Dissertação de Juliana Chrís 17.12 - repositorio.ufrn.br · Catalogação da Publicação na...

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE TECNOLOGIA

DEPARTAMENTO DE ENGENHARIA QUÍMICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA QUÍMICA

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Estratégias de Obtenção do Corante do Jambo

Vermelho (Syzygium malaccense) e Avaliação de sua

Funcionalidade

Juliana Chrís Silva de Azevêdo

Orientadora: Profª. Drª. Ana Lúcia de Medeiros Lula da Mata

Co-orientadora: Profª. Drª. Márcia Maria Lima Duarte

Natal/RN

Dezembro/2010

Juliana Chrís Silva de Azevêdo

ESTRATÉGIAS DE OBTENÇÃO DO CORANTE DO

JAMBO VERMELHO (SYZYGIUM MALACCENSE) E

AVALIAÇÃO DE SUA FUNCIONALIDADE

Dissertação de mestrado apresentada ao Programa de

Pós-Graduação em Engenharia Química – PPGEQ, da

Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como

parte dos requisitos necessários para obtenção do

título de Mestre em Engenharia Química, sob a

orientação da Profª. Drª. Ana Lúcia de Medeiros Lula

da Mata e co-orientação da Profª. Drª. Márcia Maria

Lima Duarte.

Natal/RN

Dezembro/2010

Catalogação da Publicação na Fonte.

UFRN / CT / PPGEQ

Biblioteca Setorial “Professor Horácio Nicolas Solimo”.

Azevêdo, Juliana Chrís Silva de. Estratégias de obtenção do corante do jambo vermelho (Syzygium malaccense) e avaliação de sua funcionalidade / Juliana Chrís Silva de Azevêdo. - Natal, 2010. 101 f.: il.

Orientadora: Ana Lúcia de Medeiros Lula da Mata Co-orientadora: Márcia Maria Lima Duarte.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Tecnologia. Departamento de Engenharia Química. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química.

1. Jambo vermelho - Corante natural - Dissertação. 2. Avaliação funcional -

Dissertação. 3. Compostos fenólicos totais - Dissertação. 4. Antocianinas totais - Dissertação. 5. Inibição enzimática – Dissertação. I. Mata, Ana Lúcia de Medeiros Lula da. II. Duarte, Márcia Maria Lima. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título. RN/UF/BSEQ CDU 634.42(043.3)

AGRADECIMENTOS

À Deus, fonte de vida e sabedoria.

Às pessoas mais importantes da minha vida: meus pais, Iracema e José Joaquim, meus

irmãos, Edriano, Edriana, Júlio e Ricardo, e à minha sobrinha Amanda, pelo apoio

incondicional e por permitir que tudo isso fosse possível.

A todos os professores que muito contribuíram para a minha formação. Em especial,

às professoras Dra. Ana Lúcia de M. L. da Mata e Dra. Márcia M. L. Duarte, pela orientação

desta dissertação e por todos os ensinamentos transmitidos.

À professora Dra. Roberta T. P. Correia por todo o auxílio, paciência e principalmente

pela prontidão com que sempre me atendeu. Obrigada por me ensinar tantas coisas!

Às amigas Graciana e Kátia, pelos “ombros amigos”, incentivo e amizade. Adoro

vocês!

Aos colegas de laboratório de Tecnologia de Alimentos, em especial à Petrúcia, Chico,

Thayse, Adja, Rosane, Nathália e Ana Luiza, pela amizade, companheirismo e por todas as

sugestões para o desenvolvimento deste trabalho e pela valiosa atenção.

Aos funcionários da secretária do PPGEQ, Mazinha e Medeiros, pela assistência e

gentileza.

À banca examinadora, pelas correções e sugestões.

Por fim, agradeço ao CNPq pelo apoio financeiro deste projeto.

AZEVÊDO, Juliana Chrís Silva de – Estratégias de obtenção do corante do jambo vermelho

(Syzygium malaccense) e avaliação de sua funcionalidade. Dissertação de mestrado, UFRN,

Programa de Pós-graduação em Engenharia Química. Área de concentração: Pesquisa e

Desenvolvimento de Tecnologia Regional, Natal/RN Brasil.

Orientadora: Profª. Drª. Ana Lúcia de Medeiros Lula da Mata.

Co-orientadora: Profª. Drª. Márcia Maria Lima Duarte.

RESUMO – A indústria alimentícia demonstra forte interesse em estudos de extração

envolvendo produtos naturais. A antocianina é um fenólico antioxidante de grande

importância e atuação no organismo dos seres vivos. Vários estudos relacionam à ingestão de

frutas e vegetais com a diminuição do risco e desenvolvimento de doenças crônico-

degenerativas em função de suas propriedades antioxidantes. Este trabalho teve como objetivo

comparar diferentes estratégias de obtenção do corante da casca e do jambo inteiro sem

caroço e analisar seu potencial funcional. Duas diferentes estratégias foram estudadas: (1)

extração sólido-líquido em reator enjaquetado com controle de parâmetros; (2) obtenção do

pó. A investigação do potencial funcional foi realizada por meio de análises quanto ao teor de

compostos fenólicos totais (CFT), a atividade antioxidante (AA), a concentração de

antocianinas totais (AT) e a inibição das enzimas α-amilase e α-glicosidase. Os extratos com

os melhores resultados para a estratégia 1 foram para CFT de 174,15 mg GAE/100 g, para a

AA de 3,56 µmol Trolox eq/g e para AT de 133,59 mg ci-3-gli/100 g. Os melhores valores

para a estratégia 2 foram para CFT de 1024,22 mg GAE/100 g, para AA de 29,03 µmol

Trolox eq/g e para AT de 1193,41 mg ci-3-gli/100 g. A ação inibitória das enzimas α-amilase

(26,30%) e α-glicosidase (97,47%) mostraram-se potentes. Os extratos da casca apresentaram,

de maneira geral, resultados superiores quando comparados aos valores dos extratos do jambo

inteiro e as maiores quantificações foram obtidas dos produtos desidratados. As amostras

analisadas exibiram fontes satisfatórias de fenólicos antociânicos, com potente capacidade

antioxidante e atividade inibitória das enzimas α-amilase e α-glicosidase.

Palavras chave: extração, desidratação, fenólicos totais, antioxidante, antocianinas, inibição enzimática.

ABSTRACT

The food industry is interested in natural products. Anthocyanins are phenolic antioxidants of

great importance with health-relevant applications. Several studies have linked the intake of

fruits and vegetables with reduced risk of chronic degenerative diseases because of its

antioxidant properties. This study aimed to compare different strategies for obtaining natural

pigments from red jambo (Syzygium malaccence) and analyze its functional potential. Two

different strategies were studied: (1) solid-liquid extraction (SLE) in reactor with controlled

parameters, (2) powder obtention. The investigation of the functional potential was conducted

taking into account the total phenolic content (TPC), the antioxidant activity (AA), the total

anthocyanins concentration (TA) and α-amylase and α-glucosidase inhibition. The best

extracts obtained by SLE showed TPC of 174.15 mg GAE/100g, AA of 3.56 µmol Trolox

eq/g and TA of 133.59 mg cyd-3-glu/100 g. The best results for the second strategy were TPC

of 1024.22 mg GAE/100 g, AA of 29.03 µmol Trolox eq/g and TA of 1193.41 mg cyd-3-

glu/100 g. It was observed moderate amylase inhibition (26.30%) and high glucosidase

inhibitory activity (97.47%). Skin extracts showed, in general, superior results when

compared to whole red jambo, with superior values for dehydrated products. Based on our

result, red jambo can be considered as a rich source of phenolic antioxidants, as well on

amylase and glucosidase inhibitors.

Key words: extraction, dehydration, phenolic antioxidant, anthocyanins, enzyme inhibition.

SUMÁRIO

1- INTRODUÇÃO ................................................................................................. 2

2- OBJETIVOS ..................................................................................................... 5

2.1- GERAL: .............................................................................................................................5

2.2- ESPECÍFICOS: ....................................................................................................................5

3- REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ............................................................................ 7

3.1- O JAMBO VERMELHO (SYZYGIUM MALACCENSE).................................................................7

3.2- OS CORANTES ALIMENTÍCIOS............................................................................................8

3.2.1- Urucum .....................................................................................................................9

3.2.2- Carmim de cochonila................................................................................................9

3.2.3- Pimentão-vermelho.................................................................................................10

3.2.4- Curcumina...............................................................................................................10

3.2.5- Betalaínas ...............................................................................................................11

3.3- COMPOSTOS FENÓLICOS..................................................................................................12

3.3.1- Biossíntese dos compostos fenólicos.......................................................................12

3.3.2- Classificação dos compostos fenólicos...................................................................15

3.3.2.1- Flavonóides..........................................................................................................16

3.3.2.1.1- Antocianinas .....................................................................................................18

3.3.2.1.1.1- Fatores que determinam a estabilidade das antocianinas ............................19

3.3.3- Métodos de extração de fenólicos...........................................................................28

3.4- OXIDAÇÃO E RADICAIS LIVRES........................................................................................28

3.4.1- Atividade Antioxidante............................................................................................29

3.5- INIBIÇÃO DAS ENZIMAS Α-AMILASE E Α-GLICOSIDASE....................................................31

4- MATERIAIS E MÉTODOS ............................................................................. 36

4.1- MATERIAIS .....................................................................................................................36

4.1.1- Matéria-prima: .......................................................................................................36

4.2- METODOLOGIAS.............................................................................................................36

4.2.1- Estratégia 1: Obtenção do corante por extração sólido-líquido............................36

4.2.1.1- Análise estatística ................................................................................................39

4.2.1.1.1- Delineamento estatístico...................................................................................39

4.2.1.1.2- Análise de Superfície de Resposta ....................................................................41

4.2.1.1.3- Avaliação do modelo.........................................................................................42

4.2.2- Estratégia 2: Desidratação em secador leito de jorro ...........................................43

4.3- ANÁLISE FUNCIONAL DOS PRODUTOS OBTIDOS NAS DUAS ESTRATÉGIAS DE EXTRAÇÃO .

...................................................................................................................................46

4.3.1- Determinação do teor de Compostos Fenólicos Totais (CFT) ..........................46

4.3.2- Atividade antioxidante pelo seqüestro do radical DPPH •.................................47

4.3.3- Antocianinas totais: método do pH-diferencial .................................................49

4.3.4- Concentração do pigmento.................................................................................50

4.3.5- Inibição das enzimas α-amilase e α-glicosidase ................................................52

4.3.5.1- α-amilase..............................................................................................................52

4.3.5.2- α-glicosidase ........................................................................................................53

5- RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................................ 56

5.1- ESTRATÉGIA 1: ESTUDO DO EXTRATO DA CASCA E FRUTO INTEIRO DO JAMBO SEM

CAROÇO.................................................................................................................................56

5.1.1- Análise de Superfície de Resposta e Diagrama de Pareto .....................................60

5.1.1.1- Teor de Compostos Fenólicos Totais...................................................................60

5.1.1.2- Atividade antioxidante .........................................................................................63

5.1.1.3- Antocianinas totais ..............................................................................................67

5.1.1.4- Concentração de pigmentos.................................................................................70

5.1.1.5- Inibição das enzimas α-amilase e α-glicosidase..................................................72

5.2- ESTRATÉGIA 2: ESTUDO DO EXTRATO DA CASCA E FRUTO INTEIRO SEM CAROÇO

DESIDRATADOS......................................................................................................................75

5.3-COMPARAÇÃO ENTRE AS ESTRATÉGIAS 1 E 2...................................................................80

6- CONCLUSÕES............................................................................................... 84

7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 87

Índice de figuras

Figura 3. 1: Jambo vermelho. Fonte: Arquivo pessoal (2010). ..................................................7

Figura 3. 2: Biossíntese dos compostos fenólicos (Fonte: Taiz & Zeiger, 2004). ...................13

Figura 3. 3: Rota da fenilalanina. Adaptado de Taiz & Zeiger (2004).....................................14

Figura 3. 4: Características estruturais relacionadas à capacidade antioxidante. .....................17

Figura 3. 5: As estruturas das antocianidinas (a) e antocianinas (b) ........................................18

Figura 3. 6: Esquema da rota da antocianina pós-biossíntese. Adaptado de Zhang et al., 2004.

..................................................................................................................................................21

Figura 3. 7: Transições das estruturas das antocianinas em função do pH. .............................23

Figura 3. 8: Estrutura básica e sistema de numeração dos flavonóides (Bravo, 1998). ...........24

Figura 3. 9: Mecanismo de ação para os antioxidantes primários............................................29

Figura 4.1: Fluxograma da Estratégia 1....................................................................................37

Figura 4.2: Amostras preparadas para extração do corante. Fonte: Arquivo pessoal (2010)...38

Figura 4.3: Aparato experimental da extração sólido-líquido. Fonte: Arquivo pessoal (2010).

..................................................................................................................................................39

Figura 4.4: Fluxograma da Estratégia 2....................................................................................43

Figura 4.5: Leito de jorro. Fonte: Arquivo pessoal (2010).......................................................44

Figura 4.6: Amostras preparadas para extração. Fonte: Arquivo pessoal (2010).....................45

Figura 4.7: Extração seqüencial. Fonte: Arquivo pessoal (2010) ............................................46

Figura 4.8: Curva de calibração do ácido gálico utilizada para o cálculo da concentração de

fenólicos totais..........................................................................................................................47

Figura 4.9: Curva de calibração utilizada para o cálculo de atividade antioxidante pelo método

DPPH........................................................................................................................................48

Figura 4.10: Curva de calibração do corante vermelho-congo utilizada para o cálculo da

concentração de pigmentos.......................................................................................................50

Figura 4.11: Varredura de espectro para o jambo vermelho ....................................................51

Figura 4.12: Curva de calibração da maltose utilizada para o calculo do percentual de inibição

da enzima α-amilase .................................................................................................................52

Figura 5.1: Superfície de resposta e curvas de níveis para os compostos fenólicos totais do

jambo vermelho. .......................................................................................................................60

Figura 5.2: Diagrama de Pareto para o teor de compostos fenólicos totais. ............................61

Figura 5.3: Superfície de resposta e curvas de nível para atividade antioxidante do jambo

vermelho. ..................................................................................................................................63

Figura 5.4: Diagrama de Pareto para atividade antioxidante....................................................65

Figura 5.5: Superfície de resposta e curvas de nível para antocianinas totais do jambo

vermelho. ..................................................................................................................................67

Figura 5.6: Diagrama de Pareto para antocianinas monoméricas totais...................................69

Figura 5.7: Superfície de resposta e curvas de nível para concentração de pigmento do jambo

vermelho. ..................................................................................................................................71

Figura 5.8: Diagrama de Pareto para concentração dos pigmentos..........................................72

Figura 5.9: Correlações entre compostos fenólicos totais e atividade antioxidante.................78

Figura 5.10: Correlações entre antocianinas totais e atividade antioxidante............................79

Figura 5.11: Correlação entre compostos fenólicos totais e antocianinas totais. .....................79

Índice de tabelas

Tabela 3.1: Classes dos compostos fenólicos em plantas.........................................................15

Tabela 3.2: Efeito dos substituintes do anel na cor das antocianidinas....................................19

Tabela 4.1: Matriz Experimental do Planejamento Composto Central ....................................40

Tabela 4.2: Análise de variância para o ajuste do modelo matemático....................................42

Tabela 5.1: Resultados para extração dos pigmentos do jambo vermelho...............................56

Tabela 5.2: Coeficientes dos modelos matemáticos para os termos significantes, coeficiente de

correlação (R2) e o teste F para os ensaios de extração. .......................................................58

Tabela 5.3- Resultados da extração dos pigmentos do jambo vermelho para inibição

enzimática .............................................................................................................................73

Tabela 5.4: Valores experimentais para o produto desidratado................................................75

Tabela 5.5: Valores experimentais para concentração de pigmentos e inibição enzimática para

o produto desidratado............................................................................................................77

Tabela 5.6: Valores do estudo funcional para as Estratégias 1 e 2...........................................82

Nomenclatura

AA Atividade Antioxidante

AGE Reações Finais de Glicolisação (do inglês “reactive advanced

glycation endproducts”)

ANOVA Análise de Variância

ASR Análise de Superfície de Resposta

AT Antocianinas Totais

AVIs Vacúolos Antociânicos de Inclusão (do inglês “anthocyanic vacuolar

inclusions”)

CFT Compostos Fenólicos Totais

Ci-3-gli Cianidina-3-glicosídeo

CLAE Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

CN Curvas de Nível

CP Concentração de Pigmento

DM Diabetes Mellitus

DMT1 Diabetes Mellitus Tipo 1

DMT2 Diabetes Mellitus Tipo 2

DP Desvio Padrão

DPPH 1,1-difenil-2-picrilhidrazil

GAE Equivalentes em ácido gálico

GSTs Glutationa S-Transferase (do inglês “glutathione S-transferases”)

MS Massa Seca

PAL Fenilalanina

PCC Planejamento Composto Central

ROS Espécies Reativas de Oxigênio (do inglês “reactive

oxygen species”)

T Temperatura (°C)

t tempo (minutos)

s solvente (v/v)

Capítulo 1: Introdução


Juliana Chrís Silva de Azevêdo, dezembro/2010

2

1- Introdução

A cor é uma das propriedades mais importantes dos alimentos e serve como base para

sua identificação e aceitabilidade. Normalmente, a cor dos alimentos é proveniente de sua

pigmentação natural, todavia corantes sintéticos são adicionados para conferir a coloração

desejada ao produto final esperado (Patil et al., 2009). Tendo em vista indícios de problemas à

saúde humana, que podem ser provocados pelo consumo de corantes sintéticos, pesquisas têm

sido dirigidas no intuito de substituí-los por corantes de origem natural.

As antocianinas são pigmentos fenólicos que têm despertado a atenção de

pesquisadores devido à sua extensa gama de cores e efeitos benéficos e inócuos à saúde o que

as tornam possíveis substitutos de corantes sintéticos existentes (Castañeda-Ovando et al.,

2009). As antocianinas desempenham um papel importante na redução das enfermidades

coronarianas, câncer, diabetes, possuem efeitos antiinflamatórios e melhoram a percepção

visual e o comportamento cognitivo (Garzón, 2008).

Há um interesse crescente em antioxidantes naturais como componentes bioativos nos

alimentos (Benavente-Garcia et al., 2000), sendo os mais comumente encontrados nos

vegetais os compostos fenólicos, que agem como compostos de defesa contra herbívoros e

patógenos enquanto outros têm função no suporte mecânico, como atrativo de polinizadores

ou dispersores de frutos, na proteção contra a radiação ultravioleta e na redução do

crescimento de plantas competidoras (Taiz & Zeiger, 2004).

O uso de corantes naturais na indústria alimentícia é limitado em função de sua baixa

estabilidade frente às condições de preparação, processamento e estocagem. Vários fatores

como tempo, efeito da temperatura, solventes empregados, técnicas de obtenção dos

pigmentos, dentre outros, afetarão o produto final obtido. Desse modo, o método de extração

empregado influenciará diretamente na caracterização da antocianina extraída para cada

espécie vegetal analisada e conseqüentemente na sua concentração final total (Rodríguez-

Saona & Wrolstad, 2001). Conhecer, quantificar e estabelecer um processo de extração das

antocianinas do jambo vermelho possibilitará o aproveitamento de uma fruta regional e

conseqüentemente novos avanços para a obtenção de um produto rentável e viável.



3

Este trabalho objetivou a aplicação de duas diferentes estratégias de obtenção do

corante da casca e do fruto inteiro do jambo vermelho, além da caracterização funcional dos

mesmos. Assim, a estratégia 1 utilizou a extração sólido-líquido mediante controle de

parâmetros por planejamento composto central, e a estratégia 2, desidratação em leito de

jorro. Em seguida, foi avaliado o teor de compostos fenólicos totais, a capacidade

antioxidante, a concentração de antocianinas monoméricas totais e a atividade inibitória das

enzimas α-amilase e α-glicosidase. Finalmente, após a comparação dos resultados, foram

apresentadas as melhores condições para obtenção do corante do jambo vermelho, tendo

como base o desempenho funcional dos produtos obtidos.

Capítulo 2: Objetivos

Capítulo 2: Objetivos


5

2- Objetivos

2.1- Geral:

� Estudar estratégias de obtenção do corante de jambo vermelho (Syzygium malaccense)

e avaliar a potencial funcionalidade do mesmo.

2.2- Específicos:

� Avaliar o corante obtido a partir do jambo vermelho por extração sólido-líquido em

reator enjaquetado mediante planejamento composto central;

� Estudar a obtenção do corante do jambo vermelho desidratado em secador de leito de

jorro;

� Caracterizar o corante obtido quanto ao teor de compostos fenólicos totais, atividade

antioxidante, teor de antocianinas monoméricas totais, concentração do pigmento e

capacidade de inibição das enzimas α-amilase e α-glicosidase;

� Comparar as estratégias com base na funcionalidade dos produtos obtidos.

Capítulo 3: Revisão Bibliográfica



7

3- Revisão bibliográfica

3.1- O jambo vermelho (Syzygium malaccense)

O jambo vermelho (Figura 3.1) é originário da Malásia, de onde se dispersou para as

regiões tropicais da África e América. No Brasil é encontrado nos estados da região Norte,

Nordeste e nas regiões quentes do Sudeste. A árvore alcança de 12 a 15 m de altura, possui

tronco reto e copa piramidal; as folhas são verde escuras e brilhantes na parte superior e verde

opaca na parte inferior, medindo de 20 a 22 cm de comprimento por 6 a 9 cm de largura

(Almeida et al., 2008). Os frutos do jambo vermelho são piriformes, carnosos, indeiscentes,

do tipo bacóide. O epicarpo é delgado, liso e de coloração variando com o estágio de

maturação (rosa, vermelho, vermelho-escuro a vermelho bem escuro); o mesocarpo e o

endocarpo são esbranquiçados e suculentos, constituindo a polpa. A fruta possui peso total,

em média, de 37,57 g (variando de 23,50 a 45,50 g); peso da polpa de 27,95 g (variando de

18,00 a 32,50 g); comprimento de 7,16 cm (variando de 6,37 a 7,85 cm) e largura de 5,15 cm

(variando de 3,96 a 6,22 cm) (Costa et al., 2006).

Figura 3.1: Jambo vermelho. Fonte: Arquivo pessoal (2010).

Os frutos contêm vitaminas A, B1, B12, além de cálcio, ferro e fósforo. A polpa, que

constitui 84% do fruto, apresenta °Brix de 6,8% e acidez de 0,4%, no final da maturação



8

(Costa et al., 2006). Apresenta 90,3 a 91,6% de umidade; 0,5 a 0,7 % de proteínas; 0,1 a 0,2

% de gordura vegetal; 0,6 a 0,8 % de fibras e 6,5 a 17 mg/100g de teor de ácido ascórbico

(Morton, 1987).

No Rio Grande do Norte o jambeiro é encontrado nas cidades litorâneas e no período

compreendido entre os meses de novembro a março, é considerada uma árvore ornamental e

seus frutos são consumidos na maioria dos casos in natura ou na forma de produtos

artesanais, como por exemplo, compotas, suco e geléia.

Grande parte dos frutos é desperdiçada na época da safra, em virtude da alta produção

por árvore e do curto período de produção; da pequena vida útil do fruto in natura e da falta

de conhecimento da viabilidade tecnológica para a sua industrialização (Cardoso, 2008).

3.2- Os corantes alimentícios

As cores são adicionadas aos alimentos para restituir a aparência original (afetada

durante as etapas de processamento, de estocagem, de embalagem ou de distribuição), para

tornar o alimento visualmente mais atraente, para conferir cor aos que não as possuem e para

reforçar as cores presentes nos mesmos. Duas classes bem distintas de corantes estão

disponíveis para uso em alimentos, os sintéticos e os naturais. Apesar dos corantes sintéticos

apresentarem menores custos de produção e maior estabilidade, o número de aditivos

sintéticos permitidos nos países desenvolvidos está diminuindo, a cada ano, em favor dos

pigmentos naturais (Constant, Stringheta & Sandi, 2002).

O emprego de corantes artificiais é um dos mais polêmicos avanços da indústria de

alimentos, já que seu uso em muitos alimentos justifica-se apenas por questões de hábitos

alimentares. Em geral, a importância da aparência do produto para sua aceitabilidade é a

maior justificativa para o seu emprego. Há severas críticas dos consumidos quanto à

inocuidade do uso de corantes artificiais, tornando necessário o controle de suas aplicações

com relação aos possíveis efeitos nocivos à saúde humana (Prado & Godoy, 2003).

Na prática, alguns corantes naturais, além das dificuldades tecnológicas de utilização,

são problemáticos devido à falta de informações toxicologias suficientes. Em estudos



9

conduzidos pelo Comitê Científico Europeu foi encontrada mais reação adversa (urticária)

provocada pela ingestão do corante natural urucum que pela ingestão do artificial tartrazina

(Araújo, 2008).

Comercialmente os tipos de corantes naturais mais largamente empregados pelas

indústrias alimentícias têm sido os extratos de urucum, carmim de cochonila, curcumina,

betalaínas e antocianinas (Constant, Stringheta & Sandi, 2002).

3.2.1- Urucum

O urucum é o extrato amarelo-alaranjado obtido do pericarpo da semente da planta

Bixa orellana L. (urucum). Este pigmento é constituído basicamente do carotenóide cis-

bixina, insolúvel em óleo e que compreende mais de 80% do corante presente na semente. O

pigmento é obtido mecanicamente do pericarpo submerso em óleo vegetal aquecido a 70ºC, e

o produto comercial contém 0,20 – 0,25% de bixina. O aquecimento utilizado na extração

converte a cis-bixina em trans-bixina, de coloração avermelhada e solúvel em óleo (Araújo,

2008).

No Brasil, o urucum vem sendo mais utilizado como ingrediente em diversos produtos

alimentícios nas formas hidrossolúvel e lipossolúvel. O extrato lipossolúvel do urucum foi um

dos primeiros corantes a ser usado em margarina e manteiga. O corante hidrossolúvel tem

sido tradicionalmente empregado em queijos, como o queijo prato. Apresenta aplicação

também em produtos cárneos como salsichas, peixes defumados e, quando na forma em pó,

em bebidas instantâneas e misturas secas (Constant, Stringheta & Sandi, 2002).

3.2.2- Carmim de cochonila

Cochonila é um corante vermelho extraído a partir do corpo de insetos secos

(Dactylopius coccus Costa ou Coccus cati). Seu cromóforo principal é o ácido carminíco,

sendo o extrato aquoso conhecido como cochonila. O carmim possui boa estabilidade à luz, a

temperatura e em elevada atividade de água, mas descolore na presença de dióxido de

enxofre. É solúvel em soluções alcalinas, onde apresenta coloração violeta, é sensível ao pH e



10

precipita em pH ácido; o precipitado pode ser ressuspendido em água ou gordura (Araújo,

2008).

Em razão de sua estabilidade, o carmin é considerado sob o ponto de vista tecnológico

excelente corante. Deve, no entanto, ser aplicado em alimentos com pH acima de 3,5, o que

inclui produtos cárneos (salsichas, surimi e marinados vermelhos). Outros usos importantes

compreendem alguns tipos de conservas, gelatinas, sorvetes, produtos lácteos e sobremesas

diversas (Constant, Stringheta & Sandi, 2002).

3.2.3- Pimentão-vermelho

Obtém-se do Capsicum annum um corante vermelho-alaranjado, pela extração com

solventes, utilizado em carnes, derivados e molhos. O corante é uma mistura complexa,

contendo em torno de 50 diferentes pigmentos. Seus principais cromóforos são capsantina e

capsorubina (pigmentos vermelhos) e betacaroteno (pigmento amarelo). Onde, a capsantina

representa 40 a 45% dos carotenóides no extrato. A coloração típica de alaranjado-vermelho

para vermelho-alaranjado depende da concentração, do método de obtenção, do tempo de

colheita e das condições de armazenamento. A principal variável da coloração final é a

inclusão de sementes ou sua remoção antes da extração.

O corante do pimentão, como todos os carotenóides, é sensível ao oxigênio e à luz.

Quando esses fatores são excluídos, os carotenóides em alimentos são estáveis mesmo em

temperaturas elevadas. Sua degradação é, entretanto, acelerada por radicais livres formados

durante a oxidação de lipídios. A degradação oxidativa provoca mudanças na coloração,

freqüentemente observadas em tomate e pimentão desidratados, e estão relacionadas com a

degradação oxidativa dos carotenóides. Embalagens adequadas e armazenagem a frio e livre

da ação direta da luz aumentam a vida útil do corante (Araújo, 2008).

3.2.4- Curcumina

A curcumina é um extrato amarelo-ouro extraído de rizomas de Curcuma long L.

(açafrão) com os solventes acetona, metanol, etanol, éter de petróleo e diclorometano. O



11

rizoma contém de 2,5 a 8,1% do principal componente cromóforo, denominado curcumina. A

oleorresina de boa qualidade é praticamente isenta de outros corantes, os quais estão presentes

no extrato bruto. A curcumina é insolúvel em água e solúvel em óleos e gorduras. Em razão

de sua alta intensidade de cor, pequenas quantidades são suficientes para colorir o produto.

A curcumina forma complexos estáveis com proteínas, e esta propriedade é utilizada

na produção de misturas complexas de cores naturais. É resistente à oxidação e acredita-se

possuir propriedades antioxidantes equivalentes às do BHA/BHT. O produto comercial pode

ser obtido na forma de oleorresina e de pó, bem como nas formas solúveis e dispersas em

água. É utilizada em bebidas enlatadas, produtos de panificação, derivados de leite, gomas de

mascar, cereais e molhos (Araújo, 2008).

3.2.5- Betalaínas

As betalaínas, encontradas somente em vegetais, são um grupo de pigmentos que

compreende as betacianinas, pigmentos vermelhos, e as betaxantinas, pigmentos amarelos,

cuja coloração não é afetada na mesma intensidade pelo pH como as antocianinas. A principal

betacianina é a betanina, glicosídeo da betanidina, que perfaz cerca de 75 a 95% do total de

pigmentos da beterraba. Os outros pigmentos vermelhos são isobetanina (epímero da betanina

na posição C15), prebetanina (sulfato monoéster da betanina) e isoprebetanina (sulfato

monoéster da isobetanina). Os dois principais pigmentos amarelos são vulgaxantina I e

vulgaxantina II.

A estabilidade da cor da betanina em solução é fortemente influenciada pelo pH e pelo

aquecimento. É muito estável na faixa de pH de 4,0 a 5,0 e razoavelmente estável na faixa de

pH de 4,0 a 6,0. A degradação da betanina resulta em ácido betalamínico e ciclodopa, que é

irreversível (Ribeiro & Seravalli, 2007).

O extrato concentrado de beterraba é utilizado em sorvetes, iogurtes, balas, molho,

goma de mascar e derivados de leite, podendo ser obtido nas formas de xarope ou pó (spray-

dried junto com maltodextrina). O teor de betanina é geralmente padronizado em 0,2% para a

forma líquida e 0,25% para a forma em pó. A oxidação das betalaínas é acelerada na presença

da luz, e a adição de ácido ascórbico melhora sua estabilidade. Como o cobre e ferro (cátions)



12

catalisam a oxidação do ácido ascórbico pelo oxigênio molecular, a adição do ácido cítrico

aumenta a eficiência do ácido ascórbico na estabilidade das betalaínas (Araújo, 2008).

3.3- Compostos fenólicos

Os compostos fenólicos são considerados metabólitos secundários sintetizados pelas

plantas durante o seu desenvolvimento natural e, também em resposta a condições de estresse,

como lesões físicas, radiação solar, entre outros agentes externos (Naczk & Shahidi, 2004).

A maioria dos compostos fenólicos não é encontrada no estado livre na natureza, mas

sob forma de ésteres ou de heterosídeos (Monteiro et al., 2005). Os fenóis vegetais constituem

um grupo quimicamente heterogêneo, com aproximadamente 10.000 compostos: alguns são

solúveis apenas em solventes orgânicos, outros são ácidos carboxílicos e glicosídeos solúveis

em água, e existem aqueles que são grandes polímeros insolúveis (Taiz & Zeiger, 2004).

3.3.1- Biossíntese dos compostos fenólicos

Duas rotas metabólicas básicas estão envolvidas na síntese dos compostos fenólicos: a

rota do ácido chiquímico e a rota do ácido malônico (Figura 3.2). A rota do ácido chiquímico

participa na biossíntese da maioria dos fenóis vegetais e a do ácido malônico é menos

significativa nas plantas superiores (Taiz & Zeiger, 2004).

A rota do ácido chiquímico converte precursores de carboidratos derivados da

glicólise e da rota da pentose fosfato em aminoácidos aromáticos. Um dos intermediários

dessa rota é o ácido chiquímico, que dá o nome a essa seqüência de reações. Essa rota está

presente em plantas, fungos e bactérias, mas não é encontrada em animais, os quais não

podem sintetizar três aminoácidos – fenilalanina, tirosina e triptofano - que são nutrientes

essenciais na sua dieta (Taiz & Zeiger, 2004).



13

Figura 3.2: Biossíntese dos compostos fenólicos (Fonte: Taiz & Zeiger, 2004).

A classe mais abundante de compostos fenólicos secundários em plantas é derivada da

fenilalanina, por meio da eliminação de uma molécula de amônia para formar o ácido

cinâmico (Figura 3.3). Essa reação é catalisada pela fenilalanina amonialiase (PAL), talvez a

enzima mais estudada no metabolismo secundário vegetal. A PAL está situada em um ponto

de ramificação entre os metabolismos primário e secundário, de forma que a reação que ela

catalisa é uma etapa reguladora importante na formação de muitos compostos fenólicos

vegetais, incluindo fenilpropanóides simples, cumarinas, derivados do ácido benzóico,

lignina, antocianinas, isoflavonas, taninos condensados e outros flavonóides.

C6 C3

Eritrose-4 fosfato (resultante da rota da pentose fosfato)

Ácido fosfoenolpirúvico (resultante da glicólise)

Rota do ácido chiquímico

C6 C3 Ácido gálico

Taninos hidrolisáveis

Rota do ácido malônico

C6 C6

C6

C6 C6

C6 C6

C3 C1 C3

C3 C3

n

Fenóis simples Flavonóides

Compostos fenólicos variados

Lignina Taninos condensados

n

Fenilalanina

Ácido cinâmico

Acetil CoA



14

Figura 3.3: Rota da fenilalanina. Adaptado de Taiz & Zeiger (2004).

NH2

COOH

Fenilalanina

Fenilalanina amonialiase (PAL) NH2

COOH

Derivados do ácido benzóico

Ácido transcinâmico

COOH

HO

Ácido caféico e outros

fenilpropanóides simples

Cumarinas

Precursores de lignina

Ácido p-cumárico

CoA-SH

COSCoA

HO p-cumaril-CoA

3 moléculas de malonil-CoA

Chalcona sintase

Chalconas

w HO

OH

HO O

w

HO O

O OH

Flavonas

Isoflavona

w

Flavononas

Di-hidroflavonóis HO

HO

O OH

O

OH

OH

Flavonóis - Antocianinas

- Taninos condensados



15

3.3.2- Classificação dos compostos fenólicos

Os compostos fenólicos podem ser divididos em até 10 diferentes classes dependendo

de sua estrutura química básica (Tabela 3.1), sendo as principais a dos ácidos fenólicos, dos

flavonóides e dos taninos (Naczk & Shahidi, 2004; Balasundram, Sundram & Samman,

2006).

Tabela 3.1: Classes dos compostos fenólicos em plantas.

Classe Estrutura básica

Fenólicos simples, benzoquinonas C6

Ácidos fenólicos (hidroxibenzóicos) C6-C1

Acetofenonas e ácidos feniláceticos C6-C2

Ácido hidroxicinâmicos, fenilpropanóides

(cumarinas, isocumarinas, cromonas, cromenas)

C6-C3

Naftoquinonas C6-C4

Xantonas C6-C1-C6

Estilbenos, antraquinonas C6-C2-C6

Flavonóides, isoflavonóides C6-C3-C6

Ligninas, neoligninas (C6-C3)2

Biflavonóides (C6-C3-C6)2

Ligninas (C6-C3)n

Taninos condensáveis

(proantocianidinas ou flavolans)

(C6-C3-C6)n

Fonte: Balasundram, Sundram & Samman, 2006.

Os compostos fenólicos apresentam uma grande variedade de propriedades

fisiológicas, como antialergênica, antiarteriogênica, antiinflamatória, antimicrobiana,

antitrombótica, cardioprotetora e vasodilatadora, mas o principal efeito dos compostos



16

fenólicos tem sido atribuído à sua atividade antioxidante (Balasundram, Sundram & Samman,

2006).

Prasad et al. (2009) estudaram a identificação de compostos fenólicos totais, a

capacidade antioxidante e a atividade anti-tirosinase de sementes de lichia (Litchi sinensis

Sonn.) desidratadas, utilizaram para isso cinco tipos de extratos, sendo eles, 100% etanólico,

50% etanólico, 100% metanólico, 50% metanólico e 100% aquoso. Para o conteúdo total de

fenólicos os melhores resultados, na ordem decrescente, foram: 100% metanólico (244), 50%

etanólico (239) e 100% aquoso (158), sendo expressos em equivalentes g de ácido gálico por

g de massa fresca. O extrato 50% etanólico apresentou a maior capacidade antioxidante no

seqüestro do radical DPPH e a maior atividade inibitória contra a peroxidação lipídica,

comparável ao antioxidante sintético butil-hidroxi tolueno, obtendo uma melhor atividade em

relação à anti-tirosinase, quando comparados aos demais extratos. Concluíram, assim, que as

sementes de lichia possuem potencial para utilização como uma fonte acessível de

antioxidantes naturais.

3.3.2.1- Flavonóides

Os flavonóides, o grupo mais importante dentre os compostos fenólicos, podem ser

subdivididos em 13 classes, com mais de 5000 compostos (Bravo, 1998). Existem quatro

grupos principais de flavonóides: as antocianinas, as flavonas, os flavonóis e as isoflavonas

(Taiz & Zeiger, 2004).

Os flavonóides atuam como antioxidantes na inativação dos radicais livres, em ambos

os compartimentos celulares, lipofílico e hidrofílico (Bianch & Antunes, 1999). A eficiência

antioxidante de compostos fenólicos tem grande dependência de sua estrutura química e os

flavonóides são uns dos mais potentes componentes dos antioxidantes vegetais porque possui

a estrutura elementar envolvida na atividade anti-radical (Figura 3.4): um grupo orto-

difenólico (anel B), uma dupla ligação 2-3 conjugada com o núcleo 4-oxo-flavonóide (anel C)

e grupos hidroxilas nas posições 3 e 5. Além disso, a eficiência antioxidante dos flavonóides é

diretamente correlacionada com o decréscimo de suas hidroxilações e a redução causada pela

presença de uma molécula de açúcar (glicosídeos não são antioxidante, mas a parte aglicona



17

dos flavonóides possuem esta função) e são muito eficientes na inibição de radicais hidróxido

e peróxido. Entretanto, a sua eficiência de inibição de ânios superóxidos não é bem clara

(Bravo, 1998; Aherner & O’Brien, 2002).

(a) Estrutura do flavonóide quercetina (Bravo, 1998).

Figura 3.4: Características estruturais relacionadas à capacidade antioxidante.

Vários fatores afetam o conteúdo de flavonóides nos alimentos e seus padrões

específicos de ocorrência. Cada espécie vegetal é determinada por um intrincado sistema de

controle genético de enzimas que regulam a sua síntese e distribuição no organismo da planta.

Assim, além desses fatores intrínsecos, o conteúdo de flavonóides em plantas é fortemente

influenciado por fatores extrínsecos, tais como variações no tipo de planta e de seu

crescimento, estação do ano, clima da região, grau de maturação e por fim, durante o

processamento e preparação do alimento (Aherner & O’Brien, 2002).

Dehkharghanian, Adenier & Vijayalakshmi (2010) investigaram o conteúdo total de

fenólicos e a presença de três flavonóides (quercetina, kaempferol e miricetina) e duas

flavonas (apigenina e luteolina) em extratos aquosos de espinafre. Para este fim usaram

espectrofotometria de massa e identificação por cromatografia líquida de alta eficiência

(CLAE). Ao final, constatou-se a presença de teores de polifenóis totais em espinafre fresco

de 270 mg/kg e 390 mg/kg, em equivalentes de ácido tânico e catequina, respectivamente, nos

quais os principais flavonóides detectados foram a apigenina (170 mg/kg) e o kaempferol (30

mg/kg).

O

O

A C

B

OH

OH

HO

OH

OH

5 6

7

8 2’

3’

4’

5’ 6’

4 3

2



18

3.3.2.1.1- Antocianinas

As antocianinas são flavonóides constituídos por pigmentos naturais responsáveis pela

coloração vermelha, rosa, azul e roxa de flores e frutos de muitas plantas. Existem diversas

antocianinas encontradas na natureza e sua composição é específica e importante na distinção

das diferentes espécies vegetais (Hong & Wrolstad, 1990). No entanto, as cores das

antocianinas são facilmente afetadas por uma série de condições (Fossen, Cabrita &

Andersen, 1998). Atualmente há 600 antocianinas identificadas na natureza (Konczak &

Zhang, 2004).

As antocianinas são glicosídeos que apresentam açúcares na posição 3 (Figura 3.5b) e,

algumas vezes, em outras posições. Sem seus açúcares, as antocianinas são conhecidas como

antocianidinas (Figura 3.5a). A cor das antocianinas é influenciada por muitos fatores,

incluindo o número de grupos hidroxila e metoxila no anel B da antocianidina, a presença de

ácidos aromáticos esterificados ao esqueleto principal e o pH do vacúolo, no qual tais

compostos estão armazenados. As antocianinas podem também ocorrer em complexos

supramoleculares junto a íons metálicos quelados e a co-pigmentos flavonas (Taiz & Zeiger,

2004).

(a) Antocianidina

(b) Antocianina

Figura 3.5: As estruturas das antocianidinas (a) e antocianinas (b)

OH OH

HO

A C

B 4’

3’

5’

2’

6’ 1’

O+

O+

O Açúcar

A C

B

OH

OH

HO



19

As cores das antocianinas dependem, em parte, dos substituintes ligados ao anel B.

Um aumento no número de grupos de hidroxila altera a absorção para um comprimento de

onda mais longo, resultando na cor azul. A substituição do grupo hidroxila por um grupo

metoxila (OCH3) altera a absorção para um comprimento de onda um pouco mais curto,

resultando na cor avermelhada. As antocianidinas mais comuns e suas cores estão indicadas

na Tabela 3.2 (Taiz & Zeiger, 2004).

Tabela 3.2: Efeito dos substituintes do anel na cor das antocianidinas.

Antocianidina Substituintes Cor

Pelargonidina 4’–OH Vermelho alaranjado

Cianidina 3’–OH, 4’–OH Vermelho violáceo

Delfinidina 3’–OH, 4’–OH, 5’–OH Azul violáceo

Peonidina 3’–OCH3, 4’–OH Vermelho rosado

Petunidina 3’–OCH3, 4’–OH, 5’–OCH3 Violeta

Fonte: Taiz & Zeiger, 2004.

Outra propriedade importante das antocianinas é a sua atividade antioxidante

(Konczak & Zhang, 2004), que desempenha um papel fundamental na defesa contra as

doenças neurais, cardiovasculares, câncer, diabetes e outras (Castañeda-Ovando et al., 2009).

Devido às antocianinas apresentarem uma série de atividades biológicas, a

contribuição do efeito de promoção da saúde dessas substâncias está sob investigações em

muitos estudos. Para esse propósito, há a necessidade da realização de experimentos in vitro e

in vivo (Eichhorn & Winterhalther, 2005).

3.3.2.1.1.1- Fatores que determinam a estabilidade das antocianinas

A estabilidade das antocianinas é influenciada por a sua própria estrutura química, a

temperatura, o efeito do pH, a presença de oxigênio, as interações entre os componentes dos

alimentos, tais como ácido ascórbico, íons metálicos, açúcares (Francis, 1977), a incidência da



20

luz, a formação de co-pigmentos (Bridle & Timberlake, 1997) e a degradação química e

enzimática (Zhang et al., 2004).

a) Degradação

As diferentes condições de processos para a obtenção de antocianinas são responsáveis

por perdas de suas propriedades que agregam valor a alimentos modificados industrialmente.

Em geral, a biossíntese das antocianinas tem sido mais estudada do que a etapa pós-

biossíntese. É durante essa etapa, que compreende modificações químicas e enzimáticas, que

ocorre a degradação das antocianinas no interior celular, durante o transporte, a armazenagem,

a secreção e catabolismo (Zhang, Curtin & Franco, 2002). Para elucidar o mecanismo de

transporte e armazenamento de antocianinas em células vegetais foram utilizadas células

cultivadas de uva (Vitis vinifera L.), com o objetivo de produzir antocianinas estáveis (Zhang

et al., 2004).

A síntese de antocianinas é realizada através de etapas seqüenciais catalisadas por

enzimas localizadas no citosol e retículo endoplasmático das células (Springob et al., 2003).

Uma das possibilidades de transporte da antocianina é a de aderir a um tipo de proteína, a

glutationa S-transferase (GST), e mais tarde se acumular em vacúolos antociânicos de

inclusão (Anthocyanic vacuolar inclusions - AVIs), Figura 3.6 (Conn, Zhang & Franco,

2003). Este mecanismo varia entre as espécies vegetais e ainda não está totalmente elucidado

(Zhang et al., 2004).



21

Figura 3.6: Esquema da rota da antocianina pós-biossíntese. Adaptado de Zhang et al., 2004.

b) Temperatura

O efeito da temperatura é um fator relevante quanto à estabilidade das antocianinas.

Nos estudos de extração de antocianinas de groselhas pretas, realizados por Cacace & Mazza

(2003) constatou-se que a elevação da temperatura de 6 para 30 ºC aumentou o rendimento e

reduziu o tempo de extração, utilizando como solventes etanol e água sulfurada. Entretanto, o

emprego de temperaturas de extração de 40 e 70 ºC resultou em baixos rendimentos, devido à

degradação das antocianinas.

Em investigação in vitro realizada sobre a termo-estabilidade, a composição bioativa e

a atividade antioxidante de extratos, feitos com água e acetona, de raízes de lótus e cebola

branca, a diferentes períodos de ebulição (10, 20, 40 e 60 minutos) e a temperatura ambiente,

verificaram-se maiores resultados da presença de compostos bioativos (polifenóis, flavonóis,

O+

O

OH

OH

OH

OH

OCH3

Coum

Glc

Transporte da antocianina via GST

Entrada Estocagem (AVI)

Degradação

(Química, enzimática)



22

flavonóides, antocianinas e taninos) e atividade antioxidante em extratos de raízes de lótus do

que em extratos de cebola branca. A termo-estabilidade também foi significantemente

superior em extratos de raízes de lótus, que permaneceu a mesma para o extrato aquoso em

tempo superior a 60 minutos de ebulição. A atividade antioxidante desses extratos continuou

apresentando-se elevada, de acordo com os ensaios de DPPH, FRAP, ABTS e CUPRAC (Im

et al., 2010).

c) pH

As antocianinas podem ser encontradas em diferentes formas químicas dependendo do

pH do meio reacional em que se encontre (Castañeda-Ovando et al., 2009), o que influenciará

diretamente em sua cor e estabilidade (Albarici, Pessoa & Forim, 2006).

As antocianinas são antocianidinas ligadas a açúcares e todas as antocianidinas têm

como estrutura básica o íon flavilium, o qual é muito reativo. Atribui-se a essa estrutura seis

formas de ressonância, com a maior carga parcial positiva nos carbonos 2 e 4, sendo a

estabilidade do cátion dependente desses radicais. A presença de um íon oxônio adjacente ao

carbono 2 é a razão pela qual as antocianidinas apresentarem uma natureza anfótera. Em

meios ácido e neutro, quatro estruturas de antocianinas existem em equilíbrio: o cátion

flavilium (AH+), a base quinoidal (A), a pseudobase ou carbinol (B) e a chalcona (C), como

ilustrado na Figura 3.7a (Ribeiro & Seravalli, 2007).

As antocianinas exibem coloração vermelha intensa apenas em uma faixa muito

limitada de pH, ou seja, de 1,0 a 3,0 que corresponde a um equilíbrio entre o cátion flavilium

(vermelho) e a base carbinol (incolor). Uma elevação de pH provoca uma transformação

estrutural com perda de cor vermelha. Em pH de 4,0 a 6,5 o sal flavilium é imediatamente

convertido em duas bases quinoidais neutras de cor púrpura, que lentamente se hidratam para

a pseudobase carbinol, com desaparecimento progressivo da cor (Ribeiro & Seravalli, 2007).



23

(a) Formas químicas das antocianinas dependentes do pH (R1 e R2 = H/ OH/ OMe; O – R3 =

açúcar). Adaptado de Albarici, Pessoa & Forim, 2006.

(b) Reação de degradação. Adaptado de Castãneda-Ovando et al., 2009.

Figura 3.7: Transições das estruturas das antocianinas em função do pH.

OH

HO O+

OR1

OH

OR2

O – R3

Cátion flavilium (AH+)

OH

HO O

OH

OR2

O – R3

Pseudobase ou carbinol (B)

OH

O O

OR1

OH

OR2

O – R3

Base quinoidal (A)

OH

HO OH

OR1

OH

OR2

O – R3

Chalcona (C)

+ H2O -H+

-H+

OH

O

OH

HO OH

R1

OH

R2

O – R3

Chalcona (C) pH 6

O

OH

HO OH

R1

OH

R2

O – R3

Chalcona (C)

O

OH

HO OH

O

Aldeído

+

R1

OH

R2 O

OH

Ácido fenólico

OH

HO OH

R1

OH

R2

O

O

Dicetona

Quando R1 é H:

OR1



24

A estabilidade das antocianidinas é influenciada pelos substituintes do anel B e o

número de grupos hidroxila e metoxila, que diminuem a estabilidade da parte aglicona em

meio reacional neutro. Tal comportamento é explicado porque as moléculas de açúcar evitam

a degradação de formas intermediárias instáveis em ácidos fenólicos e aldeídos. A reação de

degradação das antocianinas parte da forma chalcona (Figura 3.7b) (Castãneda-Ovando et al.,

2009).

Torskangerpoll & Andersen (2005) investigaram a estabilidade de três pigmentos

antociânicos isolados a partir de frutas e legumes, sendo eles, (1) cianidina-3-glicosídeo, (2)

cianidina-3-(2”-glucosil-glicosídeo)-5-glucosídeo e (3) cianidina-3-(2”-(2’”-sinapoil

glucosil)-6”-sinapoil-glucosídeo)-5-glucosídeo. A partir das diferentes antocianinas foram

feitas soluções aquosas tamponadas em 14 diferentes valores de pH, medidos durante 98 dias

e mantidos a temperatura de 10ºC. Observou-se o impacto da modificação do pH do meio na

estrutura química das mesmas, tais como a substituição na posição 5-glicosídica (anel A –

Figura 3.8), possível acilação de resíduos de açúcares com ácidos orgânicos na posição 3

(anel B – Figura 3.8), modificação da cor e em sua estabilidade. Os pigmentos 2 e 3 foram

mais estáveis, em parte dos valores de pH analisados, do que o pigmento 1. Todos os

pigmentos apresentaram modificações drásticas na coloração em soluções mais alcalinas. As

variações nos resultados enfatizam a importância da estrutura química para a propriedade das

antocianinas em frutos frescos e produtos hortículas.

Figura 3.8: Estrutura básica e sistema de numeração dos flavonóides (Bravo, 1998).

Em estudos com variedades de batatas pigmentadas foi relatado o predomínio de

antocianinas aciladas. Esse tipo de antocianina é atrativo para a coloração de alimentos

porque mostram uma maior estabilidade a valores de pH baixos (Eichhorn & Winterhalther,

2

C

A

B O

3 4

1

5

7

6

8 1’ 2’

6’

4’

5’

3’

C



25

2005). As antocianinas da batata vermelha, por exemplo, são discutidas como alternativa aos

corantes sintéticos (Rodríguez-Saona, Giusti & Wrolstad, 1998).

Cabrita, Fossen & Andersen (2000) investigaram a estabilidade de seis diferentes

antocianinas purificadas a partir do morango (Fragaria ananassa: pelargonidina-3-

glucosídeo), do arroz (Oriza sativa: cianidina e peonidina-3- glucosídeo); da Abies koreana

(delfinidina e petunidina-3-glucosídeo) e do mirtilo (Vaccinium spp.: malvidina-3-glucosídeo)

e a variação de cor devido ao pH, concluindo, das análises realizadas, que as mudanças são

mais significantes na região alcalina e isso deve-se ao fato das antocianinas serem

extremamente instáveis nessa região.

d) Luz

A presença de luz exerce efeito duplo sob as antocianinas: favorece sua biossíntese,

mas acelera seu processo de degradação. Os pigmentos antociânicos obtidos da Alcalipha

híspida perderam 50% da cor original após 2800 horas no escuro e após 721 horas sob

exposição à luz, em solução tampão citrato/fosfato de pH igual a 3 e temperatura de 21ºC

(Bailoni, Bobbio & Bobbio, 1998).

Em estudos realizados por Sankat, Basanta & Marahaj (2000) com frutos de jambo

expostos à luz e outros mantidos no escuro, observou-se uma maior perda da coloração

vermelha da casca nos frutos expostos diretamente à luz (mantidos durante 30 dias a 5°C) do

que naqueles protegidos da mesma, cuja perda foi reduzida. As medidas foram feitas com

relação à perda do pigmento antociânico dos frutos através de colorimetria.

Zhang et al. (2002) investigaram a ação conjunta do ácido jasmônico e da incidência

da luz para aprimoramento da biossíntese de antocianinas em uma cultura de suspensão de

células de Vitis vinifera. Os autores constataram um significativo incremento no acúmulo de

antocianinas, apresentando um valor superior de 13,9 vezes, quando comparado à cultura de

controle, que se encontrava na ausência de luz.



26

e) Oxigênio

A presença de oxigênio no meio também é um fator significativo na degradação de

antocianinas, mesmo na ausência de luz e em todos os valores de pH. Esta degradação ocorre

através de um mecanismo de oxidação direta ou indireta dos constituintes do meio que

reagem com as antocianinas (Lopes et al., 2007).

A natureza insaturada da estrutura das antocianinas torna-as suscetíveis ao oxigênio

molecular. Na presença de oxigênio, as antocianinas escurecem. Quando se substitui o O2 por

atmosferas ricas em nitrogênio ou vácuo, a cor das antocianinas é mantida (Ribeiro &

Seravalli, 2007).

f) Solvente

A solubilidade de compostos fenólicos é regida pela polaridade do solvente utilizado,

pelo grau de polimerização dos compostos fenólicos presentes, pela interação desses

compostos com outros componentes do alimento e pela formação de complexos insolúveis.

Por isso não existe um procedimento uniforme ou completamente satisfatório que seja

adequado para a extração de todos os compostos fenólicos ou uma classe específica de

substâncias fenólicas, em materiais vegetais. Diferentes solventes e combinações entre eles,

como o metanol, etanol, acetona, água e acetato de etila, são freqüentemente utilizados para

extração de compostos fenólicos (Naczk & Shahidi, 2004).

As antocianinas, obtidas a partir de materiais vegetais, são extraídas geralmente com

solventes orgânicos acidificados, onde esse sistema solvente destrói a membrana celular e ao

mesmo tempo dissolve as antocianinas e as mantêm estáveis (Naczk & Shahidi, 2004). Cacase

& Mazza (2002) utilizaram água sulfurada para extrair as antocianinas de groselhas pretas e a

quantidade máxima extraída foi a um nível de SO2 de 1000-1200 ppm em 30-35°C e a uma

proporção de solvente e massa do fruto congelado moído de 19L:1kg.

Ju & Howard (2003) empregaram um sistema a alta temperatura com líquido

pressurizado e testaram seis diferentes solventes - água acidificada (água deionizada em HCl

0,1%); etanol 60% em HCl 0,1%; metanol 60% em HCl 0,1%; uma mistura dos solventes



27

metanol (40)/ acetona (40)/ água (20) em HCl 0,1%; metanol 70% em ácido acético 7%;

metanol 70% em ácido trifluoroacético 0,1% - dos quais, tanto a água acidificada quanto o

metanol 60% acidificado apresentaram similar eficiência no máximo conteúdo de

antocianinas obtido da casca de uva desidratada, a intervalos de temperatura máxima de 80-

100°C.

g) Copigmentação

Acredita-se que a reação de copigmentação seja uma das principais responsáveis pela

estabilidade das antocianinas na natureza, mais especificamente do cátion flavilium (Dimitric-

Markovic et al., 2001). Os flavonóides não antociânicos, alcalóides, aminoácidos e

nucleosídeos, entre outros, podem atuar como copigmentos e a própria antocianina pode agir

copgimentando outra antocianina (Stringheta & Bobbio, 2000). A intensidade dos efeitos de

copigmentação depende de vários fatores, incluindo tipo e concentração de antocianinas e

copigmentos, pH e temperatura do solvente. O valor de pH para uma copigmentação máxima

está em torno de 3,5 e pode variar ligeiramente em função do sistema pigmento-copigmento

(Ribeiro & Seravalli, 2007).

Dimitric-Markovic et al. (2001) realizaram um estudo da interação dos copigmentos

do cloreto de malvidina com ácidos orgânicos (caféico, ferúlico, sináptico, clorogênico e

tânico) com o propósito de elucidar a natureza da formação da copigmentação. Os resultados

confirmaram a presença de pontes de hidrogênio na estrutura dos copigmentos analisados e o

efeito significativo do pH do meio em que as reações de copigmentação foram realizadas. A

solução tampão de pH 2,5 mostrou-se mais efetiva na formação de pontes de hidrogênio mais

fortes dos copigmentos do que em solução tampão de pH 3,65, o que, provavelmente, é uma

conseqüência da maior estabilidade dessa estrutura nos meios mais ácidos.

A ação dos ácidos tânico e gálico, que possuem a capacidade de participar da reação

de copigmentação com as antocianinas, foi estudada na estabilidade de betacianinas de extrato

70% etanólico de beterraba vermelha (Beta vulgaris L.), nos valores de pH de 5 e 6,8,

temperatura de 25°C, ausência de luz e em presença de oxigênio. Constatou-se que o ácido

tânico e o ácido gálico promoveram um aumento significativo da estabilidade da cor do



28

pigmento betacianina em pH 5,00, sendo que o ácido tânico apresentou uma proteção mais

efetiva (Drunkler, Falcão & Bordignon-Luiz, 2004).

Vários estudos ainda são necessários para elucidar de que forma as condições de

processos influenciará nas transformações e degradação na composição bioativa de produtos

vegetais e hortículas.

3.3.3- Métodos de extração de fenólicos

A extração de compostos fenólicos em materiais vegetais é influenciada pela sua

natureza química, o método de extração empregado, o tamanho da partícula da amostra,

tempo e condições de armazenagem, bem como a presença de substâncias interferentes. A

natureza química dos compostos fenólicos varia de simples a altamente polimerizados,

incluindo proporções variáveis de ácidos fenólicos, fenilpropanóides, antocianinas, taninos e

outros (Naczk & Shahidi, 2004). Sendo assim, a escolha do método de extração é de grande

importância para a extração de corantes naturais (Patil et al., 2009).

A extração com solventes tem sido o método mais comum utilizado para extrair os

diversos compostos de frutas, incluindo os flavonóides (Castañeda-Ovando et al., 2009). Os

compostos fenólicos são geralmente extraídos a partir do fruto fresco, ou também, por

trituração, secagem ou liofilização do mesmo e posterior extração por solvente (Merken &

Beecher, 2000). As antocianinas, por possuir a característica polar, são solúveis em diferentes

solventes como etanol, metanol, acetona e água.

A escolha do método de extração deverá maximizar a recuperação do pigmento com

uma quantidade mínima de interferentes e uma mínima degradação ou alteração em seu

estado natural (Rodriguez-Saona & Wrolstad, 2001). Entre os métodos mais comuns

utilizados estão aqueles que utilizam etanol e metanol acidificados (Cacace & Mazza, 2003).

3.4- Oxidação e radicais livres

A oxidação nos sistemas biológicos ocorre devido à ação dos radicais livres no

organismo. Estas moléculas têm um elétron isolado, livre para se ligar a qualquer outro



29

elétron, e por isso são extremamente reativas. Elas podem ser geradas por fontes endógenas

ou exógenas. Por fontes endógenas, originam-se de processos biológicos que normalmente

ocorrem no organismo, tais como: redução de flavinas e tióis; resultado da atividade de

oxidases, cicloxigenases, lipoxigenases, desidrogenases e peroxidases; presença de metais de

transição no interior da célula e de sistemas de transporte de elétrons. Esta geração de radicais

livres envolve várias organelas celulares, como mitocôndrias, lisossomos, peroxissomos,

núcleo, retículo endoplasmático e membranas. As fontes exógenas geradoras de radicais livres

incluem tabaco, poluição do ar, solventes orgânicos, anestésicos, pesticidas e radiações

(Soares, 2002).

A oxidação é um dos processos responsável pela deterioração dos alimentos, pois pode

afetar a segurança alimentar, a cor, o sabor e a textura (Sánchez-Moreno, Larrauri & Saura-

Calixto, 1998). Os compostos fenólicos são antioxidantes primários que promovem a remoção

ou inativação dos radicais livres formados, através da doação de átomos de hidrogênio a estas

moléculas, interrompendo a reação em cadeia. Segundo o mecanismo de ação representado

pela Figura 3.9 (Ramalho & Jorge, 2006).

Em que: ROO· e R· – radicais livres; AH – antioxidante

com um átomo de hidrogênio ativo e A· – radical inerte

Figura 3.9: Mecanismo de ação para os antioxidantes primários.

3.4.1- Atividade Antioxidante

Os antioxidantes são agentes responsáveis pela inibição e redução das lesões causadas

pelos radicais livres nas células. Eles são capazes de interceptar os radicais livres gerados pelo

metabolismo celular ou por fontes exógenas, impedindo o ataque sobre os lipídeos, os

aminoácidos das proteínas, a dupla ligação dos ácidos graxos poliinsaturados e as bases do

DNA, evitando a formação de lesões e perda da integridade celular. Os antioxidantes obtidos



30

da dieta, tais como as vitaminas C, E e A, os flavonóides e carotenóides são extremamente

importantes na interceptação dos radicais livres (Bianch & Antunes, 1999). A utilização de

compostos antioxidantes encontrados na dieta é um dos mecanismos de defesa contra os

radicais livres que podem ser empregados na indústria de alimentos.

As características químicas dos antioxidantes, incluindo a sua solubilidade, a

capacidade de se regenerar, sua relação estrutura/atividade e sua biodisponibilidade são

fatores importantes a serem considerados quando é levada em consideração a saúde humana

(Kaur & Kapoor, 2001).

Dentre os fatores que podem afetar os níveis de atividade antioxidante e compostos

fenólicos totais em frutas estão à espécie, o tamanho e a textura dos frutos, a forma de

preparação das amostras e as condições de armazenagem. Neste contexto, Patthamakanolporn

et al. (2008) estudaram as mudanças na atividade antioxidante e nos compostos fenólicos

totais de frutas selecionadas (manga madura e verde, goiaba, mamão, banana e dois frutos

indígenas – makiang e maluod) durante 10 dias de estocagem sob refrigeração (4 – 6ºC). A

atividade antioxidante e o teor de compostos fenólicos foram avaliados em 0, 3, 6 e 10 dias de

estocagem. A banana e o mamão apresentaram diminuição gradativa da atividade

antioxidante, a manga, a goiaba e os frutos indígenas exibiram altos níveis de atividade

antioxidante e reduzida diminuição da mesma ao longo do período de estocagem, bem como o

teor de fenólicos totais.

A atividade antioxidante do vinho, do suco de uva e de alguns constituintes fenólicos

sintéticos (ácido caféico, ácido ferúlico, ácido gálico, quercetina, rutina, ácido tânico e

resveratrol) mais comumente encontrados nos mesmos, foi investigada por diferentes

métodos: o método de inibição da oxidação lipídica (ferro-tiocianato - FTC) e por seqüestro

do radical livre (2,2-difenil-1-pricrilhidrazil - DPPH), sendo os seguintes reagentes tomados

como referência, DL-α-Tocoferol e 3-terc-butil-4-hidroxianisole (BHA). As principais

diferenças entre os métodos utilizados, FTC e DPPH, respectivamente, foram o meio

reacional (emulsão oleosa versus meio hidroalcoólico) e o tempo de análise (96 h para atingir

o controle da oxidação para o primeiro método e menos de 3 h para o outro). Assim, a

inibição da oxidação lipídica obedeceu à seguinte ordem: rutina = ácido ferúlico > ácido

tânico = ácido gálico = resveratrol > BHA = quercetina > DL-α-Tocoferol > ácido caféico, e



31

essa disparidade deve-se a estrutura química de cada composto fenólico. Entretanto, a

atividade mais elevada de seqüestrar o radical livre DPPH foi a do ácido gálico, mostrando-se

intermediária para ácido tânico, ácido caféico, quercetina, rutina e BHA e baixa para o DL-α-

Tocoferol e resveratrol. O vinho apresentou uma maior atividade antioxidante do que o suco e

foram mais potentes para a capacidade de eliminação de radicais livres do que para a inibição

da oxidação lipídica. Por fim, os ácidos gálico e tânico mostraram uma eficiente atividade

antioxidante para ambos os métodos dentre todo o material analisado (Sánchez-Moreno,

Larrauri & Saura-Calixto, 1999).

Em estudo do efeito da temperatura de armazenamento sobre a capacidade

antioxidante, os fenólicos totais, as antocianinas e o teor de ácido ascórbico de morango,

framboesa e mirtilo, foi constatado uma correlação positiva da capacidade antioxidante com o

teor de compostos fenólicos e antocianinas. Já, o ácido ascórbico apresentou uma fraca

contribuição para a atividade antioxidante e isso foi devido a sua perda durante a estocagem

dos frutos (Kalt et al., 1999). Em outro estudo similar, este apenas com o mirtilo, foi

observado desempenho semelhante do ácido ascórbico sobre a atividade antioxidante,

ressaltando que reduções no teor de ácido ascórbico são geralmente observados após a

colheita, devido ao fato de ser antioxidante natural, envolvido em reações antioxidativas que

se processam durante a senescência dos frutos (Severo et al., 2009).

3.5- Inibição das enzimas α-amilase e α-glicosidase

Os carboidratos são moléculas complexas que constituem a classe de substâncias de

maior importância na dieta dos ocidentais. Entretanto, para que sejam aproveitados como

fonte de energia pelos seres vivos, os carboidratos precisam ser degradados em moléculas

menores, capazes de serem absorvidas pelo trato gastrintestinal. Diante de sua complexidade,

os carboidratos dependem de enzimas para sua degradação e posterior absorção, dentre elas as

α-amilases e α-glicosidases (Antunes, 2008).

Dos carboidratos ingeridos, em torno de 60% estão na forma de polissacarídeos,

principalmente amido e glicogênio, os quais têm que ser degradados em seus

monossacarídeos constituintes antes que possam ser usados com propósitos metabólicos. Esta



32

degradação é inicialmente realizada pela α-amilase, secretada pelas glândulas salivares e pelo

pâncreas, e completada pelas glicosidases intestinais (Shils et al., 2003).

As α-amilases são largamente distribuídas em microorganismos, plantas e secreções

animais e os produtos resultantes da sua ação sobre o amido são oligossacarídeos de vários

comprimentos de cadeia (Muralikrishna & Nirmala, 2005; Payan, 2004; Yoon & Robyt,

2003). Uma das enzimas responsáveis pela quebra de oligossacarídeos e dissacarídeos em

monossacarídeos é a α-glicosidase. A inibição dessas enzimas leva a uma diminuição do

nível de glicose no sangue, porque os monossacarídeos são a forma de hidratos de carbono

que é absorvida através da borda da mucosa do intestino delgado (Funke & Melzig, 2006).

A atividade dessas enzimas também está envolvida com a progressão da cárie e da

placa dentária, com a formação do pico de concentração de glicose pós-prandial e com a

velocidade do esvaziamento gástrico. Por isso, pesquisas no sentido de se conseguir uma

inibição efetiva de α-amilases e α-glicosidases têm sido direcionadas, dentre outras áreas, no

controle da hiperglicemia pós-prandial típica dos estágios iniciais do diabetes tipo 2 (Antunes,

2008; Kwon, Apostolidis & Shetty, 2008).

O termo diabetes mellitus descreve uma desordem metabólica de múltipla origem,

caracterizada pela hiperglicemia crônica com distúrbio de carboidratos, gordura e do

metabolismo de proteínas resultantes de defeitos na secreção de insulina, da ação da insulina,

ou ambos. Os efeitos do DM incluem danos em longo prazo, disfunção e falência de vários

órgãos. Existem duas formas de DM: o DMT1 inclui os casos que podem ser atribuídos a um

processo auto-imune ou pela destruição das células-β, ocasionando a não produção de

insulina; e o DMT2, que resulta na resistência à insulina (WHOC, 1999), tem seu

desenvolvimento caracterizado por um declínio progressivo na ação da insulina e deterioração

da função da célula β e, conseqüentemente, da secreção da insulina (Fonseca, 2009). O único

tratamento do DMT1 é a substituição de insulina. Já para o DMT2, muitas e diversas

estratégias terapêuticas são conhecidas. Os tratamentos convencionais incluem a redução da

demanda por insulina, estimulação da secreção de insulina endógena, o reforço da ação da

insulina nos tecidos-alvo e a inibição da degradação de oligo e dissacarídeos (Funke &

Melzig, 2006).



33

A hiperglicemia pós-prandial e sua cronicidade leva à glicolisação não-enzimática de

proteínas biológicas, com a formação irreversível de produtos finais de glicolisação (AGEs).

Este processo ocorre in vivo através da ligação covalente de grupos aldeído ou cetona ligado

aos açúcares redutores do grupo amina de proteínas, formando estruturas AGE de cor

castanho-amarelada e fluorescente. Os AGEs possuem a propensão para gerar espécies

reativas de oxigênio (ROs). Além disso, livres ou ligados a proteínas, podem sofrer auto-

oxidação e produzir radicais livres e outros intermediários oxidativos, como o H2O2 e outros

peróxidos, que também contribuem para a formação de AGEs (Wu, Yeh & Yen, 2010).

Uma investigação foi realizada em frutas nacionais e polpas congeladas, sobre a ação

de seus componentes bioativos na promoção da saúde: como possível fonte de antioxidante

natural, sua atividade anti-inflamatória e hipocolesterolêmica (relacionada a vitamina A, C e

E) e a presença de compostos fenólicos. As amostras analisadas mostraram-se fontes

satisfatórias de flavonóides e ácido elágico, com potente capacidade antioxidante e atividade

inibitória das enzimas α-amilase e α-glicosidase (Gonçalves, Lajolo & Genevese, 2010).

Pinto et al. (2008) investigaram a ação anti-hiperglicemia e anti-hipertensiva no uso

potencial de modelos in vitro de cultivares de morangos nacionais (Fragaria x ananassa

Duch.) e chegaram a conclusão que os morangos apresentaram uma satisfatória atividade de

inibição da enzima α-glicosidase, já a inibição da α-amilase mostrou-se baixa para todos os

cultivares de morango. É sabido que a inibição em excesso da α-amilase pode levar a não

digestão do amido no intestino delgado e isso acarretará distensão do estômago e conseqüente

desconforto. Assim, as cultivares de morango que apresentaram atividades inibitórias alta para

a α-glicosidase e baixa para a α-amilase são considerados candidatos potenciais para gerenciar

as fases iniciais da hiperglicemia.

Ranilla et al. (2010) investigaram a ação conjunta das enzimas α-amilase e α-

glicosidase em plantas medicinais, ervas e especiarias (temperos) da América latina. Algumas

delas, como a Chancapiedra (Phyllantus niruri L.), a Zarzaparrila (Smilax officinalis), a erva-

mate (Llex paraguayensis St-Hill) e a Huacatay (Tagetes minuta) apresentaram atividade

inibitória da α-glicosidase com nenhum efeito sobre a α-amilase. Todos os gêneros de

pimenta (Capsicum) analisados exibiram um bom potencial tanto para a ação anti-

hiperglicemica quanto para a ação anti-hipertensiva. Portanto, os produtos analisados



34

possuem um bom potencial para a prevenção da hiperglicemia e hipertensão associada ao

DMT2.

Capítulo 4: Materiais e Métodos

Capítulo 4: Materiais e métodos


36

4- Materiais e métodos

A presente pesquisa foi conduzida nos Laboratórios de Operações Unitárias, Sistemas

Particulados, Tecnologia de Alimentos, Engenharia Bioquímica (pertencentes ao

Departamento de Engenharia Química) e Química Analítica Qualitativa (pertencente ao

Departamento de Química), localizados na Universidade Federal do Rio Grande do Norte

(UFRN).

4.1- Materiais

4.1.1- Matéria-prima:

Os frutos do jambo vermelho (Syzygium malaccense) in natura foram provenientes da

cidade de Natal, Rio Grande do Norte, colhidos durante seu período de safra, entre os meses

de novembro de 2009 a março de 2010.

4.2- Metodologias

Foram empregadas duas estratégias para a obtenção do corante do jambo vermelho: A

estratégia 1 constituiu da extração sólido-líquido em reator enjaquetado com controle dos

parâmetros experimentais por planejamento composto central, e a estratégia 2, foi realizada

por desidratação em leito de jorro.

4.2.1- Estratégia 1: Obtenção do corante por extração sólido-líquido

As etapas desenvolvidas na estratégia 1 para se atingir o objetivo proposto neste

trabalho, encontram-se descritas no fluxograma apresentado na Figura 4.1.



37

Figura 4.1: Fluxograma da Estratégia 1.

As seguintes amostras foram submetidas à extração sólido-líquido do corante do

jambo vermelho (Figura 4.2):

Jambo

Casca Jambo inteiro sem caroço

Seleção

Extração em reator

Processador

Extrato A1: Produto A1’

Planejamento

Composto

Central

Planejamento

Composto

Central

Comparação

Processador

Extração em reator

Extrato A2: Produto A2’

Análises



38

• Amostra A1: casca;

• Amostra A2: jambo sem caroço.

Todas as amostras foram trituradas separadamente, acondicionadas em sacos plásticos

e refrigeradas até o momento de serem utilizadas.

Figura 4.2: Amostras preparadas para extração do corante. Fonte: Arquivo pessoal (2010).

As amostras A1 e A2 foram submetidas à extração em um reator enjaquetado (Figura

4.3) provido de um sistema com circulação de água e controle dos seguintes parâmetros:

temperatura, tempo e proporções variadas de solvente (H2O:EtOH) utilizado, segundo a

matriz planejamento experimental da Tabela 4.1. O sistema reacional era formado pelos

seguintes parâmetros fixos: 15 g da amostra em estudo (A1 e A2) e 12 rpm de agitação.

(A1) Casca

(A2) Jambo inteiro sem caroço



39

Figura 4.3: Aparato experimental da extração sólido-líquido. Fonte: Arquivo pessoal (2010).

Para inibir uma possível degradação da cor do corante causada pela incidência da luz

nas amostras, os tubos tipo falcon (Figura 4.3e) foram revestidos com papel alumínio.

4.2.1.1- Análise estatística

4.2.1.1.1- Delineamento estatístico

Um delineamento estatístico de Composição Central com pontos axiais foi escolhido

para investigar a linearidade ou não dos efeitos dos fatores: temperatura e tempo de extração,

relação entre os solventes, no conteúdo total de fenólicos (CFT), na atividade antioxidante

(AA) e na quantificação de antocianinas totais (AT). Cada fator foi testado em três níveis

(Tabela 4.1).

B C

(a) A- Reator enjaquetado;

B- Termopar;

C- Banho termostatizado.

(b) extração em andamento (c) filtração (d) extrato (e) protegido da luz

� � �

A



40

Tabela 4.1: Matriz Experimental do Planejamento Composto Central.

Fatores Níveis

-α -1 0 +1 +α

1: T (°C) 33,18 40 50 60 66,82

2: t (min.) 3,18 10 20 30 36,82

3: s (mL) 0,318/3 1/3 2/3 1/1 3,682/3

Ensaio Ordem 1 2 3

1 5 - - -

2 3 + - -

3 14 - + -

4 13 + + -

5 4 - - +

6 15 + - +

7 17 - + +

8 1 + + +

9 16 0 0 0

10 11 0 0 0

11 6 0 0 0

12 7 -α 0 0

13 12 +α 0 0

14 8 0 -α 0

15 2 0 +α 0

16 10 0 0 -α

17 9 0 0 +α

Um Planejamento Composto Central com k-fatores e três níveis requer 2k + 2k + C

experimentos, onde 2k pontos estão nos cantos do quadrado, representando a amplitude (o

domínio) do experimento. Os pontos axiais 2k estão numa distância codificada de ±1,41 (±α)

do centro do delineamento e medem a possibilidade da não linearidade nos valores obtidos

das respostas analisadas em função dos fatores. Os pontos C em replicatas no centro do



41

quadrado (ponto central) são uma estimativa do erro experimental (Calado & Montgomery,

2003; Teófilo & Ferreira, 2006; Barros Neto, Scarminio & Bruns, 2007). Assim,

considerando três fatores e três replicatas do ponto central, o planejamento envolveu 17

experimentos, executados em ordem aleatória.

4.2.1.1.2- Análise de Superfície de Resposta

A metodologia de superfície de resposta baseia-se na construção de modelos

matemáticos empíricos que geralmente empregam funções polinomiais lineares ou

quadráticas para descrever o sistema estudado e, conseqüentemente, dão condições de

explorar (modelar e deslocar) o sistema até sua otimização. Geralmente usam-se superfícies

de respostas quando as variáveis de resposta são influenciadas por muitas variáveis

independentes e o objetivo é aperfeiçoar a resposta (Calado & Montgomery, 2003).

A temperatura, o tempo e a relação entre solventes podem ser otimizadas

estatisticamente (Wijngaard & Brunton, 2010) se o valor de CFT, AA e AT for conhecido

como uma função dos fatores experimentais, gerando um modelo matemático. Um gráfico

dessa função produz a superfície de resposta para os fenólicos, a atividade antioxidante e o

teor de antocianinas, a qual é obtida aplicando-se regressões lineares múltiplas para os valores

obtidos em função dos fatores experimentais.

A superfície de resposta pode ser representada pelo modelo matemático apresentado

na Equação 4.1 (Calado & Montgomery, 2003; Teófilo & Ferreira, 2006; Barros Neto,

Scarminio & Bruns, 2007):

(4.1)



42

4.2.1.1.3- Avaliação do modelo

O modelo obtido pode não ser exatamente aquele que descreve a região estudada do

sistema e, neste caso, não pode ser usado para fazer estimativas para deslocamento e muito

menos para extrair conclusões sobre a região ótima. A maneira mais confiável de se avaliar a

qualidade do ajuste do modelo é empregando a análise de variância (ANOVA) (Teófilo &

Ferreira, 2006).

A análise de variância (Calado & Montgomery, 2003; Teófilo & Ferreira, 2006;

Barros Neto, Scarminio & Bruns, 2007) está resumida na Tabela 4.2.

Foi realizado teste estatístico de F para determinar a significância dos diferentes

modelos obtidos. Todas as análises e testes foram conduzidos utilizando o pacote estatístico

Statistica, versão 6.0 da Statsoft.

Tabela 4.2: Análise de variância para o ajuste do modelo matemático.

Fonte de

variação

Soma Quadrática N.º de g.l. Média Quadrática F

Regressão p – 1

Resíduos n – p

Falta de ajuste m – p

Erro puro n – m

Total n – 1

% de variação explicada:

% máxima de variação explicável:



43

4.2.2- Estratégia 2: Desidratação em secador leito de jorro

As etapas desenvolvidas para alcançar o objetivo aqui proposto estão descritas no

fluxograma da estratégia 2 apresentado na Figura 4.4.

Figura 4.4: Fluxograma da Estratégia 2.

Jambo

Casca Jambo inteiro sem caroço

Seleção

Secagem:

Produto B1

Processador

Comparação

Processador

Secagem:

Produto B2

Análises



44

Foi utilizada secagem em leito de jorro (Figura 4.5), segundo o método desenvolvido

por Medeiros et al. (2001) com algumas modificações, para obtenção das amostras

desidratadas (Figura 4.6). O sistema foi operado nas seguintes condições: pré-aquecido a 60°,

utilização de 2,5 kg de material inerte, velocidade do ar 1,8 m/s e temperatura a 60°C. A

secagem foi realizada em bateladas com aproximadamente 45 g da matéria-prima, durante 20

minutos.

Figura 4.5: Leito de jorro. Fonte: arquivo pessoal (2010).

As seguintes amostras desidratadas foram submetidas à extração sólido-líquido do

corante do jambo vermelho (Figuras 4.6):



45

• Amostra B1: casca;

• Amostra B2: jambo sem caroço.

Figura 4.6: Amostras preparadas para extração.

Fonte: Arquivo pessoal (2010).

A partir das amostras B1 e B2 foram elaborados cinco tipos de extratos: 1-aquoso, 2-

EtOH 50%, 3-EtOH 70%, 4-EtOH 80% e 5-EtOH 100%, totalizando 10 grupos

experimentais. Dentre estes, 5 grupos foram obtidos com a amostra B1 (casca desidratada:

B1H2O, B150%, B170% B180% e B1100%) e os outros 5 obtidos com a amostra B2 (jambo inteiro

sem caroço: B2H2O, B250%, B270%, B280% e B2100%).

Os extratos foram obtidos pelo método de extração seqüencial de Rufino et al. (2010),

com modificações, em três etapas distintas. Na primeira etapa 1 g do material desidratado foi

adicionado a 40 mL do solvente, mantido durante 20 minutos sob agitação magnética e

filtrado (Figura 4.7a). O material depositado no papel de filtro foi adicionado a 30 mL do

(B1) Casca desidratada

(B2) Jambo inteiro sem caroço desidratado



46

mesmo solvente, agitado, e, após 20 min de agitação o material foi novamente filtrado, sendo

essa a segunda etapa de extração (Figura 4.7b). Novamente o material depositado é

adicionado a 30 mL, agitado, e, após 20 min de agitação, filtrado e a terceira e última etapa de

extração é concluída (Figura 4.7c). Os filtrados das três etapas são homogeneizados (Figura

4.7d) e acondicionados em um recipiente protegido da luz.

Figura 4.7: Extração seqüencial. Fonte: Arquivo pessoal (2010).

4.3- Análise funcional dos produtos obtidos nas duas estratégias de

extração

4.3.1- Determinação do teor de Compostos Fenólicos Totais (CFT)

O teor de fenólicos totais presentes nos extratos obtidos foi determinado segundo a

metodologia descrita por Cheplik et al. (2010): 1 mL do extrato foi adicionado a 1 mL de

etanol 95%, a 5 mL de água destilada e 0,5 mL do reagente Folin-Ciocalteau (RFC). A

solução assim preparada foi homogeneizada e deixada em repouso durante 5 minutos. Após

este tempo foi adicionado à solução 1 mL de carbonato de sódio 5% e em seguida mantida em

+ + =

(a) 1ª extração (b) 2ª extração (c) 3ª extração (d) Extrato homogeneizado



47

câmara escura por 60 minutos. Na seqüência as amostras foram homogeneizadas novamente e

tiveram suas absorbâncias medidas no comprimento de onda de 725 nm contra branco

(solução etanólica 95%). Estas medidas têm a finalidade de expressar os resultados de CFT

em miligramas equivalentes de ácido gálico por 100 g da amostra. Para isto utilizou-se uma

curva de calibração construída a partir de diferentes concentrações de ácido gálico, como

mostra a Figura 4.8, com a finalidade de converter as absorbâncias obtidas das amostras.

Figura 4.8: Curva de calibração do ácido gálico utilizada para o cálculo da concentração de fenólicos totais.

4.3.2- Atividade antioxidante pelo seqüestro do radical DPPH •

A atividade antioxidante foi determinada através da capacidade dos antioxidantes

presentes nas amostras em seqüestrar o radical (1,1-difenil-2-pricrilhidrazil) DPPH• de acordo

com o método de Duarte-Almeida et al. (2006). Foi preparada uma solução metanólica de

0,004 g de DPPH em 100 mL de álcool metílico, de forma a apresentar absorbância a um

comprimento de onda de 517 nm.



48

As determinações foram realizadas adicionando-se em cada cavidade da microplaca

200 µL da solução de DPPH• e 40 µL de metanol para o controle e também para os extratos.

As leituras das absorbâncias foram realizadas após 30 minutos de reação em

espectrofotômetro de microplaca com incubação a 25°C.

O decaimento da absorbância das amostras (Aamostra) foi correlacionado ao decaimento

da absorbância do controle (Acontrole) resultando na porcentagem de seqüestro de radicais

livres (%SRL), que pode ser expressa através da Equação 4.2.

(4.2)

Uma curva de calibração (Figura 4.9) foi preparada com diferentes concentrações de

Trolox e os resultados foram expressos em µmoles equivalentes de Trolox/g de amostra.

Figura 4.9: Curva de calibração utilizada para o cálculo de atividade antioxidante pelo método DPPH.



49

4.3.3- Antocianinas totais: método do pH-diferencial

Seguindo o método de Giusti & Wrolstad (2001), cada amostra obtida dos 17 ensaios

do planejamento experimental e dos extratos obtidos do material desidratado foi diluída, tanto

em tampão cloreto pH = 1,0, quanto em tampão acetato pH = 4,5, de acordo com o valor do

fator de diluição previamente calculado (FD = 10). Assim, foram adicionados 1,8 mL de cada

tampão a 0,2 mL de extrato, homogeneizados em agitador vortex e deixados em equilíbrio a

temperatura ambiente e na ausência de luz por 30 minutos. Ao término desse período, a

absorbância foi medida no comprimento de onda do visível no qual a absorbância é máxima,

sendo de 510 nm para os extratos de jambo, e a 700 nm para corrigir o espalhamento de luz

produzido por uma possível turbidez da amostra. Foi utilizada H2O destilada como branco e

as medidas foram feitas em triplicatas para cada amostra.

Determinou-se a absorbância resultante (A) pela Equação 4.3 a partir das leituras das

soluções obtidas.

(4.3)

O cálculo da concentração das antocianinas nos extratos foi feito de acordo com a

Equação 4.4 abaixo:

(4.4)

Em que: C é a concentração de antocianinas em mg/L;

A é a absorbância calculada pela Equação 4.3;



50

FD é o fator de diluição utilizado;

MM é a massa molar do padrão;

ε é o coeficiente de absortividade molar do padrão;

b é o caminho óptico (espessura da cubeta utilizada para leitura no

espectrofotômetro).

O cálculo baseia-se na diferença dos valores de absortividade molar em pH = 1,0 e pH

= 4,5, o qual é diretamente proporcional à concentração de antocianinas, e leva em

consideração a cianidina-3-glicosídeo com massa molecular (MM) de 449,2 g/mol e

coeficiente de absortividade molar (ε) de 26.900 (Lee, Durst & Wrolstad, 2005).

4.3.4- Concentração do pigmento

Para a quantificação da concentração do pigmento foi empregada uma adaptação dos

métodos descritos por Barroso et al. (2005) e Xavier (2004). Onde, dois mL de cada extrato

foram previamente centrifugados e o sobrenadante teve sua absorbância medida no

comprimento de onda de 530 nm contra branco (água destilada).

A partir de diferentes concentrações do corante sintético vermelho-congo foi obtida

uma curva de calibração (Figura 4.10) e os resultados foram expressos em mg equivalentes de

vermelho-congo/mL de amostra.



51

Figura 4.10: Curva de calibração do corante vermelho-congo utilizada para o cálculo da concentração de pigmentos.

A determinação do comprimento de onda adequado para os extratos do jambo foi

obtida pela varredura espectrofotométrica, na região do visível, de dois extratos obtidos a

temperatura ambiente (um aquoso e outro 50% EtOH). O que indicou a presença de um

máximo de absorbância em 530 nm, conforme pode ser visto na Figura 4.11.



52

Figura 4.11: Varredura de espectro para o jambo vermelho.

4.3.5- Inibição das enzimas α-amilase e α-glicosidase

4.3.5.1- α-amilase

A inibição da atividade da enzima α-amilase foi determinada pelo método

cromogênico descrito por Ali, Houghton & Soumyanath (2006). Neste experimento, 40 µL do

extrato obtido do jambo vermelho, 160 µL de água destilada e 400 µL de amido foram

misturados em um tubo plástico com tampa. A solução controle foi preparada substituindo-se

o extrato por 40 µL do solvente utilizado na preparação do mesmo. Já o branco, consistiu da

substituição da solução enzimática (Amilase pancreática R Porcina – CE 3.2.1.1, do tipo VI)

por 200 µL de água destilada. Assim, adicionaram-se 200 µL da enzima e passados 3 minutos,

200 µL da mistura preparada foram removidos e adicionados em um tubo separado contendo

100 µL da solução de DNS. Os tubos foram colocados em banho-maria a 85°C por 15 min.

Ao término desse período, a mistura foi diluída em 900 µL de água destilada e foram retiradas

do banho-maria. A atividade da α-amilase foi determinada através da absorbância da mistura

em comprimento de onda 540 nm. A absorbância (A) devido à maltose gerada foi calculada

segundo a Equação 4.5.

(4.5)

A partir da absorbância líquida obtida, a percentagem de maltose gerada foi calculada

usando uma curva padrão de maltose, (Figura 4.12).

A percentagem de reação foi calculada segundo a Equação 4.6 e o percentual de

inibição foi obtido pela diferença (100 - % reação) após 3 minutos.

(4.6)



53

Figura 4.12: Curva de calibração da maltose utilizada para o cálculo do percentual de inibição da enzima α-amilase.

4.3.5.2- α-glicosidase

A atividade da enzima α-glicosidase foi determinada segundo o método modificado

por Ranilla et al. (2010) que consiste na preparação de 50 µL do extrato adicionado a 50 µL

de tampão fosfato de potássio (0,1 M e pH = 6,9) e a 100 µL da solução enzimática, com

incubação a 25°C. Passados 10 minutos, adicionaram-se 50 µL de 5 mM do reagente p-nitro-

fenil-α-D-glicopiranosidase. O segundo período de incubação foi de 5 minutos e a mesma

temperatura de 25°C. A solução controle consistiu na substituição do extrato por 50 µL do

tampão fosfato de potássio. As leituras das absorbâncias foram feitas a um comprimento de

onda de 405 nm.

Os resultados de inibição da enzima α-glicosidase foram expressos de acordo com a

Equação 4.7:



54

(4.7)

Capítulo 5: Resultados e

Discussão

Capítulo 5: Resultados e discussão


56

5- Resultados e discussão

Neste capítulo estão apresentados e discutidos os resultados obtidos para cada uma das

estratégias investigadas.

5.1- Estratégia 1: Estudo do extrato da casca e fruto inteiro do jambo sem caroço

A Tabela 5.1 apresenta os resultados experimentais para o Planejamento Composto

Central da casca e do jambo inteiro sem caroço. Os melhores resultados obtidos com as

amostras A1’ e A2’ em base seca e úmida foram respectivamente: 1371,22 mg GAE/100g MS

da amostra e 174,15 mg GAE/100 g para o teor de compostos fenólicos totais; 28,07 µmol

Trolox eq/g MS da amostra e 3,56 28,07 µmol Trolox eq/g para a atividade antioxidante e

1051,9 mg ci-3-gli/100 g MS e 133,59 mg ci-3-gli/100 g para a concentração de antocianinas

totais.

Os extratos do jambo inteiro (A2’) apresentaram, de maneira geral, resultados

inferiores em relação aos valores dos extratos da casca (A1’), isso se deve ao fato dos

pigmentos fenólicos estarem concentrados na casca do jambo vermelho.

Os resultados para CFT, AA e AT foram bastante expressivos quanto aos compostos

fenólicos e antocianinas totais, quando comparados a análise de outros autores, como

Kuskoski et al., (2006), que obtiveram valores de 897,6; 229,6; 118,9; 117,1; 136,8 e 132,1

em mg GAE/100 g para fenólicos totais e 596,4; 111,2; 41,8; 30,9; 22,8 e 23,7 mg/100g para

antocianinas totais em extratos etanólicos de frutos de baguaçu, jambolão e polpas congeladas

de amora, uva, açaí e morango. No entanto, a atividade antioxidante dos extratos da casca do

jambo mostrou-se inferior ao obtido anteriormente para os frutos do estudo mencionado

acima (111,2; 13,3; 4,3; 7,0; 6,9 e 9,2 µmoles/g, respectivamente).

A concentração de pigmento em extratos da casca do jambo (A1’) variou entre 26,40

a 41,57 mg/L e no jambo inteiro de 10,00 a 18,78 mg/mL (A2’). Em estudo realizado por

Xavier (2004), essa concentração variou de 1,8 a 9,8 mg/L para a cebola roxa, evidenciando

que a casca do jambo apresentou valores mais elevados, como também, os valores do jambo

inteiro.



57

Tabela 5.1: Resultados para extração dos pigmentos do jambo vermelho. Ensaio X1 X2 X3 CFTA1’ CFTA2’ AAA1’ AAA2’ ATA1’ ATA2’ CPA1’ CPA2’

1 60 (+) 30 (+) 1:1 (+) 1199,7 704,15 27,55 27,59 1051,9 391,80 41,57 18,78

2 50 (0) 36,82 (+α) 2:3 (0) 901,38 666,48 27,35 26,57 865,62 639,90 27,43 16,79

3 60 (+) 10 (-) 1:3 (-) 837,16 613,75 26,90 20,07 950,21 657,70 26,40 16,38

4 40 (-) 10 (-) 1:1 (+) 834,45 583,89 27,46 25,62 879,65 365,20 28,93 16,97

5 40 (-) 10 (-) 1:3 (-) 879,16 475,62 28,07 15,67 880,53 707,30 28,58 10,87

6 50 (0) 20 (0) 2:3 (0) 1050,15 530,04 26,84 28,22 987,03 346,10 36,48 10,99

7 33 (-α) 20 (0) 2:3 (0) 1371,22 477,06 27,27 29,83 872,64 293,30 28,86 10,00

8 50 (0) 3,18 (-α) 2:3 (0) 922,04 511,06 27,52 29,70 926,55 346,60 33,34 11,60

9 50 (0) 20 (0) 3,682:3 (+α) 728,30 531,68 25,14 28,26 720,60 248,90 27,38 12,81

10 50 (0) 20 (0) 0,318:3 (-α) 789,74 547,37 25,40 22,80 860,40 401,00 29,31 14,70

11 50 (0) 20 (0) 2:3 (0) 1026,62 542,31 26,95 29,79 981,77 368,10 37,29 10,71

12 66 (+α) 20 (0) 2:3 (0) 1114,99 585,84 27,29 26,27 912,52 252,80 34,49 11,60

13 60 (+) 30 (+) 1:3 (-) 994,98 613,47 27,04 26,12 984,84 507,50 33,18 12,90

14 40 (-) 30 (+) 1:3 (-) 804,12 554,59 26,43 24,65 907,70 472,00 28,36 13,03

15 60 (+) 10 (-) 1:1 (+) 976,42 636,63 27,39 25,74 930,93 399,90 37,18 14,58

16 50 (0) 20 (0) 2:3 (0) 1057,0 530,04 26,94 27,69 987,30 333,30 37,71 10,66

17 40(-) 30 (+) 1:1 (+) 902,95 583,61 26,27 27,20 767,45 420,50 32,85 13,33

Em que: X1 = temperatura (°C); X2 = tempo (minutos); X3 = proporção H2O/EtOH; CFT = compostos fenólicos totais (mg GAE/100g MS amostra); AA = atividade antioxidante (µmol Trolox eq/g MS amostra); AT= antocianinas totais (mg ci-3-gli/100 g MS) e CP = concentração de pigmento em equivalentes de vermelho-congo (mg/L).



58

Mané et al. (2007) investigaram a presença de fenólicos e antocianinas na casca e

polpa de diferentes cultivares de uvas por otimização mediante planejamento experimental.

Foram bem sucedidos, obtendo modelo matemático preditivo e significante estatisticamente.

A partir dos valores reais obtidos na extração foram calculadas as estimativas dos

efeitos, que correspondem aos parâmetros β dos modelos matemáticos de regressão (Tabela

5.2). A mesma tabela apresenta os parâmetros estatisticamente significantes (p 0,05) e os

cálculos da análise de variância (ANOVA) para os resultados da regressão, lembrando que os

espaços em branco dizem respeito aos efeitos que não apresentaram significância estatística.

Os valores dos coeficientes de correlação (R2) de cada modelo matemático gerado variaram

de 73,34 a 99,20% para os extratos do jambo vermelho e demonstram que os modelos

quadráticos que obtiveram correlação na faixa de 92,14 a 99,20% seriam adequados para

descrever as condições de extração empregadas. Os modelos que obtiveram correlação na

faixa de 73,34 – 80,10% demonstram a necessidade de modificação dos níveis dos parâmetros

de controle para as análises em que ocorreram moderadas correlações.

Para verificar a representatividade do modelo matemático, foi conduzida a análise de

variância e a análise estatística através da distribuição F, que apresentou valores de Fcalculado >

1 e Ftabelado < 1. Uma vez que os modelos propostos são válidos, as equações de regressão

permitem prever o efeito dos três parâmetros estudados sobre a extração dos pigmentos do

jambo vermelho. Assim sendo, o modelo matemático gerado pode ser usado para fins de

predição (Barros Neto, Scarminio & Bruns, 2007).

Calado & Montgomery (2003) destacam que uma das intenções de um planejamento

experimental é detectar a importância relativa dos efeitos e verificar a possibilidade de

eliminar fatores menos importantes. Assim, o termo linear β2 não foi importante para três das

análises realizadas: para o teor de fenólicos totais, para a concentração de antocianinas totais e

para a intensidade de coloração dos extratos da casca do jambo. O mesmo termo mostrou

irrelevância, nos extratos do jambo inteiro, para as análises da capacidade antioxidante e

antocianinas totais.

O parâmetro de maior significância para todas as análises em extratos do jambo

vermelho foi a relação proporcional dos solventes (H2O:EtOH) que apresentou relevância

para as interações lineares (β3) e quadráticas (β32), Tabela 5.2.



59

Tabela 5.2: Coeficientes dos modelos matemáticos para os termos significantes, coeficiente de correlação (R2) e o teste F para os ensaios de extração.

Constante CFTA1’ CFTA2’ AAA1’ AAA2’ ATA1’ ATA2’ CPA1’ CPA2’

β0 2778,24 - 38,7317 - 718,571 1373,178 - 24,4573

β1 -81,90 1,8396 -0,3576 - 7,677 - 1,0672 -

β12 0,66 - 0,00240 - - - -0,0140 -

β2 - -5,3521 -0,34594 - - - - -1,0020

β22 -0,51 - 0,00295 - - 3,458 -0,0186 0,0207

β3 890,34 56,7532 1,92894 46,4544 218,591 -932,69 - -10,4148

β32 -1125,6 - -4,23346 -15,7947 -454,236 259,730 -23,2022 11,2190

β12 0,48 - 0,00391 - 0,301 - - 0,0028

β13 10,90 - 0,06639 - - - 0,5354 -0.0868

β23 7,84 - - - - 18,207 - -

R2 99,20 80,10 92,14 95,74 94,80 96,30 76,71 73,34

Fcalculado 2,76 2,69 3,408 11,64 3,93 22,30 1,70 1,06

Ftabelado 0,8811 0,1313 0,83 0,036 0,186 0,1413 0,051 0,24

CFT, AA , AT e CP, sendo, respectivamente, compostos fenólicos totais, atividade antioxidante, antocianinas totais e concentração de pigmentos

para a casca (A1’) e jambo inteiro sem caroço (A2’).



60

5.1.1- Análise de Superfície de Resposta e Diagrama de Pareto

5.1.1.1- Teor de Compostos Fenólicos Totais

As superfícies de resposta (ASR) (Figuras 5.1a1, 5.1b1, 5.1c1 e 5.1d1) representam

tridimensalmente a relação entre as variáveis dependentes (CFT) e independentes

(temperatura versus tempo e temperatura versus solvente). As curvas de nível (CN) (Figuras

5.1a2, 5.1b2, 5.1c2 e 5.1d2) fornecem a análise da tendência de resposta da variável dependente.

Cada linha tem um mesmo valor da variável de resposta. Quando essas linhas não têm

curvatura, pode-se dizer que não há efeito de interação entre as variáveis colocadas nos eixos

(Calado & Montgomery, 2003).

As superfícies apresentadas para os extratos da casca evidenciam uma boa interação

entre a temperatura e tempo de extração (Figura 5.1a1 e 5.1a2), onde observaram-se duas

zonas com bons resultados a temperatura e tempo elevados. Porém os resultados para a

interação entre os parâmetros temperatura de extração e concentração de solvente foram mais

relevantes (Figura 5.1b1 e 5.1b2). Foram obtidos ótimos resultados em T menores e a relação

de solvente numa faixa média (0,4 – 0,8) e bons resultados na faixa de 0,2 a 1,0. Observa-se,

por exemplo, máxima extração a temperatura de 50ºC com 2 H2O/3 EtOH (v/v), ou seja,

1371,22 mg GAE/100g MS amostra, presentes no ensaio de número 7.

As Figuras 5.11c1 e 5.11d1, para as superfícies de respostas, e as 5.11c2 e 5.11d2, para

as curvas de nível, geradas pelos modelos de regressão reproduz os resultados das condições

de extração do jambo inteiro sem o caroço. Constata-se que as faixas ótimas de trabalho para

determinação dos fenólicos totais estão entre 50 a 60 °C, intervalos de tempo de 25 a 30

minutos e relação entre solventes 1 H2O:1 EtOH (v/v). Apresentando, de um modo geral,

melhores resultados em T e t maiores (relação T vs t) e em T elevadas com maior diluição do

EtOH (T vs S). Ou seja, ótimos resultados também para T maiores e relação de solvente entre

0,5 e 1,1.

Estudos realizados sobre a relação entre a presença de compostos fenólicos e o

desempenho da capacidade de seqüestro de radicais livres mostram divergências. Há casos de

relação positiva, como a encontrada em casca de arroz (Lee et al., 2003), outros demonstram

haver uma relação moderada e há casos de baixa correlação.


Juliana Chrís Silva de Azevêdo, dezembro/2010 61

Em que: (a1) ASR e (a2) CN para a interação entre os parâmetros T vs t; (b1) ASR e (b2) CN para a interação entre os parâmetros S vs t para a casca. (c1) ASR e (c2) CN para a interação entre os parâmetros T vs t; (d1) ASR e (d2) CN para a interação entre os parâmetros S vs t para o jambo inteiro.

Figura 5.1: Superfície de resposta e curvas de níveis para os compostos fenólicos totais do jambo vermelho.

(a1)

(a2)

(c1)

(c2) (b2)

(b1) (d1)

(d2)



Para análises em hortaliças, como tomate e cebola roxa, por exemplo, foi observada

uma baixa relação entre os constituintes fenólicos e a propriedade antioxidante (Melo et al.,

2006).

Os diagramas de Pareto (Figura 5.2) demonstram os valores dos efeitos das diversas

variáveis sobre a resposta para 95% de confiança (p < 0,05) (Rodrigues & Iemma, 2005).

(e1) casca e (e2) jambo inteiro.

Figura 5.2: Diagrama de Pareto para o teor de compostos fenólicos totais.

Na Figura 5.2e1, para os extratos da casca, os valores - 26,05 e - 10,63 observados para

as variáveis s(Q) e t(Q), respectivamente, indicam que quanto maior for a diluição da solução

etanólica e o tempo de extração, menor seria a concentração de fenólicos totais (CFT).

(e1)

(e2)



Entretanto, os valores para a temperatura (13,77), as interações entre T vs t (8,50), T vs S

(6,98), t vs S (4,58) influenciaram positivamente no teor de CFT para a casca de jambo

vermelho.

Para os extratos do jambo inteiro o diagrama de Pareto (Figura 5.12e2) aponta efeitos

relevantes para temperatura (6,57994), tempo (4,844676) e solvente (4,447915). É visível que

os parâmetros empregados ao sistema de extração convencional foram mais atuantes para os

extratos da casca.

De acordo com Halliwell (1996), as ações defensivas de antioxidantes naturais em

frutas e vegetais estão relacionadas à presença de ácido ascórbico e fenólicos como

antioxidantes hidrofílicos e carotenóides como antioxidantes lipofílicos. Isso explica, em

parte, a atuação conjunta dos diferentes constituintes que compõem uma fonte de antioxidante

natural.

5.1.1.2- Atividade antioxidante

Na análise das superfícies e curvas de nível geradas, a interação entre temperatura e

tempo (Figura 5.3f1 e 5.3f2) não favoreceu a atividade antioxidante dos extratos obtidos da

casca do jambo e o aumento do tempo de extração não contribuiu para a manutenção da

atividade antioxidante dos extratos. A interação entre T e t foi de baixa significância

mostrando uma pequena região de bons resultados (Figura 5.3f1 e 5.3f2), para temperatura e

tempo menores. Já a interação entre o solvente e a temperatura (Figura 5.3g1 e 5.3g2)

apresentou melhor desempenho no que diz respeito à atividade antioxidante medida pelo

método DPPH em toda faixa de temperatura avaliada. Os resultados ótimos, no entanto, estão

na faixa de T entre 30 e 37°C e relação entre solventes de 0,1 e 0,9 e na faixa de T entre 60 e

65°C e solvente de 0,5 e 1,0.

As Figuras 5.3h1, 5.3h2, 5.3i1 e 5.3i2 mostram a tendência dos resultados obtidos para o

jambo inteiro, bem como a região onde sua atuação é abrangente. As superfícies geradas

apresentaram grandes regiões significativas para a interação da temperatura com o tempo e o

solvente, com destaque para a faixa de T entre 38 e 60ºC e t entre 15 e 38 minutos e solvente

entre 0,6 e 1,2. A partir das superfícies geradas é possível observar que a ação antioxidante é

mais atuante no fruto inteiro do jambo vermelho.



64

Em que: (f1) ASR e (f2) CN para a interação entre os parâmetros T vs t; (g1) ASR e (g2) CN para a interação entre os parâmetros S vs t para a casca. (h1) ASR e (h2) CN para a interação entre os parâmetros T vs t; (i1) ASR e (i2) CN para a interação entre os parâmetros S vs t para o jambo inteiro.

Figura 5.3: Superfície de resposta e curvas de nível para atividade antioxidante do jambo vermelho.

(g1)

(g2) (f2)

(f1)

(h1)

(h2)

(i1)

(i2)



É provável que a formação de produtos de escurecimento não enzimático possa

influenciar na coloração final dos pigmentos extraídos e em suas propriedades. Alguns

trabalhos relatam a geração e o acúmulo de melanoidinas, derivadas da reação de Maillard, as

quais podem ter certo grau de atividade antioxidante e com isso melhorar as propriedades

antioxidantes em processos a altas temperaturas, como, por exemplo, a 80 e 90 º C (Que et al,

2008; Miranda et al., 2009).

Assim como acontece com os compostos fenólicos, a capacidade antioxidante dos

extratos da casca do jambo sofreu diminuição devido ao emprego de temperaturas superiores

a 60ºC. Sobre esse assunto, há estudos que relatam tanto ação desfavorável quanto favorável

ao uso de altas temperaturas no processamento de matérias-primas de origem vegetal. Isso se

deve, provavelmente, à presença de diferentes constituintes bioativos do alimento, tipo de

extração, solventes empregados e estruturas químicas (Miranda et al, 2009).

Apesar disso, é importante destacar que a utilização de tempos relativamente curtos

associados a temperaturas de moderadas a altas, parece levar à melhores resultados em

análises de fenólicos totais e atividade antioxidante. Foi observado previamente que o

emprego da combinação entre 0, 2, 4 e 6 minutos a 70ºC para análise dos teores de fenólicos

totais, atividade antioxidante e antocianinas totais em extratos de uvas Isabel (Vittis labrusca)

e Refosco (Vittis vinifera L.) foi efetivo na preservação da cor antociânica e das propriedades

dos fenólicos totais avaliados, sendo uma delas a sua capacidade antioxidante (Falcão et al.,

2007).

A utilização do etanol como solvente em aplicações analíticas na indústria alimentícia

é freqüente. Monrad et al. (2010) compararam o uso de diferentes sistemas solventes na

extração de procianidinas de bagaço seco de uva “Sunbelt” (Vitis labrusca L.) a diferentes

temperaturas (40, 60, 80, 100, 120 e 140°C). Um dos sistemas utilizou etanol em seis

diferentes diluições (EtOH/H2O 0, 10, 30, 50, 70 e 90% v/v) e o outro sistema foi constituído

de acetona/água/ácido acético a 70:29,5:0,5% v/v. De uma maneira geral, os autores

observaram que o sistema constituído por 50% etanol/água foi capaz de extrair mais

procianidinas, alcançando teor total de até 115% superior. Além disso, etanol a 50%, em

temperaturas entre 80 e 140°C apresentou melhores resultados na obtenção de outros

constituintes, como epicatequina, catequina e dímeros. Assim, concluíram que a extração



acontece de maneira mais eficiente usando a relação 50% EtOH/H2O (v/v) a 80, 100, 120 e

140°C de temperatura otimizada.

O Diagrama de Pareto (Figura 5.4j1), igualmente como o observado para o CFT em

extratos da casca do jambo, revela que o efeito quadrático do solvente (- 25,96) e linear do

tempo (- 12,52) influenciaram negativamente na atividade antioxidante. Constata-se, no

entanto, efeitos positivos para a interação entre T e t, o t (Q), T(Q) e entre T e S.

Para extração dos constituintes antioxidantes do jambo inteiro, foi apenas o solvente,

influenciando tanto positivamente (7,10266) quanto negativamente (- 5,3952) nos resultados

finais que indicou uma maior relevância (Figura 5.4j2).

(j1) casca e (j2) jambo inteiro.

Figura 5.4: Diagrama de Pareto para atividade antioxidante.

(j1)

(j2)



5.1.1.3- Antocianinas totais

As superfícies de resposta geradas, auxiliadas pelas curvas de contorno, para o estudo

da concentração de antocianinas totais na casca do jambo mostram uma ampla região de

atuação do processo de extração empregado (Figuras 5.5k1, 5.5k2, 5.5l1 e 5.5l2). Já para o

jambo inteiro, o uso de temperatura de moderada a alta, dentro da faixa estudada, em

associação a curto tempo de extração, leva a região ótima de extração e, conseqüentemente,

diminuição do tempo de extração e aumento de produção do processo (Figuras 5.5m1 e

5.5m2). Ribeiro & Seravalli (2007), por exemplo, recomendam o uso de tratamento HTST

(“high temperature short time”) para uma melhor retenção do pigmento. Falcão et. al. (2007)

observaram, anteriormente, aumento no teor de antocianinas em extratos de uva a condições

em alta temperatura (70ºC). Os autores sugerem que isso ocorre porque o aumento da

temperatura auxilia a transferência dos pigmentos das cascas de uvas para o ‘mosto’, bem

como, auxilia a inativação de enzimas que degradam as antocianinas, preservando-as.

Observa-se também que tanto as interações entre T vs t quanto entre T vs S foram

efetivas na extração dos pigmentos antociânicos presentes na casca (Figura 5.5k1, 5.5k2, 5.5l1

e 5.5l2), apresentando uma vasta região favorável. Para extratos do jambo inteiro a relação

entre temperatura e solvente é favorecida por uma menor diluição do EtOH em água, ou seja,

a adição de um maior volume de água resultou em menor concentração de pigmentos (Figuras

5.5n1 e 5.5n2).

Ao compararmos os teores de antocianinas totais aqui obtidos (variaram de 248,9 –

1371,22 mg/100g MS e em base úmida, respectivamente, 174,15 – 84,17 mg/100g), observa-

se que os valores são comparáveis a resultados existentes na literatura. Malacrida & Motta

(2006) falam em conteúdo de 30 a 750 mg/100 g em uvas tintas maduras. Em uvas das

variedades Carbenet Franc, Merlot e Pinot Noir as concentrações médias variam de 994 a

1162; 1071 a 1165; 662 a 852 mg/100g, respectivamente (Mazza et al., 1999).

Lee et al. (2003) citam que, geralmente, as camadas externas das plantas, como a

casca, contêm grandes quantidades de compostos fenólicos para proteger o material interno.

Longo & Vasopollo (2006) estudaram a presença de antocianinas na casca de bagas de Smilax

aspera L., um arbusto rasteiro típico da região do Mediterrâneo, em que foram extraídos os

pigmentos e, do total de antocianinas obtidas 83% eram de pelargonidina-3-rutinosídeo.



Em que: (k1) ASR e (k2) CN para a interação entre os parâmetros T vs t; (l1) ASR e (l2) CN para a interação entre os parâmetros S vs t para a casca. (m1) ASR e (m2) CN para a interação entre os parâmetros T vs t; (n1) ASR e (n2) CN para a interação entre os parâmetros S vs t para o jambo inteiro.

Figura 5.5: Superfície de resposta e curvas de nível para antocianinas totais do jambo vermelho.

(l1)

(l2)

(k1)

(k2)

(m1)

(m2)

(n1)

(n2)



O diagrama de Pareto (Figura 5.6o1), para o teor de antocianinas da casca, mostra

influência negativa do solvente, tanto a parte linear (- 5,42) quanto à quadrática (- 10,34) do

modelo matemático, indicando que quanto mais diluído o etanol em H2O, menor será o teor

de AT nos extratos finais. Há, também, uma importante influência da T (9,08), seguida da

interação entre T e t (5,19).

O diagrama (Figura 5.6o2) para os extratos do jambo inteiro revela a contribuição do

solvente, tanto negativa (- 15,7194) quanto positiva (5,504), ao processo de extração

empregado e as contribuições positivas do fator quadrático tempo (8,7429) e do fator linear da

interação entre tempo e solvente ao sistema (8,685).

(o1) casca e do (o2) jambo inteiro.

Figura 5.6: Diagrama de Pareto para antocianinas monoméricas totais.

(o1)

(o2)



Teixeira, Stringheta & Oliveira (2008) avaliaram pelo método do pH diferencial, dez

fontes como matrizes antociânicas (casca de berinjela (Solanum melongena) e jabuticaba

(Myrciaria jaboticaba), polpa de repolho roxo (Brassica oleraceae), casca e polpa de

sabugueiro (Sambucus negra), morango (Fragaria ssp), Maria-pretinha (Solanum

americanum), açaí (Euterpe oleracea), romã (Punica granatum), pétalas de hibisco (Hibiscus

rosa-sinensis) e inflorescência de capim-gordura (Mellins minutiflora)) e sua viabilidade de

emprego como aditivo bioativo. Verificaram que a casca de jabuticaba, as pétalas de hibisco e

a casca e polpa de sabugueiro apresentaram maior conteúdo de antocianinas (p < 0,05) dentre

os substratos estudados (641,01; 229,75; 221,45 mg/100 g, respectivamente), sendo

consideradas fontes de elevado teor do pigmento.

Estudo com acerolas de diferentes regiões do Brasil mostrou teores de antocianinas

entre 3,79 e 59,74 mg/100 g (Lima et al., 2003). Os resultados para a concentração do

pigmento na casca do jambo variaram, em unidade de massa úmida, numa faixa de 97,46 a

133,59 mg/100g e para o jambo inteiro variaram de 29,61 a 84,17 mg/100 g, sendo, portanto,

inferiores ao primeiro estudo citado e superiores ao segundo.

5.1.1.4- Concentração de pigmentos

A concentração dos pigmentos dos extratos obtidos para a casca apresenta tendências

similares às observadas para o teor de antocianinas totais, o que é esperado, uma vez que

quanto mais intensa a coloração, maior a quantidade de pigmentos presentes nas amostras

(Barroso et al., 2005). De maneira semelhante ao que foi observado para as antocianinas, as

condições ótimas de extração para os pigmentos foram alcançadas mediante extração a

temperatura de 60ºC, 30 minutos e relação EtOH/H2O 1:1 (Figura 5.7).

Observando as superfícies de respostas (Figura 5.7p1, 5.7p2, 5,7q1 e 5,7q2) obtidas para

a casca é visto que o modelo gerado compreende uma extensa área do conjunto de ensaios

executados. Por exemplo, foi detectado que o emprego de um tempo de extração médio

maximiza a extração de pigmentos em grande intervalo de temperatura avaliado (Figuras

5.17p1 e 5.17p2). Na interação entre temperatura e solvente (Figuras 5.17q1 e 5.17q2),

observam-se pelas curvas de nível que quanto mais diluído o EtOH melhores resultados eram

obtidos e, por conseguinte, as condições ótimas de extração.



Em que: (p1) ASR e (p2) CN para a interação entre os parâmetros T vs t; (q1) ASR e (q2) CN para a interação entre os parâmetros S vs t para a casca. (r1) ASR e (r2) CN para a interação entre os parâmetros T vs t; (s1) ASR e (s2) CN para a interação entre os parâmetros S vs t para o jambo inteiro.

Figura 5.7: Superfície de resposta e curvas de nível para concentração de pigmento do jambo vermelho.

(p1)

(p2)

(q1)

(q2)

(r1) (s1)

(r2) (s2)



71

As superfícies e curvas geradas (Figura 5.7r1, 5.7r2, 5.7s1 e 5.7s2) para o jambo inteiro

apresentam semelhança com as obtidas para as antocianinas totais. Entretanto, diferentemente

do que ocorreu nos ensaios da casca, às condições ótimas de extração diferiram para a

quantificação de antocianinas e concentração de pigmentos do jambo inteiro sem caroço. As

condições ótimas do processo foram 40ºC, 10 minutos e 1 H2O/3 EtOH para AT e 60ºC, 30

minuto e 1 H2O/1 EtOH para CP. Existem alguns possíveis motivos para que isso ocorra: a

presença de diferentes constituintes que podem desencadear reações químicas que

influenciam diretamente no produto final obtido, como degradação pela presença de

copigmentos, o pH do meio, a presença de íons metálicos e outros fatores (Mazza, 1997).

O diagrama de Pareto (Figura 5.8t1) para extratos da casca mostra contribuição

negativa do solvente (-13,8435), da temperatura (- 7,51715) e tempo de extração (- 9,96648),

todos da parte quadrática do modelo. Isso se deve, possivelmente, à região que ultrapassou as

condições ótimas de extração, que são superiores a 60°C, 30 minutos e 1:1 da relação de

solvente, ocorrendo a degradação dos pigmentos antociânicos. Tal fato, ao contrário de

provocar a perda de cor do pigmento, pode provocar seu escurecimento (Giusti & Wrolstad,

2001). Araújo (2008) afirma que os pigmentos são degradados em temperatura acima de

60°C, ocorrendo hidrólise da ligação 3-glicosídica, liberando a aglicona, e conseqüentemente

gerando compostos escuros insolúveis de natureza polifenólica. A degradação das

antocianinas frente à degradação térmica aumenta com a diminuição do pH e ausência de

oxigênio.

Os demais parâmetros significativos para a casca foram: temperatura (12,57008),

relação de solvente (9,015163) e a interação entre temperatura e solvente (8,07731), sendo

todos termos lineares.

O diagrama de Pareto para o jambo inteiro (Figura 5.8t2) mostra que todos os

parâmetros significantes exercem efeito positivo sobre a concentração de pigmentos, sendo

eles tempo, solvente e temperatura. A única exceção foi o efeito de interação entre

temperatura e solvente (- 4,60608).



72

(t1) casca e do (t2) jambo inteiro.

Figura 5.8: Diagrama de Pareto para concentração dos pigmentos.

5.1.1.5- Inibição das enzimas α-amilase e α-glicosidase

A Tabela 5.3 mostra os resultados de inibição das enzimas α-amilase e α-glicosidase.

Segundo Gonçalves, Lajolo & Genevese (2010), moderadas inibições de α-amilase associada

a elevada inibição de α-glicosidase seria a condição mais favorável para utilização como fonte

de controle da hiperglicemia pós-prandial. Baseado nisso, os melhores valores encontrados

foram, respectivamente, 29,62 e 98,98% no ensaio 3 para a casca do jambo e 22,40 e 96,31%

no ensaio 2 para o jambo inteiro. Altas inibições de α-amilase não são favoráveis, pois podem

provocar distensões abdominais e desconfortos intestinais no organismo humano (Murai et al,

2002; Kwon, Vattem & Shetty, 2006), uma vez que promovem a interrupção da hidrólise de

(t1)

(t2)



73

polissacarídeos durante a digestão, principalmente por retardar a quebra de dissacarídeos em

monossacarídeos, em particular a glicose (Abesundara, Matsui & Matsumoto, 2004).

Tabela 5.3- Resultados da extração dos pigmentos do jambo vermelho para inibição enzimática.

Ensaio %I α-amilaseA1’ %I α-glicosidaseA1’ %I α-amilaseA2’

%I α-glicosidaseA2’

1 35,40 ± 0,050 98,68 ± 0,028 38,62 ± 0,045 95,24 ± 0,021

2 42,34 ± 0,055 99,16 ± 0,027 22,40 ± 0,057 96,31 ± 0,030

3 29,62 ± 0,020 98,98 ± 0,032 29,06 ± 0,049 95,02 ± 0,042

4 39,81 ± 0,027 99,31 ± 0,030 50,85 ± 0,019 87,05 ± 0,044

5 37,14 ± 0,035 99,27 ± 0,026 37,47 ± 0,017 92,17 ± 0,032

6 31,76 ± 0,083 98,98 ± 0,046 42,02 ± 0,013 99,46 ± 0,049

7 43,37 ± 0,015 98,99 ± 0,048 42,29 ± 0,050 98,50 ± 0,043

8 35,39 ± 0,012 98,39 ± 0,027 26,30 ± 0,040 97,47 ± 0,030

9 36,70 ± 0,019 96,21 ± 0,036 38,04 ± 0,022 97,79 ± 0,029

10 36,49 ± 0,046 78,89 ± 0,052 41,67 ± 0,084 90,05 ± 0,049

11 39,02 ± 0,069 98,75 ± 0,050 36,94 ± 0,009 98,95 ± 0,038

12 35,81 ± 0,005 98,73 ± 0,019 42,70 ± 0,034 98,17 ± 0,029

13 40,14 ± 0,039 98,99 ± 0,032 37,37 ± 0,028 97,82 ± 0,055

14 36,71 ± 0,050 99,25 ± 0,034 34,61 ± 0,043 97,17 ± 0,024

15 35,28 ± 0,018 98,63 ± 0,029 35,53 ± 0,033 96,88 ± 0,028

16 31,21 ± 0,013 98,84 ± 0,036 42,25 ± 0,036 99,26 ± 0,025

17 32,35 ± 0,022 98,98 ± 0,048 34,01 ± 0,016 97,41 ± 0,021

%I α-amilaseA1’ = porcentagem de inibição da α-amilase;

%I α-glicosidaseA1’ = porcentagem de inibição da α-glicosidase;

%I α-amilaseA2’ = porcentagem de inibição da α-amilase;

%I α-glicosidaseA2’ = porcentagem de inibição da α-glicosidase. Média ± DP, p < 0,05.



74

Ali, Houghton & Soumyanath (2006) estudaram as propriedades inibitórias de seis

plantas da Malásia (Phyllanthus amarus, Anacardium occidentale, Lagerstroemia speciosa,

Averrhoa bilimbi, Pithecellobium jiringa and Parkia speciosa), com conhecida utilidade no

tratamento contra a diabetes. Constataram que a Phyllanthus amarus foi a única que

apresentou 24,3% de inibição efetiva a α-amilase.

Pinto et al. (2010) investigaram o potencial uso de cranberry (Vaccinium

macrocarpon), fruta vermelha popular dos Estados Unidos, em terapia de controle da

hiperglicemia e hipertensão arterial associado ao DMT2, uma vez que fontes naturais têm

demonstrado um menor efeito inibitório da α-amilase contra uma forte inibição da α-

glicosidase e efeitos colaterais mínimos. Os autores obtiveram percentuais de inibição de

21,69% e 90% para a inibição da α-amilase e α-glicosidase, respectivamente, e creditam estes

bons resultados a presença de constituintes fenólicos. Dessa forma, concluíram que o

cranberry pode ser considerado uma fonte eficaz no gerenciamento dos estágios iniciais da

hiperglicemia associada ao DMT2.

Cheplick et al. (2010) realizaram investigações in vitro em extratos aquosos e

etanólicos de cultivares de morango (Honeoye, Jewel, Seneca, Sparkle, N’Easter, Ovation,

Tristar, Cavendish, Mira, Eros, Florence, DarSelect, Idea e Lambada), quanto à inibição das

enzimas α-amilase e α-glicosidase. Os autores obtiveram percentuais de inibição a α-amilase

de cerca de 50% para extratos etanólicos nas cultivares Honeoye, Idea e Jewel. A ação mais

efetiva a α-amilase foi de 15% para extratos aquosos de Sparkle. Para a α-glicosidase houve

melhor inibição nos extratos etanólicos, com atividade inibitória para Ovation de 71% em

extrato aquoso e 97% em extrato etanólico, por exemplo.

Dessa forma, os resultados obtidos em relação à inibição das enzimas α-amilase e α-

glicosidase neste estudo motivam futuras pesquisas in vivo quanto ao uso de extratos de

jambo no controle da hiperglicemia pós-prandial, associada aos estágios iniciais do diabetes

tipo 2. Vale ressaltar que o uso dos compostos bioativos não poderia, a priori, significar

tratamento da doença, mas sim uma ferramenta para uma melhor convivência com esse tipo

de enfermidade.



75

5.2- Estratégia 2: Estudo do extrato da casca e fruto inteiro sem caroço desidratados

As amostras B1 e B2 foram obtidas mediante secagem em leito de jorro, da casca e do

jambo inteiro, respectivamente, a 60ºC por 20 minutos. O teor de compostos fenólicos totais,

atividade antioxidante e antocianinas monoméricas totais estão apresentados nas Tabelas 5.4

(resultados em base úmida e em base seca).

Tabela 5.4: Valores experimentais para o produto desidratado.

CFT1 CFT2a AA1 AA2

b AT1 AT2c

B1H2O 721,06 ± 0,013 796,31 25,05 ± 0,022 27,67 618,42 ± 0,033 683,00

B150% 1024,22 ± 0,01 1131,10 26,19 ± 0,029 28,90 1193,41 ± 0,084 1317,90

B170% 818,02 ± 0,034 903,40 28,20 ± 0,023 31,15 939,03 ± 0,026 1037,03

B180% 790,13 ± 0,010 872,60 28,40 ± 0,021 31,36 822,70 ± 0,019 908,56

B1100% 650,13 ± 0,018 718,60 28,28 ± 0,045 31,23 557,74 ± 0,017 615,95

B2H2O 435,50 ± 0,003 479,60 24,35 ± 0,029 26,81 156,41 ± 0,007 172,25

B250% 595,55 ± 0,007 655,90 27,49 ± 0,027 30,27 387,97 ± 0,018 427,28

B270% 557,03 ± 0,002 613,47 26,86 ± 0,029 29,60 484,82 ± 0,012 534,00

B280% 532,46 ± 0,007 586,40 29,03 ± 0,017 32,00 475,36 ± 0,029 523,52

B2100% 425,20 ± 0,012 468,30 22,15 ± 0,019 23,30 296,68 ± 0,032 326,74

CFT = (mg GAE/100 g amostra); AA = (µmol Trolox eq/g amostra); AT= (mg ci-3-gli/100

g). Onde: 1 = resultados em base úmida e 2 = resultados em base seca. Em: a, b e c os

mesmos desvios padrões dos valores em base úmida.

B1H2O = extrato aquoso, B150% = extrato 50% EtOH, B170% = extrato 70% EtOH,

B180% = extrato 80% EtOH e B1100% = extrato 100% EtOH da casca desidratada;


B280% = extrato 80% EtOH e B2100% = extrato 100% EtOH do jambo inteiro sem caroço

desidratado. Média ± DP, p < 0,05.



76

Os resultados do presente estudo são comparáveis a pesquisas encontradas na

literatura. Por exemplo, Ikram et al. (2009) realizaram estudos sobre o teor de fenólicos e

capacidade antioxidante de 58 frutos de diferentes espécies e gêneros, dentre eles o jambo,

verificando para o mesmo teor de fenólicos de 555,57 mg GAE/100 g da amostra. Neste

trabalho foram obtidos valores para CFT que variaram de 425,20 a 1029,5 mg GAE/100 g da

amostra, situando-o dentro da faixa de valores anteriormente observados.

Vega-Gálvez et al. (2009) investigaram a capacidade antioxidante, o teor de vitamina

C e os composto fenólicos totais de pimentas vermelhas (Capsicum annuum, L. var.

Hungarian) submetidas ao processo de secagem, onde avaliaram o efeito causado pelo ar

quente aos seus constituintes bioativos. As temperaturas empregadas variaram entre 50ºC e

90ºC e foi constatado que o conteúdo de vitamina C e fenólicos totais diminuiu à medida que

a temperatura do ar de secagem diminuiu. O uso de temperaturas mais elevadas (80ºC e 90ºC)

levou a maior atividade antioxidante quando comparado a condições de temperaturas mais

brandas (50ºC, 60ºC e 70ºC). Esse comportamento pode estar relacionado à necessidade de se

ter um maior tempo de secagem ao se empregar baixas temperaturas, o que pode ocasionar

diminuição da capacidade antioxidante (Garau et al., 2007).

Da mesma maneira, o emprego de diferentes temperaturas (50ºC, 60ºC, 70ºC e 90ºC)

na desidratação de mirtilo (blueberries) da variedade O’Neil, revelou que a atividade

seqüestradora de radicais livres foi maior em altas temperaturas (80ºC e 90ºC) do que em

baixas temperaturas (50ºC, 60ºC e 70ºC), segundo López et al. (2010).

Observaram-se no presente trabalho maiores valores para CFT nos extratos obtidos a

partir da casca do jambo vermelho, quando comparado ao fruto inteiro do jambo. Alguns

relatos asseguram que as cascas de frutas são particularmente ricas em compostos fenólicos,

provavelmente, devido à função que desempenham na defesa da fruta (Balasundram, Sundram

& Samman, 2006; Ribeiro et al., 2008; Michodjehoun-Mestres et al., 2009).

A concentração de pigmento dos extratos, bem como a atividade inibitória frente as

enzimas α-amilase e α-glicosidase estão na Tabela 5.5. A concentração de pigmentos variou

de 19,68 – 27,90 mg/L para a casca desidratada e de 4,66 – 9,14 mg/L para o jambo

desidratado mostrando-se superior aos valores encontrados por Xavier (2004) em extratos de

cebola roxa (1,8 – 9,8 mg/L).



77

Tabela 5.5: Valores experimentais para concentração de pigmentos e inibição enzimática para o produto desidratado.

CP % α-amilase % α-glicosidase

B1H2O 19,58 ± 0,167 31,70 ± 0,65 67,09 ± 8,68

B150% 21,02 ± 0,160 46,63 ± 0, 89 97,67 ± 3,98

B170% 27,90 ± 0,140 26,27 ± 3,25 97,01 ± 2,20

B180% 27,56 ± 0,821 27,65 ± 5,67 96,89 ± 2,22

B1100% 8,86 ± 0,355 12,31 ± 0,96 98,97 ± 3,16

B2H2O 5,66 ± 0,464 49,28 ± 8,17 27,92 ± 4,51

B250% 9,09 ± 0,261 62,20 ± 4,09 98,19 ± 1,41

B270% 8,66 ± 0,196 37,60 ± 5,31 94,93 ± 2,10

B280% 9,14 ± 0,333 33,49 ± 3,00 95,85 ± 1,61

B2100% 4,66 ± 0,633 30,96 ± 2,32 93,16 ± 0,19

CP = concentração de pigmento em equivalentes de vermelho-congo (mg/L); %α-amilase (em

equivalentes Maltose) e %α-glicosidase.


B180% = extrato 80% EtOH e B1100% = extrato 100% EtOH da casca desidratada;


B280% = extrato 80% EtOH e B2100% = extrato 100% EtOH do jambo inteiro sem caroço

desidratado. Média ± DP, p < 0,05.

Em estudo feito por Reynertson et. al. (2008) entre 14 diferentes frutos da família

Myrtaceae foram realizadas investigações quanto à concentração de fenólicos totais, atividade

antioxidante e antocianinas totais. Os extratos dos frutos liofilizados foram elaborados

utilizando como solvente extrator metanol-ácido fórmico na proporção 9:1 v/v. Dentre os

frutos investigados estava o jambo vermelho que apresentou valores para fenólicos de 8,58

mg GAE/g em BU, atividade antioxidante de 269 IC50 em µg/mL e apenas traços (0,02 mg/g)

do pigmento antociânico cianidina-3-glicosídeo foram detectados.



78

As Figuras 5.9 e 5.10 mostram, respectivamente, que houve moderada correlação entre

os teores de fenólicos (R2 = 69,46%) e antocianinas totais do jambo vermelho (R2 = 52,20%)

em relação à capacidade antioxidante. Essa tendência também foi observada por Vasco,

Ruales & Kamal-Eldin (2008) ao analisar 17 frutos do Equador quanto ao teor de compostos

fenólicos solúveis e sua capacidade antioxidante. Os frutos foram secos em estufa a 80°C por

seis horas e depois obtidos os extratos a temperatura ambiente por extração seqüencial (duas

etapas) sob agitação continua por uma hora com 20 mL de metanol:água (50:50 v/v) e, em

seguida, por 20 mL de acetona:água (70:30 v/v). Os valores variaram entre 26 e 2100

GAE/100 mg BU, sendo que frutos como o maracujá, manga e tomate apresentaram baixo

teor (< 100 mg GAE/100 g); ameixa e a goiaba apresentaram teores intermediários (250 – 400

mg GAE/100 g) e os frutos que mostraram os maiores valores foram a amora andina, cereja e

banana (respectivamente 2167, 1494 e 1010 mg GAE/100 g BU da amostra). A relação entre

capacidade antioxidante e CFT não foi linear, ou seja, alguns frutos que apresentaram alto

teor de fenólicos não demonstraram alto poder antioxidante. Vale ressaltar que frutas, como a

goiaba, apresentaram baixo teor de fenólicos, mas elevada capacidade antioxidante (em

equivalentes Trolox), indicando que essas frutas contêm potentes fenólicos antioxidantes.

Figura 5.9: Correlação entre compostos fenólicos totais

e atividade antioxidante.



79

Figura 5.10: Correlação entre antocianinas totais e atividade antioxidante.

A correlação entre os valores de compostos fenólicos totais e o conteúdo de

antocianinas totais obtidos neste estudo está representada na Figura 5.11, e indica uma relação

positiva entre esses constituintes nos extratos do jambo vermelho (R2 = 94,61%). Essa alta

correlação evidencia que os compostos fenólicos presentes no jambo são antociânicos.

Figura 5.11: Correlação entre compostos fenólicos totais e antocianinas totais.



80

No entanto, nem sempre altos valores de CFT implicam necessariamente em teores

elevados de antocianinas totais: Tsanova-Savova, Dimov e Ribarova (2002) ao investigar os

CFT e atividade antioxidante em várias marcas de vinhos detectaram valores de 15552,3;

1640,8 e 1404,8 mg/L para CFT, as quais apresentam respectivamente, antocianinas totais de

40,8; 59,1 e 65,6 mg/L. No entanto, diferentemente Malacrida e Motta (2005) observaram em

diferentes sucos de uva, que quanto maior o teor de fenólicos, maior a concentração de

antocianinas. Por exemplo, amostras com 1,29 e 0,86 g/L para fenólicos apresentavam 36,23 e

16,94 mg/L, respectivamente, de antocianinas.

Abe et al. (2007) em estudo realizado nas cultivares de uvas Vitis labrusca L. e Vitis

vinifera L. para determinação da capacidade antioxidante e de compostos fenólicos totais,

incluindo resveratrol, antocianinas e outros flavonóides, observaram que o teor de

antocianinas apresentou forte correlação com a capacidade antioxidante (R2 = 93,00%),

enquanto que entre fenólicos totais e antocianinas foi baixa a correlação apresentada (R2 =

65,00%). Essa baixa correlação representa a presença de outros fenólicos, como as catequinas,

epicatequinas, quercetinas, caempferol e ácidos hidrocinâmicos.

A percentagem de inibição enzimática determinada no presente trabalho foi de 12,31%

e de 98,97% para a casca e de 30,96% e de 93,16% para o jambo, respectivamente, para a α-

amilase a α-glicosidase, ambos em extrato 100% EtOH. A investigação realizada por

Cheplick et al. (2010) em diferentes cultivares de morango divergiu quanto ao solvente

empregado na extração, apresentando moderadas percentagens de inibição a α-amilase em

água e elevadas percentagens de inibição a α-glicosidase em etanol.

5.3-Comparação entre as Estratégias 1 e 2

A Estratégia 1 obteve bons resultados no controle de parâmetros da extração do

corante do jambo vermelho. As condições para se obter as melhores respostas em cada um

dos parâmetros estudados diferiram. Esse achado demonstra a necessidade de otimizar as

condições para cada uma das análises sob investigação, ou seja, existem condições específicas

para maximizar o teor de compostos fenólicos totais, capacidade antioxidante, quantificação

de antocianinas totais e concentração de pigmentos.



81

A Estratégia 2, a qual consistiu da obtenção de material desidratado, levou a resultados

superiores nos atributos funcionais incluídos no estudo. Isto é de fundamental importância em

se tratando da utilização de uma fruta sazonal como o jambo. Segundo Andrade et al. (2003)

processos industriais em que há redução da atividade de água surgem como alternativa para

solucionar ou minimizar problemas, trazendo vantagens como, redução no custo de transporte

e armazenagem; estabilidade microbiológica e química; aumento na oferta em épocas em que

a safra tenha finalizado, e redução nas perdas devido à deterioração; além dessas vantagens,

há o fato de agregar valor ao produto. Araújo et al. (2010) em estudo realizado em frutos do

jambo vermelho, empregaram o processo de desidratação como uma possível forma de

reduzir as perdas pós-colheita e diversificação de seu aproveitamento industrial.

A Tabela 5.6 mostra os maiores valores obtidos para ambas as estratégias. Conforme

comentado anteriormente, os resultados obtidos a partir da estratégia 2 para os estudos de

CFT, AA e AT são superiores, sendo inferior apenas para a CP. Sugere-se que os valores

inferiores da estratégia 1 para CFT, AA e AT, resultem da formação de produtos de

escurecimento ou degradação dos pigmentos do jambo por polimerização (Giusti & Wrolstad,

2001; Malacrida & Motta, 2005; Que et al, 2008; Miranda et al., 2009) devido ao efeito

térmico (Araújo, 2008), e pela possível copigmentação causada por outros constituintes

presentes na matriz vegetal, que ocasiona um emparelhamento ou sobreposição dos mesmos

(Stringheta & Bobbio, 2000; Dimitric-Markovic et al., 2001; Ribeiro & Seravalli, 2007).

A menor concentração de pigmentos observados nas amostras desidratadas pode ser

resultado do efeito térmico associado à possível oxidação ocasionada pelas condições de

secagem.



82

Tabela 5.6: Valores do estudo funcional para as Estratégias 1 e 2.

Estratégia 1 Estratégia 2

Produtos A1’ A2’ B1 B2

CFT (mg GAE/100 g amostra) 174,15 83,80 1024,22 595,50

AA (µmol Trolox eq/g amostra) 3,56 3,55 28,40 29,03

AT (mg ci-3-gli/100 g amostra) 133,59 84,17 1193,41 484,82

CP (mg/L) 41,57 18,78 27,90 9,14

α-amilase (%) 29,62 22,40 12,31 30,96

α-glicosidase (%) 98,98 96,31 98,97 93,16

Em que: A1’ e A2’ são produtos da estratégia 1; B1 e B2 são produtos da estratégia 2.

Capítulo 6: Conclusões



6- Conclusões

Os resultados da presente pesquisa permitem concluir que:

� A estratégia 1 possibilitou a geração de modelos preditivos e significantes

estatisticamente para análises de fenólicos totais, atividade antioxidante e antocianinas

totais. A alta correlação dos modelos definidos pela análise de superfície de resposta

demonstrou que o modelo polinomial de segunda ordem pode ser usado para

otimização das condições de extração do corante do jambo vermelho.

� As melhores condições de extração para a estratégia 1 foi de:

o 33°C, 20 min. e 2H2O/3EtOH para CFT;

o 50°C, 20 min. e 2H2O/3EtOH para AA;

o 60°C, 20 min. e 1H2O/1EtOH para AT e CP;

o 50°C, 36,82 min. e 2H2O/3EtOH para a capacidade de inibição das enzimas α-

amilase e g α-glicosidase;

� A estratégia 2 mostrou resultados superiores para a concentração de compostos

fenólicos totais, atividade antioxidante e antocianinas totais, apresentando-se inferior

apenas no teor de concentração de pigmentos. O EtOH a 50% (CFT para B1 e B2; AT

para B1) e 80% (AA para B1 e B2) foram mais efetivos em relação as demais

concentrações.

� Os resultados máximos, respectivamente, para os produtos da estratégia 1 e os

produtos da estratégia 2, foram de:

o 174,15 e 1024,22 mg GAE/100 g da amostra para CFT;

o 3,56 e 28,40 µmol Trolox eq/g da amostra para a AA;

o 133,59 e 1193,41 mg ci-3-gli/100 g da amostra para AT;



85

o 41,57 e 27,90 mg/L para CP;

o 22, 40% e 26,27% para o percentual de inibição da enzima α-amilase;

o 98,98% e 97,01% para o percentual de inibição da enzima α-glicosidase;

� Os dados apresentados nesse estudo evidenciam que o jambo vermelho é uma rica

fonte de pigmentos antociânicos. Estudos complementares precisam ser conduzidos

de forma a averiguar a aplicação desse produto como corante natural e sua aplicação

em sistemas alimentares. Espera-se que os resultados aqui obtidos possam servir de

consulta para futuras pesquisas com outras frutas tropicais.

Capítulo 7: Referências

bibliográficas

Capítulo 7: Referências bibliográficas


87

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Dissertação de Juliana Chrís 17.12 - repositorio.ufrn.br · Catalogação da Publicação na...

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