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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA

INSTITUTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

ESTUDO QUÍMICO, ATIVIDADE ANTIOXIDANTE, ATIVIDADE

ANTIMICROBIANA E ANÁLISE DO ÓLEO ESSENCIAL DA ESPÉCIE

Kielmeyera coriacea Mart. & Zucc (PAU-SANTO) DO CERRADO

CARLA DE MOURA MARTINS

UBERLÂNDIA – MG

2012

UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA

INSTITUTO DE QUÍMICA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM QUÍMICA

ESTUDO QUÍMICO, ATIVIDADE ANTIOXIDANTE, ATIVIDADE

ANTIMICROBIANA E ANÁLISE DO ÓLEO ESSENCIAL DA ESPÉCIE

Kielmeyera coriacea Mart. & Zucc (PAU-SANTO) DO CERRADO

CARLA DE MOURA MARTINS

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Química da Universidade Federal de Uberlândia, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Química.

Orientação: Prof. Dr. Francisco José Tôrres de Aquino

Coorientação: Prof. Dr. Alberto de Oliveira

Uberlândia – MG

2012

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO..........................................................................................................17

1.1 METABÓLITOS SECUNDÁRIOS..........................................................................19

1.2.1 Terpenos................................................................................................................20

1.2.2 Compostos fenólicos.............................................................................................24

1.2.3 Alcaloides...............................................................................................................28

1.2.4 Xantonas................................................................................................................29

1.2.5 Óleos essenciais.....................................................................................................32

1.3 CONSTITUINTES QUÍMICOS DA MADEIRA E CASCA...................................34

1.4 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA.........................................................................39

1.5 A ESPÉCIE Kielmeyera coriacea Mart. & Zucc......................................................40

1.6 FLUXOGRAMAS UTILIZADOS NO PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL.....45

2 OBJETIVOS...............................................................................................................47

2.1 OBJETIVOS GERAIS..............................................................................................47

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS....................................................................................47

3 JUSTIFICATIVA.......................................................................................................48

4 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL...................................................................49

4.1 COLETA E PREPARO DO MATERIAL VEGETAL.............................................49

4.2 DETERMINAÇÃO DA UMIDADE.........................................................................49

4.3 DETERMINAÇÃO DOS CONSTITUINTES QUÍMICOS DA CASCA E

MADEIRA DE Kielmeyera coriacea............................................................................49

4.3.1 Determinação do teor de cinzas...........................................................................49

4.3.2 Preparação da amostra livre de extrativos.........................................................50

4.3.3 Determinação de lignina insolúvel em ácido (Lignina de Klason)...................50

4.3.4 Determinação de lignina solúvel..........................................................................51

4.3.5 Determinação de holocelulose..............................................................................51

4.4 IDENTIFICAÇÃO DOS COMPOSTOS VOLÁTEIS DE Kielmeyera coriacea.....52

4.4.1 Extração do óleo essencial por hidrodestilação.................................................52

4.4.2 Análise dos óleos essenciais por CG-EM............................................................52

4.4.3 Identificação dos óleos essenciais........................................................................52

4.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE..............................................53

4.5.1 Preparação dos extratos em etanol.....................................................................53

4.5.2. Partição líquido-líquido dos extratos em etanol...............................................53

4.5.3 Determinação de fenóis totais (FT).....................................................................53

4.5.4 Determinação do teor de taninos condensados (proantocianidinas)................54

4.5.5 Análise quantitativa da atividade antioxidante.................................................54

4.5.5.1 Construção da curva de calibração do DPPH....................................................55

4.5.5.2 Leitura das medidas de absorbância nas amostras.............................................55

4.6 ANÁLISE ESPECTROSCÓPICA NO INFRAVERMELHO..................................56

4.7 MONITORAMENTO POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA

DELGADA (CCD) COM SÍLICA GEL DAS PARTIÇÕES EM METANOL-

ÁGUA 9:1 E EM DICLOROMETANO DA CASCA INTERNA..................................56

4.7.1 Fracionamento por cromatografia em coluna da partição em

diclorometano.................................................................................................................56

4.8 ANÁLISE DAS FRAÇÕES 5 E 6 POR CLAE........................................................57


4.10 ANÁLISES ESTATÍSTICAS.................................................................................58

5 RESULTADOS E DISCUSSÕES..............................................................................59

5.1 DETERMINAÇÃO DA UMIDADE.........................................................................59

5.2 DETERMINAÇÃO DOS CONSTITUINTES QUÍMICOS DA CASCA

E MADEIRA DE Kielmeyera coriacea..........................................................................59

5.2.1 Determinação do teor de cinzas...........................................................................59

5.2.2 Preparação da amostra livre de extrativos.........................................................60

5.2.3 Determinação de lignina insolúvel em ácido (Lignina de Klason)...................61

5.2.4 Determinação de lignina solúvel..........................................................................61

5.2.5 Determinação de holocelulose..............................................................................62

5.3 IDENTIFICAÇÃO DOS COMPOSTOS VOLÁTEIS DE Kielmeyera coriacea.....63

5.4 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE..............................................69

5.4.1 Preparação dos extratos em etanol e partição líquido-líquido.........................69

5.4.2 Determinação de fenóis totais (FT).....................................................................70

5.4.3 Determinação do teor de taninos condensados (proantocianidinas)................72

5.4.4 Análise quantitativa da atividade antioxidante.................................................74

5.4.4.1 Construção da curva de calibração do DPPH....................................................75

5.4.4.2 Leitura das medidas de absorbância nas amostras.............................................75

5.4.4.3 Concentração Efetiva (CE50)...............................................................................80

5.5 ANÁLISE ESPECTROSCÓPICA NO INFRAVERMELHO..................................82

5.6 FRACIONAMENTO POR CROMATOGRAFIA EM COLUNA PARA AS

AMOSTRAS COM MELHORES CE50..........................................................................87

5.7 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE (AA), APÓS FRACIONAMENTO EM

COLUNA, DA PARTIÇÃO DICLOROMETANO DA CASCA INTERNA................90

5.7.1 Análise dos extratos 5 e 6 por CLAE..................................................................91


6 CONCLUSÕES...........................................................................................................97

REFERÊNCIAS.............................................................................................................99

APÊNDICE A..............................................................................................................111

AGRADECIMENTOS

A Deus, por todos os obstáculos superados.

A minha família que, com muito carinho e apoio, não mediram esforços para que

eu chegasse até esta etapa de minha vida.

Ao professor e orientador Francisco J. T. de Aquino pela orientação e apoio

durante o desenvolvimento do presente trabalho.

Ao professor Alberto de Oliveira por sua coorientação.

Aos professores Sérgio A. L. Morais, Roberto Chang e Evandro A. do

Nascimento, por suas contribuições para o desenvolvimento deste trabalho.

Aos professores Carlos Henrique G. Martins do Laboratório de Pesquisa em

Microbiologia Aplicada da Universidade de Franca - LaPeMa, pela realização das

análises de atividade antimicrobiana e ao professor Glein M. de Araújo do Instituto de

Biologia da UFU, pela identificação da planta.

Aos amigos do laboratório de pesquisa, Brunno, Edmilson, Gabriella, Luís, Mário

e Raquel, pelo companheirismo e apoio em tantos momentos e pela ajuda na realização

de algumas etapas deste trabalho.

A CAPES pela bolsa de mestrado.

A todas as pessoas que diretamente e indiretamente contribuíram para que esse

trabalho fosse realizado.

ÍNDICE DE TABELAS

Tabela 1: Classificação dos compostos fenólicos de acordo com a cadeia principal......24

Tabela 2: Sistema de eluição para a análise em CLAE das frações 5 e 6........................57

Tabela 3: Teor de umidade das partes da Kielmeyera coriacea Mart. & Zucc

estudadas..........................................................................................................................59

Tabela 4: Teor de cinzas da madeira e cascas de Kielmeyera coriacea Mart. & Zucc...60

Tabela 5: Porcentagem de extrativos de Kielmeyera coriacea Mart. & Zucc.................60

Tabela 6: Porcentagem dos constituintes químicos da casca e madeira de

Kielmeyera coriacea Mart. & Zucc.................................................................................62

Tabela 7: Rendimentos dos óleos essenciais de Kielmeyera coriacea............................63

Tabela 8: Principais constituintes voláteis presentes na folha, flor, casca externa,

casca interna e madeira de Kielmeyera coriacea Mart. & Zucc......................................64

Tabela 9: Comparação dos constituintes voláteis de K. coriacea e K. rugosa Choisy...67

Tabela 10: Teor de fenóis totais (expresso em mg EAG por grama de amostra)

nos extratos em etanol e nas partições de Kielmeyera coriacea Mart. & Zucc...............71

Tabela 11: Teor de proantocianidinas nos extratos etanólicos e nas partições (em

mg ECAT por grama de amostra) de Kielmeyera coriacea Mart. & Zucc.....................73

Tabela 12: Concentração inicial (100%) em ppm das amostras na cubeta na

determinação da AA dos extratos e partições de Kielmeyera coriacea Mart. &

Zucc.................................................................................................................................76

Tabela 13: Porcentagem de atividade antioxidante (% AA) para as concentrações

iniciais (em ppm) das amostras na cubeta.......................................................................76

Tabela 14: Valores de CE50 (em ppm) para extrato em etanol e partições estudadas

de Kielmeyera coriacea...................................................................................................81

Tabela 15: Valores de CE50 de extrato e frações da folha de Garcinia xanthochymus...81

Tabela 16: Principais absorções dos espectros no infravermelho das amostras

analisadas de K. coriacea................................................................................................85

Tabela 17: Atividade antioxidante (AA, em %) para as frações obtidas após

fracionamento em coluna da partição em diclorometano da casca interna.....................90

Tabela 18: Valores de CE50 das frações 4, 5, e 6.............................................................90

Tabela 19: Resultados da concentração inibitória mínima para os extratos e as

partições de Kielmeyera coriacea....................................................................................93

Tabela 20: Concentração inibitória mínima (CIM) do extrato em diclorometano

do caule de Kielmeyera cuspidata...................................................................................95

Tabela 21. Efeito inibitório dos óleos essenciais para diferentes partes de C.

pubescens contra organismos aeróbicos bucais...............................................................96

ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 - Mapa demonstrativo dos Biomas encontrados no Brasil..................................7

Figura 2 - Esquema das vias do metabolismo secundário de plantas………..………...20

Figura 3: Esquema da síntese de terpenos e a sua classificação de acordo com as

unidades de isopreno.......................................................................................................21

Figura 4: Estruturas de alguns monoterpenos..................................................................22

Figura 5: Estruturas de alguns sesquiterpenos com atividade biológica.........................23

Figura 6: Estruturas da azadiractina e ecdisona...............................................................23

Figura 7: Estrutura e numeração básica de um flavonóide..............................................25

Figura 8: Estruturas das principais classes dos flavonóides............................................25

Figura 9: Esquema da hidrólise dos taninos: galactoninos produzem ácido gálico

após hidrólise; e elagitaninos produzem ácido elágico após hidrólise............................27

Figura 10: Estrutura de uma proantocianidina, um tanino condensado..........................27

Figura 11: Estrutura do alcaloide morfina.......................................................................29

Figura 12: Estrutura básica de xantonas com núcleos numerados..................................30

Figura 13: Estrutura da xantona glicosilada mangiferina - um composto bioativo

de manga (Mangifera indica L.)......................................................................................30

Figura 14: Estrutura da xantona prenilada – mangostina................................................31

Figura 15: Estrutura da bis-xantona – globulixantona E.................................................31

Figura 16: Estrutura da xantona xantofulvina.................................................................32

Figura 17: Estrutura do fenilpropanóide ácido cinâmico e do terpeno beta-mirceno.....33

Figura 18: Esquema dos constituintes químicos da madeira...........................................34

Figura 19: Aspectos macroscópicos de uma secção transversal do tronco de uma

árvore...............................................................................................................................35

Figura 20: Esquema de formação da estrutura da celulose. Os substituintes OH-2,

OH-3 e CH2OH estão orientados equatorialmente..........................................................36

Figura 21: Estrutura da galactoglucomanana. Unidades de açúcar: beta-D-glicose,

beta-D-manose e alfa-D-galactose..................................................................................37

Figura 22: Estrutura dos álcoois precursores das unidades fenilpropanóides

guaiacila (G), siringila (S) e p-hidroxifenila (H).............................................................37

Figura 23: Estrutura proposta para lignina de madeira moída do Eucalyptus grandis....38

Figura 24: Mapa da distribuição geográfica da espécie Kielmeyera coriacea Mart.

& Zucc no Brasil..............................................................................................................41

Figura 25: Imagens que mostram as características morfológicas da espécie

Kielmeyera coriacea. 1 = arbusto; 2 = folhas – nervura central proeminente; 2 =

flores no ápice dos ramos; 4 = tronco suberoro – casca espessa; 5 = fruto tipo

cápsula; 6 = fruto aberto..................................................................................................42

Figura 26: Estruturas químicas dos compostos isolados do extrato em diclorometano

da casca do caule de Kielmeyera coriacea. 1 = Aucuparina; 2 = 2-hidroxi-1-

metoxixantona; 3 = 3-hidroxi-2,4-dimetoxixantona; 4 = 4-hidroxi-2,3-

dimetoxixantona; 5 = 1,3,7-trihidroxi-2-(3-metilbut-2-enil)-xantona; 6 =1,3,5-

trihidroxi-2-(3-metilbut-2-enil)-xantona; 7 = 1,3,7-trihidroxi-2-(3-hidroxi-3-

metilbutil)-xantona; 8 = kielcorina; 9 = osajaxantona.....................................................43

Figura 27: Estruturas químicas do delta-tocotrienol (1) e delta-tocotrienol

peróxi-dímero (2).............................................................................................................45

Figura 28: Fluxograma de trabalho utilizado na determinação dos óleos essenciais......45

Figura 29: Fluxograma de trabalho utilizado nas análises químicas...............................46

Figura 30: Estruturas dos três constituintes majoritários presentes no óleo

essencial das folhas de K. coriacea.................................................................................66

Figura 31: Estrutura química do eugenol........................................................................66

Figura 32: Estrutura dos três constituintes majoritários do óleo essencial da casca

interna de K. coriacea......................................................................................................68

Figura 33: Estrutura química do Parsol MCX@

...............................................................69

Figura 34: Reação típica do ácido gálico com o íon molibdênio presente no

reagente de Folin............................................................................................................70

Figura 35: Curva de calibração para a determinação espectrofotométrica de fenóis

totais (Método Folin-Ciocalteau).....................................................................................71

Figura 36: Reação típica da vanilina com uma proantocianidina. A seta aponta

para um segundo local potencialmente reativo................................................................72

Figura 37: Curva de calibração para a determinação espectrofotométrica de

proantocianidinas (Método da Vanilina).........................................................................73

Figura 38: Esquema da reação típica entre o radical DPPH e o antioxidante

genérico (A―H)..............................................................................................................74

Figura 39: Reação típica de redução do radical DPPH pelo flavonóide

antioxidante quercetina....................................................................................................75

Figura 40: Curva de calibração para a determinação espectrofotométrica da

atividade antioxidante (Método DPPH)..........................................................................75

Figura 41: Gráficos da porcentagem de atividade antioxidante para: a- extrato em

etanol da folha; b- partição em cicloexano da folha; c- partição em diclorometano

da folha; d- extrato em etanol da madeira.......................................................................77


etanol da casca interna; b- partição em cicloexano da casca interna; c- partição

em diclorometano da casca interna; d- partição em metanol:água 9:1 da casca

interna..............................................................................................................................78


etanol da casca externa; b- partição em cicloexano da casca externa; c- partição

em diclorometano da casca externa.................................................................................79

Figura 44: Gráfico comparativo normalizado da atividade antioxidante (AA, em

%) para as amostras, após 1 hora de reação....................................................................80

Figura 45: Espectros de infravermelho de três extratos obtidos da casca externa de

K. coriacea.......................................................................................................................83

Figura 46: Espectros no infravermelho de extratos da casca interna da K. coriacea......83

Figura 47: Espectros no infravermelho de extratos da folha da K. coriacea...................84

Figura 48: Espectro no infravermelho do extrato em etanol da madeira de K.

coriacea...........................................................................................................................84

Figura 49: Esquema da reação de ativação da sílica por aquecimento............................88

Figura 50: Fluxograma do fracionamento cromatográfico da partição em

diclorometano da casca interna........................................................................................89

Figura 51: Espectros na região do UV para os principais picos eluídos nos

cromatogramas da Figura 51: 1 = pico em 29 min fração 5; 2 = pico em 30 min

fração 5; 3 = pico em 32 min fração 5; 4 = pico em 48 min fração 5; 5 = pico em

30 min fração 6; 6 = pico em 48 min fração 6.................................................................91

Figura 52: Cromatogramas obtidos por CLAE das frações 5 e 6. Condições:

Coluna C18 (4,6 mm d.i. x 25 cm comprimento); gradiente solução 5% de

KH2PO4 0,2 mol L-1

– metanol; fluxo de 0,7 mL min-1

; detector a 220 nm....................92

LISTA DE ABREVIAÇÕES E SÍMBOLOS

AA – Atividade antioxidante

CCD – Cromatografia de camada delgada

CE50 – Concentração eficiente

CLAE – Cromatografia líquida de alta eficiência

CLSI – Clinical and Laboratory Standards Institute

CG-EM – Cromatografia Gasosa-Espectroscopia de Massas

CIM – Concentração inibitória mínima

DMAPP – Dimetil-alil difosfato

DPPH – Radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazila

DPPH-H – 2,2-difenilpicril-hidrazina

EAG – Equivalentes de ácido gálico

ECAT – Equivalentes de catequina

FPP – Farnesil difosfato

FT – Fenóis totais

GBIF – Global Biodiversity Information Facility

GPP – Geranil difosfato

IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística

IK – Índice de Kovat

IPP – Isopentenil difosfato

IV – Infravermelho

OPP – oxigênio- pirofosfato =

TIC – Total ions chromatografics

UV – Ultravioleta

λ – Comprimento de onda

O

P

O

P

OH

O

O- O

-R

O

RESUMO

A espécie Kielmeyera coriacea Mart. & Zucc, conhecida popularmente como

pau-santo, pertence à família Clusiaceae. Esta planta é muito rica em xantonas,

substâncias que apresentam várias propriedades farmacológicas. O objetivo do trabalho

foi analisar e quantificar os constituintes químicos das partes aéreas, bem como avaliar a

atividade antioxidante e antimicrobiana de extratos e partições de Kielmeyera coriacea.

As porcentagens obtidas para os constituintes macromoleculares das cascas e

madeira estão dentro da faixa de aceitação para as árvores folhosas. O teor de lignina de

Klason encontrado foi de 14,7, 57,3 e 28,0% e o de holocelulose foi 30,0, 5,5 e 71,7%

para casca interna, casca externa e madeira, respectivamente.

O óleo essencial de diferentes partes de Kielmeyera coriacea foi analisado pela

primeira vez neste trabalho. Os principais compostos identificados no óleo essencial da

folha foram sesquiterpenos, 51,3% do óleo é constituído de D-germacreno, trans-

cariofileno e biciclogermacreno. Na flor, o eugenol representa cerca de 44,0% do óleo

essencial sendo o constituinte majoritário. Em comparação com os óleos essenciais da

espécie Kielmeyera rugosa, houve diferenças na concentração dos componentes

encontrados nas folhas e flores das duas espécies Na casca interna a maioria dos

componentes são sesquiterpenos e os constituintes presentes em maior concentração

foram alfa-copaeno (14,9%), alfa-trans-bergamoteno (13,0%) e beta-bisaboleno

(9,4%). Na casca externa, dentre os componentes identificados, os alcanos e

sesquiterpenos estão presentes em maior concentração. No óleo da madeira o ácido

palmítico é o componente majoritário (16,2%) e os alcanos estão presentes em grande

concentração, que juntos representam 51,3% do óleo essencial. Este óleo essencial

pode ser considerado uma fonte alternativa para o 2-etilexil-3-(4-metoxifenil)-2-

propenoato (conhecido como Parsol MCX, encontrado em formulações de protetores

solares).

Pela análise do teor de fenóis totais, através do método Folin-Ciocalteau, os

extratos em etanol da folha e casca interna e a partição em metanol-água da casca

interna foram as amostras que apresentaram os maiores teores, com valores de 309, 346

e 372 mg EAG g-1

de extrato, respectivamente. A casca interna foi a amostra que

apresentou o maior teor de proantocianidinas com valores de 328, 253 e 410 mg ECAT

g-1

de extrato para o extrato em etanol, partição em diclorometano e partição em

metanol-água, respectivamente. A casca interna foi também a amostra que apresentou

melhor atividade antioxidante, com valores de CE50 de 5,9, 6,6 e 4,3 ppm para o extrato

em etanol, partição em diclorometano e partição em metanol-água, respectivamente. As

frações 4, 5 e 6 da partição em metanol-água da casca interna apresentaram boa

atividade antioxidante com valores de CE50 de 4,7, 4,8 e 4,3 ppm, respectivamente.

A análise dos extratos por CLAE das frações 5 e 6 obtidas do fracionamento em

coluna da partição em diclorometano da casca interna, e que apresentaram altos valores

de CE50, mostrou a presença de poucos compostos, ainda não identificados neste estudo.

A análise no IV dos extratos e das partições mostrou que os principais grupos

funcionais presentes foram hidroxila, carbonila, alcanos e presença da ligação C―O. A

análise de infravermelho não permitiu identificar diferenças na estrutura dos compostos

fenólicos e apresentou funcionalidade global muito similar.

Os resultados da CIM frente aos microrganismos bucais mostraram que a casca

interna foi a amostra com melhor atividade e a partição em cicloexano foi a mais ativa,

inibindo o crescimento bacteriano para três microrganismos bucais (S. mutans, S.

sanguinis, A. naeslundii) em concentração de 6,2 µg mL-1

.

Palavras-chave: Kielmeyera coriacea, análise química, óleo essencial, atividade

antioxidante, atividade antimicrobiana.

ABSTRACT

Kielmeyera coriacea Mart. & Zucc, known as “pau-santo”, belongs to the family

Clusiaceae. This plant is rich in xanthones, substances that exhibit various

pharmacological properties. The objective of this study was to analyze and quantify the

chemical constituents of the aerial parts, evaluate the antimicrobial and antioxidant

activity of extracts and partitions of Kielmeyera coriacea.

The percentages obtained for the macromolecular constituents of barks and

wood are within the acceptable range for hardwood trees. The Klason lignin content

found, was 14.7, 57.3 and 28.0 % and holocellulose was 30.0, 5.5 and 71.7 % for inner

bark, outer bark and wood, respectively.

The essential oils from different parts of Kielmeyera coriacea was analyzed for

the first time in this work. The main identified compounds in the essential oil of leaf

were sesquiterpenes, 51.3% of the oil consists of D-germacrene, trans-caryophyllene

and bicyclogermacrene. In the flower, eugenol represents about 44.0 % of the essential

oil, being the major constituent. Compared with essential oils of Kielmeyera rugosa,

there were differences in the concentration of the components found in leaves and

flowers of both species. In the inner bark, the most components are sesquiterpenes and

constituents in higher concentrations were alpha-copaene (14.9 %), alpha-trans-

bergamotene (13.0 %) and beta-bisabolene (9.4 %). In the outer bark, alkanes and

sesquiterpenes are present in higher concentration. In the oil of wood, palmitic acid is

the major component (16.2 %) and the alkanes are present in high concentration,

together represent 51.3 % of essential oil. This essential oil can be considered an

alternative source for 2-ethylhexyl-3-(4-methoxyphenyl)-2-propenoate (known as Parsol

MCX, found in formulations of sunscreens).

The levels of total phenols determined by Folin-Ciocalteau method, were 309,

346 and 372 expressed in Galic acid equivalents (GAC) per gram of sample, for ethanol

extracts of leaves and inner bark and methanol-water partition of the inner bark,

respectively. The inner bark was the sample that showed the highest content of

proanthocyanidins with values of 328, 253 and 410 in catechin equivalents per gram of

sample, for the ethanol extract, dichloromethane and methanol-water partitions,

respectively. The inner bark was also the sample that showed the greatest antioxidant

activity, with EC50 values of 5.9, 6.6 and 4.3 ppm for ethanol extract, dichloromethane

and methanol-water partitions, respectively. The fractions 4, 5 and 6 of methanol-water

partition from the inner bark presented good antioxidant activity with EC50 values of

4.7, 4.8 and 4.3 ppm, respectively.

The analysis of fractions 5 and 6, obtained from the fractionation column of

dichloromethane partition of the inner bark, which had high EC50 values, by HPLC,

showed the presence of a few compounds, not yet identified in this study.

The analysis of IV in extracts and fractions showed that the main functional

groups present in the extracts were hydroxyl, carbonyl, presence of alkanes and C-O

bond. The infrared analysis not allowed identify differences in the structure of phenolic

compounds and presented global functionality very similar.

The results of MIC against oral microorganisms showed that, the inner bark was

the sample with higher activity and cyclohexane partition was most active, inhibiting

bacterial growth for three oral microorganisms (S. mutans, S. sanguinis, A. naeslundii)

at a concentration of 6,2 µg mL-1

.

Keywords: Kielmeyera coriacea, chemical analysis, essential oil, antioxidant activity,

antimicrobial activity.

17

1 INTRODUÇÃO

O conhecimento sobre o uso de plantas medicinais no tratamento de

enfermidades é bastante antigo. Em muitas comunidades e até mesmo nas grandes

cidades é comum a comercialização de plantas medicinais em feiras e mercados

populares. Através do conhecimento popular sobre sua utilização e eficácia, uma grande

quantidade de fitoterápicos é consumida e comercializada em diversos países. Os

constituintes químicos presentes em plantas medicinais nem sempre são conhecidos e

este fato acarreta grande interesse de pesquisadores de diferentes áreas

multidisciplinares como a botânica, a farmacologia e a fitoquímica para o conhecimento

sobre a flora medicinal (MACIEL et al., 2002).

Dentre os biomas encontrados no Brasil (Figura 1), o Cerrado constitui-se em

grande fonte de plantas medicinais, sendo a maioria delas pouco estudada. A palavra

Cerrado é de origem espanhola e significa fechado, termo utilizado para caracterizar a

vegetação arbustivo-herbácea densa que ocorre nesse bioma. Ele ocupa

aproximadamente 22% do território nacional, localizado na porção central do país e

compreende os seguintes estados brasileiros: Mato Grosso, Mato Grosso do Sul,

Rondônia, Goiás, Tocantins, Minas Gerais, Bahia, Maranhão, Piauí, São Paulo e o

Distrito Federal, bem como áreas remanescentes nos Estados do Pará, Roraima e

Amapá. O Cerrado Brasileiro é cortado pelas três maiores bacias hidrográficas da

América do Sul: Amazônica, Platina e Sanfranciscana (FERREIRA, 2008).

Figura 1 - Mapa demonstrativo dos Biomas encontrados no Brasil.

Fonte: IBGE (2004).

18

O clima do Cerrado é caracterizado por duas estações climáticas bem definidas:

invernos secos e verões chuvosos. A estação seca ocorre entre os meses de abril e

setembro. Nesse período a umidade relativa do ar é baixa, contribuindo para a

ocorrência de incêndios e a estação chuvosa ocorre entre os meses de outubro a março,

período onde a flora do Cerrado se torna mais exuberante. O solo apresenta

características bem marcantes, é bastante antigo, quimicamente ácido (pH 4,3 a 6,2) e

profundo. Devido à profundidade do solo e a presença de água nas camadas mais

profundas, as árvores e os arbustos possuem complexos sistemas de raízes que os

ajudam no período mais seco, garantindo a sobrevivência e proteção contra as

queimadas. Devido ao fato de abranger uma área muito grande, a vegetação do Cerrado

é dividida em onze tipos fitofisionômicos, agrupados em três formações: Florestal

(Mata Ciliar, Mata de Galeria, Mata Seca e Cerradão), Savânica (Cerrado sentido

restrito, Parque de Cerrado, Palmeiral e Vereda) e Campestre (Campo Sujo, Campo

Rupestre e Campo Limpo) (SANTOS et al., 2011).

O Cerrado sofreu uma ocupação desordenada e isso provocou grandes

modificações no bioma. As principais causas dos impactos ambientais foram:

implantação e construção de estradas, desmatamento e empobrecimento genético,

degradação dos solos (decorrente das erosões, enchentes, elevadas concentrações de

fertilizantes e adubos químicos, entre outros), introdução de espécies exóticas (causa a

extinção de espécies nativas, competição com a nova espécie), contaminação química e

física da água, sistemas de irrigação, exploração mineral e formação de reservatórios

(FERREIRA, 2008).

Em 2004 foi lançado pelo Ministério do Meio Ambiente o Programa Nacional

de Conservação e Uso Sustentável do Bioma Cerrado com o objetivo de promover a

conservação, restauração e recuperação no Bioma Cerrado para reverter os impactos

socioambientais negativos causados pela ocupação desordenada (BRASIL, 2004).

Encontra-se no Cerrado diversas espécies farmacologicamente ativas utilizadas

na medicina popular, em virtude da grande diversidade de ordens, famílias e gêneros.

Segundo Farnsworth, (1988 apud PEREIRA et al., 2007), “quanto maior a diversidade

taxonômica em níveis superiores, maior é o distanciamento filogenético entre as

espécies e maior é a diferença e diversidade química entre elas” contribuindo para o

grande potencial de compostos bioativos produzidos pelas espécies do Cerrado.

Existem na literatura alguns trabalhos que relatam o uso de várias plantas

medicinais do Cerrado pela população (VIEIRA; MARTINS, 2000; RODRIGUES;

19

CARVALHO, 2001; GUARIM-NETO; MORAIS, 2003), contudo ainda é necessário

realizar estudos etnobotânicos para aprofundar os conhecimentos de espécies utilizadas

na medicina popular, identificar essas espécies e as substâncias biologicamente ativas

para comprovar a ação terapêutica e também avaliar sua toxicidade.

Os princípios ativos encontrados em plantas medicinais são formados pelo

metabolismo secundário, obtidos a partir da síntese entre metabólitos primários. As

principais classes dos metabólitos secundários são os compostos fenólicos, alcalóides e

terpenos. Esses são os compostos responsáveis pelos efeitos medicinais e/ou tóxicos

encontrados nas plantas e são compostos de grande importância ecológica, pois atuam

tanto no metabolismo de defesa das plantas quanto na polinização para a perpetuação de

espécies nativas (LÓPEZ, 2006).

1.1 METABÓLITOS SECUNDÁRIOS

Os organismos vivos produzem compostos essenciais à sua sobrevivência como

açúcares, aminoácidos, ácidos graxos, proteínas e lipídios, que são denominados

metabólitos primários. Os vegetais são capazes de produzir outras substâncias não

necessariamente essenciais ao organismo, mas que garantem vantagens na

sobrevivência e perpetuação da espécie no ecossistema, denominados metabólitos

secundários (FONSECA, 2001).

Os compostos do metabolismo secundário desempenham diferentes funções nas

plantas. Alguns são responsáveis por conferir cor em flores e frutos e possui um papel

importante na reprodução ao atrair insetos polinizadores, ou atraindo animais que

utilizam os frutos como fonte de alimento e contribuem para a disseminação das

sementes (GARCÍA; CARRIL, 2009). Outros compostos possuem a função de proteger

a planta contra ataque de predadores, eles conferem à planta sabores amargos tornando-

a indigesta ou venenosa ou atuam como pesticidas naturais (GALLO et al., 2002).

Os metabólitos secundários podem ser divididos em três grupos distintos:

terpenos, compostos fenólicos e compostos nitrogenados (Figura 2). Os terpenos são

sintetizados a partir da acetil-CoA, via rota do ácido mevalônico, ou via rota do

metileritritol fosfato (MEP). Os compostos fenólicos são biossintetizados a partir de

duas rotas principais, do ácido chiquímico e do ácido malônico e os compostos

nitrogenados são sintetizados a partir dos aminoácidos (TAIZ; ZEIGER, 2004).

20

Figura 2 - Esquema das vias do metabolismo secundário de plantas.

Fonte: Simões (2003).

1.2.1 Terpenos

Os terpenos ou terpenóides constituem o maior grupo de metabólitos

secundários. São derivados do isopreno (C5) e são classificados em monoterpenos

(C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20), triterpenos (C30) e tetraterpenos (C40).

(DEWICK, 2009).

A duas rotas principais na biossíntese de terpenos, ocorrem em organelas

diferentes da célula vegetal. Na rota do ácido mevalônico, que ocorre no citoplasma da

mesma, (Figura 3), três moléculas de acetil-CoA reagem para formar o ácido

mevalônico e este, após sofrer reações de piro-fosforilação, descarboxilação e

desidratação, resulta no isopentenil-difosfato (IPP) (TAIZ; ZEIGER, 2004). Este

composto ativado de fósforo se converte em seu isômero dimetilalil-difosfato

(DMAPP), o qual é biossintetizado pela rota do MEP que ocorre nos cloroplastos,

possui um bom grupo de saída, o oxigênio-pirofosfato (OPP). Após a protonação do seu

21

oxigênio e, consequentemente, a formação do carbocátion alílico, ocorre a dimerização,

com formação do geranil difosfato (GPP). Na rota do MEP, ocorre a reação de

condensação entre uma molécula de gliceraldeído-3-fosfato e piruvato (Figura 3), que

origina o DMAPP que se converte em seu isômero IPP (DEWICK, 2009).

Figura 3: Esquema da síntese de terpenos e a sua classificação de acordo com as

unidades de isopreno.

Fonte: García; Carril (2009).

CH3 C CH2 CH2

OH

CH2

COOH

OH

Acetil-CoA (3x)

Ácido mevalônico

CH2

CCH2

CH2 O

CH3

PP

Isopentenil difosfato (IPP)

RO

TA D

O Á

CID

O M

EVA

LÔN

ICO

CIT

OP

LASM

A

C

CH

CH2 OP

OH

HO

CH3 C

O

COOH

RO

TA D

O M

ETILERITR

ITOL FO

SFATO

CLO

RO

PLA

STO

Gliceraldeído-3-P Piruvato

CH2 CH

OH OH

OHCH3

CH2 O P

Metileritritol fosfato

CH3

C

CH

CH2

CH3

O PP

Dimetilalil difosfato (DMAPP)

CH3

C

CH

CH3

CH2

CH2 CH

CH2 O

CH3

PP

CH3

C

CH

CH2

CH2

C

CH

CH2

CH2

C

CH

CH2 O

CH3 CH3CH3

PP

CH3 CH

CH2

CH2CH

CH2

CH2CH

CH2

CH2 CH

CH2

CH3CH3

CH3 CH3

O PP

C S CoA

O

CH3

Geranil difosfato (GPP)

Farnesil difosfato (FPP)

Geranilgeranil difosfato (GGPP)

Politerpenos

IPP

IPP

Isopreno (C5)

Monoterpenos (C10)

Sesquiterpenos (C15)

Diterpenos (C20)

Triterpenos (C30)

Tetraterpenos (C40)

2 x

2 x

22

O IPP e seu isômero DMAPP são os precursores na biossíntese dos terpenos.

Eles combinam-se, também, por meio de reações de condensação para formar moléculas

maiores. Na formação dos monoterpenos o IPP e o DMAPP se juntam para formar o

geranil difosfato (GPP), formado por 10 átomos de carbono. O GPP, por sua vez, pode

reagir com outra molécula de IPP e formar o farnesil difosfato (FPP), composto

formado por 15 átomos de carbono e precursor dos sesquiterpenos, e assim

sucessivamente até formar os politerpenos, como observado na Figura 3 (TAIZ;

ZEIGER, 2004; GARCÍA; CARRIL, 2009; DEWICK, 2009).

Os monoterpenos são os principais constituintes dos óleos essenciais e são

importantes na indústria de perfumes e fragrâncias. Alguns compostos atuam como

herbicidas, pesticidas, agentes antimicrobianos e agentes anticarcinogênicos em

alimentos. São biodegradáveis e por isso são utilizados também no controle de pragas

(SILVA, 2005).

Alguns monoterpenos (Figura 4) são reconhecidos por suas propriedades

medicinais e flavorizantes. O mirceno é utilizado na fabricação de perfumes; o

lavandulol é um ingrediente presente no óleo da lavanda, utilizado em perfumes

masculinos; a carvona apresenta atividade fungicida; o linalol é um composto

aromatizante utilizado em chás; e o eucaliptol, principal componente do óleo de

eucalipto, diminui dores e inflamações (SILVA, 2008).

Figura 4: Estruturas de alguns monoterpenos.

Fonte: Silva (2008).

Os sesquiterpenos são a classe de terpenos com maior número de representantes.

Cerca de 5000 compostos são conhecidos. Eles também estão presentes em óleos

23

essenciais de várias plantas. Vários sesquiterpenos possuem atividades biológicas

(Figura 5), dentre eles destacam-se o beta-bisaboleno e o bergamoteno (que têm ação

alelopática, inibindo o crescimento de raízes), o capsidiol e o hemigossipol

(fitoalexinas, substâncias que atuam no sistema de defesa das plantas) e o debneiol, que

apresenta atividade fungitotóxica (SEIGLER, 1998 apud GUEDES, 2004).

Figura 5: Estruturas de alguns sesquiterpenos com atividade biológica.

Fonte: Guedes (2004).

Os limonóides são triterpenos que possuem características amargas e atuam

contra herbívoros. A azadiractina é um potente repelente de insetos usado na indústria

alimentícia e na agricultura para o controle de pragas. Os esteróides são formados a

partir dos triterpenos. Eles participam da formação das membranas celulares na planta.

A ecdisona é um esteróide que possui função protetora contra insetos (GARCÍA;

CARRIL, 2009). As estruturas da azadiractina e ecdisona estão apresentadas na Figura

6.

Figura 6: Estruturas da azadiractina e ecdisona.

Fonte: García; Carril (2009).

24

1.2.2 Compostos fenólicos

São substâncias bioativas, amplamente distribuídas no reino vegetal. São

formados por um ou mais anéis aromáticos hidroxilados, sendo responsáveis pela

atividade antioxidante de vegetais. Apresentam propriedades de óxido-redução atuando

na absorção e neutralização de radicais livres, pois possuem elétrons π em sua estrutura

que estabilizam o radical formado pela oxidação do fenol (HORST, 2008). Devido à

grande diversidade estrutural dos compostos fenólicos, eles podem ser classificados de

acordo com a cadeia carbônica principal que constitui o polifenol, apresentado na

Tabela 1.

Tabela 1: Classificação dos compostos fenólicos de acordo com a cadeia principal

(LEMOS, 2008).

ESTRUTURA CLASSE

C6 Fenóis

C6-C1 Ácidos hidroxibenzóicos

C6-C3 Acetofenonas, ácidos fenilacéticos e hidroxicinâmicos, cumarinas

e cromonas

C6-C4 Naftoquinonas

C6-C1-C6 Benzofenonas e xantonas

C6-C2-C6 Estilbenzenos e antraquinonas

C6-C3-C6 Flavonóides: flavonóis, antocianinas, flavonas, flavanonas,

flavanóis e isoflavonas

(C6-C3-C6)2 Biflavonóides

(C6-C1)n Taninos hidrolisáveis

(C6-C3-C6)n Taninos condensados ou proantocianidinas C6 – anel benzênico

Os flavonóides são uma importante classe de compostos fenólicos formados via

ácido malônico a partir de uma unidade de cinamoil-CoA, a qual reage através de

reações de eliminação, catalisada pela enzima PKS tipo III, com três moléculas de

malonil-CoA, formando um policetídeo. Este, através de reações de Claisen e

enolizações leva a formação de anéis aromáticos, formando os flavonóides (DEWICK,

2009), os quais são moléculas com quinze átomos de carbono arranjados em três anéis

(C6-C3-C6), sendo dois anéis fenólicos substituídos (A e B) e um anel heterocíclico

oxigenado central C, acoplado ao anel A (Figura 7).

25

Figura 7: Estrutura e numeração básica de um flavonóide.

Fonte: Rocha (2011a).

Devido a sua diversidade estrutural, os flavonóides são subdivididos em classes,

de acordo com o grau de insaturação e oxidação do anel C, apresentadas na Figura 8.

Figura 8: Estruturas das principais classes dos flavonóides.

Fonte: Dutra (2009).

Os flavonóides possuem propriedades farmacológicas comprovadas no

organismo humano, como capacidade antioxidativa, atividade anti-inflamatória, ação

antialérgica, atividade contra o desenvolvimento de tumores, anti-hepatotóxica,

antiulcerogênica, atividades antiplaquetária, antimicrobianas e antivirais (LOPES et al.,

2000).

A capacidade antioxidante é a propriedade mais difundida dos flavonóides. É

comprovada sua eficácia no combate ao envelhecimento precoce ao inibir a ação da

enzima xantina oxidase, responsável pela oxidação dos tecidos (DÔRES, 2007). Eles

são compostos doadores de elétrons e possuem estruturas químicas conjugadas ricas em

grupos hidroxilas, com grande potencial de ação sobre agentes oxidantes. Eles reagem

26

inativando ânions superóxido, oxigênio singleto, radicais peróxidos de lipídios e/ou

estabilizando radicais livres envolvidos no processo oxidativo através da hidrogenação

ou complexação com espécies oxidantes. Sua ação antioxidante pode ser representada

de acordo com as equações 1 e 2 abaixo (MACHADO et al., 2008):

Flavonoid (OH) + R• → flavonoid (O•) + RH Equação 1

Flavonoid (OCH3) + R• → flavonoid (O•) + RCH3 Equação 2

Nas plantas os flavonóides desempenham diversas funções, entre elas, proteção

contra radiação ultravioleta B (os pigmentos formados pelos flavonóides atuam como

absorventes da radiação UV-B agindo como filtro e evitando que a radiação incida

sobre outras moléculas celulares como o DNA) e produção de fitoalexinas contra

ataques microbianos. Nesse contexto, destacam-se os isoflavonóides, flavonas e

flavanonas que inibem o crescimento das micelas, esporos e partículas virais (DÔRES,

2007).

Os taninos também pertencem ao grupo de compostos fenólicos e apresentam

grande interesse econômico e ecológico como metabólitos secundários. Eles são

encontrados na forma de ésteres ou de heterosídeos, sendo solúveis em água e em

solventes orgânicos polares. São responsáveis pelo sabor adstringente de algumas frutas

e produtos vegetais, em razão da precipitação de glicoproteínas salivares, que ocasiona a

perda do poder lubrificante. São compostos reativos quimicamente e formam ligação de

hidrogênio intra e intermoleculares. Podem ser identificados em extratos vegetais por

meio da precipitação de proteínas e pela oxidação por influência de metais como o

cloreto férrico que provoca o escurecimento da solução (MONTEIRO et al., 2005).

Os taninos são classificados de acordo com a sua estrutura química em taninos

hidrolisáveis e taninos condensados. Os hidrolisáveis são ésteres de ácidos gálico e

elágicos glicolisados, obtidos pela rota do chiquimato em que o grupo hidroxila do

açúcar é esterificado com os ácidos fenólicos (Figura 9). Os ésteres do ácido

hexaidroxidifênico são formados pelo acoplamento oxidativo fenólico de funções galoil

catalisados pela enzima tipo lacase oxidase fenol (DEWICK, 2009).

27

Figura 9: Esquema da hidrólise dos taninos: galactoninos produzem ácido gálico após

hidrólise; e elagitaninos produzem ácido elágico após hidrólise.

Fonte: Queiroz (2002).

Os taninos condensados (Figura 10) são parecidos com os flavonóides, portanto,

são provenientes de seu metabolismo, pela hidroxilação de uma flavanona. Consistem

em polímeros de flavan-3-ol e/ou flavan-3,4-diol. (DÔRES, 2007; MONTEIRO et al.,

2005; LEMOS, 2008; QUEIROZ et al., 2002).

Figura 10: Estrutura de uma proantocianidina, um tanino condensado.

Fonte: Queiroz (2002).

28

A palavra "tanino", empregada na literatura botânica, é derivada do termo

“tanante”, significando que os taninos evitam a putrefação das peles dos animais e assim

elas podem ser transformadas em couros (CARVALHO et al., 2002; MONTEIRO et al.,

2005).

Os taninos estão envolvidos no mecanismo de defesa das plantas contra ataques

de fungos, bactérias, vírus, insetos e herbívoros. Ao sofrer ataque dos fitófagos, a planta

libera substâncias de sabor amargo ou adstringente ao paladar dos animais, fato que

pode ser explicado pela característica dos taninos de se associarem às glicoproteínas

salivares (SILVA, 2001). Além deste fato, eles aumentam o tempo de vida da planta no

solo, pois proporcionam um aumento no estoque de nutrientes da planta para o próximo

período de vegetação, protegendo-a contra infertilidade do solo e seca (NOZELLA,

2001).

Eles apresentam diversas atividades biológicas e farmacológicas como: efeito

antidiarrético, anti-séptico, antimicrobiano e antifúngico, ação bactericida, moluscida,

antielmíntica e antiepatóxica, inibição da replicação do HIV (os taninos atuam na

inibição da transcriptase reversa, dificultando a replicação viral), atividades anti-

tumorais e inibição de enzimas. Também são utilizados em algumas intoxicações, no

tratamento de feridas, queimaduras e inflamações da pele (HASLAM, 1996;

MONTEIRO et al., 2005).

O uso dos taninos no tratamento de doenças está relacionado a três fatores:

complexação com íons metálicos (ferro, manganês, vanádio, cobre, alumínio, cálcio,

entre outros), propriedades antioxidantes frente a radicais livres e a sua capacidade de

complexação com macromoléculas tais como proteínas e polissacarídeos. (HASLAM,

1996).

1.2.3 Alcaloides

São compostos nitrogenados farmacologicamente ativos de baixa massa

molecular e que possuem características alcalinas, fato que facilita o isolamento e a

purificação destes compostos. Entretanto, o grau de basicidade depende da estrutura

molecular do alcaloide e da presença e localidade de outros grupos funcionais.

(DEWICK, 2009). Para exemplificar a estrutura de um alcaloide, a Figura 11 apresenta

a estrutura da morfina, um alcaloide isolado da espécie Papaver somniferum, utilizado

pelas suas propriedades soponíferas e analgésicas (PINTO, 2002). São compostos

29

solúveis em água e apresentam várias atividades biológicas. Dentre elas a inseticida na

proteção da planta contra insetos predadores (TAIZ; ZEIGER, 2004).

Figura 11: Estrutura do alcaloide morfina.

Fonte: Pinto (2002).

São sintetizados a partir do metabolismo secundário das plantas, através de

reações de descarboxilação dos aminoácidos ou a partir de intermediários envolvidos na

síntese destes. Os principais aminoácidos envolvidos na biossíntese dos alcaloides são

ornitina, lisina, ácido nicotínico, tirosina, triptofano, ácido antranílico e histidina

(DEWICK, 2009). Na sua rota biossintética, as enzimas triptofano descarboxilase e

tirosina descarboxilase modificam estes aminoácidos transformando-os em precursores

de alcalóides e desviando-os do processo de síntese de proteínas (PORTO, 2009).

Nos seres humanos os alcalóides desempenham funções fisiológicas e

psicológicas devido a possuírem interação com neurotransmissores, como a cocaína,

nicotina, dopamina, propranolol, metoprolol e nadolol. Em altas concentrações estes

alcalóides são tóxicos, contudo, em baixas concentrações têm ação terapêutica, agindo

como relaxantes musculares, tranquilizantes e analgésicos (GARCÍA; CARRIL, 2009;

DEWICK, 2009).

1.2.4 Xantonas

A palavra xantona é originada do grego e significa amarelo, que é a cor

característica desses compostos. São uma classe de substâncias formadas

estruturalmente por dois anéis benzênicos A e B e uma gama-pirona central C (Figura

12). No anel A, nas posições 1-4 e no anel B, nas posições 5-8 podem ocorrer

substituição nos átomos de carbonos, originando vários derivados xantônicos obtidos

por meio naturais ou sintéticos (CORRÊA, 2009).

30

Figura 12: Estrutura básica de xantonas com núcleos numerados.

Fonte: Pedro (2002).

A mangiferina (Figura 13) é uma xantona que possui grande versatilidade de

ações biológicas e farmacológicas como função neuroprotetora, cardioprotetora,

hepatoprotetora, anticâncer, antioxidante, anti-inflamatória e antidiabética (CANUTO,

2009).

Figura 13: Estrutura da xantona glicosilada mangiferina - um composto bioativo de

manga (Mangifera indica L.).

Fonte: Canuto (2009).

A mangostina (Figura 14) é outro exemplo de xantona isolada do cerne da

madeira de Garcinia mangostana, conhecida como mangostão. As xantonas são os

principais metabólitos secundários presentes no extrato hexânico dessa espécie, a qual

também apresenta vários derivados prenilados (NILAR, 2002). O fruto dessa espécie,

também apresenta xantonas preniladas que mostraram atividade inibitória contra os

fungos fitopatogênicos Fusarium oxysporum vasinfectum, Alternaria tenuis e

Dreschlera oryzae (GOPALAKRISHNAN et al., 1997).

31

Figura 14: Estrutura da xantona prenilada – mangostina.

Fonte: Nilar (2002).

A globulixantona E (Figura 15) isolada da casca da raiz de Symphonia

globulifera, é um xantona que apresentou atividade antimicrobiana contra as bactérias

gram-positivas Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis e Vibrio anguillarium com

valores de CIM (em µg mL-1

) de 4,51, 3,12 e 5,56, respectivamente. (NKENGFACK et

al., 2002).

Figura 15: Estrutura da bis-xantona – globulixantona E.

Fonte: Nkengfack (2002).

A xantofulvina (Figura 16) isolada do fungo Penicillium sp. pode ser utilizada

no tratamento da regeneração neural em alguns tipos de anosmia (KIKUCHI et al.,

2003).

32

Figura 16: Estrutura da xantona xantofulvina.

Fonte: Corrêa (2009).

A possibilidade de inserção de diferentes substituintes em diferentes posições na

estrutura das xantonas permite uma grande variedade de estruturas que apresentam

atividade antioxidante, anti-inflamatória, anticancerígena, antifúngica, antiviral, entre

outras (POULI; MARAKOS, 2009). As xantonas de origem natural possuem os

substituintes em posições determinadas pela rota biossintética, assim a síntese de novos

compostos pode ampliar as possibilidades das posições dos substituintes e identificar

qual a característica da estrutura responsável pela atividade biológica. No trabalho de

Pedro e outros (2002), vinte e sete xantonas foram avaliadas em testes in vitro pela

capacidade de inibir o crescimento de três linhagens de células cancerígenas humanas,

MCF-7 câncer de mama, TK-10 câncer renal e UACC-62 melanoma, os resultados

mostraram que a posição e o número de substituintes no núcleo xântônico interfere nos

efeitos das xantonas.

1.2.5 Óleos essenciais

Óleos essenciais são também chamados de óleos voláteis e constituem um dos

mais importantes grupos de matérias primas para a indústria. São constituídos

principalmente de monoterpenos, sesquiterpenos, fenilpropanóides (Figura 17) e outras

substâncias de baixa massa molecular, formando misturas complexas de substâncias

voláteis odoríferas e líquidas que formam o “bouquet” de cada óleo essencial

(CRAVEIRO; QUEIROZ, 1993). Podem ser encontrados nas folhas, flores, cascas,

madeira, raízes, frutos e sementes das plantas.

33

Figura 17: Estrutura do fenilpropanóide ácido cinâmico e do terpeno beta-mirceno.

Fonte: Dewick (2009).

A principal característica desses óleos essenciais é a volatilidade e isso os

diferencia dos óleos fixos, os quais são formados por ácidos monocarboxílicos de cadeia

longa saturada ou insaturada. Apresentam também outras características como:

aparência oleosa à temperatura ambiente, aroma agradável e intenso, solubilidade em

solventes orgânicos apolares e solventes de baixa polaridade e a maioria são incolores

ou ligeiramente amarelados (LUPE, 2007).

Os óleos essenciais são importantes na sociedade por serem utilizados em

diversas indústrias como a farmacêutica, a cosmética e a alimentícia. Eles são usados

como aromas, fragrâncias, analgésicos, antissépticos, sedativos, expectorantes na

indústria farmacêutica e na preparação de infusões para extrair os princípios ativos na

medicina popular (BIZZO et al., 2009; FONSECA, 2001).

Os principais óleos produzidos no Brasil são: óleo essencial de laranja, Citrus

cinensis L. Osbeck, com maior produção; óleo essencial de eucalipto, com destaque

para a produção de óleo medicinal de Eucalyptus globulus e óleo para a perfumaria de

E. citriodora, rica em citronelal e E. staigeriana, rica em citral; e óleo essencial de pau-

rosa, Aniba roseaodora var amazonica, o Brasil é o único país fornecedor desse óleo no

mundo. O linalol é o principal constituinte desse óleo extraído da madeira da planta e o

estado de Amazonas é o maior exportador (BIZZO et al., 2009).

Os óleos essenciais fazem parte do metabolismo secundário das plantas e alguns

fatores como o horário, a época de colheita e o ataque de patógenos podem influenciar

na produção e variabilidade dos óleos. Além disso, a composição pode variar

dependendo da localização e idade da planta (FONSECA, 2001). Assim, para a

produção de compostos químicos desejáveis é importante o estudo do ambiente físico

que a planta vive.

34

1.3 CONSTITUINTES QUÍMICOS DA MADEIRA E CASCA

A madeira é um material biológico bastante conhecido e utilizado como matéria-

prima em diversas áreas como indústria de papel e celulose, marcenaria e carpintaria. É

um material heterogêneo cuja composição química e física não pode ser determinada

com precisão, uma vez que varia dentro da mesma espécie, com as condições

ambientais como localização, clima, solo entre outros e com a idade da planta. Contudo,

sua composição química pode ser dividida em dois grupos (Figura 18): componentes

estruturais (substâncias macromoleculares que formam a parede celular das madeiras:

celulose, hemicelulose e lignina) e componentes não estruturais ou extrativos

(substâncias de baixa massa molecular: extrativos e substâncias minerais) (SILVA,

2010).

Figura 18: Esquema dos constituintes químicos da madeira.

Fonte: Silva (2010).

O tronco é constituído por seis camadas: casca externa, casca interna, câmbio

vascular, alburno, cerne e âmago (Figura 19). A casca externa oferece proteção

mecânica para a casca interna e também, ajuda a limitar a perda de água por

evaporação. A casca interna (floema) é o tecido através do qual os açúcares produzidos

pela fotossíntese são transportados das folhas para as raízes. O câmbio vascular é a

camada entre a casca e a madeira e é responsável pela produção de ambos os tecidos. O

alburno é a “vida ativa” da madeira, responsável pela condução de água ou seiva das

raízes para as folhas. O âmago no centro do tronco é o resto do crescimento inicial do

tronco, antes da madeira ser formada (WIEDENHOEFT; MILLER, 2005).

35

Figura 19: Aspectos macroscópicos de uma secção transversal do tronco de uma árvore.

Fonte: Adaptado de Klock (2005).

A madeira é mais bem definida quimicamente como um biopolímero

tridimensional, formada por celulose, hemicelulose, lignina e uma menor quantidade de

extrativos e compostos inorgânicos. O principal componente da árvore é a água, mas em

base seca, a madeira é constituída de polímeros de açúcar (carboidratos, 65-75%) e

lignina (18-35%). Pela análise elementar da madeira, sua constituição é 50% de

carbono, 44% de oxigênio e 6% de hidrogênio (ROWELL et al., 2005). Botanicamente

as árvores podem ser classificadas em coníferas (madeiras moles, gimnospermas) e

folhosas (madeiras duras, angiospermas – plantas com frutos) (WIEDENHOEFT;

MILLER, 2005).

A casca é um tecido complexo composto de duas regiões: casca interna,

conhecida como floema ou entrecasca e casca externa, conhecida também como

ritidoma ou periderme. É dividida da madeira ou xilema pelo câmbio vascular. A

composição química da casca é complexa em comparação com a da madeira e varia

entre diferentes espécies e entre casca interna e externa. Muitos constituintes químicos

da madeira também estão presentes na casca, porém em diferentes proporções

(ROWELL et al., 2005).

Substâncias macromoleculares

A maior porção de carboidratos da madeira é composta de polímeros de celulose

e hemicelulose. A combinação de celulose (40-45%) e hemicelulose (15-25%) é

chamada holocelulose e geralmente representa 65-70% do peso seco da madeira

(ROWELL et al., 2005).

36

A celulose é o principal constituinte da madeira. É um polímero

(homopolissacarídeo) constituído de unidades de beta-D-glicose, ligadas entre si através

de uma ligação glicosídica entre os carbonos 1 e 4 (Figura 20). Suas moléculas são

lineares e têm grande tendência em formar ligações de hidrogênio intra e

intermoleculares porque em cada unidade de glicose há três grupos hidroxila. Como

conseqüência da sua estrutura fibrosa (regiões ordenadas e amorfas) e da forte ligação

de hidrogênio em sua molécula, a celulose possui alta resistência à tração e elevada

rigidez e é insolúvel na maioria dos solventes (SILVA, 2010; SJÖSTRÖM, 1993a).

Figura 20: Esquema de formação da estrutura da celulose. Os substituintes OH-2, OH-3

e CH2OH estão na orientação equatorial.

Fonte: Adaptado de Morais (2005).

Devido ao alto teor de extrativos da casca, especialmente de suberina, para o

isolamento da celulose é necessário condições rigorosas de análise, o que provoca a

degradação da celulose no processo de isolamento. Além disso, o conteúdo de celulose

presente na casca é baixo (ROWELL et al., 2005).

As hemiceluloses são formadas por polissacarídeos heterogêneos como mostra a

figura 21, diferenciando da celulose que é constituída apenas por unidades de glicose.

Têm a função de suporte na parede celular assim como a celulose. São facilmente

hidrolisadas por ácidos em seus monômeros que consistem principalmente em D-

glicose, D-manose, D-galactose, D-xilose, L-arabinose e em menor quantidade de

ácidos urônicos (SJÖSTRÖM, 1993a). As cadeias carbônicas das hemiceluloses são

mais curtas que as da celulose e podem conter ramificações (KLOCK et al., 2005). Na

maioria das análises, as hemiceluloses encontradas na madeira são similares às

encontradas na casca, com algumas variações na composição (ROWELL et al., 2005).

37

Figura 21: Estrutura da galactoglucomanana. Unidades de açúcar: beta-D-glicose, beta-

D-manose e alfa-D-galactose.

Fonte: Morais (2005).

A estrutura da lignina é amorfa, altamente complexa e constituída por polímeros

aromáticos ramificados de unidades de fenilpropanóides. A estrutura tridimensional do

polímero é composta de ligações C―C e C―O―C (ROWELL et al., 2005). É a

segunda substância orgânica mais abundante na plantas, perdendo somente para a

celulose. É insolúvel na maioria dos solventes orgânicos o que torna sua extração muito

difícil sem ocorrer degradação. É encontrada na parede celular de vários tecidos de

suporte e transporte, nos traqueídes e nos vasos do xilema. Possui função estrutural –

fortalece os caules e tecidos vasculares permitindo o crescimento vertical e a condução

de água e minerais através do xilema – e função protetora, devido sua resistência

mecânica e natureza química evita que as plantas sirvam de alimento para os herbívoros

tornando-as indigeríveis (GARCÍA; CARRIL, 2009).

Os precursores da biossíntese da lignina são o álcool p-cumarílico, álcool

coniferílico e álcool sinapílico (Figura 22). A lignina da madeira pode ser classificada

de acordo com a quantidade dos monômeros guaiacila (G), siringila (S) e p-

hidroxifenila (H) derivados dos álcoois coniferílico, sinapílico e p-cumarílico,

respectivamente (BARBOSA et al., 2008).

Figura 22: Estrutura dos álcoois precursores das unidades fenilpropanóides guaiacila

(G), siringila (S) e p-hidroxifenila (H).

Fonte: Barbosa (2008).

38

A lignina de madeira mole é obtida como produto da polimerização do álcool

coniferílico e é chamada de lignina guaiacil. A lignina de madeira dura é formada

principalmente por unidades de siringil-guaiacil devido à copolimerização dos alcoóis

coniferílico e sinapílico (ROWELL et al., 2005). A estrutura de uma lignina é

apresentada na figura 23.

Figura 23: Estrutura proposta para lignina de madeira moída do Eucalyptus grandis.

Fonte: Morais (1993).

Substâncias de baixa massa molecular

Os extrativos são formados por uma grande variedade de componentes solúveis

em solventes orgânicos neutros ou água. Constituem um grupo de substâncias da parede

celular formado principalmente de gorduras, ácidos graxos, alcoóis graxos, fenóis,

terpenos, esteróides, ácidos de resina, ceras e muitos outros compostos orgânicos

minoritários. Eles existem como monômeros, dímeros e polímeros. A maioria dos

extrativos está localizada no cerne e são responsáveis pela cor, cheiro e durabilidade da

madeira (ROWELL et al., 2005). Os diferentes tipos de extrativos são importantes para

manter a diversidade biológica de funções da árvore, as gorduras constituem a fonte de

energia das células da madeira e os terpenóides, ácidos de resina e compostos fenólicos

protegem a madeira contra danos microbiológicos ou ataques de insetos (SJÖSTRÖM,

39

1993b). A casca contém maior quantidade de extrativos do que a madeira, a

porcentagem de extrativos pode ser diferente mesmo para mesmas espécies porque

depende do método de extração utilizado (ROWELL et al., 2005).

A madeira contém compostos inorgânicos, medidos como cinzas e não excedem

1% do peso da madeira em base seca. Eles são absorvidos pela árvore através das raízes

e transportados por toda a árvore. Os metais presentes em maior quantidade nas cinzas

da madeira são cálcio, potássio e magnésio, representando 80% das cinzas. Outros

metais encontrados na madeira são manganês, zinco, ferro, alumínio, cromo, níquel

entre outros. Os metais são encontrados como carbonatos, silicatos, oxalatos e fosfatos.

A casca contém maior porcentagem de conteúdo mineral do que a madeira (2-5% do

peso seca da casca), os metais são encontrados como oxalatos, fosfatos, silicatos, entre

outros. Os principais metais encontrados na casca são sódio, cálcio, potássio, manganês,

zinco, fósforo e magnésio (SJÖSTRÖM, 1993b; ROWELL et al., 2005).

1.4 ATIVIDADE ANTIMICROBIANA

A pesquisa por novos agentes antimicrobianos, por exemplo, a partir de extratos

vegetais, se faz necessária devido ao surgimento de microrganismos resistentes aos

medicamentos atuais. O conhecimento da ação terapêutica desses extratos é importante

no campo farmacêutico e cosmético para o desenvolvimento de novos medicamentos

resistentes a microrganismos. O Brasil, o qual possui imensa biodiversidade vegetal, é,

portanto, um país com grande potencial de estudos nessa área (OSTROSKY et al.,

2008).

Os componentes responsáveis pela atividade antimicrobiana de espécies vegetais

são sintetizados a partir do metabolismo secundário da planta (LOGUERCIO et al.,

2005). A utilização de fitoterápicos e de plantas medicinais no tratamento de algumas

doenças, também está relacionada à saúde bucal. As doenças periodontais podem ser

definidas como um processo infeccioso, causado por microrganismos orais, os quais

possuem a capacidade de implantar-se no sulco gengival e produzir substâncias tóxicas

que provocam a degeneração do tecido periodontal (CORDEIRO et al., 2006).

As infecções odontológicas mais comuns descritas na literatura são: a cárie, a

gengivite, a periodontite, a estomatite aftosa e a herpes simples. A cárie dentária é uma

infecção microbiana dos tecidos calcificados dos dentes, em que ocorre a perda mineral

destes, a gengivite é caracterizada por uma inflamação dos tecidos gengivais, que pode

40

evoluir a uma periodontite, uma doença periodontal de maior gravidade, que envolve a

gengiva, o osso alveolar e o ligamento periodontal, caso não seja tratada pode levar à

perda dos dentes. A estomatite aftosa é uma doença caracterizada pelo aparecimento de

úlceras na mucosa da cavidade bucal e a herpes simples é uma doença infecciosa

comum, causada pelo vírus do herpes simples (HSV), que se caracteriza pelo

aparecimento de pequenas bolhas nos lábios (OLIVEIRA et al., 2007). Algumas destas

infecções odontológicas, como a gengivite e a afta são tratadas através da fitoterapia,

utilizando espécies vegetais como cravo da índia, romã, malva, amoreira, camomila,

entre outras (OLIVEIRA et al., 2007).

O crescimento de microrganismos orais na cavidade bucal, é influenciado por

fatores como temperatura, pH, disponibilidade de nutrientes e água, fluxo salivar e

presença de substâncias antimicrobianas. Cada fator, num determinado habitat bucal,

influencia a seleção de microrganismos orais e ajuda a manter o equilíbrio entre as

populações bacterianas. Dessa forma, é observado diferenças da população bacteriana

em diferentes partes da cavidade oral. Algumas espécies de bactérias como as do gênero

estreptococos (S. mutans, S. sobrinus, S. cricetus, S. rattus e S. sanguis) são

encontradas, principalmente, sobre os dentes, enquanto que S. salivarius é encontrada

na língua (MARCOTTE; LAVOIE, 1998).

Nesse contexto, estudos sobre a ação terapêutica e eficácia de plantas medicinais

frente a microrganismos orais, mostra-se como uma alternativa importante para

melhorar o acesso da população aos cuidados com a prevenção e tratamento de doenças

periodontais (CORDEIRO et al., 2006).

1.5 A ESPÉCIE Kielmeyera coriacea Mart. & Zucc

Existem várias espécies pertencentes à família Guttiferae, também denominada

Clusiaceae, no Brasil e algumas delas possuem propriedades medicinais. A família

Clusiaceae foi descrita por Antonie Laurent de Jussieu e apresenta cerca de 1.370

espécies, distribuídas em 45 gêneros. A família é constituída por árvores ou arbustos e

os gêneros Hypericum, Vismia, Clusia, Calophyllum, Garcinia e Kielmeyera têm

importância econômica na produção de madeiras, gomas, pigmentos, óleos essenciais e

resinas (DI STASI; HIRUMA-LIMA, 2002).

No Brasil a família Clusiaceae está distribuída nos domínios fitogeográficos

Amazônia, Caatinga, Cerrado e Mata Atlântica (BITTRICH, 2010a). O gênero

41

Kielmeyera Mart. & Zucc é o segundo com maior número de representantes no Brasil,

com 46 espécies e duas subespécies, perdendo somente para o gênero Clusia L., com 67

espécies e quatro subespécies (FRANCO et al., 2011).

A espécie Kielmeyera coriacea Mart. & Zucc, conhecida popularmente como

pau-santo, pertence à família Clusiaceae e foi descrita por Martius & Zuccarini. Está

distribuída geograficamente no Brasil (Figura 24) nas regiões: Norte (Pará, Amazonas,

Rondônia), Nordeste (Bahia), Centro-Oeste (Mato Grosso, Goiás, Distrito Federal,

Mato Grosso do Sul), Sudeste (Minas Gerais, São Paulo) e Sul (Paraná), (BITTRICH,

2010b).

As plantas do gênero Kielmeyera são endêmicas na América do Sul e a espécie

Kielmeyera coriacea frequentemente documentada, principalmente em cerrados, pode

ser encontrada, além do Brasil, também no Paraguai e Bolívia. Segundo o Global

Biodiversity Information Facility (GBIF, 2011), foram reportadas para esses países 31 e

7 ocorrências, respectivamente, dessa espécie .

Figura 24: Mapa da distribuição geográfica da espécie Kielmeyera coriacea Mart. &

Zucc no Brasil.

Fonte: Bittrich (2010b).

Esta espécie apresenta interesse econômico para a produção de madeira, carvão,

celulose e tanino para a indústria de couro (PINTO et al., 1994). Da casca desta espécie

é extraída a cortiça, muito utilizada na fabricação de placas de revestimentos acústicos,

térmicos e decorativos (ARELLO; PINTO, 1993) e uma resina amarela tônica e

emoliente, usada na medicina popular no tratamento de dores de dentes (CORREA,

1969).

42

A espécie em estudo (Figura 25) apresenta as seguintes características

morfológicas: pode ser encontrada como arbusto ou árvore, com ramos tortuosos sem

pêlos, com cicatrizes, casca espessa de cortiça que se desprega facilmente e cor clara.

Possui látex de cor creme e abundante. As folhas são alternas, coriáceas, reunidas no

ápice dos ramos, tendo até 22 cm de comprimento. As nervuras estão em destaque e em

forma de pena (peninérvea). As inflorescências estão na extremidade dos ramos e

possuem poucas flores (até 7 cm de diâmetro), de pétalas brancas e estames amarelo-

ouro. Os frutos são secos (tipo cápsula) que abrem em 3 partes (valvas) e liberam

grande quantidade de sementes aladas (REDE DE SEMENTES DO CERRADO, 1995).

Figura 25: Imagens que mostram as características morfológicas da espécie Kielmeyera

coriacea. 1 = arbusto; 2 = folhas – nervura central proeminente; 3 = flores no ápice dos

ramos; 4 = tronco suberoro – casca espessa; 5 = fruto tipo cápsula; 6 = fruto aberto.

Fonte: Almeida-Manso (2011).

A espécie Kielmeyera coriacea é uma planta muito rica em xantonas,

substâncias que apresentam propriedades farmacológicas como atividade antitumoral,

antifúngica, antibacteriana, tuberculostática e anti-inflamatória (CORTEZ et al., 1999).

No trabalho de Cortez e outros (1999), oito xantonas e uma bifenila foram

isoladas (Figura 26) do extrato em diclorometano da casca do caule de K. coriacea. No

trabalho de Cortez e outros (1998) foram isolados e identificados dez xantonas, uma

43

bifenila e três tripterpenos do extrato dicloremetano das folhas e caule de K. coriacea.

Dos compostos isolados, quatro xantonas e a bifenila apresentaram atividade

antifúngica contra o fungo patogênico Clasdosporium cucumerinum e duas xantonas

preniladas inibiram o crescimento de Candida albicans.

Figura 26: Estruturas químicas dos compostos isolados do extrato em diclorometano da

casca do caule de Kielmeyera coriacea. 1 = Aucuparina; 2 = 2-hidroxi-1-

metoxixantona; 3 = 3-hidroxi-2,4-dimetoxixantona; 4 = 4-hidroxi-2,3-dimetoxixantona;

5 = 1,3,7-triidroxi-2-(3-metilbut-2-enil)-xantona; 6 = 1,3,5-triidroxi-2-(3-metilbut-2-

enil)-xantona; 7 = 1,3,7-triidroxi-2-(3-hidroxi-3-metilbutil)-xantona; 8 = kielcorina; 9 =

osajaxantona.

Fonte: Cortez (1999).

Dos compostos isolados na Figura 26, a substância 1 (aucuparina) apresentou

atividade antimicrobiana contra Bacillus subtilis com valor de concentração inibitória

mínima (CIM) de 3,12 µg mL-1

e a substância 5 (1,3,7-triidroxi-2-(3-metilbut-2-enil)-

xantona) foi ativa contra Staphylococcus aureus com valor de CIM de 12,5 µg mL-1

(CORTEZ et al., 2002). Alguns trabalhos da literatura que relatam outros estudos

referentes aos extratos da planta são apresentados a seguir.

1

O

R1

R3

R4

R2

O

R1 R2 R3 R4

2 OCH3 OH H H

3 H OCH3 OH OCH3

4 H OCH3 OCH3 OH

O

O

R1

R2

OH

OH

CH3

CH3

O

OH

O

OH

OH

CH3

CH3

OH7

O

O

O

O

H3CO

OH

OCH3

OH

8

O O

O

OH

CH3

CH3

9

OH

OCH3

OCH3

R1 R2

5 H OH

6 OH H

44

Foi avaliado o efeito do extrato hidroalcoolico das folhas (AUDI et al., 2002) e

caule (MARTINS et al., 2004) de Kielmeyera coriacea no sistema nervoso central em

ratos e o extrato da folha mostrou-se efetivo como ansiolítico, mas não como um

antidepressivo e o do caule apresentou perfil de composto ansiolítico e antidepressivo.

Com o objetivo de encontrar novos medicamentos de produtos naturais para o

tratamento da úlcera, Goulart e outros (2005) relataram o efeito do extrato

hidroetanólico do caule de K. coriacea em lesões gástricas induzidas em ratos. Os

resultados mostraram que o extrato aumentou a resistência a agentes necrosantes,

fornecendo efeito de proteção sobre a mucosa gástrica.

A literatura relata que a classe das xantonas inibe o metabolismo energético

mitocondrial. A ação do extrato hidroetanólico do caule foi investigada sobre o

metabolismo energético hepático utilizando uma mitocôndria isolada de fígado de rato.

Os resultados da pesquisa sugerem que o extrato de Kielmeyera coriacea prejudica o

metabolismo energético hepático, atuando como desacoplador e inibidor mitocondrial,

podendo levar ao aparecimento de efeitos adversos. Contudo, esse resultado pode ser à

base da ação antifúngica e antiprotozoário que o extrato apresenta (ZAGOTO et al.,

2006).

A toxicidade do extrato diclorometano do caule de K. coriacea foi avaliada em

roedores e os resultados mostraram que a administração oral do extrato não apresentou

nenhum efeito toxico podendo ser utilizado com segurança (OBICI et al., 2008).

Extratos de K. coriacea foram testados contra o fungo dermatófito Trichophyton

rubrum e apresentaram atividade promissora contra essa fungo. Existe um grande

interesse em descobrir novas substâncias a partir de extratos de plantas do cerrado para

o tratamento de infecções dermatófitas (SILVA et al., 2009).

A ação larvicida sobre larvas de Aedes aegypti do extrato diclorometânico das

folhas de K. coriacea foi avaliada. Os resultados sugerem o fracionamento e a

biomonitoração do extrato para o isolamento de substâncias ativas sobre as larvas do

mosquito A. aegypti (COELHO et al., 2009).

A partir do fracionamento do extrato hexânico da casca da raiz de K. coriacea

obtém-se uma mistura de delta-tocotrienol e o seu dímero (Figura 27). A citotoxidade

dessa mistura foi testada contra quatro células cancerígenas humanas (melanona, cólon,

leucemia e glioblastoma). Os resultados sugerem que a mistura suprime o crescimento

da leucemia e reduz a sobrevivência da célula, dependendo da concentração utilizada

(MESQUITA et al., 2011).

45

Figura 27: Estruturas químicas do delta-tocotrienol (1) e delta-tocotrienol peróxi-

dímero (2).

Fonte: Mesquita (2011).

1.6 FLUXOGRAMAS UTILIZADOS NO PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

Para os procedimentos experimentais a metodologia utilizada encontra-se

resumida nos fluxogramas das Figuras 28 e 29.

Figura 28: Fluxograma de trabalho utilizado na extração e identificação dos óleos

essenciais.

46

Figura 29: Fluxograma de trabalho utilizado nas análises químicas.

Material Vegetal

Revisão bibliográficaColeta

1. Secagem2. Moagem

Determinação de fenóis totais e

proantocianidinas

Avaliação antioxidante com

DPPH

Atividade antimicrobiana

Determinação dos constituintes

macromoleculares

Extração em etanol

Partição líquido-líquido

Espectroscopia IV

Fracionamento em coluna

47

2 OBJETIVOS

2.1 OBJETIVOS GERAIS

Este trabalho teve como objetivo analisar e quantificar os constituintes químicos

das partes aéreas, bem como avaliar a atividade antioxidante e antimicrobiana dos

extratos da espécie Kielmeyera coriacea, conhecida popularmente como pau-santo,

árvore típica do Cerrado brasileiro.

2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Quantificar os constituintes macromoleculares da madeira, casca interna e casca

externa;

Identificar os constituintes voláteis do óleo essencial da folha, flor, casca interna,

casca externa e madeira por CG-EM;

Determinar o teor de fenóis totais e proantocianidinas dos extratos e das

partições;

Caracterizar os extratos e partições por espectroscopia no infravermelho;

Avaliar a atividade antioxidante dos extratos e das partições frente ao radical

livre DPPH;

Fracionar em coluna a partição em diclorometano da casca interna que

apresentou melhor atividade antioxidante;

Avaliar a atividade antimicrobiana dos extratos e das partições frente a

microrganismos bucais (Streptococcus sanguinis, Streptococcus mitis,

Streptococcus mutans e Actinomyces naeslundii).

48

3 JUSTIFICATIVA

O bioma Cerrado é a segunda maior área em abundância de plantas nativas do

Brasil, ocupando 23% do território nacional. Está localizado basicamente no planalto

central e é considerado um complexo vegetacional de grande heterogeneidade

fitofisionômica. Este bioma é apontado como grande detentor de diversidade biológica,

sendo a formação savânica com maior diversidade vegetal do mundo, especialmente

quando se consideram as espécies lenhosas (GUARIM-NETO; MORAIS, 2003).

A flora do Cerrado ainda é pouco conhecida e há poucos estudos voltados para a

identificação de plantas úteis, principalmente quando comparada à diversidade e à área

ocupada. A pouca informação sobre a flora do Cerrado brasileiro acarreta uma grande

perda de conhecimento sobre a utilização de plantas para uso medicinal, uma vez que

estima-se que cerca de 40% do bioma já tenha sido devastado e que este possui somente

1,5% de sua extensão protegida por lei, sendo atualmente a vegetação em maior risco no

país (GUARIM-NETO; MORAIS, 2003).

Neste contexto, nosso grupo de pesquisa de Produtos Naturais do Instituto de

Química da UFU vem estudando algumas espécies nativas e tem interesse em estudar a

espécie vegetal Kielmeyera coriacea Mart. & Zucc, típica do cerrado. Existem poucos

estudos sobre sua identificação química. Seu óleo essencial, por exemplo, ainda não foi

caracterizado. Adicionalmente, ela apresenta grande interesse econômico para produção

de madeira, carvão, celulose, tanino para indústria de couros e placas para revestimento

acústico e é considerada como planta medicinal pelas suas propriedades cercaricidas e

pela presença de xantonas (substâncias medicinais) que são fitonutrinentes com

poderosas propriedades antioxidantes. Com a expansão agrícola nos cerrados, a espécie

K. coriacea vem sendo vítima de uma exploração predatória tornando-se extinta em

muitas regiões (PINTO et al., 1996).

49

4 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL

4.1 COLETA E PREPARO DO MATERIAL VEGETAL

As partes aéreas de Kielmeyera coriacea foram coletadas na cidade de

Uberlândia, em abril de 2010, no bairro Jardim Karaíba, próximo a Vila Royal Park

(18°94’08.27’’S; 48°26’06.40’’W) e transportada para o laboratório de Produtos

Naturais da Universidade Federal de Uberlândia. Em seguida sua exsicata foi preparada,

identificada pelo professor Glein Monteiro de Araújo (Instituto de Biologia – UFU), e

depositada no Herbário da Universidade Federal de Uberlândia (HUFU) com o número

57181. As amostras (folha, madeira, casca interna e casca externa) da planta foram

cortadas, descascadas e posteriormente picadas. A secagem ocorreu em temperatura

ambiente. Após esse período, o material seco foi triturado até a forma de fino pó.

Para a análise de óleo essencial foi utilizado material fresco, coletado poucas

horas antes da extração.

4.2 DETERMINAÇÃO DA UMIDADE

Para a determinação da umidade utilizou-se uma balança de luz infravermelha da

marca Kett, modelo FD-600. Cerca de 1,0 g de amostra foi deixada a uma temperatura

de 105 ºC por quinze minutos até que o teor de umidade permanecesse constante.


MADEIRA DE Kielmeyera coriacea

4.3.1 Determinação do teor de cinzas

Para a determinação do teor de cinzas, aproximadamente de 2 g de amostra foi

transferido para cadinhos de porcelana previamente calcinados, esfriados e pesados.

Após a distribuição uniforme das amostras nos cadinhos, as mesmas foram incineradas

na temperatura de aproximadamente 600 °C por 6 horas. Após esta etapa foram

calculadas as porcentagens de cinzas em relação ao pó que foi submetido ao processo de

secagem.

50

4.3.2 Preparação da amostra livre de extrativos

Uma amostra de aproximadamente 40 g de madeira e cascas foi colocada em um

cartucho de papel filtro e adaptado ao extrator Soxhlet. Foram realizadas três extrações

com 300,0 mL dos solventes: cicloexano, cicloexano:etanol (2:1 v v-1

) e água

sucessivamente. A extração com cada solvente foi feita por um período de 25 horas. Em

seguida, o material vegetal livre de extrativos foi retirado do aparelho Soxhlet e deixado

em dessecador até a evaporação completa do solvente (amostra A).

Esse procedimento de extração foi realizado por mais duas vezes, obtendo-se as

amostras B e C. As amostras A, B e C foram utilizadas na determinação de lignina

insolúvel e lignina solúvel em ácido e determinação de holocelulose.

4.3.3 Determinação de lignina insolúvel em ácido (Lignina de Klason)

Para a determinação de lignina de Klason, lignina solúvel em ácido e da

holocelulose nas cascas é necessário a realização de um pré-tratamento da casca em

meio básico para solubilização de substâncias que também são insolúveis em ácidos

minerais e seriam contabilizadas no rendimento final.

Nesse pré-tratamento, 2 g (40/60 meshes) das cascas foram tratadas com uma

solução de hidróxido de sódio 1% (m v-1

) a 90 °C durante 1 hora. O resíduo obtido foi

filtrado em cadinho de vidro sinterizado, lavado sucessivamente com 100 mL de água

destilada quente, 50,0 mL de ácido acético 10% (v v-1

) e novamente com 200,0 mL de

água quente, seco a 105 3 oC e pesado. O rendimento foi calculado.

A lignina de Klason foi determinada de acordo com o método descrito por

Browning (1967). Aproximadamente 1 g da amostra livre de extrativos e pré-tratada

(40/60 meshes), foi colocada em um béquer e adicionou-se 15,0 mL de uma solução de

ácido sulfúrico 72%, de forma lenta e sob agitação constante. A mistura foi deixada em

repouso por duas horas à temperatura ambiente, agitando a cada 10 minutos. Em

seguida a mistura foi diluída num balão de destilação de 1,0 L com 560,0 mL de água e

refluxada durante 4 horas. Depois disso, a solução foi resfriada, filtrada e o resíduo

lavado com água destilada até pH neutro. O resíduo foi seco em estufa a 105 oC até

massa constante. O rendimento foi determinado pela diferença entre a massa pré-tratada

e a massa do resíduo obtido.

51

4.3.4 Determinação de lignina solúvel

O filtrado do procedimento anterior foi colocado em um balão volumétrico de

1,0 L e completado com água destilada até o volume do balão. A partir dessa solução,

foi retirado 10,0 mL e acrescentado mais 5,0 mL de água destilada, formando assim

uma segunda solução. A partir dessa nova solução foi possível determinar

quantitativamente a lignina solúvel por espectroscopia ultravioleta (UV), a partir da

análise das bandas de absorção nas regiões de 215 e 280 nm do espectro. Foi feito um

branco realizando o mesmo procedimento para determinação de lignina insolúvel,

entretanto, sem a presença de cascas livres de extrativos. A concentração de lignina

solúvel foi calculada segundo a equação 3 (GOLDSCHIMID, 1971 apud MORAIS,

2005):

CL.S. = 300

53,4 280215 AA Equação 3

em que:

CL.S. = concentração em g L-1

de lignina na amostra;

A215 = absorvância da solução a 215 nm menos a absorvância do branco a 215 nm; e

A280 = absorvância da solução a 280 nm menos a absorvância do branco a 280 nm.

4.3.5 Determinação de holocelulose

O teor de holocelulose foi determinado pelo método descrito por Browning

(1967). Inicialmente foi realizado o pré-tratamento de 8,0 g das cascas livres de

extrativos com solução de hidróxido de sódio 1% (m v-1

) como descrito anteriormente.

Em seguida, em um erlenmeyer de 1,0 L foram adicionados cerca de 5,0 g de amostra

livre de extrativos e pré-tratada (40/60 meshes). Foram adicionados 110,0 mL de água

destilada; 3,0 mL de ácido acético glacial; 22,0 mL de solução de acetato de sódio a

20% (m v-1

) e 9,0 mL de clorito de sódio a 40% (m v-1

), respectivamente. A mistura foi

homogeneizada com agitação magnética, vedada com um erlenmeyer de 100,0 mL

invertido para evitar a saída prematura de gases e colocada em banho aquecido a 75 oC

por 60 minutos, sob agitação frequente. A adição dos reagentes foi repetida por mais

três vezes a cada intervalo de 60 minutos, até que foi observada a holocelulose com

coloração branca. Em seguida, a solução foi filtrada em cadinho de vidro sinterizado

sob vácuo. O filtrado foi lavado com cerca de 1,0 L de água destilada, duas porções

52

pequenas de acetona (cerca de 10,0 mL cada porção) e aspirado até a holocelulose ficar

relativamente seca. O produto foi seco em estufa a 70 °C por 24 horas e o rendimento

calculado.

4.4 IDENTIFICAÇÃO DOS COMPOSTOS VOLÁTEIS DE Kielmeyera coriacea

4.4.1 Extração do óleo essencial por hidrodestilação

A extração dos óleos voláteis foi realizada por hidrodestilação em aparelho Clevenger.

Aproximadamente 30 g das amostras frescas (folha, flor, casca externa, casca interna e

madeira) foram colocadas em um balão volumétrico com 150,0 mL de água. Após 4

horas em ebulição, o óleo foi recolhido em um funil de separação com cerca de 2,0 mL

de diclorometano, onde foi separado da fase aquosa (MORAIS et al., 2009). Os óleos

essenciais extraídos foram secos com sulfato de sódio anidro, acondicionados em

pequenos frascos de vidro âmbar e mantidos sob refrigeração, à temperatura de

aproximadamente -18,0 ± 5°C até o momento das análises. A massa do óleo essencial

obtido foi pesada em uma balança analítica, e calculou-se percentagem correspondente

de óleo, em relação à massa da amostra.

4.4.2 Análise dos óleos essenciais por CG-EM

A identificação dos constituintes voláteis foram realizadas por cromatografia

gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM) num aparelho da Shimadzu,

modelo GC17A/QP5000. O programa de temperatura foi de 60-240 °C (3 °C min-1

);

injetor no modo split 1:20 a 220°C; hélio a fluxo constante de 17 mL min-1

. O detector

de massas operou com energia de impacto de 70 eV e foram captados os fragmentos de

40 a 650 u; a temperatura da interface foi de 240 °C. Dois microlitros das amostras

foram injetados. (ADAMS, 2001).

4.4.3 Identificação dos óleos essenciais

A identificação dos compostos foi feita por comparação dos seus espectros de

massas com aqueles armazenados nas bibliotecas de espectros de massas da Wiley (7,

139 e 229) e Nist (127 e 147), por comparação com índices de Kovat tabelados

53

(ADAMS, 2001) e por meio de alguns padrões de terpenos. Para obtenção da equação

do índice de Kovats, foi utilizada uma mistura de padrões de alcanos pares (C8-C20). A

quantificação de cada componente foi obtida através da normalização das áreas dos

picos no cromatograma de íons totais (TIC, total ions chromatografics).

4.5 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

4.5.1 Preparação dos extratos em etanol

Foram pesadas 100,0 g das amostras (folha, madeira e cascas) e transferidas para

um cartucho e colocado em um extrator Soxhlet com 650 mL de etanol. A extração foi

realizada por 6 horas após o inicio da ebulição. A solução obtida foi filtrada e levada a

um evaporador rotativo a 40 °C para retirada do etanol. Os extratos foram guardados em

frascos de vidro e armazenados no freezer a -18,0 ± 5 °C até sua utilização (FERRI,

1996).

4.5.2. Partição líquido-líquido dos extratos em etanol

Os extratos em etanol foram submetidos à partição líquido-líquido com

solventes de polaridades crescentes (cicloexano, diclorometano e acetato de etila). Cada

uma das soluções obtidas foi concentrada em evaporador rotativo, sob pressão reduzida,

fornecendo, então, as respectivas partições do extrato bruto (MATOS, 1997).

4.5.3 Determinação de fenóis totais (FT)

A determinação do teor de fenóis totais presentes no extrato em etanol e nas

partições obtidas foi realizada por meio de espectroscopia na região do visível

utilizando o método de Folin–Ciocalteau (SINGLETON; ROSSI, 1965; SOUSA et al.,

2007) que contém uma mistura de ácidos fosfomolibídico e fosfotungstico, com

formação de um complexo de coloração amarela, e com absorção máxima em 760 nm.

Uma alíquota contendo 25 mg de amostra foi dissolvida em metanol, transferida

quantitativamente para um balão volumétrico de 50,0 mL e o volume final completado

com metanol. Para a reação colorimétrica, uma alíquota de 0,5 mL da solução

54

metanólica de extrato foi adicionada de 2,5 mL de solução aquosa do reativo Folin-

Ciocalteau a 10% e 2,0 mL de carbonato de sódio a 7,5%. A mistura foi incubada por 5

minutos em banho-maria a 50 °C e, posteriormente, a absorvância foi medida a 760 nm,

utilizando-se cubetas de vidro, tendo como “branco” o metanol e todos os reagentes,

menos a amostra. O teor de fenóis totais foi determinado empregando-se a equação da

reta obtida pela curva de calibração construída com padrões de ácido gálico (10, 20, 30,

40, 50, 60, 70 e 80 μg mL-1

) e expressos como mg de EAG (equivalentes de acido

gálico) por grama de extrato.

4.5.4 Determinação do teor de taninos condensados (proantocianidinas)

Para a determinação dos taninos condensados foi utilizado o método da vanilina

(GODEFROOT et al., 1981 apud MORAIS et al., 2009). Uma alíquota contendo 25 mg

de amostra foi dissolvida em metanol, transferida quantitativamente para um balão

volumétrico de 50,0 mL e o volume final completado com metanol. Desta solução foi

retirado uma alíquota de 2,0 mL, transferida para um tubo de ensaio e adicionado 3,0

mL de uma solução recém-preparada de vanilina em ácido sulfúrico 70%, na

concentração de 5,0 mg mL-1

. A mistura foi mantida em um banho de água a uma

temperatura de 50 ºC por 15 minutos. A amostra foi esfriada e a absorbância medida a

500 nm utilizando-se cubetas de vidro, tendo como “branco” o metanol e todos os

reagentes, menos a amostra. O teor de taninos condensados foi determinado

empregando-se a equação da reta obtida pela curva de calibração construída com

padrões de catequina (1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22 e 25 μg mL-1

). A curva padrão foi

construída nas mesmas condições da reação em que a amostra foi substituída pela

catequina. Os resultados foram expressos como mg de ECAT (equivalentes de

catequina) por grama de extrato.

4.5.5 Análise quantitativa da atividade antioxidante

A avaliação quantitativa da atividade antioxidante dos extratos e partições foi

feita seguindo metodologia descrita na literatura, com pequenas modificações,

monitorando-se o consumo do radical livre DPPH pelas amostras, através da medida do

decréscimo da absorbância de soluções de diferentes concentrações. Estas medidas

55

foram feitas em espectrofotômetro UV-Vis no comprimento de onda 517 nm (BRAND-

WILLIAMS et al., 1995; SOUSA et al., 2007).

4.5.5.1 Construção da curva de calibração do DPPH

Preparou-se 50 mL de solução estoque de DPPH em metanol na concentração de

40 μg mL-1

, mantida sob refrigeração e protegida da luz. Foram feitas diluições de 35,

30, 25, 20, 15, 10, 5 e 1 μg mL-1

. A curva de calibração foi construída a partir dos

valores da absorbância a 517 nm de todas as soluções (1 a 40 μg mL-1

), medidas em

cubetas de vidro com percurso óptico de 1 cm e tendo como “branco” o metanol.

4.5.5.2 Leitura das medidas de absorbância nas amostras

Soluções dos extratos em etanol (500 μg mL-1

) e das partições obtidas foram

diluídas nas concentrações de 250, 200, 150, 100, 50 e 25 μg mL-1

. As medidas das

absorbâncias das misturas reacionais (0,3 mL da solução da amostra e 2,7 mL da

solução estoque de DPPH na concentração de 40 μg mL-1

) foram realizadas a 517 nm,

no 1º, 5º e 10º min até completar 1 hora. A mistura de metanol (2,7 mL) e solução em

metanol do extrato e das partições (0,3 mL) foi utilizada como branco. A partir da

equação da curva de calibração e dos valores de absorbância no tempo de 60 min para

cada concentração testada, foram determinados os percentuais de DPPH remanescentes

(% DPPHREM), conforme a Equação 4 (YILDIRIM et al., 2001):

% DPPHREM = [DPPH]T=t / [DPPH]T=0 x 100 Equação 4

onde [DPPH]T=t corresponde à concentração de DPPH no meio, após a reação com o

extrato e [DPPH]T=0 é a concentração inicial de DPPH, ou seja, 40 mg mL-1

. A

concentração eficiente, quantidade de antioxidante necessária para decrescer a

concentração inicial de DPPH em 50% (CE50) foi determinada a partir de uma curva

exponencial de primeira ordem, obtida plotando-se na ordenada as concentrações da

amostra (μg mL-1

) e na abscissa a porcentagem de DPPH remanescente (% DPPHREM).

Os valores de absorbância em todas as concentrações testadas, no tempo de 60 min,

foram também convertidos em porcentagem de atividade antioxidante (AA),

determinada pela Equação 5 (SOUSA et al., 2007):

56

%AA = {[Abscontrole – (Absamostra – Absbranco)] x 100} / Abscontrole Equação 5

Onde: Abscontrole é a absorbância inicial da solução em metanol de DPPH e Absamostra é a

absorbância da mistura reacional (DPPH+amostra).

4.6 ANÁLISE ESPECTROSCÓPICA NO INFRAVERMELHO

Os extratos em etanol e as partições obtidas das amostras foram submetidos à

análise por espectroscopia no infravermelho, utilizando-se de um espectrômetro

Shimadzu IR - Prestige-21, que permite a leitura do espectro de infravermelho na região

de 4000 a 500 cm-1

, com resolução de 4 cm-1

e acumulando 32 varreduras. Os espectros

foram registrados a partir de pastilhas de KBr na proporção 1:100 (m m-1

).

4.7 MONITORAMENTO POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA

(CCD) COM SÍLICA GEL DAS PARTIÇÕES EM METANOL-ÁGUA 9:1 E EM

DICLOROMETANO DA CASCA INTERNA

No monitoramento por CCD das partições em metanol-água 9:1 e em

diclorometano da casca interna foram utilizadas placas de vidro (11,2 x 2,8 cm). A

espessura do adsorvente (sílica gel 60, 70-230 MESH ASTM) foi de 0,5 mm. Uma

suspensão do adsorvente foi preparada em água destilada e mantendo-se a placa na

horizontal. Em seguida, a suspensão foi transferida para a superfície da placa,

espalhando-se o material de maneira bem uniforme. A ativação das placas (adsorvente

livre do solvente) foi feita em estufa a 105°C, por 30 minutos.

4.7.1 Fracionamento por cromatografia em coluna da partição em diclorometano

Para o fracionamento da partição em diclorometano da casca interna em coluna

empacotada com sílica gel (fase estacionária) foram utilizadas 2,0 g da partição em

diclorometano da casca interna, que foram eluídas nos seguintes solventes:

cicloexano/acetato de etila 1:1, cicloexano/acetato de etila 4:6, cicloexano/acetato de

etila 3:7, cicloexano/acetato de etila, 2:8, acetato de etila, acetato de etila/metanol 9:1,

acetato de etila/metanol 8:2, acetato de etila/metanol 7:3, acetato de etila/metanol 6:4,

57

acetato de etila/metanol 1:1, acetato de etila/metanol 4:6, acetato de etila/metanol 3:7,

acetato de etila/metanol 2:8, acetato de etila/metanol 1:9, metanol e metanol/água 8:2.

4.8 ANÁLISE DAS FRAÇÕES 5 E 6 POR CLAE

As frações 5 e 6 obtidas após fracionamento em coluna foram submetidas a

análise por CLAE. Para a análise das amostras foi utilizado um cromatógrafo da marca

Shimadzu, modelo SCL-10A VP, equipado com detector SPD-M10A VP do tipo “rede

de diodos”, com um sistema de bombeamento quaternário LC-10AD VP. Foi usada uma

coluna de fase reversa C18 da marca Shimadzu modelo CLC-ODS (M), 4,6 mm de

diâmetro interno e 25 cm de comprimento, tamanho das partículas de 5 μm e tamanho

dos poros com 10 nm de diâmetro. O volume injetado em cada corrida foi de 20 µL com

um fluxo de 0,7 mL min-1

. Foi usado um sistema de solventes com gradiente de tampão

de fosfato (solução A) preparado com 5% de solução de diidrogeno fosfato de potássio

0,2 mol L-1

e metanol (solução B).

O sistema de eluição dos solventes está apresentado na Tabela 2.

Tabela 2: Sistema de eluição para a análise em CLAE das frações 5 e 6.

Tempo (min) Gradiente

A B

5,0 90 10

15,0 80 20

20,0 65 35

30,0 55 45

50,0 0 100

55,0 90 10

60,0 90 10

(A) = solução 5% de KH2PO4 0,2 mol L-1

, (B) = metanol


A metodologia utilizada na determinação da atividade antimicrobiana dos

extratos e das partições consistiu em avaliar a menor quantidade de amostra necessária

para inibir o crescimento dos microrganismos-teste. Esse valor é expresso como

Concentração Inibitória Mínima (CIM) (OSTROSKY, 2008). A leitura da concentração

inibitória mínima (CIM) foi efetuada visualmente após incubação das bactérias durante

24 horas, a 37 °C.

58

A atividade antimicrobiana foi determinada utilizando o método da

microdiluição em caldo (MIC), segundo o CLSI para os microrganismos aeróbios

(CLSI, 2006) e CLSI para os microrganismos anaeróbios (CLSI, 2007). As análises

foram realizadas no Laboratório de Pesquisa em Microbiologia Aplicada da

Universidade de Franca (LaPeMA), com a colaboração do Prof. Dr. Carlos Henrique

Gomes Martins. O procedimento experimental para a determinação das concentrações

inibitórias mínimas (CIM) está detalhado no Apêndice A.

4.10 ANÁLISES ESTATÍSTICAS

As análises na determinação dos constituintes macromoleculares, fenóis totais, e

proantocianidinas, bem como da atividade antioxidante foram realizadas em triplicata e

os resultados correspondem à média ± o desvio padrão.

59

5 RESULTADOS E DISCUSSÕES

5.1 DETERMINAÇÃO DA UMIDADE

A secagem por radiação infravermelha é uma técnica rápida e fornece a

quantidade de calor suficiente para a liberação de moléculas de água (BORGES et al.,

2005).

A determinação do excesso de água em matérias-primas vegetais é importante

para evitar a atividade enzimática e a proliferação de microrganismos como fungos e

bactérias (NASCIMENTO et al., 2005).

Os valores obtidos para a umidade das amostras estão na Tabela 3.

Tabela 3: Teor de umidade das partes da Kielmeyera coriacea Mart. & Zucc estudadas.

Amostras Umidade (%)

Folha 8,3 ± 0,1

Casca interna 10,7 ± 0,3

Casca externa 5,1 ± 0,2

Madeira 9,9 ± 0,3

Os teores de umidade encontrados para a madeira, casca interna e folha estão

dentro da faixa estabelecida pela Sociedade Brasileira de Farmacognosia que é de 8,0 a

14,0% de água para drogas vegetais, exceto para a casca externa que apresentou valor

pouco inferior.


MADEIRA DE Kielmeyera coriacea

5.2.1 Determinação do teor de cinzas

As cinzas de madeira e casca são substâncias de baixa massa molecular e

constituem os materiais inorgânicos. São determinadas com a amostra seca e picada

porque no processo de extração elas podem ser removidas por solventes como a água

(KLOCK et al., 2005).

60

A Tabela 4 mostra as porcentagens obtidas de cinzas na madeira, casca interna e

casca externa.

Tabela 4: Teor de cinzas da madeira e cascas de Kielmeyera coriacea Mart. & Zucc.

Amostras Cinzas (%)



Madeira 0,7 ± 0,1

As cascas das árvores geralmente apresentam maior teor de cinzas do que a

madeira, como foi encontrado na análise realizada. Na literatura (FOELKEL, 2005) é

encontrado que as cinzas das cascas correspondem de 3 a 10% de seu peso. Os

principais componentes das cinzas são sódio, potássio, cálcio, magnésio e manganês, os

quais são obtidos na forma de óxidos durante a incineração.

5.2.2 Preparação da amostra livre de extrativos

Na análise dos compostos macromoleculares da casca e madeira (lignina e

holocelulose) é necessário remover os extrativos a fim de evitar que produtos de

condensação com a lignina sejam formados (KLOCK et al., 2005).

Dos solventes utilizados na extração, a água foi a mais eficiente para a casca

interna e madeira, representando 85% e 88%, respectivamente do total da extração,

enquanto o cicloexano foi melhor para a casca externa representando 59% do total da

extração. Os teores obtidos de extrativos estão na tabela 5.

Tabela 5: Porcentagem de extrativos de Kielmeyera coriacea Mart. & Zucc.

Solventes Casca interna Casca externa Madeira

Cicloexano 0,6 ± 0,1 5,3 ± 0,4 0,02 ± 0,01

Cicloexano-etanol 2:1 4,4 ± 0,4 2,2 ± 0,2 0,6 ± 0,2

Água 29,1 ± 2,4 1,5 ± 0,2 4,4 ± 0,3

Total % 34,1 9,0 5,0

Pode-se inferir que a maioria dos extrativos presentes na casca interna e na

madeira sejam polares, porque a água foi o solvente que com maior porcentagem de

61

extração destes compostos e os extrativos constituintes da casca externa sejam apolares,

porque o cicloexano foi o solvente com maior porcentagem na remoção dos compostos

orgânicos.

5.2.3 Determinação de lignina insolúvel em ácido (Lignina de Klason)

Os métodos tradicionais utilizados na determinação quantitativa da lignina da

madeira são insatisfatórios quando aplicados à casca. Este fato acontece, porque a casca

é formada por uma mistura de substâncias, algumas destas, são solúveis em soluções

alcalinas, mas insolúveis em soluções ácidas. Se essas substâncias não forem

devidamente removidas por uma pré-extração alcalina, elas não são solubilizadas e

aparecem como lignina (BROWNING, 1967).

Durante a análise ocorre uma reação de hidrólise dos polissacarídeos com ácido

sulfúrico a 72% formando vários oligossacarídeos, que são hidrolisados na segunda

etapa com o H2SO4 diluído. O resíduo resultante é a lignina de Klason ou lignina

insolúvel em ácido (ROSA, 2003).

Nos trabalhos descritos na literatura (FOELKEL, 2005), o teor de lignina

encontrado na casca é inferior ao teor encontrado na madeira da mesma árvore.

Entretanto, a casca externa apresentou alto teor de lignina, maior que a madeira e a

casca interna (Tabela 6). Na casca externa há a presença de cortiça, a qual interfere na

análise e para removê-la é necessário realizar uma saponificação alcalina, que causa

degradação da lignina. É comum a análise da lignina somente na casca interna porque

esta apresenta menor quantidade de substâncias que interferem na análise

(BROWNING, 1967). O alto teor de lignina encontrado na casca externa pode ser

atribuído a presença de cortiça, uma vez que a casca externa da planta é utilizada na

fabricação da mesma.

5.2.4 Determinação de lignina solúvel

Os valores encontrados de lignina solúvel em ácido foram baixos para a casca

interna e externa como pode ser observado na Tabela 6. Para a madeira, os valores de

absorvância medidos, quando aplicados a equação 3, encontrou-se um valor negativo, o

que indica que na madeira não há lignina solúvel em ácido (MORAIS et al., 2005).

62

5.2.5 Determinação de holocelulose

Os valores obtidos para o teor de holocelulose estão na Tabela 6. A madeira

apresentou alto teor de holocelulose, representando cerca de 70% do total dos

constituintes. A holocelulose é o componente majoritário da madeira e é constituída de

celulose e hemicelulose (SANTOS, 2008), sendo a celulose o principal componente.

O termo holocelulose é empregado para indicar o produto obtido após a remoção

da lignina. Para obter uma deslignificação ideal é necessária a remoção total da lignina,

porém, não há metodologia que satisfaça essa condição. Assim, durante a determinação

da holocelulose pode haver uma porcentagem de lignina residual que permanece na

holocelulose (KLOCK et al., 2005).

A porcentagem total dos constituintes químicos da casca interna, casca externa e

madeira não foi igual a 100%. Porém, esse resultado é esperado, devido à deficiência do

método analítico. De acordo com Browning (1967), a falha no somatório total dos

constituintes pode ser atribuída a alguns fatores como: perda de um constituinte,

sobreposição na análise, presença de impurezas e interferências de outros componentes.

É comum a porcentagem total variar de 95 a 102%. Entretanto os valores encontrados

acima de 102% são aceitáveis devido aos problemas que acontecem durante análise

química.

Tabela 6: Porcentagem dos constituintes químicos da casca e madeira de Kielmeyera

coriacea Mart. & Zucc.

Constituintes Casca interna Casca externa Madeira

Extrativos 34,1 9,0 5,0

Extrativos solução de

hidróxido de sódio a 1%

24,0 ± 3,0 21,7 ± 1,9 -

Lignina de Klason 14,7 ± 1,8 57,3 ± 0,2 28,0 ± 1,0

Lignina solúvel em ácido 2,7.10-3

± 0,1 2,8.10-3

± 0,1 -

Holocelulose 30,0 ± 3,4 5,5 ± 1,0 71,7 ± 3,3

Cinzas 1,6 ± 0,1 1,6 ± 0,1 0,7 ± 0,1

Total 104,4 95,1 105,4

63

A metodologia utilizada na deslignificação baseia-se na reação da lignina com

ClO2 e ClO-, que são sub-produtos obtidos na reação de oxirredução do ClO2

- (Equação

6) em meio ácido (REYES et al., 1998).

8 ClO2- + 6 H

+ → 6 ClO2 + ClO

- + Cl

- + 3 H2O Equação 6

5.3 IDENTIFICAÇÃO DOS COMPOSTOS VOLÁTEIS DE Kielmeyera coriacea

Existem vários estudos na literatura sobre o isolamento de substâncias a partir

dos extratos de Kielmeyera coriacea. Entretanto, não há relatos sobre a composição

química do óleo essencial desta espécie. No trabalho de Andrade e outros (2007),

apresenta a composição dos compostos voláteis das folhas, flores e frutos do gênero

Kielmeyera, sendo a espécie estudada Kielmeyera rugosa Choisy.

A Tabela 7 mostra os rendimentos (%) obtidos do óleo essencial de K. coriacea

em base seca.

Tabela 7: Rendimentos dos óleos essenciais de Kielmeyera coriacea.

Amostra Rendimento %

Folha 0,7 ± 0,1

Flor 0,5 ± 0,1



Madeira 0,2 ± 0,1

O maior rendimento do óleo foi encontrado para a folha, seguido da flor, casca

externa, casca interna e madeira. Esse resultados estão próximos dos teores de óleos

essenciais encontrados paras as folhas e caule, por exemplo, de Campomanesia

pubescens, que foram 0,64 ± 0,06 % e 0,15 ± 0,01 %, respectivamente (ROCHA,

2011a).

A Tabela 8 mostra os principais compostos identificados por CG-EM nas

diversas partes da Kielmeyera coriacea Mart. & Zucc.

64

Tabela 8: Principais constituintes voláteis presentes na folha, flor, casca externa, casca

interna e madeira de Kielmeyera coriacea Mart. & Zucc.

Compostos IK Área do pico (% TIC)

Folha Flor Casca

interna

Casca

externa

Madeira

1 Cicloexano - 2,8 - - -

2 3-Z-hexen-1-ol 859 2,1 0,6 - - 1,3

3 Benzenoetanol 1107 - 16,2 - - -

4 Benzilidrazina - - 3,3 - - -

5 Eugenol 1359 - 44,9 - - -

6 Alfa-copaeno 1377 3,5 - 14,9 2,1 -

7 Beta-bourboneno 1388 1,6 - - - -

8 Beta-elemeno 1391 1,3 - - - -

9 Trans-cariofileno 1419 15,5 11,9 - - -

10 Beta-cedreno 1421 - - 5,2 0,9 -

11 n.i. (MM = 204) - - 3,6 - -

12 Widreno 1431 - - 4,2 0,8 -

13 Alfa-E-bergamoteno 1435 - 13,0 0,8

14 n.i. (MM = 204) - - 2,4 0,7 -

15 Alfa-humuleno 1455 3,0 1,2 - - -

16 Beta-E-farneseno 1457 - - 8,6 - -

17 Beta-acoradieno 1471 - - 1,3 - -

18 Beta-chamigreno 1478 - 0,2 1,3 1,0 -

19 Alfa-curcumeno 1481 - - 7,4 0,7 -

20 D-germacreno 1485 24,2 0,5 - - -

21 Alfa-selineno 1498 - 1,0 - - -

22 Alfa-muuroleno 1500 - - 0,6 1,1 -

23 Biciclogermacreno 1500 11,6 - - - -

24 Beta-bisaboleno 1506 - - 9,4 - -

25 Alfa-chamigreno 1508 - - 1,7 0,3 -

26 n.i.( MM = 202) - - - 2,3 -

27 Gama-cadineno 1514 1,11 0,4 - - -

28 Gama-bisaboleno (Z) 1515 - - 1,5 - -

29 Delta-cadineno 1523 4,8 2,1 2,2 - -

30 Gama-dehidro-Ar-

himachaleno

1532 - - 1,0 - -

31 Espatulenol 1578 1,1 - - - -

32 Viridiflorol 1593 3,3 - - - -

33 Sesquiterpeno

oxigenado

1597 3,1 - - - -

34 Beta-oplopenona 1608 - - - 3,8 -

35 Sesquiterpeno

oxigenado

2,2 - - - -

36 n.i. (MM = 220) - - - 2,4 -

37 Gama-eudesmol 1632 - - - 0,8 -

38 Alfa-eudesmol 1654 - - - 4,2 -

39 Alfa-cadinol 1654 4,4 - - - -

40 Delta-cadinol 4,3 - - - -

41 Beta-bisabolol 1675 - - 1,4 - -

65

42 Cadaleno 1677 - - - 1,8 -

43 Bisabolol <epi-alfa> 1685 - - 1,8 -

44 Alfa-bisabolol 1686 - - 1,9 - -

45 Sesquiterpeno

oxigenado

- - - 2,7 -

46 Sesquiterpeno

oxigenado

- - - 2,2 -

47 Sesquiterpeno

oxigenado

- - - 6,4 -

48 Sesquiterpeno

oxigenado

- - - 6,3 -

49 Sesquiterpeno

oxigenado

- - - 1,6 -

50 Longipinocarvona - - - 1,6 -

51 Beta-bisabolenol 1790 - - - 2,7 -

52 Ácido tetradecanóico - - - - 1,6

53 n.i. - - 2,3 - -

54 Hexadecanol 1876 - - - - 2,5

55 Nonadecano 1900 - - - 1,0 -

56 Ácido palmítico - 0,5 0,7 1,0 16,2

57 Eicosano 2000 - - - 1,4 -

58 Óxido manoil <epi-

13>

2017 - - - 1,7 -

59 Kaureno 2043 - - - 2,3 -

60 Octadecanol 2078 - - 0,6 - 4,0

61 Heneicosano 2100 - 1,1 -

62 Gama-palmitolactona - 0,6 0,7 - -

63 Ácido oleico - - - - 1,8

64 Parsol MCX (Z) - - - - 2,2

65 Docosano 2200 - - - 0,9 -

66 n.i. - - - 0,9 -

67 n.i. - - - 0,8 -

68 n.i. - - - 1,1 -

69 Tricosano 2300 - - - 1,1 1,3

70 Parsol MCX (E) - - - - 2,3

71 Amida do ácido

oleico

- - - - 2,4

72 Tetracosano 2400 - - - 1,3 1,5

73 Pentacosano 2500 - - - 2,7 3,2

74 Hexacosano 2600 - - - 3,0 4,8

75 Heptacosano 2700 - - - 3,7 7,4

76 Octacosano 2800 - - - 4,9 8,4

77 Esqualeno - - - 1,7 1,5

78 Hidroc. saturado - - - - 1,3

79 Nonacosano 2900 - - - 5,8 9,7

80 Hidroc. saturado - - - 2,4 7,4

81 Hidroc. saturado - - - - 6,3

Total 87,1 86,2 87,7 86,0 87,1

Rendimento do óleo (% m/m), base seca 0,7± 0,1 0,5± 0,1 0,3±0,1 0,4± 0,1 0,2± 0,1 IK = índice de Kovat; n.i. = não identificado; MM = massa molecular; TIC = Total ions chromatografics

66

Nas folhas, aproximadamente 85% dos constituintes voláteis são sesquiterpenos,

sendo os principais representantes o D-germacreno (24,2%), o trans-cariofileno (15,5%)

e o biciclogermacreno (11,6%). Estes sesquiterpenos apresentam-se em quantidades

bem superiores quando comparados com óleos essenciais de outras espécies do Cerrado

(ROCHA, 2011a). Os sesquiterpenos trans-cariofileno e alfa-humuleno (3,0%),

apresentaram potencial de utilização no tratamento de doenças inflamatórias

(FERNANDES et al., 2007). As estruturas dos principais componentes do óleo

essencial das folhas estão apresentadas na Figura 30.

Figura 30: Estruturas dos três constituintes majoritários presentes no óleo essencial das

folhas de K. coriacea.

O espatulenol e o viridiflorol também foram encontrados nas folhas desta planta

do cerrado, nas mesmas concentrações daquelas encontradas recentemente nas folhas da

Campomanesia pubescens (ROCHA, 2011a).

Nas flores, o monoterpeno oxigenado eugenol, é o constituinte majoritário,

responsável por 44,9% do óleo essencial. O benzenoetanol é o segundo maior

componente do óleo com 16,2%, seguido do trans-cariofileno (11,9%) e benzilidrazina

(3.28%). O eugenol (Figura 31) é o principal constituinte do óleo essencial do cravo-

da-índia (Eugenia caryophyllata), e que apresenta propriedades anti-inflamatória,

cicatrizante, analgésica, e eficácia na eliminação de bactérias bucais. Foi demonstrado

também, que o eugenol pode suprimir o crescimento de linhas de células de câncer

cervical (HeLa) (CHANG et al., 2011).

Figura 31: Estrutura química do eugenol.

Fonte: Chang (2011).

67

Os principais componentes identificados no óleo essencial das folhas e flores de

K. coriacea são apresentados na Tabela 9. Para efeito de comparação, estes resultados

foram confrontados com os resultados encontrados em K. rugosa.

Tabela 9: Comparação dos constituintes voláteis de K. coriacea e K. rugosa Choisy.

* ANDRADE e outros, 2007.

No trabalho de Andrade e outros (2007), foram identificados os constituintes

voláteis das folhas e flores da espécie Kielmeyera rugosa Choisy, proveniente do Estado

de Sergipe, nordeste do Brasil. Os principais componentes encontrados nas folhas foram

alfa-cubebeno, alfa-copaeno, trans-cariofileno e delta-cadineno, representando cada um

cerca de 10% do óleo essencial. Esses compostos também foram encontrados em

Kielmeyera coriacea, porém em diferentes concentrações (0,6%, 3,5%, 15,5% e 4,8%,

respectivamente, totalizando 24,4%). Não foi identificado o biciclogermacreno nas

folhas de Kielmeyera rugosa.

Nas flores de Kielmeyera rugosa, o componente majoritário identificado foi o

benzenoetanol, seguido pelo álcool benzílico e eugenol. Assim como nas folhas, houve

Compostos Kielmeyera rugosa*

Kielmeyera coriacea

Folha (%) Folha (%)

alfa-cubebeno 11,8 0,6

alfa-copaeno 11,0 3,5

trans-cariofileno 10,8 15,5

delta-cadineno 8,5 4,8

biciclogermacreno - 11,6

D-germacreno 3,1 24,2

Flor (%) Flor (%)

benzenoetanol 58,2 16,2

álcool benzílico 18,6 -

eugenol 15,9 44,9

benzilidrazina - 3,3

trans-cariofileno 0,1 11,9

68

diferenças na concentração dos componentes encontrados nas flores das duas espécies.

Em K. rugosa, o componente majoritário nas flores foi o benzenoetanol (58,2%)

enquanto em K. coriacea é o eugenol (44,9%). Não foi identificado o composto

benzilidrazina nas flores de K. rugosa.

As diferenças encontradas nas concentrações desses compostos são comuns

porque a composição química dos óleos essenciais pode variar dependendo de fatores

como época de coleta, ataque de patógenos, localização e idade da planta (GOBBO-

NETO; LOPES, 2007).

Na casca interna, os hidrocarbonetos sesquiterpênicos são os constituintes

principais, representam aproximadamente 72% do óleo essencial, sendo o alfa-copaeno

(14,9%) o componente majoritário. Outros componentes identificados em maior

quantidade foram trans-alfa-bergamoteno (13,0%), beta-bisaboleno (9,4%), E-beta-

farneseno (8,62%), alfa-curcumeno (7,4%), beta-cedreno (5,2%) e widreno (4,2%).

Foram identificados três isômeros do bisabolol (beta-bisabolol, epi-alfa-

bisabolol e alfa-bisabolol), que juntos representam cerca de 5% do óleo essencial. O

bisabolol é uma substância atóxica e possui propriedades anti-inflamatórias, bactericidas

e cicatrizantes. É utilizado principalmente na indústria farmacêutica e de higiene

pessoal. Devido à sua propriedade anti-inflamatória, ele reduz a vermelhidão da pele

causada pela exposição aos raios ultravioleta do sol; através da ação antibacteriana, o

bisabolol é utilizado no tratamento da bromidose diminuindo a concentração de

bactérias nos locais afetados (AZAMBUJA, 2009). As estruturas dos principais

componentes do óleo essencial da casca interna estão apresentadas na Figura 32.

Figura 32: Estrutura dos três constituintes majoritários do óleo essencial da casca

interna de K. coriacea.

Os componentes voláteis majoritários da casca externa, não foram identificados

pela comparação de seus espectros de massa com aqueles armazenados nas bibliotecas

69

de espectros de massa Nist e Wiley (compostos 47e 48) e juntos representam

aproximadamente 13% do óleo essencial. Dos componentes identificados, os alcanos

estão presentes em maior concentração, alguns alcanos identificados foram hexacosano

(3,0%), heptacosano (3,7%), octacosano (4,9%) e nonacosano (5,8%). Alfa-eudesmol

(4,2%) e beta-oplopenona (3,8%) são os sesquiterpenos oxigenados em maior

concentração no óleo. O óleo da madeira é constituído especialmente de alcanos e

ácidos orgânicos. O ácido palmítico (16,2%) é o componente majoritário e os principais

alcanos identificados foram hexacosano (4,8%), heptacosano (7,4%), octacosano (8,4%)

e nonacosano (9,7%). Foi identificado pela primeira vez o 2-etilexil-3-(4-metoxifenil)-

2-propenoato (4,5%), composto sintetizado e conhecido como Parsol MCX@

(Figura

33). Esse composto é um forte absorvedor de radiação UVB. É um óleo solúvel, incolor

e inodoro utilizado em várias formulações de protetores solares. Se combinado com

outros filtros solares UV, o fator de proteção solar (FPS) aumenta (DMS, 2009).

Figura 33: Estrutura química do Parsol MCX@

.

Fonte: DMS (2009).

Por estas informações de atividades biológicas, conclui-se que o óleo essencial

das diferentes partes da K. coriacea apresenta um potencial significativo para a sua

utilização na farmacopéia nacional.

5.4 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIOXIDANTE

5.4.1 Preparação dos extratos em etanol e partição líquido-líquido

A folha (100,0 g), a casca interna (100,0 g), a casca externa (200,0 g) e a

madeira (120,0 g) seca e moída foram submetidas à extração com etanol em Soxhlet.

Após filtração e evaporação do solvente sob pressão reduzida, em evaporador rotativo,

foram obtidas 20,5, 16,4, 14,9 e 0,6 g de extrato bruto para a folha, casca interna, casca

70

externa e madeira, respectivamente. A partição líquido-líquido do extrato em etanol da

madeira não foi realizada porque a massa de extrato obtida foi insuficiente e, além deste

fato, a madeira é constituída principalmente de lignina e holocelulose.

5.4.2 Determinação de fenóis totais (FT)

A metodologia utilizada baseia-se no uso do reagente Folin-Ciocalteau,

constituído por uma mistura dos ácidos fosfomolibídico (H3PMo12O40) e fosfotungstico

(H3PW12O40), resultando numa solução de cor amarela. Em meio básico, ocorre a

desprotonação dos compostos fenólicos, gerando ânions fenolatos. Em seguida, ocorre

uma reação de oxirredução entre o ânion gerado e o reagente de Folin, no qual o

molibdênio sofre redução, ocasionando a mudança de cor do meio reacional de amarela

para azul e o composto fenólico é oxidado, como pode ser observado na Figura 34

(OLIVEIRA et al., 2009).

Figura 34: Reação típica do ácido gálico com o íon molibdênio presente no reagente de

Folin.

Fonte: Oliveira (2009).

A partir da determinação das absorvâncias obtidas para as amostras de

concentração conhecida de ácido gálico foi traçada uma curva de calibração (Figura 35).

71

Figura 35: Curva de calibração para a determinação espectrofotométrica de fenóis totais

(Método Folin-Ciocalteau).

A partir dos valores de absorvância medidos das amostras em 760 nm e

empregando-se a equação da reta obtida pela curva de calibração do ácido gálico, foram

obtidos os teores de fenóis totais, expressos em miligrama equivalente de ácido gálico

por grama de amostra, mostrados na Tabela 10.

Tabela 10: Teor de fenóis totais (expresso em mg EAG por grama de amostra) nos

extratos em etanol e nas partições de Kielmeyera coriacea Mart. & Zucc.

Amostra Folha Casca

interna

Casca

externa

Madeira

Extrato em etanol 309 ± 4 346 ± 2 77,2 ± 2,7 130 ± 2

Partição em cicloexano 57,5 ± 1 82,3 ± 0,6 27,7 ± 2,7 -

Partição em diclorometano 139 ± 1 241 ± 1 125 ± 1 -

Partição em metanol-água 9:1 - 372 ± 1 - -

Os extratos em etanol da folha e da casca interna e a partição em metanol-água

9:1 da casca interna apresentaram a maior quantidade de fenóis totais. Em comparação

com os teores encontrados para Campomanesia pubescens O. Berg (gabiroba peluda),

também estudada por nosso grupo (ROCHA 2011a,b), que foram de 115 e 114 mg de

EAG g-1

(para folha e casca, respectivamente), e em comparação com a Eugenia

umbelliflora (pitanga), 128 e 106 mg de EAG g-1

para folha e casca, respectivamente,

(MAGINA et al., 2010) estes valores para os extratos da folha e da casca interna são

superiores.

A partição em diclorometano também apresentou bons conteúdos de fenóis

totais, em relação aos trabalhos acima citados. As partições em cicloexano das amostras

72

foram as que resultaram na menor quantidade de fenóis totais. Este fato pode ser

atribuído ao efeito do solvente, dada a sua apolaridade. Uma vez que os compostos

fenólicos possuem grupos hidroxila e carbonila, existe uma maior afinidade destas

estruturas com solventes polares, como o etanol e metanol.

5.4.3 Determinação do teor de taninos condensados (proantocianidinas)

Os taninos condensados ou proantocianidinas são amplamente encontrados no

reino vegetal. São produtos do metabolismo secundário e possuem imensa diversidade

estrutural, devido aos padrões de substituições entre as unidades flavânicas, variações

nas posições de suas ligações e na estereoquímica de suas moléculas. Este fato acarreta

dificuldades na sua determinação analítica (MONTEIRO et al., 2005).

A metodologia empregada baseia-se na reação da vanilina com os taninos

condensados, formando complexos coloridos que absorvem em 500 nm (Figura 36). O

método depende do solvente usado, da concentração do ácido, do tempo da reação, da

temperatura e da concentração da vanilina (SCHOFIELD et al., 2001).

Figura 36: Reação típica da vanilina com uma proantocianidina. A seta aponta para um

segundo local potencialmente reativo.

Fonte: Schofield (2001).

A partir da determinação das absorvâncias para as amostras de concentrações de

catequina conhecidas, foi traçado uma curva de calibração, apresentada na Figura 37.

73

Figura 37: Curva de calibração para a determinação espectrofotométrica de

proantocianidinas (Método da Vanilina).

A partir dos valores de absorvância medidos das amostras em 500 nm, e

empregando-se a equação da reta obtida pela curva de calibração da catequina, os teores

de proantocianidinas (taninos condensados) foram obtidos e expressos em miligrama

equivalente de catequina por grama de amostra (Tabela 11).

Tabela 11: Teor de proantocianidinas nos extratos etanólicos e nas partições (em mg

ECAT por grama de amostra) de Kielmeyera coriacea Mart. & Zucc.

Amostra Folha Casca

interna

Casca

externa

Madeira

Extrato em etanol 109 ± 1 328 ± 1 19,9 ± 0,3 18,4 ± 1,0

Partição em cicloexano 32,2 ± 1,4 102 ± 1 8,5 ± 0,3 -

Partição em diclorometano 52,0 ± 2,2 253 ± 3 28,1 ± 1,4 -

Partição em metanol-água 9:1 - 410 ± 3 - -

Os extratos em etanol da folha e da casca interna e a partição em metanol-água

9:1 da casca interna aqui também apresentaram as maiores quantidades deste polifenol,

com valores entre 102 a 410 mg ECAT g-1

de amostra. O rendimento do extrato em

etanol para as diferentes partes da planta decrescem na seguinte ordem: casca interna,

folha, casca externa, e madeira. Estes resultados são bem superiores aos encontrados por

Rocha e outros (2011b) para Campomanesia pubescens O. Berg.

A partição em diclorometano também apresentou bons conteúdos de

proantocianidinas quando comparados aos trabalhos logo acima citados. A casca

externa apresentou a menor quantidade de proantocianidinas também na partição em

diclorometano. As amostras estudadas na partição em cicloexano foram as que

74

resultaram na menor quantidade de proantocianidinas, a exemplo do que aconteceu com

o teor de fenóis totais.

O uso de drogas contendo taninos está relacionado com as propriedades

adstringentes que esses possuem. Algumas propriedades dos taninos já foram

comprovadas, como efeito antidiarréico, antisséptico e na precipitação de proteínas,

ajudando nos processos de cura da pele, como feridas, queimaduras e inflamações

(MONTEIRO et al., 2005). Enquanto que as plantas se utilizam destes compostos para

seu mecanismo de defesa à exposição térmica e mecânica.

5.4.4 Análise quantitativa da atividade antioxidante

A metodologia para verificar a capacidade antioxidante baseia-se em avaliar a

atividade sequestradora do radical livre 2,2-difenil-1-picrilidrazila (DPPH), que possui

coloração violeta, e absorve em 517 nm. Numa reação típica (Figura 38), o radical

DPPH é reduzido e forma-se a 2,2-difenilpicrilidrazina (DPPH-H) por meio da ação do

antioxidante (A―H), originando uma solução de coloração amarela. Através do

decréscimo da absorvância, determina-se a porcentagem de atividade antioxidante, ou

seja, a quantidade do radical DPPH que é consumido pelo antioxidante ou a

porcentagem do radical livre DPPH que permanece no meio reacional (BRAND-

WILLIAMS et al., 1995; OLIVEIRA et al., 2009).

Figura 38: Esquema da reação típica entre o radical DPPH e o antioxidante genérico

(A―H).

Fonte: Halliwell; Gutteridge (2007).

Os compostos com ação antioxidante possuem a capacidade de reagir com os

radicais livres e transformá-los em espécies estáveis não reativas (Figura 39). Esta

reatividade impede que os radicais ataquem as células, causem danos ao DNA ou oxide

lipídios e proteínas. (TEIXEIRA; SILVA, 2011).

75

Figura 39: Reação típica de redução do radical DPPH pelo flavonóide antioxidante

quercetina.

Fonte: Teixeira; Silva (2011).

5.4.4.1 Construção da curva de calibração do DPPH

A partir da determinação das absorvâncias para as amostras de concentrações do

radical DPPH conhecidas, foi traçada uma curva de calibração, apresentada na Figura

40.

Figura 40: Curva de calibração para a determinação espectrofotométrica da atividade

antioxidante (Método DPPH).

5.4.4.2 Leitura das medidas de absorbância nas amostras

Na Tabela 12 estão as concentrações das amostras utilizadas na determinação da

atividade antioxidante (AA). Todas as amostras foram testadas a partir da concentração

inicial (100%), diluídas em 5 concentrações diferentes e na mesma proporção: 83 % -

66 % - 49 % - 32 % - 15 %. Na análise, para obter o valor do CE50 é necessário que o

76

valor de 50% na porcentagem de DPPH remanescente (Equação 4) esteja entre a

concentração 100% e 15%.

Tabela 12: Concentração inicial (100%) em ppm das amostras na cubeta na

determinação da AA dos extratos e partições de Kielmeyera coriacea Mart. & Zucc.

Amostra Folha Casca interna Casca externa Madeira

Extrato em etanol 25 10 50 50

Partição em cicloexano 100 50 200 -

Partição em diclorometano 25 10 50 -

Partição em metanol-água 9:1 - 10 - -

A partir da Equação 5, a porcentagem da atividade antioxidante foi calculada, no

tempo de 60 minutos. A atividade antioxidante (AA, em %) para a concentração inicial

das amostras na cubeta e após 1 hora de reação estão apresentados na Tabela 13.

Tabela 13: Porcentagem de atividade antioxidante (% AA) para as concentrações

iniciais (em ppm) das amostras na cubeta.

Amostra Folha Casca interna Casca externa Madeira

Extrato em etanol 93,7 75,9 45,1 92,8

Partição em cicloexano 39,6 84,7 92,3 -

Partição em diclorometano 86,8 78,6 92,9 -

Partição em metanol-água 9:1 - 93,7 - -

Os gráficos obtidos da cinética da atividade antioxidante das amostras nas seis

concentrações estão apresentados nas figuras 41 a 43.

77

a b

c d

Figura 41: Gráficos da cinética de atividade antioxidante para: a- extrato em etanol da

folha; b- partição em cicloexano da folha; c- partição em diclorometano da folha; d-

extrato em etanol da madeira.

78

a b

c d


casca interna; b- partição em cicloexano da casca interna; c- partição em diclorometano

da casca interna; d- partição em metanol:água 9:1 da casca interna.

79

a b

c


casca externa; b- partição em cicloexano da casca externa; c- partição em diclorometano

da casca externa.

Para comparação das atividades antioxidantes (AA) das amostras, foi construído

um gráfico normalizado, dividindo-se a porcentagem de AA dos extratos e das partições

pela concentração inicial das amostras, na cubeta. O gráfico obtido está apresentado na

Figura 44.

80

Figura 44: Gráfico comparativo normalizado da atividade antioxidante (AA, em %) para

as amostras, após 1hora de reação.

Pode-se verificar através do gráfico que as melhores porcentagens de atividade

antioxidante da folha foram obtidas para o extrato em etanol e para a partição em

diclorometano. Para a casca interna, as melhores porcentagens de AA foram obtidas nas

partições em metanol-água 9:1, em diclorometano e no extrato em etanol, nesta ordem.

A partição em cicloexano foi a que apresentou menor AA. Estes fatos têm correlação

direta com os teores de fenóis totais e de proantocianidinas já discutidos. Desta forma,

pode-se concluir que a casca interna é a amostra com o melhor potencial atividade

antioxidante.

5.4.4.3 Concentração Efetiva (CE50)

Os resultados da atividade antioxidante (AA) dos extratos estudados também

podem ser expressos através da concentração efetiva média (CE50) que representa a

concentração de amostra necessária para sequestrar 50% do radical livre DPPH. Assim,

o valor do CE50 foi calculado a partir da Equação 4 (item 4.5.5.2). Os valores obtidos

estão na Tabela 14.

81

Tabela 14: Valores de CE50 (em ppm) para extrato em etanol e partições estudadas de

Kielmeyera coriacea.

Amostra Folha Casca

interna

Casca

externa

Madeira

Extrato em etanol 10,6 ± 0,7 5,9 ± 0,1 55,2 ± 1,7 25,5 ± 3,9

Partição em cicloexano 133 ± 2 16,0 ± 1,7 70,1 ± 0,4 -

Partição em diclorometano 12,7 ± 0,6 6, 6 ± 0,9 21,1 ± 0,8 -

Partição em metanol-água 9:1 - 4,3 ± 0,3 - -

Os melhores resultados para o valor de CE50 foram encontrados na casca interna

(extrato em etanol, partição em diclorometano e partição em metanol-água 9:1) como

pode ser observado na Tabela 14. Essas amostras também foram as que apresentaram a

maior quantidade de compostos fenólicos e a melhor % de AA.

Comparando os resultados obtidos com dados da literatura, verifica-se que o

valor de CE50 encontrado para a folha de Kielmeyera coriacea foi maior que o

encontrado para as partições em acetato de etila e em butanol, da folha de Kielmeyera

variabilis (planta também encontrada no cerrado), a qual apresentou CE50 de 3,5 e 4,4

ppm, respectivamente (COQUEIRO, 2010).

Em comparação com os extratos e frações da folha da espécie Garcinia

xanthochymus, conhecida como falso mangostão, (FERNANDES, 2009) e que pertence

também à família Clusiaceae, os resultados de CE50 do extrato em etanol e da partição

em diclorometano da folha de K. coriacea foram similares (Tabela 15).

Tabela 15: Valores de CE50 de extrato e frações da folha de Garcinia xanthochymus

(FERNANDES, 2009).

Extratos e frações CE50 (ppm)

Extrato em etanol 11,7

Fração em acetato 12,1

Fração em butanol 17,8

Estes resultados para extrato em etanol e partição em diclorometano da folha são

bem superiores aos resultados encontrados para esta parte aérea de três plantas

medicinais do semi-árido nordestino (SOUZA et al, 2007), região próxima ao cerrado.

Comparando-se o valor de CE50 do extrato em etanol da casca interna com o resultado

82

(27,59 ppm) para o mesmo extrato de Terminalia brasilienses camb. (conhecida como

catinga de porco), neste mesmo trabalho, temos um resultado para K. coreacea muito

superior.

O resultado de CE50 para a partição em cicloexano da folha foi alto, revelando

um baixo efeito de sequestro do radical livre DPPH. Semelhante efeito foi observado

para a partição em outro solvente apolar, o hexano, das folhas de Campomanesia

pubenscens (CARDOSO et al., 2008).

Segundo padrões da literatura, o valor de CE50 menor que 50 ppm é considerado

um resultado muito ativo, de 50 – 100 ppm é moderadamente ativo, de 100 - 200 é um

pouco ativo. Entretanto um valor acima de 200 ppm é considerado um resultado inativo

(REYNERTSON et al., 2005). Comparando os resultados encontrados nas amostras

estudadas com estes padrões, oito amostras são muito ativas em relação à capacidade

antioxidante, duas são moderadamente ativas e 1 é pouco ativa. Pode-se concluir, em

geral, que esta planta do cerrado possui atividade antioxidante significativa, uma vez

que a maioria das amostras demonstrou serem ativas frente ao radical livre DPPH.

Em geral, a boa atividade antioxidante está relacionada com a presença de

compostos fenólicos, como flavonóides, antocianinas, taninos e ácidos fenólicos

(derivados do ácido hidroxicinâmico e do ácido hidroxibenzóico) (DEGÁSPARI;

WASZCZYNSKYJ, 2004). Desta forma, as amostras aqui estudadas que apresentaram

os melhores resultados de CE50 foram as mesmas que apresentaram a maior quantidade

de fenóis totais e proantocianidinas. Além da propriedade antioxidante os compostos

fenólicos possuem propriedades fisiológicas como: antialergênica, antiarteriogênica,

anti-inflamatória, antimicrobiana, antitrombótica, cardioprotetiva e vasodilatadora

(ANDREO; JORGE, 2006).

5.5 ANÁLISE ESPECTROSCÓPICA NO INFRAVERMELHO

A espectroscopia de absorção no IV é uma técnica analítica que permite a

determinação dos grupos funcionais de uma amostra. Cada grupo funcional absorve em

uma frequência característica de radiação na região do IV. Assim, através do gráfico de

intensidade de radiação versus frequência, é possível identificar os principais grupos

funcionais presentes em uma amostra desconhecida.

Os espectros no infravermelho obtidos para os extratos estudados estão

apresentados nas Figuras de 45 a 48.

83

Figura 45: Espectros de infravermelho de três extratos obtidos da casca externa de K.

coriacea.

Figura 46: Espectros no infravermelho de extratos da casca interna da K. coriacea.

84

Figura 47: Espectros no infravermelho de extratos da folha da K. coriacea.

Figura 48: Espectro no infravermelho do extrato em etanol da madeira de K. coriacea.

85

Na faixa de 3000 a 3500 cm-1

foram observadas bandas de absorção alargadas.

Essa região é característica da absorção da vibração de deformação de grupos OH em

ligação de H inter- e intra-moleculares. Em todos os espectros foram observadas

absorções na faixa de 2950 a 2850 cm-1

, atribuídas normalmente à presença de grupos

metilas (deformação C-H de grupos CH3), o que confirma a presença de estruturas

alifáticas. Nos espectros da casca externa, essa banda de absorção foi mais evidente para

a partição em cicloexano e para o extrato em etanol, provocando uma diminuição na

banda de absorção característica de hidroxila. Nos espectros da casca interna e da folha,

verifica-se, com mais evidência, a banda característica de grupamentos alifáticos na

partição em cicloexano. Pode-se inferir que, as partições em cicloexano das amostras

possuem compostos com estruturas alifáticas, fato que fica comprovado, ao observar os

espectros de IV para estas amostras. No espectro de IV do extrato em etanol da madeira,

também é observado a banda de absorção de alifáticos, porém com menor intensidade

que as observadas nas partições em cicloexano.

Na região de 1700 cm-1

, foram observadas bandas característica de carbonilas.

As bandas de absorção atribuídas à presença de grupamentos fenólicos são

encontradas habitualmente na região entre 1290 e 1350 cm-1

.

Para a região de absorção correspondente à de formação de CH aromático (800-

950 cm-1

), as absorções foram distintas entre os diferentes tipos de extratos. O mesmo

foi observado para as absorções na região de impressão digital (de 500 a 750 cm-1

).

A Tabela 16 mostra as principais bandas de absorção nos diferentes extratos das

amostras estudadas.

Tabela 16: Principais absorções dos espectros no infravermelho das amostras analisadas

de K. coriacea.

Número de onda

(cm-1

)

Grupo funcional Comentários

Extrato

3000 - 3500 deformação axial da

ligação O―H

-Partições em diclorometano da casca

externa, casca interna e folha;

-Extrato em etanol da casca interna,

casca externa, folha e da madeira;

- Partição em cicloexano da casca


86

- Partição em metanol-água da casca

interna.

2950 e 2850 deformação axial de CH3 -Partição em cicloexano da casca

externa, da casca interna e folha;

-Extrato em etanol da casca externa e

da madeira.

1760 - 1700 deformação da ligação

C═O de carbonilas

-Partição em diclorometano da casca


-Partição em cicloexano da casca


-Extrato em etanol da casca externa,

casca interna e folha;

-Partição metanol-água da casca

interna;

-Extrato em etanol da madeira.

1500

deformação das ligações

C-H e C=C de

aromáticos


externa;


externa;


folha e madeira.

1290 - 1350 deformação das ligações

C-O de fenóis






casca interna e folha;

-Partição em metanol-água da casca

interna;

-Extrato em etanol da madeira.

1200-1050

deformação da ligação

C―O de alcoóis e éteres


interna e folha;


87

interna;

-Extrato em etanol da casca interna,

folha e madeira;

- Partição em metanol-água da casca

interna.

930-810

deformação C-H de

aromático

Partição em diclorometano da casca





externa, casca interna e folha.

Os espectros de IV dos extratos foram bastante similares. A principal absorção

que pode diferenciá-los é em 2950 e 2850 cm-1

, (deformação axial de alcanos) que

aparece principalmente nas partições em cicloexano da casca externa, casca interna e

folha, e no extrato em etanol da casca externa e madeira, com absorções específicas na

região de impressão digital.

5.6 FRACIONAMENTO POR CROMATOGRAFIA EM COLUNA PARA AS

AMOSTRAS COM MELHORES CE50

A triagem fitoquímica é um procedimento muito utilizado na determinação da

composição química de plantas, permitindo identificar quais substâncias estão presentes

na amostra e descobrir qual a rota biossintética de origem (DÔRES, 2007).

Antes de fazer o fracionamento em coluna, as amostras com o melhor resultado

de CE50 (partição em metanol-água 9:1 e partição em diclorometano da casca interna)

foram analisadas em CCD. O extrato em etanol da casca interna não foi testado porque

neste extrato estão solubilizadas várias substâncias químicas, enquanto nas partições os

constituintes estão separados por afinidade nos solventes usados nas partições.

A partição em diclorometano da casca interna resultou no melhor fator de

retenção em CCD para o fracionamento em coluna. A partição em metanol-água 9:1 da

casca interna, por ser uma amostra muito polar, não resultou em uma boa separação na

sílica, pois a sílica apresenta grupos O―H em sua superfície que, durante sua ativação

88

por aquecimento disponibiliza ligações O-H (Figura 49), permitindo maior interação

destas ligações com os compostos polares presentes na partição.

Figura 49: Esquema da reação de ativação da sílica por aquecimento.

Fonte: Costa (2007).

Na Figura 50, está representado sob a forma de fluxograma o fracionamento

cromatográfico. A escolha da sequência dos solventes foi realizada após monitoramento

por cromatografia em camada delgada (CCD) com sílica gel (MATOS, 1997). Ao todo,

foram obtidas 17 frações.

89

acetato = acetato de etila

Figura 50: Fluxograma do fracionamento cromatográfico da partição em diclorometano

da casca interna.

90

5.7 ATIVIDADE ANTIOXIDANTE (AA), APÓS FRACIONAMENTO EM

COLUNA, DA PARTIÇÃO DICLOROMETANO DA CASCA INTERNA

A avaliação da atividade antioxidante (AA) de todas as 17 frações foi realizada

com o objetivo de verificar qual das frações tinha a melhor atividade antioxidante. A

análise da atividade antioxidante (AA) foi realizada uma única vez para todas as

frações. Para aquelas que apresentaram o melhor resultado foi repetida a análise para o

cálculo do CE50. A Tabela 17 mostra a concentração usada e a porcentagem de

atividade antioxidante (AA), após 1 h de reação, para cada fração. Estão destacadas

nesta tabela as frações 4, 5, e 6, que apresentaram a mais alta porcentagem de AA.

Tabela 17: Atividade antioxidante (AA, em %) para as frações obtidas após

fracionamento em coluna da partição em diclorometano da casca interna.

Frações Concentração (ppm) AA (%)

1 500 50,77

2 500 57,61

3 100 43,90

4 100 93,74

5 100 93,13

6 100 95,49

7 100 38,36

8 100 52,62

9 100 44,20

10 100 40,10

11 300 90,46

12 300 46,30

13 300 63,24

14 300 74,15

15 300 69,51

16 300 27,48

17 300 21,20

Os valores de CE50 obtidos à partir das atividades antioxidantes (%) para as

frações 4,5, e 6 estão apresentados na Tabela 18.

Tabela 18: Valores de CE50 das frações 4, 5, e 6.

Frações 4 5 6

CE50 (ppm) 4,7 ± 1,1 4,8 ± 1,1 4,3 ± 0,1

91

Os resultados de CE50 para as frações 4, 5, e 6 foram praticamente iguais. Isso

indica que em todas as frações existem substâncias com alto potencial de combater

radicais livres.

5.7.1 Análise dos extratos 5 e 6 por CLAE

As frações 5 e 6 foram analisadas em CLAE a fim de obter o perfil

cromatográfico das amostras. Foram preparadas soluções (1000 ppm) em metanol das

frações. Foi obtido pequena quantidade da amostra 4 (0,06 g), o que impossibilitou a

continuação da análise para essa fração. Além deste fato, essa fração dissolve-se com

dificuldade em metanol, solvente utilizado na análise em CLAE. A escolha do

comprimento de onda (λ) a ser utilizado foi feita através da análise do espectro de UV

da fração 6 (Figura 51-6) em que o pico de maior intensidade apresentou maior

absorção em 220 nm. Nesse comprimento de onda obteve-se o maior número de picos.

Figura 51: Espectros na região do UV para os principais picos eluídos nos

cromatogramas da Figura 51: 1 = pico em 29 min fração 5; 2 = pico em 30 min fração 5;

3 = pico em 32 min fração 5; 4 = pico em 48 min fração 5; 5 = pico em 30 min fração 6;

6 = pico em 48 min fração 6.

92

Os cromatogramas obtidos por CLAE das frações 5 e 6 estão apresentados na Figura

52.

Figura 52: Cromatogramas obtidos por CLAE das frações 5 e 6. Condições: Coluna C18

(4,6 mm d.i. x 25 cm comprimento); gradiente solução 5% de KH2PO4 0,2 mol L-1

–

metanol; fluxo de 0,7 mL min-1

; detector a 220 nm.

Através da análise dos cromatogramas verificou-se que as duas frações

apresentam picos no mesmo tempo de retenção e em intensidades diferentes. A fração 5

apresentou 4 picos principais: em 29 min, 30 min, 32 min e 48 min. O pico de maior

intensidade é o de 29 min. A fração 6 apresentou um pico majoritário em 48 min. Esse

pico apareceu na fração 5 em menor intensidade. A análise serve para mostrar quantos

compostos as frações possuem e indicar um possível grau de “pureza” das frações, pois

quanto menor a quantidade de picos mais pura está a fração. É necessário realizar outro

fracionamento em coluna para separar os constituintes das frações. Esse procedimento

será realizado posteriormente e fará parte das análises a serem realizadas na continuação

do trabalho.

93


A avaliação da atividade antimicrobiana através da CIM mostrou que os extratos

e partições de diferentes partes aéreas de K. coriacea possuem diferentes níveis de

atividade contra cada estirpe bacteriana estudada (Tabela 19). Quanto menor o valor de

CIM, melhor a atividade antimicrobiana das amostras. E resultados de CIM menores de

100 µg mL-1

são considerados promissores (RÍOS; RECIO, 2005).

Tabela 19: Resultados da concentração inibitória mínima para os extratos e as partições

de Kielmeyera coriacea.

AMOSTRAS

RESULTADOS - µg mL-1

AERÓBIAS ANAERÓBIA

S. mitis

ATCC 49456

S. mutans

ATCC 25175

S. sanguinis

ATCC 10556

A. naeslundii

ATCC 19039

Extrato em etanol da casca

interna

3,1 50 25 100

Partição em cicloexano da casca

interna

25 6,2 6,2 6,2

Partição em diclorometano da

casca interna

400 400 > 400 > 400

Partição em metanol-água da

casca interna

400 > 400 > 400 200

Extrato em etanol da folha 400 > 400 400 200

Partição em cicloexano da folha > 400 > 400 200 > 400


folha

200 > 400 > 400 400

Extrato em etanol da casca

externa

> 400 > 400 400 > 400

Partição em cicloexano da casca

externa

400 > 400 > 400 > 400


casca externa

> 400 > 400 400 400

CONTROLE

Clorexidina

3,688 3,688 1,844 1,844

94

Houve atividade de todos os extratos partições frente aos microrganismos bucais

S. mitis, S. mutans, S. sanguinis e A. naeslundii, avaliada pelo método de microdiluição.

Para a bactéria anaeróbia A. naeslundii estudada os valores de CIM das amostras

estiveram entre 6,2 e 400 µg mL-1

. A amostra mais ativa frente à bactéria anaeróbia foi

a partição em cicloexano da casca interna com um valor excelente de CIM (6,2 µg mL-

1). As bactérias anaeróbias são mais resistentes que as aeróbias porque possuem uma

bicamada fosfolipídica na sua parede celular.

Para as bactérias aeróbias os valores de CIM estiveram entre 3,1 e 400 µg mL-1

.

Os resultados demonstram que os extratos e partições da casca externa, extrato em

etanol da folha e partições em metanol-água e em diclorometano da casca interna não

inibiram o crescimento das bactérias em concentrações menores que 400 µg mL-1

,

enquanto as partições em cicloexano e em diclorometano da folha não inibiram o

crescimento de bactérias aeróbias em concentrações menores de 200 µg mL-1

.

As amostras mais ativas frente às bactérias aeróbias foram o extrato em etanol da

casca interna (com valores de CIM de 3,1, 25 e 50 µg mL-1

); e a partição em cicloexano

da casca interna (com valores de CIM de 6,2 e 25 µg mL-1

). Nessas duas amostras os

resultados de CIM foram bastante significativos e promissores.

Dessa forma, essas amostras possuem potencial de utilização na prevenção da

cárie e em lesões mais complexas, como as periodontites (perda de fibras e osso) e

infecções endodônticas (infecção no canal do dente).

Duas substâncias isoladas do extrato em diclorometano das folhas e caules de K.

coriacea, a aucapurina e a 1,3,7-triidroxi-2-(3-metilbut-2-enil)-xantona (Figura 26, p.

43 – substâncias 1 e 5) foram testadas contra as bactérias Staphylococcus aureus,

Escherichia coli, Bacillus subtilis e Pseudomonas aeruginosa. Os resultados de CIM

para a substância 1 (aucuparina) frente a estas bactérias foram de 12,5, 100, 3,1 e 100

µg mL-1

, respectivamente. E os valores de CIM para a substância 5 (uma xantona)

foram de 12,5, <100, 12,5 e <100 µg mL-1

, respectivamente. Para substâncias isoladas,

valores de CIM menores de 10 µg mL-1

são promissores. Assim, pode-se concluir que o

valor de CIM para a aucuparina frente à bactéria Bacillus subtilis foi bastante

significativo.

Nesse contexto, pode-se verificar que a partição em cicloexano da casca interna,

no geral, foi a amostra mais ativa frente aos microrganismos testados, com resultados de

CIM (6,2 µg mL-1

), para as bactérias S. mutans, S. sanguinis e A. naeslundii. Esse

resultado para uma partição é bastante promissor e indica que essa partição tem

95

potencial significativo para combater microrganismos bucais. Vale aqui ressaltar que o

resultado de CIM (25 µg mL-1

) desta partição é cerca de 5000 vezes mais eficiente

frente a S. mitis, do que o composto puro Timol, regularmente encontrado em

formulações farmacêuticas (colutórios e dentifrícios) encontradas no mercado brasileiro

para o controle bacteriano bucal (LIMA et al., 2009).

Os resultados de CIM igual a 6,2 μg mL-1

da partição em cicloexano da casca

interna é superior ao observado para o extrato em diclorometano do caule de Kielmeyera

cuspidata contra M. luteus, que exibiu uma CIM de 7,8 μg mL-1

, e chega a ser

significativo frente a CIM de 3,9 μg mL-1

do cloranfenicol, antibiótico utilizado como

controle positivo (SOBRAL et al., 2009). A Tabela 20 mostra os valores de CIM para o

extrato em diclorometano do caule de Kielmeyera cuspidata Saddi (SOBRAL et al.,

2009).

Tabela 20: Concentração inibitória mínima (CIM) do extrato em diclorometano do caule

de Kielmeyera cuspidata (SOBRAL et al., 2009).

Microrganismos Extrato em diclorometano (µg mL-1

)

Bacillus subtilis ATCC 6633 15,6

Staphylococcus aureus ATCC 6538 31,2

Streptococcus mutans ATCC 5175 31,2

Micrococcus luteus ATCC 10240 7,8

Escherichia coli ATCC 94863 > 500

Pseudomonas aeruginosa > 500

Salmonela choleraesuis ATCC 14028 > 500

Comparando os resultados de K. coriacea com os resultados de CIM do extrato

em diclorometano do caule de K. cuspidata, pode-se verificar que este foi mais ativo

frente a bactérias aeróbias do que as partições em diclorometano de diferentes partes de

K. coriacea. Os resultados demonstram que a partição em diclorometano da folha de K.

coriacea não conseguiu inibir o crescimento bacteriano em concentração menor do que

200 μg mL-1

e o extrato em diclorometano do caule de K. cuspidata exibiu CIM de 7,8

μg mL-1

.

São encontrados poucos estudos sobre atividade antimicrobiana de óleos

essenciais frente a bactérias bucais ( BOTELHO et al., 2007; SEGHATOLESLAMI et

al., 2009; MECCIA et al., 2007; SCHENEIDER et al., 2008; SILVA et al., 2010). Em

96

recente trabalho realizado por Rocha e outros (2011b) foi observado que os óleos

essenciais da raiz, caule, folhas e frutos da planta do cerrado Campomanesia pubescens

O. Berg (gabiroba peluda) exibiram importante efeito antimicrobiano (Tabela 21) contra

S. mitis, S. mutans e S. sanguinis, também aqui estudados. Como se pode observar, os

resultados obtidos pelos extratos e partições da K. coriacea (Tabela 19) são , em geral,

bem superiores.

Tabela 21. Efeito inibitório dos óleos essenciais para diferentes partes de C. pubescens

contra organismos aeróbicos bucais (ROCHA, 2011b).

Óleo essencial Microrganismos (CIM μg mL

-1)

S. mitis S. mutans S. sanguinis

do fruto 500 500 1000

da folha 500 500 1000

do caule >2000 >2000 >2000

da raiz >2000 >2000 2000

Em recente trabalho de Montanari e outros (2011) a composição química e a

atividade antimicrobiana de óleos essenciais de diferentes espécies de Verbanaceae foi

comparada. Neste trabalho, estes óleos foram caracterizados com alto teor de

sesquiterpenos como o trans-cariofileno, o D-germacreno e o biciclogermacreno como

os principais componentes.

A presença de trans-cariofileno no óleo essencial da folha de K. coriacea (15%)

pode explicar, sinergeticamente com outros sesquiterpenos oxigenados, a boa atividade

antimicrobiana do extrato em diclorometano, uma vez que já foi comprovada a sua ação

antibacteriana também por Deena e Thopppil (2000).

O bisabolol presente no óleo essencial da casca interna de K. coriacea (5,1%)

também apresenta atividade antimicrobiana (HERNADEZ, 2005). Sinergeticamente

com outros compostos de baixa concentração podem exercer a boa atividade

antimicrobiana do extrato não polar em cicloexano desta parte da planta.

97

6 CONCLUSÕES

A análise e a quantificação dos constituintes químicos das partes aéreas de

Kielmeyera coriacea (pau-santo), bem como a atividade antioxidante de seus extratos,

apresentaram resultados que confirmam a utilização desta planta pelas populações do

cerrado. A sua casca externa apresentou alto teor de lignina, o que pode explicar o fato

da casca ser utilizada na produção de cortiça. As porcentagens obtidas para os

constituintes macromoleculares da casca interna e madeira estão dentro da faixa de

aceitação para as árvores folhosas.

O óleo essencial de Kielmeyera coriacea foi analisado pela primeira vez. O óleo

da folha é constituído principalmente de D-germacreno, trans-cariofileno e

biciclogermacreno. No óleo essencial da flor, o eugenol é o constituinte majoritário. Na

casca interna, os constituintes presentes em maior concentração foram alfa-copaeno,

alfa-trans-bergamoteno, beta-bisaboleno, E-beta-farneseno e alfa-curcumeno. Na casca

externa, os dois componentes presentes em maior concentração no óleo não foram

identificados. A maioria dos componentes identificados são sesquiterpenos e alcanos. E

no óleo da madeira, o ácido palmítico é o componente majoritário. Foi encontrada uma

grande concentração de alcanos, (tricosano, tetracosano, pentacosano, hexacosano,

heptacosano, entre outros) que juntos representam 51,3% do óleo essencial. Em

comparação com os óleos essenciais da Kielmeyera rugosa, houve diferenças na

concentração dos componentes encontrados nas folhas e flores das duas espécies. Foi

identificado, ainda, no óleo da madeira, o 2-etilexil-3-(4-metoxifenil)-2-propenoato

(conhecido como Parsol MCX), um composto que absorve fortemente a radiação UVB.

É um óleo solúvel, incolor e inodoro utilizado em várias formulações de protetores

solares. Pelas informações de atividades biológicas dos compostos identificados,

conclui-se que o óleo essencial das diferentes partes da K. coriacea apresenta um

potencial significativo para a sua utilização na farmacopéia nacional.

Os extratos e as partições da folha e casca interna apresentaram altos teores de

compostos fenólicos, o que explica a boa atividade antioxidante (AA), avaliada pelo

método DPPH para esses extratos. As amostras que apresentaram os melhores

resultados de CE50 foram também as que obtiveram a maior quantidade de fenóis totais

e proantocianidinas. As frações 5 e 6, obtidas após fracionamento em coluna da

partição diclorometano da casca interna, caracterizou-se com grande potencial

antioxidante.

98

A análise dos extratos por CLAE das frações 5 e 6 obtidas do fracionamento em

coluna da partição diclorometano da casca interna e que apresentaram altos valores de

CE50, mostrou a presença de poucos compostos, ainda não identificados neste estudo.

A análise de infravermelho dos diferentes extratos não permitiu identificar

diferenças na estrutura dos compostos fenólicos. Apesar da funcionalidade global muito

similar, identificou-se o efeito das partes da planta na assinatura química das diversas

frações estudadas.

Na análise da atividade antimicrobiana a partição em cicloexano da casca

interna foi, no geral, a mais ativa frente a três microrganismos bucais com resultados de

CIM de 6,2 µg mL-1

para as bactérias S. mutans, S. sanguinis e A. naeslundii., sendo

uma amostra promissora no tratamento de infecções periodontais. Os extratos e as

partições da folha e casca interna apresentaram altos teores de compostos fenólicos que,

sinergeticamente, agindo com sesquiterpenos oxigenados podem explicar a boa

atividade antimicrobiana destes extratos.

99

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111

APÊNDICE A – METODOLOGIA PARA A DETERMINAÇÃO DA

ATIVIDADE ANTIMICROBIANA

1 MICRORGANISMOS UTILIZADOS NOS ENSAIOS

Para a determinação da atividade antimicrobiana dos extratos brutos e das

partições foram utilizadas as seguintes cepas padrão, provenientes da “American Type

Culture Collection” (ATCC): Streptococcus sanguinis (ATCC 10556), Streptococcus

mitis (ATCC 49456), Streptococcus mutans (ATCC 25175) e Actinomyces naeslundii,

(ATCC 19039) (Tabela 1).

Tabela 1: Microrganismos, procedência, morfotipos e meios de culturas utilizados na

avaliação da atividade antimicrobiana.

Microrganismo/Cepas

Padrão ATCC

Morfotipo

Meio de cultura

do inóculo

Meio de

cultura do teste

Streptococcus sanguinis

ATCC 10556

Coco Gram positivo

TSB Ágar TSB

Streptococcus mitis

ATCC 49456

Coco Gram positivo

TSB Ágar TSB

Streptococcus mutans

ATCC 25175

Coco Gram positivo

TSB Ágar TSB

Actinomyces naeslundii

ATCC 19039

Bacilo Gram

positivo

Schaedler

Agar

Schaedler

TSB: Triptona de soja

2 MEIOS DE CULTURA UTILIZADOS

Os meios de cultura utilizados para a determinação da atividade antimicrobiana

pelo método de microdiluição em caldo (MIC), para determinação da concentração

inibitória mínima (CIM), foram: Caldo Schaedler e Ágar Schaedler suplementado para

bactérias anaeróbias e caldo triptona de soja (TSB) e Ágar sangue para bactérias

aeróbias, descritos abaixo.

O termo “suplementado”, encontrado no decorrer do texto, deve ser considerado

como a adição de 1,0 mL de solução de Hemina a uma concentração de 5,0 mg mL-1

e

1,0 mL de menadione a uma concentração de 1,0 mg mL-1

para cada 1,0 L de meio de

cultura.

112

Caldo Schaedler (BD®)

Composição:

Digestão Pancreática de Caseína ................................................................................ 8,2g

Digestão Peptídica de Tecido Animal ........................................................................ 2,5g

Digestão Papaínica de farelo de soja .......................................................................... 1,0g

Dextrose ...................................................................................................................... 5,8g

Extrato de Levedura .................................................................................................... 5,0g

Cloreto de Sódio ......................................................................................................... 1,7g

Fosfato dipotássio ....................................................................................................... 0,8g

Hemina ...................................................................................................................... 0,01g

L-Cystina .................................................................................................................... 0,4g

TRIS (hidroximetil) aminometano ............................................................................. 3,0g

Preparação: Dissolveu-se aproximadamente 28,4 g desta composição em 1,0 L de água

destilada, a qual foi homogeneizada e autoclavada por 15 min a 121 ± 1 ºC. Após

autoclavagem a solução foi suplementada com 1,0 mL de solução de Hemina a 5,0 mg

mL-1

e 1,0 mL de solução de menadione a 1,0 mg mL-1

.

Caldo triptona de soja TSB (DB®)

Composição:

Peptona de Caseína.....................................................................................................17,0g

Peptona de soja.............................................................................................................3,0g

Glicose..........................................................................................................................2,5g

Cloreto de sódio............................................................................................................5,0g

Hidrogenofosfato dipotássico.......................................................................................2,5g

Preparação: Dissolveram-se 30,0g desta composição em 1,0 L de água destilada, a qual

foi homogeneizada e autoclavada por 20 min a 121 ± 1 ºC.

113

Base para ágar sangue (BD®)

Composição:

Infusão de músculo cardíaco ...................................................................................... 2,0g

Digestão pancreática de caseína ............................................................................... 13,0g

Extrato de levedura ..................................................................................................... 5,0g

Cloreto de sódio........................................................................................................... 5,0g

Agar .......................................................................................................................... 15,0g

Preparação: Dissolveu-se 40,0g desta composição em 1,0 L de água destilada. A

solução resultante foi aquecida e homogeneizada até a dissolução do pó e autoclavada

por 15 min, a 121ºC. Após autoclavagem, a base foi resfriada de 45 a 50 °C e

adicionada uma solução de 5% de sangue desfibrinado de carneiro. 25,0 mL dessa

mistura foram colocados em placas de Petri.

Ágar Schaedler (DB®)

Composição:

Digestão pancreática de caseína...................................................................................8,2g

Digestão peptídica de tecido animal.............................................................................2,5g

Digestão papaínica de farelo de soja............................................................................1,0g

Dextrose........................................................................................................................5,8g

Extrato de levedura.......................................................................................................5,0g

Cloreto de sódio............................................................................................................1,7g

Fosfato dipotássio.........................................................................................................0,8g

Hemina..........................................................................................................................0,4g

L-Cytina........................................................................................................................0,4g

TRIS (hidroximetil) aminometano...............................................................................3,0g

Ágar............................................................................................................................13,0g

Preparação: Dissolveu-se aproximadamente 41,9 g desta composição em 1,0 L de água

destilada. A solução resultante foi aquecida e homogeneizada até a completa dissolução

do pó e autoclavada por 15 min a 121 ºC. Logo em seguida, a solução foi suplementada

com 1,0 mL de solução de Hemina (5,0 mg mL-1

), 1,0 mL de solução de menadione (

114

1mg mL-1

) e com solução 5% de sangue desfibrinado de carneiro. Em seguida, foram

distribuídos 30,0 mL da solução resultante em placas de Petri.

Solução de Hemina

Dissolveu-se 0,5 g de Hemina em 10,0 mL de solução NaOH a 1,0 N e

adicionou-se 90,0 mL de água destilada esterilizada. Após obter a solução na

concentração final de 5 mg mL-1

, esta foi filtrada em membrana filtrante de 0,22 μm de

porosidade para um tubo esterilizado.

Solução Menadione

Dissolveu-se em frasco esterilizado 0,1g de menadione em 100,0 mL de etanol

absoluto, obtendo-se uma solução na concentração de 1,0 mg mL-1

.

3 AVALIAÇÃO DA ATIVIDADE ANTIMICROBIANA

A avaliação da atividade antimicrobiana dos extratos brutos e das partições foi

determinada pelo método da microdiluição em caldo (MIC) através da concentração

inibitória mínima (CIM).

4 PREPARO DAS AMOSTRAS DOS EXTRATOS PARA O MÉTODO DE

MICRODILUIÇÃO

Para a realização da técnica de microdiluição em microplaca, todas as amostras

selecionadas foram inicialmente preparadas com concentrações de 8000 μg mL-1

(solução de partida). Para se obter esta concentração, dissolveram-se 2,0 mg de cada

amostra em 250 μL de dimetilsulfóxido (DMSO). Em seguida preparam-se as seguintes

soluções:

1-Solução mãe para o teste de microdiluição em caldo para aeróbios:

Retirou-se 125 μL da solução de partida, colocou-se em um frasco de 10,0 mL e

acrescentou-se 1875 μL de caldo TSB, obtendo-se uma nova solução de concentração

500 μg mL-1

.

115

2-Solução mãe para o teste de microdiluição em caldo para anaeróbios:

Retirou-se 162,5 μL da solução de partida e acrescentou-se 2437,5 μL de caldo

Schaedler suplementado, obtendo-se uma nova solução de concentração 500 μg mL-1

.

5 PREPARO DO INÓCULO

Com o auxílio de uma alça de platina esterilizada, foram transferidas culturas de

24 horas dos microrganismos indicadores, crescidos no meio Ágar triptona de soja

adicionado com solução 0,5% de sangue de carneiro, para tubos contendo caldo triptona

soja para os microrganismos aeróbios; o mesmo procedimento foi utilizado para

preparação das bactérias anaeróbias com crescimento de 72 horas em ágar Schaedler.

Padronizou-se o inóculo fazendo a comparação deste com o tubo 0,5 (1,5 x 108 UFC

mL-1

) para bactérias na escala Mc Farland. Esta preparação do inóculo foi realizada para

todas as bactérias.

6 PREPARAÇÃO DA DROGA PADRÃO

A droga padrão utilizada para validação da técnica foi o dicloridrato de

clorexidina. Primeiro pesou-se 1 mg da droga e diluiu-se em 10,0 mL de água destilada

esterilizada, tendo uma concentração final de 0,1 mg mL-1

. Em seguida, transferiu-se 1

mL dessa primeira diluição para um tubo contendo 4,0 mL de caldo Schaedler

suplementado; essa ultima diluição de concentração de 0,02 mg mL-1

é a solução

estoque para realização da técnica. Levou-se em consideração a potência de 100 % da

droga.

7 CONTROLES POSITIVOS E NEGATIVOS

Para a determinação de atividade antimicrobiana pelo método da microdiluição,

utilizou-se como controle positivo, frente aos microrganismos indicadores e dicloridrato

de clorexidina. Para o método de CIM, as concentrações de dicloridrato de clorexidina

variam de 0,0115 μg mL-1

a 5,9 μg mL-1

.

Ainda realizaram-se para o método de microdiluição em caldo os seguintes

controles: esterilidade dos caldos TSB e Schaedler; controle da cultura (inóculo);

esterilidade da clorexidina, esterilidade dos extratos e partições e controle do DMSO.

116

8 MÉTODO DA MICRODILUIÇÃO PARA DETERMINAÇÃO DA

CONCENTRAÇÃO INIBITÓRIA MÍNIMA

A determinação de concentração inibitória mínima das soluções dos extratos e

das partições foi realizada segundo o método de microdiluição em caldo segundo os

padrões CLSI para os microrganismos aeróbios (CLSI, 2006) e o CLSI para os

microrganismos anaeróbios (CLSI, 2007).

Realizou-se todo procedimento em capela de fluxo laminar, com os cuidados

necessários; as vidrarias, ponteiras e os meios de cultura foram esterilizados. Foram

utilizadas microplacas estéreis com 96 orifícios. Cada orifício recebeu inóculo, caldo

triptona soja ou caldo Schaedler e amostra das soluções preparadas. O volume final em

cada orifício foi de 100,0 μL para os microrganismos aeróbios e 200,0 μL para os

anaeróbios.

Avaliaram-se as amostras das soluções nas seguintes concentrações: 400 a 3,0

μg mL-1

. Determinou-se, então, a concentração mínima de cada amostra capaz de inibir

o crescimento dos microrganismos indicadores.

As microplacas foram seladas com parafilme e incubadas a 37 ºC por 24 horas.

As placas que continham S. mutans, S. sanguinis e S mitis foram incubadas em

microaerofilia pelo sistema de chama/vela. Após o período de incubação, foram

adicionados em cada orifício 30,0 μL de resazurina (Sigma) preparada em solução

aquosa (0,01%) para bactérias.

Este sistema revelador permite a observação imediata da atividade

antimicrobiana da amostra testada, sendo que a cor azul representa ausência de

crescimento bacteriano e a cor vermelha, a presença de crescimento bacteriano. Os

microrganismos anaeróbicos são incubados por 48 a 72 horas em câmara de

anaerobiose, a 36 ºC. Em seguida, utiliza-se o mesmo revelador (resazurina) para a

determinação das concentrações inibitórias mínimas (CIM) frente aos microrganismos

anaeróbios.

Para todas as bactérias testadas foi realizado o controle do solvente (DMSO) nas

concentrações de 5 a 1%. Todos os extratos e as partições foram avaliados frente aos

microrganismos indicadores em triplicata.

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