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Dissertação de Mestrado em Análises Clínicas

Avaliação do comportamento da proteína recombinante CPX2

como marcador de diagnóstico e do sucesso terapêutico da

leishmaniose canina

Inês da Conceição Aleixo Ribeiro

Setembro de 2009

Trabalho realizado sob orientação da Professora Doutora Anabela Cordeiro-da-Silva

Professora Associada da Faculdade de Farmácia da Universidade do Porto

ii

De acordo com a legislação em vigor, não é permitida a reprodução de

qualquer parte desta dissertação.

Inês Ribeiro

iii

Agradecimentos Pela valiosa contribuição para a realização desta dissertação, a autora expressa o seu

agradecimento a:

Professora Doutora Anabela Cordeiro-da-Silva (Faculdade de Farmácia, Universidade

do Porto)

Professor Doutor Luís Miguel Cardoso (Departamento de Ciências Veterinárias,

Universidade de Trás-os-Montes e Alto Douro)

Equipa de investigadores do Grupo de Doenças Parasitológicas (“parasite disease

group”) do Instituto de Biologia Molecular e Celular do Porto e da Faculdade de

Farmácia da Universidade do Porto, com especial agradecimento para a Drª Joana

Cunha, Drª Marisa Teixeira e o Dr. Nuno Santarém.

Aos meus pais, à minha irmã, aos meus amigos e ao Rui, pela sua profunda

contribuição para a realização deste trabalho.

v

Sumário

A leishmaniose é um grupo heterogéneo de doenças, causada pela infecção por

um protozoário do género Leishmania. Este parasita infecta tanto seres humanos como

outros animais mamíferos. A leishmaniose canina é caracterizada por uma elevada

incidência de infecções assintomáticas. Devido à elevada prevalência de cães

assintomáticos em zonas endémicas de leishmaniose visceral é necessária a existência

de um teste sensível que permita um diagnóstico exacto. Estes animais são os principais

reservatórios domésticos da doença, cujo vector é o insecto flebotomíneo.

Neste estudo avaliou-se o comportamento da proteína recombinante CPX2

(LiTXN1 – Leishmania infantum triparedoxina 1) como marcador de diagnóstico e

determinou-se o sucesso do tratamento para a leishmaniose canina, pela técnica de

ELISA-CPX2. Utilizou-se amostras colhidas de animais infectados com Leishmania no

momento do diagnóstico e em várias fases após tratamento. Para além da técnica de

ELISA usando como antigénio a CPX2 foram também realizadas ELISAS com extracto de

promastigotas e amastigotas e uma outra proteína recombinante, a MTPX (LiTXN2 -

Leishmania infantum triparedoxina 2) como antigénio. O estudo indicou que os anticorpos

anti-CPX2 estavam presentes em todas as fases da infecção, sendo o seu título

relacionado com a presença do parasita. Observou-se que esta proteína recombinante se

mostrou mais imunogénica na maior parte das amostras, quando comparada com os

outros antigénios utilizados na técnica de ELISA, como o extracto de amastigota e

promastigotas, assim como a sua homóloga MTPX. Os resultados obtidos na maioria dos

canídeos mostraram a proteína CPX2 com um papel potencial no diagnóstico serológico

de leishmaniose canina visceral, principalmente como diferencial entre o período pré e

pós-tratamento, e na monitorização e follow-up do mesmo. No entanto, devido ao facto

de ter sido observado um comportamento atípico com pelo menos um canídeo,

evidenciou-se a necessidade de investigação acrescida em relação a este marcador.

Para além da avaliação serológica por ELISA, foi realizado um estudo do

reconhecimento de antigénios de superfície da forma promastigota do parasita por

citometria de fluxo, que se mostrou inadequada na avaliação do sucesso terapêutico.

Palavras-chave: Leishmaniose canina; ELISA; CPX2; Marcador imunológico

vi

Summary Leishmaniasis is a heterogeneous group of diseases caused by infection with a

protozoan of the genus Leishmania. This parasite infects both humans and other

mammals. The canine leishmaniasis is characterized by a high incidence of asymptomatic

infections. Due to the high prevalence of asymptomatic dogs in endemic areas of visceral

leishmaniasis, is necessary to have a sensitive test that allows an accurate diagnosis,

since these animals are the main domestic reservoirs of the disease, which vector is a

sand fly.

This study evaluated the behavior of the recombinant protein CPX2 (LiTXN1 -

Leishmania infantum tryparedoxin 1), as a diagnostic marker and have determined the

success of treatment of canine leishmaniasis, by ELISA-CPX2. The test used samples

taken from animals infected with Leishmania, at the time of diagnosis and at various

stages after treatment. In addition to ELISA using as antigen CPX2, another ELISA were

also performed using the extract of promastigotes and amastigotes and other recombinant

protein, the MTPX (LiTXN2 - Leishmania infantum tryparedoxin 2).

The study indicated that anti-CPX2 was present in all stages of infection and the

title was related to the presence of the parasite. It was observed that this recombinant

protein was more immunogenic in most samples when compared with other antigens used

in ELISA, as the extract of amastigotes and promastigotes, as well as its homologous

MTPX. The results obtained in most dogs showed CPX2 protein with a potential role in the

serological diagnosis of canine visceral leishmaniasis, especially as the differential

between pre and post-treatment and in the follow-up. However, due to the fact that it was

observed an atypical behavior with at least one canine, highlights the need for increased

research on this marker.

In addition to the serological assessment by ELISA, a study of the recognition of

surface antigens of the promastigote form of the parasite by flow cytometry was

performed, which proved to be inadequate in the assessment of therapeutic success.

Key words: Canine leishmaniasis; ELISA; CPX2; Immunological marker

viii

Índice Agradecimentos ....................................................................................................... iii

Sumário.................................................................................................................... v

Summary .................................................................................................................. vi

Índice ....................................................................................................................... viii

Índice de figuras ....................................................................................................... x

Índice de tabelas ...................................................................................................... x

Lista de abreviaturas ................................................................................................ xi

1. Introdução ..................................................................................................... 1

1.1. Leishmaniose ......................................................................................... 2

1.1.1. O parasita e o ciclo de vida .................................................... 2

1.1.2. O vector ................................................................................. 4

1.1.3. O hospedeiro ......................................................................... 4

1.1.4. Transmissão e epidemiologia ................................................. 5

1.1.5. Características clínicas .......................................................... 7

1.1.6. Interacção parasita-hospedeiro .............................................. 9

1.2. Métodos de diagnóstico da leishmaniose ............................................... 18

1.2.1. Diagnóstico directo ................................................................. 18

- Exame microscópico ........................................................... 18

- Histopatologia ...................................................................... 19

- Imunohistoquímica .............................................................. 20

- Cultura................................................................................. 20

- Isolamento dos parasitas em animais de laboratório ........... 21

- Xenodiagnóstico .................................................................. 21

- Reacção da polimerase em cadeia ...................................... 21

- PCR em tempo real ............................................................. 23

- Nucleic Acid Sequence-Based Amplification........................ 24

1.2.2. Diagnóstico indirecto – ensaios imunológicos ........................ 24

- Contraimunoelectroforese .................................................... 25

- Ensaio de imunodifusão ....................................................... 26

- Teste de imunofluorescência indirecta ................................. 26

- Teste de aglutinação directa ................................................ 27

ix

- Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) ................... 27

- Teste rápido imunocromatográfico ....................................... 32

- Western Blotting ................................................................... 33

- Citometria de fluxo ............................................................... 34

1.2.3. Diagnóstico indirecto – imunidade celular .............................. 35

- Teste de Montenegro ........................................................... 35

- Ensaio de proliferação de linfócitos ...................................... 36

- Bioensaio de inibição do efeito citopático do interferão γ ..... 36

1.3. Tratamento e prevenção da leishmaniose ............................................. 38

2. Material e métodos ...................................................................................... 41

2.1. Caracterização das amostras da população de canídeos ...................... 41

2.2. Antigénios usados na técnica de ELISA ................................................. 41

2.3. Ensaio de ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay) ...................... 42

2.4 .Preparação dos parasitas para a técnica de citometria de fluxo ............. 43

2.5. Citometria de fluxo ................................................................................. 43

3. Resultados e discussão ............................................................................... 44

3.1. Descrição das amostras em estudo ....................................................... 44

3.2. Determinação da resposta humoral dirigida aos antigénios totais do

parasita (ELISA) ........................................................................................... 45

3.3. Determinação da resposta humoral dirigida aos antigénios CPX2

e MTPX (ELISA) ........................................................................................... 45

3.4. Estudo da reactividade das amostras ao longo do tempo (ELISA) ......... 46

3.5. Reconhecimento dos antigénios de superfície do parasita (forma

promastigota) pelas diferentes amostras ao longo do tempo

(citometria de fluxo) ...................................................................................... 48

3.6 . Interpretação dos resultados ................................................................. 50

Referências bibliográficas ........................................................................................ 53

x

Índice de figuras

Figura 1. Duas formas morfológicas da Leishmania ................................................ 3

Figura 2. Ciclo de vida da Leishmania ..................................................................... 3

Figura 3. Flebotomíneo vector da Leishmania ......................................................... 4

Figura 4. Classificação da Leishmania ilustrando os três sub-géneros .................... 6

Figura 5. Distribuição geográfica mundial da leishmaniose ..................................... 7

Figura 6. Dicotomia Th1 e Th2 na leishmaniose canina .......................................... 10

Figura 7. Relação entre IL-10 e a patogénese da leishmaniose visceral humana .... 15

Figura 8. Separação electroforética dos antigénios utilizados na técnica de

ELISA .......................................................................................................... 42

Figura 9. Representação gráfica dos resultados das amostras dos seis canídeos ao

longo do tempo, pela técnica de ELISA com utilização dos antigénios:

promastigotas (ELISA Pro), amastigotas (ELISA Ama), CPX2 (ELISA-CPX2)

e MTPX (ELISA-MTPX) ............................................................................................ 46,47

Figura 10. Representação gráfica dos resultados das amostras ao longo do tempo

do reconhecimento dos antigénios de superfície de promastigotas, efectuada por

citometria de fluxo .................................................................................................... 48,49

Índice de tabelas Tabela 1. Sensibilidade e especificidade de ELISA com antigénios recombinantes

no diagnóstico da leishmaniose visceral canina ...................................................... 31

Tabela 2. Comparação dos métodos laboratoriais de diagnóstico da infecção

canina por Leishmania ............................................................................................. 37

Tabela 3. Identificação das amostras em estudo ..................................................... 41

Tabela 4. Descrição das amostras em estudo ......................................................... 44

Tabela 5. Resultados obtidos pela técnica de ELISA utilizando os antigénios

promastigota e amastigota ...................................................................................... 45

Tabela 6. Resultados obtidos pela técnica de ELISA usando como antigénios

CPX2 e MTPX ........................................................................................................ 45

xi

Lista de abreviaturas

AIDS “acquired immune deficiency syndrome” (syndrome de imunodeficiência

humana) APG “antigen presenting cell” (células apresentadoras de antigénio)

CD “cluster of differentiation” (marcador de diferenciação)

CIE “counterimmunoelectrophoresis” (contraimunoelectroforese)

CL “cutaneous leishmaniasis” (leishmaniose cutânea)

CVL “canine visceral leishmaniasis” (leishmaniose canina visceral)

CPX2 “Leishmania infantum tryparedoxin” (Leishmania infantum triparedoxina 1 ;

LiTXN1)

CR “complement receptor” (receptor do complemento)

CSF “colony-stimulating factor” (factor estimulante de colónias)

DAT “direct agglutination test” (teste de aglutinação directa)

DC “dendritic cell” (células dendríticas)

DCL “diffuse cutaneous leishmaniasis” (leishmaniose cutânea difusa)

DNA “deoxyribonucleic acid” (ácido desoxirribonucleico)

ELISA “enzyme-linked immunosorbent assay” (ensaio imunoenzimático)

FAST “fast agglutination screening test” (teste rápido de aglutinação directa)

GIPL “glicosilinositol fosfoslipids” (fosfolípidos glicosilinositol)

GP “glicoprotein” (glicoproteína)

HIV “human immunodeficiency virus” (vírus da imunodeficiência humana)

HST “homologue SIR two” (homóloga à SIR2)

IDA “immunodiffusion assay” (ensaio de imunodifusão)

IFAT “indirect fluorescent antibody test” (teste de imunofluorescência indirecta)

IFN “interferon” (interferão)

IFNB “interferon- γ biossay” (bioensaio de IFN- γ)

IG “immunoglobulins” (imunoglobulinas)

IL “interleukin” (interleuquina)

ITS1 “internal transcribed spacer 1” (espaço interno 1 transcrito)

JAK “janus cinases”

JAK-STAT “Janus kinase-signal transducers and activators of transcription”

LCF “Leishmania chemotatic factor” (factor quimiotático da Leishmania)

xii

LPA “lymphocyte proliferation assay” (ensaio de proliferação de linfócitos)

LPG “lipofosfoglican” (lipofosfoglicano)

LPS “lipopolysaccharide” (lipopolissacarídeo)

LSA “Leishmania soluble antigen” (antigénio solúvel da Leishmania)

LST “leishmanin skin test” (teste cutâneo “leishmanine”)

Mabs “monoclonal antibodies” (anticorpos monoclonais)

MHC “major histocompatibility complex” (complexo principal de

histocompatibilidade)

MIP “macrophage inflammatory protein” (proteína inflamatória dos macrófagos)

MTPX Leishmania infantum tryparedoxin (Leishmania infantum triparedoxina 2;

LiTXN2)

NASBA “nucleic acid sequence-based amplification” (amplificação baseada na

sequência de ácidos nucleicos)

NF-κB “nuclear factor kappa B” (factor nuclear kappa B)

NK “natural killer” (assassino natural)

NO “nitric oxide” (óxido nítrico)

NOS “nitric oxide sintetase” (sintetase do óxido nítrico)

OC “oligochromatografy” (oligocromatografia)

PBMC “periferic blood mononuclear cells”(células mononucleares do sangue

periférico)

PCR “polimerase chain reaction” (reacção da polimerase em cadeia)

PEG “polythylene glycol” (polietilenoglicol)

PMN “polymorphonuclear” (polimorfonuclear)

RFPL “restriction fragment lengh polymorphism” (polimorfismo restrito ao

tamanho do fragmento)

PKDL “pos-kalazar dermic leishmaniasis” (leishmaniose dérmica pós-Kala azar)

RNA “ribonucleic acid” (ácido ribonucleico)

RNI “reactive nitrogen species” (espécies reactivas de nitrogénio)

RNO “reactive oxigen species” (espécies reactivas de oxigénio)

TGF “transforming growth factor” (factor de transformação de crescimento)

Th T “helper” (T auxiliar)

TNF “tumor necrosis factor” (factor de necrose tumoral)

VL “visceral leishmaniasis” (leishmaniose visceral)

WB “western blot” (imunodetecção)

WHO “World Health Organization” (Organização Mundial de Saúde)

Mestrado em Análises Clínicas

1

1. Introdução

A leishmaniose é um grupo heterogéneo de doenças causadas pela infecção por

um protozoário do género Leishmania (Neuber, 2008). As suas manifestações clínicas

dependem tanto da espécie de Leishmania envolvida na infecção como da espécie e da

resposta imunológica do hospedeiro (Grevelink and Lerner, 1996).

Este protozoário infecta tanto humanos como outros animais mamíferos. Devido à

natureza zoonótica da doença, os cães infectados com Leishmania representam um

grave problema tanto para a medicina veterinária como para a saúde pública (Cardoso et

al., 2007), uma vez que são os principais reservatórios domésticos da doença. A

Organização Mundial de Saúde (WHO) recomenda como principais medidas profiláticas

de controlo de leishmaniose visceral o tratamento dos casos humanos e caninos, o

controlo do vector por insecticidas e a eutanásia de cães seropositivos não tratados (Reis

et al., 2009). Uma vez que nem todos os cães infectados com o parasita desenvolvem

sinais clínicos e que a diagnóstico definitivo de leishmaniose canina continua a ser um

desafio, é de extrema importância o desenvolvimento de testes de diagnóstico sensíveis,

específicos e reprodutíveis. Estes testes devem ainda ser simples, fáceis de executar,

económicos e possíveis de executar em laboratórios regionais. Idealmente devem ser

capazes de detectar todos os cães infectados com a doença e permitir uma colheita de

amostras biológicas não invasiva (Maia and Campino, 2008).

O presente trabalho pretende avaliar o comportamento da proteína CPX2 (LiTXN1

– Leishmania infantum triparedoxina 1) como marcador de diagnóstico e do sucesso de

tratamento da leishmaniose canina. Para isso foi avaliada a detecção de anticorpos anti-

Leishmania infantum em cães sintomáticos antes, durante e após tratamento. Esta

avaliação foi efectuada por ELISA usando como antigénio a proteína recombinante CPX2

e comparada com a mesma técnica usando como antigénio extracto das formas

amastigotas e promastigotas do parasita e uma outra proteína recombinante, a MTPX

(LiTXN2 - Leishmania infantum triparedoxina 2). Além disso, foram comparados estes

resultados com o reconhecimento de antigénios de superfície da forma promastigota do

parasita, realizada por citometria de fluxo.

As proteínas CPX2 e MTPX pertencem a uma classe especial de oxidoreductases

denominada triparedoxinas. Estas proteínas são componentes da cascata de

detoxificação de hidroperóxidos dos Kineplastida, onde medeiam a transferência de

electrões entre a tripanodiona e a peroxiredoxina, que reduz hidroperóxidos e


2

possivelmente peroxinitritos. Em estudos realizados por imunofluorescência indirecta em

Leishmania a CPX2 foi localizada no citoplasma tanto da forma promastigota como da

forma amastigota intracelular, enquanto que a MTPX foi encontrada unicamente na

mitocôndria do parasita. (Castro et al., 2004).

1.1. Leishmaniose

1.1.1. O parasita e o ciclo de vida

O género Leishmania engloba um grupo de protozoários flagelados da família

Trypanosomatidae, ordem Kinetoplastida (de Almeida et al., 2003).

Os parasitas de todas as espécies de Leishmania são morfologicamente similares,

pelo que são necessárias análises bioquímicas para uma identificação formal a nível de

espécie (Ashford, 2000). Possuem uma única mitocôndria e o DNA mitocondrial aparece

condensado numa região próxima dos corpúsculos basais do flagelo – nove pares de

microtúbulos concêntricos e um par central – sendo denominado cinetoplasto (Castellano,

2005).

Este parasita reside alternativamente nos insectos flebotomíneos sobre a forma

promastigota, flagelada e alongada, com cerca de 5-15 µm, e no hospedeiro mamífero

como uma forma amastigota intracelular, não flagelada e ovóide, com 3-5 µm (Bates,

2008). Os amastigotas vivem dentro de vacúolos lisossomais presentes nas células

fagocíticas do hospedeiro vertebrado, nomeadamente monócitos, macrófagos e células

dendríticas (de Almeida et al., 2003). Quando a fêmea do insecto vector pica um

mamífero infectado, as células infectadas com os amastigotas entram pelo seu tracto

gastrointestinal (Neuber, 2008), sofrendo uma série de alterações morfológicas e

funcionais. Rapidamente se diferenciam numa forma promastigota procíclica móvel e

divisível, que se prende à parede do intestino. Posteriormente transformam-se numa

forma promastigota metacíclica não divisível que é incapaz de se prender ao intestino e

por isso migra para a parte superior do aparelho gastrointestinal, o proboscis (de Almeida

et al., 2003).


3

Os promastigotas são fagocitados pelos

macrófagos

(a) (b)

Figura 1 - Duas formas morfológicas da Leishmania (a) forma promastigota; (b) forma amastigota (Fonte: http://www.medicine.mcgill.ca/tropmed/txt/lecture3 other system protozoa.htm).

Aquando uma refeição, o vector inocula os promastigotas flagelados metacíclicos

na pele do hospedeiro mamífero, onde são rapidamente fagocitados pelos monócitos

locais (Murray et al., 2005), os quais são atraídos ao local de inoculação pela reacção

inflamatória (Neuber, 2008). Os promastigotas ligam-se ao fagócito mononuclear via

mecanismo mediado por receptor, e entram na célula por fagocitose através de um

fagossoma. Este funde-se com lisossomas para formar um fagolisossoma. Dentro dos

macrófagos os promastigotas sofrem modificações bioquímicas e metabólicas, das quais

resultam as formas intracelulares obrigatórias, os amastigotas. Estes são libertados pelos

macrófagos e podem re-invadir células dendríticas e fibroblastos, assim como novos

macrófagos (Handman and Bullen, 2002).

Figura 2 – Ciclo de vida da Leishmania (Adaptado de Centers for Disease Control and Prevention, http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/HTML/Leishmaniasis.htm).

Os promastigotas transformam-se em

amastigotas nos macrófagos

Os amastigotas multiplicam-se nas células (incluído macrófagos)

de diferentes tecidos

O insecto vector faz a sua refeição hematófaga

(ingere os macrófagos infectados com amastigotas)

Ingestão das células

parasitadas

Os amastigotas transformam-se em promastigotas no intestino do insecto

Dividem-se no intestino do insecto e migram até o proboscis.

O insecto faz a sua refeição (injecta os promastigotas na pele)

Estadio no vector Estadio no homem

Estadio infeccioso

Forma de diagnóstico directo

Forma infecciosa


4

1.1.2. O vector

O vector da Leishmania é a fêmea dos insectos flebotomíneos

(Diptera:Psychodidae, sub-família Phlebotominnae), estando restringido a dois géneros:

espécies Phlebotomus em África, Ásia e Europa e Lutzomyia na América do Sul e Central

(Bates, 2008).

Figura 3 – Flebotomíneo vector da Leishmania (Fonte: http://www.medicine.mcgill.ca/tropmed/txt/lecture3

other system protozoa.htm).

Na tentativa de se alimentarem, os flebotomíneos têm que circunscrever o sistema

hemostático do hospedeiro, composto pela cascata da coagulação sanguínea,

vasoconstrição, fibrinólise e agregação plaquetária. Além da hemostase, os insectos

também têm que se evadir da resposta imunológica inata e adquirida do hospedeiro. Para

ultrapassar estes obstáculos desenvolveram uma secreção salivar rica em componentes

farmacológicos como anticoagulantes, anti-plaquetários, vasodilatadores e moléculas

imunomoduladoras e anti-inflamatórias. Estes mediadores com actividades redundantes e

sinérgicas criam um microambiente favorável para uma refeição adequada e parecem

também ser importantes para o estabelecimento da leishmaniose. Foi, no entanto,

demonstrado que o conteúdo salivar varia na mesma espécie de flebotomíneo, em

diferentes regiões geográficas (Andrade et al., 2007).

1.1.3. O hospedeiro

Quando o vector infecta seres humanos trata-se de uma antroponose, se infecta

outros mamíferos terrestres trata-se de uma zoonose (Murray et al., 2005).

O homem é habitualmente um reservatório acidental da Leishmania, uma vez que

se encontra em zonas endémicas e está por isso exposto ao vector. O reservatório

zoonótico inclui roedores, raposas e cães, entre outros (Grevelink and Lerner, 1996).


5

A leishmaniose canina causada pela Leishmania infantum, ou o seu sinónimo no

Novo Mundo, Leishmania chagasi, é a maior infecção zoonótica potencialmente fatal nas

regiões da Europa, África, Ásia e América. Esta é uma doença complexa, uma vez que os

cães doentes manifestam diferentes sinais clínicos com variáveis graus de severidade,

tornando difícil o seu diagnóstico. Para além disso, nem todos os cães infectados

desenvolvem a doença. Estudos longitudinais em áreas endémicas mostraram que a

história natural de cães infectados pode envolver diferentes caminhos. Foram

documentados dois padrões principais de progressão da doença. Alguns cães

desenvolveram sinais clínicos severos que apareceram logo após a infecção. Um

segundo grupo de animais permaneceu infectado durante um longo período, mas

mostraram-se capazes de evitar o aparecimento das lesões e da doença. No entanto,

quando ocorreu uma alteração da saúde do animal levou à activação da infecção latente

e ao desenvolvimento dos sinais clínicos. Deste modo, importa salientar que a taxa de

cães que podem transmitir doença é muito superior à fracção que mostra sinais da

doença (Baneth et al., 2008). Para além disso, o período de incubação antes do

aparecimento da doença clínica pode ir dos 3 aos 7 meses (Miro et al., 2008). Neste

contexto, é de realçar a importância da existência de testes diagnósticos confiáveis para

cães sintomáticos e assintomáticos, uma vez que os cães infectados constituem o

principal reservatório doméstico do parasita e têm um papel central na sua transmissão

aos humanos.

Recentemente foram reportadas infecções assintomáticas e doenças clínicas

causadas por Leishmania infantum em gatos em alguns países onde a zoonose está

presente, como por exemplo Portugal (Maia et al., 2008).

1.1.4. Transmissão e epidemiologia

A transmissão da Leishmania ocorre quase exclusivamente pela picada de uma

fêmea do insecto flebotomíneo infectada (Grevelink and Lerner, 1996). Durante a refeição

o insecto ingere os parasitas amastigotas que se dividem no seu intestino e se

transformam em promastigotas. Estes promastigotas prendem-se às microvilosidades do

intestino e alguns diferenciam-se em formas metacíclicas, estruturas com corpo pequeno

e um longo flagelo, que se movem mais rapidamente e não são capazes de se prender

ao intestino. A transmissão depende da injecção destas formas metacíclicas quando o

flebotomíneo volta a tomar outra refeição (Ashford, 2000).

A transmissão pode ainda acontecer pela inoculação de material infectado de uma

pessoa para outra, como evidenciam alguns casos de transmissão de Leishmania


6

associada a infecção por HIV, por partilha de seringas e agulhas infectadas, no Sul da

Europa (Ashford, 2000). Também já foram registados casos de transmissão de

Leishmania por transfusão, assim como transmissão transplacentária e sexual. A

viabilidade e infectividade da Leishmania durante o armazenamento dos bancos de

sangue já foi provada e a transmissibilidade foi demonstrada em animais (Cardo, 2006).

Existem pelo menos 20 espécies de Leishmania, em que cada uma pode provocar

uma doença específica dependendo da resposta e da espécie de hospedeiro. A

prevalência dos parasitas e o padrão de doença difere com a distribuição geográfica

(Piscopo and Mallia, 2006).

Figura 4 – Classificação da Leishmania ilustrando os três sub-géneros. Os parasitas dos sub-géneros

Leishmania e Viannia infectam os mamíferos, o sub-género Sauroleishmania infecta répteis (Adaptado de Bates, 2007).

A leishmaniose é endémica em mais de 60 países do mundo, incluindo da Europa

do Sul, Norte de África, Médio Oriente, América Central e do Sul e o subcontinente

Indiano. Não é endémica do Sudeste Asiático e Austrália. A maioria dos casos de

leishmaniose cutânea ocorre no Afeganistão, Paquistão, Síria, Arábia Saudita, Algéria,

Irão, Brasil e Peru, enquanto que a leishmaniose visceral ocorre maioritariamente na

Índia, Bangladesh, Nepal, Sudão e Brasil (Piscopo and Mallia, 2006). A incidência anual

de casos de leishmaniose visceral é estimada em 500.000 casos. O crescimento no

número de pacientes infectados está em grande parte relacionado com a co-infecção por

HIV (Castellano, 2005).

Género Leishmania

Cutânea no Velho Mundo

Cutânea no Novo Mundo

(Velho Mundo) (Novo Mundo)

Visceral


7

Distribuição da leishmaniose cutânea no Novo Mundo e Velho Mundo

Distribuição da leishmaniose visceral no Novo Mundo e Velho Mundo

Figura 5 – Distribuição geográfica mundial da leishmaniose (Adaptado de World Health Organization

2003, http://who.int/leishmaniasis/leishmaniasis_maps/en/index.html).

Durante os últimos 15 anos a distribuição geográfica da leishmaniose sofreu uma

expansão significativa. Alguns factores de risco contribuíram para esse aumento, tais

como fenómenos de migração e urbanização, e o aumento da susceptibilidade devido a

condições de imunossupressão ou má-nutrição. Outro factor importante foi o impacto das

alterações climáticas, incluindo o aquecimento global, no alastrar dos vectores

flebotomíneos e na imergência de leishmaniose autóctone em regiões primariamente

não-endémicas (Zimmermann et al., 2009).

1.1.5. Características clínicas

Podem ocorrer três padrões principais de doença: leishmaniose visceral, cutânea

ou mucocutânea (Piscopo and Mallia, 2006).

Áreas com leishmaniose

Áreas com leishmaniose


8

A leishmaniose visceral (VL) ou Kala azar é uma doença sistémica causada pela

disseminação da Leishmania pelo sistema reticuloendotelial (Grevelink and Lerner, 1996).

O período de incubação varia dos 10 dias a um ano (Malla and Mahajan, 2006). É muitas

vezes precedida por uma lesão seca ou ulcerativa no local da picada do insecto (Ashford,

2000). Os sinais sistémicos como febre intermitente média-grave, anemia,

esplenomegalia, hepatomegalia e caquexia progressiva desenvolvem-se em vários graus,

entre semanas a anos após a infecção. Sinais menos frequentes incluem linfoadenopatia

e diarreia. Hipoalbuminémia e hipergamaglobulinémia (IgG e IgM) são características

frequentes (Awasthi et al., 2004). Se a doença não for tratada pode resultar em morte ou

resolver espontaneamente (Ashford, 2000).

A leishmaniose dérmica pós-Kala azar (PKDL) é normalmente uma sequela de

uma leishmaniose visceral (Ashford, 2000). A doença manifesta-se sob várias formas

clínicas, desde máculas hipopigmentadas a nódulos infiltrados ou ulcerados

(Zimmermann et al., 2009). Aparece habitualmente no espaço de dois anos após cura

completa (Ashford, 2000).

A leishmaniose cutânea (CL) aparece inicialmente como uma picada de insecto

persistente. Gradualmente a lesão alarga, permanecendo vermelha, mas sem provocar

calor ou dor. A resolução da lesão envolve a migração de leucócitos, que isolam a área

afectada levando à necrose dos tecidos e à formação de um granuloma curativo na base

da lesão. O processo de necrose pode ser rápido, causando uma lesão aberta, larga e

húmida, ou pode ser indolente, sem ulceração franca, dependendo da espécie de

parasita em causa. Habitualmente ocorre cura espontânea, no entanto o tempo para

ocorrer essa cura varia de acordo com a identidade do parasita ou o local de lesão. Por

norma este tipo de leishmaniose não está associado a sintomas ou sinais sistémicos, no

entanto pode ocorrer aumento dos gânglios linfáticos e a lesão pode espalhar-se pelos

ductos linfáticos. Os pacientes curados permanecem imunes a uma infecção homóloga

durante vários anos (Ashford, 2000).

A leishmaniose cutânea difusa (DCL) é usualmente uma manifestação da infecção

com parasitas que normalmente causam leishmaniose cutânea, associada a uma

ausência de resposta imunológica do hospedeiro. As lesões podem ser restritas ou

espalhar-se por todo o corpo. Essas lesões apresentam-se como máculas elevadas na

pele fina, que apesar de indolores, são francamente desfigurantes (Ashford, 2000).

A leishmaniose mucocutânea é ocasionalmente reportada no Sudão e noutros

focos no Velho Mundo. Neste caso a lesão parece começar no local da picada do insecto

ou perto de uma superfície de mucosa. Seguido de uma aparente resolução inicial da

lesão, muitas vezes anos depois aparecem lesões metastáticas na zona da mucosa bucal


9

ou nasal. A mucosa e a cartilagem associada sofrem uma erosão gradual até parte da

face estar destruída. O sintoma inicial é uma irritação leve no topo do nariz ou de outra

superfície afectada (Ashford, 2000).

1.1.6. Interacção parasita-hospedeiro

A Leishmania é um excelente exemplo da complexa interacção parasita-

hospedeiro. Devido à sua tremenda diversidade ecológica e genética dentro das

diferentes populações humanas e animais expostas ao parasita, é difícil chegar-se a uma

compreensão conclusiva sobre os parâmetros de resistência/susceptibilidade (Tripathi et

al., 2007).

Muitos estudos têm sido realizados na tentativa de compreender a natureza da

infecção por estes parasitas. Os animais são o melhor modelo para a caracterização da

doença e do seu impacto no hospedeiro. Até à data foram classificados dois sistemas de

hospedeiros para o estudo da infecção por Leishmania, baseado na sua susceptibilidade

ou resistência (Awasthi et al., 2004). Os ratinhos BALB/c são sensíveis à infecção e os

ratinhos C57BL/6, CBA, C3H.HeJ são resistentes (Santarem et al., 2007).

Está bem documentado que a resposta imunológica do tipo Th1 é a chave para a

resistência à infecção por Leishmania. Esta resistência está associada à produção de IL-

12 por células apresentadoras de antigénio (APC) como macrófagos ou células

dendríticas, levando à diferenciação e proliferação do grupo Th1 das células T CD4+,

produtoras de IFN-γ (Bogdan et al., 1996; Santarem et al., 2007). Pelo contrário, a falha

no controlo da infecção tem sido associada com a produção de citoquinas anti-

inflamatórias como IL-4, IL-10 e TGF- β (Alexander and Bryson, 2005; Santarem et al.,

2007). Os ratinhos C57BL/6 rapidamente induzem uma resposta Th1 e previnem a

crescimento do parasita causando um fenótipo auto-curável (Awasthi et al., 2004;

Lehmann et al., 2000; Locksley et al., 1987), enquanto que as espécies BALB/c iniciam

primariamente uma resposta Th2 do qual resulta uma lesão que não cura e uma

exacerbação da doença (Awasthi et al., 2004; Himmelrich et al., 2000; Locksley et al.,

1987; Morris et al., 1993). Para além do tipo de resposta imunológica, também o fundo

genético do hospedeiro é importante para a susceptibilidade ou resistência ao parasita.

Locus nos cromossomas 6,7,10,11,15 e 16 foram associados a resistência,

demonstrando a natureza multigénica do fenótipo C57BL/6 (Awasthi et al., 2004; Beebe

et al., 1997).


10

No hospedeiro mamífero a Leishmania infecta células fagocíticas, primariamente

macrófagos e células dendríticas, no entanto está bem documentado que podem infectar

outras células como neutrófilos ou fibroblastos (Kima, 2007).

Os macrófagos são os primeiros fagócitos que servem como hospedeiro à

Leishmania. A activação destes é o primeiro mecanismo de eliminação da Leishmania,

presumivelmente mediado por metabolitos tóxicos de oxigénio, que incluem anião

superóxido (O-2), peróxido de hidrogénio (H2O2) e o óxido nítrico (Assreuy et al., 1994).

Uma variedade de estímulos pode induzir alterações das características morfológicas,

bioquímicas e funcionais dos macrófagos activados (Awasthi et al., 2004). Os antigénios

são processados dentro dos macrófagos e apresentados às células T CD4+, que

determinarão uma resposta do tipo Th1 ou Th2. A espécie de parasita, a dose inoculada,

o local de inoculação, a saliva de algumas espécies de flebotomíneos, aspectos

imunológicos e de predisposição genética do hospedeiro pode influenciar essa resposta

(Reis et al., 2006). Muitas investigações sugerem que a resposta imunológica protectora

ou não protectora contra a Leishmania depende do tipo de antigénio reconhecido pelas

células T. Está bem documentado que as células T se podem diferenciar tanto em célula

tipo Th1 como célula tipo Th2, e que esta flexibilidade de diferenciação depende

grandemente do estímulo durante a mesma (Seder, 1994). Foi demonstrado que a IL-4

induz diferenciação Th2 enquanto a IL-12 induz a diferenciação em Th1 (Awasthi et al.,

2004; Hsieh et al., 1993; Macatonia et al., 1993; Seder et al., 1993).

Figura 6 – Dicotomia Th1 e Th2 na leishmaniose canina (Adaptado de Trends in Parasitology).

Estudos experimentais em modelos murinos com leishmaniose cutânea

estabeleceram uma dicotomia clara entre a protecção, mediada por células Th1, e a

susceptibilidade à doença, mediada por células Th2. Apesar de na leishmaniose cutânea

Activação dos macrófagos

Eliminação do parasita

Radicais livres de oxigénio

Disseminação do parasita

Sintetase do óxido nítrico

Inibição IL-10

Inibição

Óxido nítrico


11

humana a doença estar associada a um perfil de citoquinas Th2 e a imunidade a um perfil

Th1, a definição da resposta imunológica doença versus protecção não está ainda bem

estabelecida (Tripathi et al., 2007).

Depois de entrarem num hospedeiro mamífero compatível os promastigotas de

Leishmania são alvo do seu sistema imunológico. Os componentes do plasma, como o

sistema complemento, são o primeiro desafio após a entrada na corrente sanguínea. Os

promastigotas procíclicos são altamente susceptíveis à acção do complemento, enquanto

que os metacíclicos são capazes de evitar a sua acção (Puentes et al., 1989; Santarem

et al., 2007). Esta diferença marcante é devida principalmente a uma molécula de

superfície da Leishmania, o lipofosfoglicano (LPG) (Santarem et al., 2007; Spath et al.,

2003). O lipofosfoglicano é um glicolípido complexo que forma um importante glico-cálice

por toda a superfície dos promastigotas (Handman and Bullen, 2002). Está ligado à

membrana através de ligações glicosilfosfatidilinositol e é mais longo nos promastigotas

metacíclicos, prevenindo a ligação das sub-unidades C5b-C9 do sistema complemento,

evitando deste modo a sua acção lítica (Puentes et al., 1989; Santarem et al., 2007). O

LPG tem sido ainda implicado em muitos passos relacionados com o estabelecimento da

infecção do macrófago e a sobrevivência no insecto vector (Awasthi et al., 2004;

Descoteaux and Turco, 1999; Mosser and Brittingham, 1997). Está envolvido em vários

processos, como à ligação do insecto vector às células epiteliais (Davies et al., 1990), à

fagocitose pelos macrófagos mediada por receptores CR3/CR1 ou receptor manose-

fucose, em conjunto com a gp63 (Mosser and Rosenthal, 1993; Sacks, 1989), sinalização

receptor 2 “toll-like”(de Veer et al., 2003), estimulação das células NK (Becker et al.,

2003), inibição da fusão fagossoma-endossoma (Dermine et al., 2000; Desjardins and

Descoteaux, 1997; Miao et al., 1995) e inibição do superóxido derivado do fagossoma

(Lodge et al., 2006; Santarem et al., 2007).

A glicoproteína 63 (gp63) é outra molécula que tem sido implicada nos

mecanismos de invasão e evasão do parasita (Santarem et al., 2007). É uma

metaloprotease de zinco que está disposta abundantemente pela superfície dos

promastigotas (Handman and Bullen, 2002). Foi relacionada com a multiplicação da

Leishmania donovani e implicada na resistência ao complemento da L. major e L.

amazonensis, através da mediação da conversão do C3b a C3bi (Brittingham et al., 1995;

Santarem et al., 2007). A interconversão favorece a entrada via CR3 evitando a explosão

oxidativa. A ligação da gp63 aos receptores de fibronectina favorece a entrada do

parasita nos macrófagos (Brittingham et al., 1999; Santarem et al., 2007). Por outro lado,

a gp63 também ajuda o parasita a sobreviver na célula hospedeira. Como

endoproteinase com um espectro largo de substratos, a gp63 tem o potencial de


12

degradar imunoglobulinas, factores do complemento e proteínas lisossomais (Chaudhuri

and Chang, 1988; Santarem et al., 2007). A sua actividade proteolítica a pH 4 tem

particular relevância na sobrevivência dos amastigotas num ambiente acídico como os

fagolisossomas dos macrófagos (Awasthi et al., 2004; Chaudhuri et al., 1989). Apesar

disso a expressão de gp63 está diminuída nos amastigotas (Santarem et al., 2007;

Schneider et al., 1992).

Os fosfolípidos glicosilinositol (GIPLs) são moléculas 10 vezes mais abundantes

que o LPG, presentes à superfície do parasita. Foram descritos na L. major como tendo

um papel protector, modulando a expressão da sintetase do óxido nítrico em macrófagos

de murinos (Proudfoot et al., 1996; Proudfoot et al., 1995; Santarem et al., 2007).

Outro grupo de proteínas presentes no parasita são as proteases de cisteína. A

sua actividade pode ser encontrada à superfície do parasita ou dentro do retículo

endoplasmático do macrófago, provavelmente associada a proteases libertadas no

fagolisossoma pela Leishmania. A inibição das moléculas do complexo major de

histocompatibilidade classe II parece envolver, na L. amazonensis, o sequestro directo

destas moléculas seguido de degradação dependente das proteases de cisteína (De

Souza Leao et al., 1995; Ikeda-Garcia et al., 2007). Também foi demonstrado que

induzem a repressão de IL-12 e a degradação de NF-κB, na L. mexicana (Cameron et al.,

2004; Santarem et al., 2007).

Ao escaparem ao meio extracelular os parasitas penetram nas células fagocíticas

pela interacção entre os receptores dos macrófagos e as moléculas de superfície do

parasita. Essa ligação pode ser directa, via parasita-macrófago, ou indirecta, através de

moléculas presentes no plasma (Reis et al., 2006). A ligação dos promastigotas pode dar-

se aos receptores CR1 e CR3 dos macrófagos, gerando um sinal inibitório que suprime a

sua função responsável pela eliminação do parasita (Awasthi et al., 2004), ou os

promastigotas podem ser opsonizados pelos C3b e C3bi, que se fixam, respectivamente,

ao CR1 e ao CR3 do macrófago (Reis et al., 2006).

Depois do parasita entrar na célula hospedeira por fagocitose, os fagossomas

fundem-se com lisossomas secundários formando um vacúolo parasitóforo completo. As

formas metacíclicas rapidamente se transformam em amastigotas intracelulares (Awasthi

et al., 2004). Estas formas são mais adaptadas ao pH ácido do meio e possuem enzimas

como a catalase e a superóxido dismutase em grandes concentrações, protegendo o

parasita da explosão oxidativa dos macrófagos (Castellano, 2005). Durante esta

transformação o LPG migra para a superfície dos macrófagos infectados onde vai inibir a

cadeia respiratória, um processo que ocorre depois da fagocitose, e a actividade


13

hidrolítica das enzimas lisossomais, possivelmente através da quelação do cálcio ou

inibição da proteína cinase C (Awasthi et al., 2004; Turco and Descoteaux, 1992).

São conhecidos vários mecanismos de evasão e modulação intracelular do

sistema imunológico do hospedeiro pelo parasita, em seu próprio benefício. Quando os

promastigotas infectam os macrófagos, diminui a expressão de CD80, uma molécula co-

estimulatória, resultando uma anulação da resposta de células T. Para além disso, a

apresentação de antigénio através de moléculas do tipo MHC classe II está impedida em

macrófagos infectados com Leishmania. Os amastigotas Leishmania degradam essas

moléculas e deste modo impedem a apresentação do antigénio, sem indução de

sinalização de células T e menor produção de IFN-γ. Os macrófagos infectados

interagem com células T CD4+ que expandem a população de células T CD4+ produtoras

de IL-4, diminuindo o IFN-γ e a resposta Th1, promovendo a progressão da doença

(Awasthi et al., 2004).

Uma outra forma eficiente do parasita escapar à destruição pelo sistema

imunológico do hospedeiro é o controlo da expressão de IL-12 pelo parasita (Castellano,

2005). A IL-12 é um adjuvante efectivo e um pré-requisito para a resposta imunológica do

tipo Th1, na maior parte das infecções por parasitas intracelulares. Os principais

produtores de IL-12 são células apresentadoras de antigénio como macrófagos e células

dendríticas (Yamane et al., 1999), que produzem IL-12 através da interacção CD40-

CD40L (Kato et al., 1996) quando o CD40L presente à superfície das células T activadas

interage com o CD40 dos macrófagos (Armitage et al., 1993; Renard et al., 1994;

Yamane et al., 1999). A IL-12 activa as células T que produzem IFN-γ com função

leishmanicida (Awasthi et al., 2004). Estudos demonstraram que tanto a Leishmania

como LGP ou GIPLs isolados do parasita são capazes de inibir, de forma selectiva, a

produção de IL-12, sem inibirem a produção de outras citoquinas (McDowell and Sacks,

1999). Esta inibição está intimamente relacionada com a inibição via Jak-STAT (“Janus

kinase-signal transducers and activators of transcription”). A selectividade desta inibição

em infecções por Leishmania relaciona-se com o STAT1. (Castellano, 2005).

A IL-18 é uma citoquina pró-inflamatória que ajuda o despoletar de uma resposta

imunológica do tipo Th1 e é particularmente eficiente em colaboração com a IL-12 (Tsuji-

Takayama et al., 1999). Ambas as interleuquinas, IL-12 e IL-18, induzem a produção de

IFN-γ.

O IFN-γ é importante na produção de NO, aumentando a transcrição de iNOS e a

libertação de NO dos macrófagos estimulados (Awasthi et al., 2004). A ligação do IFN-γ

ao receptor na superfície dos macrófagos resulta na dimerização das unidades α e β do

receptor e na sua fosforilação. Esta acção inicia uma cascata de sinalização que envolve


14

a fosforilação de receptores cinases, Janus cinases (Jak) 1 e 2, e a transdução do sinal e

activação da transcrição STAT1, que se transloca para o núcleo para activar a transcrição

dos genes que respondem ao IFN-γ (Blanchette et al., 2003; Kima, 2007). Muitos estudos

demonstraram que os macrófagos infectados com Leishmania não respondem à indução

da produção de NO pelo IFN-γ. Tanto as formas amastigota como as formas

promastigota de Leishmania mostraram que inibem selectivamente a activação por IFN-γ

pela via Jak 1 e 2, assim como STAT1 (Blanchette et al., 1999; Kima, 2007; Nandan and

Reiner, 1995).

O TNF-α é uma das citoquinas anti-Leishmania mais bem estudadas. Esta

citoquina mostrou actuar sinergicamente com o IFN-γ na indução da iNOS e produção de

NO in vitro (Awasthi et al., 2004; Deng et al., 1993).

A IL-10 é uma citoquina de regulação produzida por células T, células B,

macrófagos, células dendríticas e células epiteliais. Em doentes com leishmaniose

visceral foram observados níveis elevados de IL-10, que apesar de estar envolvida na

limitação de certas patologias imunológicas, especialmente do fígado, no caso de

leishmaniose visceral a sua actividade imunossupressora parece promover a replicação

do parasita e a progressão da doença (Nylen and Sacks, 2007). A associação entre a IL-

10 e a leishmaniose visceral em humanos com doença activa está firmemente

estabelecida, no entanto não está estabelecida na leishmaniose canina visceral (CVL).

Quinnel et al. (2001) demonstraram níveis similares de transcrição de IL-10 em animais

assintomáticos, oligossintomáticos e polissintomáticos (Carrillo and Moreno, 2009;

Quinnell et al., 2001b).

A IL-10 contribui para a patogénese da leishmaniose visceral em humanos de

várias formas. Mantém os macrófagos inertes aos sinais de activação, por exemplo ao

IFN-γ, e inibe a indução de metabolitos reactivos de nitrogénio e oxigénio (RNI e ROI).

Nas células apresentadoras de antigénio, a IL-10 diminui a expressão de moléculas MHC

classe II, moléculas co-estimulantes e IL-12, inibindo a proliferação e a manutenção de

células Th1. Para além disso, inibe a maturação e migração das células dendríticas e

pode induzir a proliferação de células dendríticas tolerogénicas, que produzem IL-10 e

promovem o aparecimento de células Tr1 produtoras de IL-10. Pode ainda contribuir para

a morte de células T activadas, e promover a sobrevivência de células B e diferenciação

de plasmócitos. À medida que progride a doença a célula B, fonte de IL-10, e os

anticorpos parecem contribuir para a patogénese da leishmaniose visceral devido aos

anticorpos auto-reactivos e à deposição de imunocomplexos, que podem causar danos

no tecido. Para além disso, os complexos imunológicos estimulam os macrófagos e os

monócitos a produzirem IL-10, assim como citoquinas pró-inflamatórias, nomeadamente


15

IL-6 e TNF-α, o que vai provocar um aumento brusco de mais complexos imunológicos e

uma maior produção de IL-10 (Nylen and Sacks, 2007).

Figura 7 – Relação entre IL-10 e a patogénese da leishmaniose visceral humana. As setas pretas indicam

fontes de IL-10; linhas a vermelho indicam bloqueio/modulação negativa da IL-10; setas verdes indicam diferenciação/apoptose promovida pela IL-10. Abreviaturas: ROI, intermediários reactivos de oxigénio; RNI,

intermediários reactivos de nitrogénio (Adaptado de Trends in Immunology).

Outras citoquinas envolvidas na mediação da activação dos macrófagos incluem

IL-2, IL-4 e IL-7 (Awasthi et al., 2004).

Para além de se evadir aos mecanismos de defesa extra e intracelulares, a

Leishmania é capaz de modular a acção de outras células do sistema imunológico que

não as células alvo da infecção (Castellano, 2005).

Os neutrófilos polimorfonucleares (PMNs) são das primeiras células a migrar para

o local da infecção ou de lesão de tecido (Awasthi et al., 2004). A sua função é de

destruir parasitas invasores, utilizando mecanismos de fagocitose (Castellano, 2005). Ao

ingerirem partículas estranhas destroem-nas por acção de enzimas proteolíticas

armazenadas em grânulos especiais e pela produção de espécies reactivas de oxigénio

(Awasthi et al., 2004). Estas células têm vida curta, e após sofrerem morte por apoptose

são fagocitados pelos macrófagos (Castellano, 2005). Foi demonstrado que os

promastigotas de Leishmania podem induzir a migração de PMNs humanos através da

libertação de um factor LCF (Factor Quimiotático da Leishmania), com potente actividade

quimiotática em neutrófilos mas não sobre outros leucócitos, como monócitos ou células

NK (van Zandbergen et al., 2002). Os neutrófilos que fagocitam a Leishmania começam

por secretar quimiocinas como IL-8 (Laufs et al., 2002), essencial para a atracção de

Activação de células B policlonais

Complexos imunológicos

Auto-anticorpos

Sobrevivência das células B Diferenciação em plasmócitos Troca IgG – IgG1, IgG3, IgA

Apoptose

DC tolerogénicas

Resposta bloqueada

aos sinais de activação

Complexos imunológicos e patologia mediada por

auto-anticorpos


16

mais neutrófilos para o local de infecção. Dois a três dias depois uma segunda onda de

células, monócitos e macrófagos, entram no local de infecção (Awasthi et al., 2004;

Muller et al., 2001; Sunderkotter et al., 1993)

Como mecanismo de parasitismo é favorável à Leishmania escapar a outras

células do sistema imunológico. Os PMNs são células intrinsecamente de vida curta, com

uma semi-vida de aproximadamente 6-10h na circulação, após as quais entram em

apoptose espontânea. A vida dos PMN maduros pode ser estendida in vitro pela

incubação com citoquinas pró-inflamatórias como GM-CSF e G-CSF, IL-8, IL1β,

glicocorticóides e produtos bacterianos como LPS. Foi demonstrado que a Leishmania

estende a vida dos neutrófilos granulócitos (Aga et al., 2002), por um mecanismo que

envolve a inibição da caspase-3, uma caspase conhecida como indutora de apoptose em

PMN de vida curta. A Leishmania retarda mas não inibe a apoptose espontânea que

acaba por acontecer em 2-3 dias (Aga et al., 2002). Os PMN infectados recrutam

monócitos e macrófagos pela indução de quimioquinas MIP-1α e MIP-1β (Scapini et al.,

2000). Estes macrófagos ingerem os PMNs infectados pela identificação de fosfatidil

serinas na superfície da célula apoptótica (Fadok et al., 1992). A ingestão destas células

não activa a actividade microbicida dos macrófagos (Meagher et al., 1992) e será uma

óptima forma de entrada silenciosa da Leishmania nas suas principais células

hospedeiras, os macrófagos (Laskay et al., 2003). Antes de entrarem em apoptose, os

neutrófilos secretam ainda diferentes citoquinas que afectam a activação e diferenciação

das células T (Awasthi et al., 2004).

Os macrófagos em descanso e os activados por IFN-γ diferem quanto às suas

funções como células apresentadoras de antigénio (Unanue, 2002). Do mesmo modo,

tem sido observado que cerca de 47% dos neutrófilos circulantes no sangue periférico

expressam CD28 (Venuprasad et al., 2001) e que os sinais CD28 através da cinase PI3

induzem IFN-γ (Venuprasad et al., 2002) e também induzem factores quimiotácticos para

células T (Venuprasad et al., 2003), sugerindo o papel importante dos neutrófilos na

resposta mediada por células T. O IFN-γ parece resultar do aumento da expressão de

MHC classe II de um modo autócrino. Estes factos revelam que os neutrófilos podem ter

um papel contraditório na infecção por Leishmania: a interacção directa com a

Leishmania ajuda à morte por fagocitose e à transferência para os macrófagos, enquanto

a interacção indirecta com macrófagos infectados por Leishmania resulta numa activação

dos mesmos e indução de uma resposta imunológica do tipo Th1 (Awasthi et al., 2004).

Outras células apresentadoras de antigénio que merecem destaque são as

células dendríticas – células de Langerhans. Quando infectadas, estas células são

activadas e passam a ter expressão aumentada de MHC I, MHC II e co-factores, apesar


17

da diminuição de expressão de E-caderina. Esta molécula de superfície está relacionada

com a ligação das células de Langerhans aos queratinócitos da epiderme. Estes eventos

de desregulação permitem que as células parasitadas não se adiram ao tecido

epidérmico e migrem para os gânglios linfáticos regionais, de modo a apresentarem os

antigénios de Leishmania às células efectoras do sistema imunológico (Castellano, 2005).

Para além da importante resposta imunológica mediada por células T, a

leishmaniose está também associada ao desenvolvimento de imunidade humoral. Em

modelos experimentais com ratinhos susceptíveis à doença, espécies doentes

respondem com IgG1 e IgE, em contraste com uma resposta predominantemente IgG2a

nas espécies com fenótipo resistente (Heinzel et al., 1989; Sakai et al., 2000). Nos

ratinhos existem evidências claras que as células Th2 promovem respostas IgG1/IgE

específicas de antigénio, enquanto que respostas imunológicas controladas por células

Th1 induzem uma fraca reacção humoral com predomínio de anticorpos IgG2a. Na

leishmaniose este último anticorpo, IgG2a, parece ter um papel importante na resposta

imunológica, captando os amastigotas libertados por macrófagos infectados. Apesar

destas evidências no modelo murino, nos humanos infectados esta associação não está

tão clara e depende da forma de doença. Por exemplo, na leishmaniose cutânea

humana a resposta imunológica está associada a um perfil de anticorpos de IgG1, IgG2 e

IgG3, sugerindo uma resposta do tipo Th1, enquanto que na leishmaniose cutânea difusa

predomina uma resposta do tipo IgG4, IgG1 e IgG2 (Rodriguez et al., 1996). Em

contraste, outros estudos reportaram uma resposta humoral específica de antigénio com

todas as subclasses de IgG, sem nenhum perfil definido (da Matta et al., 2000; Day,

2007).


18

1.2. Métodos de diagnóstico da leishmaniose

O desenvolvimento de testes de diagnóstico fiáveis é essencial para a detecção

de infecção por Leishmania em cães sintomáticos e assintomáticos, uma vez que cães

infectados sem sinais da doença são potenciais transmissores da doença (Miro et al.,

2008).

O diagnóstico da leishmaniose pode ser realizado usando diferentes métodos, que

podem ser directos, com detecção do parasita ou do seu DNA, ou indirectos, por testes

imunológicos ou celulares (Maia and Campino, 2008). Os avanços tecnológicos obtidos

com a utilização de antigénios recombinantes no diagnóstico serológico da leishmaniose

visceral e a identificação de parasitas em amostras de sangue por técnica de PCR

resultou num aumento da exactidão do diagnóstico de leishmaniose canina visceral. No

entanto, ambas as técnicas necessitam de estar largamente disponíveis para terem

impacto no controlo da doença. Deste modo, a redução de custos das mesmas continua

a ser o maior desafio na sua utilização em zonas endémicas de países em

desenvolvimento (Gomes et al., 2008).

A identificação da espécie de Leishmania responsável pela infecção é crucial para

a decisão de tratamento adequado, uma vez que o desenvolvimento de resistências

secundárias aos fármacos varia entre as espécies. Esta identificação pode ser feita por

análise isoenzimática, análise microsatélite ou PCR em combinação com Restriction

Fragment Lengh Polymorphism (RFPL) (Zimmermann et al., 2009).

1.2.1. Diagnóstico directo

- Exame microscópico

Classicamente o diagnóstico da leishmaniose pode ser realizado pela observação

microscópica de formas amastigotas de Leishmania em esfregaços corados de tecidos

e/ou órgãos infectados, nomeadamente medula óssea, gânglios linfáticos, pele e sangue

periférico (Maia and Campino, 2008). As amostras são examinadas por microscopia

óptica com óleo de imersão (Gomes et al., 2008). Com a coloração Giemsa ou Leishman,

os amastigotas aparecem livres ou dentro de monócitos, macrófagos e neutrófilos, como

corpos ovais ou redondos, com 2-4 µm de diâmetro. O seu citoplasma aparece azul

pálido, com um núcleo relativamente largo que cora de vermelho. No mesmo plano do

núcleo, no ângulo direito em relação a este, o cinetoplasto aparece como um corpo

redondo, corado de vermelho ou violeta. A densidade de parasitas no esfregaço pode ser


19

estimada contando o número de amastigotas em relação à contagem de leucócitos. É

aplicada uma escala logarítmica do 0 (sem parasitas) a +6 (mais de 100 parasitas por

campo do microscópio) (Ciaramella et al., 1997; Saridomichelakis et al., 2005). A maioria

das amostras são obtidas por procedimentos invasivos, que não são geralmente

efectuados em cães assintomáticos (Alvar et al., 2004; Maia and Campino, 2008). Por

outro lado, a observação de esfregaços de medula óssea ou de gânglios linfáticos

mostrou ser uma técnica sensível e específica de diagnóstico de leishmaniose canina

sintomática, no entanto a sua sensibilidade diminui (<30%) nas infecções assintomáticas

(Miro et al., 2008; Saridomichelakis et al., 2005). O exame directo de aspirados de

medula óssea e de gânglios linfáticos podem ainda levar a resultados falsos negativos,

tanto devido ao baixo número de parasitas presentes, especialmente em cães

assintomáticos, como devido a amostras hemodiluídas (Gomes et al., 2008;

Ikonomopoulos et al., 2003; Piarroux et al., 1994).

Liarte et al. (2001) descreveu um método fluorescente directo e rápido, com

Quantitative Buffy Coat (QBC®), que mostrou elevada sensibilidade na detecção de

amastigotas em sangue periférico de cães infectados com Leishmania. No entanto devem

ser realizados mais estudos em cães não infectados de zonas endémicas e não

endémicas para avaliar a sua especificidade (Liarte et al., 2001; Maia and Campino,

2008). Uma outra técnica desenvolvida por Cenini et al. (1989) permite avaliar a

viabilidade dos amastigotas, usando uma contagem diferencial entre as formas vivas e as

formas mortas. Depois de corar os amastigotas com diacetato de fluoresceína e brometo

de etídio, sob luz azul, os parasitas vivos aparecem a verde enquanto os mortos coram

de laranja (Cenini et al., 1989). Tanto esta técnica como a anterior requerem

equipamento dispendioso como microscópio de fluorescência, porém podem ser úteis no

seguimento do tratamento (Cenini et al., 1989; Maia and Campino, 2008).

- Histopatologia

A análise histopatológica de órgãos infectados corados com hematoxilina e eosina

também tem sido utilizada para detectar a presença de parasitas. Devem ser realizadas

procuras minuciosas uma vez que os organismos parasitários não são facilmente

reconhecidos. Apesar da baixa sensibilidade do método, foi demonstrado por Moreira et

al (2007) que o material recolhido dos gânglios linfáticos foi o que mostrou melhores

resultados, seguido do baço e de secções de medula óssea (Moreira et al., 2007). Não

obstante estes resultados terem sido obtidos em amostras colhidas post-mortem, as


20

biópsias de gânglios linfáticos, medula óssea e pele têm sido utilizados na prática clínica

(Maia and Campino, 2008).

- Imunohistoquímica

Podem ser usadas técnicas imunohistoquímicas com imunoperoxidase ou

imunofluorescência directa em tecidos como ferramenta suplementar para confirmar o

diagnóstico da análise histopatológica, especialmente em órgãos que não tenham uma

carga parasitária elevada (Maia and Campino, 2008).

É importante salientar que tanto a observação microscópica, histopatológica e

identificação imunohistoquímica de amastigotas requerem um observador experiente e

especialista, e estão sujeito à habilidade do mesmo. Estes métodos podem levar a

resultados falsos negativos, uma vez que a sua sensibilidade depende da carga

parasitária, ou resultados falsos positivos porque alguns artefactos visíveis ao

microscópio óptico podem ser erroneamente considerados amastigotas (Alvar et al.,

2004; Baneth et al., 2008; Gomes et al., 2008; Maia and Campino, 2008).

- Cultura

As culturas de diferentes tecidos in vitro podem melhorar a sensibilidade da

detecção do parasita. O meio de cultura pode ser monofásico, como o meio de

Schneider, M199, RPMI, meio Grace´s, ou difásico como meio Novy-McNeal-Nicolle ou

Brain Heart Infusion. Os meios são inoculados com uma ou duas gotas de aspirado ou

fragmento de órgão homogeneizado e incubados a uma temperatura entre 22º a 26º. As

culturas são examinadas todas as semanas à procura de promastigotas. Os parasitas

devem-se observar na primeira semana apesar de as subculturas semanais em meio

fresco serem necessárias para os visualizar. Habitualmente uma cultura é considerada

negativa após quatro subculturas sucessivamente negativas (Maia and Campino, 2008).

De acordo com Madeira et al (2006) o baço, os gânglios linfáticos e a medula

óssea são os materiais biológicos que mostram maior número de culturas positivas (de

Fatima Madeira et al., 2006). Devido aos resultados satisfatórios obtidos com o baço

alguns autores (Barrouin-Melo et al., 2006; Rosypal et al., 2003) defendem a eleição

desta amostra para o diagnóstico parasitológico da infecção por Leishmania. No entanto

o facto do procedimento de colheita de material biológico ser invasivo (Maia and

Campino, 2008) e de haver risco de complicações como hemorragia (Singh and


21

Sivakumar, 2003) tem sido usado, como alternativa, o aspirado de gânglio linfático. Em

cães sem parasitas detectáveis nos gânglios a medula óssea pode ser usada como

alternativa (Maia and Campino, 2008). Apesar de serem 100% específicas, as culturas são pouco utilizadas hoje em dia

como meio de diagnóstico, devido a desvantagens como a demora dos resultados,

susceptibilidade a contaminação microbiológica, dependência da carga parasitária e por

vezes dificuldade de execução devido à fraca adaptação do isolado ao meio. No entanto

são usadas quando se pretende obter um número de parasitas suficiente para

identificação isoenzimática, para antigénio de diagnóstico imunológico, para modelos de

infecções experimentais assim como para o screening de fármacos ou até identificação

molecular (Maia and Campino, 2008).

- Isolamento dos parasitas em animais de laboratório

A presença do parasita pode ser demonstrada pela inoculação no hamster

Mesocricetus auratus. Apesar de não ser habitualmente usado como método de

diagnóstico, uma vez que são necessários alguns meses para se obterem resultados,

pode ser utilizado quando há um risco significativo de contaminação do material clínico

colhido. Após a inoculação, o animal é examinado todas as semanas à procura de sinais

da doença como esplenomegalia (Maia and Campino, 2008).

- Xenodiagnóstico

O xenodiagnóstico é uma técnica que usa o vector artrópode natural na detecção

e isolamento do parasita. É um método que não é usado no diagnóstico, uma vez que só

pode ser executado em laboratórios especializados, onde a colónia de flebotomíneos

esteja bem estabelecida. No entanto tem sido importante para resolver algumas questões

epidemiológicas sobre o estado clínico e o tratamento da doença (Maia and Campino,

2008).

- Reacção da polimerase em cadeia (PCR – Polymerase Chain Reaction)

O método por PCR aplicado à Leishmania é o mais fiável para determinar a

presença e identificar parasitas não apenas nos casos activos de doença como também

na monitorização pós-tratamento. Estes ensaios aumentaram grandemente a

sensibilidade do diagnóstico parasitológico de leishmaniose em cães (Maia and Campino,


22

2008). A técnica por PCR consegue detectar RNA ou DNA do parasita poucas semanas

depois do aparecimento de sinais ou sintomas clínicos (Singh and Sivakumar, 2003). Por

outro lado, tem a vantagem de poder ser conduzido utilizando uma variedade de

amostras, como sangue total, medula óssea, aspirado de gânglios linfáticos, pele ou

zaragatoa da conjuntiva, (Andrade et al., 2002; Ferreira Sde et al., 2008; Fisa et al., 1997;

Maia and Campino, 2008; Strauss-Ayali et al., 2007) embora com sensibilidades

diferentes.

Um resultado negativo de PCR num cão com suspeita clínica de doença não é

dado suficiente para afastar o diagnóstico de infecção. Estudos que avaliaram PCR em

diferentes tecidos de cães infectados mostraram resultados variáveis e por vezes

conflituosos (Baneth and Aroch, 2008; Maia and Campino, 2008).

A eficácia da técnica de PCR vai depender de vários factores como os primers

utilizados, número de cópias do alvo, método de extracção do DNA, material biológico e o

protocolo de PCR (Alvar et al., 2004; Baneth and Aroch, 2008; Cortes et al., 2004; Maia

and Campino, 2008).

O diagnóstico por PCR é baseado na amplificação in vitro de sequências

nucleotídicas específicas presentes no parasita. As células da Leishmania, assim como

outros cinetoplastídeos, contêm uma complexa rede de moléculas de DNA circular,

denominado DNA do cinetoplasto ou kDNA, dentro da sua mitocôndria. O DNA

mitocondrial deste parasita representa cerca de 20% do DNA total celular, e está

organizado numa rede em forma de disco, onde cerca de 95% são milhares de pequenos

minicírculos interligados. Cada minicírculo tem uma região conservada com 120 a 200

pares de bases e uma região variável. A região conservada contem três blocos altamente

conservados e outras regiões menos conservadas, que podem ser usadas como alvos de

PCR para a discriminação dos grupos de Leishmania (Gomes et al., 2008). O PCR

baseado no kDNA provou ser mais sensível que o DNA genómico na detecção de

Leishmania no sangue de canídeos (Lachaud et al., 2002; Miro et al., 2008; Nasereddin

et al., 2006).

Para além deste, outros alvos têm sido usados, como DNA ribossómico ou o

espaço interno transcrito 1 (ITS1 – internal transcribed spacer 1), apesar de se terem

mostrado menos sensíveis devido ao menor número de cópias como alvo (Gomes et al.,

2008; Nasereddin et al., 2006).

Estudos revelaram uma elevada sensibilidade na detecção de DNA de Leishmania

infantum em amostras do baço e aspirados de gânglios linfáticos de cães seropositivos

ou quando o DNA é obtido a partir da purificação de zaragatoas da conjuntiva. A

utilização de amostras de sangue total ou camada concentrada de células da série


23

branca obtidas a partir do sangue centrifugado (“buffy coat”) baixa a sensibilidade do

método (Miro et al., 2008). No entanto, uma vez que a colheita das amostras não é

invasiva, é mais aceite pelos proprietários dos animais (Maia and Campino, 2008; Maia et

al., 2009).

De acordo com Maia et al. (2009), o PCR realizado em gânglios linfáticos mostrou

ser útil como primeira linha de diagnóstico ou seguimento de tratamento e o PCR que usa

medula óssea deve ser apenas utilizado quando os gânglios linfáticos popliteais não são

detectáveis. Nos casos em que ambas as amostras não são fiáveis, por razões

económicas ou devido à larga escala dos estudos epidemiológicos, é proposto que se

use soro em ensaios imunológicos ou sangue total marcado em papel de filtro para PCR

para complementar os resultados serológicos (Maia et al., 2009).

- PCR em tempo real (RT-PCR)

O PCR quantitativo em tempo real permite a monitorização da amplificação de

sequências específicas de DNA enquanto a reacção ocorre (Maia and Campino, 2008). É

uma técnica avançada que consegue detectar níveis muito baixos de parasitas. Estudos

mostraram que esta técnica é consideravelmente mais sensível que o PCR convencional.

O PCR em tempo real consegue detectar <1 parasita por ml, enquanto que o PCR

convencional apenas detecta uma carga parasitária que seja ≥30 parasitas por ml

(Francino et al., 2006; Miro et al., 2008). Para além disso o tempo do ensaio é mais

reduzido e o risco de contaminação é menor (Gomes et al., 2008; Maia and Campino,

2008; Mortarino et al., 2004; Rolao et al., 2004).

Recentemente foram estabelecidos alguns protocolos de PCR quantitativo, com

elevada sensibilidade e reprodutibilidade, baseados em sistemas SYBR Green ou

TaqMan, em fígado ou pele de rato e sangue periférico humano, tendo como alvo tanto

cromossomas com uma única cópia, como as sequências em minicírculo multi-cópia

(Gomes et al., 2008; Mortarino et al., 2004). Estes métodos baseiam-se na utilização de

probes fluorescentes. A tecnologia SYBR Green é um sistema de detecção não

específico baseado num DNA fluorescente que se intercala, e que é aplicável a todos os

potenciais alvos. Outro sistema, o TaqMan, é mais específico uma vez que avalia

directamente a quantidade de DNA amplificado usando probes fluorescentes específicas

para a sequência alvo, localizadas ao lado do par primer (Maia and Campino, 2008).

O PCR quantitativo é muito útil no diagnóstico da leishmaniose canina e facilita a

monitorização da carga parasitária durante e depois do tratamento em diferentes

amostras, permitindo a predição de recorrências associadas a parasitémia residual


24

(Francino et al., 2006; Maia and Campino, 2008; Manna et al., 2008; Miro et al., 2008;

Pennisi et al., 2005b; Solano-Gallego et al., 2007). É vantajoso quando é necessário um

diagnóstico rápido e sensível, especialmente nos casos em que os resultados serológicos

sejam dúbios (Gomes et al., 2008; Vitale et al., 2004).

-Nucleic Acid Sequence-Based Amplification (NASBA)

Uma outra técnica desenvolvida recentemente é a amplificação de sequências de

ácidos nucleicos (NASBA) da subunidade 18S do rRNA. Apesar de não permitir ainda a

diferenciação entre as espécies de Leishmania, permite detectar infecções activas com

elevada especificidade e sensibilidade. Uma vez que se baseia na amplificação de RNA e

os parasitas podem ser quantificados (QT-NASBA) pode ser particularmente útil na

monitorização da progressão da doença e dos resultados da terapêutica anti-Leishmania.

A amplificação isotérmica não necessita de equipamento sofisticado e por isso é mais

facilmente aplicável nos países com zonas endémicas, em comparação com PCR ou RT-

PCR. A detecção da amplificação por NASBA numa tira de oligocromatografia (OC)

através da hibridização com uma probe conjugada com ouro representa um avanço

significativo num diagnóstico sensível e específico de leishmaniose em países em

desenvolvimento e está em avaliação em áreas tropicais (Zimmermann et al., 2009).

1.2.2. Diagnóstico indirecto – ensaios imunológicos

A leishmaniose canina visceral é usualmente diagnosticada pela detecção de

imunoglobulinas G (IgG) que se ligam especificamente aos antigénios Leishmania

(Gomes et al., 2008). Os cães infectados desenvolvem um título de anticorpos anti-

Leishmania que aumenta ao longo do tempo, apesar da produção de anticorpos ser baixa

no início ou numa fase tardia da doença, ou em doentes assintomáticos. Os cães

sintomáticos, para além das alterações hematológicas e proteicas, desenvolvem uma

forte resposta humoral (Maia and Campino, 2008; Oliva et al., 2006).

Apesar dos níveis elevados de imunoglobulinas específicas, os métodos

serológicos subestimam muitas vezes a taxa de infecção com Leishmania de populações

de canídeos em zonas endémicas. Para além disso, a presença de anticorpos anti-

Leishmania por si só não é um sinal conclusivo de doença. Deste modo, é aconselhável

executar mais do que um teste serológico, para melhorar o diagnóstico de leishmaniose

canina (Campino, 2002), e monitorizar com a repetição do teste passados 3 meses

(Baneth and Aroch, 2008; Maia and Campino, 2008).


25

A determinação das subclasses de IgG não é geralmente usada no diagnóstico.

Os níveis de subclasses de IgG específicas anti-Leishmania têm sido testadas como

marcadoras de susceptibilidade e consequente estatuto clínico dos animais infectados

(Cardoso et al., 2007; Iniesta et al., 2002; Iniesta et al., 2005; Leandro et al., 2001; Maia

and Campino, 2008; Pinelli et al., 1994). Na sua maioria os investigadores têm focado os

seus estudos na resposta IgG1 e IgG2 e tentaram relacionar a sua produção com a

susceptibilidade mediada por células Th2 ou resposta tipo Th1 protectora,

respectivamente (Cardoso et al., 2007; Deplazes et al., 1995; Iniesta et al., 2005; Nieto et

al., 1999; Rodriguez-Cortes et al., 2007a). No entanto, os resultados não foram

conclusivos. Estudos efectuados em infecções por L. infantum mostraram uma

predominância de IgG2 durante tanta a fase aguda como a infecção subclínica da

leishmaniose visceral (Ribeiro et al., 2007) É possível que as discrepâncias encontradas

sejam explicadas pelos diferentes anti-soros usados (Day, 2007; Maia and Campino,

2008; Ribeiro et al., 2007).

Estão disponíveis uma larga variedade de métodos imunológicos para o

diagnóstico da leishmaniose visceral, que variam na sensibilidade e especificidade. Os

testes menos específicos foram usados no passado e são pontualmente utilizados

actualmente, uma vez que um teste positivo não confirma diagnóstico de leishmaniose

(Herwaldt, 1999).

Outros testes serológicos mais específicos utilizados são o teste indirecto com

anticorpo fluorescente (IFAT – “Indirect Fluorescent Antibody Test”), teste de aglutinação

directo (DAT – “Direct Agglutination Test”) e imunoensaio ligado a enzima (ELISA –

“Enzyme-linked Immunosorbent Assay”) (Gomes et al., 2008).

- Contraimunoelectroforese (CIE)

A contraimunoelectroforese (CIE – counterimmunoelectrophoresis) é um método

qualitativo explorado por Barbosa et al. (1973), baseado na visualização de um arco de

precipitação azul (coloração com azul Coomassie) numa tira de cellogel®, devido à

interacção entre os antigénios da Leishmania e os anticorpos presentes na amostra de

soro submetida a electroforese (Barbosa et al., 1973). Pode ser usado para soros de

diferentes hospedeiros simultaneamente uma vez que não requer uma imunoglobulina

específica. Tem as vantagens de ser um teste rápido, obtendo-se resultados em poucas

horas, económico e que requer equipamento simples, tornando-o um dos testes

escolhido para estudos epidemiológicos. Estudos mostraram uma sensibilidade que varia

com a condição clínica do hospedeiro, entre 72,7% em animais assintomáticos, 80% em


26

cães com doença branda e 96,1% em animais com doença clínica severa (Maia and

Campino, 2008; Mancianti and Meciani, 1988). Estudos mais recentes realizados em 143

cães de zonas endémicas mostraram uma sensibilidade e especificidade de 85,5% e

94,7%, respectivamente (Maia et al., 2009).

- Ensaio de imunodifusão (IDA)

O ensaio de imunodifusão (IDA – Immunodiffusion Assay) com polietilenoglicol

(PEG) foi desenvolvido por Bernardina et al. (1997) para o diagnóstico de leishmaniose

canina. Esta técnica consiste numa dupla imunodifusão num gel de 1% agarose contendo

3% de PEG, e é executado usando amostras de soro e antigénio solúvel de Leishmania

(LSA). A formação de bandas é registada após coloração com Coumassie Blue. É um

ensaio fácil de executar, que não requer equipamento sofisticado e permite o tratamento

de uma série de amostras simultaneamente. A especificidade obtida foi de 98% em cães

controlo de zonas endémicas e de 100% em cães de zonas não endémicas, e a

sensibilidade variou entre 69% em cães sintomáticos com cultura negativa e 100% em

cães sintomáticos (Bernadina et al., 1997; Maia and Campino, 2008).

-Teste de imunofluorescência indirecta (IFAT)

O IFAT é considerado o método padrão do diagnóstico serológico (Maia and

Campino, 2008), sendo um dos testes disponíveis mais sensível (Singh and Sivakumar,

2003). Baseia-se na detecção de anticorpos, que estão presentes em estadios recentes

de doença e não são detectáveis seis a nove meses após a cura. Se os anticorpos

persistem em títulos baixos, é um bom indicador de recaída (Singh and Sivakumar,

2003). Este teste usa todo o corpo do parasita como antigénio e é útil em estudos

epidemiológicos, na prática clínica e no seguimento do tratamento (Alvar et al., 2004;

Gradoni, 2002; Maia and Campino, 2008; Mancianti et al., 2002). Existe a possibilidade

de reacção cruzada com soro tripanossomal, que pode ser minimizado pela utilização de

amastigotas Leishmania como antigénio, em substituição de promastigotas (Singh, 1999;

Singh and Sivakumar, 2003). A sua aplicação requer um nível elevado de experiência e

equipamento de laboratório dispendioso. Outra das suas limitações é o facto de terem

que ser feitas diluições seriadas do soro, o que torna o método trabalhoso e pouco

prático para o screening de um largo número de amostras. Estão disponíveis alguns kits

comerciais, no entanto antigénios preparados no laboratório são usualmente mais

efectivos (Gradoni, 2002). As amostras em que o parasita mostre fluorescência verde


27

homogénea são consideradas positivas enquanto que aquelas que mostram uma

coloração vermelha são consideradas negativas. A sensibilidade da IFAT na detecção de

cães infectados varia entre 21,6% (Silva et al., 2001) a 100% (Ciaramella et al., 1997;

Maia and Campino, 2008).

- Teste de aglutinação directa (DAT)

O teste de aglutinação directa (DAT) é um teste económico e simples de executar

tornando-o o ideal para utilização no laboratório e em campo (Meredith et al., 1995). Usa

promastigotas marcados tanto em suspensão como na forma congelada a vácuo e pode

ser conduzido em plasma ou em soro. Em vários estudos realizados em cães de zonas

endémicas com leishmaniose visceral mostrou uma sensibilidade entre 70,6% (Mohebali

et al., 2004b) e 100% (da Silva et al., 2006) e uma especificidade entre 84,9% (Mohebali

et al., 2004b) e 100% (Neogy et al., 1992; Schallig et al., 2002a). Duas das suas

limitações é o tempo relativamente longo de incubação (18h) e o facto de serem

necessárias diluições seriadas do soro ou plasma, o que faz o teste trabalhoso e não

aplicável para o screening de um largo número de amostras (el Harith et al., 1989). Um

outro teste, teste rápido de aglutinação directa (FAST – Fast Agglutination Screening

Test), que combina uma concentração elevada de parasitas com um volume pequeno de

teste tem como principais vantagens o facto de requerer apenas uma diluição de soro e

os resultados serem lidos após 3h. Foram obtidas sensibilidades desde 93,6% a 97,7%

(Maia and Campino, 2008; Schallig et al., 2004; Schallig and Oskam, 2002; Schallig et al.,

2002b).

-Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)

Os métodos de diagnóstico por ELISA são úteis no laboratório ou aplicados ao

campo. Permitem a avaliação de um largo número de amostras num período de tempo

curto uma vez que podem ser executados de uma forma simples e facilmente adaptados

ao uso de vários antigénios tais como antigénios citoplasmáticos totais, purificados,

péptidos sintéticos definidos e proteínas recombinantes (Maia and Campino, 2008).

A sensibilidade e a especificidade do teste são fortemente influenciados pelo tipo

de antigénio utilizado (Islam et al., 2002; Miro et al., 2008; Porrozzi et al., 2007; Salotra et

al., 2002; Santarem et al., 2005; Scalone et al., 2002; Silvestre et al., 2008; Zijlstra et al.,

1998).


28

Mettler et al. (2005) obtiveram uma elevada sensibilidade em cães assintomáticos

(94,1-100%) e sintomáticos (100%) usando ELISA baseada em antigénios promastigotas

e amastigotas (Maia and Campino, 2008; Mettler et al., 2005).

Fisa et al. (1997) obteve uma sensibilidade e especificidade de 100% no

diagnóstico de leishmaniose canina usando dot-ELISA com proteina A-peroxidase. A

vantagem da utilização da proteína A marcada com peroxidase em vez de anticorpo

secundário anti-cão reside no facto do teste poder ser usado para analisar soro de

humanos ou de outros possíveis hospedeiros (Fisa et al., 1997). Num estudo realizado

por Baleeiro et al. (2006) foi demonstrado que a variação das espécies de Leishmania

utilizadas como antigénios pode influenciar significativamente o resultado do teste no

diagnóstico de leishmaniose canina (Baleeiro et al., 2006). Solano-Gallego et al. (2003)

realizaram ELISAs com proteína A-peroxidase em urinas de 115 cães. Destas amostras,

26 deram positivo. Como os anticorpos anti-Leishmania presentes na urina apenas foram

encontrados em cães proteinúricos, a sua detecção é um método não-invasivo mais

específico e mais confiável no diagnóstico de leishmaniose canina e no prognóstico de

cães com glomerulonefrite (Maia and Campino, 2008; Solano-Gallego et al., 2003)

Um outro método de diagnóstico foi desenvolvido por Islam et al. para detectar

imunoglobulina G (IgG) anti-Leishmania donovani por ELISA, usando como amostra urina

humana. Foram utilizados como antigénio extracto de promastigotas de L. donovani e

antigénio constituído por promastigotas de L. donovani purificados com acetona. Com

extracto de antigénio foi obtida uma sensibilidade de 93,5% e especificidade de 89,3%,

enquanto que com antigénio purificado conseguiu-se aumentar a sensibilidade e a

especificidade para 95% e 95,3%, respectivamente. Uma vez que a colheita de amostra é

mais simples do que a colheita de soro, este método pode ser importante como

ferramenta em estudos epidemiológicos (Islam et al., 2002).

Alguns grupos de investigação avaliaram a utilização de anticorpos monoclonais

(Mabs) no diagnóstico de leishmaniose visceral. Uma ELISA competitiva, usando três

Mabs produzidos contra L. donovani (D2, D3 e D14) mostrou uma sensibilidade e

especificidade de 90% e 100%, respectivamente, em pacientes com leishmaniose

visceral. Os cães não foram incluídos no estudo (Jaffe and McMahon-Pratt, 1987).

Apesar dos Mabs serem directamente contra determinados epítopos, podem ocorrer

reacções cruzadas contra epítopos partilhados (Bergquist, 1992). Para além disso, a

produção de Mabs que reajam exclusivamente contra um antigénio é actualmente mais

difícil do que gerar antigénios específicos por técnicas de DNA recombinantes (Gomes et

al., 2008).


29

Apesar dos avanços serológicos, têm sido reportadas dificuldades com resultados

falsos positivos na leishmaniose visceral canina. Estes resultados parecem estar

relacionados com reacções de reactividade cruzada em cães com leishmaniose cutânea,

doença das Chagas, equinicose, ricketiose e toxoplasmose (Barbosa-De-Deus et al.,

2002; Costa et al., 1991; el Amin et al., 1986; Harith et al., 1987). Para além disso, a

utilização de antigénios como o extracto de promastigotas ou parcialmente purificados,

assim como diferentes procedimentos em laboratórios levaram a resultados

inconsistentes. Estas dificuldades ilustram a necessidade de um melhor entendimento e

padronização de procedimentos e reagentes. São desejáveis níveis adequados de

sensibilidade e especificidade para evitar resultados falsos negativos ou falsos positivos,

que possam levar, respectivamente, a uma transmissão da doença ou a uma eutanásia

de cães saudáveis (Gomes et al., 2008). Para superar esta limitação, têm sido testados

para o diagnóstico de leishmaniose polipéptidos recombinantes contendo epítopos

específicos, entre eles a proteína recombinante K39 (rK39) (Miro et al., 2008), rGBP da L.

donovani, rORFF da L. infantum, rgp63, rK9, rK26 e rK39 da L. chagasi (Singh and

Sivakumar, 2003), LmSIR2, LmS3a, LimTXNPx , LicTXNPx e LiTXN1 (Santarem et al.,

2005).

As proteínas recombinantes de Leishmania Hsp90 e Hsp70 foram reconhecidas

por soros de pacientes com leishmaniose visceral e não por soros de pacientes com

doença das Chagas, apesar do Trypanosoma cruzi partilhar com a Leishmania mais de

80% da identidade de aminoácidos destas proteínas (de Andrade et al., 1992). Uma

ELISA usando o antigénio recombinante da L.infantum Hsp70 (Re. ELISA) foi comparada

com a ELISA convencional (Conv. ELISA) na análise de soros de cães de zonas

endémicas do nordeste do Brasil. Este trabalho revelou que 75% (320/421) dos

resultados dos soros estavam de acordo nas ELISAS. (Andrade et al., 1998; Gomes et

al., 2008).

Carvalho et al. (2002) investigou a utilização do antigénio recombinante A2 da L.

donovani no diagnóstico da leishmaniose visceral americana em cães e em seres

humanos. Esta molécula é expressa em amastigotas como uma família de proteínas que

expõem um número variável de repetições de um conjunto de 10 aminoácidos. Em zonas

endémicas do Brasil, os anticorpos anti-A2 foram detectados por ELISA em 77% dos

soros de pacientes com leishmaniose visceral sintomática e em 87% dos soros de cães

com IFAT ou com avaliação parasitológica positiva. Para além disso, os anticorpos anti-

A2 foram ainda detectados em 14/15 sintomáticos e 10/13 cães assintomáticos. Dentro

dos animais assintomáticos anti-A2 positivos, nove apresentaram-se positivos para a

presença de parasitas e não foi observada reacção cruzada significativa com soros de


30

animais de outras doenças comuns. Estes resultados mostraram o antigénio A2 como

potencialmente útil no diagnóstico de leishmaniose visceral no Novo Mundo,

particularmente no diagnóstico de leishmaniose visceral canina (Carvalho et al., 2002;

Gomes et al., 2008).

O antigénio recombinante rK39 tem sido frequentemente avaliado como marcador

de diagnóstico de leishmaniose canina (Maia and Campino, 2008). A detecção de

anticorpos IgG contra este antigénio mostrou ser extremamente sensível e específica no

diagnóstico de leishmaniose visceral (Carvalho et al., 2003). A ELISA rK39 manifestou

ser um teste sensível na detecção de infecção recente e com um importante potencial no

diagnóstico de infecção por L. donovani no Sudão, assim como ferramenta para estudos

epidemiológicos (Zijlstra et al., 1998). A ELISA rK39 tem um elevado efeito preditivo na

detecção da doença em pessoas imunocomprometidas, como aquelas com AIDS (Singh

and Sivakumar, 2003). Os títulos de ELISA-rK39 permanecem positivos até 2 anos após

tratamento, pelo que não permite discriminação entre infecção activa e infecção passada

(Zijlstra et al., 1998). Por outro lado não foram detectados anticorpos anti-rK39 na

leishmaniose cutânea ou mucocutânea. (Singh and Sivakumar, 2003). Badaró et al

(1996) realizou um estudo em que analisou a sensibilidade e especificidade de rK39 em

comparação com antigénios de extracto de promastigotas de L.infantum, usando soros

de pacientes com leishmaniose visceral (aguda, assintomática, subclínica), assim como

de cães com leishmaniose visceral. De acordo com estes autores, a reactividade a rK39 é

um indicador serológico da doença causada por L. infantum. Esta reactividade

acompanha a doença aguda e existe também nos casos subclínicos que progridem para

leishmaniose visceral, antecipando os sinais e sintomas da doença (Badaro et al., 1996;

Gomes et al., 2008).


31

Tabela 1 – Sensibilidade e especificidade de ELISA com antigénios recombinantes no diagnóstico de leishmaniose visceral canina (Adaptado de Maia and Campino, 2008)

Antigénio Sensibilidade (%) Especificidade (%) Referência

rLdA2 87 100 (Carvalho et al., 2002)

Hsp70 75 - (Andrade et al., 1998)

rLiP0 78 - (Soto et al., 1995b)

rliP2a, rLiP2b 80 100 (Soto et al., 1995a)

rHSp83 88 - (Angel et al., 1996)

rHsp70 (FAST) 100 - (Quijada et al., 1996)

rLiH3 (FAST) 81 100 (Soto et al., 1998)

LI gp63 100 - (Morales et al., 1997)

LiP2a-rLip2b-rLiP0-

rH2A (FAST) 79-93 96-100 (Soto et al., 1998)

Hsp70,KMP-11 100 - (Nieto et al., 1999)

rLih2A, rLiH2B, rLiH3,

rLiH4 (FAST) 44-72 - (Soto et al., 1999)

rPSA 100 - (Angel et al., 1996)

rk-9 95 100 (Rosati et al., 2003)

rK-26 99,1-100 96-100 (Rosario et al., 2005) e

(Rosati et al., 2003)

rK-39 95-98,1 100 (Rosario et al., 2005)

rK-40 52,9-64,7 96-100 (Mettler et al., 2005)

rK9-rK26-rK39 96 99 (Boarino et al., 2005)

Outras proteínas recombinantes têm sido testadas, como LmSIR2, LmS3a,

LimTXNPx , LicTXNPx e LiTXN1, as duas primeiras sendo da L. major e as outras da L.

infantum (Santarem et al., 2005). LmSIR2 partilha a sequência de identidade de uma

família altamente conservada de proteínas estreitamente relacionadas com espécies

tanto procariotas como eucariotas denominadas Hst (Homologue SIR two, proteína SIR2)

(Zemzoumi et al., 1998). A LmS3a apresenta uma extensa homologia com a proteína

ribossómica eucariota S3a (Zemzoumi et al., 1999). Tanto a LmSIR2 e LmS3a são

secretadas pelos promastigotas e amastigotas (Zemzoumi et al., 1999). LimTXNPx e

LicTXNPx são membros de família peroxiredoxina, sendo a LimTXNPx mitocondrial

enquanto que LicTXNPx é citoplasmática (Castro et al., 2002). Estas proteínas são

expressas em todas os estadios do desenvolvimento do parasita. Finalmente a LiTXN1

codifica a triparedoxina, uma proteína relacionada com tioredoxinas ubiquitárias (Castro

et al., 2004). É expressada predominantemente numa fase estacionária dos

promastigotas e em amastigotas. Foi demonstrado que todas estas proteínas são

expressas em promastigotas e amastigotas de todas as espécies diferentes de

Leishmania (Castro et al., 2002; Zemzoumi et al., 1999; Zemzoumi et al., 1998). Num

estudo realizado em Portugal foram avaliadas por ELISA as respostas imunológicas a

estas proteínas, em crianças infectadas com Leishmania infantum de uma zona


32

endémica, usando as proteínas recombinantes referidas e comparadas com o extracto de

promastigotas como antigénio. Quando se usou extracto de promastigotas as leituras

foram baixas e não houve diferença de valores entre o pré e o pós-tratamento. Em

contraste, foi observado que durante o tratamento a variação dos níveis de anticorpos

contra algumas proteínas recombinantes (LicTXNPx, LimTXNPx e LmSr3arp) tende a

diminuir, chegando a valores comparáveis ou ligeiramente maiores do que os obtidos em

indivíduos saudáveis. A LicTXNPx foi a proteína que demonstrou a melhor capacidade de

distinguir entre infecção e cura (Santarem et al., 2005). Outro estudo importante reforçou

o potencial papel da proteína LicTXNPx como um marcador definido no diagnóstico de

leishmaniose canina visceral, com a capacidade de detectar infecções assintomáticas

(Silvestre et al., 2008).

- Teste rápido imunocromatográfico

Os kits de testes imunocromatográficos rápidos são muito atractivos devido ao

seu formato simples, facilidade de utilização e resposta rápida, permitindo uma

intervenção rápida no diagnóstico de leishmaniose visceral canina. No entanto, a questão

da confiança no método permanece (Gradoni, 2002; Maia and Campino, 2008). Um teste imunocromatográfico usando rk39 como antigénio está disponível

comercialmente numa forma de tiras de nitrocelulose impregnadas com antigénio. O

aparecimento de duas linhas (uma controlo e uma do teste) indica um resultado positivo.

O resultado da tira não é válido se não se obtiver a linha do controlo (Maia and Campino,

2008). Estudos efectuados em casos de leishmaniose visceral canina mostraram uma

sensibilidade e especificidade de 70,9% e 84,9%, respectivamente (Gomes et al., 2008;

Mohebali et al., 2004b).

O teste imunocromatográfico com rK39 foi também testado na leishmaniose

visceral humana, com uma sensibilidade de 87,8% e especificidade de 100% (Delgado et

al., 2001). Uma vez que este teste é rápido, não invasivo e não é necessário

equipamento especializado pode ser usado para um screening rápido e diagnóstico de

leishmaniose visceral tanto canina como humana (Delgado et al., 2001; Gomes et al.,

2008; Mohebali et al., 2004b).

A avaliação do comportamento do antigénio recombinante rK39 num formato de

imunocromatografia (strip test) foi comparado com o ensaio por ELISA usando extractos

de antigénios totais obtidos a partir de promastigotas de L.chagasi. A sensibilidade e a

especificidade do teste strip com rK39 foi de 90% e 100%, respectivamente, enquanto

que na ELISA com antigénio em bruto a sensibilidade obtida foi 89% e especificidade de


33

98%. Este estudo reforça a exactidão do strip teste com antigénio recombinante rK39 no

diagnóstico de leishmaniose visceral numa população de elevada prevalência (Carvalho

et al., 2003).

Costa et al. (2003) comparou a eficácia de rK30 e rK26 como antigénios no

diagnóstico de leishmaniose canina em testes imunocromatográficos. Conclui-se que

apesar de a rK26 ser menos sensível do que a rK30 os dois antigénios complementam-se

melhorando a sensibilidade do teste sem perda de especificidade (da Costa et al., 2003;

Maia and Campino, 2008).

- Western Blotting (WB)

Este teste não é aplicável ao diagnóstico de rotina, uma vez que requer material

específico, é moroso e dispendioso. Basicamente a sua utilização está limitada à

investigação (Ferroglio et al., 2007). Para além disso, ainda não existe entendimento

global em relação às bandas padrão correlacionadas com infecção versus doença (Maia

and Campino, 2008).

Abranches et al. (1991), Carrera et al. (1996) e Fernández-Pérez et al. (2003)

realizaram estudos que relacionaram bandas de 26 e 34-35,4 kDa na fase aguda de cães

infectados experimentalmente e naturalmente, respectivamente. As amostras obtidas

após tratamento mostraram uma baixa imunoreactividade contra 67 kDa indicando o

potencial valor prognóstico desta proteína (Abranches et al., 1991; Carrera et al., 1996;

Fernandez-Perez et al., 2003; Maia and Campino, 2008). Iniesta et al. (2007) usou WB

para analisar a expressão idiotípica de IgG1 e IgG2 em cães naturalmente infectados e

concluiu que a infecção por L. infantum é caracterizada pelo reconhecimento de fracções

polipéptidas 14, 16, 18 kDa pela IgG1 e 14, 16 kDa pela IgG2 (Iniesta et al., 2007; Maia

and Campino, 2008).

A análise por WB de antigénios de parasitas completos é considerada um método

sensível quando o título de anticorpos presente é baixo (Riera et al., 2004) e provou ter

elevada especificidade no diagnóstico de leishmaniose visceral canina (Carrera et al.,

1996; Gomes et al., 2008).

Talmi-Frank et al. (2006) desenvolveu um WB quantitativo computadorizado para

análise da resposta de anticorpos durante uma infecção experimental canina com L.

infantum. Distinguiu-se o aumento da intensidade e frequência das bandas

imunodominantes (12,14, 24, 29, 48 e 68 kDa) de anticorpos de cães infectados (Gomes

et al., 2008). A reactividade com 14, 48, 68 kDa foi associada a infecção recente

enquanto que 14, 24 e 29 kDa foi associado com persistência do parasita após


34

tratamento com alopurinol e possivelmente pior prognóstico (Gomes et al., 2008; Maia

and Campino, 2008; Talmi-Frank et al., 2006).

- Citometria de fluxo (FC)

A citometria de fluxo (FC) é uma técnica de contagem, observação e classificação

de partículas microscópicas suspensas numa corrente de fluído. Permite uma análise

multiparamétrica simultânea das características físicas e químicas de células individuais

que circulam através de um aparelho de detecção óptico e/ou electrónico. Esta técnica

tem-se tornado uma ferramenta importantíssima tanto na saúde pública como em

laboratórios de investigação, uma vez que é um método rápido, exacto e reprodutível,

tem a capacidade de analisar milhares de partículas por segundo e separar e isolar

activamente partículas com propriedades específicas (Maia and Campino, 2008).

Andrade et al. (2007) avaliou o desempenho de uma metodologia baseada em FC

para detectar promastigotas L. chagasi fixados com anticorpos (FC-AFPA-IgG, FC-AFPA-

IgG1 e FC-AFPA-IgG2) em amostras de soros de cães infectados com L. chagasi e de

cães vacinados contra a leishmaniose canina. Os autores concluíram que o uso de FC-

AFPA-IgG e IgG2 é uma ferramenta útil na discriminação de cães infectados de cães

não-infectados e vacinados, com uma especificidade de 100% tanto para IgG como IgG2

e 97% e 93% de sensibilidade, respectivamente (de Andrade et al., 2007; Maia and

Campino, 2008).

Em geral a técnica por citometria de fluxo quantifica os anticorpos contra

antigénios de superfície da Leishmania, ajudando a conter a potencial reactividade

cruzada contra estruturas intracelulares mais conservadas. A maioria das investigações

usa como alvos promastigotas vivos ou fixados para detectar anticorpos específicos.

Silvestre et al. (2008) propôs usar amastigotas vivos, a forma do parasita presente no

hospedeiro mamífero, como um melhor e mais conveniente alvo na detecção de IgG em

soros de cães. A análise comparativa do ensaio com amastigotas e promastigotas

mostrou um aumento da sensibilidade total no primeiro (96% versus 89%,

respectivamente) enquanto a especificidade se manteve a mesma (Silvestre et al., 2008).

Deste modo devem ser feitas mais investigações com o objectivo de melhorar a

especificidade do método, uma vez que mostrou reactividade cruzada em soros de cães

com outras patologias mesmo em animais de zonas não endémicas de Leishmania (Maia

and Campino, 2008).


35

1.2.3. Diagnóstico indirecto – imunidade celular

Os ensaios que avaliam a resposta imunológica celular à Leishmania em cães

estão menos padronizados que as técnicas serológicas e não são habitualmente usados

no diagnóstico. Apesar da imunidade celular específica poder ser detectada em cães com

ou sem anticorpos específicos, uma resposta celular positiva deve ser a base para uma

protecção contra o desenvolvimento da doença (Maia and Campino, 2008). De acordo

com Fernández-Bellón et al. (2005) a determinação exacta desta resposta é um indicador

crucial de fenótipo Th1 associado a um controlo efectivo da infecção por parte do

hospedeiro e como resultado a sobrevivência (Fernandez-Bellon et al., 2005). Um teste

prático e padronizado de avaliação da resposta imune celular poderá, certamente, ser

aplicado na clínica tanto para monitorizar a evolução da leishmaniose e a resposta ao

tratamento, como ajudar a estabelecer o prognóstico (Maia and Campino, 2008).

- Teste de Montenegro

O teste de Montenegro ou teste de pele da Leishmania (LST – Leishmanin Skin

Test), que indica um tipo de hipersensibilidade retardada ao antigénio Leishmania,

consiste numa inoculação intradérmica de uma suspensão de promastigotas inactivos

(3×106-8/ml) diluída numa solução salina de fenol ou metiolato. Como controlo é injectado

o diluente leishmanin noutro local da pele. Depois de 48 ou 72h uma leitura positiva

traduz-se por um endurecimento de cerca de 5 mm de diâmetro (Cardoso et al., 1998;

Fernandez-Bellon et al., 2005; Montenegro, 1926; Pinelli et al., 1994; Solano-Gallego et

al., 2001). Em geral, durante a doença activa o LST é negativo, no entanto é positivo

durante a infecção sub-clínica (auto-curável), uma infecção recente ou depois de

tratamento eficaz. Rodríguez-Cortés et al. (2007b) detectou uma correlação significativa

entre reacção LST e o estadio clínico de cães infectados experimentalmente (Maia and

Campino, 2008; Rodriguez-Cortes et al., 2007b).

A LST é um teste simples e económico, o que o torna apropriado para o uso em

trabalho de campo envolvendo um largo número de animais (Cardoso et al., 1998;

Cardoso et al., 2007; Fernandez-Bellon et al., 2005). No entanto, a necessidade da

vigilância após 48-72h e a indução iatrogénica de falsos positivos após repetição do teste

limitam a sua utilização (Fernandez-Bellon et al., 2005; Maia and Campino, 2008).


36

- Ensaio de proliferação de linfócitos (LPA)

Esta técnica consiste na separação das células mononucleares do sangue

periférico (PBMCs), que são posteriormente estimuladas com LSA e um mitogénio.

Células não estimuladas são também incubadas como controlos negativos. A proliferação

celular é normalmente expressa segundo um índice de estimulação (SI, células

estimuladas versus células não estimuladas). Valores de SI maiores que 2, 2,5 ou 3 são

considerados positivos. Quinnell et al. (2001) apenas consideram como positivos cães

com SI≥5 devido à baixa especificidade da resposta celular a antigénios Leishmania

(Quinnell et al., 2001a). Cães assintomáticos ou resistentes apresentam uma resposta

proliferativa forte enquanto que cães susceptíveis falham na resposta a LSA in vitro

(Abranches et al., 1991; Pinelli et al., 1994; Quinnell et al., 2001a). Geralmente, em cães

com doença óbvia não se faz a proliferação mitogénica de PBMC (Abranches et al., 1991;

Pinelli et al., 1994; Rhalem et al., 1999; Strauss-Ayali et al., 2005). Em cães clinicamente

curados foi observada a restituição da linfoproliferação depois de quimioterapia com

antimónios (Bourdoiseau et al., 1997), antimónios e alopurinol (Fernandez-Perez et al.,

2003), pentamidina (Rhalem et al., 1999) ou anfotericina B (Moreno et al., 1999). Apesar

de ter ocorrido uma resposta linfoproliferativa específica em cães experimentalmente e

naturalmente infectados, tanto sintomáticos como assintomáticos, com ou sem

tratamento, esta resposta parece ser intimamente dependente tanto da severidade da

doença como do fundo genético e imunológico do hospedeiro (Maia and Campino, 2008).

- Bioensaio de inibição do efeito citostático do interferão-γ (IFNB)

Este bioensaio detecta o IFN-γ produzido pelos linfócitos circulantes em

sobrenadantes de culturas. Os PBMCs são incubados com ou sem LSA durante 72h. O

sobrenadante é removido e incubado em células renais de cães Madin-Darby durante

16h. Depois deste período, o sobrenadante é descartado e as células são infectadas com

vírus de estomatite vesicular e incubadas 24h. De acordo com Fernández-Bellón et al.

(2005) este ensaio, que quantifica as citoquinas que contribuem na sua maioria para a

resposta celular imunológica, deve ser o método de escolha para avaliar o tipo de

resposta celular em cães (Fernandez-Bellon et al., 2005; Maia and Campino, 2008).

Num estudo realizado por esses mesmos autores IFNB e LST mostraram ser os

ensaios mais sensíveis de avaliação da imunidade celular específica da infecção canina

por Leishmania. Para além disso, Rodríguez-Cortés et al. (2007a) defenderam o uso

destas duas técnicas em conjunto com LPA de modo a se obter uma perspectiva


37

apropriada dos acontecimentos imunológicos que modulam a resposta imunitária celular

contra a Leishmania (Maia and Campino, 2008; Rodriguez-Cortes et al., 2007a).

As principais desvantagens do método são o facto de ser trabalhoso e utilizar um

vírus que está incluído na lista A da World Organization of Animal Health (Maia and

Campino, 2008).

Tabela 2 – Comparação dos métodos laboratoriais de diagnóstico da infecção canina por Leishmania,

adaptado de Miro et al., 2008

Vantagens Desvantagens Recomendações Exame microscópico Coloração de amostras de tecido por citologia (gânglios linfáticos, medula óssea, baço e pele)

Definitivo Moroso, dependente da experiência do examinador, baixa sensibilidade em cães assintomáticos

Para o diagnóstico de suspeita de doença sintomática

Imunohistoquímica de amostras de tecido histopatológico

Sensível em doença sintomática

Difícil disponibilidade Para o diagnóstico quando a lesão compatível com histopatologia

Cultura de parasitas a partir de tecidos

Específica Não aplicável a diagnóstico rápido

Para investigação e determinação de espécie

PCR convencional Alvos:

ITS1 (DNA genómico) Sensível nos aspirados de baço e gânglios linfáticos; permite identificação de espécie com RFLP subsequente

Baixa sensibilidade com sangue

Para o diagnóstico quando determinação da espécie de Leishmania em causa é importante

kDNA Sensível com gânglios linfáticos, medula óssea e baço

Não específica para L. infantum

Aplicável no diagnóstico de rotina

PCR quantitativo em tempo real (kDNA)

Maior sensibilidade; útil na detecção com sangue; permite quantificação dos parasitas

Difícil disponibilidade; não específico para L. infantum

Para o diagnóstico em sangue ou outros tecidos; útil para follow-up de resposta a tratamento

Serologia qualitativa Dispositivos imunocromatográficos

Diagnóstico rápido no local Baixa sensibilidade em infecções assintomáticas; não quantitativo

Baixo valor preditivo negativo

Serologia quantitativa IFAT Sensível na doença

sintomática Baixa sensibilidade na doença assintomática, podem ocorrer reacções cruzadas com infecção por Trypanosoma cruzi

Mais útil no diagnóstico de doença suspeita sintomática ou em cães assintomáticos que progridem para doença

ELISA com extracto solúvel de promastigotas

Sensível na doença sintomática

Baixa sensibilidade na doença assintomática

Mais útil no diagnóstico de doença suspeita sintomática

Polipéptidos recombinantes

Específico Sensibilidade variável em cães assintomáticos, dependendo do antigénio

Útil no diagnóstico de doença suspeita sintomática e para diminuir o efeito de reaçcão cruzada com T. cruzi

DAT Bom grau de sensibilidade Resultados em 18h Útil para estudos epidemiológicos

* Abrev.: DAT: teste de aglutinação directo; ELISA: imunoensaio ligado a enzima; IFAT: teste de imunofluorescência indirecto; IST1: internal transcribed spacer 1; kDNA: DNA do cinetoplasto, RFLP: restriction fragment lenght polymorphism


38

1.3. Tratamento e prevenção da leishmaniose

Actualmente o tratamento de leishmaniose visceral constitui um desafio exigente.

As dificuldades que surgiram mais recentemente são a co-infecção com HIV e a

resistência aos antimónios pentavalentes. Estas duas questões juntam-se a uma série de

obstáculos que têm dificultado o controlo da doença, como o controlo inadequado do

vector, a pobreza e má-nutrição, a migração de refugiados não protegidos, a limitação de

ferramentas de diagnóstico e a indisponibilidade e dificuldade de acesso a fármacos para

tratamento. A questão do tratamento de leishmaniose visceral nos países em

desenvolvimento deixou de estar limitada ao paciente individual e passou a ser um

problema de saúde pública, considerando o facto de uma terapêutica ineficaz e

inadequada estar relacionada com o aparecimento de resistências secundárias

(Rosenthal and Marty, 2003).

Vários fármacos usados no tratamento da leishmaniose canina são capazes de

melhorar temporariamente os sinais clínicos ou curar clinicamente, no entanto nenhum

elimina fiavelmente a doença (Miro et al., 2008; Noli and Auxilia, 2005). Após a

suspensão da terapêutica, e na ausência de resposta imunitária eficaz, os parasitas

voltam a expandir-se, aumentando de novo o risco de transmissão aos flebotomíneos.

(Alvar et al., 1994). Deste modo, uma vez que os cães tratados continuam a albergar a

doença, são infecciosos para o vector (Guarga et al., 2002; Ikeda-Garcia et al., 2007;

Koutinas et al., 2001; Manna et al., 2008; Miro et al., 2008) e consequentemente para o

homem.

Os fármacos mais utilizados no tratamento da leishmaniose canina são o

antimoniato de meglumina e o alopurinol (Miro et al., 2008).

Os sais orgânicos de antimónio pentavalentes são usados na terapêutica há mais

de 60 anos (Herwaldt and Berman, 1992; Rosenthal and Marty, 2003). Estes fármacos

inibem selectivamente a glicólise e a oxidação de ácidos gordos da Leishmania (Miro et

al., 2008). Entre as desvantagens estão o modo de administração parenteral, a longa

duração da terapêutica e as reacções adversas.

O alopurinol é usado frequentemente em combinação com antimónios

pentavalentes. O seu mecanismo de acção consiste na inibição da tradução proteica por

interferência com a síntese de RNA. Estudos realizados para cada um destes dois

fármacos, sozinhos ou em combinação, demonstraram que a maior parte dos animais

cura clinicamente, no entanto permanecem reservatórios do parasita e estão sujeitos a

recaídas (Guarga et al., 2002; Ikeda-Garcia et al., 2007; Koutinas et al., 2001; Manna et

al., 2008; Miro et al., 2008).


39

O agente anti-fúngico anfotericina B é reconhecido largamente como potente

fármaco leishmanicida (Rosenthal and Marty, 2003). Actua através da ligação ao

ergosterol da membrana celular do parasita, alterando a sua permeabilidade. No entanto,

é nefrotóxica podendo pôr em perigo cães com leishmaniose canina que já tenham

patologia renal pré-existente (Miro et al., 2008). As formulações lipídicas que têm sido

desenvolvidas aumentam a eficácia e limitam a toxicidade da anfotericina B convencional

(Davidson et al., 1996; Dietze et al., 1995; Rosenthal and Marty, 2003; Sundar and

Murray, 1996). Estes três fármacos são usados na primeira linha do tratamento da

leishmaniose canina (Miro et al., 2008).

Outros fármacos que têm eficácia contra a leishmaniose canina incluem terapia

combinada de pentamidina, miltefosina, aminosidina, cetoconazol, metronidazol com

espiramicina, e metronidazol com enrofloxacina (Bianciardi et al., 2004; Miro et al., 2008;

Noli and Auxilia, 2005; Pennisi et al., 2005a). Estes são actualmente considerados de

segunda linha, no entanto são necessários mais estudos que verifiquem a sua eficácia

terapêutica (Miro et al., 2008).

O interferão gama (IFN-γ) mostrou ser um potente activador de macrófagos com

actividade sinergística com antimónios em ratinhos (Murray et al., 1991). No entanto, este

activador tem eficácia limitada quanto usado sozinho no tratamento de leishmaniose

visceral humana (Sundar and Murray, 1995). O seu custo elevado e o aparecimento de

outros fármacos como as formulações lipídicas de anfotericina B têm limitado a sua

utilização (Rosenthal and Marty, 2003).

A vacinação efectiva de cães contra a leishmaniose pode prevenir a doença e

constitui a melhor estratégia para a diminuição da infecção no Homem. Depois de

décadas de tentativas de produção de uma vacina segura e eficaz foram produzidas

novas vacinas que estão actualmente em testes clínicos. O adjuvante adicionado à

vacina da Leishmania tem o papel mais importante na resposta ao antigénio do que o seu

reconhecimento pelo sistema imunitário (Miro et al., 2008).

Foram avaliadas quatro classes de candidatos a vacinas de Leishmania:

Leishmania inactivada (Giunchetti et al., 2008; Lasri et al., 1999; Mayrink et al., 1996;

Mohebali et al., 2004a), fracções de Leishmania purificada (Borja-Cabrera et al., 2002;

Dantas-Torres, 2006; Lemesre et al., 2005), antigénios recombinantes (Gradoni et al.,

2005) e vacinas DNA (Miro et al., 2008; Rafati et al., 2005; Ramiro et al., 2003;

Rodriguez-Cortes et al., 2007c).

Um controlo eficaz do vector pode reduzir ou mesmo prevenir a transmissão do

parasita Leishmania pelo flebotomíneo, evitando deste modo a quimioterapia ou a

vacinação. Algumas campanhas utilizando sprays insecticidas foram implementadas


40

recentemente e podem reduzir as populações de flebotomíneos. Devido à maior

actividade nocturna das picadas das fêmeas a utilização de redes tratadas com

insecticida representa uma alternativa adequada e económica na redução da transmissão

de Leishmania dentro de locais fechados. Os repelentes químicos e a utilização de roupa

protectora são a única forma de protecção no exterior (Zimmermann et al., 2009).


41

2. Material e métodos 2.1. Caracterização das amostras da população de canídeos

Neste estudo foi utilizado um painel de 46 amostras de soros de cães domésticos

naturalmente infectados, provenientes do nordeste de Portugal, onde a leishmaniose

canina visceral é endémica.

Tabela 3 – Identificação das amostras em estudo

283 Fusco I – K125 281 Flint I – K119 246 Fusco II – K126 260 Flint II – K120 219 Fusco III – K127 286 Flint III – K121 225 Fusco IV – K128 287 Flint IV – K122 218 Fusco V – K129 224 Flint V – K123 217 Fusco VI – K130 130 Flint VI – K124 216 Fusco VII – K218 223 Flint VII 215 Fusco VIII 222 Flint VIII 214 Fusco IX 221 Flint IX 213 Fusco X 220 Flint X 212 Fusco XI 211 Fusco XII 282 Fusco XIII 466 Bandeirinha I 447 Volga I – K178 465 Bandeirinha II 170 Volga II – K179 464 Bandeirinha III 237 Volga III – K180 463 Bandeirinha IV 446 Volga IV – K181 462 Bandeirinha V 452 Volga V – K217 461 Bandeirinha VI 445 Volga VI 460 Bandeirinha VII 444 Volga VII 174 Scubidu I – K40 118 Preto I – K146 291 Scubidu II – K219 285 Preto II – K147 132 Scubidu III – K220 288 Preto III – K148 284 Scubidu IV 290 Preto IV – K149 289 Scubidu V

2.2. Antigénios usados na técnica de ELISA

As fracções solúveis obtidas de promastigotas e amastigotas de L.infantum

(espécie Mon-1) foram obtidas como previamente descrito, com pequenas modificações

(Cordeiro-da-Silva et al., 2003). Resumidamente, os parasitas foram lavados três vezes

em solução tampão fosfato (PBS) a pH 7.2 (3000g,10min,4ºC). Posteriormente, o

sedimento foi ressuspendido em 1 mL de PBS e a mistura foi submetida a 10 ciclos de

congelamento (-80ºC) e descongelamento em banho de água (37ºC) para completa

ruptura dos parasitas. A mistura foi centrifugada a 13000 g durante 30 min a 4ºC, o

sobrenadante foi retirado e o sedimento utilizado como extracto de parasita, aliquotado e


42

armazenado a -20ºC. As proteínas recombinantes utilizadas, CPX2 e MTPX, foram

obtidas a partir de cultura de E.coli BL21 recombinante e purificadas por cromatografia de

afinidade numa coluna Ni-NTA (Qiagen®).

O conteúdo proteico de cada preparação de extractos e proteínas recombinantes

foi determinado pelo método de Lowry modificado (BIORAD®) e cada mistura foi

separada por electroforese em gel de SDS-PAGE.

Prom. Amast. PM MTPX CPX2

Figura 8 – Separação electroforéctica dos antigénios utilizados na ténica de ELISA.

(Prom.:promastigotas; Amast.:amastigotas; PM: peso molecular)

2.3. Ensaio de ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay)

O ensaio de ELISA foi realizado adaptando o protocolo descrito em Cordeiro-da-

Silva et al (2003). Resumidamente, placas de Greiner High Binding de 96 poços foram

revestidas com 50 µL de tampão de revestimento (tampão carbonato/bicarbonato 0.05M,

pH 9.6) com 10 µg/mL dos antigénios solúveis de promastigota ou amastigota de

Leishmania ou 5 µg/mL de cada proteína, CPX2 ou MTPX. As placas foram incubadas

durante a noite a 4ºC. O conteúdo foi descartado e as placas foram bloqueadas com 200

µL de solução 3% leite em PBS durante 30 min a 37ºC. De seguida as placas foram

lavadas com PBS-Tween 0.05% (PBS-T) e adicionado, em duplicado, 100 µL do soro da

amostra diluído em PBS-T, assim como 100 µL de PBS-T em triplicado, que funcionaram

como brancos. As placas foram incubadas 30 min a 37ºC. Depois de lavadas com PBS-T

foram incubadas com 100 µL de anticorpo secundário diluído 1/5000, durante 30 min.

Depois da incubação, as placas foram lavadas e incubadas com dihidricloreto de o-

fenilenediamina (OPD, Sigma) durante 10 min. A reacção foi parada com 50 µL de HCl

3M e os valores de absorvância lidos a 492 nm, num leitor automático de ELISA (Power

Conc. extracto amastigotas = 0,37 mg/mL Conc. extracto promastigotas = 2,67 mg/mL Conc. CPX2 = 2,9 mg/mL Conc. MTPX2 = 1 mg/mL


43

Wase WS, Isaza). O anticorpo secundário utilizado foi anti-cão IgG conjugado com

peroxidase (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX).

2.4. Preparação dos parasitas para a técnica de citometria de fluxo

Leishmania infantum (Mon-1) foi usada em todos os ensaios. Os promastigotas de

L. infantum foram cultivados em meio RPMI 1640, com 10% de soro fetal (FBS), 1%

glutamina, 1% penicilina/estreptomicina e 2% tampão Hepes 1M, com inóculo inicial de

1×106 parasitas/mL, durante 5 dias a 27ºC.

Os amastigotas axénicos foram cultivados em meio MAA suplementado com 20%

FBS e 1% glutamina, com inóculo inicial de 1×105 parasitas/mL, durante 4 dias a 37ºC

numa atmosfera de 5% de CO2.

2.5. Citometria de fluxo

Foi adicionada a uma placa de 96 poços de fundo cónico uma quantidade de

1×106 parasitas por poço (promastigotas). Os parasitas foram centrifugados (3500 rpm,

10 min, 4ªC), e após descartar o sobrenadante, foi adicionado 50 µL de soro da amostra

diluído 1:50 em PBS contendo 2% de FCS e a placa incubada a 4ºC no escuro durante

30 min. A mistura foi lavada três vezes com PBS-FCS e o sobrenadante descartado.

Posteriormente foi adicionado 50 µL de anticorpo secundário IgG de cabra anti-cão

marcado com FITC (Bethyl Laboratories, Montgomery, TX) diluído 1:50 em PBS contendo

2% de FCS. Incubou-se a placa a 4ºC no escuro durante 30 min. Após incubação a

mistura foi lavada duas vezes com PBS com FBS 2% por centrifugação a 3500 rpm

durante 10 min a 4ºC. O sedimento foi ressuspenso em 400 µL de PBS com FBS a 2%.

As células foram analisadas no citometro de fluxo. Foram incluídos controlos internos da

reacção em todas as análises para monitorizar as ligações inespecíficas, nos quais os

parasitas foram incubados na ausência de soro de cão, mas na presença de anticorpo de

cabra anti-cão marcado com FITC.


44

3. Resultados e discussão

3.1. Descrição das amostras em estudo

Tabela 4 – Descrição das amostras em estudo

Num Nome Data Clínica Parasi-tologia DAT Observações*

K.125 Fusco (I) 02.07.99 Suspeito Positiva >102,400 K126 Fusco (II) 03.12.99 ND ND 51,200 K-127 Fusco (III) 11.04.00 ND ND 51,200 K-128 Fusco (IV) 03.10.00 ND ND 51,200 K-129 Fusco (V) 01.02.01 ND ND 25,600 K-130 Fusco (VI) 02.07.01 ND ND 51,200 K-218 Fusco (VII) 03.09.02 ND ND 25,600

Fusco (VIII) 11.04.03 ND ND ND Fusco (IX) 26.06.03 ND ND ND Fusco (X) 03.10.03 ND ND ND Fusco (XI) 06.02.04 ND ND ND Fusco (XII) 17.12.04 ND ND ND Fusco (XIII) 14.03.05 ND ND ND

K-40 Scubidu (I) 23.04.01 Sintom. Positivo >102,400

K-219 Scubidu (II) 04.09.02 Assint. ND 51,200 K-220 Scubidu (III) 02.10.02 Assint. Positivo 25,600 K-221 Scubidu (IV) 20.03.03 ND ND ND K-222 Scubidu (V) 08.03.04 ND ND ND

K-119 Flint (I) 13.10.00 Sintom. Negativo 51,200

K-120 Flint (II) 13.12.00 Sintom. Positivo >102,400 K-121 Flint (III) 17.01.01 ND ND 51,200 K-122 Flint (IV) 26.02.01 ND ND 25,600 K-123 Flint (V) 27.09.01 ND ND 6,400 K-124 Flint (VI) 30.01.02 Assint. ND 800

Flint (VII) 08.01.03 ND ND ND Flint (VIII) 13.03.03 ND ND ND Flint (IX) 12.12.03 ND ND ND Flint (X) 06.12.04 ND ND ND

K-178 Volga (I) 23.08.96 ND ND 25,600

K-179 Volga (II) 30.06.00 Sintom. Positivo >102,400 K-180 Volga (III) 25.09.00 ND ND 51,200 K-181 Volga (IV) 23.07.01 ND ND >102,400 K-217 Volga (V) 03.05.02 ND ND 51,200

Volga (VI) 27.01.03 ND ND ND Volga (VII) 16.09.03 ND ND ND

K-146 Preto (I) 24.11.99 Sintom. Positivo >102,400

Recebeu tratamento com Glucantime e Zyloric durante 3 meses.Foi mantido

o tratamento com Zyloric

K-147 Preto (II) 21.12.99 ND ND >102,400 K-148 Preto (III) 19.01.00 ND ND >102,400 K-149 Preto (IV) 23.03.00 ND ND 51,200

IFAT (cutoff 80) Bandeirinha (I) 26.01.94 ND ND 320 Bandeirinha I clinicamente suspeito,

iniciou tratamento com Glucantime e Zyloric durante 30 dias. Bandeirinha II reiniciou mesmo tratatamento. Bandeirinha IV suspendeu tratamento com Zyloric, uma vez que se apresentava assintomático. Bandeirinha VI foi detectada resposta celular com teste intradérmica positivo

Bandeirinha (II) 22.02.95 ND ND 160?? Bandeirinha (III) 06.05.95 ND ND 160 Bandeirinha (IV) 10.10.95 ND ND 160 Bandeirinha (V) 12.01.96 ND ND 40 Bandeirinha (VI) 30.04.96 ND ND 40 Bandeirinha (VII) 24.07.96 ND ND 40

*Todos os canídeos receberam tratamento durante 30 dias com antimoniato de meglumina (Glutantime 100mg/kg, q24h, SC) e no mínimo 6 meses de alopurinol (Zyloric 10-15 mg/kg, q12 h, PO). (ND: informação não disponível)


45

3.2. Determinação da resposta humoral dirigida aos antigénios totais do

parasita (ELISA) Tabela 5 – Resultados obtidos pela técnica de ELISA utilizando os antigénios promastigota e amastigota

Elisa

Promastigota (Densidade óptica)

Elisa Amastigota

(Densidade óptica)

Elisa Promastigota (Densidade óptica)

Elisa Amastigota

(Densidade óptica)

283 – Fusco I 0,747±0,099 0,383±0,172 281 – Flint I 2,660±0,255 4,950±0,424 246 – Fusco II 0,254±0,001 0,358±0,011 260 – Flint II 0,373±0,005 1,410±0,057 219 – Fusco III 0,067±0,008 0,103±0,021 286 – Flint III 0,743±0,052 2,365±0,007 225 – Fusco IV 0,341±0,029 0,354±0,023 287 – Flint IV 0,529±0,029 1,405±0,191 218 – Fusco V 0,549±0,036 0,473±0,016 224 – Flint V 0,423±0,011 0,747±0,006 217 – Fusco VI 0,166±0,013 0,230±0,018 130 – Flint VI 0,440±0,001 0,822±0,0024 216 – Fusco VII 0,788±0,037 0,584±0,036 223 – Flint VII 0,171±0,028 0,256±0,001 215 – Fusco VIII 0,292±0,055 0,372±0,016 222 – Flint VIII 0,192±0,002 0,298±0,001 214 – Fusco IX 0,115±0,012 0,263±0,017 221 – Flint IX 0,141±0,018 0,215±0,013 213 – Fusco X 0,365±0,020 0,783±0,000 220 – Flint X 0,071±0,004 0,121±0,016 212 – Fusco XI 0,050±0,010 0,072±0,002 447 – Volga I 0,529±0,006 2,792±0,014 211 – Fusco XII 0,059±0,005 0,111±0,002 170 – Volga II 0,719±0,122 4,225±0,177 282 – Fusco XIII 0,154±0,007 0,352±0,019 237 – Volga III 0,758±0,017 2,435±0,040 466 – Bandeirinha I 0,915±0,014 1,470±0,156 446 – Volga IV 0,763±0,278 2,790±0,127 465 – Bandeirinha II 0,858±0,021 0,991±0,044 452 – Volga V 0,559±0,000 1,430±0,071 464 – Bandeirinha III 0,854±0,001 0,909±0,011 445 – Volga VI 0,200±0,028 1,295±0,092 463 – Bandeirinha IV 0,405±0,017 0,562±0,017 444 – Volga VII 1,944±0,106 2,327±0,045 462 – Bandeirinha V 0,121±0,011 0,182±0,001 118 – Preto I 1,810±0,085 3,043±0,0509 461 – Bandeirinha VI 0,495±0,035 0,700±0,057 285 – Preto II 2,405±0,035 4,135±0,120 460 – Bandeirinha VII 0,959±0,093 1,020±0,030 288 – Preto III 2,400±0,071 3,940±0,198 174 – Scubidu I 0,475±0,021 2,001±0,037 290 - Preto IV 0,392±0,061 0,950±0,014 291 – Scubidu II 0,654±0,016 1,705±0,009 132 – Scubidu III 0,247±0,008 1,084±0,027 284 – Scubidu IV 0,091±0,004 0,277±0,027 289 – Scubidu V 0,495±0,044 2,319±0,085

As amostras foram diluídas 1/1500, 1/3000, 1/6000, 1/10000, 1/15000, 1/100000 e 1/150000 em PBS-T 0.05%. Desvios padrões obtidos <20%

3.3. Determinação da resposta humoral dirigida aos antigénios CPX2 e MTPX

(ELISA) Tabela 6 – Resultados obtidos pela técnica de ELISA usando como antigénios CPX2 e MTPX

Elisa-CPX2 (Densidade óptica)

Elisa-MTPX (Densidade óptica)

Elisa-CPX2 (Densidade óptica)

Elisa-MTPX (Densidade óptica)

283 – Fusco I 5,911±0,155 0,267±0,022 281 – Flint I 4,010±0,009 0,441±0,046 246 – Fusco II 0,445±0,134 0,105±0,008 260 – Flint II 0,985±0,007 0,149±0,003 219 – Fusco III 0,705±0,007 0,147±0,017 286 – Flint III 1,075±0,035 0,281±0,042 225 – Fusco IV 3,063±0,130 0,141±0,001 287 – Flint IV 0,779±0,019 0,157±0,003 218 – Fusco V 0,530±0,099 0,178±0,026 224 – Flint V 0,505±0,051 0,093±0,008 217 – Fusco VI 1,679±0,017 0,131±0,018 130 – Flint VI 0,466±0,022 0,092±0,002 216 – Fusco VII 0,834±0,105 0,198±0,021 223 – Flint VII 0,087±0,059 0,076±0,025 215 – Fusco VIII 0,624±0,030 0,133±0,008 222 – Flint VIII 0,123±0,002 0,087±0,004 214 – Fusco IX 1,596±0,013 0,087±0,006 221 – Flint IX 0,083±0,016 0,030±0,004 213 – Fusco X 1,951±0,023 0,235±0,006 220 – Flint X 0,036±0,001 0,065±0,009 212 – Fusco XI 0,506±0,004 0,027±0,004 447 – Volga I 1,585±0,016 0,181±0,006 211 – Fusco XII 0,563±0,124 0,058±0,011 170 – Volga II 1,510±0,057 0,585±0,055 282 – Fusco XIII 0,987±0,237 0,109±0,028 237 – Volga III 1,511±0,057 0,202±0,021 466 – Bandeirinha I 2,269±0,025 0,196±0,026 446 – Volga IV 3,567±0,006 0,380±0,006 465 – Bandeirinha II 1,399±0,057 0,164±0,008 452 – Volga V 2,151±0,074 0,200±0,018 464 – Bandeirinha III 0,974±0,177 0,235±0,019 445 – Volga VI 2,031±0,130 0,194±0,006 463 – Bandeirinha IV 0,342±0,014 0,150±0,003 444 – Volga VII 0,711±0,049 0,124±0,006 462 – Bandeirinha V 0,208±0,004 0,136±0,008 118 – Preto I 3,955±0,148 0,088±0,001 461 – Bandeirinha VI 0,460±0,041 0,355±0,001 285 – Preto II 4,320±0,792 0,346±0,016 460 – Bandeirinha VII 0,793±0,281 0,220±0,024 288 – Preto III 3,125±0,049 0,447±0,023 174 – Scubidu I 0,090±0,012 0,299±0,001 290 - Preto IV 0,464±0,141 0,292±0,006 291 – Scubidu II 0,070±0,013 0,453±0,012 132 – Scubidu III 0,062±0,019 0,187±0,011 284 – Scubidu IV 0,055±0,023 0,179±0,021 289 – Scubidu V 0,137±0,026 0,259±0,007

As amostras foram diluídas 1/1500, 1/3000, 1/6000, 1/10000, 1/15000, 1/100000 e 1/150000 em PBS-T 0.05%. Desvios padrões obtidos <20%


46

3.4. Estudo da reactividade das amostras ao longo do tempo (ELISA)


47

Figura 9 – Representação gráfica dos resultados das amostras dos seis canídeos ao longo do tempo, pela técnica de ELISA com utilização dos antigénios: promastigotas (ELISA Pro), amastigotas (ELISA Ama), CPX2

(ELISA-CPX2) e MTPX (ELISA-MTPX). Desvios padrões obtidos <20%.


48

3.5. Reconhecimento dos antigénios de superfície do parasita (forma

promastigota) pelas diferentes amostras ao longo do tempo (citometria de

fluxo)


49

Figura 10 – Representação gráfica dos resultados das amostras ao longo do tempo do reconhecimento dos

antigénios de superfície de promastigotas, efectuado por citometria de fluxo. Desvios padrões obtidos <20%.


50

3.6. Interpretação dos resultados

Uma das principais limitações da utilização do extracto do parasita como antigénio

na técnica de ELISA, tanto na forma amastigota como na forma promastigota, é a

ocorrência de falsos positivos devido a reacções cruzadas com outras doenças presentes

nas áreas endémicas de leishmaniose visceral. O aparecimento da engenharia genética

permitiu a expressão e purificação de proteínas recombinantes que têm sido utilizadas

como antigénios alvo nos ensaios de serodiagnóstico (Gomes et al., 2008). O diagnóstico

precoce e exacto da leishmaniose canina tem extrema importância na tentativa de limitar

a propagação da doença, uma vez que cães assintomáticos infectados com Leishmania

são também responsáveis pela propagação da mesma.

No presente estudo avaliou-se o potencial diagnóstico da técnica serológica de

ELISA usando a proteína recombinante CPX2 como antigénio alvo, em canídeos

naturalmente infectados com L. infantum, assim como o comportamento da proteína

CPX2 na determinação do sucesso do tratamento da leishmaniose canina.

Cinco dos canídeos (Fusco, Scubidu, Flint, Volga e Preto) foram confirmados

como infectados com leishmaniose pelo método parasitológico directo e foi avaliado o

reconhecimento dos antigénios de promastigotas por citometria de fluxo de todas as

amostras obtidas ao longo do tempo. As amostras I coincidem maioritariamente com o

diagnóstico parasitológico ou serológico da infecção. As restantes amostras (II, III, IV, V,

VI, VII, VIII, IX, X, XI, XII, XIII, quando aplicável) correspondem a diferentes pontos de

recolha de soros após o tratamento.

Os resultados obtidos por ELISA-CPX2 foram comparados com os obtidos pelo

mesmo método com os antigénios de promastigotas, amastigotas e a proteína

recombinante MTPX, assim como com os resultados obtidos por DAT/IFAT, em algumas

das amostras.

Em relação ao primeiro canídeo, o Fusco, observou-se uma relação estreita entre

o anticorpo anti-CPX2 e os resultados obtidos por DAT na quase totalidade das amostras,

relação esta mais evidente na comparação com ELISA-amastigotas ou promastigota. O

ponto I (Fusco I) coincidiu com o diagnóstico parasitológico e com o início do tratamento

com derivados antimónio e alopurinol, verificando-se uma descida de anticorpos até à

amostra II (Fusco II), em que o animal se encontra apenas com administração de

alopurinol. De notar ainda o pico ascendente de anticorpos na amostra IV (Fusco IV)

quando o cão não se encontra sob nenhum tratamento. Posteriormente verificou-se uma

estabilização dos anticorpos, possivelmente relacionada com uma imunidade adquirida.

Em relação à proteína MTPX observou-se que não é imunogénica.


51

Os resultados de densidade óptica obtidos na ELISA-CPX2 com o canídeo

Bandeirinha são, do mesmo modo, concordantes com os resultados obtidos pela mesma

técnica com antigénios de amastigota ou promastigota, havendo no entanto uma

diferença mais marcada entre a fase pré e pós tratamento. Entre a primeira amostra

(Bandeirinha I) e a segunda amostra (Bandeirinha II) decorreu cerca de um ano em que

foi administrado uma combinação de antimoniato de meglumina e alopurinol durante

trinta dias e 6 meses de alopurinol. Observa-se uma diminuição de anticorpos e a

22.02.95 (Bandeirinha II) foi reiniciado o mesmo tratamento, uma vez que o título de

IFAT era superior a 80. A terapêutica foi suspensa na amostra IV (Bandeirinha IV), visto

que o animal se apresentava assintomático. Verificou-se uma diminuição de anticorpos

ao longo do tratamento efectuado, havendo no entanto uma subida final que se reflecte

nos pontos VI e VII, com teste intradérmico positivo no Bandeirinha VI, indicando

possivelmente uma resistência à doença. A MTPX mostra-se novamente pouco

imunogénica. A avaliação da resposta a antigénios de superfície efectuada por citometria

de fluxo com promastigotas acompanhou o perfil de resposta humoral obtido na ELISA-

promastigotas, exceptuando a amostra VI.

Relativamente ao Scubidu verificou-se um comportamento atípico na resposta

imunogénica à CPX2, tendo sido obtida melhor resposta na ELISA-amastigota. Este

canídeo nunca recuperou clinicamente por completo da doença. Apresentou-se

assintomático em termos de sinais externos cutâneos na amostra III (Scubidu III),

estando no entanto positivo parasitologicamente, o que indica que não se encontrava

curado.

No Flint observou-se uma diminuição de anticorpos com a administração de

antimoniato de meglumina em combinação com alopurinol, diminuição esta que continuou

com a terapêutica com alopurinol. Na amostra V (Flint V) o animal já se encontrava sem

tratamento e verificou-se, a partir deste ponto, uma tendência de estabilização dos

anticorpos. A resposta imunológica ao extracto de amastigotas foi mais intensa quando

comparada com a resposta à CPX2. Por outro lado, a resposta dos anticorpos aos

antigénios de superfície, avaliada por citometria de fluxo com promastigotas, permanece

elevada e mantém-se estável ao longo do tempo, até à amostra VII (Flint VII), ao

contrário da resposta ao extracto de promastigotas pela técnica de ELISA, em que há

uma diminuição brusca logo na amostra II (Flint II).

Relativamente ao canídeo Volga a primeira amostra (Volga I) foi obtida com um

grande intervalo de tempo da amostra seguinte (Volga II), pelo que não foi considerada

na interpretação dos resultados. As restantes amostras foram também colhidas com

intervalos de cerca de oito meses. O animal apresentava-se sintomático e com teste


52

parasitológico positivo na amostra II (Volga II). Verificou-se uma descida inicial de

anticorpos, tanto anti-CPX2 como extracto amastigota, corroborante com os valores

obtidos no DAT, numa fase em que o animal se encontra sob tratamento (Volga III).

Posteriormente observou-se uma subida de anticorpos (Volga IV), possivelmente

relacionada com a paragem do tratamento.

Em relação ao canídeo Preto, recebeu tratamento com antimoniato de meglumina

e alopurinol durante três meses, uma vez que mantinha lesões cutâneas ao final do

primeiro ciclo (1ºmês) e segundo ciclo (2ºmês) de antimoniato de meglumina. O título de

anticorpos manteve-se estável durante os primeiro dois meses (Preto I e II), ocorrendo

uma descida acentuada quando interrompeu o tratamento com antimoniato de

meglutamina. Foi observada uma melhoria significativa em termos clínicos, apesar de

ainda se verificarem manisfestações clínicas como alopecia, queratoconjuntivite e

emagrecimento, pelo que se manteve a administração de alopurinol.

Observou-se que a proteína recombinante CPX2 se mostrou mais imunogénica

quando comparada com ELISA-amastigotas e ELISA-promastigotas para a maioria das

amostras dos diferentes animais estudados, permitindo um maior diferencial nas

oscilações serológicas na relação tempo versus tratamento e na presença/ausência do

parasita. Apesar de ter sido observado um comportamento atípico num dos canídeos, o

Scubidu, em que o melhor marcador obtido foi ELISA-amastigotas, a presença de uma

elevada reactividade da IgG total contra a CPX2 pode ser tomado como um indicador de

que os anticorpos anti-CPX2 podem estar envolvidos nos processos patológicos que

levam à progressão da doença.

Deste modo é importante reforçar o facto de terem sido obtidos resultados

positivos com o marcador CPX2, não obstante o facto de ter sido observado um

comportamento atípico com pelo menos um canídeo, o que leva à necessidade de

investigação acrescida em relação a este marcador. No entanto, os resultados obtidos

mostraram que esta proteína recombinante, CPX2, tem um papel potencial no

diagnóstico serológico de leishmaniose canina visceral, principalmente como diferencial

entre tempo pré e pós-tratamento, e na monitorização e follow-up do mesmo.

Relativamente à avaliação da resposta ao tratamento por reconhecimento de

antigénios de superfície promastigotas por citometria de fluxo, a técnica não se mostrou

eficaz na avaliação do sucesso terapêutico uma vez que o título de anticorpos se

manteve estável na grande maioria dos canídeos. Seria interessante realizar a mesma

abordagem com as formas amastigotas do parasita.


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