intestinal e se instalar e multiplicar nos hepatcitos e macrfagos do bao, com o auxlio de uma hemolisina chamada listeriosina O (Quinn et al., 1994). A listeriolisina O a responsvel pelo aparecimento da zona de beta-hemlise, observada quando L. monocytogenes inoculada em gar-sangue, e codificada pelo gene hly. Ela permite que a bactria escape ao processo de fagocitose (Salyers e Whitt, 1994). Uma das protenas associadas invaso celular a p60, que codificada pelo gene chamado iap, de invasion associated protein (Rocourt e Cossart, 1997). Uma rota alternativa pode ser a das superfcies das mucosas ao sistema nervoso central, via bainha do nervo perifrico, terminando no nervo trigmeo (Quinn et al., 1994).

    O crescimento no ambiente reduz a produo dos fatores de virulncia, pelo fato desses no serem necessrios sobrevivncia. Mas se introduzidos na intimidade do hospedeiro susceptvel, ocorre rpida expresso dos genes de virulncia. O domnio sobre o mecanismo de ao desses fatores fornece subsdios teis para as medidas preventivas e teraputicas. E, particularmente, para o desenvolvimento de mtodos mais adequados para deteco (Almeida e Almeida, 2003).

  • 17

    2.5 SENSIBILIDADE A ANTIMICROBIANOS E RESISTNCIA TRMICA

    A resistncia e sensibilidade a antimicrobianos foram testadas por Hofer et al. (1998). A bactria se mostrou sensvel eritromicina, tetraciclina e cloranfenicol e resistente s cefalosporinas de terceira gerao. Hofer et al. (1999) mostraram que L. monocytogenes sorotipo 4b foi resistente cefoxitina, clindamicina, oxacilina e penicilina.

    Quanto resistncia trmica, alguns estudos tm sido realizados h algum tempo para avaliar os efeitos sobre Listeria spp. Bearns e Girard (1958), por exemplo, demonstraram a eficincia da pasteurizao de acordo com a quantidade inicial de Listeria monocytogenes no leite cru. Em quantidades inferiores a 5 x 103 no leite cru a pasteurizao (61,7C durante 35 minutos) se mostrou eficaz.

    Bradshaw et al. (1985) demonstraram por meio de experimento que, se realizada de acordo com as recomendaes do FDA (Food and Drug Administration), a pasteurizao garante a destruio da L. monocytogenes no leite integral. Padilha et al. (2001) no encontraram L. monocytogenes em leite pasteurizado comercializado na cidade de Recife, Estado de Pernambuco. Segundo os autores, a ampla microbiota encontrada no leite pesquisado e os processos fsicos e qumicos empregados para destru-la podem ter interferido no isolamento.

    A indstria utiliza o sal e o frio como um mtodo de preservao de alimentos. A habilidade de a Listeria sobreviver em altas concentraes de sal e a baixas temperaturas torna mais difcil o seu controle na indstria alimentcia (Gandhi e Chikindas 2007).

    2.6 ALGUNS SURTOS E OCORRNCIAS EM ALIMENTOS

    Entre 30 de junho e 30 de agosto de 1983, 49 pacientes no estado de Massachusets, nos Estados Unidos, adquiriram listeriose. Sete casos ocorreram em fetos ou crianas e 42 em adultos imunossuprimidos. Quatorze pacientes morreram (29%). Das 40 amostras de L. monocytogenes isoladas e testadas, 32 eram do sorotipo 4b. Estudos epidemiolgicos revelaram que a doena estava fortemente associada com a ingesto de uma bebida elaborada com leite integral ou parcialmente desnatado, pasteurizada. O leite envolvido no surto teve origem em fazendas onde, de acordo com as anotaes do veterinrio, ocorreram casos de listeriose em algumas vacas em lactao na mesma poca do surto. Muitos sorotipos de L. monocytogenes foram encontrados no leite cru dessas fazendas aps o surto. No local de beneficiamento do leite, nenhuma evidncia de falha na pasteurizao foi encontrada. Esses resultados levam a questionar a capacidade da pasteurizao em erradicar grandes quantidades de L. monocytogenes em leite cru contaminado (Fleming et al., 1985).

    Em um trabalho reportando seis casos clnicos de neurolisteriose em adultos, a idade variou de 27 a 71 anos, sendo quatro pacientes do sexo feminino e dois do sexo masculino. Trs deles consumiam queijos artesanais com freqncia (Salamano et al., 2005).

    Silva et al. (1998) encontraram amostras de queijo positivas para L. monocytogenes em um estudo realizado no Rio de Janeiro. Foram analisadas 103 amostras de vrios tipos de queijos e 1,8% estavam contaminadas com essa bactria. Os queijos contaminados eram dos tipos Gorgonzola, Roquerfort e Minas frescal.

    De 173 amostras coletadas em Portugal, provenientes de superfcies do ambiente e de

  • 18

    equipamentos de laticnios, 6,4% foram positivas para L. monocytogenes. Amostras de alimentos (carne, peixe, leite e frango) crus e processados tambm foram coletadas na mesma localidade durante um perodo de oito meses. Das 272 amostras analisadas, 6,6% estavam contaminadas com L. monocytogenes (Pinto et al., 2001).

    Durante o perodo de um ano, foi pesquisada a presena de L. monocytogenes em duas plantas de processamento de leite no Reino Unido. Esta bactria foi encontrada em 6,25% dos equipamentos, 40,6% no ambiente, 22,2% no leite cru e em nenhuma amostra de leite pasteurizado. Porm foi encontrada L. welshimeri no leite pasteurizado, indicando contaminao ps-processamento (Kells e Gilmour, 2004).

    O queijo Minas frescal um dos queijos mais populares produzidos no Brasil. Sua maior caracterstica um agradvel gosto cido. um queijo fresco, macio, altamente perecvel e possui validade curta, mesmo sob refrigerao. Listeria monocytogenes psicrotrfica e suporta pH cido. O crescimento desse microrganismo pode ocorrer neste tipo de queijo. De acordo com o fluxograma de fabricao do queijo Minas frescal, Silva et al. (2003) coletaram amostras em diferentes etapas do processamento deste queijo (recepo do leite cru, pasteurizao, coagulao e estocagem). De um total de 218 amostras coletadas, 13 foram positivas para Listeria spp., sendo duas caracterizadas como L. monocytogenes.

    No Rio de Janeiro, foi encontrada L. monocytogenes em um nmero significativo (13,3%) de amostras de salame (Borges et al., 1999). Segundo os autores, necessrio monitorar a presena desse patgeno, principalmente nesse tipo de produto, por ser consumido sem tratamento trmico. Em Florianpolis, Pelisser et al. (2001) analisaram 48 carcaas de frango de diferentes marcas, coletadas em

    supermercados, detectando L. monocytogenes em 11 amostras (23%).

    Lingias mistas do tipo frescal so produtos de origem animal que apresentam alta atividade de gua e, por serem intensamente manipuladas e no serem submetidas a tratamento trmico, podem conter microrganismos patognicos. Em um estudo realizado no Rio Grande do Sul, foi detectada Listeria spp. em todas as amostras analisadas. Foram coletadas amostras de matria-prima, equipamentos e produto final. Listeria monocytogenes foi encontrada em 29,3%, inclusive no produto final, demonstrando a necessidade de readequao das prticas de limpeza e sanificao da planta de processamento (Silva et al., 2004).

    Em outro estudo, L. monocytogenes foi isolada em 307 das 3.685 amostras de vrios produtos (carne crua e cozida, frango cru e processado, vegetais congelados, peixe defumado, leite cru e processado, e outros) que foram coletadas durante quatro anos em diferentes indstrias e mercados no norte da Espanha. Dentre as amostras positivas, 285 foram encontradas em produtos prontos para consumo. Este fato preocupa por serem esses alimentos consumidos sem prvio tratamento trmico. Ateno especial tem que ser dada para evitar a contaminao ps-processamento (Vitas et al., 2004).

    A ocorrncia de mastite bovina causada por L. monocytogenes pouco descrita na literatura. Em um trabalho realizado por Gitter et al. (1980), L. monocytogenes sorotipo 4 foi isolada na amostra de leite colhida do quarto afetado. Porm, o exame histolgico dos linfonodos e do tecido mamrio no revelaram a presena da bactria. A presena da L. monocytogenes no leite, segundo os autores, no significa que seja a causa da mastite.

    2.7 MTODOS DE DETECO

  • 19

    O mtodo 993.12 da Association of Offical Analytical Chemists (AOAC)/International Dairy Federation (IDF) freqentemente o de escolha para detectar Listeria monocytogenes em produtos lcteos e possui instrues especficas para preparao das amostras de cada produto lcteo. Para deteco de Listeria, este mtodo utiliza enriquecimento seletivo por 48 horas em um meio contendo acriflavina e cido nalidxico, para, ento, ser plaqueado em gar Oxford (Gasanov et al., 2005).

    A metodologia convencional para o isolamento de Listeria spp. baseia-se no emprego de enriquecimento primrio da amostra em meio lquido seletivo, seguido ou no de enriquecimento secundrio, tambm em meio seletivo. A seguir, as alquotas deste caldo de enriquecimento so semeadas em placas de meios slidos seletivos e, aps incubao, colnias suspeitas do microrganismo so identificadas atravs da avaliao de suas caractersticas (Figura 1), segundo Rodrigues et al. (2003).

    ISOLAMENTO

    ENRIQUECIMENTO SELETIVO ISO 11290 FDA BAM

    USDA

    PLAQUEAMENTO SELETIVO GAR OXFORD GAR PALCAM

    GAR MOX GAR LBM

    ou mtodo equivalente

    CONFIRMAO mtodos utilizados na rotina

    FENOTPICOS GENOTPICOS CULTURA BIOQUMICOS IMUNOLGICOS DNA

    Motilidade Fermentao Imuno-precipitao DNA hibridizao Gram de acares ELISA PCR Hemlise RT-PCR CAMP RNA

    Fonte: Gasanov et al. (2005) Figura 1: Esquema de isolamento e identificao de Listeria spp. e Listeria monocytogenes em amostras de alimentos e do ambiente

    Uma grande variedade de mtodos bacteriolgicos, incluindo meios de cultura, vem sendo proposta, objetivando agilizar o

    rastreamento de L. monocytogenes em diversos tipos de alimentos (Silva et al., 1998).

  • 20

    Os caldos de enriquecimento apresentam composio bsica muito semelhante, variando apenas a concentrao e combinao dos agentes seletivos. Entretanto os meios de isolamento de Listeria apresentam um maior nmero de variveis. De maneira geral, esses meios exploram a resistncia da bactria a vrios antimicrobianos como, por exemplo, cido nalidxico, polimixina B, moxalactam, cefotetan, cicloheximida, entre outros. Estes antimicrobianos so usados em conjunto, com outros agentes seletivos, tais como feniletanol, cloreto de ltio, acriflavina, anidrido glicnico e telurito de potssio (Rodrigues et al., 2003).

    Pini e Gilbert (1988) compararam a eficincia de prticas de isolamento de L. monocytogenes. Naquela poca, era utilizado o resfriamento (4C) por semanas ou at meses para favorecer o crescimento dessa bactria em relao aos outros microrganismos, por ser psicrotrfica. O tempo para obteno do resultado a grande desvantagem do mtodo. O enriquecimento pelo frio foi comparado com a tcnica que

    utiliza um caldo e depois incubao a 30C por 24 e 48 horas. Aps o perodo de incubao, foram feitos o plaqueamento e a identificao. Para as amostras de leite, no houve diferena significativa entre os mtodos para deteco da L. monocytogenes. Porm, para as amostras de frango, o mtodo de enriquecimento a 30C foi o mais sensvel.

    A eficincia dos diferentes procedimentos para o isolamento de L. monocytogenes a partir de queijos est associada a inmeros fatores, como caractersticas intrnsecas da amostra analisada (pH, atividade de gua, potencial de xido-reduo, contedo em nutrientes, microbiota presente e a sua distribuio no alimento), seletividade dos meios de cultura e tipo de incubao (temperatura e atmosfera) (Silva et al., 1998). A Tabela 1 mostra vrios meios utilizados para deteco de Listeria spp. e seus agentes seletivos e indicadores.

    Tabela 1. Agentes seletivos e indicadores em alguns meios para detectar Listeria monocytogenes Agentes seletivos e indicadores Meio Acriflavina Glicina anidra Fenil etanol LiCl Esculina Telurito de K Antibitico MMA - + + + - - Cyclo LPM - + + + - - Mox Mod. VJ - + - + - + Mox, Nal, B RAPAMY + - + - + - Mox, Nal PALCAM + - - + + - Cz, Poly ACA + - - - - - Cz Oxford + - - + + - Ctt, Fos, Col Mod. Oxford - - - + + - Mox, Col ASLM + - + + + - Mox, Cz Abreviaes: MMA: agar McBride modificado; LPM: gar Moxalactam feniletanol clorado; Mod VJ: gar Vogel Johnson modificado; ACA: gar acraflavina-ceftazidima; Mod Oxford: meio Oxford modificado; ASLM: meio Al-Zorecky-Sandine para Listeria; Cyclo: cycloeximida; Mox: oxalactam; Nal: cido nalidixico; B: bacitracina; Cz: ceftazidime; Poly: polimixina B; Ctt: cefotetan; Fos: fosfomicina; Col: colistina Fonte: Farber e Peterkin (1991)

  • 21

    Para pesquisar a presena de Listeria em carcaas de frango, utilizaram-se dois mtodos: o recomendado pelo Food and Drug Administration (FDA), porm com uma segunda etapa de enriquecimento antes do plaqueamento e o mtodo rpido Clearview (Oxoid, UK, Ltd). Com o primeiro mtodo foram encontradas 14 carcaas positivas para Listeria spp., sendo sete caracterizadas como L. monocytogenes. Com o segundo mtodo, detectaram-se 17 e 11 amostras positivas para Listeria e Listeria monocytogenes, respectivamente. Outra observao feita pelos autores que, utilizando o mtodo Clearview + API Listeria, o resultado confirmado para espcie foi obtido aps 115-139 horas. Entretanto, com o mtodo convencional modificado + API Listeria foram necessrias 120-160 horas. Os resultados obtidos pelos mtodos utilizados mostraram-se moderadamente concordantes e no apresentaram diferena significativa (Pelliser et al., 2001).

    Almeida e Almeida (2003) descreveram em uma reviso sobre deteco de L. monocytogenes os seguintes mtodos: tcnicas imunolgicas (ELISA), sondas de DNA, reao em cadeia da polimerase (PCR), RAPD-PCR (anlise do polimorfismo de fragmentos de DNA amplificados ao acaso), bioluminescncia, mtodo de amplificao fgica e mtodo fago-luciferase.

    A PCR uma tcnica da biologia molecular que permite a amplificao de cpias mltiplas de uma seqncia especfica de DNA. Ela envolve ciclos mltiplos de desnaturao do DNA, anelamento dos iniciadores e extenso da fita, requer uma DNA polimerase termoestvel (Taq DNA polimerase), Mg++ como co-fator da Taq, deoxirribonucleotdeos (dNTP), iniciadores e um tampo de reao.

    Em um experimento para detectar L. monocytogenes em biofilmes, Guilbaud et

    al. (2005) utilizaram a tcnica de PCR, em tempo real, baseada no uso de uma sonda fluorescente que se hibridiza com a seqncia-alvo, gerando um sinal fluorescente que acumulado durante a amplificao, proporcionalmente concentrao de produtos amplificados. um sistema que permite correlacionar a intensidade de um sinal coletado com a quantidade de produto amplificado. O RAPD-PCR uma tcnica gentica baseada na amplificao do DNA com um ou vrios iniciadores de seqncia arbitrria. Estes iniciadores detectam polimorfismos na seqncia do DNA que podem ser usados como marcadores genticos. Os perfis de RAPD so analisados em gel de poliacrilamida ou agarose quanto presena ou ausncia da banda para cada loco amplificado.

    A RT-PCR pode ser utilizada para estimar a quantidade do microrganismo na amostra e ajudar a estudar o comportamento da L. monocytogenes frente presena de outras bactrias produtoras de inibidores mostrando a atividade inibitria nesse patgeno (Guilbaud et al., 2005).

    Vrios autores utilizaram a PCR para diagnosticar a presena de L. monocytogenes em alimentos, rgos, meio ambiente, gua e fezes (Novga et al., 2000; Shen et al., 2006;)

    3 OBJETIVOS

    3.1 OBJETIVO GERAL

    Detectar Listeria monocytogenes inoculada em leite, aps a etapa de enriquecimento seletivo, por meio da tcnica de PCR.

    3.2 OBJETIVOS ESPECFICOS

    - Confirmar a identificao de amostras de Listeria spp. por meio de testes bioqumicos.

  • 22

    - Padronizar uma reao de PCR com culturas puras de Listeria monocytogenes.

    - Avaliar a eficincia de amplificao da reao de PCR, utilizando-se trs oligonucleotdeos diferentes.

    - Avaliar a especificidade da reao de PCR testando-se diferentes estirpes de Listeria monocytogenes, bem como outras espcies de Listeria e outros gneros bacterianos.

    - Avaliar a sensibilidade da reao de PCR na identificao de Listeria monocytogenes inoculada em leite.

    4 MATERIAL E MTODOS

    A parte experimental do trabalho foi realizada no Laboratrio de Microbiologia do Leite da Embrapa Gado de Leite, em Juiz de Fora, Minas Gerais.

    4.1 AMOSTRAS DE BACTRIAS

    Neste estudo foram utilizados 41 amostras de Listeria spp., compreendendo: 31 amostras de Listeria monocytogenes e duas de Listeria innocua isoladas de ambiente de laticnios, de queijo e de produtos crneos; quatro amostras-padro de Listeria monocytogenes (ATCC 19111, ATCC 19117, ATCC 7644, SCOTT A), e uma amostra-padro de cada uma das seguintes espcies: Listeria innocua (IAL 1984), Listeria ivanovii (IAL 1983), Listeria seeligeri (IAL 1985) e Listeria welshimeri (IAL 1986). Os isolados de ambiente, de queijo e de produtos crneos foram gentilmente cedidos por outros laboratrios e estocados a 20C e a 80C para posterior utilizao.

    4.2 CARACTERIZAO BIOQUMICA DAS AMOSTRAS DE BACTRIAS

    A identificao dos isolados foi confirmada por meio dos seguintes testes bioqumicos,

    realizados de acordo com Barrow e Feltham (1993): colorao de Gram; produo de catalase; oxidase e de hemlise beta em gar contendo 5% de sangue desfibrinado de carneiro; hidrlise da esculina; teste do Vermelho de Metila e de Voges- Proskauer (VM/VP); motilidade no meio de SIM; teste de CAMP com Staphylococcus aureus e Rhodococcus equi (R. equi); produo de cido a partir de glicose, manitol, ramnose, xilose e ribose; hidrlise do hipurato de sdio e reduo do nitrato. A identificao foi realizada de acordo com Quinn et al. (1994) e Bille et al. (2003).

    4.2.1 Colorao de Gram

    Inicialmente, uma colnia cultivada por 24 h foi homogeneizada com gua destilada estril em uma lmina e fixada com calor. A lmina foi coberta com soluo de cristal violeta durante um minuto e, depois, o corante foi desprezado. Em seguida, a lmina foi coberta com lugol, por mais um minuto e desprezou-se novamente o corante. Com a lmina inclinada, gotejou-se lcool at no mais ocorrer desprendimento de corante (cerca de 15 segundos). Posteriormente, a lmina foi rapidamente lavada em gua corrente. Por fim, cobriu-se com safranina e aguardaram-se 45 segundos. A lmina foi lavada, seca e observada ao microscpio ptico em objetiva de imerso (Barrow e Feltham, 1993).

    4.2.2 Tipo de Hemlise

    O tipo de hemlise foi determinado em gar-sangue composto de meio TSA (Tripticase Soy Agar, Difco) adicionado de 5% de sangue desfibrinado de carneiro. A hemlise denominada de alfa quando ocorre a destruio parcial de eritrcitos (o meio de cultura ao redor da colnia torna-se esverdeado). Quando ocorre a destruio total dos eritrcitos, a hemlise classificada como beta, ou hemlise total. A cultura considerada

  • 23

    no-hemoltica quando no se observa alterao do meio ao redor da colnia (Barrow e Feltham, 1993).

    4.2.3 Teste de catalase

    Este teste detecta a enzima catalase, que converte o perxido de hidrognio em gua e oxignio. Para a realizao do teste, colheu-se uma colnia da placa de Petri contendo gar BHI (Brain Heart Infusion, Difco). Essa colnia foi colocada sobre uma lmina de vidro. Em seguida, adicionou-se uma gota de perxido de hidrognio a 3%, homogeneizando-se a colnia. O teste positivo quando se observa a formao de bolhas de ar (Barrow e Feltham, 1993).

    4.2.4 Motilidade no meio SIM

    Esta prova teve como objetivo avaliar a motilidade do microrganismo. O teste foi feito em meio SIM (Biobrs). O meio foi inoculado at dois teros com uma colnia isolada da bactria (18 - 24 horas de incubao) e incubado a 25C, durante 3-5 dias. A motilidade positiva quando o meio fica turvo e negativa quando o meio continua transparente e o crescimento bacteriano se restringe apenas ao longo da picada. Listeria monocytogenes, ao mover-se, produz um formato de guarda-chuva caracterstico (Barrow e Feltham, 1993).

    4.2.5 Teste do Vermelho de Metila (VM)

    Este teste tem como princpio testar a habilidade de um microrganismo em produzir cidos orgnicos, relativamente estveis, a partir da fermentao da glicose, de modo a suplantar a capacidade tampo existente no meio. No teste, pesquisada a fermentao cida mista, em que as bactrias utilizam a glicose como substrato e liberam grande concentrao de cidos como produto final (Ribeiro e Soares, 1998).

    Com o auxlio de uma ala de inoculao, duas ou trs colnias crescidas na placa de gar-sangue a 35C por 18 a 24 horas, sob aerobiose, foram inoculadas em um tubo contendo 2 ml de caldo peptona-glicose (preparado de acordo com Lennette et al., 1985). Aps incubao a 35C durante 7 dias, foram adicionadas ao tubo, duas a trs gotas de uma soluo hidroalcolica de vermelho de metila. O vermelho de metila um indicador que cido e indicar os graus de acidez por alteraes de cor em uma escala de pH de 4,4 a 6,0. Com o pH de 4,4, o indicador fica vermelho e com a diminuio da acidez (pH 6,0), o indicador fica amarelo. O tubo foi agitado vigorosamente vrias vezes durante 30 minutos. A reao positiva quando ocorre a colorao avermelhada do tubo ao final dos 30 minutos. A colorao rsea do tubo interpretada como teste fracamente positivo (Barrow e Feltham, 1993).

    4.2.6 Teste de Voges-Proskauer (VP)

    O teste de Voges-Proskauer usado para determinar a habilidade de um microrganismo produzir um composto neutro, o acetilmetilcarbinol (acetona), a partir da fermentao da glicose (Ribeiro e Soares, 1998).

    Com o auxlio de um swab estril, a cultura crescida na placa de gar-sangue a 35C por 18 a 24 horas, sob aerobiose, foi inoculada em um tubo contendo caldo peptona-glicose (tambm usado para o teste do Vermelho de Metila), incubado a 35C durante 24 horas. Aps o perodo de incubao e a realizao do teste VM, foram adicionados ao tubo 0,6 mL de soluo A (-naftol 5%) e 0,2 mL de soluo B (hidrxido de sdio 40%). O tubo foi agitado vigorosamente vrias vezes, para o oxignio atmosfrico penetrar e oxidar a acetona em diacetila, sendo que o hidrxido de potssio atua como agente oxidante e o -naftol como catalisador e intensificador de cor. Com o uso de um agente oxidante, a cor produzida desaparece rapidamente,

  • 24

    sobretudo porque o complexo de reao diacetila-peptona pode ser rapidamente oxidado em um composto incolor. Portanto, a reao positiva obtida quando ocorre a colorao vermelha do tubo entre 15 minutos e 1 hora. A colorao rsea do tubo interpretada como teste fracamente positivo e a colorao marrom-esverdeada, como resultado negativo (Ribeiro e Soares, 1998).

    4.2.7 Teste de CAMP (Christie, Atkins e Munch-Peterson)

    Este teste foi realizado em uma placa de Petri contendo gar-sangue, na qual inicialmente inoculou-se, em uma linha vertical, uma amostra de Staphylococcus aureus -hemoltico e em uma outra linha vertical, paralela primeira, uma amostra de Rhodococcus equi. Em seguida, em posio perpendicular s linhas de inoculao de S. aureus e R. equi, inoculou-se a amostra a ser testada sem que esta tocasse as outras. A placa, ento, foi incubada a 35C, durante 24 horas.

    O resultado positivo quando a amostra testada produzir uma substncia, a qual consiste em uma protena extracelular (fator CAMP), que aumenta a rea de hemlise produzida por S. aureus e por R. equi. Neste caso, ocorre a formao de uma rea de hemlise tpica (forma de meia-lua) na juno das duas culturas (Barrow e Feltham, 1993).

    4.2.8 Teste de oxidase

    O princpio do teste consiste na deteco de indofenol (citocromo-oxidase). Tiras para reao de oxidase (Laborclin) foram utilizadas. Com o auxlio de um palito de madeira estril, transferam-se assepticamente uma ou duas colnias da amostra para a superfcie da tira. A colorao violeta da tira caracteriza o teste de oxidase positivo (Barrow e Feltham, 1993).

    4.2.9 Hidrlise da esculina

    O teste foi realizado em tubos de ensaio contendo gar TSA com 1% de esculina e 0,5% de cloreto frrico. O meio foi inoculado com uma ou duas colnias de uma cultura de 24 h e incubado a 35C, por at 7 dias.

    Quando a bactria capaz de hidrolisar a esculina, presente no meio contendo cloreto frrico, ocorre a formao de dois compostos: esculetina e um sal metlico, os quais originam um composto marrom escuro. Da a reao positiva do teste ser caracterizada pelo escurecimento do meio (Quinn et al., 1994).

    4.2.10 Hidrlise do hipurato de sdio

    Este teste foi realizado em caldo HI (Heart Infusion, Difco), contendo 1% de hipurato de sdio. O meio foi inoculado com uma ou duas colnias da amostra crescida em gar-sangue e depois, incubado a 35C durante 14 dias. Aps o perodo de incubao, o meio foi centrifugado a 2.500 g durante 10 minutos e 0,8 ml do sobrenadante foi transferido para outro tubo de ensaio. Aps a adio de 0,2 ml de cloreto frrico, agitou-se o tubo. O resultado positivo quando houver formao de um precipitado, o qual deve permanecer por mais de 10 minutos, e turvao do meio. Este precipitado indica a presena de cido benzico, resultante da hidrlise do hipurato. O resultado negativo quando, aps a agitao, o tubo fica claro e assim permanece. Uma reao fracamente positiva, ou seja, quando ocorre a formao de pouco precipitado, pode acontecer com algumas amostras (Facklam e Elliott, 1995).

    4.2.11 Formao de cidos a partir de carboidratos

    Foi investigada a formao de cidos a partir dos carboidratos D-glicose, manitol, ramnose, ribose e xilose. O princpio do teste se baseia em determinar a capacidade

  • 25

    de um microrganismo em hidrolisar o carboidrato incorporado em um meio base, com conseqente produo de cido.

    O teste foi realizado em tubo com BHI contendo 1% do carboidrato especfico e o indicador prpura de bromocresol. Vrias colnias crescidas em gar-sangue durante 24 horas foram transferidas para esses tubos contendo os diferentes carboidratos e incubados a 35C por at 14 dias. A reao positiva quando houver alterao da colorao do meio para amarelo, e negativa quando o meio permanece inalterado (Facklam e Elliott, 1995).

    4.2.12 Reduo do nitrato

    Para a realizao deste teste, utilizou-se o caldo nitrato (preparado de acordo com Barrow e Feltham, 1995). Foram transferidas duas a trs colnias da amostra para o tubo. Aps incubao a 37C por 5 dias, adicionou-se 1 ml do reagente A (cido sulfanlico 0,33% em cido actico 5N) e 1 ml do reagente B (0,5% de a-naftilamina em cido actico 5N). A reao positiva quando houver alterao da colorao do meio para vermelho, indicando a presena de nitrito, ou seja, a reduo do nitrato, e negativa quando o meio permanece inalterado (Barrow e Feltham, 1993).

    4.3 EXTRAO DE DNA DAS CULTURAS BACTERIANAS

    Para a extrao de DNA das culturas bacterianas, utilizou-se o mtodo descrito por Jersek et al. (1996), no qual foram utilizados fenol e clorofrmio. Aps a padronizao da PCR, outros dois mtodos foram utilizados para extrao de DNA de amostras de Listeria spp., sendo um de lise trmica segundo Nunes et al. (1999) e outro para cultura em meio slido, no qual a lise trmica foi feita diretamente da colnia, segundo Hu et al. (1999).

    4.3.1 Extrao utilizando fenol e clorofrmio (Jersek et al., 1996)

    Uma colnia de uma cultura cultivada por 24 horas foi inoculada em 3 ml de BHI e este foi incubado a 35C durante a noite, sem agitao.

    Aproximadamente 2 ml do caldo BHI inoculado foi transferido para um microtubo estril e centrifugado a 12.000 g durante 3 minutos. O sobrenadante foi imediatamente desprezado e foram adicionados 500 l de tampo 1 X SSC (0,15 mol/l NaCl, 0,015 mol/l citrato de sdio), seguindo-se agitao em agitador de tubos e nova centrifugao.

    O sobrenadante foi desprezado, adicionaram-se 100 l de gua ultra pura (Milli-Q) e 8 l de lisozima (50 mg/ml) e foi feita incubao em tubo esttico a 35C durante 45 minutos sem agitao. Aps o perodo de incubao, foram adicionados 200 l de TE (0,05 mol/l Tris-HCl, pH 8,0, 0,02 mol/l Na2EDTA), 100 l de Sarkosyl (5% em TE) e 100 l de Proteinase K (25 mg/ml em TE) e a amostra foi incubada a 35C durante uma hora em tubo esttico.

    s clulas lisadas, adicionaram-se 250 l de fenol e 250 l de clorofrmio/lcool isoamlico (24:1). Foi feita agitao manual vigorosa por aproximadamente 1 minuto e centrifugao a 12.000 g durante 5 minutos. Aps a centrifugao, o sobrenadante foi transferido para outro tubo e as duas etapas anteriores repetidas, agitando-se o tubo com menos vigor.

    Aps as repeties, adicionaram-se 500 l de clorofrmio/lcool isoamlico (24:1), agitou-se manualmente o tubo com cuidado por 30 segundos e centrifugou-se a 12.000 g durante mais 5 minutos. Novamente, o sobrenadante foi transferido para outro tubo no qual foram adicionados 200 l de acetato de sdio 3M e 400 l de etanol (100%) para precipitao dos cidos nuclicos. Este tubo foi centrifugado a 12.000 g durante 30

  • 26

    minutos. Por fim, suspendeu-se o pellet, com cuidado, em 40 l de gua Milli-Q, e este foi mantido em geladeira durante a noite. O DNA extrado foi quantificado em espectrofotmetro e congelado a 20C.

    4.3.2 Mtodo de lise trmica

    Tranferiu-se 2 ml de uma cultura de 18 horas em caldo BHI para um microtubo estril. Aps centrifugao a 5.000 g durante 4 minutos, o sobrenadante foi desprezado, o pellet foi lavado trs vezes com 500 l de tampo TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,8) e submetido a uma centrifugao por dois minutos a 5.000 g. O pellet foi suspenso novamente em 100 l de TE e ferveu-se por 10 minutos. Em seguida foi feita centrifugao a 12.000 g durante 30 segundos e o sobrenadante foi estocado a -20C para posterior utilizao (Nunes et al., 1999).

    4.3.3 Mtodo de lise trmica diretamente da colnia

    Utilizou-se o mtodo de lise trmica descrito por Hu et al. (1999) para as colnias

    caractersticas de L. monocytogenes crescidas no meio TSYEA.

    Uma colnia selecionada foi suspensa em 100 l de gua Milli-Q em microtubo estril. Em seguida, o microtubo foi mantido durante 10 minutos em gua fervente, seguindo-se centrifugao durante dois minutos a 12.000 g. Dois microlitros deste lisado foram utilizados na PCR.

    4.4 QUANTIFICAO DE DNA

    A quantificao de DNA foi feita em espectrofotmetro de luz ultravioleta visvel (Gene Quant Pro, Amesham Biosciences) e as concentraes de DNA ajustadas para a reao de PCR (50-100 ng/l). 4.5 PADRONIZAO DA PCR

    4.5.1 Oligonucleotdeos iniciadores

    Foram utilizados oligonucleotdeos iniciadores especficos, descritos na literatura (Tabela 2).

    Tabela 2. Oligonucleotdeos utilizados na reao de PCR para identificao de Listeria monocytogenes

    Oligonucleotdeos Gene-alvo Produto codificado Produto amplificado

    Referncia

    LMA: CGGAGGTTCCGCAAAAGATG LMB: CCTCCAGAGTGATCGATGTT

    hlyA Listeriolisina O 234 pb Furrer et al. (1991)

    IAP1: ACAAGCTGCACCTGTTGCAG IAP2: TGACAGCGTGTGTAGTAGCA

    iap Invasion associated protein

    131 pb Niederhauser et al. (1993)

    LM1: CCTAAGACGCCAATCGAA LM2: AAGCGCTTGCAACTGCTC

    hlyA Listeriolisina O 702 pb Border et al. (1990)

    4.5.2 PCR

    As PCRs foram padronizadas com DNA extrado das amostras-padro de Listeria monocytogenes (ATCC 19111, ATCC 19117, ATCC 7644, SCOTT A), Listeria

    innocua (IAL 1984), Listeria ivanovii (IAL 1983), Listeria seeligeri (IAL 1985) e Listeria welshimeri (IAL 1986). As reaes foram realizadas em termociclador (GeneAmp PCR System 9600, Applied Biosystems). Adicionou-se 1 l de DNA bacteriano (100 ng/l) uma mistura

  • 27

    contendo 1 l de cada oligonucleotdeo (10 M), 5 l de tampo de PCR 10 X, 1,5 l de MgCl2 (50mM), 1 l da mistura de nucleotdeos (10 mM), 0,2 U de Taq polimerase e gua Milli-Q para completar um volume de 50 l. As condies de amplificao foram: 5 minutos a 94C, 35 ciclos de 30 segundos a 94C, 45 segundos temperatura de anelamento dos oligonucleotdeos (50C para LM1/LM2 e 55C para LMA/LMB e IAP1/IAP2) e 45 segundos a 72C, e uma extenso final de 5 minutos a 72C, como descrito por Aznar e Alarcn (2003). Como controle positivo da reao, utilizou-se DNA extrado da amostra de Listeria monocytogenes ATCC 19117, e como controle negativo, gua Milli-Q esterilizada.

    Foram feitas tentativas para amplificar os trs fragmentos de DNA (oligonucleotdeos LM1/LM2, LMA/LMB e IAP1/IAP2) em uma mesma reao (PCR multiplex), testando-se diferentes concentraes de MgCl2, DNA bacteriano, temperaturas de anelamento e oligonucleotdeos iniciadores.

    4.5.3 Eletroforese em gel de agarose

    Os fragmentos de DNA amplificados foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,5% (p/v) aps, aproximadamente, uma hora utilizando-se 70 volts. O gel de agarose foi submerso em soluo de brometo de etdio (0,005%, p/v) durante 30 minutos e

    fotografado em fotodocumentador (Eagle Eye II, Stratagene). Utilizou-se marcador de peso molecular de 100 pb (Promega) para estimativa do tamanho dos produtos de PCR.

    4.6 AVALIAO DA ESPECIFICIDADE E SENSIBILIDADE DA PCR PARA Listeria monocytogenes

    4.6.1 Avaliao da especificidade

    A especificidade de duas reaes de PCR, a primeira com os oligonucleotdeos LM1/LM2 e a segunda com os oligonucleotdeos LMA/LMB e IAP1/IAP2 (PCR multiplex), foi avaliada utilizando-se as amostras de Listeria spp. descritas no item 4.1 e amostras pertencentes a outros gneros bacterianos: Escherichia coli (ATCC 11775 e ATCC 11229), Shigella sonnei (CIP 6310), Klebsiella pneumoniae (ATCC 13883), Salmonella Tiphymurium, Staphylococcus aureus, Staphylococcus spp. coagulase-negativo, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis. As bactrias utilizadas foram escolhidas por serem encontradas em leite e por estarem disponveis no banco de bactrias da EMBRAPA Gado de Leite Juiz de Fora/MG. Para a avaliao da especificidade, utilizou-se na PCR, DNA extrado pelo mtodo do fenol-clorofrmio.

  • 28

    Listeria monocytogenes em caldo BHI (18-24 horas de incubao)

    Vrias diluies em gua fosfatada

    1 ml diluio+24 ml de leite Petrifilm + 225 ml de LEB

    2 ml para extrao de DNA Placas de Oxford e PALCAM

    Figura 2: Fluxograma de comparao dos mtodos de PCR e convencional para deteco de Listeria monocytogenes

    4.6.2 Avaliao da sensibilidade

    Realizaram-se ensaios para avaliar se a PCR padronizada teria potencial para identificar at uma nica clula bacteriana, partindo-se de leite esterilizado e com diferentes nveis de contaminao bacteriana. O leite foi coletado diretamente no tanque de expanso com garrafas e coletores estreis e tambm no Laticnio Cndido Tostes com garrafas estreis.

    4.6.2.1 Determinao da concentrao celular de um cultivo de Listeria monocytogenes

    Duas colnias de Listeria monocytogenes de um cultivo de 18 horas foram inoculadas em 4 mL de caldo BHI e incubadas a 35C por 18 horas. Foram feitas diluies decimais em tampo fosfato (as diluies decimais foram preparadas at a extino - 1010 ou mais) e inoculadas, em duplicata, em

    Petrifilm (3M) para contagem total de microrganismos mesoflicos. Os filmes foram incubados a 37C por 24 horas e ao final deste perodo, realizou-se a contagem bacteriana (UFC/ml). Este experimento foi repetido trs vezes e foi determinada a contagem bacteriana (UFC/mL) mdia.

    Para a avaliao da sensibilidade da PCR, inocularam-se experimentalmente as diluies acima em leite esterilizado (110C/10minutos) e leite cru com baixa e alta contaminao.

    4.6.2.2 Determinao da sensibilidade da PCR em detectar Listeria monocytogenes em leite esterilizado a 110C/10 minutos

    Foram feitas diluies decimais de uma cultura da amostra-padro Listeria monocytogenes ATCC 19117 cultivada em caldo BHI por 24 h/35C, diluindo-se 0,6 ml da cultura em 5,4 mL de tampo fosfato, at

  • 29

    se obter a extino celular. Para as diluies contendo cerca de 100, 10, 1 e 0 UFC/ml, foi feito plaqueamento de 1 ml da diluio em duplicata em Petrifilm (para determinar o nmero de UFC/mL aps 24 e 48 horas de incubao a 30C) e inoculao de 1 ml em cada 3 frascos contendo 24 ml de leite em p desnatado reconstitudo estril (Molico desnatado, Nestl). O leite com o cultivo bacteriano foi transferido para um frasco contendo 225 ml de caldo LEB (Listeria Enrichment Broth, Difco). O controle negativo foi feito utilizando apenas gua fosfatada estril, caldo LEB e leite. Os frascos foram incubados por 24-48h/30C e foi realizada a extrao de DNA de 2 ml da cultura de cada frasco pelo mtodo de lise trmica, descrito por Nunes et al. (1999) e fenol-clorofrmio, descrito por Jersek et al. (1996). O DNA assim extrado foi usado na PCR (com os oligonucleotdeos LM1/LM2) para determinar a sensibilidade da tcnica, ou seja, o menor nmero de UFC presentes no leite que o mtodo seria capaz de detectar. Tambm foi feito o plaqueamento segundo o mtodo convencional (Flowers et al, 1992). Este ensaio foi repetido duas vezes visando analisar a repetibilidade.

    4.6.2.3 Determinao da sensibilidade da PCR em detectar Listeria monocytogenes em leite cru com baixa contaminao microbiana inicial e em leite cru com alta contaminao microbiana inicial

    Os ensaios foram feitos com leite cru (contagem bacteriana total inferior a 1 x 104 UFC/ml), proveniente na Embrapa Gado de Leite, Campo Experimental de Coronel Pacheco, coletado utilizando material assptico, e com leite cru (contagem bacteriana total maior que 1 x 106 UFC/ml), obtido no Instituto de Laticnios da Cndido Tostes/EPAMIG. Realizou-se o mesmo procedimento descrito no item 4.6.2.2 , substituindo-se o leite estril por leite cru com as diferentes contaminaes.

    4.7 COMPARAO DA PCR COM O MTODO CONVENCIONAL

    O frasco contendo o caldo de enriquecimento (LEB) inoculado foi incubado a 30oC por 24-48 horas. A partir do caldo de enriquecimento, foram feitas estrias em duas placas de gar Oxford (Difco) e duas de gar PALCAM (Difco). Os meios foram incubados a 35oC por 24-48 horas. Aps o perodo de incubao, as placas foram examinadas para colnias tpicas de Listeria spp. Em ambos os meios, as colnias de Listeria spp. apresentam-se com 2 a 3 mm de dimetro e com halos castanhos ou negros, devido hidrlise da esculina. De cada placa de isolamento foram selecionadas duas colnias tpicas ou suspeitas, as quais foram estriadas em gar TSYEA (gar triptona extrato de levedura, Difco), de modo a obter colnias bem isoladas. As placas de TSYEA foram incubadas a 35oC por 24 horas ou at que o crescimento fosse satisfatrio para a realizao dos testes bioqumicos de identificao e da reao de PCR a partir da colnia suspeita (Harrigan, 1998; Hitchins et al. 1998).

    5 RESULTADOS E DISCUSSO

    5.1 CARACTERIZAO BIOQUMICA DAS BACTRIAS

    As amostras de Listeria spp. apresentaram-se como bastonetes Gram-positivo, mveis e com crescimento caracterstico (formato de guarda-chuva) no meio de SIM, resultado positivo nos testes de produo de catalase e hidrlise da esculina e negativo para a produo de oxidase, formaram cido a partir da D-glicose, mas no a partir do manitol, e nem reduziram o nitrato. As demais caractersticas podem ser visualizadas na Tabela 3.

  • 30

    Tabela 3. Caracterizao bioqumica e amplificao por PCR de amostras de Listeria spp. isoladas do ambiente, de queijo e de produtos crneos, e de amostras-padro de Listeria spp.

    N

    amostras

    Procedncia HEM S.

    aureus

    R.

    equi

    HIP RAM XYL RIB VM VP PCR -

    LMA

    PCR

    IAP

    PCR -

    LM1

    Identificao

    13 ambiente/MG + + + + + - - + + + + + L. monocytogenes

    2 ambiente/MG + + +/- + + - - + + + + + L. monocytogenes 1 ambiente/MG + + - + + - - + + + + + L. monocytogenes 1 frango/MG + + + + + - - + + + + + L. monocytogenes

    11 queijo/RS + + + + + - - + + + + + L. monocytogenes 2 queijo/RS + + - + + - - + + + + + L. monocytogenes 1 queijo/RS + + +/- + + - - + + + + + L. monocytogenes 1 queijo/RS - - - + + - - + + - - - L. innocua 1 lingia/RS - - - + + - - + + + + - L. innocua

    1 ATCC 19111 - - - + + - - + + + + + L. monocytogenes 1 ATCC 19117 + + + + + - - + + + + + L. monocytogenes 1 ATCC 7644 + + - + + - - + + + + + L. monocytogenes 1 SCOTT A + + + + + - - + + + + + L. monocytogenes 1 IAL 1984 - - - - + - - + + - - - L. innocua 1 IAL 1983 + - + - - + + +/- + - - - L. ivanovii 1 IAL 1985 - + + - - + - + - - - - L. seeligeri 1 IAL 1986 - - - - - + + + + - - - L. welshimeri

    41 TOTAL

    Abreviaturas: HEM hemlise; S. aureus CAMP com S. aureus; R. equi CAMP com R. equi; HIP hidrlise do hipurato; RAM ramnose; XYL xilose; RIB ribose; VM vermelho de metila; VP Voges-Proskauer

    As amostras-padro ATCC 1911, IAL 1984, IAL 1983, IAL 1985 e IAL 1986 apresentaram algumas caractersticas atpicas (Tabela 3, resultados sombreados). possvel que no tenham mais a expresso gnica de algumas caractersticas, por exemplo, hemlise, pelo fato das mesmas no serem necessrias sobrevivncia no ambiente, como citado por Almeida e Almeida (2003).

    5.2 PADRONIZAO DA PCR

    As PCRs empregaram dois pares de oligonucleotdeos que amplificam o gene da listeriolisina O (oligonucleotdeos LM1/LM2 e LMA/LMB) e um par de

    oligonucleotdeos que amplifica o gene que codifica uma protena associada invaso da clula hospedeira (invasion associated protein, oligonucleotdeos IAP1/IAP2).

    Vrios ensaios foram feitos utilizando-se a amostra-padro Listeria monocytogenes ATCC 19117. Nos ensaios, variou-se a concentrao de oligonucleotdeos, MgCl2, Taq polimerase, mistura de nucleotdeos, DNA bacteriano e temperatura de anelamento. Foi testada uma reao de PCR multiplex com todos os oligonucleotdeos, porm no foi obtido nenhum produto de amplificao. Uma reao de PCR multiplex com os oligonucleotdeos LMA/LMB e IAP1/IAP2 apresentou produtos de amplificao bem ntidos (Figura 3).

  • 31

    Figura 3. Reao de PCR multiplex com os oligonucleotdeos LMA/LMB e IAP1/IAP2. Canaleta 1: L. monocytogenes ATCC 19117; canaleta 2: Streptococcus uberis; canaletas 3 e 5: Streptococcus agalactiae, canaleta 4: marcador de peso molecular de 100 pb; canaletas 6 e 7: Staphylococcus aureus; canaleta 8: controle negativo

    Todas as amostras de Listeria spp. foram testadas com os trs oligonucleotdeos. Todas as amostras de L. monocytogenes apresentaram produtos de amplificao com os trs oligonucleotdeos testados: 702 pb (LM1/LM2), 234 pb (LMA/LMB) e 131 pb (IAP1/IAP2). Uma amostra de L. innocua apresentou produtos de amplificao com os oligonucleotdeos LMA/LMB e IAP1/IAP2 (Tabela 2). As demais espcies de Listeria e os outros gneros bacterianos no apresentaram produto de amplificao com os oligonucleotdeos testados. Desta forma, verificou-se que os trs pares de oligonucleotdeos apresentaram uma boa eficincia de amplificao, pois detectaram todas as amostras de L. monocytogenes. Os oligonucleotdeos LM1/LM2 tambm foram especficos, pois s amplificaram amostras de L. monocytogenes.

    Como apresentam temperaturas de anelamento idnticas, os oligonucleotdeos LMA/LMB e IAP1/IAP2 foram usados com sucesso na mesma reao (PCR multiplex), o mesmo no ocorrendo com os

    oligonucleotdeos LM1/LM2, que apresentam temperatura de anelamento inferior, como j descrito por Aznar e Alarcn (2003). Desta forma, foram necessrias duas reaes diferentes para obter os resultados com os trs oligonucleotdeos.

    Apesar de serem especficos para L. monocytogenes, a reao com os oligonucleotdeos LM1/LM2 pode dar origem a bandas inespecficas (Figura 4), que, no entanto, apresentam peso molecular diferente de 702 pb, no interferindo, portanto, na identificao de L. monocytogenes. Este fato tambm foi reportado por Aznar e Alarcn (2003). Os mesmos oligonucleotdeos foram utilizados por Rijpens e Herman (2004) para identificar L. monocytogenes em amostras de queijos contaminados artificialmente com diferentes concentraes desse microrganismo.

    1 2 3 4 5 6 7 8

    LMA/LMB (234 pb) IAP1/IAP2 (131 pb)

  • 32

    Figura 4. PCR com os oligonucleotdeos LM1/LM2. Canaleta 1: L. monocytogenes ATCC 19117; canaleta 2: L. monocytogenes; canaleta 3: L. innocua IAL 1984; canaleta 4: L. ivanovii IAL 1983; canaleta 5: marcador de peso molecular de 100 pb; canaleta 6: L. seeligeri IAL 1985; canaleta 7: L. welshimeri; canaleta 8: controle negativo da reao de PCR.

    A extrao por fenol e clorofrmio resultou em DNA em quantidade e qualidade superior, revelado pela leitura em espectrofotmetro, quando comparado com o DNA extrado por lise trmica. Entretanto, com os dois protocolos de extrao houve a amplificao de bandas especficas e ntidas (Figura 5).

    Os protocolos de extrao por lise trmica so mais rpidos e utilizam apenas quantidades pequenas de solues-tampo, portanto, sendo mais econmicos. Alm disso, oferecem menos riscos sade do manipulador por no utilizar o fenol e menos impactos ao meio ambiente. Os protocolos podem ser utilizados quando no existe a necessidade de conservar o DNA bacteriano para futuros experimentos. Neste ltimo caso, deve-se optar pelo protocolo convencional de extrao por fenol e clorofrmio.

    5.3 DETERMINAO DA SENSIBILIDADE DA PCR EM DETECTAR Listeria monocytogenes EM LEITE ESTERILIZADO A 110C/10 MINUTOS

    A PCR realizada com amostra de bactrias aps 48 horas de enriquecimento em meio seletivo para Listeria (LEB), detectou a presena de L. monocytogenes no leite inoculado com a diluio na qual apenas uma colnia cresceu em Petrifilm (1 UFC/ml). Tambm, houve crescimento da bactria nas placas de Oxford e PALCAM que posteriormente, foram analisadas pela metodologia convencional. Neste ensaio no houve diferena na sensibilidade de deteco entre a tcnica de PCR e a metodologia convencional. A sensibilidade de deteco de ambos os mtodos coincidiu em todas as repeties e variou de 1 a 4 UFC/ml (Tabela 4 e Figura 5).

    1 2 3 4 5 6 7 8

    LM1/LM2 (702 pb)

  • 33

    Tabela 4. Comparao entre os mtodos Convencional e PCR na deteco de Listeria monocytogenes inoculada em leite estril Diluio Inculo de L.

    monocytogenes Convencional

    A * B* C* PCR

    A* B* C* Repetio 1 10-8

    10-9 10-10 10-11

    41 UFC 4 UFC 4 UFC 0 UFC

    + + -

    -

    + + + -

    + + -

    +

    + + -

    -

    + + + -

    + + -

    + Repetio 2 10-8

    10-9 10-10 10-11

    48 UFC 4 UFC 2 UFC 0 UFC

    + + -

    -

    + + -

    -

    + + + -

    + + -

    -

    + + -

    -

    + + + -

    Repetio 3 10-8 10-9 10-10 10-11

    48 UFC 8 UFC 1 UFC 0 UFC

    + + -

    -

    + + + -

    + + -

    -

    + + -

    -

    + + + -

    + + -

    -

    * A, B e C: triplicatas para cada repetio +: positivo aps incubao a 30C/48 h em meio de enriquecimento (LEB) -: negativo aps incubao a 30C/48 h em meio de enriquecimento (LEB)

    Nenhuma bactria foi detectada pela PCR quando esta foi realizada aps 24 horas de incubao em caldo de enriquecimento (LEB), nem com DNA extrado por fenol-clorofrmio (Jersek et al., 1996), nem com DNA extrado por lise trmica (Nunes et al., 1999). O DNA extrado por ambas as tcnicas foi quantificado em espectrofotmetro.

    A dificuldade em se detectar L. monocytogenes com 24 horas de incubao pode ser devido baixa quantidade do microrganismo ou pureza do DNA. Rijpens e Herman (2004) e Guilbaud et al. (2005) comentam em seus trabalhos que os mtodos rpidos utilizados, atualmente, para identificar L. monocytogenes necessitam de uma concentrao mnima do microrganismo de 105 UFC/ml.

    Tabela 5. Concentrao de DNA bacteriano total obtido por extrao de DNA utilizando fenol-clorofrmio aps 24 e 48 horas de incubao em caldo de enriquecimento (LEB).

    Concentrao de DNA (ng/l) Diluio 24 horas 48 horas

    10-8 197,5 1.210,5 10-9 210,0 1.124,0 10-10 128,0 1.276,5 10-11 222,0 1.089,0 10-12 213,0 600,0 10-13 127,0 375,5

  • 34

    Figura 5. PCR com os oligonucleotdeos LM1/LM2 aps a etapa de enriquecimento a 30C/48 h, com diferentes diluies de L.monocytogenes. Canaletas 1,2 e 3: extrao de DNA por lise trmica do leite contaminado inicialmente com 48 UFC/ml; 4, 5 e 6: extrao de DNA por lise trmica do leite contaminado inicialmente com 8 UFC/ml; 7 e 24; marcador de peso molecular (100 pb); 8, 9 e 10: extrao de DNA por lise trmica do leite contaminado inicialmente com 1 UFC/ml; 11 e 25: controles positivos; 12 a 21: extrao de DNA por lise trmica do leite inoculado com diluies nas quais no foi observado crescimento bacteriano no Petrifilm; 22: controle negativo no inoculado; 23: controle negativo da PCR; 26, 27 e 28: extrao de DNA utilizando fenol-clorofrmio do leite contaminado inicialmente com 48 UFC/ml; 29, 30 e 31: extrao de DNA utilizando fenol-clorofrmio do leite contaminado inicialmente com 8 UFC/ml; 32,33 e 34: extrao de DNA utilizando fenol-clorofrmio do leite contaminado inicialmente com 1 UFC/ml; 15 e 35 vazio

    Na Figura 5, observa-se que quando utilizado o fenol-clorofrmio, a banda foi enfraquecendo medida que foi diminuindo a concentrao de DNA. Provavelmente, houve perda de DNA durante o procedimento de extrao. Neste procedimento so realizadas extraes sucessivas com fenol e clorofrmio 1:1 para purificar completamente os cidos nuclicos. Entretanto, cada etapa de mistura e centrifugao responsvel por quebras nas molculas de DNA e perda do DNA total (Brown, 2003). Com uma menor quantidade de DNA disponvel, o fragmento amplificado se torna cada vez mais fraco.

    5.4 DETERMINAO DA SENSIBILIDADE DA PCR EM DETECTAR L. monocytogenes EM LEITE CRU COM BAIXA CONTAMINAO MICROBIANA INICIAL

    Neste ensaio, a PCR no detectou L. monocytogenes aps 48 horas de enriquecimento em meio seletivo para Listeria (LEB) em nenhuma diluio, em nenhuma repetio e com nenhum dos dois mtodos de extrao de DNA.

    A sensibilidade de deteco de L. monocytogenes pela metodologia convencional variou de 2 a 6 UFC/ml (Tabela 6).

    Resultados positivos com PCR em condies semelhantes foram obtidos por Rijpens e Herman (2004). Alm de utilizarem dois passos de enriquecimento, o primeiro no muito seletivo para recuperar as bactrias estressadas, esses autores tambm utilizaram a separao imunomagntica para, ento, fazer a amplificao por PCR.

    1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

    16 17 18 19 20 21 22 2324 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

    LM1/LM2 (702 pb)

    LM1/LM2 (702 pb)

  • 35

    Tabela 6: Comparao dos mtodos Convencional e PCR na deteco de L. monocytogenes experimentalmente inoculada em leite cru com baixa populao microbiana, submetido a diferentes nveis de contaminao

    Contagem microbiana do leite cru

    Diluies Inculo de L. monocytogenes

    Convencional A* B* C*

    PCR A* B* C*

    Repetio

    1

    Contagem Padro em Placas

    3 x 103 UFC/ml

    Coliformes 6 x 101 UFC/ml

    10-7 10-8 10-9 10-10 10-11 10-12

    Incontvel 61 UFC 8 UFC 2 UFC 0 UFC 0 UFC

    + + + -

    -

    -

    + + + -

    -

    -

    + + + + -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    Repetio

    2

    Contagem Padro em Placas

    1,7 x 105 UFC/ml

    Coliformes 4 x 102 UFC/ml

    10-7 10-8 10-9 10-10 10-11 10-12

    Incontvel 35 UFC 2 UFC 0 UFC 0 UFC 0 UFC

    + + + -

    -

    -

    + + + -

    -

    -

    + + + -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    Repetio

    3

    Contagem Padro em Placas

    2 x 103 UFC/ml

    Coliformes 2 x 101 UFC/ml

    10-7 10-8 10-9 10-10 10-11 10-12

    Incontvel 45 UFC 6 UFC 0 UFC 0 UFC 0 UFC

    + + + -

    -

    -

    + + + -

    -

    -

    + + + -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    * A, B e C: triplicatas para cada repetio +: positivo aps incubao a 30C/48 h em meio de enriquecimento (LEB) -: negativo aps incubao a 30C/48 h em meio de enriquecimento (LEB)

    Aps 48 horas de incubao das placas de Oxford e PALCAM, inoculada por esgotamento a partir do meio LEB inoculado com as diferentes diluies, foram feitas a extrao de DNA (item 4.3.3) e a reao de PCR das colnias suspeitas. Todas as colnias suspeitas apresentaram resultado positivo. As bandas no gel de agarose

    diretamente das colnias suspeitas podem ser visualizadas na Figura 6. Com o DNA puro, as condies de amplificao foram adequadas, conforme descrito por Novga et al. (2000). No houve diferena de intensidade das bandas com maior (45 UFC/ml) e menor (6 UFC/ml) contaminao.

    Figura 6: PCR realizado com DNA extrado diretamente de colnias suspeitas crescidas nas placas de TSYEA. Canaletas 1,2 e 3: contaminao inicial de 45 UFC/ml; 4-7, 9-13: contaminao inicial de 6 UFC/ml; 14: controle positivo da reao; 8: marcador de peso molecular (100 pb)

    1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

    LM1/LM2 (702 pb)

  • 36

    A presena de outros microrganismos pode ter inibido a multiplicao de L. monocytogenes e, assim, ela no pde ser detectada pela reao de PCR, por no estar na concentrao mnima j antes comentada de 105 UFC/ml (Guilbaud et al., 2005). Em um experimento em que a bactria foi adicionada ao leite e o DNA extrado por lise trmica, imediatamente aps a inoculao, o limite de deteco por PCR foi de 5 UFC/ml de leite (Aslam et al., 2003).

    Componentes dos alimentos, meios de cultura e reagentes utilizados na extrao de DNA de L. monocytogenes podem inibir a reao de PCR, diminuindo assim a sensibilidade e gerando resultados falso-negativos (Fluit, et al, 1993; Novga et al., 2000; Lzaro et al., 2005). Segundo Aslam et al., 2003, a gordura do leite pode inibir ou dificultar a extrao de DNA e a PCR. O ensaio com leite autoclavado foi realizado com leite desnatado, enquanto que nos demais, utilizou-se leite integral.

    Alguns autores atribuem a dificuldade de deteco de L. monocytogenes utilizando PCR ao fato de o meio de enriquecimento de Listeria conter inibidores da Taq polymerase (Fluit, et al., 1993; Manzano et al., 1998). Khan et al. (1998) demonstraram que certos inibidores presentes no leite como por exemplo a gordura, podem interferir com a reao de PCR quando as bactrias crescem no leite.

    A diminuio da sensibilidade da reao de PCR quando a bactria incubada em leite durante a noite pode ser devido lise insuficiente da bactria aps crescer no leite e conseqente quantidade insuficiente de DNA. A razo da lise incompleta pode ser

    atribuda gordura do leite, que cobre a superfcie bacteriana, dificultando a lise celular (Aslam et al., 2003). Essa pode ser uma explicao para a no amplificao dos fragmentos de DNA nos ensaios em que foi utilizado leite integral.

    5.5 DETERMINAO DA SENSIBILIDADE DA PCR EM DETECTAR L. monocytogenes EM LEITE CRU COM ALTA CONTAMINAO MICROBIANA INICIAL

    As trs repeties do experimento com leite de alta contaminao apresentaram resultados semelhantes ao ensaio com leite de baixa contaminao inicial: no foi possvel detectar L. monocytogenes por PCR em nenhuma diluio e com nenhum dos dois mtodos de extrao de DNA. A sensibilidade de deteco de L. monocytogenes pela metodologia convencional variou de 189 a 7 UFC/ml (Tabela 7). Observou-se uma menor sensibilidade de deteco tambm da metodologia convencional, quando o leite utilizado tinha uma alta contaminao microbiana.

    Colnias suspeitas que cresceram nas placas de Oxford e PALCAM foram repicadas em gar TSYEA. A partir deste meio foi realizada a extrao de DNA (item 4.3.3) da colnia para a confirmao da identidade da bactria.

    Como ilustrado na Figura 7, as bandas formadas no gel de agarose so ntidas. O mtodo de lise trmica diretamente da colnia um bom mtodo de extrao de DNA para a confirmao de colnias suspeitas, substituindo uma bateria de testes fenotpicos mais demorados e menos acurados.

  • 37

    Figura 7. Reao de PCR com os oligonucleotdeos LM1/LM2 aps a etapa de enriquecimento a 30C/48 h com diferentes diluies de L.monocytogenes, com DNA extrado pelo mtodo utilizando fenol-clorofrmio e reao de PCR realizada com DNA extrado diretamente de colnias suspeitas. Canaletas 1 a 9: extrao de DNA do leite contaminado com nmero incontvel de L. monocytogenes; 7 e 24: marcador de peso molecular (100 pb); 10 e 11: extrao de DNA do leite contaminado com 70 UFC/ml; 12 e 13: extrao de DNA do leite contaminado com 8 UFC/ml; 14 e 25: controles positivos; 15 e 35: vazios; 16 ao 23: extrao de DNA do leite no inoculado com L. monocytogenes; 26 e 27: controles negativos; 28 a 32: extrao de DNA direto da colnia/contaminao inicial incontvel; 33 e 34: extrao de DNA direto da colnia com contaminao inicial de 70 UFC/ml

    Tabela 7: Comparao dos mtodos Convencional e PCR na deteco de L. monocytogenes inoculada em leite cru com alta contaminao microbiana, aps etapa de enriquecimento seletivo Contagem microbiana

    do leite cru Diluies Inculo de L.

    monocytogenes Convencional

    A* B* C* PCR

    A* B* C* Repetio

    1

    Contagem Padro em Placas

    1 x 107UFC/ml

    Coliformes 1,5 x 105UFC/ml

    10-7 10-8 10-9 10-10 10-11 10-12 10-13

    Incontvel 40 UFC 7 UFC

    13 UFC 1 UFC 0 UFC 0 UFC

    + + + -

    -

    -

    -

    + -

    -

    -

    -

    -

    -

    + + + -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    Repetio

    2

    Contagem Padro em Placas

    1 x 107UFC/ml

    Coliformes 8 x 105UFC/ml

    10-7 10-8 10-9 10-10 10-11 10-12 10-13

    Incontvel 189 UFC 98 UFC 45 UFC 19 UFC 09 UFC 0 UFC

    + -

    -

    -

    -

    -

    -

    + -

    -

    -

    -

    -

    -

    + + -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    Repetio

    3

    Contagem Padro em Placas

    5 x 107UFC/ml

    Coliformes 3,2 x 105UFC/ml

    10-7 10-8 10-9 10-10 10-11 10-12 10-13

    Incontvel 70 UFC 8 UFC 0 UFC 0 UFC 0 UFC 0 UFC

    -

    + -

    -

    -

    -

    -

    + + -

    -

    -

    -

    -

    + + -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    -

    * A, B e C: triplicatas para cada repetio +: positivo aps incubao a 30C/48 h em meio de enriquecimento (LEB) -: negativo aps incubao a 30C/48 h em meio de enriquecimento (LEB)

    1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

    16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35

    LM1/LM2 (702 pb)

    LM1/LM2 (702 pb)

  • 38

    As placas de Oxford apresentaram resultados positi