Dissertacao Daniele

download Dissertacao Daniele

of 60

Transcript of Dissertacao Daniele

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    1/60

    3

    DANIELE CRISTINA VITORINO

    EFEITO DA SUPLEMENTAO COM LEO DE FGADO DE

    TUBARO SOBRE O SISTEMA IMUNITRIO DE RATOS

    TREINADOS

    Dissertao de mestrado defendida comopr-requisito para obteno do ttulo deMestre em Educao Fsica, noDepartamento de Educao Fsica, Setor deCincias Biolgicas da Universidade Federaldo Paran.

    Orientador: Prof. Dr. Luiz Claudio Fernandes

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    2/60

    4

    Este trabalho dedicado aqueles por quem eu vivo,

    meus pais Jos e Neuza.

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    3/60

    5

    AGRADECIMENTOS

    Primeiramente, a minha famlia que em momento algum jamais me faltou com

    apoio.

    Ao querido prof. Luiz Claudio Fernandes por todo o incentivo, pacincia, tempo

    e oportunidade de desenvolver este importante trabalho. Obrigada pela confiana e

    pelos momentos de sabedoria comigo compartilhado, que me ajudaram a crescer

    como pessoa e profissionalmente.

    A todos os companheiros de laboratrio que contriburam para a realizao

    deste trabalho, desde aqueles que me ajudaram com uma simples conversa aaqueles que estiveram presentes comigo nos dias de experimento. Muito obrigada a

    todos vocs.

    Aos professores Raul Osieck e Paulo Ivo Bittencourt Junior pela gentileza e

    boa vontade de apreciar este trabalho.

    A professora Maria Gisele, pelas inmeras palavras de incentivo, amizade,

    apoio e confiana.

    Ao amigo Franklin Buzzachera que sempre esteve presente nos momentosdifceis.

    Aos funcionrios do biotrio, Claudio, aos estagirios Marcelo e Araceli, e

    tambm aqueles que sem sua participao no seria possvel a realizao deste,

    nossos queridos ratinhos.

    A Universidade Federal do Paran e a todos os funcionrios pelo privilgio e

    oportunidade de ter feito parte desta instituio, os quais me ajudaram nessa

    conquista.Ao secretario de mestrado Daniel Dias... Obrigada pela ateno e pacincia.

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    4/60

    6

    SUMRIO

    RESUMOABSTRACT

    ABREVIATURAS

    LISTA DE TABELAS

    LISTA DE FIGURAS

    1 INTRODU O 121.1 Sistema Imunitrio 121.2 Exerccio Fsico e o Processo Inflamatrio 14

    1.3 Exerccio Fsico e o Sistema Imunitrio 171.4 leo de Fgado de Tubaro 221.5 leo de Fgado de Tubaro e o Sistema Imunitrio 261.6 Objetivos 291.6.1 Objetivo Geral 291.6.2 Objetivos Especficos 292 MTODOS 302.1 Tipo de Estudo 302.2 Animais 302.3 Protocolo de Treinamento 312.4 Sobrecarga de Chumbo 312.5 Suplementao 322.6 Lactato Srico 322.7 Ortotansia dos Animais 322.8 Obtenes de Macrfagos e Neutrfilos 322.9 Solues 332.10 Produo de Perxido de Hidrognio 342.11 Mensurao de nion Superxido 342.12 Atividade Fagoctica 352.13 Volume Lisossomal 362.14 Obteno de Linfcitos 36

    2.15 Analise Estatstica 373 RESULTADOS 383.1 Peso corporal 383.2 Parmetros imunitrios de macrfagos e neutrfilos 393.3 Proliferao de linfcitos 403.3.1 Proliferao de linfcitos associados ao intestino 393.3.2 Proliferao de linfcitos associados ao bao 423.3.3 Proliferao de linfcitos associados ao timo 434 DISCUSSO 455 CONCLUS O 49

    6.REFERNCIAS 50

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    5/60

    7

    RESUMO

    Estudos prvios tm demonstrado que a suplementao crnica com leo de fgado

    de tubaro (OFT) melhora a resposta imunitria de linfcitos, macrfagos e

    neutrfilos. De forma semelhante, o treinamento fsico tambm tem a capacidade de

    estimular o sistema imunitrio. Nosso principal objetivo foi investigar o efeito da

    suplementao crnica com OFT sobre parmetros imunitrios de ratos treinados.

    Ratos Wistar machos foram divididos em quatro grupos: sedentrios (SED, n= 20),

    sedentrios suplementados com OFT (SEDoft, n= 20), exercitados (EX, n= 17) e

    exercitados suplementados (EXoft, n= 19). Os animais nadaram por 6 semanas, 90

    min por dia, 4 vezes por semana em meio liquido a temperatura de 32 1 C, comuma sobrecarga correspondente a 6% do massa corporal presa ao trax de cada

    rato. Os animais foram ortotanasiados 48 h aps a ltima sesso de treinamento. A

    suplementao com OFT no alterou a fagocitose, volume lisossomal, a produo

    de nion superxido e perxido de hidrognio dos macrfagos peritoneais e

    neutrfilos sanguneos. A proliferao de linfcitos do timo e bao foi

    significativamente maior nos grupos SEDoft, EX e EXoft quando comparadas do

    grupo SED (P < 0.05). A proliferao de linfcitos associados ao intestino, por outrolado, foi similar entre os quatro grupos experimentais. Nossos achados demonstram

    que o OFT e o EX so realmente hbeis em aumentar a proliferao linfocitria,

    porm sua associao no induziu a um efeito sinergista sobre a resposta imunitria

    adaptativa. Em adio no encontramos qualquer efeito sobre a resposta imunitria

    inata.

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    6/60

    8

    ABSTRACT

    Previous studies have reported that shark liver oil (SLO) chronic supplementationimproves immune response of lymphocyte, macrophage, and neutrophil. Likewise

    exercise training also has been shown to stimulate the immune system. We are not

    aware of any study about the association of exercise and SLO supplementation on

    immune response. Our main goal was to investigate the effect of chronic

    supplementation with SLO on immune innate and adaptive response of exercise-

    trained rats. Male Wistar rats were divided into four groups: sedentary (SED, n = 20),

    sedentary with SLO supplementation (SEDslo, n = 20), exercised (EX, n = 17) andexercised supplemented with SLO (EXslo, n = 19). Rats swam for 6 weeks, 90 min

    h/day, 4 times per week in water at 32 1 C, with a load of 6.0% body weight

    attached to the torax of rat. Animals were killed 48 hours after the last exercise

    session. SLO supplementation did not change phagocytosis, lysosomal volume,

    superoxide anion and hydrogen peroxide production by peritoneal macrophages and

    blood neutrophils. Thymus and spleen lymphocyte proliferation were significantly

    higher in SEDslo, EX, and EXslo groups when compared to SED group (P < 0.05).

    Gut associated lymphocyte proliferation, on the other hand, was similar between the

    four experimental groups. Our findings show that SLO and EX indeed are able to

    increase lymphocyte proliferation but their association did not induce further

    stimulation in the adaptive immune response and also did not modify innate

    immunity.

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    7/60

    9

    ABREVIATURAS

    CD4- Cluster of differentiation 4

    CD8- Cluster of differentiation 8

    Con-A- Concanavalia A

    ELISA-Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

    H2O2 - Perxido de hidrognio

    IL-1- Interleucina 1

    IL-6- Interleucina 6

    LPS- Lipopolissacardeo

    NBT- Nitroblue tetrazoliumNK- Clulas Natural Killer

    O-- nion superxido

    PBS- Soluo tampo fosfato-salina

    PHA- Phitoemaglutinina

    PK-C- Protena quinase

    PUFA- Polyunstaturated Fatty Acids

    Rpm - Rotaes por minutoTh- Clula auxiliar T helper

    TNF- Fator de Necrose Tumoral

    URTI- Upper Respiratory Trat Infections

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    8/60

    10

    LISTA DE TABELAS

    Tabela 01- Efeitos do exerccio fsico extenuante sobre o sistema imunitrio

    Tabela 02- Fagocitose, volume lisossomal e produo de nion superxido e

    perxido de hidrognio por macrfagos peritoneais obtidos de ratos sedentrios

    (SED), sedentrios suplementados (SEDoft), exercitados (EX) e exercitados

    suplementados (EXoft).

    Tabela 03- Fagocitose, volume lisossomal e produo de nion superxido e

    perxido de hidrognio por neutrfilos sanguneos obtidos de ratos sedentrios

    (SED), sedentrios suplementados (SEDoft), exercitados (EX) e exercitados

    suplementados (EXoft).

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    9/60

    11

    LISTA DE FIGURAS

    Figura 01- Curva em J que mostra a relao entre a quantidade de exerccio fsico

    e o risco para infeces no trato respiratrio superior (URTI).

    Figura 02- Relao proposta de curva em S entre carga de treinamento e taxa de

    infeco.

    Figura 03- Exemplos de compostos contendo glicerol.

    Figura 04- Estrutura qumica das molculas de alquilglicerol mais comuns

    Figura 05- Estrutura qumica do 1-O-(2-metxi) hexadecilglicerol, um alquilglicerol

    metxi substitudo encontrado no leo de fgado de tubaro.

    Figura 06- Evoluo da massa corprea dos animais durante as 6 semanas de

    treinamento.

    Figura 07- Proliferao em contagens por minuto (cpm) de linfcitos associados ao

    intestino dos quatro grupos experimentais (SED, SEDoft, EX e EXoft) .

    Figura 08- Proliferao em contagens por minuto (cpm) de linfcitos do bao dos 4

    grupos experimentais (SED, SEDoft, EX e EXoft) .

    Figura 09- Proliferao em contagens por minuto (cpm) de linfcitos presentes no

    timo dos 4 grupos experimentais (SED, SEDoft, EX e EXoft) .

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    10/60

    12

    1 INTRODUAO

    1.1SISTEMA IMUNITRIO

    A funo primria do sistema imunitrio a proteo do hospedeiro

    contra microorganismos patognicos (CHAPLIN, 2006). A defesa contra os

    microorganismos mediada pelas reaes iniciais da imunidade inata e pelas

    reaes mais tardias da imunidade adquirida. A imunidade inata consiste de

    mecanismos existentes antes da infeco, os quais possuem rpidas respostas aosmicroorganismos e que reagem essencialmente do mesmo modo s infeces

    repetidas. Os componentes principais da imunidade inata so: (1) barreiras fsicas e

    qumicas (epitlios e substncias antimicrobianas produzidas nas superfcies

    epiteliais); (2) clulas fagocticas (neutrfilos, macrfagos) e clulas natural killer

    (NK); (3) protenas do sangue (incluindo os componentes do sistema complemento e

    outros mediadores da inflamao); e (4) citocinas, protenas que regulam e

    coordenam muitas das atividades das clulas da imunidade inata, a qual proporcionaas linhas iniciais de defesa contra os microorganismos (ABBAS et al., 2003).

    Os neutrfilos so a primeira linha de defesa contra

    microorganismos invasores, constituindo 50-60 % de todos os leuccitos circulantes.

    Essas clulas tambm esto envolvidas na sntese e liberao de citocinas

    imunomodulatrias que influenciam a funcionalidade de linfcitos B e T, possuindo,

    portanto, um papel eferente, como fagocitose e degranulao, e aferente, como

    liberao de molculas imunomoduladoras (PYNE, 1994).Os macrfagos se originam de um precursor celular na medula

    ssea, sendo posteriormente transferidos para a circulao sangunea como

    moncitos, onde ali permanecem por diversas horas at migrarem para os tecidos

    diferenciados em macrfagos (NATHAN, 1983). O macrfago atua como clula

    chave no incio e operao de muitos componentes da funo imunitria, uma vez

    que essas clulas fazem parte de um sistema celular altamente regulado e verstil.

    Como possuem atividade microbicida, os macrfagos so capazes de reconhecer e

    destruir invasores extracelulares ou intracelulares, sendo estes procariotos ou

    eucariotos (ADAMS; HAMILTON, 1984). Essas clulas so conhecidas tambm por

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    11/60

    13

    atuarem em uma grande variedade de funes do organismo, como o metabolismo

    de ferro e de lipdeos. O grande nmero de produtos gerados e secretados pelos

    macrfagos auxilia na regulao de outras clulas, incluindo fibroblastos e clulas

    envolvidas na formao do componente mielide da medula ssea (COHN, 1982)

    Em contraste com a imunidade inata, os mecanismos de defesa

    mais altamente evoludos so estimulados pela exposio aos agentes infecciosos e

    aumentam em magnitude e capacidade defensiva em cada exposio sucessiva a

    um microorganismo em particular, sendo denominada de imunidade adquirida, pelo

    fato desta forma de imunidade desenvolver-se em resposta uma infeco e

    adaptar-se a ela. As caractersticas que definem este tipo de imunidade incluem a

    grande especificidade para as distintas macromolculas e a capacidade de memria,assim respondendo mais vigorosamente s repetidas exposies ao mesmo

    microorganismo. Em funo de sua grande especificidade em distinguir diferentes

    microorganismos e macromolculas, a imunidade adquirida tambm denominada

    de imunidade especfica, sendo os linfcitos seus componentes. Os produtos e

    substncias estranhas que induzem as respostas especficas ou so alvo dessas

    substncias so chamadas de antgenos (ABBAS et al.,2003).

    Aps exposio ao antgeno ou outro agente que altere ahomeostase do organismo, os linfcitos tornam-se ativados para entrar no ciclo

    celular e se proliferarem (BAUM; LIESEN; ENNEPER, 1994).

    O sistema imunolgico inato e adaptativo (ou adquirido) so

    freqentemente descritos como vias separadas contrastando a resposta do

    hospedeiro; no entanto, essas respostas usualmente atuam juntas, com a resposta

    inata representando a primeira linha de defesa e a resposta adaptativa tornando-se

    proeminente aps diversos dias quando as clulas antgeno-especfico B e T tm sesubmetido a expanso clonal. Alm disso, as clulas antgeno-especfico amplificam

    suas respostas por recrutamento de mecanismos efetores inatos para gerar o

    completo controle dos microorganismos invasores. Dessa forma, embora as

    respostas imunolgica inata e adaptativa sejam fundamentalmente distintas em seus

    mecanismos de ao, a sinergia entre essas essencial para uma resposta

    imunolgica inteiramente efetiva e intacta (CHAPLIN, 2006).

    A comunicao dentro do sistema imunitrio adaptativo e entre os

    sistemas inato e adaptativo ocorre por contato direto clula-clula e pela produo

    de mensageiros qumicos. Estes mensageiros qumicos so protenas chamadas

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    12/60

    14

    citocinas que agem regulando a atividade das clulas que produzem citocinas e/ou

    de outras clulas. Cada citocina pode ter mltiplas atividades sobre diferentes

    clulas. As citocinas agem por se ligarem a receptores especficos na superfcie

    celular e assim induzir mudanas no crescimento, desenvolvimento ou atividade da

    clula alvo. Citocinas pr-inflamatrias so predominantemente produtos do sistema

    imunitrio. Entretanto, clulas endoteliais e fibroblastos tambm tm capacidade

    para produzi-las. A citocina denominada TNF (tumor necrosis factor) age como

    desencadeadora para ativar cascatas de produo de citocinas. O TNF liberado

    rapidamente em resposta a agentes inflamatrios e infecciosos, e induz a produo

    de grande nmero de outras citocinas (CALDER, 2001; GRIMBLE, 1998). TNF-, IL-

    1 e IL-6 so as citocinas mais importantes produzidas por moncitos e macrfagos.Estas citocinas estimulam neutrfilos, moncitos e macrfagos a iniciarem a

    destruio de clulas bacterianas e tumorais, estimulam a proliferao de linfcitos T

    e B e tambm estimulam a produo de outras citocinas. A produo de quantidades

    apropriadas de TNF, IL-1 e IL-6 so raramente benficas em resposta infeco,

    mas sua produo inapropriada pode ser perigosa e estas citocinas, principalmente

    o TNF, so causas de respostas patolgicas que ocorrem em condies

    inflamatrias (CALDER, 2001). Todas as clulas nucleadas do organismo produzemcitocinas, e similarmente expressam seus receptores em suas membranas

    (TANIGUCHI, 1995).

    1.2EXERCCIO FSICO E O PROCESSO INFLAMATRIO

    O exerccio fsico provoca distrbios em muitos componentes do

    sistema imunitrio (ROWBOTTOM; GREEN, 2000; AKIMOTO; FURUDATE; SAITOH

    et al., 2002; JILMA; EICHLER; STOHLAWETZ et al., 1997; KELLEY, 2001), incluindo

    alterao no nmero de neutrfilos (BUTTERFIELD; BEST; MERRICK, 2006),

    elevadas concentraes de interleucina IL-1, IL-6 e fator de necrose tumoral (TNF-

    ) (OSTROWSKI; ROHDE; ASP et al., 1999; VASSILAKOPOULOS; KARATZA;

    KATSAOUNOU et al., 2003). Essas citocinas so conhecidas por estarem tambm

    envolvidas no processo inflamatrio (MEKSAWAN; VENKATRAMAN; AWAD et al.,

    2004).

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    13/60

    15

    O processo inflamatrio pode ser originado atravs de uma

    variedade de mecanismos fisiolgicos, os quais incluem a introduo de patgenos

    e modificaes no sistema orgnico, como estresse qumico, trmico ou mecnico

    (BUTTERFIELD; BEST; MERRICK, 2006). Na medicina do esporte, o termo

    inflamao freqentemente usado para descrever uma srie de sinais e sintomas

    aps dano tecidual muscular ou sseo, sendo que essa denominao foi

    originalmente usada para descrever quatro classes de eventos que afetam a

    resposta do tecido ao trauma: vermelhido, inchao, aumento da temperatura e dor

    (ROCHA e SILVA, 1994). A tentativa de se reduzir ou prevenir esses sinais e

    sintomas da inflamao aps trauma tecidual tem tornado-se um dogma, sendo que

    os mecanismos responsveis pela inflamao no reparo e cicatrizao de tecidoainda no esto completamente compreendidos (BUTTERFIELD; BEST; MERRICK,

    2006).

    O processo inflamatrio definido como a proliferao de clulas

    sanguneas brancas aps dano tecidual muscular (QUINDRY; STONE; KING et al.,

    2003). Desse modo, a resposta inflamatria origina-se logo no incio do exerccio

    fsico, quando a quantidade de neutrfilos circulantes aumentam significativamente

    (QUINDRY; STONE; KING et al., 2003; McINTYRE; REID; LISTER et al., 2000). Osneutrfilos so as primeiras populaes de clulas sanguneas brancas a chegarem

    e atuar em resposta inflamatria durante o exerccio fsico ou dano muscular, alm

    disso, estas clulas possuem mecanismos de defesa especficos e no-especficos,

    alguns dos quais so capazes de causar dano tecidual adicional (PEAK, 2002;

    CANNON; ORENCOLE; FIELDINGet al., 1990; ARMSTRONG, 1990).

    No passado, os efeitos iniciais do dano excntrico causado pelo

    exerccio fsico foram propostos serem resultado de um elevado nmero deneutrfilos circulantes, uma vez que essas clulas so requeridas para entrar no

    local de injria e iniciar a fagocitose ou a remoo dos tecidos lesados (SMITH;

    McCAMMON; SMITH et al., 1989). No entanto, esta resposta imediata tambm tem

    sido observada aps exerccio isomtrico e alongamento passivo sem dano,

    mostrando que apresena de neutrfilos no necessariamente est relacionada

    presena de leso (SMITH; McCAMMON; SMITH et al., 1989)

    A neutrofilia precoce ps-exerccio provavelmente devida a uma

    combinao de fatores (BUTTERFIELD; BEST; MERRICK, 2006). Durante o

    repouso, mais da metade dos neutrfilos circulantes encontram-se marginados ao

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    14/60

    16

    longo da parede endotelial dos vasos sanguneos. No incio do exerccio, o aumento

    na epinefrina circulante, fluxo sanguneo e molculas sinalizadoras celulares

    removem esses neutrfilos do endotlio, permitindo a estes acesso a circulao e se

    redistribuirem no corpo, conforme a necessidade do organismo (QUINDRY; STONE;

    KING et al., 2003; McINTYRE; REID; McKENZIE, 1995; PYNE, 1994). Os

    mecanismos pelos quais os neutrfilos se translocam at o tecido lesionado esto

    apenas comeando a ser compreendidos, o que poderia representar uma estratgia

    chave de interveno para limitar certos aspectos da inflamao (BUTTERFIELD;

    BEST; MERRICK, 2006).

    O msculo esqueltico produz e libera continuamente citocinas,

    peptdeos e protenas de baixo peso molecular que auxiliam a controlar e mediarinteraes entre as clulas envolvidas na resposta imunitria (BAGBY; CROUCH;

    SHEPHERD, 1996; DINARELLO, 1994), numa tentativa tambm de manter a

    homeostase e regular a sua funo. Distrbios simples no msculo esqueltico, tais

    como o alongamento ativo durante a contrao excntrica, aumentam

    significativamente a expresso de IL-1 e TNF- (MALM; NYBERG; ENGSTROM,

    2000). Essas citocinas pr-inflamatrias aumentam a expresso de molculas de

    adeso leuccito-endotelial (E-selectina) no interior do endotlio dos vasossanguneos adjacentes (CANNON; ST. PIERRE, 1998; WELLER; ISENMANN;

    VESTWEBER, 1992). A ativao do endotlio ocorre em local especfico e pode

    resultar em liberao adicional de IL-1, alm de citocinas pr-inflamatrias

    adicionais, incluindo IL-6 e IL-8, as quais esto relacionadas neutrofilia

    (KAPLANSKI; FARNARIER; KAPLANSKI et al., 1994; DETMERS; LO; OLSEN-

    EGBERG et al., 1990; LIU; SPOLARICS, 2003). Em contrapartida, foi atribuda a IL-

    6 tambm um efeito antiinflamatrio quando esta liberada durante a realizao deexerccio fsico e posicionamentos que promovem estmulos reflexos

    proprioceptivos. Alm disso, a IL-6 tambm atua aumentando a produo de IL-10 e

    de IL-Ra (molcula inibitria dos efeitos inflamatrios causados pelas citocinas pr

    inflamatrias) (WINKELMAN, 2007). Desse modo, a ativao endotelial apresenta

    duas finalidades principais: estimular a adeso de neutrfilos no local da leso

    celular (marginao) e auxiliar a clula no recrutamento adicional de neutrfilos

    (BUTTERFIELD; BEST; MERRICK, 2006).

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    15/60

    17

    1.3EXERCCIO FSICO E O SISTEMA IMUNITRIO

    Os efeitos da atividade fsica no sistema imunitrio tm sido

    constantemente investigados na literatura cientfica(EKBLOM; EKBLOM; MALM,

    2006). Atualmente, h uma preocupao de que o exerccio fsico exaustivo poderia

    prejudicar o sistema imunitrio, conduzindo o indivduo a uma aumentada

    suscetibilidade a doenas, nas quais as infeces virais, especialmente as do trato

    respiratrio superior (URTI, do ingls Upper Respiratory Tract Infections), tm sido

    foco. Em contrapartida, estudos tm demonstrado que o exerccio de intensidade

    moderada reduz as taxas de infeco, especialmente entre os idosos (NIEMAN;

    MILLER; HENSONet al., 1993); entretanto, h uma carncia de estudos controlados

    envolvendo grandes populaes (WOODS et al.,2002).

    Buscando explicar a possvel suscetibilidade infeces devido

    prtica de exerccio fsico exaustivo, diversos estudos tm investigado os efeitos

    dessa atividade sobre as clulas sanguneas brancas, substncias sinalizadoras e

    imunidade na mucosa (EKBLOM; EKBLOM; MALM, 2006). Evidncias demonstram

    que modificaes na mensurao do fentipo de clulas sanguneas brancas aps

    exerccio fsico extenuante podem persistir aps setenta e duas horas, a qual

    poderia ser afetada pelo modo e durao da atividade (PEAK, 2002). O evento mais

    proeminente e consistente durante o exerccio fsico a neutrofilia e o reduzido

    nmero de clulas NK, poucas horas aps o trmino da atividade (PEDERSEN;

    ULLUM, 1994; PEAK, 2002).

    A ocorrncia de decrscimo na porcentagem de linfcitos Th1

    circulantes, mas no de Th2, tm sido demonstrados aps o exerccio fsicoprolongado extenuante (STEENSBERG; TOFT; BRUUNGAARD et al., 2001) e

    grandes cirurgias (BLOTTA, 1997). Alm disso, alteraes no balano de linfcitos

    Th1/Th2 em favor da dominncia do linfcito Th2 poderia prover uma explicao

    para a elevada suscetibilidade s infeces seguindo o exerccio prolongado

    (STEENBERG; TOFT; BRUUNGAARD, et al., 2001) e tambm a cirurgia

    (BERGUER et al., 1999).

    Em relao proliferao de linfcitos, a maioria dos estudosusaram mitgenos que induzem muitos, ou todos os linfcitos de certo tipo a se

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    16/60

    18

    proliferarem (JANEWAY; TRAVERS, 1994). Estudos em seres humanos indicam que

    h declnio na resposta dos linfcitos aos mitgenos fitoemaglutinina (PHA) e

    concavalina-A (Con-A) durante e por at muitas horas aps o exerccio; isto tambm

    foi detectado consistentemente em estudos com animais, (Tabela 01) ocorrendo,

    pelo menos em parte, devido ao aumento das clulas NK na circulao (FRY et.al.

    1992).

    TABELA 01. Efeitos relatados do exerccio fsico extenuante sobre o sistema imunitrio.

    Durante Exerccio Aps Exerccio

    Contagem de neutrfilos

    Contagem de moncitos

    Contagem de linfcitos

    Contagem clulas T+CD4

    Contagem clulas T+CD8

    Contagem de clulas B +CD19

    Contagem de clulas NK+CD16+56

    Apoptose linfcitos

    Resposta proliferativa aos mitgenos

    Resposta dos anticorpos in vitro

    IgA da saliva

    Atividade das clulas NK

    Atividade das clulas LAK

    Protena C-reativa

    Concentrao plasmtica de TNF-

    Concentrao plasmtica de IL-1

    Concentrao plasmtica de IL-6

    Concentrao plasmtica de IL-1ra

    Concentrao plasmtica de IL-10

    Concentrao plasmtica de TNF-R

    - Acrscimo; - Decrscimo; - Acrscimo acentuado; TNF- -fator de necrose tumoral- ; TNF-R- receptor dofator de necrose tumoral; IL- interleucina; MIP- protena inflamatria macrfago.

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    17/60

    19

    Intensos perodos de treinamento fsico so freqentemente

    associados com imunossupresso (FITZGERALD, 1988; MACKINNON, 2000) e

    elevada incidncia de infeces (GLEESON, 2000). Baseado nestes e em outros

    achados tm sido hipotetizado que poderia haver um elevado risco infeces

    durante as horas subseqentes ao exerccio fsico, comumente referido como

    Teoria da Janela de Oportunidade (PEDERSEN; BRUUNSGAARD, 1995).

    A imunodepresso reconhecida pela diminuio das clulas CD4+

    e CD8+, da atividade de neutrfilos, prejuzo da sntese de anticorpos e reduo na

    concentrao de imunoglobulinas no sangue e saliva (PEDERSEN, 2000).

    Devido s numerosas sesses de treinamento exaustivo, maiores

    episdios de URTI so verificados em atletas de elite do que em indivduos noatletas durante um dado perodo de tempo. Entretanto, apenas pequenas diferenas

    tm sido reportadas quando se compara com o sistema imunitrio de atletas e

    sedentrios (EKBLOM; EKBLOM; MALM, 2006). Em estudo conduzido por NIEMAN

    et al(1994), somente a atividade citotxica das clulas NK foram significantemente

    diferentes entre maratonistas e sedentrios.

    Sabe-se que o exerccio fsico pode exercer efeitos negativos e

    positivos sobre a funo imunitria. A relao entre exerccio e suscetibilidade infeces tem sido ilustrado no chamado modelo de curva em J (NIEMAN, 1994).

    Este modelo sugere que, enquanto a atividade fsica moderada poderia melhorar a

    funo imunitria acima dos nveis observados em indivduos sedentrios, o

    exerccio prolongado e de alta intensidade poderia prejudicar a funo imunolgica

    (GLEESON, 2007).

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    18/60

    20

    Figura 01. Curva em J que mostra a relao entre volume e intensidade de exerccio fsico e o riscopara infeces no trato respiratrio superior (URTI). Este modelo sugere que exerccios moderadospoderiam reduzir o risco de URTI, enquanto excessivas quantidades de exerccio poderiam aumentaresse risco (NIEMAN, 1994).

    Em 1987 o efeito de URTI foi investigado em 2.311 maratonistas

    (NIEMAN et al., 1990). Na semana seguinte maratona 12,9% contraiu doenas,

    quando comparados apenas 2,2% em atletas no competitivos. Corredores que

    treinaram >96 km/semana dobraram os casos de doenas quando comparados aos

    que treinaram

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    19/60

    21

    Baixo Moderado Alto Elite

    Carga de exerccio

    Figura 02. Relao proposta de curva em S entre carga de treinamento e taxa de infeco(Adaptado de Malm, 2006).

    Heath et al (1991) verificaram que a probabilidade de desenvolver

    URTI foi aumentada com a mdia de corrida em quilmetros por ano, mas somente

    at 2222 km por ano. Isto representa 43 km por semana, o que equivale a uma

    pequena distncia de corrida. Acima dos 43 km por semana, essa probabilidade

    permanece constante, sendo que a distncia normal de corrida para atletas de elite

    varia de 120-200 km por semana (MALM, 2006). Nieman et al(1990) compararam

    atletas que correram uma mdia de 32,97 km por semana, relatando que a

    probabilidade para URTI foi menor para os que realizaram maior tempo de corrida.Sendo assim, baseado nos estudos publicados acima, um modelo de curva em S

    entre carga de exerccio e infeco foi proposto (MALM, 2006).

    As alteraes no sistema imunitrio induzidas pelo exerccio fsico

    podem ser influenciadas por mltiplos fatores, incluindo modo, durao e

    intensidade do exerccio (NIEMAN, 1997), to bem como horas e dias aps a ltima

    sesso de treinamento, os quais so importantes fatores que poderiam influenciar a

    resposta imunitria (PEDERSEN; TOFT, 2000). Enquanto estudos anteriores tmdemonstrado que a funo imunitria danificada aps um tiro de exerccio

    Probabilidade de desenvolverinfeco

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    20/60

    22

    moderado/intenso (PEDERSEN; TOFT, 2000; NGUYEN; TIDBALL, 2003; KWAK,

    2006; SANTOS et al., 2007), outros tm demonstrado que o exerccio crnico

    moderado melhora a funo imunolgica (THARP; PREUSS, 1991; SUGIURA et al.,

    2001; LEVADA-PIRES et al., 2007). De fato, Sugira et al. (2001) verificou que a

    capacidade fagoctica e produo de nion superxido por macrfagos peritoneais

    foram significantemente aumentadas em ratos treinados quando comparados aos

    sedentrios, aps doze semanas de treinamento moderado. Similarmente, Tharp e

    PREUSS (1991) demonstraram que a resposta proliferativa de linfcitos do bao

    quando estimulados com concanavalina A (Con-A) ou lipopolissacride (LPS) foi

    significantemente maior em ratos que realizaram exerccio fsico moderado. Juntos,

    esses estudos sugerem que a resposta imunitria inata e adaptativa poderiam sermodificadas pelo treinamento fsico moderado.

    1.4LEO DE FGADO DE TUBARO

    No decorrer das ltimas duas dcadas, o interesse pelos leos depeixe tem aumentado consideravelmente, uma vez que estes possuem uma rica

    fonte de cidos graxos poliinsaturados (PUFA- Polyunstaturated Fatty Acids)

    (NAVARRO-GARCIA; PACHECO-AGUILAR; VALLEJO-CORDOVA et al., 2000).

    Dois desses PUFAs, o cido eicosapentaenico (EPA) e o docosahexaenico (DHA)

    tm tido relevante importncia na preveno ou mesmo reduo de doenas

    cardacas (STANSBY, 1990), inflamatrias (GURR, 1993), alm da possibilidade de

    atuao do DHA como suplemento nutricional para o crebro e no desenvolvimentode retinas em bebs (HOFFMAN; UAUY, 1992).

    O leo de fgado de tubaro reconhecido como importante fonte de

    PUFAs (BORDIER, SELLIER, FOUCAULT et al., 1996), sendo inclusive empregado

    como medicamento para o tratamento de debilidades em geral entre os povos

    esquims, habitantes da costa oeste da Noruega e Sucia (KROTKIEWSKI,

    PRZYBYSZEWSKA, JANIK et al., 2003). Alm disso, o leo de fgado de tubaro

    tem sido historicamente utilizado para diversas outras finalidades teraputicas, tais

    como cicatrizao de feridas, tratamento e irritaes do trato respiratrio e distrbios

    alimentares (KROTKIEWSKI; PRZYBYSZEWSKA; JANIK et al., 2003).

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    21/60

    23

    O contedo lipdico encontrado nas clulas de fgado de tubaro tem

    sido investigado e relatado na literatura desde os meados de 1950. Deste contedo

    lipdico, cerca 30% a 50% corresponde a molculas de alquilgliceris (BROHULT et

    al., 1977; HALLGREN et al., 1978; NAVARRO-GARCIA et al., 2000)

    Os alquilgliceris tm na sua estrutura qumica, via uma ligao ter,

    um cido graxo ligado a uma longa cadeia carbnica, saturada ou insaturada e

    unidas por numerosas duplas ligaes, sendo que diversas destas so derivadas de

    ter lipdeo (HALLGREN; LARSSON, 1962).

    A ligao ter a chave para o entendimento funcional dos

    alquilgliceris. A ligao C-O-C encontrada em muitos compostos biolgicos

    importantes, como a tiroxina da glndula tireide por exemplo. Os teres glicerisso muito difundidos, sendo estes isolados de muitas formas de vida e em diferentes

    arranjos moleculares. A estrutura bsica destes compostos consiste de uma

    molcula de glicerol com um ou mais grupamento hidroxila sendo substituda por

    uma longa cadeia de cido graxo (PUGLIESE; JORDAN; CEDERBERG et al., 1998).

    Figura 03. Exemplos de compostos contendo glicerol. Observe que a molcula de glicerol contendotrs carbonos constitui a estrutura bsica para as outras duas molculas. Note tambm que otriglicerdeo contm somente cido graxo ligado a ster, enquanto que o alquilglicerol contm tambmcido graxo ligado a ter.

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    22/60

    24

    Os alquilgliceris mais comuns so os alcois quimil (hexadecil),

    batil (octadecil) e selaquil (octadecenil) (HALLGREN; LARSSON, 1962) (figura 04).

    Dependendo da espcie de tubaro, o leo extrado pode ser rico em 1-O-

    alquilglicerol, o qual exerce efeitos bacteriostticos, fungistticos, antiinflamatrios e

    hematopoiticos (BORDIER; SELLIER; FOUCAULT, et al., 1996); ou esqualeno,

    composto orgnico verificado comumente na superfcie da pele humana

    (DAVENPORT; DEPREZ, 1989).

    Figura 04. Estrutura qumica das molculas de alquilglicerol mais comuns.

    Uma pequena quantidade de alquilgliceris encontrada nas clulas

    vivas de grande parte dos tecidos animais, principalmente nos rgoshematopoiticos, incluindo medula ssea, bao, fgado, tecidos linfticos e sangue

    (SNYDER; WOOD, 1969). Os gliceris ter lipdicos tambm so encontrados no

    colostro humano, leite de ovelha e humano, sendo que este contm

    aproximadamente dez vezes mais alquilglicerol que o leite de vaca (HALLGREN;

    NIKLASSON; STALLBERG et al.,1974).

    Algumas molculas de alquilglicerol apresentam grupamento metxi

    (-OCH3) no incio da sua cadeia aliftica, substituindo um tomo de hidrognio.Enquanto os alquilgliceris em geral apresentam importante atividade biolgica, os

    alquilgliceris metxi-substitudos so conhecidos por serem ainda mais potentes

    (CARBALLEIRA, 2002). Alguns dos mais antigos lipdeos metoxilados estudados

    foram os alquilgliceris metoxilados na posio 2 da cadeia aliftica, onde em leo

    de fgado de tubaro eles constituam 4% do total de teres de glicerol

    (CARBALLEIRA, 2002)

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    23/60

    25

    Figura 05. Estrutura qumica do 1-O-(2-metxi) hexadecilglicerol, um alquilglicerol metxi substitudoencontrado no leo de fgado de tubaro

    Os benefcios da ingesto de alquilgliceris foram verificados

    primeiramente em casos de leucemia infantil, em 1952, onde os pacientes ingeriamgordura no saponificvel obtida da medula ssea de gado como auxiliar do

    tratamento contra o cncer. Antes disso, em 1930, j se administravam extratos de

    tecido gerador de clulas sangneas para tratar distrbios sangneos como a

    granulocitopenia. Posteriormente foi demonstrado que a frao da medula ssea

    vermelha responsvel por estes efeitos correspondia aos alquilgliceris presentes no

    tecido (BROHULT, 1962).

    Posteriormente, foram verificados diversos efeitos benficos do usode alquilglicerol tais como: reduo dos efeitos colaterais da radioterapia (leucopenia

    e trompocitopenia), inibio do crescimento tumoral, alm de estimular e modular a

    resposta imunitria (PUGLIESE et al.,1998).

    Muitos lipdeos sintticos contendo alquilglicerol tambm possuem

    atividade farmacolgica de grande interesse mdico, como atividade antagonista do

    fator de ativao plaquetrio e atividade neoplsica. O alquilglicerol no substitudo

    por si s j possui vrias atividades biolgicas; o 1-O-dodecilglicerol estimula a

    produo de anticorpos em ratos (NGWENYA et al., 1991) e ativa macrfagos

    (YAMAMOTO et al., 1988), alm tambm desta forma de alquilglicerol estimular a

    diferenciao de neurnios (VED et al., 1991) e atividade antitumoral (ANDO et al.,

    1972).

    Em mamferos, os alquilgliceris vindos da dieta so absorvidos sem

    a quebra de sua ligao ter e so usados como precursores de fosfolipdeos de

    membrana em diferentes tecidos. Blank et al(1991) e Reichwald & Mangold (1977)

    relataram que os alquilgliceris da dieta so incorporados preferencialmente nos

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    24/60

    26

    fosfolipdeos fosfatidiletanolamina (1-O-alquil-2-acil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina) e

    fosfatidilcolina (1-O-alquil-2-acil-sn-glicero-3-fosfocolina), onde aps serem

    incorporados na membrana, estes lipdeos tornam-se disponveis s clulas para

    serem usados como precursores de outras molculas e assim exercerem seus

    efeitos biolgicos. Os alquilacilgliceris gerados a partir da hidrlise de

    fosfatidilcolina ativam a protena quinase C (PK-C) (ROBINSON et al.,1991). No

    entanto, o 1-O-alquil-2-acil-n-glicerol, um glicerolipdeo encontrado na medula ssea,

    considerado ser um antagonista da PK-C (FORD et al., 1989).

    Aps a ingesto oral, a absoro dos teres lipdeos ocorre no

    intestino. Cerca de 95 porcento de lcool quimil radiomarcado administrado foi

    absorvido no intestino, enquanto que o restante (5%) foi excretado nas fezes(BERGSTROM; BLOMSTRAND, 1956).

    Os alquilgliceris podem se incorporar na membrana de vrios tipos

    celulares, alm de plaquetas. Estudos realizados com plaquetas de coelho e

    alquilgliceris in vitro mostraram que estas molculas inibiram parcialmente a

    liberao de PAF (fator ativador de plaquetas) e a estimulao das plaquetas. A

    ativao de plaquetas participa de mecanismos envolvidos em vrias doenas, e

    podem exercer importante papel no crescimento metasttico de clulas cancerosas(PEDRONO et al., 2004). Alm disso, foi verificado que o tratamento de 1-O-

    alquilglicerol in vitro aumentou a motilidade de espermatozides e fertilidade,

    sugerindo que este efeito esta relacionado ao metabolismo do PAF e funo do

    espermatozide de sunos selvagens (CHEMINADE et al., 2002).

    1.5LEO DE FGADO DE TUBARO E O SISTEMA IMUNITRIO

    As funes do sistema imunitrio podem ser influenciadas tambm

    pelo estado nutricional. Como componentes cruciais nas dietas, os lipdeos so

    substncias que exercem profundo efeito na modulao do sistema imunitrio. Este

    argumento tem sido demonstrado em numerosos estudos, incluindo um

    epidemiolgico realizado em 1980, que revelou a baixa incidncia de doenas auto-

    imunes em esquims cuja alimentao era rica em leo de peixe. Os lipdeos agem

    como importantes moduladores da resposta inflamatria, o que no

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    25/60

    27

    surpreendente, uma vez que um grande nmero de compostos modulatrios so

    derivados da hidrlise de fosfolipdeos de membrana, pela ao de fosfolipases

    (fosfolipase A2, gerando prostaglandinas e leucotrienos; fosfolipase C, que gera

    diacilglicerol; fosfolipase D, que gera cido fosfatdico) e esfingomielinases que

    geram ceramida (GRIMBLE, 1998; PABLO et al.,2000).

    Os alquilgliceris possuem muitas propriedades biolgicas que os

    diferem significativamente de outros teres anlogos. Dentre estas propriedades

    destacam-se sua ao antibitica contra diversas bactrias, fungos e parasitas

    (HALLGREN, 1983; CROFT, NEAL; PENDERGAST et al.,1987), imunoestimulao

    (BOERYD; NILSSON; LINDHOLM, et al., 1978; BROHULT; BROHULT; BROHULT

    et al., 1972) e seus efeitos anti-tumorais (HERMMANN; NEUMMAN, 1986; UNGER;EIBL; KIMet al., 1987; BROHULT; BROHULT; BROHULT et al., 1986), sendo que

    as duas ltimas so caractersticas de compostos metil/metxi-substitudos

    (PAMBLAND; SAMUELSSON; BROHULT et al., 1990).

    Em estudo realizado por Pambland et al. (1990) foi verificado

    tambm que vrios tipos de alquilgliceris poderiam estimular a resposta funcional

    de neutrfilos em humanos, devido ativao do metabolismo oxidativo, aumento

    da concentrao de clcio intracelular, ou ambos. Ainda, diferentes tipos dealquilgliceris tm demonstrado estimular plaquetas em diferentes vias (HANAHAN;

    MUNDER; SATUOCHI et al., 1981; HADVRY; BAUMGARTNER, 1983). Contudo,

    apesar das inmeras funes biolgicas terem sido constantemente confirmadas por

    diversos estudos, os mecanismos moleculares precisos de ao dos alquilgliceris

    ainda no esto completamente elucidados (LE BLANC; SAMULSSON; BROHULT

    et al., 1995).

    Na Europa, os alquilgliceris tm sido usados desde 1934,utilizando-se extratos de medula ssea de gado a fim de se tratar granulocitopenia

    (MARBERG; WILES, 1938). Posteriormente, esses investigadores demonstraram

    que a frao no saponificvel da medula ssea foi responsvel pelo aumento no

    nmero de leuccitos.

    A ativao da resposta imunitria por alquilgliceris foi tambm

    verificada por Homma e Yamamoto (1990), os quais realizaram estudos in vivo

    administrando pequenas doses de alquilgliceris em ratos, e tambm estudos in vitro

    com clulas peritoneais de ratos, incubadas com alquilgliceris. Nestes estudos, foi

    observado que o breve tratamento com alquilgliceris produziu significativa elevao

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    26/60

    28

    da atividade fagoctica de macrfagos, e que esta atividade macrofgica estimulada

    era dependente da participao de clulas peritoneais no aderentes, ou seja, de

    linfcitos. Esta observao sugere a ocorrncia de rpida comunicao de linfcitos

    para macrfagos durante o perodo de tratamento das clulas com alquilgliceris,

    gerando como resultado uma aumentada atividade fagocitria. Ngwenya e Foster

    (1991) observaram resultados similares em estudos in vitrocom clulas peritoneais

    de camundongos deficientes em linfcitos T (BALB/c-nu/nu) e de camundongos

    normais. Os resultados demonstraram a necessidade de linfcitos T para a ativao

    de macrfagos mediada por alquilgliceris, e tambm a estimulao da produo de

    anticorpos induzida por estes compostos.

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    27/60

    29

    1.6OBJETIVOS

    1.6.1OBJETIVO GERAL

    Devido influncia do leo de fgado de tubaro e do exerccio fsico

    moderado sobre o sistema imunitrio, este estudo objetiva investigar os efeitos da

    suplementao com leo de fgado de tubaro associada ao exerccio fsico

    moderado sobre a resposta imunitria de ratos treinados.

    1.6.2OBJETIVOS ESPECFICOS

    Mensurar parmetro sangneo indicador de exerccio de

    intensidade moderada, no caso a concentrao srica de lactato.

    Medir a taxa de proliferao de linfcitos obtidos do bao, timo e

    linfonodos mesentrico atravs da incorporao de timidina radiomarcada em DNA.

    Verificar a capacidade de adeso, atividade fagoctica, volume

    lisossomal, nion superxido e de perxido de hidrognio em neutrfilos e

    macrfagos.

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    28/60

    30

    2. MTODOS

    2.1TIPO DE ESTUDO

    No presente estudo foi adotado delineamento de pesquisa

    experimental verdadeiro com grupos randomizados, divididos de acordo com o tipo

    de suplementao e realizao de treinamento fsico em: (a) sedentrio (controle);

    (b) sedentrio e suplementado com leo de fgado de tubaro; (c) treinado e nosuplementado; (d) treinado e suplementado com leo de fgado de tubaro. Esse

    delineamento de pesquisa proporciona o controle de diversas fontes de ameaa

    validade do estudo (THOMAS; NELSON; SILVERMAN, 2005).

    2.2ANIMAIS

    Todos os procedimentos envolvendo animais foram aprovados pelo

    comit de tica em experimentao animal (CEEA) do Setor de Cincias Biolgicas

    da UFPR. Para a realizao deste trabalho foram utilizados 80 ratos machos da

    linhagem Wistar, provenientes do biotrio central do Setor de Cincias Biolgicas da

    Universidade Federal do Paran, com idade de 60 dias e massa corporal

    aproximado de 200 / 250g. Os animais foram divididos em 4 grupos com 20indivduos:

    A Sedentrios (SED);

    B Sedentrios suplementados com leo de fgado de tubaro

    (SEDoft);

    C Exercitados (EX);

    D Exercitados e suplementados com leo de fgado de tubaro

    (EXoft);

    21

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    29/60

    31

    2.3PROTOCOLO DE TREINAMENTO

    Aps um perodo de adaptao ao meio lquido (30 minutos de natao por dia,

    durante dois dias, sem uso de sobrecarga), os animais foram submetidos a um

    programa de treinamento fsico. Este consistiu de sesses de 1 hora e 30 minutos

    de natao, quatro vezes por semana (Seg., Ter., Qui. e Sex.), divididos em 3 sries

    de 30 minutos com intervalo de 5 minutos entre cada srie, com sobrecarga de 6,0

    % do massa corporal (mximo peso considerado como carga aerbia, equivalente a

    70 % de VO2 mx.) (GOBATTO et al., 2001; ROMBALDI, 1996). Aps 3 semanas de

    treinamento, a sobrecarga foi aumentada para 6,5 % do peso corpreo do animal. Operodo total de treinamento, necessrio para produzir as adaptaes requeridas foi

    de 6 semanas (GOBATTO et al., 2001). Para a realizao do treinamento, foi

    utilizado tambm um sistema de natao composto por 10 tubos de PVC, com 250

    mm de dimetro e 60 cm de altura, interligados atravs de uma central de

    bombeamento e aquecimento de gua, comportando um animal por tubo. A

    temperatura da gua foi mantida em 30C - 32C, termicamente neutra para a

    temperatura corprea do rato (GOBATTO et al.,2001). Todos os animais receberamgua e rao vontade e foram submetidos a ciclo invertido claro/escuro

    (22:00/10:00hs) e mantidos em ambiente com temperatura controlada (23C 2C).

    2.4SOBRECARGAS DE CHUMBO

    Todos os ratos foram pesados 3 vezes por semana, sempre no

    mesmo horrio, em balana marca Marte modelo Urano. Bolinhas de chumbo foram

    utilizadas como sobrecarga, ajustadas semanalmente de acordo com a variao da

    massa corporal dos animais. A sobrecarga com chumbo foi armazenada em coletes

    e presos ao dorso do animal. As sobrecargas utilizadas foram de 6 % at a 3

    semana, passando a 6,5 % da massa corprea do animal at a 6 e ltima semana

    de treinamento (GOBATTO et al.,2001).

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    30/60

    32

    2.5SUPLEMENTAO

    A suplementao com leo de fgado de tubaro foi feita na dose de1 g/kg do peso corpreo do animal, utilizando-se pipeta de volume ajustvel, durante

    as 6 semanas de treinamento, 6 vezes por semana (Seg., Ter., Quart., Quint., Sext.,

    Sb.), sempre na parte na manh.

    2.6LACTATO SRICO

    O lactato srico dos animais foi mensurado uma vez por semana

    (sexta-feira) utilizando-se lactmetro (Accutrend lactate), imediatamente aps o

    trmino do treinamento. Para tanto, foi coletado uma gota de sangue (10 a 15 L) da

    extremidade da cauda dos ratos.

    2.7ORTOTANSIA DOS ANIMAIS

    Os ratos foram ortotanasiados utilizando-se uma guilhotina, dois dias

    aps o ltimo dia de treinamento. Foram retiradas amostras de sangue, bao, timo e

    linfonodos mesentrico de cada animal.

    2.8OBTENES DE MACRFAGOS E NEUTRFILOS

    Aps a ortotansia, a pele da regio abdominal foi removida e 10 mL

    de tampo fosfato-salina (PBS, pH 7,4) foram injetados na cavidade peritoneal dosanimais. Aps breve massagem na regio, a cavidade peritoneal foi aberta e o fluido

    23

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    31/60

    33

    contendo as clulas foi aspirado com o auxlio de pipeta esterilizada de plstico, tipo

    Pasteur. Em seguida, estas clulas foram centrifugadas (Eppendorf Centrifuge

    5810 R) a 1200 rpm, 4 C, durante 5 minutos. Os macrfagos ento, aps descarte

    do sobrenadante, foram ressuspensos em trs mL de PBS, para posterior anlise de

    parmetros imunitrios.

    Os neutrfilos foram isolados conforme mtodo proposto por Byum

    (1976). O sangue dos animas foi coletado em tubos tipo falcon contendo

    anticoagulante (EDTA) e mantido sob refrigerao. Posteriormente, o sangue foi

    centrifugado no prprio tubo a 1200 rpm a 4 C por min. O plasma foi separado e o

    restante do sangue, transferido para tubo tipo falcon de 50 ml, acrescentando-se o

    mesmo volume em PBS. Em tubos contendo 3 ml de Ficoll-Paque PLUS foi

    acrescentado 8 ml do sangue diludo em PBS. Os tubos foram centrifugados a 1400

    rpm a 18 C durante 40 min. A camada superior transparente composta por clulas

    mononucleares e plaquetas foi desprezada.

    A camada inferior constituda por hemcias e clulas

    polimorfonucleares foi transferida para outro tubo. Submeteu-se a amostra, duas

    vezes, a lise hipotnica por incubao com soluo hemoltica (Tris base (tris

    [hidroximetil] aminometano) 17,0 mM; NH4CL 18,7 mM) em banho-maria a 37 C por

    15 min. A soluo foi centrifugada a 1200 rpm por 10 min. O sobrenadante foi

    desprezado e as clulas, ressuspendidas em PBS e contadas em cmara de

    Neubauer (CURI et al., 1998).

    2.9SOLUES

    Os reagentes utilizados na preparao das solues foram obtidos da Reagen

    (Quimibrs Indstria Qumica Ltda, RJ). Soluo de tampo fosfato salina pH 7,4, 10

    mM (PBS) foi utilizada como meio de diluio para os corantes. O fixador utilizado foi

    o Baker formol-clcio (formaldedo 4%, cloreto de sdio 2% e acetato de clcio 1%).

    A soluo de extrao consiste de cido actico glacial 1% e etanol 50% em gua

    destilada. A soluo estoque do corante vermelho neutro (Sigma) foi preparada pela

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    32/60

    34

    dissoluo de 20 mg de corante em 1 mL de DMSO (dimetil sulfxido Sigma) e a

    soluo para uso de rotina foi preparada pela diluio de 20 L da soluo estoque

    em 5 mL de PBS. A soluo de vermelho fenol (Sigma) para os ensaios de produo

    de H2O2 consiste de 5,5 mM de dextrose, 0,56 mM de vermelho fenol e 8,5 U/mL

    peroxidase horseradish (Sigma) em PBS pH 7,4 a 340 mOsm, onde foi

    previamente adicionado 0,05% de zimosan (2,3 x 108partculas/mL - Sigma), para

    os ensaios de fagocitose, obtendo-se uma soluo diluindo-se 40 mg de zimosan em

    6 mL de PBS e adicionou-se 600 L de vermelho neutro.

    2.10PRODUO DE PERXIDO DE HIDROGNIO

    A produo de perxido de hidrognio foi mensurada utilizando-se o

    mtodo descrito por Pick & Mizel (1981), modificado. Atravs da oxidao de

    vermelho fenol possvel detectar a produo de H2O

    2. Alquotas de 100 l de

    soluo de macrfagos e 10 l de ster de forbol miristato acetato (PMA 20 mM)

    foram colocadas em placas de ELISA. Aps 1 hora de incubao no escuro (para

    prevenir a foto-oxidao), o sobrenadante foi descartado por inverso da placa e os

    pocinhos receberam 100 l da soluo de vermelho fenol contendo peroxidase

    (horseradish) e zimosan. Em seguida os macrfagos e neutrfilos foram incubados

    por mais 30 minutos e aps o trmino deste tempo a leitura foi feita no comprimento

    de onda de 620 nm em espectrofotmetro (Microplate reader Bio-rad - Benchmark).

    Os resultados foram determinados a partir de uma curva padro e expressos em

    absorbncia/106clulas.

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    33/60

    35

    2.11MENSURAO DO NION SUPERXIDO

    A gerao de nion superxido foi determinada atravs da reduo

    de nitroblue tetrazolium (NBT Sigma), composto amarelo lipossolvel que se

    torna insolvel e de cor azul no seu estado reduzido (MADHAVI et al., 1994). Os

    macrfagos (450 l) foram incubados por 1 hora com 0,1% de NBT e 30 l de PMA

    (80 mM) em PBS a 37 C. Esta reao ser interrompida pela adio de um volume

    igual de cido actico glacial. Esta mistura foi centrifugada rapidamente (30

    segundos a 10.000 rpm) e o NBT reduzido, presente no sedimento foi solubilizado

    em 0,9 mL de cido actico a 50% e sonicado (1 pulso de 30). Os restos celulares

    foram sedimentados e a absorbncia do sobrenadante determinada a 550 nm em

    espectrofotmetro (Ultrospec 2000). Os dados sero expressos em

    absorbncia/106clulas.

    2.12ATIVIDADE FAGOCTICA

    Foi utilizado o mtodo descrito por Pipe et al. (1995). Foram

    depositados 100 L da soluo de macrfagos e neutrfilos obtidos como descrito

    acima, em placa do tipo ELISA e adicionado 10 L de zimosan (2,3 x 10 8

    partculas/mL) corado com vermelho neutro e incubado por 30 minutos. Aps este

    procedimento, foram adicionados 100 L de fixador para interromper o processo defagocitose e 30 minutos depois, a placa foi lavada com PBS e em seguida,

    centrifugada, por 5 minutos a 1.500 rpm, a fim de remover o zimosan e o vermelho

    neutro no fagocitados pelos macrfagos. O vermelho neutro no interior dos

    fagcitos foi solubilizado utilizando-se 100 L de soluo de extrao. Aps 30

    minutos, foi feita a leitura das placas, a 550 nm utilizando espectrofotmetro

    (Microplate reader Bio-rad - Benchmark). Os dados foram expressos em

    absorbncia/106

    clulas.

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    34/60

    36

    2.13VOLUME LISOSSOMAL

    Para esta anlise, foi utilizado o mtodo descrito por Pipe et al.(1995), onde em placa do tipo ELISA foi depositado 100 L da soluo de

    macrfagos e neutrfilos adicionado 20 L de vermelho neutro a 2%. Aps 30

    minutos, a placa foi centrifugada por 5 minutos a 1.500 rpm. O sobrenadante foi

    descartado e os pocinhos lavados com PBS, para eliminar o vermelho neutro que

    no foi internalizado pelas clulas. Foram adicionados 100 l de soluo de extrao

    para solubilizar o vermelho neutro que estava dentro dos lisossomos. Esta

    solubilizao possvel porque o vermelho neutro um corante catinico que se

    difunde atravs da membrana celular e, uma vez presente no lisossomo, fica

    aprisionado devido mudana de cargas causada pelo pH cido do sistema

    lisossomal. Finalmente, aps 30 minutos, a placa foi lida a 550 nm utilizando

    espectrofotmetro (Microplate reader Bio-rad - Benchmark). Os dados foram

    expressos em absorbncia/106clulas.

    2.14OBTENES DE LINFCITOS E PROLIFERAO LINFOCITARIA

    Os rgos linfides bao, timo e linfonodos mesentricos foram

    mantidos em PBS com antibiticos (penicilina 10.000 e estreptomicina 10mg/L)

    (PBS+AB), e macerados com auxilio de embolo de seringa e peneira de malha fina,

    em placa de petri. O contedo macerado foi filtrado em papel filtro Whatman e

    centrifugado (1.200 rpm ou 400 G, 4 graus C) por duas vezes durante 10 minutos.

    Uma alquota de clulas foi diluda 1:100 em salina e 100 l desta foi misturado ao

    mesmo volume de azul de tripan para contagem da viabilidade celular em cmara de

    Neubauer.

    Os linfcitos foram cultivados em placas de 96 escavaes, 180 l

    de soluo de clulas contendo 2105clulas/ escavao, a 37 C em atmosfera de

    95% ar/ 0,5% CO2 por 48 h, estimuladas ou no com 20 l/ escavao do mitgeno

    concanavalina A (Con-A-5 g/mL) ou LPS. Vinte microlitros/escavao de soluo

    contendo (2-14 C)-timidina em meio de cultura (50mCi/mmol) foram adicionados por

    um perodo adicional de 18h, sob as mesmas condies descritas anteriormente.

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    35/60

    37

    Aps este perodo as clulas foram coletadas automaticamente em coletor mltiplo

    (Skatron Combi Multiple Cell Harvester, UK) em papeis de filtro especficos para

    coleta (COX Scientific- England). Os discos de papel contendo a radioatividade

    incorporada no DNA foram levados para contagem em cintilador Beckman LS 6500.

    2.15ANLISE ESTATSTICA

    Os dados esto apresentados como mdia erro padro da mdia e

    foram submetidos anlise de varincia de duas vias, tendo como fatores, oexerccio e dieta, seguido de ps-teste de Bonferroni, com nvel de significncia para

    p < 0,05.

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    36/60

    38

    3. RESULTADOS

    3.1 PESO CORPORAL

    No houve diferena na massa inicial entre os quatro grupos (Figura

    06). No entanto, aps seis semanas de treinamento, o peso corporal foi

    significantemente menor nos ratos que se exercitaram (334,9 8,2 e 353,6 8,2

    para os grupos EX e EXoft, respectivamente) quando comparado aos grupos

    sedentrios ( 379,7 12,8 e 383 6,3 gramas para os grupos SED e SEDoft,respectivamente) (p< 0.05).

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    37/60

    39

    Figura 06. Evoluo da massa corprea dos animas durante as 6 semanas de

    treinamento. A partir da semana 3 os animais sedentrios (SED e SEDslo) tiverammaior ganho de peso que ambos os exercitados (p

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    38/60

    40

    Tabela 02. Fagocitose, volume lisossomal e produo de nion superxido e

    perxido de hidrognio por macrfagos peritoneais obtidos de ratos sedentrios

    (SED), sedentrios suplementados (SEDoft), exercitados (EX) e exercitados

    suplementados (EXoft).

    Tabela 03. Fagocitose, volume lisossomal e produo de nion superxido e

    perxido de hidrognio por neutrfilos sanguneos obtidos de ratos sedentrios

    (SED), sedentrios suplementados (SEDoft), exercitados (EX) e exercitados

    suplementados (EXoft).

    3.3PROLIFERAO DE LINFCITOS3.3.1 Proliferao de linfcitos associados ao intestino

    A resposta proliferativa de linfcitos associados ao intestino na

    ausncia e presena de mitgenos (Con-A ou LPS) esta apresentada na Figura 7.

    Na ausncia de estmulo, linfcitos obtidos de ratos sedentrios suplementados com

    OFT (SEDoft) apresentaram aumento significativo (P

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    39/60

    41

    comparada dos sedentrios (SED). No entanto, a associao entre exerccio fsico

    e suplementao com OFT (EXoft) no exerceu efeito aditivo sobre a proliferao

    basal de linfcitos quando comparada de ambos fatores isoladamente (P> 0.05 vs.

    SEDoft e EX). Na presena de Con-A, mitgeno para linfcito T, a proliferao de

    linfcitos associados ao intestino aumentou significativamente em 3,6, 2,1, 2,1 e 2,3

    vezes nos grupos SED, SEDoft, EX e EXoft, respectivamente, quando comparada

    ausncia de estimulo (P< 0.05). Sob estimulao com LPS, mitgeno para linfcito

    B, a resposta proliferativa de linfcitos associados ao intestino foi similar condio

    basal em todos os grupos, exceto no grupo SED, onde houve um aumento de 2,5

    vezes (P< 0.05)

    FIGURA 07. Proliferao linfocitria, em contagens por minuto (cpm) de linfcitos

    associados ao intestino dos 4 grupos experimentais (SED, SEDoft, EX e EXoft). (P 0,05). A estimulao com Con-A

    aumentou a proliferao de linfcitos do bao em 2,6, 3,1, 2,1 e 2,4 vezes nos

    grupos SED, SEDoft, EX e EXoft respectivamente, quando comparada proliferao

    basal (P< 0,05 vs. sem estmulo). Os linfcitos estimulados com Con-A do grupo

    sedentrio suplementados com leo de fgado de tubaro (SEDoft) tiveram a maiorproliferao quando comparada dos outros grupos (P< 0,05 ). Na presena de

    LPS, a proliferao de linfcitos B do bao aumentou em 2,5, 2,5 e 3,2 vezes nos

    grupos SEDoft, EX e EXoft respectivamente, (P< 0,05 vs. sem estmulo), mas no

    houve mudana no grupo SED (P> 0,05 vs. sem estmulo). Todos os grupos

    estimulados com LPS apresentaram uma maior proliferao linfocitria quando

    comparada do grupo SED (P< 0,05).

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    41/60

    43

    Figura 08. Proliferao em contagens por minuto (cpm) de linfcitos do bao dos 4

    grupos experimentais (SED, SEDoft, EX e EXoft) (P< 0.05) aps 48 h de incubao

    na presena de Con-A ou LPS. Os dados representam a mdia EPM 20, 20, 17 e

    19 animais dos grupos SED, SEDslo, EX e EXslo respectivamente.

    a- Diferena significativa (P

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    42/60

    44

    EXoft, aumentaram a resposta proliferativa em 1,8, 3,1, 3,3 e 3,2 vezes

    respectivamente, quando comparada com a resposta de proliferao basal (P< 0,05

    vs. sem estmulo). A proliferao de linfcitos do timo na presena de LPS foi menor

    no grupo sedentrio quando comparada dos outros grupos (P< 0,05).

    Figura 09. Proliferao em contagens por minuto (cpm) de linfcitos presentes no

    timo dos 4 grupos experimentais (SED, SEDoft, EX e EXoft). (P< 0,05) aps 48 h deincubao na presena de ConA ou LPS. Os dados representam a mdia EPM 20,

    20, 17 e 19 animais dos grupos SED, SEDslo, EX e EXslo respectivamente.

    a- Diferena significativa (P

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    43/60

    45

    4. DISCUSSO

    O exerccio fsico pode induzir tanto ao ganho ou perda de massa

    corporal. Esta caracterstica depende da intensidade, durao e principalmente do

    tipo de exerccio. Os resultados aqui apresentados demonstraram que aps 6

    semanas de exerccio, ambos os grupos (SED, SEDoft, EX e EXoft) aumentaram a

    massa corprea, porm menor que o verificado nos grupos sedentrios. Ns

    sugerimos que este pequeno aumento de peso (~10%) nos ratos exercitados

    poderia ser atribudo ao seu grande dispndio energtico dirio. Alm disso, a

    incluso de leo na dieta, como o leo de fgado de tubaro, no induziu a umganho de peso corporal como efeito colateral, o qual poderia ser uma preocupao

    entre os atletas.

    Foi tambm bem documentado que a dieta com gordura e com

    cidos graxos induz a alteraes em muitos componentes do sistema imunitrio

    (PIZZATO et al., 2006; CALDER 2001; 2002; MEKSAWAN et al., 2004; HILL et al.,

    2008). Especificamente, a suplementao crnica com OFT, o qual representa uma

    rica fonte de alquilgliceris, tm sido ligada a uma melhora na funo imunitria,incluindo aumento na resposta de macrfagos (BERDEL, 1987), neutrfilos

    (PALMBLAD et al., 1990) e linfcitos (HOMMA; NIEMAN, 1994). De um modo

    similar, muitos estudos tm indicado que o treinamento tambm melhora a funo

    imunolgica (NIEMAN, 1994; 1997; PEDERSEN, 2000; BACURAU et al., 2007;

    LEANDRO et al., 2007; LEVADA-PIRES et al., 2007). Entretanto, nenhum estudo foi

    realizado para se avaliar o efeito da combinao ou associao da suplementao

    de OFT e do treinamento sobre a funo imunitria. Portanto, o objetivo do presenteestudo foi investigar o efeito da suplementao crnica com OFT sobre as respostas

    imunitrias de ratos treinados.

    Os macrfagos exercem um papel crtico como primeira linha de

    defesa do hospedeiro contra invasores microbianos pela sua capacidade fagoctica,

    citotxica e de exterminar o agente invasor (SUGIRA, 2001; ADAMS; HAMILTON,

    1984). Alm disso, os macrfagos so importantes tambm por atuarem como

    clulas apresentadoras de antgenos (MOURA et al., 2002). Os neutrfilos

    constituem a primeira barreira de defesa contra infeco devido habilidade dessas

    clulas em migrar rapidamente para o local de infeco (LEVADA-PIRES et al.,

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    44/60

    46

    2007). Embora estudos anteriores tenham reportado que a estimulao direta por

    OFT ou estimulao indireta por alquilgliceris poderiam tambm modificar a

    funcionalidade de neutrfilos (PALMBLAND et al., 1990, LEWKOWICZ et al., 2005),

    nossos resultados mostram que a suplementao crnica com OFT no foi capaz de

    alterar a capacidade fagoctica, volume lisossomal e produo de nion superxido e

    perxido de hidrognio por macrfagos peritoneais e neutrfilos sanguneos de ratos

    treinados e sedentrios (Tabelas 01 e 02). Estes resultados no so corroborados

    por outros estudos que demonstraram melhora na funcionalidade de macrfagos

    aps estimulao por alquilglicerol, um componente ter lipdeo encontrado no OFT

    (HOMMA; YAMAMOTO, 1990; YAMAMOTO; NGWENYA, 1987, YAMAMOTO et al.,

    1988). Ns acreditamos que esses achados diferentes possam ser explicados pelosdiferentes tipos de abordagem utilizados. Yamamoto et al. (1988) investigou in vitro

    as atividades de macrfagos peritoneais residentes. Nosso estudo, por outro lado,

    investigou a atividade ex vivo dessas clulas imunitrias. Portanto, abordagens in

    vitroe ex vivopoderiam ser a razo por estas diferenas observadas.

    Os linfcitos constituem os componentes primrios da resposta

    imunolgica adaptativa, sendo composto pelos linfcitos B e T (PALMBLAD et al.,

    1990). A determinao da resposta proliferativa de linfcitos sob estimulao comvrios mitgenos in vitro um ensaio bem estabelecido para examinar a capacidade

    funcional de linfcitos B e T (NIEMAN, 1994). Ns investigamos a proliferao de

    linfcitos obtidos de rgos linfides secundrios (timo, bao e linfonodo) com o

    propsito de verificar se a resposta imunolgica adaptativa poderia ser modulada

    pelo treinamento e/ou possivelmente pela suplementao em um diferente modelo

    (HOFFMAN-GOETZ et al., 1989; FERRY et al., 1991). Primeiro, ns demonstramos

    que a proliferao basal de linfcitos foi aumentada pela suplementao e peloexerccio fsico, o qual fascinante. Posteriormente, quando um mitgeno

    estimulador foi adicionado ao meio de cultura, as clulas se proliferaram ainda mais.

    Entretanto, a proliferao de linfcitos associados ao intestino foi similar entre os

    grupos experimentais, sendo que no bao e timo a proliferao linfocitria foi

    significativamente diferente entre os 4 grupos experimentais. Portanto, os linfcitos

    obtidos de diferentes regies possivelmente contribuem para os resultados

    controversos em relao ao treinamento e funcionalidade de linfcitos (KWAK, 2006;

    SANTOS et al., 2007; THARP; PREUSS, 1991; HOFFMAN-GOETZ et al., 1989;

    FERRY et al., 1991; PEIJIE et al., 2003). Esses achados e suas diferenas nos

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    45/60

    47

    levam ao seguinte questionamento: pode-se utilizar clulas de um determinado

    rgo linfide e projetar sua resposta como sendo de todo o sistema imunitrio?

    Nossa resposta de que no. Assim, ns acreditamos que estudos buscando

    informaes sobre a funcionalidade do sistema imunitrio utilizando clulas de

    diferentes rgos linfides devem ser cuidadosamente interpretados, reforando a

    idia de que o comportamento funcional de linfcitos obtidos de um rgo linfide

    em particular no deve ser tomado como padro para todas as diferentes

    populaes linfocitrias.

    Em concordncia com prvios estudos (HOMMA; YAMAMOTO,

    1990; PEDERSEN; TOFT, 2000; THARP; PREUSS, 1991; PEIJIE et al., 2003;

    PEDRONO et al., 2004) nossos resultados demonstraram que a suplementao comOFT e o treinamento moderado, aumentaram a proliferao de linfcitos do timo e

    bao de ratos, exceto nos linfcitos associados ao intestino. No entanto, nenhum

    efeito sinergista da combinao entre suplementao de OFT e treinamento

    moderado sobre a resposta proliferativa de linfcitos foi verificado. Isto sugere que

    ambos os tratamentos (exerccio e suplementao com OFT) poderiam

    compartilhar a mesma via de sinalizao celular para a ativao da proliferao

    linfocitria. Estudos posteriores deveriam ser realizados a fim de testar estahiptese.

    Sabe-se, at o momento, que os alquilgliceris exercem influncia

    sobre a atividade da quinase protica C (PK-C) (HEYMANS et al., 1987; ROBINSON

    et al., 1995), enzima envolvida no controle da proliferao e diferenciao celular

    (PUGLIESE et al., 1998). A quinase protica C encontra-se amplamente distribuda

    entre os rgos e tecidos, sendo encontrada inclusive em altas concentraes no

    crebro (NISHIZUKA, 1984). A ativao da PK-C bioquimicamente dependente efisiologicamente independente de Ca+, sendo esta normalmente uma protena

    citoslica solvel inativa. Atravs da ao de ons Ca+, a PK-C liga-se a uma

    poro da membrana plasmtica onde ativada pelo 1,2 diacilglicerol (DARNELL et

    al., 1990). Tambm, de acordo com Heymans et al,(1987) estruturas anlogas ao

    diacilglicerol, possuindo ligao ter na posio 1 do glicerol, no so

    funcionalmente eficientes para a ativao da PK-C, enquanto que as mesmas

    estruturas, no entanto com ligao ter na posio 2 do glicerol e ligao ster na

    posio 1, permitem a ativao da PK-C. O diacilglicerol, sendo um importante

    ativador fisiolgico da PK-C, encontra-se elevado durante a proliferao celular,

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    46/60

    48

    quando comparado a clulas quiescentes (WHATLEY et al., 1993; BANFIC et al.,

    1993), sugerindo que este composto contribui para a regulao da atividade basal

    da PK-C durante alteraes no crescimento celular (WARNE et al., 1995).

    A ativao de linfcitos T um evento essencial da resposta

    imunolgica, onde numerosos fatores de transcrio so estimulados resultando na

    expresso gnica de IL-2 e outras citocinas. De fato, uma potencializada transcrio

    gnica mediada por segundos mensageiros como o clcio, onde um aumento na

    sua concentrao livre no citossol est relacionado transcrio de diversos genes,

    engatilhando desta forma um sinal responsvel pela ativao de clulas T, sendo

    que a concentrao intracelular de Ca2+depende do influxo de Ca2+extracelular e de

    sua liberao dos estoques intracelulares (PEDRONO et al., 2004). De acordo comeste mecanismo, o Ca2+ seria primeiramente liberado do meio intracelular aps a

    ativao de receptor de antgeno, principalmente do retculo endoplasmtico, sendo

    ento liberado para o meio extracelular (PUTNEY, 1990). Pedrono et al, (2004) ao

    utilizar clulas T Jukart de humanos (linhagem linfocitria leucmica) verificou que

    os alquilgliceris poderiam potencializar o influxo de clcio atravs, em parte, da

    abertura de canais de Ca2+ voltagem-dependentes, atravs de uma alta e rpida

    despolarizao na membrana plasmtica dessas clulas.Tomados juntos, esses estudos demonstram o envolvimento dos

    alquilgliceris em via de sinalizao intracelular, alm disso, considerando que estes

    compostos ocorram naturalmente nas clulas, esses resultados apontam ainda para

    um potencial papel regulador observado nesses compostos.

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    47/60

    49

    5. CONCLUSO

    O principal achado deste estudo foi que a suplementao com OFT,

    o exerccio fsico e sua associao no causaram efeito sobre a resposta

    imunolgica inata, mas aumentou significativamente a proliferao de linfcitos

    (resposta imunolgica adaptativa).

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    48/60

    50

    REFERNCIAS

    ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; POBER, J. S. Imunologia celular e molecular.

    Editora Revinter. Quarta edio, 2003.

    ADAMS, D. O.; HAMILTON, T. A. The cell biology of macrophage activation. AnnualReview of Immunololy, v. 2, p. 283-318.

    ANDO, K.; KODAMA, K.; KATO, A.; TAMURA, G.; ARIMA, K. Antitumor activity ofglyceryl ethers. Cancer Research, v. 321, p. 125-129, 1972.

    ARMSTRONG, R. B. Initial events in exercise-induce muscular injury. Medicine andScience in Sports and Exercise, v. 22, p. 429-435, 1990.

    AKIMOTO, T.; FURUDATE, M.; SAITOH, M.; SUGIURA, K.; WAKU, T.; AKAMA, T.;KONO, I. Increased plasma concentrations of intercellular adhesion molecule-1 afterstrenuous exercise associated with muscle damage. European Journal of AppliedPhysiology, v. 86, p. 185-190, 2002.

    BACURAU, A. V., BELMONTE, M. A., NAVARRO, F., MORAES, M. R., PONTES, L.F. Jr., PESQUERO, J. L., ARAJO, R. C., BACURAU, R. F. Efeitos de umtreinamento de alta intensidade sobre a funo e metabolismo de macrfagos elinfcitos de ratos portadores de tumor de Walker 256. Experimental Biology andMedicine, v. 232, p.1289-1299, 2007.

    BAGBY, G. J.; CROUCH, L. D.; SHEPHERD, R. E. Exercise and cytokines:spontaneous and elicited responses. In: HOFFMAN-GOETZ, L. Exercise andimmune function, Boca Raton: CRC Press, p. 55-77, 1996.

    BANFIC, H.; ZIZAK, M.; DIVECHA, N.; IRVINE, R. F. Nuclear diacylglycerol isincreased during cell proliferation in vivo. The Biochemical journal, v. 290, p. 633-

    636, 1993.BAUM, M.; LIESES, H.; ENNEPER, J. Leukocytes, lymphocytes, activationparameters and cell adhesion molecules in middle-distence runners under differenttraining conditions. International Journal of Sports Medicine, v. 15, p. 122-126,1994.

    BERGUER, R.; BRAVO, N.; BOWYER, , M.; EGAN, C.; KNOLMAYER, T.; FERRICK,D. Major surgery suppresses maximal production of helper T-cell type 1 cytokineswithout potentiating the release of helper T-cell type 2 cytokines. Archives of

    Surgery, v. 134, p. 540-5444, 1999.

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    49/60

    51

    BLERGSTROM, S.; BLOMSTRAND, R. The intestinal absorption and metabolism ofchimyl alcohol in the rat. Acta Physiologica Scandinavica, v. 38, p. 166, 1956.

    BLANK, M.L.; CRESS, E.A.; SMITH, Z.L.; SNYDER, F. Dietary supplementation withether-linked lipids and tissue lipid composition. Lipids, v. 26, p. 166-169, 1991.

    BLOTTA, M. H.; DEKRUYIFF, R. H.; UMETSU, D. T. Corticosteroids inhibit IL-12production in human monocytes and enhance their capacity to induce IL-4 synthesisin CD+4 lymphocytes. Journal of Immunology, v. 158, p. 5589-5595, 1997.

    BORDIER, C. G.; SELLIER, N.; FOUCAULT, A. P. ; LE GOFFIC, F. Purification and

    characterization of deep sea shark Centrophorus squamosusliver oil 1-O-alkylglycerol ether lipids. Lipids, v. 31,p. 521-529, 1996.

    BYUM, A. Isolation of lymphocytes, granulocytes and macrophages. ScandinavianJournal Immunology, v. 5, p. 9-15, 1976.

    BROHULT, A. Alkoxyglycerol-esters in irradiation treatment. Nature, v. 193, n. 4822,1962.

    BROHULT, A.; BROHULT, J.; BROHULT, S. Effect of irradiation and alkoxyglyceroltreatment on the formation of antibodies after Salmonella vaccination. Experientia,v.28, p. 954-959, 1972.

    BROHULT, A.; BROHULT, J.; BROHULT, S.; JOELSON, I. Effect of alkoxyglycerolson the frequency of injuries following radiation therapy for carcinoma of the uterinecervix. Acta Obstetricia et Gynecologica Scandinavica,v. 56, p. 441-448, 1977.

    BROHULT, A.; BROHULT, J.; BROHULT, S.; JOELSSON, I. Reduced mortality incancer patients after administration of alkylglycerols. Acta Obstetricia etGynecologica Scandinavica,v. 65, p. 779-785, 1986.

    BUTTERFIELD, T. A.; BEST, T. M.; MERRICK, M. A. The dual roles of neutrophilsand macrophages in inflammation: a critical balance between tissue damage andrepair. Journal of Athletic Training, v. 41, p. 457-465, 2006.

    CALDER, P.C. N-3 fatty acids, inflammation and immunity: pouring oil on troubled

    waters or another fishy tale? Nutrition Research, v. 21, p. 309-341, 2001.

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    50/60

    52

    CARBALLERA, N. M. New advances in the chemistry of methoxylated lipids.Progress in Lipid Research, v. 41, p. 437-456, 2002.

    CANNON, J. G.; ORENCOLE, S. F.; FIELDING, R. A.; MEVDANI, M.; MEVDANI, S.N.; FIATARONE, M. A.; BLOMBERG, J. B.; EVANS, W. J. Acute phase response inexercise: interaction of age and vitamin E on neutrophils and muscle enzymerelease. American Journal of Physiology, v. 259, p. R1214-R1219, 1990.

    CANNON, J. G.; ST PIERRE, B. A. Cytokines in exertion-induced skeletal muscleinjury. Molecular and Cellular Biochemistry, v. 179, p. 159-167, 1998.

    CASTELL, L.M. Can glutamine modify the apparent immunodepression observed

    after prolonged, exhaustive exercise? Nutrition, v. 18, p. 371-375, 2002.

    CHEMINADE, C.; GAUTIER, V.; HICHAMI, A.; ALLAUME, P.; LANNOU, D.;LEGRAND, B. A. 1-O-Alkylglycerols improve boar sperm motility and fertility. Biologyof reprodutuction, v.66, p.421-428, 2002.

    COHN, Z. A. The macrophage- Versatile element of inflammation. Harvey Lecture,v. 77, p. 63, 1982.

    CROFT, S. L.; NEAL, R. A.; PENDERGAST, W.; CHANT, J. H. The activity of alkylphosphorylcholines and related derivatives againstLeishmania donovani.Biochemichal Pharmacology, v. 36, p. 2633-2636, 1987.

    CURI, TC.; DE MELO, MP.; PALANCH, AC., MIYASAKA, AK., CURI., R. Percentageof phagocitosis, production of O2-, H2O2 and NO, and antioxidant enzyme activitiesof rat neutrophils in culture. Cell Biochemistry in Function, v.16, p. 43-49, 1998.

    DARNELL, J.; LODISH, H.; BALTIMORE, D. Molecular cell biology. W H FreemanCompany, New York, p. 742, 1990.

    DAVENPORT, S.; DEPREZ, P. Market opportunities for shark liver oil. AustralianFish, v. 48, p. 8-10, 1989.

    DETMERS, P. A.; LO, S. K.; OLSEN-EGBERG, E.; WALZ, A.; BAGGIOLINI, M.;COHN, Z. A. Neutrophil-activating protein 1/interleukin 8 stimulates the bindingactivity of the leukocyte adhesion receptor CD11b/CD18 on human neutrophils. TheJournal of Experimental Medicine, v. 171, p. 1155-1162, 1990.

    DINARELLO, C. A. Interleukin-1. In: THOMSON, A. W. The cytokine handbook.London: Academic Press, p. 31-56, 1994.

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    51/60

    53

    EKBLOM, B.; EKBLOM, O.; MALM, C. Infectious episodes before and after themarathon race. Scandinavian Journal of Medicine and Science in Sports, v. 16,p. 287-293, 2006.

    FITZGERALD, L. Exercise and the immune system. Immunology Today, v. 9, p.337-339, 1988.

    FORD, D. A.; MIYAKE, R.; GLASSER, P. E.; GROSS, R. W. Activation of proteinkinase C by naturally occurring ether-linked diglycerides. Journal of BiologicalChemistry, v. 264, p. 13818-13824, 1989.

    GLEESON, M. Mucosal immune responses and risk of respiratory illness in elite

    athletes. Exercise Immunology Review, v. 6, p. 5-42, 2000.

    GLEESON, M. immune function in sport and exercise. Journal Applied Physiology,v.103, p.693-699, 2007.

    GOBATTO, C. A.; MELLO, M. A. R.; SIBUYA, C. Y.; AZEVEDO, J. R. M.; SANTOS,L. L.; KOKUBUN, E. Maximal lactate steady state in rats submitted to swimmingexercise.Comparative Biochemistry and Physiology, v. 130, p. 21-27, 2001.

    GOBATTO, C. A.; SIBUYA, C. Y.; AZEVEDO, J. R. M.; LUCIANI, E.; KOKUBUN, E.;MELLO, M. A. R. Caracterizao da intensidade de exerccio e do efeito detreinamento fsico no modelo de natao de ratos wistar.Motriz, v.7, p.57-62, 2001.

    GRIMBLE, R.F. Dietary lipids and the inflammatory response. Proceedings of theNutrition Society, v. 57, p. 535-542, 1998.

    GURR, M. Polyunsaturated fatty acids of the n-3 family: influence on inflammatory

    disease. Lipid Technology, v. 5, p. 65-68, 1993.

    HADVARY, P.; BAUMGARTNER, H. R. Activation of human and rabbit bloodplatelets by synthetic structural analogs of platelet activating factor. ThrombosisResearch, v. 30, p. 143-156, 1983.

    HANAHAN, D. J.; MUNDER, P. G.; SATUOCHI, K.; McMANUS, L.; PINCKARD, R.N. Potent platelet stimulating activity of enantiomers of acetyl glyceril etherphosphorylcholine and its methoxy analogues. Biochemichal and Biophysical

    Research Community, v. 1, p. 183-188, 1981.

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    52/60

    54

    HALLGREN, B. Therapeutic effects of ether lipids. Ether Lipids, New York:Academic Press, 1983.

    HALLGREN, B.; LARSSON, S. The glycerol ethers in the liver oils of elasmobranchfish. Journal of Lipid Research, v. 3, p. 31-38, 1962.

    HALLGREN, B.; NIKLASSON, A.; STALLBERG, G.; THORIN, H. On the occurrenceof 1-O-alkyglycerols and 1-O-(2-methoxyalkyl) glycerols in human colostrum, Humanmilk, cows milk, sheeps milk, human red bone marrow, red cells, blood plasma anda uterine carcinoma. Acta Chemicha Scandinavica, v. 28, p. 1029-1034, 1974.

    HALLGREN, B.; STALLBERG, G.; BOERYD, B. Occurrence synthesis and biologicaleffects of substituted glycerol ethers. Progress in the Chemistry of Fats and Other

    Lipids, v. 16, p. 45-58, 1978.

    HEATH, G. W.; FORD, E. S.; CRAVEN, T. E.; MACERA, C. A.; JACKSON, K. L.;PATE, R. R. Exercise and the incidence of upper respitatory tract infections.Medicine Science in Sports Exercise, v.23, p.152-157, 1991.

    HERMMANN, B. J.; NEUMMAN, H. A. Cytotoxic ether phospholipids. Journal ofBiological Chemistry, v. 261, p. 7724-7727, 1986.

    HEYMANS, F.; DA SILVA, C.; MARREC, N.; GODFROID, J. J.; CASTAGNA, M.Alkyl analogs of diacylglycerol as activators of protein kinase. FEBS Letters, v. 218,p.35-40, 1987.

    HOFFMAN, D. R.; UAUY, R. Essentiality of dietary omega-3 fatty acids for prematureinfants: plasma and red blood cells fatty acid composition. Lipids, v. 27, p. 886-894,1992.

    HOMMA, S.; YAMAMOTO, N. Activation process of macrophages after in vitrotreatment of mouse lymphocytes with dodecylglycerol. Clinical and ExperimentalImmunology,v. 79, p. 307-313, 1990.

    JILMA, B.; EICHLER, H. G.; STOHLAWETZ, P.; DIRNBERGER, E.; KAPIOTIS, S.;WAGNER, O. F.; SCHULTZ, W.; KREJCY, K. Effects of exercise on circulatingvascular adhesion molecules in healthy men. Immunobiology,v. 197, p. 505-512,1997.

    KAPLANSKI, G.; FARNARIER, C.; KAPLANSKI, S.; PORAT, R.; SHAPIRO, L.;BONGRAND, P.; DINARELLO, C. A. Interleukin-1 induces interleukin-8 secretionfrom endothelial cells by a juxtacrine mechanism. Blood, v. 84, p. 4242-4248, 1994.

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    53/60

    55

    KELLEY, D. S. Modulation of human immune and inflammatory responses by dietaryfatty acids. Nutrition, v. 17, 669-673, 2001.

    KROTKIEWSKI, M.; PRZYBYSZEWSKA, M.; JANIK, P. Cytostatic and cytotoxiceffects of alkylglycerols (Ecomer). Medical Science Monitor, v. 9, p. 131-135, 2003.

    KWAK, Y. S. Effects of training on spleen and peritoneal exudates reactive axygenspecies and lymphocyte proliferation by splenocytes at rest and after an acute boutof exercise. Journal of Sports Sciences, v.24, p.973-978, 2006.

    LEANDRO, C. G.; de LIMA, T. M.; ALBA-LOUREIRO, T. C.; do NASCIMENTO, E.;

    MANHAES de CASTRO, R.; de CASTRO, C. M.; PHITON-CURI, T. C.; CURI, R.Stress-induced downregulation of macrophage phagocytic function is attenuated byexercise training in rats. Neuroimmunomodulation, v. p. 4-7, 2007.

    LE BLANC K. ; SAMULSSON, J.; BROHULT, J. BERG, A. ; PALMBLAD, J. 1-O-Hexadecyl-2-metoxy-glycer-3-phophatidylcholine A methoxy ether lipid inhibitingplatelet activating factor-induced platelet aggregation and neutrophil oxidativemetabolism. Biochemichal Pharmacology, v. 49, p. 1577-1582, 1995.

    LEIGHTON, B.; COOPER, G. L. S. Pancreatic amylin and calcitonin gene-relatedpeptide cause resistance to insulin in skeletal muscle in vitro. Nature,v. 335, p.632-635, 1989.

    LEVADA-PIRES, A. C.; LAMBERTUCCI, R. H.; MOHAMAD, M.; HIRABARA, S. M.;CURI, R.; PITHON-CURI, T. C. Exercise training raises expression of the cytosoliccomponents of NADPH oxidase in rat neutrophils. European Journal of Applied

    Physiology, v. 100, p.153-160, 2007.

    LIU, X.; SPOLARICS, Z. Methemoglobin is a potent activator of endothelial cells bystimulating IL-6 and IL-8 production and E-selectin membrane expression. AmericanJournal of Physiology,v. 285, p. 1036-1046, 2003.

    LARRABEE, R. C. Leucocytosis after violent exercise. Journal of MedicalResearch,v.7, p.76-82, 1902.

    MACKINNON, L. T. Chronic exercise training effects on immune function. Medicineand Science in Sports and Exercise, v. 32, p. S369-S376, 2000.

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    54/60

    56

    MADHAVI, N.; DAS, V.N. Effects of n-3 and n-6 fatty acids on the survival ofvineristine sensitive and resistant human cervical carcinoma cells, in vitro. CancerLett, v. 84, p. 31-41, 1994.

    MARBERG, CM.; WILES, HO. Granulocytopoietic fraction of yellow bone marrow.Archives of Internal Medicine, v. 61, p. 408, 1938.

    McINTYRE, D. L.; REID, W. D.; LYSTER, D. M.; McKENZIE, D. C. Different effects ofstrenuous eccentric exercise on the accumulation of neutrophills in muscle in womenand men. European Journal of Applied Physiology, v. 81, p. 47-53, 2000.

    McINTYRE, D. L.; REID, W. D.; McKENZIE, D. C. Delayed muscle soreness: the

    inflammatory response to muscle injury and its clinical implications. SportsMedicine,v. 20, p. 24-40, 1995.

    MACKINNON, L. T., HOOPER, S. L. Plasma glutamine and upper respiratory tractinfection during intensified training in swimmers. Medicine Science in SportsExercise, v .28, p.285-290, 1996.

    MALM, C.; NYBERG, P.; ENGSTROM, M. Immunological changes in human skeletalmuscle and blood after eccentric exercise and multiple biopsies. Journal ofPhysiology, v. 529, p. 243-262, 2000.

    MALM, C. Susceptibility to infections in elite athletes: the S-curve. ScandinavianJournal of Medicine & Science in Sports, v.16, p. 4-6, 2006.

    MATTHEWS, C.E; OCKENE, I. S.; FREEDSON, P. S.; ROSAL, M. C.; MERRIAN, P.A.; HEBERT, J. R. Moderate to vigorous physical activity and the risk of upper-respiratory tract infection. Medicine and Science in Sports Exercise. v. 34. p.1242-

    1248, 2002.

    MEKSAWAN, K.; VENKATRAMAN, J. T.; AWAD, A. B.; PENDERGAST, D. R. Effectof dietary fat intake and exercise on inflammatory mediators of the immune system insedentary men and women. Journal of the American College of Nutrition,v. 23, p.331-340, 2004.

    NATHAN, C. F. Mechanisms of macrophage antimicrobial activity. Trans RoyalSociety of Tropical Medicine and Hygiene,v. 77, p. 620-630, 1983.

    NAVARRO-GARCIA, G.; PACHECO-AGUILAR, R.; VALLEJO-CORDOVA, B.;RAMIREZ-SUAREZ, J. C.; BOLANOS, A. Lipid composition of the liver oil of shark

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    55/60

    57

    species from the Caribbean and Gulf of California water. Journal of FoodComposition and Analysis, v. 13. p. 791-798, 2000.

    NGWENYA, B. Z.; FOSTER, D. M. Enhancement of antibody production by

    lysophosphatidylcholine and alkylglycerol. Proc. Soc. Exp. Biol. Med., v. 196, p. 69-75, 1991.

    NIEMAN, D.; JOHANSSEN, L.M.; LEE, J.W. ARABATZIS, K. Infectious episodesbefore and after the Los Angeles marathon. The Journal of Sports Medicine andPhysical Fitness, v. 30, p. 289, 1990.

    NIEMAN, D. C. Exercise, infection and immunity. International Journal of SportsMedicine, v.30, p.131-141, 1994.

    NIEMAN, D. C.; MILLER, A. R.; HENSON, D. A.; WARREN, B. J.; GUSEWITCH, G.;JOHNSON, R. L.; DAVIS, J. M.; BUTTERWORTH, D. E.; HERRING, J. L.;NEHLSEN-CANNARELLA, S. L. Effect of high-versus moderate-intensity exercise onlymphocyte subpopulations and proliferative response. International Journal ofSports Medicine, v. 15, p. 199-206, 1994.

    NIEMAN, D. C. Immune response to heavy exertion. Journal of Applied

    Physiology,v. 82, p. 1385-1394, 1997.

    NIEMAN, D. C. Risck of upper respiratory tract infection in athletes: an epidemiologicand immunologic perspective. Journal of Athletic Training,v.32. p.344-349, 1997.

    NIEMAN, D. C. Is infection risk linked to exercise workload? Medicine and Sciencein Sports and Exercise,v.32, p.406-411, 2000.

    NISHIZUKA, Y. Turnover of inositiol phospholipids and signal transduction. Science,v. 225, p. 1365-1370, 1984.

    NGWENYA, B. Z.; FOSTER, D. M. Enhacement of antibody production byLysophosphatidylcholine and alkylglycerol. PSEBM, v. 196, p. 69-75, 1991.

    NGUYEN, H. X., TIDBALL, J. G. Interao entre neutrfilos e macrfagos promovemorte de macrfagos de clulas musculares de ratos in vitro. Journal ofPhysiology, v.547, p.125-132, 2003.

    NUNES, E. A.; BONATTO, S. J.; DE OLIVEIRA, H. H.; RIVERA, N. L.; MAIORKA, A.;KRABBE, E. L.; TANHOFFER, R.; FERNANDES, L. C. The effect of dietary

  • 7/24/2019 Dissertacao Daniele

    56/60

    58

    supplementation with 9-cis:12-trans and 10-trans:12-cis conjugated linoleic acid(CLA) for nine months on serum cholesterol, lymphocyte proliferation andpolymorphonuclear cells function in Beagle dogs. Research Veterinary Science,2007.

    OSTROWSKI, K.; ROHDE, T.; ASP, S.; SCHJERLING, P.; PEDERSEN, B. K. Proand anti-inflammatory cytokine balance in strenuous exercise in humans. Journal ofPhysiology, v. 515, p. 287-291, 1999.

    PABLO, M.A.; PUERTOLLANO, M.A.; CIENFUEGOS, G.A. Immune cell function,lipids and host natural resistance. FEMS Immunology and Medical Microbiology,v. 29, p. 323-328, 2000.

    PALMBLAD, J.; SAMUELSSON, J.; BROHULT, J. Interactions betweenalkylglycerols and human neutrophill granulocytes. Scandinavian Journal ofClinical and Laboratory Investigation,v. 50, p. 363-370, 1990.

    PEAK J. M. Exercise-induced alterations in neutrophil degranulation and respiratoryburst activity: possible mechanisms of action. Exercise Immunology Review,v. 8,p. 49-100, 2002.

    PEDERSEN, B. K.; TOFT, A. D. Effects of exercise on lymphocytes and cytokines.British Journal of Sports Medicine, v. 34, p. 246-251, 2000.

    PEDERSEN, B.