UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS DE FARMACÊUTICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

OBTENÇÃO DE DERIVADOS DA PRIMINA: AVALIAÇÃO DO PERFIL DE ATIVIDADE BIOLÓGICA

Célio Ricardo Melo do Nascimento

Recife, 2004

Célio Ricardo Melo do Nascimento

OBTENÇÃO DE DERIVADOS DA PRIMINA: AVALIAÇÃO DO PERFIL DE ATIVIDADE BIOLÓGICA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas do Departamento de Ciências Farmacêuticas da Universidade Federal de Pernambuco, como parte dos requisitos à obtenção do título de Mestre em Ciências Farmacêuticas. Área de Concentração: Fármacos e Medicamentos. Departamento de Ciências Farmacêuticas (UFPE) Orientador: Prof. Dr. Dalci José Brondani Co-Orientador: Profa. Dra. Ana Cristina Lima Leite

1 ii

Recife

2004

Nascimento, Célio Ricardo Melo do

Obtenção de derivados da Primina : avaliaçãodo perfil de atividade biológica / Célio Ricardo Melo do Nascimento. – Recife : O Autor, 2004.

xiii, 221 : il., fig., tab. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de

Pernambuco. CCS. Ciências Farmacêuticas, 2004.

Inclui bibliografia e apêndice.

1. Ciências farmacêuticas – Fármacos e medicamentos. 2. Fármacos – Síntese e planejamento. 3. Quinonas – Síntese de derivados da Primina. 4. Primina – Atividade biológica. I.Título.

615.31 CDU(2ed.) UFPE

615.31 CDD (22.ed.) BC2004-580

2

UNIVERSIDADE FEDERAL DE PERNAMBUCO

REITOR Amaro Henrique Pessoa Lins VICE-REITOR Gilson Edmar Gonçalves e Silva PRÓ-REITORIA PARA ASSUNTOS DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO Celso Pinto de Melo DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE José Thadeu Pinheiro VICE-DIRETOR DO CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE Márcio Antônio de Andrade Coelho Gueiros CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Silvana Cabral Maggi VICE-CHEFE DO DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Antônio Rodolfo de Faria COORDENADOR DO CURSO DE MESTRADO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Miracy Muniz de Albuquerque VICE-COORDENADOR DO CURSO DE MESTRADO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS Pedro José Rolim Neto

3 iii

4

“Alguns homens têm aprendido que, ao lado de Deus, podemos andar além dos

nossos limites realizando os sonhos mais ousados...”

Autor desconhecido.

5 iv

Dedico este trabalho

In memoriam aos meus avós.

Aos meus pais pelo auxílio, compreensão e amor nas horas que precisei.

Ao meu irmão pelo amor, amizade e companheirismo.

A minha esposa, pelo auxílio, paciência, compreensão, amor, encorajamento e

apoio.

A minha filha, que veio encher de luz a minha vida.

6 v

AGRADECIMENTOS

A Deus, que permitiu a realização deste sonho.

Ao Prof. Dr. Dalci José Brondani, pela amizade, orientação científica,

incentivo e pela confiança depositada.

A Profa. Dra. Ana Cristina Lima Leite, pela amizade, pela orientação

científica, atenção, incentivo e apoio em todos os momentos.

A Profa. Dra. Ivone Antônia de Souza, pela realização dos ensaios

biológicos, colaboração científica, atenção e apoio.

A Profa. Dra. Janete Magali de Araújo, pela realização dos ensaios de

atividade antimicrobiana.

Aos Colegas do LabSinfa Maria Patrícia, Dayane e Flávio, pela amizade,

convivência e incentivo.

Aos alunos de Iniciação Científica Diogo, Carol, Renata e Marcos pela

contribuição na realização deste trabalho.

Aos colegas do curso de mestrado e em especial a Lívia, Janaína e Nádia,

companheiras de estudo.

Aos professores e funcionários do Departamento de Farmácia pela

dedicação, amizade e convívio. Em especial a Iguacy.

Aos meus pais, Seu Teodomiro e Dona Tereza, pelo exemplo de vida,

caráter, dedicação e amor em tudo que fazem e pelo incentivo e carinho.

Ao meu irmão Rogério, que nunca mediu esforços para me auxiliar em tudo

que precisei.

7 vi

Ao meu amor, minha esposa Rossana, pelo auxílio, apoio, compreensão,

carinho e sua preciosa colaboração que contribuiu para concretização deste

trabalho.

A todos que diretamente ou indiretamente contribuíram para a realização

deste trabalho.

8 vii

SUMÁRIO

Pág.

LISTA DE SIMBOLOGIA E ABREVIAÇÕES x

RESUMO xii

ABSTRACT xiii

Capitulo 1 - Introdução e Revisão da Literatura 15

1. INTRODUÇÃO 16

1.1 Produtos Naturais e a Descoberta de Novos Fármacos 16

1.2 Objetivos 25

1.2.1 Objetivo Geral 25

1.2.2 Objetivos Específicos 25

2. REVISÃO DA LITERATURA 27

2.1 Primina: Isolamento e Identificação 27

2.2 Síntese da Primina e seus Análogos 29

2.3 Relação Estrutura-Atividade Biológica 35

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 38

Capitulo 2 43

Artigo I – Synthesis, antitumour and Antiinflammatory activities of

a Primin Precursor 44

Capitulo 3 52

Artigo II – Síntese e Atividade Antitumoral de um Novo Pró-fármaco 53

9 viii

da Primina

Capitulo 4 70

Artigo III – Avaliação da Atividade Antimicrobiana de Derivados

Acetoxilados da Primina 71

Capitulo 5 - Conclusões e Perspectivas 87

CONCLUSÕES 88

PERSPECTIVAS 89

APÊNDICE 90

10ix

LISTA DE SIMBOLOGIA E ABREVIAÇÕES

HTS - High-Thoughput-Screening

PhRMA - Pharmaceutical Research and Manufactures of América

FDA - Food and Drug Administration

MHQ-THP - 2-methoxi-1,4-hidroquinona-bis-(2’ tetrahidropiranil) éter

P-MHQ-THP - 2-methoxi-6-pentil-1,4-hidroquinona-bis-(2’ tetrahidropiranil)

éter

DHP - Dihidropirano

1H-RMN - Espectrometria de Ressonância Magnética de Hidrogênio

1H-NRM - Magnetic Resonance of hydrogen Espectrometry

IVTF - Espectrometria de Infravermelho com Transformada de

Fourier

IRFT - Infrared Espectrometry with Fourier Transformed

UV - Espectro de Radiação Ultra Violeta

DMSO-d6 - Dimetilsulfóxido deuterado

TOSOH - Ácido-p-toluenosulfônico

S180 - Sarcoma 180

ES - Carcinoma de Erhrlich sólido

TMEDA - Tetrametil etileno diamida

i.p. - Via de administração intraperitonial

TMS - Tetrametilsilano

11x

CCD - Cromatografia em camada delgada

h - Horas

mim. - Minutos

ppm - Partes por milhão

Hz - Hertz

hex. - Hexano

act. - Acetato de etila

Ac2O - Anidrido acético

oC - Grau Celsius

OMe - Grupamento metoxila

Rf - Referência de fase

p.f. - Ponto de Fusão

n-BuLi - n-butil lítio

J - Constante de Acoplamento

EPC - Edema de pata induzido por carraginina a 1%

INCA - Instituto Nacional do Câncer

IA - Coleção de microrganismo do Departamento de Antibióticos

da UFPE

Cn - Cadeia Alquílica com n carbonos

12xi

RESUMO

Há alguns milhares de anos a humanidade faz uso sistematicamente de

produtos naturais no tratamento de doenças e enfermidades. Desde então, a natureza tem contribuído de forma fantástica para obtenção de novas substâncias. A prospecção e testes biológicos de produtos naturais podem revelar substâncias candidatas a novos fármacos que poderão ser usadas como uma matriz adequada em um projeto de química medicinal. É neste universo de prospecção que surge a primina (2-metoxi-6-pentil –1,4-benzoquinona), um forte alergênico isolado pela primeira vez por Bloch & Karrer em 1927 da Prímula obconica (Primulaceae). Atualmente há métodos simples, diretos e generalizáveis para a preparação de análogos da primina. Esses análogos tem mostrado atividade biológica, mas ainda com pronunciada toxicidade. A proposta deste trabalho foi a otimização do fármaco protótipo – a primina – através da síntese de derivados, potencializando seus efeitos farmacológicos e minimizando seus efeitos tóxicos. Os compostos 2-metoxi-hidroquinona bis(2’-tetrahidropiranil)-eter (MHQ-THP) e 2-metoxi-6-pentil-hidroquinona bis(2’-tetrahidropiranil)-eter (P-MHQ-THP) foram sintetizados partindo da 2-metoxi-hidroquinona, a primeira etapa foi à proteção das hidroxilas com o dihidropirano (DHP), obtendo o intermediário (MHQ-THP). A segunda etapa consistiu na litiação do MHQ-THP e subseqüente alquilação regioseletiva, obtendo o P-MHQ-THP. Os produtos tiveram suas estruturas confirmadas através de espectroscopia de infravermelho e de ressonância magnética nuclear de próton. A atividade biológica dos compostos sintetizados foi avaliada através dos testes de toxicidade aguda, atividade antitumoral frente ao sarcoma 180 (S-180) e carcinoma de Ehrlich (ES) e atividade antiinflamtória através do ensaio edema de pata induzido por carragenina. Os resultados da toxicidade aguda indicaram, tanto para o precursor MHQ-THP como para o P-MHQ-THP, que não houve efeitos tóxicos significantes em doses de 1000 mg/kg e 2000 mg/kg. Na avaliação da atividade antitumoral os dois compostos apresentaram boa resposta inibitória quando comparados à primina, com inibição variando entre 60,83% e 79,81%. Os resultados para atividade antiinflamatória do composto MHQ-THP, demonstraram boas taxas de inibição, de 69,05%. Estes resultados animadores nos levaram a planejar novas modificações no composto protótipo com o objetivo de minimizar custos e facilitar a obtenção de novos derivados. Baseados nos resultados anteriores escolhemos para a proteção das hidroxilas o grupamento acetoxi, introduzido através da reação de Thiele. A avaliação qualitativa preliminar da atividade antimicrobiana para esses compostos, mostrou que as modificações implementadas não contribuíram para a atividade antimicrobiana.

13xii

ABSTRACT There are some thousands of years the humanity makes use systematically of natural products in the treatment of diseases. Ever since, the nature has been contributing to obtaining of new drugs. The search and biological tests of natural products can reveal substances candidates the new drugs that can be used in a project of medicinal chemistry. It is in this universe that appeared the primin (2-methoxy-6-pentyl -1,4-benzoquinone), a strong allergenic isolated for the first time by Bloch & Karrer in 1927 of the Prímula obconica (Primulaceae). Actually there are simple, direct and generalized methods for the preparation of analogous of the primin. Those analogous have been showing biological activity, but still with pronounced toxicity. The proposal of this work is the synthesis of the primin prodrug - through the synthesis of derivatives, its increasing effects therapeutic profile and minimizing its toxicity effects. The compounds 2-methoxy-hidroquinone bis(2'-tetrahidropyranyl)-eter (MHQ-THP) and 2-methoxy-6-pentyl-hidroquinone bis(2'-tetrahidropyranyl)-eter (P-MHQ-THP) they were synthesized through the route leaving of 2-methoxy-hidroquinone, the first step went to the protection of the hidroxyl groups with the dihidropyranyl (DHP), obtaining the intermediate (MHQ-THP). The second step consisted of the lithiation of MHQ-THP and subsequent alkylation, obtaining P-MHQ-THP. The products had its structures confirmed through IR spectra and 1H-NMR spectra. The biological activity of the synthesized compounds was evaluated through of the toxicity profile, antitumour activity to the sarcoma 180 (S-180) and Ehrlich carcinoma (ES) and antiinflamatory activity through the paw edema induced by carrageenin. The results of toxicity profile indicate, so much for precursory MHQ-THP as for P-MHQ-THP, that there were not significant toxicity effects in doses of 1000 mg/kg and 2000 mg/kg. In the evaluation of the antitumour activity the two compounds presented better inhibition when compared to the primin, with inhibition varying between 60,83% and 79,81%. The results for antiinflamatory activity of the composition MHQ-THP, demonstrated good inhibition rates, of 69,05%. These exciting results took us to plan new modifications in the prototype with the objective of to minimize costs and to facilitate the obtaining of new derivatives. Based on the previous results, we chose for the protection of the hidroxyl groups the acetoxy group, introduced through the Thiele reaction. The preliminary qualitative evaluation of the antimicrobial profile for those compounds, it showed that the implemented modifications didn't contribute to the antimicrobial activity.

14xiii

Capítulo 1

Introdução e Revisão da Literatura.

15

1. INTRODUÇÃO

1.1. Produtos Naturais e a Descoberta de Novos Fármacos

Há mais de cinco mil anos a humanidade começou a usar produtos naturais

como base de uma medicina primária (Barreiro e Fraga, 2001). Ervas e raízes

começaram a serem usadas sistematicamente no tratamento de doenças e

enfermidades. Contudo, apenas a partir do século XIX surgiram os primeiros

estudos com base científica sobre algumas plantas que já eram conhecidas como

medicinais (Montanari e Bolzani, 2001).

Com desenvolvimento da química no início do século XX, foram isolados os

primeiros princípios ativos e surgiram algumas substâncias que, com o passar do

tempo, tiveram seu uso terapêutico consagrado, por exemplo, a morfina, a cânfora

e a cocaína. (Barreiro e Fraga, 2001). No século XX também surgiram os

primeiros antibióticos e foi possível o desenvolvimento de um grande número de

novos fármacos sintéticos, produzidos pela efervescente indústria farmacêutica do

pós-guerra. Isso fez com que o uso de produtos naturais e seus derivados

sofressem uma diminuição gradativa, mas não deixando de ter um papel

importante na história da sociedade (Montanari e Bolzani, 2001).

Atualmente, tem-se observado um extraordinário progresso no que diz

respeito aos estudos farmacológicos e químicos visando obter novos compostos a

partir de produtos naturais. Com o desenvolvimento de novas técnicas analíticas,

16

tornou-se possível elucidar estruturas moleculares complexas com extrema

rapidez e a realização de Bioensaios em Larga Escala [High-Throughput-

Screening (HTS)] permitiu testar um grande número de substâncias em apenas

um único dia (Montanari e Bolzani, 2001).

Ainda assim, considerando todos os avanços conseguidos, a descoberta de

novos fármacos constitui um processo demorado e dispendioso.

A Pharmaceutical Research and Manufactures of América (PhRMA) afirma

que, entre 5.000 – 10.000 compostos candidatos a novos fármacos, apenas um

passa nos testes pré-clínicos e clínicos e é submetido a aprovação do Food and

Drug Administration (FDA) para ser comercializado (Montanari e Bolzani, 2001).

Por isso, no planejamento racional de novos fármacos, não há como

desprezar o potencial que os produtos naturais possuem de fornecer substâncias

novas. A natureza tem se apresentado como uma fantástica fonte de prospecção

de novas moléculas. Um exemplo claro deste potencial são os vegetais, as plantas

são fonte de compostos com estruturas complexas e substâncias

enatiomericamente puras, muitas vezes impossíveis de serem obtidas

sinteticamente de modo racional (Montanari e Bolzani, 2001).

A prospecção e testes biológicos de produtos naturais podem revelar

substâncias candidatas a novos fármacos que poderão ser usadas como uma

matriz adequada em um projeto de química medicinal para planejar as

modificações moleculares que serão realizadas na estrutura deste composto

protótipo, visando estabelecer uma relação estrutura-atividade que permita

identificar os grupos farmacofóricos e toxicofóricos, otimizando o composto

17

protótipo candidato a novo fármaco. O fluxograma a seguir (Figura 1), mostra de

forma resumida este processo.

EXTRATOS SEMIPUROS

EXTRATO BRUTO

TESTES BIOLÓGICOS

PLANTA (PRODUTO NATURAL)

PROCEDIMENTOS CROMATOGRAFICOS

FRAÇÕES E COMPOSTOS PUROS

ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL

MODIFICAÇÃO ESTRUTURAL

SÍNTESE DE ANÁLOGOS

RELAÇÃO ESTRUTURA-ATIVIDADE

TESTES BIOLÓGICOS

TESTES BIOLÓGICOS

TESTES BIOLÓGICOS

TESTES BIOLÓGICOS

Figura 1. Fluxograma para obtenção de novos fármacos.

(adaptado de Cechinel Filho, 1998)

É neste universo de prospecção de novos protótipos, candidatos a fármaco,

que estão inseridos os compostos quinonoídicos. Amplamente distribuídos na

natureza, eles são encontrados em bactérias, fungos, plantas superiores e no

reino animal (artrópodes). Estão envolvidos em etapas importantes do ciclo de

18

vida desses seres vivos, principalmente nos níveis respiratórios e de fotossíntese.

(da Silva et al, 2003).

As quinonas representam, certamente, a maior classe entre os compostos

quinonoídicos e as que ocorrem na natureza estão divididas em três principais

grupos (em ordem crescente de tamanho), benzoquinonas, naftoquinonas e

antraquinonas. Em adição as quinonas de ocorrência natural há um grande

número de outras quinonas simples e complexas que têm sido sintetizadas.

As quinonas sofrem rapidamente reações de adição e substituição e podem

reagir diretamente com nucleófilos celulares (Esquema 1; Reações 1, 2 e 3).

O

O

N u + N u

O H

O H

+ H +

(1)

N u

O H

O H

O

O

N u H 2 O 2 + + O 2

(2)

N u

O H

O H

O

O

O

O

N u O H

O H

+ + (3)

Esquema 1.

Reações de adição e substituição de quinonas simples

(Nu, representa um nucleófilo)

19

Em estudos farmacológicos as quinonas têm mostrado variada

biodinamicidade, atuando de diferentes formas. Por exemplo, destaca-se o

processo de estresse oxidativo, que provocam ao induzirem a formação deletéria

endógena de espécies bioreativas derivadas do oxigênio (Esquema 2; Reações 4,

5, 6 e 7).

O

O

H++

+ e-

O

OH

(4)

+ 2 e-

2 H++

O

O

OH

OH

(5)

OH

OH

O

O

+

O

OH

2 (6)

O 2 +

O

O

O

O H

- H + + O 2 ( 7 )

Esquema 2. Formação de espécies derivadas do oxigênio

20

Outro processo que se destaca é a formação de radical semiquinona, o qual

pode formar ligações covalentes com o DNA e outras macromoléculas (Esquema

3; Reações 8 e 9).

C H D N A

C H

O H

O H

C H 2 D N A

C H

O H

O

+ ( 8 )

+

O H

O H

C H 2 D N A

C H 2

O

O

C H 2 D N A

C H 2

O H

O H

C H 2 D N A

C H 2 ( 9 )

Esquema 3.

Ligação covalente com o DNA

A facilidade para a rápida transferência de elétrons entre formas

quinonoídicas parcialmente ou completamente reduzidas, bem como a

transferência de elétrons com oxidantes ou redutores biológicos, mostra a

dificuldade de determinar qual o caminho metabólico e qual a forma do composto

quinonoídico é responsável pela atividade biológica (Powis, 1987).

Algumas quinonas, selecionadas entre um grande número de compostos

testados, têm sido usadas na terapêutica (Thomson, 1971). Em especial as

benzoquinonas têm se destacado por mostrar freqüentemente ação

antimicrobiana (Di Marco et al., 1975), em alguns casos antitumoral (Melo et al.,

21

1974), tripanosomicida (Santana et al., 1968; Melo et al.,1984) e supressora

alimentar em insetos (Bernays et al.,1984).

Dentre as benzoquinonas de estrutura simples encontramos vários

compostos 2-metoxi-1,4-benzoquinonas alquil substituídos, que têm apresentado

atividade biológica relevante.

Um composto muito importante desta série é a primina (2-metoxi-6-pentil-

1,4-bezoquinona), um forte alergênico isolado da Prímula obconica (Primulaceae)

(ver Figura 2) e que provoca severa dermatite de contato (König et al., 1993). A

primina chegou a ser utilizada em Pernambuco no tratamento de câncer de pele

humano (Melo et al., 1974). Seus testes clínicos forneceram bons resultados o que

permitiu sua comercialização (Cotias et al., 1974), mas seu uso tornou-se restrito

devido ao seu efeito irritativo.

Figura 2. Prímula obconica (Primulaceae)

Vários análogos da primina (2-metoxi-6-pentil-1,4-benzoquinona) já foram

sintetizados. Muitos deles com diferentes substituintes alquílicos em posições

22

estruturais distintas (3,5 e 6-alquil substituídos), mostrando boa atividade

biológica, mas ainda com pronunciada toxicidade.

Um estudo da primina à luz do Planejamento de Fármacos pôde solucionar

o problema da elevada toxicidade da primina e seus análogos. A partir dos

resultados já publicados sobre o metabolismo e atividade biológica para essa

classe de compostos, e com a síntese de novos derivados, pôde-se estabelecer

uma relação estrutura-atividade, que permitiu a obtenção de um novo protótipo

candidato a fármaco, em que seus efeitos tóxicos foram minimizados.

Sendo assim, nosso objetivo foi otimizar o fármaco protótipo - a primina –

potencializando seus efeitos farmacológicos e minimizando, sobretudo, seus

efeitos tóxicos, viabilizando seu uso através da aplicação de estratégias

adequadas de modificação molecular.

O presente trabalho se inicia com uma revisão da literatura, onde serão

abordados aspectos relevantes sobre a descoberta da primina, seu uso na terapia

contra o câncer de pele em humanos, discute sua síntese e a síntese de seus

análogos e finalmente os resultados obtidos que relacionam estrutura e atividade

biológica.

O capítulo seguinte traz o primeiro artigo científico, que trata da síntese,

caracterização e avaliação da atividade antitumoral e antiinflamatória do produto

intermediário 2-metoxi-1,4-hidroquinona-bis-(2’-tetrahidropiranil) éter (MHQ-THP).

O terceiro capítulo traz o segundo artigo científico, que trata sobre a

síntese, caracterização e avaliação da atividade antitumoral e antiinflamatória para

23

o derivado da primina, o 2-metoxi-6-pentil-1,4-hidroquinona-bis-(2’-

tetrahidropiranil) éter (P-MHQ-THP).

O quarto capítulo traz o terceiro e último artigo científico, sobre a avaliação

da atividade antimicrobiana de derivados acetoxilados da primina.

Finalmente, no quinto capítulo, serão apresentadas as considerações finais

à cerca dos resultados obtidos e as perspectivas que envolvem o trabalho.

24

1.2. Objetivos

1.2.1. Objetivo Geral

Otimização de um fármaco protótipo a partir de um núcleo base, a primina,

buscando potencializar efeitos farmacológicos e minimizar efeitos toxicológicos,

através da aplicação de estratégias adequadas de modificação molecular.

1.2.2. Objetivos Específicos

a) Preparar derivados não naturais da primina (2-metoxi-6-pentil-1,4-

benzoquinona);

b) Caracterizar a estrutura química dos compostos sintetizados através de

Espectroscopia de Infravermelho (IVTF) e de Ressonância Magnética

Nuclear de Prótons (1H-RMN), Ponto de Fusão e Rf;

c) Avaliar a toxicidade aguda, através do teste de efeitos gerais, dos

compostos sintetizados;

d) Avaliar a atividade antitumoral dos compostos sintetizados frente ao

sarcoma 180 e carcinoma de Ehrlich;

e) Avaliar a atividade antiinflamatória dos compostos sintetizados;

25

f) Avaliar a atividade antimicrobiana dos compostos sintetizados; e

g) Avaliar a relação Estrutura Química – Atividade Biológica.

26

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. Primina: Isolamento e Identificação

Vários compostos antibióticos da série de 6-alquil-2-metoxi-1,4-

benzoquinonas (1) já foram isolados e identificados, entre eles o antibiótico 6-

metil-2-metoxi-1,4-benzoquinona (1a), isolado de culturas de Aspergillus sp (Melo

et al., 1974), outro antibiótico é o 2-metoxi-6-propil-1,4-benzoquinona (1b) foi

isolada de Camarops microspora (Sood et al., 1982), mais recentemente, o

composto 2-metoxi-6-heptil-1,4-benzoquinona (1f) foi isolado da Miconia lepidota

(Gunatilaka, 2001) e (Berger, 2001) e o mais importante desta série, o composto

2-metoxi-6-pentil-1,4-bezoquinona, a primina (1d), isolada primeiramente por

Bloch e Karrer em 1927 da Primula obconica, uma planta ornamental que provoca

reações alérgicas devido à secreção desta quinona pelas folhas causando

dermatite (Esquema 4).

O

O

OMeR

1a. R = CH3

1b. R = C3H7

1c. R = C4H9

1d. R = C5H11

1e. R = C6H13

1f. R = C7 H15

(1)

Esquema 4.

2-metoxiquinonas 6-substituída

27

A primina também foi isolada do extrato bruto metanólico das raízes da

árvore Miconia eriodonta (Melastomaceae), de nome vulgar “Pau-Mondé”

(Santana et al., 1968), sendo relatado os primeiros informes sobre sua atividade

antimicrobiana e antineoplásica (Lima et al., 1970). A análise farmacológica

(Cotias et al., 1974) e os testes clínicos (Melo et al., 1974) realizados com a

primina permitiram a sua comercialização e utilização para o tratamento de câncer

de pele humana, apresentando resultados satisfatórios no tratamento de

epitelioma baso-celular (Figura 3) apesar de mostrar uma alta atividade irritativa

(Melo et al., 1974). Posteriormente, a primina foi retirada do mercado devido à

baixa procura e ao efeito alérgico bem pronunciado.

Figura 3. Epitelioma basocelular: forma nódulo-ulcerativa

(fonte: INCA – Instituto Nacional do Câncer, 1996)

Ainda foram isolados da natureza, outros dois regioisômeros do composto

1a. Um deles é a coprimina, o 5-metil-2-metoxi-1,4-benzoquinona (2a), isolada de

28

culturas de Coprinus radians e Coprimus similis (Volc et al., 1977), o outro é o 2-

metoxi-3-metil-1,4-benzoquinona (3a), um componente da secreção defensiva dos

artrópodes (Thomson, 1971) (Esquema 5).

O

O

OMe

R''

3a., R = CH3 (coprimina)

3b., R = C3H7

3c., R = C5H11

(3)

O

O

OMe

R'

2a., R = CH3 (coprimina)

2b., R = C4H9

2c., R = C5H11

2d., R = C6H13

(2)

Esquema 5.

2-metoxiquinonas 3 e 5-substituídas

2.2. Síntese da Primina e Seus Análogos

Em 1967 foi realizada a primeira síntese da primina e alguns de seus

isômeros, confirmando assim a estrutura proposta para o produto natural isolado.

Partindo da orto-vanilina a síntese foi realizada em seis etapas, usando o sal de

29

Fremy como oxidante, fornecendo rendimento global baixo. (Schildknecht e

Schmidt, 1967) (Esquema 6).

OH

CH3O CHO (CH3)2SO4

OCH3

CH3O CHO 1) BrMgR

2) HoAc/Eis

OCH3

CH3O CHO R

Cr2O72 / H

OCH3

CH3O C R

OAlCl3 / Toluol

OH

CH3O C R

OZn / Mg

HCl 1:1

OH

CH3O CH2 R

ON(SO3K)2pH = (8) 9

CH3O CH2 R

O

OR = C C C C

85 - 90 %

73 - 83 %

60 - 90 %70 - 89 %

20 - 40 %

H

Esquema 6.

Síntese da Primina (Schildknecht e Schmidt, 1967)

A otimização da última etapa da síntese de Schildneknecht foi obtida por

Gras em 1977. Na tentativa de obter a 2-metoxi-6-metil-1,4-benzoquinona (1a) ele

partiu da orto-vanilina e o 3-hidroxi-o-cresol para chegar ao 2-metoxi-6-metilfenol,

que foi oxidado por oxigênio molecular catalisado por salcomina (bis-(salicilideno)-

30

etilenodiamino-cobalto II), cuja função é complexar o oxigênio para uma oxidação

radicalar, levando a p-benzoquinona desejada (Gras, 1977) (Esquema 7).

OH

OCH3OHC

1) NaH-DMF

2) CH3I70%

salcomina (O2)

MgSO4 / DMF86%

O

OCH3H3C

O

OH

OHH3C1) NaH-DMF

2) CH3I70%

OH

OCH3H3C

Esquema 7.

Síntese da Primina (Gras, 1977)

O uso de reagentes metalorgânicos em Reações de Metalação surgiu como

uma importante estratégia para síntese regioespecífica na obtenção de análogos

6-alquil substituídos (Posner e Canella, 1985; Costa e Saá, 1987; Snieckus, 1990

e 1994).

Um método simples, direto e generalizável de preparação de 6-alquil-2-

metoxi-1,4-benzoquinonas foi desenvolvido a partir da litiação e posterior

alquilação do tetrahidropiranil éter de guaiacol. (Rolim Neto, 1988; Bieber et al.,

1990) (Esquema 8).

31

Os compostos 3-substituídos podem ser sintetizados a partir de 3-metoxi-

fenol em três etapas, semelhante às estruturas 6-substituídas.

OH

OCH3 O, H+ OTHP

OCH31) n-ButLi2) R'X

3) H3O+

OTHP

OCH3R' O2 / Salcomina

O

O

R' OCH3

R'= metil, etil, propil, butil, pentil e hexil

Esquema 8.

Síntese da Primina e seus análogos 6-substituídos (Rolim Neto, 1988; Bieber et

al., 1990)

Com controle cinético da reação e a escolha de um solvente apropriado foi

possível à obtenção de compostos 3-alquil substituídos com bom rendimento

(Brondani, 1991 e 1995). Partindo da 2-metoxi-hidroquinona, em um solvente

apolar, a metalação e subseqüente alquilação foi direcionada exclusivamente para

a posição 3. Com o uso de um solvente polar e sob controle cinético na

metalação, à baixa temperatura, a alquilação acontece quase que exclusivamente

na posição 6 (Esquema 9).

Os isômeros 5-alquil substituídos foram obtidos a partir da alquilação

seletiva da 2-metoxi-1,4-benzoquinona com trialquilboranos e subseqüente

oxidação, fornecendo exclusivamente o produto 5-substituído com excelente

rendimento, sendo possível à síntese de um grande número de compostos para

32

estudos comparativos de atividade biológica (Kalbaka, 1971; Rolim Neto, 1988;

Bieber, 1990). A reação ocorre via mecanismo radicalar e segundo Bieber a

seletividade do método pode ser explicada pela formação de um complexo

quinona/borano o qual sofre ataque direto do radical alquil (Esquema 10).

OH

OH

OMeO

TOSOH / THF

OTHP

OTHP

OMe

O

OTHP

OMe

O

LiSolv.

R

OTHP

O

OMe

Li

O

R

OTHP

OTHP

OMe

OTHP

OTHP

OMeR'

OTHP

OTHP

OMe

R'

R'X

R'X

Solv. Polar

n-ButLi

Solv. Apolar

n-ButLi

OTHP

OTHP

OMeLi- RH

OTHP

OTHP

OMe

Li

- RH

2)

1)

Esquema 9.

Síntese de Análogos da Primina 3 e 6—substituídos

(Brondani, 1991 e 1995)

33

A obtenção de benzoquinonas alquil substituídas através de reações de

adição com reagentes metalorgânicos tem demonstrado que com o uso de

reagentes de Grinard ou organolítios ocorre reação adição 1,4. Com

organoboranos também foi observado o mesmo tipo de adição (Brondani, 1991;

Bieber et al., 1999).

O

O

OCH3

O

O

OCH3

BrR3

OBR2

OCH3

O

HR

O

O

OCH3

R

O

O

OCH3

HR

BrR3

BR3 Riniciador

H3O+/Fe3+

BR3

Esquema 10.

Síntese de Análogos da Primina 5—substituídos

(Kalbaka, 1971; Rolim Neto, 1988; Bieber et al, 1990)

34

2.3. Relação Estrutura - Atividade Biológica

Vários estudos foram realizados ao longo desses anos onde a atividade

biológica da primina e seus análogos foram testados. Em 1982, Sood testou a

atividade antibacteriana e antifungica da 6-metil-3-metoxi-1,4-benzoquinona,

isolada de Aspergillus sp., que mostrou uma taxa de inibição moderada frente aos

microrganismos testados. O mesmo composto apresentou uma toxicidade aguda

(DL50, i.p.) de 7,4 mg/kg (Sood et al., 1982).

A primina também foi sintetizada e testada como um potencial agente

supressor alimentar contra seis espécies diferentes de insetos, apresentando

atividade supressora em todos os casos (Bernays, 1984).

Rolim Neto estudou novos métodos sintéticos para as 2-metoxi-

benzoquinonas-1,4-alquil-substituídas nas posições 5 e 6. Com os produtos

sintetizados por ele, foram realizadas as primeiras observações sobre atividade

antimicrobiana, toxicidade aguda e atividade antitumoral em relação à estrutura,

com resultados bastante interessantes.

A determinação da Concentração Mínima Inibitória (CMI) contra 21

microrganismos representativos demonstrou que, comparando os resultados entre

as duas séries de compostos 5 e 6-substituídos, de modo geral os compostos 6-

substituídos apresentaram maior atividade. Com média para os valores de CMI

oscilando entre 30 e 100 µg/mL (Rolim Neto, 1988; Brondani et al., 2003).

35

Os resultados encontrados por Rolim Neto para a toxicidade aguda, através

da DL50 aproximada, indicam que para os compostos 5-substituídos os valores se

situaram a cima de 25 mg/kg de peso corpóreo, enquanto para o compostos 6-

substituídos variaram numa faixa entre 10 e 17 mg/kg de peso corpóreo.

Observou-se ainda que o aumento do peso da cadeia alquílica lateral não trouxe

significativas mudanças nos valores de toxicidade (Neto, 1988).

A atividade antitumoral da primina (6-pentil-2-metoxi-1,4-benzoquinona) foi

testada, in vivo, frente ao Sacoma 180, apresentando marcante efeito inibitório

para as doses de 7,0; 9,0 e 10,0 mg/kg de peso corpóreo, com resultados de

inibição tumoral de 68,73%, 78,13% e 80,86%, respectivamente (Neto, 1988).

Brondani (1991) desenvolveu novos métodos de síntese para 3-alquil-2-

metoxi-1,4-benzoquinonas, bem como para seus isômeros 5 e 6 substituídos, por

via de metalação e alquilação regioseletiva de 2-metoxi-hidroquinona. A atividade

antitumoral dos compostos sintetizados destas séries foi testada. Os resultados

obtidos indicaram uma inibição tumoral significativa, porém sempre com doses

próximas a toxicidade aguda.

Gunatilaka (2001) e Berger (2001) prepararam alguns análogos da primina,

usando métodos descritos na literatura, para tentar estabelecer uma relação

estrutura-atividade entre os compostos isolados da Miconia lepidota, o 2-metoxi-6-

heptil-1,4-benzoquinona e o 2-metoxi-6-pentil-1,4-benzoquinona. Os resultados

demonstraram em ensaios de atividade antimicrobiana e citotoxicidade que houve

um acréscimo da atividade com o aumento da cadeia lateral alquílica até C10, mas

36

a atividade decresceu significativamente quando uma cadeia com C19 foi

introduzida (Gunatilaka et al., 2001; Berger, 2001).

A primina tem um poder irritante muito grande e pode causar séria

dermatite de contato, principalmente em indivíduos sensíveis a essa substância.

Alguns estudos à cerca do assunto têm usado a primina sintética na formulação

de “Patch” em testes para determinação de indivíduos alérgicos (Sugiura e

Hayakawa, 1994), (Dewert et al., 1997).

No intuito de determinar a relação estrutura-atividade alergênica da primina,

Alguns estudos têm sido realizados tentando relacionar a cadeia lateral alquilica

com potencial irritativo da primina. Vários análogos foram sintetizados com cadeia

lateral variando de C1 a C19 e o potencial de sensibilização destes compostos

testado em experimento com porcos da índia. Os resultados mostraram um

crescimento da capacidade de sensibilização com o aumento do tamanho da

cadeia lateral, tendo sensibilização máxima entre C10 e C12 (König et al., 1993;

Hausen et al., 1995).

Além destes, outros estudos também foram realizados. Horper & Marner

(2001) estudaram a biosíntese da primina em experimentos com precursores

radiativamente marcados e com homólogos. Alcanfôr e colaboradores (1994)

propuseram métodos fluorimétricos para a determinação de alguns compostos

quinonoídicos entre eles a primina (2-metoxi-6-n-pentil-1,4-bezoquinona).

37

3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. ALCANFÔR, S. K.; Fluorimetric studies of some quinines and quinonoid compounds after reduction reaction. Analytica Chimica Acta, 289, p. 273-290, 1994.

2. BARREIRO, E. J.; FRAGA, C. A. M.; Química Medicinal: As bases Moleculares da Ação dos Fármacos. Artmed Editora Ltda., São Paulo, 2001.

3. BERGER, J. M.; Isolation, Characterization and Synthesis of Bioactive Natural Products from Rainforest Flora. Dissertation of Doctor of Philosophy in Chemistry. Virginia Polytechnic Institute and State University. Blacksburg, Virginia, 2001.

4. BERNAYS, E.; LUPI, A.; MARINI BETTOLO, R; MASTROFRANCESCO, C.; TAGLIATESTA, P; Antifeedant Nature of the Quinone Primin and its Quinol Miconidin from Miconia spp.; Experienta. 40, 1010-1011, 1984.

5. BIEBER, L. W.; CHAPPETA, A. A.; SOUZA, M. A. M.; GENERINO, R. M.; Simple Syntese of Primin and Its Analogues Vai Lithiation of Protected Gauiacol, Jounal of Natural Products, Vol. 53, No. 3, 706-709, May-Jun 1990.

6. BIEBER, L. W; ROLIM NETO, P.; GENERINO, R. M.; Regioselective Alkylation of Substituted Quinones by Trialkylboranes, Terahedron Letters, 40, 4473-4476, 1999.

7. BLOCH, B.; KARRER, P.; Beiblat Zur Vierteljahresschrif Der Naturforsch., 22 (3), 36, 1967.

8. BRONDANI, D. J., Litiação e Alquilação Regioseletivas de 2-metoxihidroquinona, dissertação de mestrado, Departamento de Ciências Farmacêuticas, UFPE, Recife, 1991.

38

9. BRONDANI, D. J.; BIEBER, L W.; regioselective Lithiation and Alkylation of 2-Methoxy-Hydroquinone, Química nova, Vol. 18, No. 2, 144-146, 1995.

10. BRONDANI, D. J; FILHO, A. A. S.; LEITE, A. C.; NASCIMENTO, C. R. M.; ROLIM NETO, P. J. R.; BIEBER, L. W.; Síntese e Avaliação da Atividade Antimicrobiana de Análogos da Primina 5 e 6 Alquil-Substituídos. Acta Farm. Bonaerense, 22(3), 217-21, 2003.

11. CECHINEL FILHO, V.; Estratégias para a Obtenção de Compostos Farmacologicamente Ativos a partir de Plantas Medicinais. Conceitos Sobre Modificação Estrutural para Otimização da Atividade. Química Nova, 21(1), 99-105, 1998.

12. COSTA, A.; SAÁ, J. M.; On Metalation of Phenolic Compounds: Ready Access to Highly Substituted Phenols. Tetrahedron Letters, Vol. 28, No. 45, pp. 5551-5554, 1987.

13. COTIAS, C. F.; PINTO, K. V.; LACERDA, A. L.; MARTINS, D. G.; Propriedades Farmacológicas da Primina; Rev. Inst. Antib., Recife, 14, 17, 1974.

14. da SILVA, M. N.; FERREIRA, V. F.; SOUZA, M. C. B. V; Um panorama Atual da química e da Farmacologia de Naftoquinonas, com Ênfase na β-Lapachona e Derivados. Química Nova, 26(3), 407-416, 2003.

15. DEGWERT, J.; STECKEL, F.; HOPPE, U.; KLIGMAN, L. H.; In vitro Model for Contact Sensitization: I. Stimulatory Capacities of Human Bloog-derived dentritic Cells and their Phenotypical Alterations in the presence of Contact Sensitizers; Toxicology in Vitro, 11, 613-618, 1997.

16. DI MARCO, A.; ARCAMONE, F., ZUNINO, F.; Antibiotics, 3, 101, 1975.

17. GRAS, J. L. ; Tetrahedron Letters, 47, 4117, 1977.

39

18. GUNATILAKA, A. A. L.; BERGER J. M.; EVANS R.; MILLER J. S.; WISSE J.H.; NEDDERMANN K. M.; BURSUKER I.; KINGSTON D. G. I.; Isolation, Synthesis, and Structure-activity Relationships of Bioactive Benzoquinones from Miconia lepidota from the Suriname rainforest. JOURNAL OF NATURAL PRODUCTS, Vol 64, Iss 1, pp 2-5, 2001.

19. HAUSEN, B. M; HEITSCH, H; BORRMANN, B.; KOCH, D.; RATHMANN, R.; RICHTER, B.; KÖNIG, W. A.; Struture-activity Relationships in Allergic Contact Dermatitis (I) Studies on the Influence of side-chain legth with derivatives of Primin; Contact dematitis, 33, 12-16, 1995.

20. HORPER, W.; MARNER, F.; Byosynthesis of Primin and Miconidin and its derivatives. Phytochemistry. 41(2), 451-456, 1996.

21. KABALKA, G. W.; The Reaction of Trialkylboranes with 1,4-naphthoquinone: A New, Convenient Synthesis os 2-Alkyl-1,4-Naphthalenediols. Evidence for a Free-Radical Chain Macanism, Jounal Organometal Chemistry, 33 C25-C28, 1971.

22. KÖNIG, W. A.; FAASCH, W.; HEITTSCH, H.; COLBERG, C.; HAUSEN, B. M.; Synthese Von Seittnkettenmodifiziertn Analogem des Allergens Primin; Z. Naturforsch. 48b, 387-393, 1993.

23. LIMA, O. G.; MARINI-BERTTOLO, G. B.; MONACHE, F. D.; COÊLHO, J. S. B; D’ALBUQUERQUE, I. L.; MACIEL, G. M; LACERDA, A.; MARTINS, D. G.; Substâncias Antimicrobianas de Plantas Superiores, Revista do Instituto de Antibióticos, Recife, Vol. 10 No. (1 2), 29-34, 1970.

24. MELO, A. M.; JARDIM, M. L.; SANTANA, G. F. de; LIMA, O. G. de; D`ALBUQUERQUE, I. L.; LACET, Y; Primeiras Observações do Uso Tópico da Primina, Plumbagina e Maitenina em Pacientes Portadores de Câncer de Pele; Rer. Inst. Antib., Recife, 14 (1/2), 9, 1974.

25. MELO, E. J. T.; AMARAL, P. C.; ANDRADE, P. P.; ANDRADE, C. R.; Sensitivy of Lower Trypanosomatides to Anti-Trypanosoma Cruzi Drugs, Anais XIV. Enc. Anal Pesq. Bras. Doenças de Chagas, Caxanbu-MG, 1984.

40

26. MINISTÉRIO DA SAÚDE. INSTITUTO NACIONAL DE CÂNCER. COORDENAÇÃO NACIONAL DE CONTROLE DO TABAGISMO – CONTAPP. “Falando Sobre o Câncer e Seus Fatores de Risco” Rio de Janeiro, 1996.

27. MONTANARI e BOLZANI, C. A.; BOLZANI, V. S., Planejamento Racional de Fármacos Baseado em Produtos Naturais, Química nova, Vol. 24, No. 1, 105-111, 2001.

28. POSNER, G. H; CANELLA, K. A.; Phenoxide-Directed Ortho Lithiation. J. Am. Chem. Soc. 107, 2571-2573, 1985.

29. POWIS, G.; Quinoid Anticancer Agents, Pharm. Ther. Vol. 35, pp. 57-162, 1987.

30. ROLIM NETO, P. J.; Síntese de 2-metoxi-p-benzoquinonas 3,5 e 6 alquil substituídas, dissertação de mestrado, Departamento de Ciências Farmacêuticas e Antibióticos, UFPE, Recife, 1988.

31. SANTANA, C. E. de; LIMA, O. G. de; D`ALBUQUERQUE, I. L.; LACERDA, A. L.; MARTINS, O. G., Observações Sobre as Propriedades Antitumorais e Toxicológicas do Extrato do Líber e de Alguns Componentes do Cerne do Pau D’arco; Rer. Do Inst. De Antib., Recife, 8, 89, 1968.

32. SCHILDKNECHT, H.; SCHMIDT, H.; Synthesen und Eigenschaften des Primins und seiner Isomeren; Zeitschrif Naturforsch, 22B, 287, 1967.

33. SNIEKUS, V.; Combined Direct orto Metalation-cross Coupling Strategies. Desing for Natural Product Systhesis. Pure Appl. Chem. Vol. 66, 10/11, pp. 2155-2158, 1994.

34. SNIEKUS, V.; The Directed Ortho Metalation Reaction. Methodology, Applications, Synthetic links and a Non-aromatic Ramification. Pure Appl. Chem. Vol. 62, No. 10, pp. 2047-2056, 1990.

35. SOOD, R. S.; ROY, K.; REDDY, G. C. S.; REDEN, I.; GANGULI, B. N.; J. Antib., 35, 985, 1982.

41

36. SUGIURA, M.; HAYAKAWA, R.; Results of Testing Uit Synthetic Primin. JSID Abstracts, p. 139, 1984.

37. THOMSON, R. H., Naturally Occuring Quinones, 2th ed. London, Academic Press, 1971.

38. VOLC, I.; SEDMERA, P.; ROY, K.; YASEK, V.; VOKOUN, I.; Collect. Czech.

Chem. Commun., 42, 2957, 1977.

42

Capítulo 2

Artigo I - Synthesis, Antitumour and Antiinflammatory Activities of a Primin

Precursor.

43

SYNTHESIS, ANTITUMOUR AND ANTIFLAMMATORY ACTIVITIES OF A

PRIMIN PRECURSOR Dalci José Brondani1*, Célio Ricardo M. Nascimento1 Ivone A. de Souza2 , Lothar

W. Bieber3 and Ana Cristina Lima Leite1

1LABSINFA - Departamento de Ciências Farmacêuticas

2Departamento de Antibióticos, 3Departamento de Química Fundamental, Universidade Federal de Pernambuco - Rua Prof. Artur Sá S/N, CDU, 50740-520,

Recife, Pernambuco - Brasil – dalci@ufpe.br

Abstract

Primin, a naturally-occuring from Primula obconica (Primulaceae) has showen antimicrobial and antitumour activities. The synthesis of prodrugs of Primin to obtain 3- 5- and 6-alkyl substituted derivatives has been previously attempt seeking antitumour activity (unupublished data). The intermediate reaction product, 2-methoxy-1,4-hidroquinone-bis-(2’-tetrahidropyranyl) ether, was isolated, characterized and evaluated as antitumour, antiinflamatory agent and toxicity profile. In vivo antitumour activity tests showed that this intermediary compound was able to inhibits S-180 sarcoma and Ehrlich carcinoma growth in mice.

Keywords: Primin derivative; pro-drug; antitumour agent; antiinflammatory activity

1. Introduction

Primin the natural quinone, was first identified in primrose leaves (Primula

obconica)[1]. Its structure of 2-methoxy-6-n-pentyl-1,4-benzoquinone was

confirmed by synthesis[3]. The same product has also been found in the roots of a

Brazilian tree, called “pau mondé” and now identified as Miconia eriodonta DC[4].

This benzoquinone is known to its allergenic properties[5] and a strong sensitizer

that’s has early been recognized to induce contact dermatitis [6]. It also shows

significant antimicrobial and antitumour activity [7]. After clinical trial it was

marketed in Brazil for the treatment of basal cell carcinoma with excelent results[8].

In the last years several reports deal with this benzoquinone and derivatives

concerning the biosynthesis [9] and structure-activity relationships [10].

44

We have worked on the preparation of the synthesis of primin

derivatives in order to provide an easier accses to those rather simple quinones.

The direct synthetic strategy to introduce alkyl groups using 2-methoxy-1,4-

hydroquinone includes ortho-metalation by lithiation followed by alkylation.

Protection of phenolic hydroxyl groups by the using dihydropirane (DHP) was

necessary in this strategy, leaving to the intermediate 2-methoxy-1,4-hidroquinone-

bis-(2’-tetrahidropyranyl) ether (MHQ-THP) [11]. In view to establish the

structure/activity relationships of alkyl substituents and protecting groups on

precursor and primin we present here toxicity profile, antitumour and anti-

inflammatory activity of MHQ-THP.

2. Chemistry.

The tetrahydropyranyl protecting group was chosen because of its

easy introduction and cleavage under acidic conditions and of its good directing

properties demonstrated in similar cases. The synthesis of 2-methoxy-1,4-

hidroquinone-bis-(2’-tetrahidropyranyl) ether (MHQ-THP), was carried out as

previously described [11]. Equation 1.

DHP/THF

TosOH

OHOMe

OH O

OOMe

O

O

Equation 1

45

3. Experimental procedures

3.1 Chemistry

1H-NMR spectra were recorded on a Varian UNITYplus-300 MHz NMR

spectrophotomether using DMSO-d6 as solvent and tetramethylsilane as an internal

standard. IR spectra were obtained on using KBr pellets. Thin-layer chromatography

was carried out on silica gel plates having fluorescence indicator F254 (0.2 mm, E.

Merck); the spots were visualised with UV light. Column chromatography was

performed on silica using Kiesegel 60 (230-400 mesh, E. Merck). All reagents used in

the present work were of analytical grade.

3.1.1 3-2-methoxy-1,4-hidroquinone-bis-(2’-tetrahidropyranyl) ether

To a solution of 2-methoxyhydroquinone (2.80 g, 20 mmol), in 20 mL of

anhydrous THF, were added at 0oC 3,4-dihydro-2H-pyran (4.56 mL, 50 mmol) and

anhydrous p-toluenosulfonic acid (50 mg). After standing at 5o C for 15 h, 10 mL of

10% sodium hydroxide were added. The mixture was diluted with 100 mL of water

and extracted with cyclohexane (3 x 30 mL). The combined extracts were washed

with 10% NaOH (2 x 20 mL) and then with water. After drying over anhydrous

K2CO3 the solvent was removed under vacuo and the oily residue purified over

silica gel column (20 g) eluting initially with toluene. Yield 5.126 g (84%) of

colourless oil. 1H NMR (CDCl3; δ= ppm) 1.46-2.06 (m, 12H); 3.86 (s)

superimposed to 3.40-4.10 (m, total 7H); 5.20-6.45 (m, 2H); 6.57 (dd, 1H, J=8.69

Hz e 2.69 Hz); 6.63 (d, 1H, J=2.69); 7.01 (d, 1H, J=8.69 Hz).

46

3.2 Pharmacology

3.2.1. Toxicity tests

36 male suisse adult white mice, (ca. 25-28 g.) were divided in 6 groups

and private of eat 20 hours before injections. The preliminary phase dosages are

1000 and 2000 mg/Kg to MHQ-THP. It was diluted in Tween 80 (two drops) and

saline (0.9%). Single intraperitoneal injections were given and the general effects

observed during 60 min and continued about 72 hs after injection. The control

group received solvent only.

3.2.2. Antitumor activity Compounds were diluted in Tween 80 (two drops) and saline (0,9%).

Females, 20-25 g, from Antibiotics Department of the Pernambuco Federal

University, were divided in 6 groups. Transplants of tumour fragments, about 1.5-

2.0 mm of Sarcoma S-180 are made subcutaneously in lateral thoracic wall of 6

mice; starting 48 hours later, injections (35 mg/Kg) of test compounds are made

i.p. once daily for 8 days. After treatment, tumours were removed and measured.

The efficacy of treatment was estimated by the ellipsoid formula, and V of control

group was taken in calculations for 100%.

3.2.3. Antiinflammatory activity

Carrageenin-induced hind paw edema in rats was produced by the method

of Winter et al. [12]. Carrageenin solution (1.0% in sterile 0.9% NaCl solution) in a

volume of 0.1 ml was injected subcutaneously into subplantar region of the right

hind paw 1 h after the administration of the test compound. Control animals

47

received only 0.9% NaCl solution. Right hind-paw volume was measured using a

hydroplethysmomether (model 7150, Ugo Basile, Italy) immediately before and 1,

2, 3, 4, 5 and 6h after the carrageenin injection. The increase of results was made

with five groups of rats, 10 animals each (the 1st one was control).

4. Results and discussion

Biological in vivo test

4.1. Antiinflamatory activity

Antiinflammatory activity was studied by carrageenin paw edema in mice. The

inhibition of the edema was mesured after 1, 2, 3, 4, 5 and 6h from administration

of the test compound. As reference substance in experiments Indometacin was

used (10 mg/Kg).

The synthetic precursor MHQ-THP, showed antiinflammatory activity higher

than that of Indometacin; it reduced carrageenin-induced rat paw edema in

69.05%.

4.2. Behavioral effects and Acute Toxicity.

The acute toxicity test of the MHQ-THP was realised through

intraperitoneal way, on the concentrations of 1000 and 2000 mg⁄/kg in mice. All

animals were monitored continuously for 72 hours after dosing for signs of

toxicosis.

In the present study, we verified that the tested substance did not

show any significant gross behavioral effects at the 1000 and 2000 mg/Kg. Clinical

48

signals to both doses included motor uncoordination, hiperactivity, tremors,

decrease of muscle tone, prostration and labored brating. At 2000 mg/kg dose was

observed clonic convultion. No death was observed during experimentation period.

The precursor MHQ-THP revealed low toxicity when compared to

primin (2-methoxy-6-n-pentyl-1,4-benzoquinone), which showed intraperitoneal

LD50 in mice of 14 mg/Kg [7]. That’s means the tetrahidropyranyl protetion group

can dispay a important role of the decrease of toxicity in the precursor that’s was

140-fold less toxic.

4.3 In vivo Antitumour activity.

The antitumour activity of compound was tested against murine sarcoma S-

180 and solid Ehrlich carcinoma in six Swiss albino mice (25-28 g) for tested

product. The treatment began forty eight (48) hours after the implantation of the

tumour and was continued for eight (8) days, with an intraperitoneal dose of 100

mg⁄ kg⁄ day.

In both cases MHQ-THP presented a antitumour profile with reduction of

the tumour mass in 70,7%, to S180 and 60,83% to Ehrlich Carcinoma. It was

previously reported that primin inhibited S180 with 66,7% and Ehrlich Carcinoma

55,6%, but with a lower dose 10mg/Kg. Although primin exhibited a better

antitumour profile, but its dosis is at the limite of acute toxicity [7].

In a preliminary analysis of the structure/activity relationship the lower

acute toxicity and better antitumour activity of MHQ-THP indicates that the

49

tetrahidropyranyl protetion group supresses the acute toxicity but not the antitumor

activity.

In conclusion MHQ-THP revealed potential antitumour, anti-

inflammatory activities and the low acut toxicity. Although these results deserve

further studies, it is very suggestive that MHQ-THP is an effective candidate for a

prodrug of primin and related benzoquinones.

Acknowledgements

The authors thank from the “Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnologico” (CNPq), the “Fundação de Amparo a Ciência do Estado

de Pernambuco” (FACEPE) and Banco do Nordeste for financial support.

References

[1] B. Bloch and P. Karrer, Chemische und Biologische Untersuchungen uber

die Primelidiosynkrasis, Beiblatt zur Vierteljahresschrift der Naturforsch. Ges.

Zürich, 13, 1, (1927) 1-26.

[2] H. Schildknecht, I. Bayer, H. Schmidt, Struktur des Primelgiftstoffer. Z.

Naturforsch., Teil, 22b (1967).36-41.

[3] H. Schildknecht, I. Bayer, H. Shmidt, Struktur des Primelgiftstoffer, Synthese

und Eigenschaften des Primins und seiner Isomeren, Z. Naturforsch., Teil,

22b, (1967) 287-294.

[4] L. J. Bieber, A. A. Chiappeta, M. A. M. Souza, R. M. Generino and P. R. Neto,

Simple synthesis of primin and its analogues via Lithiation of Protected

Guaiacol, Journal of Natural Products, 53(3), 1990, 706-709.

50

[5] S. Mabic, L. Vaysse, C. Benezra and J. P. Lepoittevin, New Synthesis of the

Benzoquinone Primin and its Water-soluble analog Primn Acid via Heck

Reactions, 7 (1999) 1127-1134.

[6] K. H. Schulz, I. Garbe, B. M. Hausen, M. H. Simatupang, The sensitizing

capacity of naturally occurring quinones (II). Benzoquinones. Arch. Dermatol.

Res., 264 (1979), 275-286.

[7] O. G. De Lima, G. B. Marini-Bettòlo, F.Delle Monache, J. S. B. Coelho, I. L.

D’Albuquerque, G. M. Maciel, A. L. Lacerda, D. G. Martins, Atividade

antimicrobiana e antineoplásica de produto identificado como 2-metoxi-6-n-

pentil-p-benzoquinona (Primina). Rev. Inst. Antibióticos., Univ. Federal de

Pernambuco, Recife, 10, (1970), 29-39.

[8] A. M. Melo, M. L. Jardim, C. F. Santana, J. L. Filho, O. G. Lima, and I. L.

D’Albuquerque, primeiras observações do uso tópico da Primina, Plumbagina

e Maitenina em pacientes portadores de câncer de pele. Rev. Inst.

Antibióticos., Univ. Federal de Pernambuco, Recife, 14, (1974), 9-27.

[9] W. Horper and F. J. Marner, Synthesis of primin and Miconidin and its

derivatives, Phytochemistry, 41 (1996), 451-456.

[10] B. M. Hausen, H. Heitsch, B. Borrmann, D. Koch, R. Rathmann, B. Richter

and W. A. König, Structure-activity relationships in allergic contact dermatitis,

Contact Dermatitis, 33 (1995), 12-16.

[11] D. J. Brondani, L. W. Bieber, Regioselective Lithiation and alkylation of 2-

methoxy-hydroquinone, Química Nova, 18 (2) (1995), 144-146.

[12] C. A. Winter, E. A. Risley, G. W. Nuss, Carragenin-induced edema in hind

paw of rat as the assay for antiinflammatory drugs, Proc. Soc. Exp. Biol. (NY)

3 (1962) 544-547.

51

Capítulo 3

Artigo II - Síntese e Atividade Antitumoral de um Novo Pró-fármaco da Primina.

52

SÍNTESE E ATIVIDADE ANTITUMORAL DE UM NOVO PRÓ-

FÁRMACO DA PRIMINA

Dalci José Brondani1*, Célio Ricardo M. Nascimento1 Ivone A. de Souza2,

Lothar W. Bieber3 e Ana Cristina Lima Leite1

1LABSINFA - Departamento de Ciências Farmacêuticas

2Departamento de Antibióticos, 3Departamento de Química Fundamental.

Universidade Federal de Pernambuco - Rua Prof. Artur Sá S/N, CDU, 50740-520, Recife,

Pernambuco - Brasil – dalci@ufpe.br

53

Resumo. A primina, 3-metoxi-6-pentil-1,4-p-benzoquinona, um forte alergênico, isolado primeiramente da Primula obconica (Primulaceae), apresenta significativa atividade antimicrobiana e antitumoral. A primina chegou a ser usada no tratamento de câncer de pele humano, mas teve seu uso interrompido devido ao seu efeito irritativo pronunciado. Atualmente, existem vários métodos simples, diretos e generalizáveis para preparação de análogos da primina. Visando obter um fármaco protótipo otimizado, com melhor perfil farmacoterapêutico, sintetizamos o composto intermediário da síntese da primina, o 2-metoxi-6-pentil-1,4-hidroquina-bis (2’-tetrahidropiranil) éter (P-MHQ-THP), partindo do 2-metoxi-1,4-hidroquina-bis (2’-tetrahidropiranil) éter (MHQ-THP). A avaliação da toxicidade aguda para o P-MHQ-THP, demostrou que, assim como para o seu precursor o MHQ-THP, o composto testado nas doses de 1000 mg/Kg e 2000 mg/Kg, possui baixa toxicidade quando comparado a primina, que apresenta DL50 de 12 mg/Kg. Na avaliação da atividade antitumoral, os resultados encontrados para as doses terapêuticas testadas de 10 e 100 mg/Kg do P-MHQ-THP, também indicam um bom perfil de inibição antitumoral, respectivamente de 73,0% e 79,81% de inibição para o sarcoma 180 (S180) e 69,8 e 71,30 % para o carcinoma de Erhrlich sólido (ES). Esses resultados são animadores quando comparados aos valores obtidos tanto para o MHQ-THP, que na dose de 100mg apresentou inibição de 70,7% para o S180 e 60,83% para o ES, quanto para a primina, 3que nas doses de 8 e 5 mg/Kg, apresentou inibição tumoral respectivamente de 72,0% e 66,7% para o S180 e na dose de 5 mg/Kg de 55,6% para o ES, principalmente considerando que a dose terapêutica para a primina ficou bem próxima ao limiar de toxicidade. Summary. The primin, 3-methoxy-6-pentyl-1,4-p-benzoquinone, a strong allergenic, isolated firstly of the Primula obconica (Primulaceae), it presents significant antimicrobial and antitumour activity. The primin arrived to be used in the treatment of skin human's cancer, but she had its use interrupted due to its effect pronounced irritant. actually, exist several simple, direct and generalized methods for preparation of analogous of the primin. Seeking to obtain a prodrug, with better therapeutic profile, we synthesized the intermediate reaction product of the synthesis of the primin, the 2-methoxy-6-pentyl-1,4-hidroquinone-bis (2'-tetrahidropyranyl) ether (P-MHQ-THP), leaving of the 2-methoxy-1,4-hidroquinnone-bis (2'-tetrahidropyranyl) ether (MHQ-THP). The evaluation of the toxicity profile for P-MHQ-THP, showed that, as well as for its precursor MHQ-THP, the compound tested in the doses of 1000 mg/Kg and 2000 mg/Kg, possesses low toxicity profile when compared to the primin, that presents LD50 of 12 mg/Kg. In the evaluation of the antitumour activity, the results found for the tested therapeutic doses of 10 and 100 mg/Kg of P-MHQ-THP, also indicate a good profile of tumour inhibition, respectively of 73,0% and 79,81% of inhibition for sarcoma 180 (S180) and 69,8 and 71,30% for the Erhrlich carcinoma solid (ES). Those results are exciting when compared to the values obtained so much for MHQ-THP, that presented inhibition of 70,7% for S180 60,83% ES, as for the primin, that in the doses of 8 and 5 mg/Kg, it presented tumour inhibition respectively of 72,0% and 66,7% for the S180 and in the dose of 5 mg/Kg of 55,6% for ES, mainly considering that the therapeutic dose for the primin was very close to the toxicity threshold.

PALAVRAS CHAVE: Quinonas, primina, atividade antitumoral e atividade antiinflamatória. KEY WORDS: Quinones, primin, Antitumour activity and antiiflammatory activity.

* Autor a quem a correspondência deverá ser enviada. E-mail: dalci@ufpe.br

54

1. INTRODUÇÃO

As quinonas representam a maior classe entre os compostos quinonoídicos

e, em adição as que ocorrem na natureza, há um grande número de outras

quinonas simples e complexas que tem sido sintetizados 1.

Algumas dessas quinonas tem apresentado interessante atividade

biológica. Em especial as benzoquinonas têm se destacado por mostrar

freqüentemente ação antimicrobiana 2, em alguns casos antitumoral 3 e 4,

tripanocida 5 e supressora alimentar em insetos 6.

Dentre as benzoquinonas de estrutura simples, encontramos vários

compostos 2-metoxi-1,4-benzoquinonas alquil substituídos com potencial biológico

relevante. Entre esses compostos, um merece destaque, a primina (2-metoxi-6-

pentil-1,4-benzoquinona) (1), um forte alergênico isolado pela primeira vez por

Bloch & Karrer em 1927 7 da Primula obconica (Primulaceae) e que provoca

severa dermatite de contato 8.

Lima et al. 9 Isolaram a primina do extrato bruto metanólico das raízes da

árvore Miconia eridonta (Melastomaceae), relatando posteriormente os primeiros

informes sobre sua atividade antitumoral e antimicrobiana. Após estudos clínicos

10, a primina chegou a ser utilizada no tratamento de câncer de pele humano 3,

mas seu uso tornou-se restrito devido ao seu efeito irritativo (Figura 1).

55

O

O

OMe

(1)

Figura 1. Primina

A primeira síntese da primina foi realizada por Schildknecht & Schmidt em

1967 11, confirmando a estrutura proposta para o produto natural. Partindo da o-

vanilina a síntese foi realizada em 6 etapas, obtendo rendimento global baixo.

Outras sínteses foram realizadas, mas sempre em baixo rendimento e com

número elevado de etapas.

Atualmente há métodos simples, diretos e generalizáveis para preparação

de análogos da primina com diferentes substituintes alquílicos em posições

estruturais distintas (3,5 e 6 alquil substituídos), mostrando boa atividade

biológica, mas ainda com pronunciada toxicidade 12, 13, 14, 15 e 16.

Esses métodos empregados na preparação de análogos da primina

baseiam-se na introdução de substituintes via metalação e alquilação

regioseletiva. Este tipo de reação exige uma proteção das hidroxilas presentes a

fim de evitar reações indesejadas. Um grupo protetor largamente usado na síntese

de análogos da primina é o grupo tetrahidropirano (THP) devido a sua relativa

estabilidade em meio básico e facilidade de introdução e remoção em meio ácido.

56

Recentemente sintetizamos o composto intermediário 2-metoxi-6-pentil-1,4-

hidroquina-bis (2’-tetrahidropiranil) éter (MHQ-THP) 17, na avaliação da atividade

biológica deste composto foi constado que o mesmo apresenta baixa toxicidade e

efetiva atividade antitumoral quando comparado a primina.

Visando obter um fármaco protótipo otimizado, com melhor perfil

farmacoterapêutico, sintetizamos um composto intermediário, precursor da

primina, o 2-metoxi-6-pentil-1,4-hidroquina-bis (2’-tetrahidropiranil) éter, e

avaliamos sua atividade antitumoral e antiinflamatória, buscando estabelecer uma

relação entre estrutura química – atividade biológica.

1.1. Parte Química

A literatura mostra vários métodos de obtenção da primina (1) e seus

análogos estruturais utilizando diversas vias sintéticas e diferentes compostos de

partida. O composto 2-metoxi-6-pentil-1,4-hidroquinona-bis (2’-tetrahidropiranil)

éter (P-MHQ-THP) (3) foi obtido a partir da proteção da 2-metoxi-hidroquinona (2)

com dihidrofurano (DHP), seguida da litiação e subseqüente alquilação 13, 14, 15 e 16

(Esquema 1).

Todos os espectros de 1H-NMR foram registrados em um equipamento

Varian UNITY plus-300 MHz utilizando DMSO-d6 como solvente e tetrametilsilano

(TMS) como padrão interno. Os espectros de infravermelho (IVTF) foram obtidos

usando pastilhas de KBr. A cromatografia em camada delgada (CCD) foi realizada

em placas de sílica gel (0.2 mm, E. Merck). Os cromatogramas foram visualizados

57

com luz ultravioleta (UV). Para cromatografia em coluna, foi utilizada sílica

Kiesegel 60 (230-400 mesh, E. Merck). Todos os reagentes usados neste trabalho

foram de grau analítico.

OH

OH

OCH3O

TOSOH / THF

OTHP

OTHP

OCH31) n-ButLi / THF

2) C5H11Br

OTHP

OTHP

OCH3H11C5

84% 60%

(1) (2) (3)

ESQUEMA 1.

Síntese do composto P-MHQ-THP (3) a partir da do MHQ-THP via litiação seguida

de alquilação regioseletiva

2. Procedimento Experimental

2.1. Química

2.1.1. 2-metoxi-1,4-hidroquina-bis (2’-tetrahidropiranil) éter (2)

Em uma solução de 20 de mmol de (1) em 20 mL de THF seco, foi

adicionada à 0oC, 50 mmol de 3,4-dihidro-2H-pirano e 50 mg de ácido p-

58

toluenosulfonico anidro, como catalisador. Esta mistura foi mantida a 00C, em

ambiente anidro e sob atmosfera de argônio, por 2 h. Em seguida permaneceu na

geladeira a 50C por 15 h. Foram adicionados, logo após, 10 mL de 10% hidroxido

de sódio. A mistura foi diluída com 100 mL de água e foi extraída com ciclohexano

(3 x 30 mL). O extrato foi lavado com NaOH 10% (2 x 20 mL) e com mais 50 mL

de água. Depois foi seco com K2CO3 anidro. O solvente foi evaporado à vácuo e o

resíduo oleoso purificado em coluna de sílica de gel (20 g), eluido inicialmente

com tolueno/ciclohexano 1:1 e passando gradativamente para tolueno puro. O

redimento foi de 5,126 g (84%) de um óleo incolor. 1H-RMN (CDCl3; δ= ppm)

1,46-2,06 (m, 12H); 3,86 (s) sobreposto a 3,40-4,10 (m, total 7H); 5,20-6,45 (m,

2H); 6,57 (dd, 1H, J=8,69Hz e 2,69Hz); 6,63 (d, 1H, J=2,69); 7,01 (d, 1H, J=8,69

Hz). IVTF (KBr): νasCH3 2835 cm-1; νsCH3 2960 cm-1; ν C=Canel 1570 cm-1, 1500

cm-1; νsC-O-C 1250 cm-1; νasC-O-C 1100 cm-1; ν C=C 690 cm-1.

2.1.2. 2-metoxi-6-pentil-1,4-hidroquina-bis (2’-tetrahidropiranil) éter (3)

A uma solução de 1,0 mmol de (2) em 10 mL de THF seco, e 2,0 mmol de

tetrametil etileno diamida (TMEDA) foi adicionado 1,0 mmol de n-ButLi, a – 100oC,

deixando reagir por 2 h, até chegar a –10oC, quando foi adicionado 1,0 mmol de

brometo de pentila, deixando reagir por 15 h. A extração e purificação foram

efetuadas como descrito para o composto anterior. Rendimento 0,227 g (60%) de

um óleo incolor. 1H-RMN (CDCl3; δ=ppm): 0,96 (t, 3H, J = 7,5Hz); 1,20-2,22 (m,

59

18H); 2,50-2,86 (m, 2H); 3,90 (s) sobreposto a 3,42-4,26 (m) (total 7 H); 4,95-5,60

(m, 2 H); 6,58 (d, 1H, J=2,69Hz); 6, 64(d, 1H, J=2,6Hz). IVTF (KBr): νasCH3 2835

cm-1; νsCH3 2960 cm-1; ν C=Canel 1570 cm-1, 1500 cm-1; νsC-O-C 1250 cm-1; νasC-

O-C 1100 cm-1; ν C=C 690 cm-1.

2.2. Estudos Biológicos

2.2.1. Toxicidade Aguda – Testes de Efeitos Gerais

O teste de toxicidade aguda para o composto P-MHQ-THP foi realizado

através de via intraperitonial (i.p.), nas concentrações de 1000 e 2000 mg/ kg de

peso corpóreo, com grupos de 6 camundongos albinos suíços para cada dosagem

administrada, com peso variando entre 25-30 g. Os composto foram solubilizados

com solução fisiológica (0,9% de NaCl, p/v) e Tween 80, o grupo controle recebeu

apenas solução fisiológica (0,9% de NaCl, p/v). Os animais foram monitorados

continuamente por 72 horas, segundo o método descrito por Malone e Carlini 18.

2.2.1. Atividade Antitumoral

Os testes de atividade antitumoral in vivo, seguindo à técnica descrita por

Stock 19, foram realizados com tumores transplantáveis sarcoma 180 (S180) e

carcinoma de Erhrlich sólido (ES) em camundongos albinos suíços. Quarenta e

60

oito horas após a implantação dos tumores foi iniciado o esquema terapêutico com

o composto testado. O tratamento teve duração de oito dias, com uma dose diária

de 100 mg/Kg/dia utilizando via intraperitonial (i.p.). No oitavo dia, os animais

foram sacrificados e os tumores isolados e pesados, e a inibição do crescimento

tumoral calculada em comparação ao grupo controle. Foram realizados três

experimentos para cada dose testada.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

3.1. Determinação da Toxicidade Aguda

Os animais testados não apresentaram reações diversificadas. As reações

verificadas no experimento se caracterizaram com sendo neurovegetativas, com

respostas estimulantes e depressoras. Os sinais clínicos para ambas doses de

1000 mg/kg e 2000 mg/kg incluíram movimentos esteriotipados, piloereção,

alteração do sistema músculo-esquelético, falta de coordenação motora,

hiperatividade, tremores, convulsão clônica e prostração. Nenhuma morte foi

observada durante período de experimentação.

É importante salientar que os mesmos resultados foram observados

também para o composto MHQ-THP 17 em seu ensaio de toxicidade aguda, o que

evidencia a contribuição do grupamento THP para a diminuição desta em relação

ao composto protótipo primina. Os precursores MHQ-THP e P-MHQ-THP

revelaram-se bem menos tóxicos. Uma vez que, de acordo com a literatura 10 e 12 ,

61

a primina tem uma DL50 de 12 mg/Kg, ou seja, a princípio 100 vezes mais tóxica

que os precursores. Mesmo considerando que o P-MHQ-THP tem massa 45%

maior que a primina, o que reduz em quase pela metade a concentração

administrada deste princípio ativo, ainda assim o efeito tóxico foi

consideravelmente menor.

3.2. Avaliação da Atividade Antitumoral

Os testes de atividade antitumoral realizados com a primina e os seus

diversos análogos já sintetizados 10, 12 e 14 mostraram, de modo geral, um bom

efeito inibitório, mas com o problema da dose aplicada está, geralmente, bem

próximo ao limiar de toxicidade. Os resultados obtidos mostram que o composto

P-MHQ-THP (3) apresenta uma boa taxa de inibição tumoral. Para o P-MHQ-THP,

nas doses terapêuticas de 10 mg/Kg e 100 mg/Kg, tivemos 73,0 e 79,81% de

inibição para o S180 e 69,30 e 71,30 % para o ES, conforme indica a tabela 1.

Quando comparado ao precursor, MHQ-THP, constatamos que o composto

P-MHQ-THP, substituído na posição 6 por um grupo pentil, apresentou um perfil

de atividade antitumoral ligeiramente melhor. O que sugere que a introdução do

grupo pentila na posição 6 altera a lipofilia da molécula de forma a facilitar sua

absorção.

62

TABELA 1. Atividade antitumoral para os seguintes compostos: Primina, MHQ-

THP e P-MHQ-THP.

Composto Dose

(mg/Kg/dia)

No de

sobreviventes

Inibição

(%) Tumor

Primina O

O

OMeH11C5

8

5

5

5/6

6/6

6/6

72,00

66,70

55,60

S180

S180

ES

100

6/6

70,70

S180

MHQ-THP

OTHP

OTHP

OCH3

100 6/6 60,83 ES

10

6/6

73,00

S180

100 6/6 79,81 S180

10 6/6 69,30 ES

P-MHQ-THP OTHP

OTHP

OCH3H11C5

100 6/6 71,30 ES

Contudo, o composto MHQ-THP apresenta também uma boa taxa de

inibição tumoral na dose terapêutica testada de 100 mg/Kg, respectivamente,

63

70,7% para o S180 e 60,83% par o ES, o que mostra uma relevante melhora da

atividade inibitória tumoral para essa classe de compostos (proteção com o grupo

THP) em relação ao composto protótipo, a primina, que apresentou inibição nas

doses testadas de 5 e 8 mg/Kg, respectivamente, de 66,7% e 72,0% pra o S180 e

na dose de 5 mg/Kg apresentou inibição de 55,6% para o ES. Sendo que na dose

de 8 mg/Kg para o S180 apresentou um óbito.

Ë importante considerar o fato que o produto P-MHQ-THP com a presença

do grupo protetor THP quase dobra a massa molecular (45% a mais) em relação

ao composto protótipo, a primina. Desta forma, a dose administrada possui quase

a metade da concentração de princípio ativo (primina), e mesmo assim,

apresentou uma resposta inibitória tumoral mais eficiente, enquanto com os

compostos MHQ-THP e P-MHQ-THP não foi registrado nenhum óbito entre os

animais tratados.

Ao aumentar a dose do P-MHQ-THP de 10 mg/Kg para 100 mg/Kg houve

um acréscimo na resposta terapêutica, passando a inibição tumoral

respectivamente para 79,81 para o S180 e 71,30 para o ES, sem haver

manifestações dos efeitos deletérios verificados para a primina.

Após analisar os resultados das respostas inibitórias frente aos tumores

S180 e ES constatamos que o composto P-MHQ-THP, além de apresentar uma

significativa inibição frente aos tumores, sem apresentar óbito entre os animais

teste, apresenta-se como um potencial pró-fármaco.

Os resultados da inibição significativa frente aos tumores S180 e ES podem

ser melhor visualizados na figura 1.

64

o e e o

méto

comp

verifi

revel

tóxic

MHQ

Control

Figura 1. Comparação entre os tumores tr

grupo controle (à esquerda para o S180

4. CONCLUSÕES

Na preparação dos precursores MHQ-THP

dos simples, econômicos e generalizáveis d

ostos foram obtidos com bons rendimentos.

Na avaliação do perfil de atividade biológi

camos que a proteção das hidroxilas da 2

ou que os derivados MHQ-THP e P-MHQ-T

o que a primina e seus análogos.

Verificamos que, a avaliação da atividade

-THP, apresentou um perfil de redução

Tratad

atados com o com

e à direita para o E

e P-MHQ-THP, fo

escritos na literatu

ca, o teste de toxi

-metoxihidroquino

HP são potencial

antitumoral para

tumoral superior

Control

Tratad

posto (3) e o

S)

ram utilizados

ra. Todos os

cidade aguda

na com DHP

mente menos

composto P-

ao reportado

65

anteriormente para a primina 10 e 12, cuja dose terapêutica fica próxima ao limiar de

toxicidade, o que não ocorre com o composto testado.

5. AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnologico (CNPq), a Fundação de Amparo a Ci6encia e Tecnologia

do Estado de Pernambuco (FACEPE) e ao Banco do Nordeste pelo suporte

financeiro.

66

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. POWIS, G.; Quinoid Anticancer Agents, Pharm. Ther. Vol. 35, pp. 57-162, 1987.

2. DI MARCO, A.; ARCAMONE, F., ZUNINO, F.; Antibiotics, 3, 101, 1975.

3. MELO, A. M.; JARDIM, M. L.; SANTANA, G. F. de; LIMA, O. G. de; D`ALBUQUERQUE, I. L.; LACET, Y; Primeiras Observações do Uso Tópico da Primina, Plumbagina e Maitenina em Pacientes Portadores de Câncer de Pele; Rer. Inst. Antib., Recife, 14 (1/2), 9, 1974.

4. SANTANA, C. E. de; LIMA, O. G. de; D`ALBUQUERQUE, I. L.; LACERDA, A. L.; MARTINS, O. G., Observações Sobre as Propriedades Antitumorais e Toxicológicas do Extrato do Líber e de Alguns Componentes do Cerne do Pau D’arco; Rer. Do Inst. De Antib., Recife, 8, 89, 1968.

5. MELO, E. J. T.; AMARAL, P. C.; ANDRADE, P. P.; ANDRADE, C. R.; Sensitivy of Lower Trypanosomatides to Anti-Trypanosoma Cruzi Drugs, Anais XIV. Enc. Anal Pesq. Bras. Doenças de Chagas, Caxanbu-MG, (1984).

6. BERNAYS, E.; LUPI, A.; MARINI BETTOLO, R; MASTROFRANCESCO, C.; TAGLIATESTA, P; Antifeedant Nature of the Quinone Primin and its Quinol Miconidin from Miconia spp.; Experienta. 40, 1010-1011, (1984).

7. BLOCH, B.; KARRER, P.; Beiblat Zur Vierteljahresschrif Der Naturforsch., 22 (3), 36 (1967).

8. KÖNIG, W. A.; FAASCH, W.; HEITTSCH, H.; COLBERG, C.; HAUSEN, B. M.; Synthese Von Seittnkettenmodifiziertn Analogem des Allergens Primin; Z. Naturforsch. 48b, 387-393(1993).

67

9. LIMA, O. G.; MARINI-BERTTOLO, G. B.; MONACHE, F. D.; COÊLHO, J. S. B; D’ALBUQUERQUE, I. L.; MACIEL, G. M; LACERDA, A.; MARTINS, D. G.; Substâncias Antimicrobianas de Plantas Superiores, Revista do Instituto de Antibióticos, Recife, Vol. 10 No. (1 2), 29-34, 1970.

10. COTIAS, C. F.; PINTO, K. V.; LACERDA, A. L.; MARTINS, D. G.; Propriedades Farmacológicas da Primina; Rev. Inst. Antib., Recife, 14, 17, 1974.

11. SCHILDKNECHT, H.; SCHMIDT, H.; Synthesen und Eigenschaften des Primins und seiner Isomeren; Zeitschrif Naturforsch, 22B, 287, 1967.

12. ROLIM NETO, P. J.; Síntese de 2-metoxi-p-benzoquinonas 3,5 e 6 alquil substituídas, dissertação de mestrado, Departamento de Ciências Farmacêuticas e Antibióticos, UFPE, Recife, 1988.

13. BIEBER, L. W.; CHAPPETA, A. A.; SOUZA, M. A. M.; GENERINO, R. M.; Simple Syntese of Primin and Its Analogues Vai Lithiation of Protected Gauiacol, Jounal of Natural Products, Vol. 53, No. 3, 706-709, May-Jun 1990.

14. BRONDANI, D. J., Litiação e Alquilação Regioseletivas de 2-metoxihidroquinona, dissertação de mestrado, Departamento de Ciências Farmacêuticas, UFPE, Recife, 1991.

15. BRONDANI, D. J.; BIEBER, L W.; regioselective Lithiation and Alkylation of 2-Methoxy-Hydroquinone, Química nova, Vol. 18, No. 2, 144-146, 1995.

16. BIEBER, L. W; ROLIM NETO, P.; GENERINO, R. M.; Regioselective Alkylation of Substituted Quinones by Trialkylboranes, Terahedron Letters, 40, 4473-4476, 1999.

17. BRONDANI, D. J.; NASCIMENTO, C. R. M.; de SOUZA, I. A.; BIEBER, L. W.; LEITE, A. C. L. Synthesis, Antitumour and Antiflammatory Activities of a Primin Precursor. IL FARMACO, 2004 (submetido)

68

18. a) CARLINI, E. A.; OLIVEIRA, M. G. M.; Monteiro, M. G. MACAÚBAS, C.; BARBOSA, V. P.; Pharmacologic and Toxicologic Esseects of Two Maytenys Species. In: laboratory Animals. J. Ethnopharmacology, 34, 29-41, 1991. b) Malone, H. H; Natural Products and Plants Drugs Phamacological or Therapeutical Activity, 1977.

19. STOCK, C. C.; CLARCK, D. A.; PHILIPS, F.; Sarcoma 180 – Inibition of Screening Date. Cancer Research, 1977. 2: 2-3, 1955.

69

Capítulo 4

Artigo III – Avaliação da Atividade Antimicrobiana de Derivados Acetoxilados

da Primina.

70

Avaliação da Atividade Antimicrobiana de Derivados

Acetoxilados da Primina.

Dalci José Brondani1*, Célio Ricardo M. Nascimento1 Janete Magali de

Araújo2 e Ana Cristina Lima Leite1

1LABSINFA - Departamento de Ciências Farmacêuticas 2Departamento de Antibióticos, Universidade Federal de Pernambuco - Rua Prof. Artur Sá

S/N, CDU, 50740-520, Recife, Pernambuco - Brasil – dalci@ufpe.br

Resumo: A primina, 3-metoxi-6-pentil-1,4-p-benzoquinona, é um forte alergênico, isolado primeiramente da Primula obconica (Primulaceae) e apresenta significativa atividade antimicrobiana e antitumoral. Visando, principalmente, minimizar custos e facilitar a obtenção de novos derivados da primina, idealizamos uma série de compostos, onde procuramos utilizar vias sintéticas simples e reagentes de fácil aquisição. A preparação do ácido 4-oxo(2,5-diacetoxifenil)butanóico (6) foi realizada em duas etapas, a partir da acetoxilação da hidroquinona com anidrido acético catalisado por ácido sulfúrico e subseqüente reação de Friedel-Crafts com anidrido succínico e cloreto de alumínio. Para o composto 2-metil-1,4,5-triacetoxibenzoquinona (9) a via sintética escolhida foi através da oxidação da 2-metilhidroquinona (7) com óxido de manganês e ácido sulfúrico, obtendo a toluquinona (8), que foi posteriormente acetoxilada (reação de Thiele), Os diferentes intermediários e os produtos obtidos foram testados quanto a sua atividade antimicrobiana frente a algumas espécies de microorganismos Gram-positivos, Gram-negativos e fungos. Todos os derivados acetoxilados foram sintetizados com bons rendimentos e o conjunto dos resultados mostra que as modificações implementadas não contribuíram para a atividade antimicrobiana, evidenciando, entretanto, a importância das hidroxilas livres.

Summary: The primin, 3-methoxy-6-pentyl-1,4-p-benzoquinone, it is a strong allergenic,

isolated firstly of the Primula obconica (Primulaceae) and it presents significant antimicrobial and antitumour activity. Seeking, mainly, to minimize costs and to facilitate the obtaining of new derivetes of the primin, we idealized a series of compounds, where we tried to use simple synthetic ways and drug of easy acquisition. The preparation of the 4-oxo(2,5-diacetoxyfenyl)butanoic acid (6) it was accomplished in two steps, starting from the acetylation of the hydroquinone with acetic anhydride catalyzed by sulfuric acid and subsequent Friedel-Crafts reaction. For the compound 2-methyl-1,2,5-triacetoxybenzoquinone (9) the chosen synthetic way went through to oxidation of 2-methylhydroquinone (7) with oxide of manganese and sulfuric acid, obtaining the toluquinone (8), that was acetylated later on (Thiele reaction), The differents intermediates and the obtained products were tested with relationship its antimicrobial activity front to some species of Gram-positive, Gram-negative microorganisms and fungus. Everybody acetylated derivetes was synthesized with good yield and the results exhibition that the implemented modifications didn't contribute to the antimicrobial activity, evidencing, however, the importance of the free hidroxyl groups..

PALAVRAS CHAVE: Quinonas, derivados da primina, atividade antmicrobiana. KEY WORDS: Quinones, primin derivates, antimicrbial activity.

* Autor a quem a correspondência deverá ser enviada. E-mail: dalci@ufpe.br

71

1. INTRODUÇÃO

Dentre os muitos compostos encontrados na natureza um pequeno grupo,

as quinonas 1 e 2, tem despertado interesse especial devidos as suas propriedades

biológicas. Muitas dessas quinonas apresentam ação antimicrobiana 3, antitumoral

4 , tripanocida 5 e supressora alimentar em insetos 6 . Em especial podemos citar,

entre as estruturas mais simples deste grupo, algumas séries de compostos 2-

metoxi-1,4-benzoquinonas alquil substituídas, que possuem atividade biológica.

Entre estes compostos, vários antibióticos das séries 6-alquil-2-metoxi-1,4-

benzoquinonas (1) já foram isolados e identificados, entre eles o antibiótico 6-

metil-2-metoxi-1,4-benzoquinona (1a), isolado de culturas de Aspergillus sp 7,

outro antibiótico é o 2-metoxi-6-propil-1,4-benzoquinona (1b) isolado de Camarops

microspora 8 e o mais importante desta série, o composto 2-metoxi-6-pentil-1,4-

benzoquinona, a primina (1c), isolada primeiramente por Bloch & Karrer 9 em 1927

da Primula abconica, uma planta ornamental que provoca reações alérgicas

devido a secreção desta quinona.

Lima et al. 10 isolaram a primina do extrato bruto metanólico das raízes da

árvore Miconia eridonta (Melastomaceae), de nome vulgar “Pau-Mondé, relatando,

posteriormente, os primeiros informes sobre sua atividade antimicrobiana e

antineoplásica. A análise farmacológica 11 e os testes clínicos 7 e 11 realizados

permitiram a sua comercialização e utilização para o tratamento do câncer de pele

humano. Posteriormente, a primina foi retirada do mercado devido à baixa procura

e ao efeito alérgico pronunciado (Figura 1).

72

(1)

O

O

R O M e1 a . , R = C H 3 1 b . , R = n - C 3 H 7 1 c . , R = n - C 5 H 1 1 ( p r i m i n a )

Figura 1. 2-metoxiquinonas 6 substituídas

A primeira síntese da primina foi realizada em 1967 por Schildknecht &

Schmidt 12, confirmando a estrutura proposta para o produto natural. Esta síntese

mostrou baixo rendimento, além do composto de partida ser relativamente caro.

Na tentativa de se obter a primina e seus análogos estruturais, outros

métodos foram propostos, utilizando outras vias sintéticas e outros compostos de

partida 13, 14, 15, 16 e 17. Atualmente existem vários métodos de preparação dos

diferentes análogos da primina. Mas esses métodos ainda são complexos e

utilizam, no geral, reagentes caros.

Os métodos empregados na preparação de análogos da primina baseiam-

se na introdução de substituintes via metalação e alquilação regioseletiva. Este

tipo de reação exige uma proteção das hidroxilas presentes, a fim de evitar

reações indesejadas. Um grupo protetor largamente usado é o tetrahidropirano

(THP) devido a sua relativa estabilidade em meio básico e facilidade de introdução

e remoção em meio ácido. Além disso, resultados recentes indicam que os

73

compostos intermediários de síntese, protegidos com THP, apresentam atividade

biológica superior à primina e seus análogos, com a vantagem de apresentar

baixa toxidade18.

Com o objetivo de obter um novo candidato a fármaco mais potente e

menos tóxico e visando, principalmente, minimizar custos e facilitar a obtenção de

novos derivados da primina, idealizamos uma série de compostos, onde

procuramos utilizar vias sintéticas simples e reagentes de fácil aquisição.

Para atingir este objetivo, escolhemos para substituir o grupamento THP na

proteção das hidroxilas, o grupamento acetoxi. A acetoxilação de compostos

quinonoídicos tem sido bem estudada, Thiele 19 propôs um método para a

acetoxilação de quinonas através da reação desta com anidrido acético catalisada

por ácido sulfúrico. Wilgus e Gates (1967) 20 reportaram em suas investigações

que toluquinona reagindo com anidrido acético e ácido sulfúrico produz um

rendimento de 90% de uma mistura de 78% de 2,4,5-triacetoxi e 14,5% de 2,3,5-

isômero. (esquema 1.)

Ainda dentro do contexto de modificação estrutural, o composto (11) foi

planejado visando uma possível potencialização da atividade biológica com a

introdução do grupo ácido carboxílico, assim como, posteriormente, facilitar a

condensação com aminoácidos, obtendo um pró-fármaco direcionado para o

princípio da latenciação.

74

O

O

Ac2O

H2SO4

OAc

OAcOAc

OAc

OHOAc

OAc

OHOAc

H

(2) (3) (4) (5)

ESQUEMA 1. Reação de Thiele 19

O

O

H3CAc2O / H2SO4

3 h, 55-60oC

OAc

OAc

H3C

OAc

+

OAc

OAc

H3C OAc

(6) (7) 2,4,5-Isômero (8) 2,3,5-Isômero

78% 14,5%

ESQUEMA 2. Acetoxilação da toluquinona (6), Wilgus & Gates 20

Química

A preparação do ácido 4-oxo(2,5-diacetoxifenil)butanóico (11) foi realizada

em duas etapas, a partir da acetoxilação da hidroquinona com anidrido acético

75

catalisado por ácido sulfúrico 21 e subseqüente reação de Friedel-Crafts, com

anidrido succínico e cloreto de alumínio como catalisador (Esquema 3).

40' - 2h5 mim.

OH

OH

Ac2O

H2SO4

OAc

OAc

O OO

AlCl3

OAc

OAc

COOH

O

HCl+

(60-70) oC 130-200 oC

(9) (10) (11)

ESQUEMA 3.

Síntese do composto 4-oxo(2,5-diacetoxifenil)butanóico

Para o composto 2-metil-1,4,5-triacetoxibenzoquinona (13) a via sintética

escolhida foi através da oxidação da 2-metilhidroquinona (12) com óxido de

manganês e ácido sulfúrico, obtendo a tuloquinona (6), que foi posteriormente

acetoxilada (reação de Thiele) 19, 20 e 21 (Esquema 4).

2. Procedimento Experimental

Parte Química

Todos os espectros de 1H-NMR foram registrados em um equipamento

Varian UNITY plus-300 MHz utilizando DMSO-d6 e CDCl3 como solventes e

76

tetrametilsilano (TMS) como padrão interno. O ponto de fusão foi determinado

utilizando um equipamento Quimis Mod. Q340.23 e os resultados foram expressos

sem correção. A cromatografia em camada delgada (CCD) foi realizada em placas

de sílica gel (0.2 mm, E. Merck). Os cromatogramas foram visualizados com luz

ultravioleta (UV). Para cromatografia em coluna, foi utilizada sílica-gel 60 (230-400

mesh, E. Merck). Todos os reagentes usados neste trabalho foram de grau

analítico.

OH

OH

CH3 MnO2

H2O / H2SO4

O

O

CH3

(65-70) oCt.a.

Ac2O

H2SO4

OAc

OAc

CH3

AcO

(12) (6) (13)

ESQUEMA 4.

Síntese do composto 2-metil-1,4,5-triacetoxibenzoquinona

Diacetoxilação da hidroquinona (9)

A 50 mmol (5,5 g) de hidroquinona, foram adicionados 100 mmol (9,5 ml) de

anidrido acético e 5-10 gotas de H2SO4 concentrado. Deixando a mistura reagir à

5oC por 5 minutos, sob agitação constante. Em seguida a mistura foi filtrada e

77

lavada com 50 mL de água destilada em pequenas porções. Após evaporação o

resíduo cristalino foi recristalizado três vezes com 10 mL de etanol/água 1:1. O

rendimento foi de 65-70% de cristais incolores. Ponto de Fusão: 122oC e o Rf foi

de 0,57 (sist. hex./act. 8:2). 1H-RMN (CDCl3): 2,15 (s, 6H); 7,15 (s, 4H).

Ácido 2-4-oxo(2,5-diacetoxifenil)butanóico (11)

Em balão seco, foram adicionados 41,7 mmol (5,6 g) de cloreto de alumínio

e 13,9 mmol (1,4 g) de anidrido succínico. A mistura foi aquecida a 130oC sob

atmosfera de argônio e foram adicionados 13,9 mmol de (10). O sistema foi

mantido nestas condições por 40 minutos, depois a temperatura foi elevada à

200oC e permaneceu reagindo por 1 h e 20 mim. A extração foi realizada com três

vezes de 10 mL acetato de etila . Após a evaporação do solvente, o resíduo foi

purificado por cromatografia de coluna com 10 g de sílica-gel 60 e eluido

inicialmente com hexano puro, passando para hexano/acetato de etila 5%. O

rendimento foi de 40% de cristais amarelos pálido e o Ponto de Fusão foi 115oC,

com Rf de 0,46 (sist. hex./act. 6:4). 1H-RMN (DMSO-d6) 2,22 (s, 6H); 2,58 (s, 2H);

3,36 (s, 2H); 6,72 (d, 1H, J=8,69Hz); 6,9 (d, 1H, J=8,69Hz); 9,4 (s, 1H).

Oxidação da 2-metoxihidroquinona (12)

A uma solução de 5 mL de água destilada, 5 mmol de toluquinona (6) e 1,0

mL de H2SO4 concentrado, foi adicionado 16 mmol (1,4 g) de MnO2. A mistura

78

reagiu por 15 minutos à temperatura ambiente. Posteriormente, foi lavada com 50

mL de água destilada e extraída com três vezes de 10 ml de éter. Em seguida foi

seca sob Na2SO4 anidro, filtrada e o solvente evaporado. O resíduo foi purificado

por cromatografia de coluna com 10 g de sílica-gel 60 e eluido com hexano puro.

2-metil-1,4,5-triacetoxibenzoquinona (13)

A 3 mmol do composto (6) foram adicionados 35 mmol (3,3 mL) de anidrido

acético e 15-20 gotas de ácido sulfúrico concentrado deixar reagir por 2 horas à

temperatura ambiente. Logo após a mistura foi lavada com 50 mL de água

destilada e extraída com 3 vezes de 10 ml de éter. A mistura foi seca sob Na2SO4

anidro e filtrada. Após a evaporação do solvente, o resíduo foi purificado por

cromatografia de coluna com 10 g de sílica-gel 60 e eluido com hexano. O

rendimento foi de 60% de cristais amarelos e o Ponto de Fusão foi 135oC, com Rf

de 0,70 (sist. hex./act. 6:4). 1H-RMN (CDCl3) 2,15 (s, 3H); 2,33 (s, 9H); 6,9 (s, 1H);

7,2 (s, 1H).

Atividade Antimicrobiana

Os diferentes intermediários e os produtos obtidos foram testados quanto a

sua atividade antimicrobiana frente a algumas espécies de microorganismos

Gram-positivos, Gram-negativos e fungos: Staphylococcus aureus W IA-02,

Bacillus subtilis IA-16, Escherichia coli IA-224, Micrococcus luteus IA-100, Candida

79

albicans IA-1007, Klesbisiela pneumoniae AI-396, Aspergillus niger IA-2003,

Pseudomonas auriginosa IA-416 (IA = Coleção de microrganismos do

Departamento de Antibióticos da UFPE).

A atividade antimicrobiana in vitro dos compostos sintetizados foi avaliada

de acordo com o método descrito por Bauer & Kirby 22. Esta técnica baseia-se na

inibição do crescimento de microrganismo na superfície do meio de cultura

inoculado, ao redor de um papel de filtro impregnado com a substância teste. Este

método é qualitativo e informa se o microrganismo é sensível ou resistente a um

determinado antibiótico.

Os resultados obtidos foram considerados positivos quando o halo de

inibição foi igual ou superior a 10 mm. Todos os produtos foram testados à

concentração de 25 mg/mL.

3. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Parte Química

Todos os derivados acetoxilados foram sintetizados e isolados por

cromatrografia em coluna com bons rendimentos e caracterizados por 1H-RMN, pf

e Rf.

Os métodos de síntese empregados mostraram-se eficazes na obtenção de

compostos acetoxilados, bem como, compostos que contenham, ligados ao seu

80

anel aromático, três grupamentos contendo oxigênio, assemelhado-se ao

composto protótipo, a primina.

Atividade Antimicrobiana

Os resultados do espectro antimicrobiano estão apresentados na tabela 1.

O produto de partida 2-metoxihidroquinona (12), apresentou o maior espectro de

inibição, chegando a inibir totalmente o crescimento do Micrococos luteus e obteve

halos de inibição de 41 mm para o Staphilococos aureus e 37 mm para o Bacillus

subitilis.

Os intermediário e produtos acetoxilados (10), (11) e (13) apresentaram

comportamento inibitório semelhantes frente à maioria de microrganismos

testados. O composto (11) foi o mais ativo de todos os compostos acetoxilados.

Apresentando halo de inibição de 15 mm para o Staphylococos aureus, de 12 mm

para o Bacillus subtilis e de 23 mm para o Micrococos luteus. Este comportamento

evidencia a importância das hidroxilas livres na atividade antibiótica, uma vez que

o composto (12), que possui duas hidroxilas livres, apresentou melhores

resultados, enquanto o composto (11), com apenas uma hidroxila na função ácido

da cadeia lateral, apresentou melhor espectro de inibição entre os produtos

acetoxilados.

81

Tabela 1. Espectro antimicrobiano dos compostos: Diacetoxiquinona (10), ácido 2-

4-oxo(2,5-diacetoxifenil)butanóico (11), 2-metoxihidroquinona (12), 2-metil-1,4,5-

triacetoxibenzoquinona (13).

HALO DE INIBIÇÃO (mm)

MICRORGANISMO (10) (11) (12) (13) Staphylococos aureus - 15 41 15

Bacilus subitilis - 12 37 10

Echerichia coli - - 13 -

Micrococos luteus 26 23 *IT -

Cândida albicans - - - -

Klesbisiela pneumoniae - - 13 -

Aspergilus niger - - - -

Pseudomonas auringinosa - - 10 -

*IT – Inibição Total

4. CONCLUSÕES

Para a preparação dos derivados acetoxilados da primina foram

empregados métodos econômicos, simples e generalizáveis. A proteção das

hidroxilas foi realizada usando o grupo acetoxi, através de reações simples e em

temperatura branda (60-70oC). O composto (6) foi obtido através de reação de

acilação de Friedel-Crafts, merecendo uma melhor avaliação biológica, além de

funcionar como protótipo para possíveis modificações moleculares, como a

82

condensação com aminoácidos, visando obter um pró-fármaco direcionado para o

princípio da latenciação.

Os resultados qualitativos da atividade antimicrobiana demonstram que

compostos como, por exemplo, o composto (12), merece ter uma avaliação mais

criteriosa quanto a determinação de sua Concentração Mínima Inibitória (CMI).

O conjunto dos resultados mostra que as modificações implementadas não

contribuíram para a atividade antimicrobiana, evidenciando, entretanto, a

importância das hidroxilas livres.

5. AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Desenvolvimento

Científico e Tecnologico (CNPq), a Fundação de Amparo a Ciência e Tecnologia

do Estado de Pernambuco (FACEPE) e ao Banco do Nordeste pelo suporte

financeiro.

83

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. THOMSON, R. H., Naturally Occuring Quinones, 2th ed. London, Academic Press, 1971.

2. POWIS, G.; Quinoid Anticancer Agents, Pharm. Ther. Vol. 35, pp. 57-162,

1987.

3. DI MARCO, A.; ARCAMONE, F., ZUNINO, F.; Antibiotics, 3, 101, 1975.

4. SANTANA, C. E. de; LIMA, O. G. de; D`ALBUQUERQUE, I. L.; LACERDA, A. L.; MARTINS, O. G., Observações Sobre as Propriedades Antitumorais e Toxicológicas do Extrato do Líber e de Alguns Componentes do Cerne do Pau D’arco; Rer. Do Inst. De Antib., Recife, 8, 89, 1968.

5. MELO, E. J. T.; AMARAL, P. C.; ANDRADE, P. P.; ANDRADE, C. R.; Sensitivy of Lower Trypanosomatides to Anti-Trypanosoma Cruzi Drugs, Anais XIV. Enc. Anal Pesq. Bras. Doenças de Chagas, Caxanbu-MG, 1984.

6. BERNAYS, E.; LUPI, A.; MARINI BETTOLO, R; MASTROFRANCESCO, C.; TAGLIATESTA, P; Antifeedant Nature of the Quinone Primin and its Quinol Miconidin from Miconia spp.; Experienta. 40, 1010-1011, 1984.

7. MELO, A. M.; JARDIM, M. L.; SANTANA, G. F. de; LIMA, O. G. de; D`ALBUQUERQUE, I. L.; LACET, Y; Primeiras Observações do Uso Tópico da Primina, Plumbagina e Maitenina em Pacientes Portadores de Câncer de Pele; Rer. Inst. Antib., Recife, 14 (1/2), 9, 1974.

8. BLOCH, B.; KARRER, P.; Beiblat Zur Vierteljahresschrif Der Naturforsch., 22 (3), 36, 1967.

9. LIMA, O. G.; MARINI-BERTTOLO, G. B.; MONACHE, F. D.; COÊLHO, J. S. B; D’ALBUQUERQUE, I. L.; MACIEL, G. M; LACERDA, A.; MARTINS, D. G.; Substâncias Antimicrobianas de Plantas Superiores, Revista do Instituto de Antibióticos, Recife, Vol. 10 No. (1 2), 29-34, 1970.

84

10. COTIAS, C. F.; PINTO, K. V.; LACERDA, A. L.; MARTINS, D. G.; Propriedades Farmacológicas da Primina; Rev. Inst. Antib., Recife, 14, 17, 1974.

11. SCHILDKNECHT, H.; SCHMIDT, H.; Synthesen und Eigenschaften des Primins und seiner Isomeren; Zeitschrif Naturforsch, 22B, 287, 1967.

12. ROLIM NETO, P. J.; Síntese de 2-metoxi-p-benzoquinonas 3,5 e 6 alquil substituídas, dissertação de mestrado, Departamento de Ciências Farmacêuticas e Antibióticos, UFPE, Recife, 1988.

13. BIEBER, L. W.; CHAPPETA, A. A.; SOUZA, M. A. M.; GENERINO, R. M.; Simple Syntese of Primin and Its Analogues Vai Lithiation of Protected Gauiacol, Jounal of Natural Products, Vol. 53, No. 3, 706-709, May-Jun 1990.

14. BRONDANI, D. J., Litiação e Alquilação Regioseletivas de 2-metoxihidroquinona, dissertação de mestrado, Departamento de Ciências Farmacêuticas, UFPE, Recife, 1991.

15. BRONDANI, D. J.; BIEBER, L W.; regioselective Lithiation and Alkylation of 2-Methoxy-Hydroquinone, Química nova, Vol. 18, No. 2, 144-146, 1995.

16. BIEBER, L. W; ROLIM NETO, P.; GENERINO, R. M.; Regioselective Alkylation of Substituted Quinones by Trialkylboranes, Terahedron Letters, 40, 4473-4476, 1999.

17. BRONDANI, D. J.; NASCIMENTO, C. R. M.; de SOUZA, I. A.; BIEBER, L. W.; LEITE, A. C. L. Synthesis, Antitumour and Antiflammatory Activities of a Primin Precursor. IL FARMACO, 2004 (submetido)

18. THIELE; WINTER, Org. React.; 19; 199, 1972

19. WILGUS, H. S., GATES Jr., J. W., Canad. J. Chem., 45, 1975, 1967.

85

20. MANO, E. B., Práticas de Química Orgánica, 3o edição. Ed. Edgard Blücher Ltda. 1987.

21. BAUER, A. W., KIRBY, W. M., Antibiotic Susceptibility Testing by a Standardized Single Disk Method, AMER. J. CLIN. PATH., 45 (4), 493-496, 1966.

86

Capítulo 5

Conclusões e Perspectivas.

87

CONCLUSÕES

Na preparação dos precursores MHQ-THP e P-MHQ-THP, foram utilizados

métodos descritos na literatura e todos os compostos foram obtidos com bons

rendimentos.

A proteção do produto de partida, 2-metoxi-hidroquinona, com o DHP

revelou, através da avaliação do perfil de atividade farmacológica dos precursores

MHQ-THP e P-MHQ-THP, que eles são potencialmente bem menos tóxico que a

primina e seus análogos e apresentam uma boa taxa de inibição tumoral frente

aos tumores testado quando comparado ao composto protótipo, cuja dose

terapêutica fica próxima ao limiar de toxicidade, o que não ocorre para o MHQ-

THP e o P-MHQ-THP.

Avaliação da atividade antiinflamatória mostrou que o composto MHQ-THP

apresenta uma boa inibição quando testado no modelo de edema de pata induzido

por carragenina 1% (EPC).

Utilizamos na preparação dos derivados acetoxilados métodos simples,

econômicos e generalizáveis descritos na literatura e todos os compostos foram

obtidos com bons rendimentos.

A avaliação qualitativa preliminar da atividade antimicrobiana para esses

compostos, indica que, no conjunto dos resultados, as modificações

implementadas não contribuíram para a atividade antimicrobiana, evidenciando,

entretanto, a importância das hidroxilas livres.

88

PERSPECTIVAS

Os resultados obtidos são promissores o que nos estimulam a continuar o

projeto. Inicialmente, pretendemos ainda testar os precursores MHQ-THP e P-

MHQ-THP quanto à atividade antiinflamatória, obtendo uma curva dose-resposta

para os dois compostos, conseguindo assim uma avaliação farmacológica mais

detalhada.

Quando aos compostos acetoxilados, pretendemos sintetizar novos

derivados, principalmente para o ácido 4-oxo(2,5-diacetoxifenil)butanóico, com a

condensação com aminoácidos, visando uma possível potencialização da

atividade biológica, obtendo um pró-fármaco direcionado para o princípio da

latenciação, além de realizar outros ensaios biológicos que permitam traçar um

perfil de atividade biológica para esta série.

Pretendemos ainda, sintetizar o composto 6-pentil-1,2,4-triacetoxibenzeno

para fazermos um estudo farmacológico comparativo com a primina e com o P-

MHQ-THP.

89

Apêndice

Produção Científica.

90

91

92

93

94

95

96

97

98

99