DISSERTAÇÃO DE MESTRADO - Universidade Federal do Rio ... · Palavras-chave: adsorventes,...

Universidade Federal do Rio Grande do Norte

Centro de Tecnologia

Departamento de Engenharia Química

Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO

Síntese e caracterização de adsorvente pelicular para

Adsorção em Leito Expandido (ALE)

Cinthia Meirelly de Araújo Elpídio

Orientador: Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos

Coorientadora: Profª. Drª Gorete Ribeiro de Macedo

Natal/RN

Fevereiro/2016

Cinthia Meirelly de Araújo Elpídio

Síntese e caracterização de adsorvente pelicular para

Adsorção em Leito Expandido (ALE)

Dissertação de mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação em

Engenharia Química da Universidade

Federal do Rio Grande do Norte, para

obtenção do grau de Mestre em

Engenharia Química, sob a orientação do

Prof. Dr. Everaldo Silvino dos Santos e

coorientação da Profª Drª Gorete Ribeiro

de Macedo.

Natal/RN

Fevereiro/2016

Catalogação da Publicação na Fonte.

UFRN / CT / DEQ

Biblioteca Setorial “Professor Horácio Nícolás Sólimo”.

Elpídio, Cinthia Meirelly de Araújo.

Síntese e caracterização de adsorvente pelicular para Adsorção em Leito

Expandido (ALE)/ Cinthia Meirelly de Araújo Elpídio. - Natal, 2016.

89 f.: il.

Orientador: Everaldo Silvino dos Santos.

Coorientador: Gorete Ribeiro de Macedo.

Dissertação (Mestrado) - Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro

de Tecnologia. Departamento de Engenharia Química. Programa de Pós-Graduação

em Engenharia Química.

1. Adsorventes - Dissertação. 2. Cromatografia por afinidade - Dissertação. 3.

Biomoléculas - Dissertação. I. Santos, Everaldo Silvino dos. II. Macedo, Gorete

Ribeiro de. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.

RN/UF/BSEQ CDU 661.18 (043.3)

ELPIDIO, Cinthia Meirelly de Araújo – Síntese e caracterização de adsorvente pelicular

para Adsorção em Leito Expandido (ALE). Programa de Pós-Graduação em Engenharia

Química. Área de Concentração: Engenharia Química, Linha de pesquisa: Processos

químicos, catalíticos e biotecnológicos, Natal/RN, Brasil.


Coorientadora: Profª Drª Gorete Ribeiro de Macedo

Resumo: O presente trabalho refere-se à síntese e caracterização de um adsorvente pelicular

adequado ao processo de Adsorção em Leito Expandido (ALE).O material sintetizado possui

um núcleo composto de esferas de zircônia estabilizadas com ítria e recobertas por uma

matriz insolúvel de agarose. Nos ensaios para obtenção das partículas revestidas foi utilizado

o método de emulsão usando-se um sistema agitado com temperatura controlada. Uma

triagem dos corantes reativos (ligantes) Azul Brilhante de Remazol RN, Remazol Azul

Turquesa G 133% e Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado foi feita variando-se o pH,

para encontrar o ligante com maior capacidade de adsorção de Soro Albumina Bovina (BSA),

e a melhor condição para operar o processo. O corante Remazol Amarelo Ouro RGB

Concentrado foi selecionado, visto que apresentou um bom desempenho (94,348 mg/mL

adsorvente) e se mostrou mais estável em pH 4,5 a 5,0. A análise morfológica das partículas

revestidas foi realizada por microscopia óptica e mostrou que a espessura do adsorvente

pelicular é aproximadamente 2,5 µm. A distribuição de tamanho realizada em Granulômetro

Cilas mostrou que a maioria das partículas adsorventes possui diâmetro entre 112 – 300 µm,

cujo diâmetro médio foi 197,54 µm e 202,25 µm, para a esfera sem e com cobertura,

respectivamente. A avaliação da densidade ligante mostrou que a quantidade deBSA

adsorvida é maior quando a relação corante/adsorvente (µg/mg) é maior. O estudo cinético

mostrou que o equilíbrio é alcançado em menos de uma hora. O modelo de Langmuir ajustou

bem os dados da isoterma apresentando capacidade de adsorção máxima (qm) igual a 102,328

mg de BSA/mL de adsorvente ao se utilizar o adsorvente pelicular imobilizado com o corante

reativo Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado.Observou-se que a resina sintetizada tem

uma boa característica de expansão e pode ser utilizada a uma velocidade de operação

elevada. Nesse caso, foi possível obter uma capacidade dinâmica de 7,832 mg de BSA/mL de

adsorvente.

Palavras-chave: adsorventes, cromatografia por afinidade, biomoléculas.

ELPIDIO, Cinthia Meirelly de Araújo – Pellicular adsorbent synthesis and characterization

for adsorption in expanded bed. Qualificação de Mestrado, UFRN, Programa de Pós-

Graduação em Engenharia Química. Área de Concentração: Engenharia Química, Linha de

pesquisa: Processos químicos, catalíticos e biotecnológicos, Natal/RN, Brasil.


Coorientadora: Profª Drª Gorete Ribeiro de Macedo

Abstract: This study deal with the synthesis and characterization of a pellicular adsorbent

appropriate to the EBA process. The synthesized adsorbent has a nucleus of zirconia

stabilized with yttria and coated with an insoluble agarose matrix. In the tests to obtain the

coated particles was used the emulsion method coupled to a stirred system using a

temperature controlled. A screening of reactive dyes (linkers) Brilliant Blue Remazol RN,

Remazol Turquoise G 133% and Remazol Yellow Gold RGB concentrate was made by

changing the pH to find the bind capacity to adsorb Bovine Serum Albumin - BSA during the

tests and the best condition to operate the process. The Remazol Yellow Gold Concentrate

RGB was selected, as it performed well (94,348 mg BSA/mL adsorbent) and was more stable

at pH 4,5 to 5,0. Morphological analysis of the coated particles was performed by light-

scattering microscopy and showed that the agarose thickness of the adsorbent is about 2,5

micrometers. The size distribution of granulometer Cilas performed showed that the majority

of the adsorbent particles have a diameter between 112 - 300 µm, whose average diameter

was 197,54 µm and 202,25 µm, for the adsorbent with and without cover, respectively. The

evaluation of the ligand density showed that the higher the ligand density the higher the

amount of adsorbed BSA (mg of BSA / mg of adsorbent). The kinetic study of the dye

immobilized particle showed that equilibrium is reached before one hour. The adsorption

isotherm showed that the Langmuir model fitted quite well with maximum adsorption

capacity (qm) of BSA - to the pellicular particle with the immobilized reactive dye - Remazol

Golden Yellow Concentrate RGB - is equal to 102,328 mg / mL adsorbent. In this study, the

results showed that the pellicular resin has a good characteristic of expansion and may be used

at a high operating flow rate. In this case, a dynamic capacity of 7,832 mg of BSA/mL of

adsorbent was obtained.

Keywords: adsorbents, affinity chromatography, biomolecules.

A Deus, aos meus pais, Marluce e Canindé, e à

minha irmã, Camilla, que são o alicerce da minha

vida dedico este trabalho.

Sumário

Lista de figuras............................................................................................................................i

Lista de tabelas...........................................................................................................................iv

Lista de abreviaturas e siglas......................................................................................................v

1 Introdução.......................................................................................................................... 15

2 Revisão bibliográfica......................................................................................................... 19

2.1 Purificação de biomoléculas ...................................................................................... 19

2.2 Cromatografia ............................................................................................................ 20

2.3 Cromatografia Líquida ............................................................................................... 21

2.3.1 Cromatografia de troca-iônica ............................................................................ 22

2.3.2 Cromatografia de interação hidrofóbica ............................................................. 22

2.3.3 Cromatografia de imunoafinidade ...................................................................... 23

2.3.4 Cromatografia de afinidade ................................................................................ 23

2.3.4.1 Seleção do suporte ou matriz .......................................................................... 25

2.3.4.2 Matriz de agarose ............................................................................................ 25

2.3.4.3 Corantes reativos (ligantes pseudobioespecíficos) ......................................... 26

2.4 Adsorção em Leito Expandido (ALE) ....................................................................... 31

2.4.1 Fundamentos e operação .................................................................................... 33

2.4.2 Caracterização do leito expandido ...................................................................... 34

2.4.3 Adsorventes ........................................................................................................ 36

2.5 Albumina do Soro Bovino (BSA) .............................................................................. 38

3 Materiais e métodos .......................................................................................................... 41

3.1 Síntese, caracterização e avaliação da capacidade de adsorção do adsorvente

pelicular ................................................................................................................................ 41

3.1.1 Material ............................................................................................................... 41

3.1.2 Métodos .............................................................................................................. 42

3.1.2.1 Síntese do adsorvente pelicular ....................................................................... 42

3.1.2.2 Caracterização física dos adsorventes peliculares .......................................... 43

3.1.2.3 Reticulação química das partículas (cross-linking) e imobilização com corante

reativo ........................................................................................................................ 45

3.1.2.4 Densidade ligante ............................................................................................ 45

3.1.2.5 Determinação da concentração de proteínas totais ......................................... 46

3.1.2.6 Triagem dos corantes reativos ........................................................................ 46

3.1.2.7 Cinética de adsorção ....................................................................................... 47

3.1.2.8 Isoterma de adsorção ...................................................................................... 47

3.2 Adsorção em Leito Expandido .................................................................................. 49

3.2.1 Material ............................................................................................................... 49

3.2.2 Métodos .............................................................................................................. 50

3.2.2.1 Expansão do leito ............................................................................................ 50

3.2.2.2 Curva de ruptura ............................................................................................. 51

4 Resultados e discussão ...................................................................................................... 52

4.1 Síntese do adsorvente ................................................................................................. 52

4.1.1 Morfologia do adsorvente pelicular .................................................................... 52

4.1.2 Reticulação química (cross-linking) e imobilização das partículas.................... 56

4.1.3 Densidade ligante ............................................................................................... 60

4.2 Propriedades físicas da partícula ................................................................................ 61

4.3 Triagem dos corantes e cinética de adsorção ............................................................. 63

4.4 Isoterma de adsorção ................................................................................................. 66

4.5 Adsorção em Leito Expandido .................................................................................. 68

4.5.1 Expansão do leito e efeito da viscosidade .......................................................... 68

4.5.2 Correlação da porosidade do leito e velocidade de operação ............................. 69

4.5.3 Curva de ruptura ................................................................................................. 71

5 Conclusões ........................................................................................................................ 74

Referências bibliográficas........................................................................................................77

Apêndice...................................................................................................................................87

i

Lista de figuras

Figura 2.1 - Princípio da cromatografia por afinidade. Fonte: Gondim (2012).

Figura 2.2 – Estrutura química da Agarose. Fonte: Sigma Aldrich.

Figura 2.3 - Estrutura química do corante reativo Procion Brilliant Blue RS. Fonte: Gondim

(2012).

Figura 2.4 - Grupo antraquinona (esquerda) e agrupamento azo (direita). Fonte: Miquelante

(2011).

Figura 2.5 – Estrutura química do corante Azul Brilhante de Remazol RN. Fonte: Simionato

(2005).

Figura 2.6 – Corante Remazol Amarelo Ouro RGB concentrado. Fonte: Geutbitz et al. (2004);

Cavalcanti (2010b).

Figura 2.7 – (a) Grupo cromóforo ftalocianina de cobre; (b) Grupo reativo sulfatoetilsulfona.

Fonte: Beltrame (2006); Almeida (2013).

Figura 2.8 - Etapas da ALE: (a) leito sedimentado; (b) estabelecimento do equilíbrio

(expansão do leito); (c) aplicação da amostra; (d) lavagem (leito expandido); (e) eluição (leito

empacotado); (f) regeneração (leito empacotado). Fonte: Amersham Pharmacia Biotech

(1997).

Figura 2.9 - Técnicas cromatográficas preparativas. Fonte: Shukla et al.(2007); Padilha

(2013).

Figura 2.10 – Representação do arcabouço protéico da albumina do soro bovino (BSA).

Fonte: Silva et al.(2014).

Figura 3.1 – Representação do sistema para síntese do adsorvente pelicular. 1 = impelidor de

aço inox; 2 = recipiente cilíndrico de polipropileno; 3 = agitador mecânico; 4 = banho

termostatizado.

Figura 3.2 – Representação do sistema para preparação do gel de agarose. 1 = banho

termostatizado; 2 = tubo tipo Falcon.

ii

Figura 3.3 - Aparato experimental para os ensaios de adsorção em leito expandido.

Figura 4.1 – Aparência da partícula zircônia - agarose a partir de microscópio óptico (20x).

Figura 4.2 – Formação de complexo aglomerado.

Figura 4.3- Formação de contínuo homogêneo.

Figura 4.4 – Aparência da partícula zircônia - agarose imobilizada com o corante Azul

Brilhante de Remazol RN, a partir de microscópio óptico (20x).

Figura 4.5 – Aparência da partícula zircônia - agarose imobilizada com o corante Remazol

Azul Turquesa G 133%, a partir de microscópio óptico (20x).

Figura 4.6 – Aparência da partícula zircônia - agarose imobilizada com o corante Azul

Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado, a partir de microscópio óptico (20x).

Figura 4.7 – Distribuição de tamanho das partículas com e sem revestimento.

Figura 4.8 – Triagem dos adsorventes peliculares por adsorção específica e não específica nos

em diferentes pH.

Figura 4.9 – Cinética de adsorção da BSA diluída em tampão acetato 0,05 M e pH 4,5.

Figura 4.10 – Isotermas de adsorção da BSA com o corante Remazol Amarelo Ouro RGB

Concentrado.

Figura 4.11 – Grau de expansão do leito para o adsorvente pelicular em função da velocidade

do fluido.

Figura 4.12 – Correlação de Richardson-Zaki entre a velocidade do fluido e a porosidade do

leito.

Figura 4.13 – Curva de ruptura da BSA ao se utilizar o adsorvente pelicular zircônia - agarose

imobilizado com o corante Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado.

Figura A.1 – Curva padrão do corante Azul Brilhante de Remazol RN.

Figura A.2 – Curva padrão do corante Remazol Azul Turquesa G 133%.

Figura A.3 – Curva padrão do corante Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado.

iii

Figura B.1 – Curva padrão da BSA na faixa de concentração 0,15 a 0,5 mg/mL.


iv

Lista de tabelas

Tabela 4.1 – Relação núcleo esférico por agarose encontradas na literatura.

Tabela 4.2 – Referências da literatura sobre dados de propriedades físicas dos adsorventes.

Tabela 4.3 -–Densidade ligante dos corantes reativos testados.

Tabela 4.4 – Dados de capacidade de adsorção experimentais.

Tabela 4.5 – Comparação das constantes das isotermas de Langmuir e Freundlich para a

adsorção da BSA com o adsorvente sintetizado.

Tabela 4.6 – Parâmetros Ut e n correlacionados pela equação de Richardson-Zaki.

Tabela 4.7 - Comparação da velocidade superficial da agarose-zircônica (este trabalho) com

outras matrizes.

v

Lista de abreviaturas e siglas

ALE: Adsorção em Leito Expandido

BSA: Albumina de Soro Bovino

c: Concentração na fase líquida, mg/mL

c0: Concentração inicial da fase líquida, mg/mL

CI: Colour Index

D: Diâmetro da coluna, cm

DEAE: Ethyl-Diethanolamine

dp: Diâmetro da partícula adsorvente, cm

dc: diâmetro do núcleo, cm

GE: Grau de expansão do leito

FP: Fator de purificação

H: Altura de leito expandido, cm

H0: Altura do leito fixo, cm

Kd: Parâmetro da isoterma de Langmuir modificada, mg/mL

K: Parâmetro da isoterma de Freundlich

m: Parâmetro da isoterma de Freundlich

MM: Massa molar, g/mol

n: Coeficiente de Richardson-Zaki/carga

pI: ponto isoelétrico das proteínas

q: Quantidade de adsorbato retida no sólido, mg/mL

q*: Quantidade de adsorbato retida no sólido na condição de equilíbrio, mg/mL

qmax: Capacidade máxima de adsorção do adsorbato, mg/mL

Rc: Raio do núcleo do adsorvente pelicular

Rp: Raio da partícula

U: Velocidade superficial, cm/h

vi

t: Tempo, s

Ut: Velocidade terminal, cm/h

v: Volume do adsorvente usado

ε: Porosidade do leito

μ: Viscosidade da solução, g/cm.s²

ρc: Densidade do núcleo, g/mL

ρp: Densidade da partícula revestida, g/mL

ρgel: Densidade da agarose, g/mL

CAPÍTULO I

INTRODUÇÃO

Introdução 15

__________________________________________________________________________________ Cinthia Meirelly de Araújo Elpídio Fevereiro/2016

1 Introdução

Nos últimos anos, os processos e produtos biotecnológicos têm apresentado um

significativo crescimento. Estão cada vez mais presentes no campo industrial, em diversas

áreas dentre elas, em especial, no segmento de fármacos. Isso se deve a ampla aplicação

desses produtos o que gera um interesse crescente tanto no desenvolvimento de novos

materiais como no aperfeiçoamento de técnicas utilizadas. Nessa perspectiva, a ampliação na

aplicação de seus produtos, os investimentos em técnicas que possam melhorar o rendimento

e a produtividade se tornam cada vez mais estudadas.

O processo de recuperação e purificação de uma biomolécula é composto por várias

etapas como filtração, centrifugação, precipitação, dentre outras, sendo estas operações

unitárias conhecidas como downstream processing. Em geral, busca-se explorar as diferenças

entre a molécula de interesse (alvo) e os contaminantes tais como: tamanho, hidrofobicidade,

sequência de aminoácidos, atividade biológica, dentre outros fatores (Cavalcanti, 2010a).O

número de operações irá variar de acordo com o grau de pureza e a aplicabilidade da proteína

isolada, quanto maior for a exigência, mais etapas são aplicadas e isso faz com que os

processos downstream sejam bastante onerosos, alcançando, em alguns casos, 80% do custo

global (Santos, 2001).É nesse contexto que o processo de adsorção em leito expandido está

inserido, visto que reduz o número de etapas envolvidas uma vez que o leito opera na forma

expandida, favorecendo o uso de material particulado em suspensão que pode ser alimentado

diretamente na coluna, sem prejuízo de bloqueio da mesma,visto que esses passarão

preferencialmente pelos espaços vazios do leito. No processo com ALE, a mistura das

partículas é mínima e o fluxo do líquido através do leito aproxima-se do comportamento

tubular. A operação em leito expandido alterna etapas de fluidização estável e sedimentação

do leito. Dessa forma, as características hidrodinâmicas do leito expandido se assemelham as

propriedades cromatográficas do leito fixo (Oliveira, 2003).

Para assegurar que o processo de adsorção (ALE) seja bem sucedido, se faz necessário

uma escolha minuciosa de matrizes adsorventes visto que diversos fatores importantes devem

ser considerados como, por exemplo, tamanho da molécula alvo, densidade do adsorvente,

afinidade química, dentre outros. Diversos tipos de adsorventes têm sido utilizados para a

recuperação e purificação de bioprodutos por ALE. Esses adsorventes, especialmente

Introdução 16


desenvolvidos para aplicações que usam a ALE, têm sido empregados na recuperação e

purificação de enzimas/proteínas e outras biomoléculas. Dentre estas resinas pode-se destacar

a série Streamline® que foi lançada do mercado na década de noventa, pela Amersham

Pharmacia atualmente GE Life Sciences, sendo até hoje a resina para ALE mais usada. Essas

resinas, a base de agarose, pode ser derivatizada com diferentes grupos ligantes, conferindo-

lhe diferentes propriedades tais como as resinas Streamline® Phenyl que atuam por interações

do tipo hidrofóbicas (Conrado et al., 2005) e as resinas Streamline® DEAE e Streamline

® SP

que atuam por troca iônica, ou seja, aniônica e catiônica, respectivamente, (Santos et al.,

2001).

O crescimento de aplicações para a ALE é limitado pela disponibilidade de fases

sólidas adsorventes adequadas. O adsorvente ideal deve ter: uma densidade relativamente

elevada para facilitar o comportamento de fluidização estável em meios viscosos, uma

estrutura interna porosa para permitir a transferência rápida de massa a uma grande superfície

adsorvente além de uma composição sólida para permitir derivação química e limpeza

rigorosa durante as operações (Lyddiatt et al., 2002; Chi-Wei Lan et al., 1999; Hamilton et

al., 2000).

Além das matrizes comerciais disponíveis para ALE, um grande número denovas

matrizes estão sendo desenvolvidas por alguns grupos de pesquisas (Asghari & Jahanshahi,

2012; Asghari et al., 2012; Xia et al., 2007; Tong & Sun, 2001). Estes adsorventes, chamados

de adsorventes peliculares, foram definidos como sendo adequados para a adsorção em leito

expandido (Lyddiatt & O’Sullivan, 1998) e têm sido amplamente estudados nos processos de

recuperação e purificação de biomoléculas. Atualmente,o aperfeiçoamento da tecnologia

empregada para recuperação de um bioproduto por adsorção em leito expandido é baseado

essencialmente no desenvolvimento de adsorventes adequados com capacidade de equilibrar a

produtividade e eficiência de separação em várias velocidades de operação e viscosidades de

matéria-prima (Rezvani et al., 2014).

Desta forma, o presente trabalho aborda a síntese de um adsorvente pelicular

constituído por um núcleo de esfera de zircônia estabilizada com ítria, cuja densidade é 3,816

g/mL, e coberto por uma camada de agarose produzido a partir do método de emulsificação

água em óleo.O método cromatográfico empregado é o de cromatografia por afinidade ou

pseudo-afinidade, no qual um corante reativo é utilizado como ligante para interagir com a

biomolécula alvo a ser recuperada. Com isso, os adsorventes sintetizados foram imobilizados

Introdução 17


com três corantes reativos das classes azo, antraquinona e ftalocianina a fim de que estes

atuassem como ligantes de pseudo-afinidade. Para a obtenção de dados cinéticos, equilíbrio

de adsorção e ALE foi utilizada a proteína modelo (Albumina do Soro Bovino – BSA) a fim

de avaliar a capacidade de adsorção da BSA para o adsorvente pelicular sintetizado.

A presente dissertação está dividida seis em capítulos. Nesta seção, Capítulo 1, é

apresentada uma introdução aos temas abordados no trabalho. No Capítulo 2, mostra-se uma

revisão da literatura com relação à purificação de biomoléculas, a técnica de cromatografia

por afinidade e o processo de adsorção em leito expandido. O capítulo 3 irá abordar a

metodologia utilizada, enquanto que os resultados e a discussão serão mostrados no capítulo

4. Em seguida, no Capítulo 5, são apresentadas as conclusões do trabalho e, por último, são

mostradas as referências pesquisadas para realização deste trabalho.

CAPÍTULO II

REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

Revisão bibliográfica 19


2 Revisão bibliográfica

Neste tópico é apresentada uma revisão da literatura com relação à purificação de

biomoléculas, a técnica de cromatografia por afinidade ou pseudo-afinidade e o processo de

adsorção em leito expandido. Dentro deste tema serão abordados assuntos inerentes à

operação ALE como fluidodinâmica e transferência de massa, além das características dos

adsorventes peliculares.

2.1 Purificação de biomoléculas

Bioprodutos, em geral, consistem em um grande número de compostos cuja maioria

das estruturas têm diferentes propriedades físicas e químicas que podem ser derivadas a partir

de uma grande variedade de fontes, tais como animais, vegetais e microbianas. Deste modo,

as estratégias de purificação podem de ser desenvolvidas individualmente e de forma

empírica, a fim de que estejam adequadas as propriedades físico-químicas do produto e aos

modos de operação, adequados aos respectivos passos de processamento, com a finalidade de

atingir altos graus de pureza e elevadas taxas de recuperação, conservando a atividade da

molécula alvo.

Com base nisso, é sabido que a purificação e recuperação de uma biomolécula

produzida por microrganismo não é uma tarefa trivial, uma vez que estão envolvidos diversos

aspectos técnicos e econômicos para tornar o processo viável. Por isso, geralmente, são

envolvidas diversas operações unitárias incluindo filtração, centrifugação, precipitação,

cromatografia e cristalização. Este conjunto de etapas é mais conhecido como downstream

processing e dele dependem a viabilidade econômica do processo de purificação e

recuperação. A redução das etapas do downstream processing a partir da inserção de uma

nova técnica substituinte deve ser vista com grande interesse, pois o emprego correto de

processos de purificação torna-se essencial para que se obtenha êxito na seleção da molécula

alvo. Dentro desse contexto existe interesse pela adsorção em leito expandido (ALE), devido,

principalmente, à redução de etapas, visto que é possível em uma única etapa promover a

captura, recuperação e a purificação da biomolécula, em soluções contendo ou não material

particulado (Cavalcanti, 2010a).



No processo de purificação de proteínas, o objetivo é alcançar rendimento máximo

com alta seletividade, considerando os custos das operações empregadas (Silva, 2000). Com

relação aos bioprodutos, especificamente as enzimas, o desempenho de qualquer técnica de

purificação é verificado pelas variáveis rendimento e fator de purificação. A primeira irá

estabelecer o percentual de molécula alvo que foi recuperado durante a etapa, e a última

quantifica o aumento da atividade específica da enzima ao se utilizar etapas que promovam

sua purificação (Padilha, 2013).

2.2 Cromatografia

A descoberta da cromatografia como técnica analítica ocorreu em 1906, e é atribuída ao

botânico russo Mikhael Semenovich Tswett, ao descrever sua experiência cujo propósito era a

separação dos componentes de extrato de folhas (Collins, 1997). Em seu estudo, o botânico

conseguiu isolar pigmentos de cloroplastos em folhas verdes de plantas, usando uma coluna

de vidro recheada com carbonato de cálcio como fase estacionária e éter de petróleo como

fase móvel, visto que a separação de componentes ocorreu em faixas coloridas, deu-se o nome

de cromatografia (chrom = cor e grafie = escrita) embora o processo não dependa da cor

(Collins, 1997; Lázaro de la Torre, 2013).

Até a década de 30, a técnica cromatográfica não foi muito disseminada, sendo

redescoberta por Kuhn e Lederer que aperfeiçoaram a cromatografia em coluna, separando e

identificando as xantofilas da gema de ovo, utilizando um experimento semelhante ao de

Tswett, com carbonato de cálcio como fase estacionária e éter de petróleo como fase móvel.

Desde então, o método cromatográfico foi aperfeiçoado e, em parceria, com os avanços

tecnológicos foi levado a um alto grau de sofisticação que resultou no seu grande potencial de

aplicação em muitas áreas (Collins, 1997; Lázaro de la Torre, 2013).

Vale ressaltar que os métodos cromatográficos são, em geral, baseados em fenômenos

adsortivos; são lentos e totalmente dependentes de investimentos em materiais adsorventes. A

cromatografia divide-se em duas categorias: líquida e gasosa. Sendo a primeira a que

realmente interessa às purificações de metabólitos celulares.



2.3 Cromatografia Líquida

Na cromatografia líquida, há uma retenção dos solutos (metabólitos celulares) em um leito

contendo material poroso, uma vez que ocorrem fenômenos de adsorção (química ou física),

partição ou exclusão molecular. A fase estacionária é composta por diferentes tipos de

materiais (partículas esféricas), dentre eles: sílica porosa e polímeros orgânicos sintéticos,

cujo diâmetro médio da partícula fica em torno de 100 a 200 µm. Existem alguns métodos

cromatográficos industrialmente utilizados, nos quais ocorre adsorção das diferentes

moléculas sobre a matriz e, em seguida, a dessorção seletiva. Neste grupo, descrevem-se as

adsorções baseadas em troca-iônica, interação hidrofóbica, afinidade e imunoafinidade

(Pessoa Jr. & Kilikian, 2005).

Na cromatografia, as fases móvel e estacionária utilizadas definem o mecanismo

envolvido no processo de separação. Os processos de adsorção e partição são mecanismos de

separação físicos baseados em interações eletrostáticas, incluindo as pontes de hidrogênio.

Quando a fase estacionária trata-se de um sólido, a adsorção ocorre na interface entre as

partículas sólidas e a fase móvel. No processo de partição, a fase estacionária é um líquido

distribuído na superfície de um sólido e, nesta situação, a separação baseia-se na diferença de

solubilidade dos compostos da amostra nas fases móveis e estacionária.

O mecanismo de exclusão é um processo mecânico e a separação é feita com base no

tamanho das moléculas. A fase estacionária é constituída de macromoléculas com ligações

cruzadas que possuem poros de tamanhos específicos. As moléculas do analito maiores não

entram nos poros e eluem mais rapidamente, enquanto as moléculas menores sofrem a difusão

nos poros eluindo com maior tempo de retenção.

Em processos onde ocorre troca-iônica, a separação baseia-se nos diferentes graus de

afinidade eletrostática dos íons. A fase estacionária é altamente carregada, assim os trocadores

aniônicos têm sítios ativos carregados positivamente, retendo ânions, o inverso ocorre para

trocadores catiônicos. Os solutos são eluídos por deslocamentos com outros íons, com mesmo

tipo de carga (Collins et al., 2006; Cunha, 2013).



2.3.1 Cromatografia de troca-iônica

Esta técnica cromatográfica é geralmente empregada para purificação de proteínas

porque, comparada a outros métodos, ela apresenta facilidade em sua aplicação, alta

resolução, alta capacidade de adsorção e bastante versatilidade (Pessoa Jr. & Kilikian, 2005).

Neste método, a solução contendo a molécula alvo passa através de uma coluna de

troca iônica, na qual a biomolécula se ligará à resina através de interações eletrostáticas. Em

seguida, a coluna é lavada com um tampão de maior força iônica a fim de que haja a liberação

das biomoléculas que ficaram fracamente ligadas e depois daquelas que interagiram mais

fortemente, promovendo dessa forma a separação (Bailey & Ollis, 1986).

Conforme Kawasaki (1991), para que a técnica apresente um desempenho satisfatório

é necessário que o trocador iônico seja um sólido macroporoso com grupos funcionais ligados

a sua estrutura. Como a superfície das biomoléculas pode ter passantes positivas ou negativas,

essas resinas se subdividem em catiônicas (carregada positivamente) e aniônicas

(negativamente), conforme o grupo funcional que apresentam. Esses grupos podem se

associar a contra íons, e os contra íons podem ser reversivelmente trocados por outros íons de

mesma passante sem alteração do adsorvente. Dessa forma, a capacidade dessas resinas

depende da concentração dos grupos iônicos e da porosidade do suporte. Segundo Fonseca

(1995), a capacidade típica de adsorção de biomoléculas para essas resinas é da ordem de 100

mg/mL de adsorvente, sendo também afetada por fatores externos como, por exemplo, pH e

concentração de sal no tampão.

Em um processo de cromatografia de troca-iônica as condições de operação devem ser

bem determinadas uma vez que a capacidade de purificação pode ser afetada caso as

condições experimentais como: pH, força iônica do tampão, temperatura, natureza do íon-

oposto e velocidade de operação não estejam bem ajustadas (Cavalcanti, 2010 a).

2.3.2 Cromatografia de interação hidrofóbica

A cromatografia de interação hidrofóbica é baseada no ganho entrópico do sistema

protéico, devido à remoção de água nos domínios hidrofóbicos presentes na estrutura da

proteína e, adicionalmente, pelo aumento da força iônica no meio, através do efeito da adição



de sal inerte. Isto faz com que a proteína sofra a influência dos íons do meio sobre sua

estrutura protéica, alterando sua solubilidade, devido à exposição dos grupos apolares

existentes em sua cadeia de aminoácidos. Estes grupos apolares normalmente ficam na parte

interna das estruturas das proteínas quando em meio aquoso (Arruda, 1999).

Segundo Cavalcanti (2010 a), a hidrofobicidade das proteínas está baseada na dos

aminoácidos que tem a tendência de se concentrarem na superfície interna das proteínas

globulares e os hidrofílicos na superfície externa. Com base nisso, ao se executar a técnica de

cromatografia de interação hidrofóbica deve-se atentar para as características da fase

estacionária e da fase móvel uma vez que esses dois fatores podem afetar o processo. A fase

estacionária irá variar de acordo com o ligante imobilizado na matriz. Os ligantes mais

utilizados nesta técnica são os alcanos de cadeia linear com ou sem o grupo amino terminal. A

fase móvel deve apresentar características como pH, temperatura e concentração do sal que

proporcionem a interação da proteína com o adsorvente.

2.3.3 Cromatografia de imunoafinidade

O termo cromatografia de imunoafinidade é usado para o método de cromatografia de

afinidade cuja fase estacionária consiste de um anticorpo relacionado a um antígeno; em

outras palavras, baseia-se no reconhecimento de epítopos antigênicos por anticorpos. Esta

técnica é uma poderosa ferramenta para isolar um determinado composto a partir de amostras

complexas que necessitem de um alto grau de seletividade visto que apresenta elevada

especificidade e afinidade que outros métodos não conseguiriam. Em geral, consiste nas

seguintes etapas: obtenção da amostra contendo o produto de interesse, anticorpos antígenos-

específicos para serem imobilizados em matriz apropriada, eliminação de produtos

indesejados e recuperação por meio de eluição do produto de interesse (Caporale, 2010).

2.3.4 Cromatografia de afinidade

Para identificação, purificação e separação de biomoléculas, a cromatografia de

afinidade é considerada um processo bem consolidado (Denizli & Piskin, 2001; Gondim,

2012). Esse tipo de cromatografia se diferencia dos outros métodos cromatográficos por



basear-se, sobretudo, nas propriedades biológicas ou funcionais das espécies que interagem: a

biomolécula a ser separada e a fase estacionária. Esta técnica de separação depende de

interações bastante específicas entre os materiais biológicos como: enzima-substrato, enzima-

inibidor, antígeno-anticorpo. É importante destacar que embora classificada como

cromatografia de afinidade, ao se utilizar um corante como ligante para interagir com a

proteína, tem-se de fato uma cromatografia de pseudoafinidade. Neste trabalho, utilizaram-se

corantes reativos como ligantes; eles atuam mimetizando cofatores de interesse da molécula

alvo e, por isso, são chamados de ligantes de pseudoafinidade, pseudoespecíficos ou

pseudobioespecíficos.

Neste processo, um dos componentes da interação é o ligante, um composto

previamente imobilizado em um suporte insolúvel, denominado matriz porosa. Esse ligante

possibilitará a captura da molécula a ser isolada durante a passagem da solução contendo a

molécula alvo através do leito sob condições favoráveis (Hermanson et al., 1992). O princípio

do método se baseia em basicamente três etapas: I – imobilização de um composto químico

ou bioquímico (ligante) na superfície de uma matriz porosa insolúvel; II – estágio da adsorção

durante o qual a solução contendo a molécula alvo a ser adsorvida é colocada em contato com

o adsorvente para permitir que as interações ocorram e estágio de lavagem, onde a coluna é

equilibrada com o tampão inicial no qual os componentes adsorvidos por interações não

específicas são removidos; e por fim, a etapa III – processo de eluição no qual a biomolécula

é recuperada e liberada do complexo adsorvido-ligante. Após estas etapas, ainda ocorre à

regeneração desse adsorvente, processo que irá permitir a reutilização deste adsorvente em um

novo ciclo. A Figura 2.1 ilustra o princípio da cromatografia de afinidade.

Figura 2.1- Princípio da cromatografia de afinidade. Fonte: Gondim (2012).



2.3.4.1 Seleção do suporte ou matriz

A escolha da matriz sólida para aplicação na cromatografia de afinidade deve seguir

alguns critérios e possuir determinadas características: geralmente, deve ser hidrofóbica e não

ter outros grupos de trocas reativos, uma vez que se deseja a inibição da adsorção não

específica; possuir boas propriedades mecânicas, as quais não sejam afetadas pelo tratamento

químico de modo que ainda possibilite a resistência à vazão e garanta o mesmo fluxo durante

a eluição e lavagem; ter boa porosidade para que a adsorção da molécula alvo ocorra de forma

facilitada; apresentar um número suficiente de grupos ativos que são essenciais nas ligações

cruzadas e ser mecânica e quimicamente estável ao tratamento químico de modificação e

variação das condições de operação (Pessoa Jr. & Kilikian, 2005).

Diversos materiais têm sido adotados para compor as matrizes cromatográficas de

afinidade utilizadas na purificação de biomoléculas. Essas substâncias possuem propriedades

que permitem empregá-las como suportes insolúveis ou matrizes. Entre elas destacam-se:

agarose, celulose, dextrana, poliacrilamida e outros polímeros, partículas porosas de alumina,

sílica de porosidade controlada e algumas associações entre as substâncias citadas. Sendo

assim, o adsorvente usado na cromatografia de afinidade é composto de duas partes: o suporte

ou matriz e o ligante.

2.3.4.2 Matriz de agarose

A agarose é um biopolímero linear extraído das algas. É constituída de unidades de

agarobiose, que é um dissacarídeo composto por D-galactose e 3,6-anidro-L-galactopiranose

unidas por ligações glicosídicas α-1,6 e β-1,4, conforme ilustrado na Figura 2.2. A utilização

da agarose como suporte insolúvel ou matriz, na cromatografia por afinidade requer uma

preparação da estrutura secundária do gel. Para aumentar a estabilidade do composto é

necessário realizar uma reação-cruzada (cross-linking) como, por exemplo, uma reação com

epicloridrina em meio alcalino, visto que tal reação leva à formação de ligações covalentes

cruzadas entre cadeias de agarose, tornando a matriz mecanicamente rígida e mais estável aos

regentes orgânicos e inorgânicos.

Diversas percentagens de agarose são usadas na matriz. No entanto, a matriz contendo

4% desse componente tem sido mais frequentemente utilizada na síntese de adsorventes. Um



suporte ou matriz com 4% apresenta área total superficial de aproximadamente 5,0 m².mL-1

e

diâmetro médio do poro de 30 nm (Pessoa Jr. & Kilikian, 2005)A agarose é uma boa opção

porque apresenta a maioria das características desejáveis em uma matriz e tem como

vantagem uma estrutura porosa altamente hidrofílica, inerte e quimicamente estável.

Figura 2.2 – Estrutura química da Agarose Fonte: Sigma Aldrich.

2.3.4.3 Corantes reativos (ligantes pseudobioespecíficos)

Os corantes têxteis são compostos orgânicos que possuem estruturas moleculares

complexas, as quais podem ser divididas em duas partes principais, o grupo cromóforo, que

fornece cor a substância, e o grupo funcional, responsável pela fixação à fibra, denominado de

auxocromo (Kunz et al., 2002). Os grupos de corantes conhecidos são: diretos, azóicos,

ácidos, sulforosos, dispersos, pré-metalizados, básicos e reativos.

As estruturas dos corantes são formadas por um ou mais cromóforos: azo - mono, di,

tri e poliazo -, nitrofenol, nitrosofenol, triarilmetano, antraquinônico, pirimidina,

vinilsulfônico e triazina, entre outros (Twardokus, 2004); e por grupos reativos que favorecem

a interação com as moléculas de interesse (Pinheiro, 2011). Dentre a classe dos reativos, os

principais possuem o grupo cromóforo azo e antraquinona e grupos reativos clorotriazinila e

sulfatoetilsulfonila.

As estruturas da maioria dos corantes são muito complexas e, muitas vezes, é de fato

inconveniente nomeá-los por sua fórmula química. Com base nisso, a nomenclatura correta

raramente é usada, sendo preferível utilizar nomes comerciais para nomeá-los. Ainda assim,

os mesmos corantes podem ser comercializados com diferentes denominações. Uma forma de



classificá-los e, também, de diferenciá-los é utilizar o Colour Index (C.I.), um catálogo da

Associação Americana de Química Têxtil e Coloristas e da Sociedade Britânica de Corantes e

Coloristas (Wesenberg et al., 2003; Miquelante, 2011).

Uma característica dos corantes reativos aplicada à área de bioprocessos é a

possibilidade de atuarem como ligantes pseudobioespecíficos uma vez que apresentam a

capacidade de se ligar a proteínas por meio de interações hidrofóbicas, eletrostáticas ou de

coordenação. Eles surgiram como alternativa aos ligantes bioespecíficos por apresentarem um

bom custo-benefício, baixo custo e disponibilidade comercial, e pela facilidade de

imobilização, principalmente em matrizes contendo grupo hidroxila (Denizli & Piskin, 2001;

Yavuz et al., 2006; Gondim, 2012). Esses corantes são aplicados na cromatografia de

afinidade para purificação de biomoléculas, devido a sua capacidade de ligação a diversas

proteínas de forma seletiva e reversível e por apresentaram um sistema de afinidade composto

por um cromóforo e um grupo reativo. A Figura 2.3 mostra a estrutura do corante reativo

Procion Brilliant Blue RS, na qual o grupo reativo é um anel diclorotriazina e cujo cromóforo

é constituído por um grupo antraquinona e um anel benzênico sulfonado (Gondim, 2012).

Figura 2.3 - Estrutura química do corante reativo Procion Brilliant Blue RS. Fonte:

Gondim (2012).



De acordo com Miquelante (2011), as duas principais classes, segundo a estrutura

química, agrupam corantes contendo na sua molécula grupos azo e/ou o antraquinona (Figura

2.4).

Figura 2.4 - Grupo antraquinona (esquerda) e agrupamento azo (direita). Fonte: Miquelante

(2011).

A primeira, a dos azos corantes, é uma importante classe de corantes têxteis,

representando cerca de 60 a 80% dos corantes registrados no Colour Index. Seus integrantes

se caracterizam pela presença de um ou mais grupos cromóforos (azo) em suas moléculas (-

N=N-) (Plumb et al., 2001). Possuem estabilidade química frente a agentes externos, como

luz, temperatura, umidade e atmosfera oxidante e facilidade de síntese sendo, por isso, muito

utilizados em indústrias de alimentos, de cosméticos, farmacêuticas e têxteis (Patel& Suresh,

2008).

O segundo grupo de corantes (antraquinônicos) dominou o mercado de corantes

reativos até o final da década de 70. Ele é extremamente eficaz na capacidade de fixação à

fibra, embora seja de alto custo e apresente uma pequena capacidade de coloração. Os mais

comumente usados são os derivados do ácido bromoamínico que, através da variação dos

substituintes do anel aromático, apresentam colorações variando do violeta azulado ao azul

esverdeado (Miquelante, 2011).

Os corantes sintéticos são classificados como ligantes de afinidade devido a sua

interação com os sítios ativos de muitas proteínas e enzimas, visto que mimetizam a estrutura

dos seus substratos, cofatores ou agentes ligantes (Denizli & Piskin, 2001; Yavuz et al., 2006;

Gondim, 2012). Em condições apropriadas, matrizes com corantes imobilizados podem

adsorver as proteínas e estes ligantes, por sua vez, proporcionam diversas oportunidades para

diferentes tipos de interações com outras partes das proteínas. No entanto, muitas proteínas se



ligam de forma não específica por uma combinação complexa de interações eletrostáticas,

hidrofóbicas, transferência de carga e ligações de hidrogênio, sendo elas todas passíveis de

ocorrer visto a estrutura complexa dos corantes reativos (Denizli & Piskin, 2001; Gondim,

2012).

Como exemplo de corantes reativos que podem ser utilizados na cromatografia por

afinidade tem-se: Azul Brilhante de Remazol RN, Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado,

Remazol Azul Turquesa G 133%. As estruturas químicas desses compostos estão

representadas nas Figuras de 2.5 a 2.7.

O corante Azul Brilhante de Remazol RN pertence ao grupo antraquinona, possui 4

grupos aromáticos e 3 sulfonados e apresenta massa molar igual a 660 g/mol.

Figura 2.5 – Estrutura química do corante Azul Brilhante de Remazol RN. Fonte: Simionato

(2005).

O corante Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado é da família dos azos corantes,

com dois anéis benzênicos sulfonados, sua massa molar é 481 g/mol. Sua estrutura é ilustrada

na Figura 2.6.



Figura 2.6 – Corante Remazol Amarelo Ouro RGB concentrado. Fonte: Geutbitz et al.(2004);

Cavalcanti (2010b).

O corante Remazol Azul Turquesa possui um grupo cromóforo pouco comum, a

ftalocianina de cobre (Figura 2.7a), e como grupo reativo o sulfatoetilsulfona (Figura 2.7b).

Sua massa molar é 764,5 g/mol. Segundo Beltrame (2006), o grupo ftalocianina é

provavelmente a classe mais estável entre todas as utilizadas, sua tonalidade varia entre verde

e azul, dependendo de seus substituintes sendo que a maior parte destes corantes são

complexos metálicos de cobre e apresentam boas propriedades de cor e resistência, mas

também podem formar a estrutura com o níquel (Almeida, 2013).

Figura 2.7 – (a) Grupo cromóforo ftalocianina de cobre; (b) Grupo reativo sulfatoetilsulfona.

Fonte: Beltrame (2006); Almeida (2013).



2.4 Adsorção em Leito Expandido (ALE)

A purificação e recuperação de uma biomolécula produzida por microrganismo é uma

atividade desafiadora, visto que há vários aspectos técnicos e econômicos envolvidos.

Os diferentes tipos de operações unitárias utilizadas durante a recuperação ou

purificação de biomoléculas alvo são chamados de downstream processing e dele dependem a

viabilidade econômica da comercialização dessa biomolécula, uma vez que são essas

operações unitárias que demandam um maior investimento. Portanto, qualquer técnica que

permita a redução das etapas do downstream processing deve ser vista com grande interesse,

pois a estratégia correta de protocolos de processos de purificação torna-se essencial para que

se atinja êxito na seleção da molécula alvo (substância ou espécie desejada). Dentro desse

contexto, existe interesse pela adsorção em leito expandido (ALE) devido, principalmente, à

redução de etapas, pois é possível em uma única etapa promover a captura, recuperação e a

purificação da biomolécula, em soluções contendo ou não material particulado (Cavalcanti,

2010a). A técnica de ALE vem sendo de crescente interesse nos últimos anos sendo aplicada

tanto na academia como na indústria (Santos, 2001; Cabanne et al., 2004; Hidayat et al.,

2004; De Lamotte, 2005; Toledo et al., 2007; May & Pohlmeyer, 2011).

A ALE surgiu a partir da cromatografia de proteínas e baseia-se na fluidização do leito de

adsorventes cromatográficos. O acréscimo de interstícios pelo aumento da porosidade do leito

permite a aplicação direta de uma alimentação bruta contendo suspensão de material

biológico (ex: células, detritos, substratos insolúveis, etc.). Isto reduz as etapas de purificação

destes materiais diminuindo também seus custos. O processo de fluidização do leito promove

uma maior interação das matrizes adsorventes e as moléculas alvo, o que pode elevar a

afinidade do meio cromatográfico, por uma maior exposição da área superficial do adsorvente

(Curvelo-Santana et al., 2008).

A ocorrência do fenômeno de segregação, que se refere à tendência das partículas

menores ou menos densas posicionarem-se na parte superior do leito e as partículas maiores

ou mais densas posicionarem-se na parte inferior (Santos, 2001) levando à formação de

múltiplos estágios de adsorção das moléculas-alvo sobre as partículas de adsorvente

fluidizadas, em decorrência da distribuição em camadas distintas pelo tamanho e densidade de

tais partículas. Dependendo dos parâmetros sistemáticos efetivos, tais como tipo e

concentração da biomassa, características do ligante, força iônica da fase fluida e pH, podem-



se observar diferentes situações hidrodinâmicas durante o processo ideal em plug flow até a

sorção-limite (Fernández-Lahore et al., 2000).

Os métodos tradicionais de purificação de bioprodutos utilizam o processo de

operação em leito fixo o qual contem as resinas cromatográficas compactadas. No entanto,

após o término da etapa de fermentação, tem-se um líquido de elevada viscosidade e com

sólidos suspensos que impossibilitam o uso desse caldo fermentado direto na coluna

cromatográfica empacotada. Em busca de provar a viabilidade econômica dos processos

biotecnológicos, tem-se estudado técnicas de ações integradas, as quais possam remover

material particulado e que ofereçam boa resolução de purificação (Padilha, 2013).

Como a adsorção em leito expandido baseia-se na fluidização, parte-se de um leito

fixo, e aumenta-se a vazão do fluido a fim de atingir uma velocidade na qual a força de arraste

se iguale ao peso das partículas, ou seja, a força de arraste iguala-se à queda de pressão em

uma determinada área transversal. Então, um leito fluidizado estável é formado quando as

partículas adsorventes são suspensas devido ao equilíbrio entre a velocidade de sedimentação

e a velocidade do fluido ascendente. Diferente da técnica de fluidização convencional, que é

caracterizada principalmente pela ocorrência da mistura resultando, assim, em uma baixa

eficiência de ligação adsorvente-proteína, essa técnica opera em condições “suaves” de

fluidização, sendo elas ocasionadas pela segregação das partículas adsorventes e

caracterizadas por um baixo Reynolds da partícula, da ordem de 0,5-1, aumentando, então, a

eficiência da ligação adsorvente-proteína (Santos, 2001; Sierra, 2008).

O emprego da fluidização do leito com os adsorventes convencionalmente utilizados

na adsorção em leito fixo provoca elevada mistura entre o líquido e o adsorvente gerando uma

dispersão axial elevada, diferindo do comportamento desejável de escoamento tubular

apresentado pelo leito fixo e aproximando-se indesejavelmente ao comportamento de tanque

agitado, onde a existência de apenas um estágio de equilíbrio compromete a eficiência do

processo de separação por adsorção. Diante desta situação, soluções foram propostas para

minimizar o grau de mistura das partículas adsorventes, visando o comportamento plug-flow

(Oliveira, 2003).

A companhia Pharmacia Biotech atualmente GE Life Sciences, em 1993, lançou no

mercado novos tipos de adsorventes, produtos estes tem que por finalidade atuar na operação

em leito expandido (McCormick, 1993). As resinas fabricadas foram denominadas



Streamline®

, as quais permitiram a expansão estável do leito, operando em uma faixa maior

de velocidade (100-300 cm/h) (Padilha, 2013).

2.4.1 Fundamentos e operação

O processo de cromatografia em leito expandido compreende algumas operações que

incluem o equilíbrio das cargas da resina, alimentação da amostra, a lavagem das proteínas

não adsorvidas, a eluição do composto e a regeneração (Moraes et al., 2009). A Figura 2.8

apresenta um esquema dessa sequência. O equilíbrio é alcançado com a alimentação de um

tampão de baixa molaridade, em fluxo ascendente, promovendo a expansão do leito em 2 ou 3

vezes, dependendo da velocidade. Após essa etapa, é usualmente feita a alimentação com

caldo bruto contendo as biomoléculas alvo e partículas em suspensão. A velocidade deve ser

controlada para que seja possível manter o mesmo grau de expansão do leito estabelecido.

Posteriormente, faz a etapa de lavagem, necessária para remoção de partículas e proteínas

fracamente ligadas (adsorvidas). Depois da lavagem, promove-se a eluição com o leito

empacotado, modo no qual a resolução na separação das moléculas adsorvidas é elevada e

permite concentrar a molécula-alvo no eluente. Em geral, é necessário um pequeno volume

para eluir o bioproduto e o uso de gradientes salinos pode ser mais efetivo para separação.

Após essa etapa, é feita a regeneração para que a resina esteja pronta para ser novamente

utilizada (Amersham Pharmacia Biotech, 1997).

Figura 2.8 - Etapas da ALE: (a) leito sedimentado; (b) estabelecimento do equilíbrio

(expansão do leito); (c) aplicação da amostra; (d) lavagem (leito expandido); (e) eluição (leito

empacotado); (f) regeneração (leito empacotado). Fonte: Amersham Pharmacia Biotech,

1997.



Há algumas particularidades na operação em leito expandido e dentre elas está a

possibilidade da eluição em modo expandido. A vantagem de operar dessa forma é não ter

que mover o adaptador para a posição de leito fixo, o que reduz o risco de problemas em

função da resistência do material. Entretanto, esta eluição resulta na diluição do composto de

interesse. Além do volume, também há um aumento no tempo gasto para eluição em modo

expandido (Anspach et al., 1999).

2.4.2 Caracterização do leito expandido

Para que o processo de adsorção em leito expandido ocorra satisfatoriamente é

necessário o conhecimento do comportamento do leito em função das propriedades físicas das

partículas e do fluido. Essa caracterização ocorre principalmente medindo-se a expansão do

leito em função da velocidade do fluido, ou observando-se a influência do outros fatores como

distribuição de tamanho de partículas, viscosidade do fluido, presença de células, ligação

proteína-adsorvente e concentração da molécula alvo, etc. Segundo Chase & Draeger (1992),

o sucesso da purificação de proteínas depende essencialmente da obtenção de um leito com

expansão estável. Sendo esta condição fundamental, para que se possa realizar um aumento de

escala, partindo-se dos resultados obtidos em laboratório.

O grau de expansão (GE), parâmetro de suma importância para a operação em leito

expandido, representa a razão entre a altura do leito expandido (H) e a altura inicial (H0), para

uma dada velocidade aplicada (Santos, 2001; Cavalcanti, 2010a; Padilha, 2013). A Equação

2.6 representa esta relação.

𝐺𝐸 = 𝐻

𝐻0 (2.6)

Para haver uma fluidização estável, em uma coluna cromatográfica, as forças de

interação partícula - fluido devem equilibrar o peso da partícula. Essa condição é estabelecida

se a velocidade do líquido excede um valor mínimo, chamado velocidade mínima de

fluidização. As propriedades da partícula fluidizada e do líquido fluidizante definem a faixa

de vazão que pode ser utilizada (Kalil, 2000). Como a adsorção em leito expandido baseia-se

na fluidização, uma forma de conhecer o comportamento do leito é através da equação

proposta por Richardson e Zaki (1954), a qual relaciona a velocidade superficial do fluido e a



velocidade terminal da partícula com a porosidade do leito, conforme a Equação 2.7, que é

válida para fluidos com perfil Newtoniano (Moraes, 2009):

𝑈 = 𝑈𝑡 . 𝜀𝑛 (2.7)

sendo Ut a velocidade terminal de uma partícula única; ε a porosidade do leito e n o expoente

de Richardson-Zaki, que expressa o regime de escoamento.

Esse modelo é fundamental para avaliar a expansão do leito quando este alcança o

equilíbrio. A velocidade terminal da partícula (Ut) é calculada pela linearização por logaritmo,

tendo como coeficiente angular o expoente de Richardson-Zaki (n) (Frej et al., 1997; Li et al.,

2003; Padilha, 2013). O valor do expoente de Richardson-Zaki pode ser obtido através das

seguintes expressões:

𝑛 = 4,65 + 20𝑑𝑝

𝐷 para Ret< 0,1 (2.8)

𝑛 = (4,4 + 18𝑑𝑝

𝐷) 𝑅𝑒𝑡

−0,03 para 0,1 <Ret< 0,2 (2.9)

𝑛 = (4,4 + 18𝑑𝑝

𝐷) 𝑅𝑒𝑡

−0,1 para 1 <Ret< 200 (2.10)

𝑛 = 4,4𝑅𝑒𝑡−0,1

para 200 <Ret< 500 (2.11)

n = 2,4 para Ret< 500 (2.12)

em que D é o diâmetro da coluna do leito expandido e o Ret é o número de Reynolds baseado

na velocidade terminal (Richardson & Zaki, 1954; Padilha, 2013).

No regime de Stokes, em que o Rep< 0,1, a velocidade terminal de uma partícula

isolada Ut é dada por:

𝑈𝑡 =𝑔𝑑𝑝

2(𝜌𝑝− 𝜌𝐿)

18 µ (2.13)

em que g é a aceleração da gravidade, dp é o diâmetro da partícula, μ é a viscosidade do

fluido, ρp e ρL são as densidades da partícula e do fluido.



2.4.3 Adsorventes

Atualmente, o mercado disponibiliza uma diversidade de adsorventes cromatográficos,

explorando diferentes técnicas que podem ser usadas em escala preparativa, conforme

ilustrado na Figura 2.9. Dessa forma, é necessária uma escolha criteriosa na escolha do

adsorvente uma vez que representa um fator muito importante nas etapas de recuperação e

purificação.

Figura 2.9 - Técnicas cromatográficas preparativas. Fonte: Adaptado de Shukla et al.(2007);

Padilha (2013).

Na década de 1990, Amersham Biosciences desenvolveu a linha de adsorventes

Streamline lançando-a no mercado para uso em bioprocessos. Estes adsorventes são

compostos de 6% de agarose contendo um núcleo de quartzo cristalino, que atua aumentando

a densidade da partícula, com um tamanho de partícula que varia de 100-300µm, com

tamanho médio de 200,0 µm e densidade em torno de 1,2 g/mL (Xia et al., 2007).

Em geral, a ALE emprega adsorventes porosos análogos aos adsorventes utilizados em

leitos fixos convencionais. Matrizes adequadas para o processo ALE são preparadas

utilizando uma variedade de diferentes compostos. Devido à exigência de alta produtividade,

a adsorção em leito expandido deve ser operada a uma velocidade relativamente elevada.

Assim, há maneiras de aumentar a velocidade de operação dos adsorventes em um leito

Cromatografia de adsorção

Técnicas de não-afinidade:

- Fase reversa (RPC)

- Hidroxiapatita (HA)

- Interação hidrofóbica (HIC)

- Troca iônica (IEX)

Técnicas de afinidade:

- Metal imobilizado (IMAC)

- Imunoafinidade

- Ligantes biomiméticos

- Ligantes com peptídeos

- Ligante com corante

- Ligante com Proteína A



expandido, como: elevar o tamanho e a densidade das partículas, que são formas de aumentar

a velocidade terminal da partícula. O aumento de tamanho de partícula vai certamente

diminuir a transferência de massa e tende a reduzir a capacidade de adsorção dinâmica. Com

base nisso, aumentar a densidade torna-se a melhor opção (Miao et al., 2005).

O aumento da densidade do adsorvente para alcançar de moderadas a elevadas

velocidades de fluido pode ser obtido, quer por utilização de um material poroso de alta

densidade ou através da combinação de um material pesado não poroso com um material

poroso leve. A utilização de esferas porosas de sílica é um exemplo da primeira opção, e a

incorporação de liga de Nd-Fe-B em pó em esferas de agarose é um exemplo da segunda

estratégia (Tong & Sun, 2001). Ao aumentar o tamanho do núcleo, a densidade das partículas

é aumentada consequentemente, a fim de permitir que a velocidade do fluido seja ainda

maior.

Para que as operações com o leito expandido sejam eficientes, adsorventes peliculares

densos de tamanho pequeno são desejados, uma vez que esta configuração beneficiaria o

processo por diminuir a distância do caminho difusivo intrapartícula de macromoléculas e,

por conseguinte, aumentar a taxa de transferência de massa aparente ou a eficiência do

processo na ALE.

Os adsorventes peliculares foram definidos como sendo adequados para adsorção em

leito expandido (Lyddiatt & O’Sullivan., 1998), uma vez que permitem operar em altas

velocidades por serem caracterizados por um núcleo denso, tal como o vidro, aço inoxidável

(Palsson et al., 2000) ou zircônia-sílica (Dainiak et al., 2002; Sun et al., 2001) revestido com

uma camada de material poroso e insolúvel como, por exemplo, agarose. Tais matrizes

prometem altas taxas de adsorção/dessorção devido à ausência de poros convectivos

profundos e às distâncias de difusão curtas dentro da camada porosa fina que compreende a

película (Jahanshahi et al, 2008).

A síntese de adsorventes sólidos adequados tem atraído fortemente a atenção dos

pesquisadores nos últimos anos uma vez que este elemento é essencial na adsorção em leito

expandido (Palsson et al., 2000).Os critérios básicos dos adsorventes da ALE adequados são

propostas a apresentar densidade suficiente e ampla distribuição de tamanho de partícula. É

necessária uma alta densidade dos adsorventes para a operação estável,com maiorvelocidade,

e a distribuição de tamanho de partícula apropriado contribui significativamente para a



redução da mistura na coluna. Além disso, a eficiência de adsorção da proteína deve ser

considerada na síntese de adsorventes para leito expandido.

2.5 Albumina do Soro Bovino (BSA)

A albumina do soro bovino (BSA) é uma proteína globular com um bom perfil de

aminoácidos essenciais. Consiste em cadeia polipeptídica simples contendo aproximadamente

582 aminoácidos com dezessete ligações dissulfídicas intramoleculares (Antunes, 2003;

Monteiro et al., 2015). É a proteína mais abundante no sangue bovino, tendo uma

concentração típica de 50 mg/mL, e possui uma estrutura muito similar à estrutura da HSA

(Human Serum Albumin), uma vez que a porcentagem de sequências idênticas de aminoácidos

é de 76% (Ferreira, 2009).

As albuminas possuem uma estrutura complexa, a qual se divide em primária e

secundária; as regiões de ligações preferenciais de analitos são classificadas em três grandes

domínios estruturalmente similares, denominados de I, II e III, e cada domínio contém dois

subdomínios, classificados de A e B. As regiões responsáveis pelo armazenamento dos

compostos nas albuminas estão localizadas nos subdomínios IIA e IIIA, e são conhecidas

como sítios I e II de Sudlow, como mostrado na Figura 2.10 (Silva et al.,2014).

De acordo com Carter & Ho (1994),a massa molecular da BSA é de 66.462 Da (66,462

kDa). A albumina tem uma alta afinidade por ácidos graxos, hematina (hematin), bilirrubina,

e uma grande afinidade por pequenos compostos aromáticos negativamente carregados

(Ferreira, 2009). O seu ponto isoelétrico (pI) é 4,9 (Asgari et al., 2014). O pI da molécula

indica o pH no qual ela se encontra com a mesma quantidade de carga positiva e negativa.

O ponto isoelétrico (PI) da proteína é usado como determinante da carga elétrica na

superfície da proteína. Se o pH < pI a proteína assume carga global positiva, enquanto na

condição em que o pH > pI, a carga global é negativa. Entretanto, é de se ressaltar que as

proteínas são moléculas anfóteras, dada a presença de resíduos de aminoácidos de natureza

básica e ácida (Padilha, 2013).

A Figura 2.10 mostra a representação do arcabouço protéico da albumina do soro

bovino (BSA).



Figura 2.10 – Representação do arcabouço protéico da albumina do soro bovino (BSA).

Fonte: Silva et al.(2014).

CAPÍTULO III

MATERIAIS E MÉTODOS

Materiais e métodos 41


3 Materiais e métodos

Neste capítulo serão apresentados os materiais e as metodologias empregadas para a

obtenção do adsorvente pelicular enfatizando os métodos utilizados para caracterização e

avaliação da sua capacidade de adsorção, além da técnica de adsorção em leito expandido.

3.1 Síntese, caracterização e avaliação da capacidade de adsorção do

adsorvente pelicular

3.1.1 Material

Para a síntese do adsorvente pelicular, utilizou-se um banho termostático TE-184

(Tecnal) no qual se inseriu um sistema que consiste em um recipiente cilíndrico de

polipropileno, adaptado para ser o reator, cujo diâmetro interno é de 12,0 cm e um agitador

mecânico TE – 139 (Tecnal), o qual possui um impelidor de aço inox de 6,0 cm de diâmetro,

conforme Figura 3.1.

Figura 3.1 – Representação do sistema para síntese do adsorvente pelicular. 1 = impelidor de aço

inox; 2 = recipiente cilíndrico de polipropileno; 3 = agitador mecânico; 4 = banho termostatizado.



Para preparação do gel de agarose, utilizou-se outro banho termostatizado e um tubo

cilíndrico tipo Falcon de 50 mL, conforme ilustrado na Figura 3.2.

Figura 3.2 – Representação do sistema para preparação do gel de agarose. 1 = banho

termostatizado; 2 = tubo tipo Falcon.

O núcleo utilizado para o adsorvente é composto por esferas de zircônia estabilizadas

com ítria (ρc = 3,814 g/mL) cujo diâmetro médio de partícula é aproximadamente 200,0 µm, e

foi adquirido da empresa Soesferas (São Paulo/BR). A matriz insolúvel é a base de pó de

Agarose Tipo VII com baixa temperatura de gelificação adquirida da Sigma Aldrich

(Missouri/USA). O óleo de girassol foi obtido em um supermercado local. O surfactante

utilizado foi o Span 80. Os corantes reativos - Azul Brilhante de Remazol RN, Remazol Azul

Turquesa G 133% e Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado - foram doados pelo

Laboratório de Processos Químicos Têxteis, vinculado ao Departamento de Engenharia Têxtil

da Universidade Federal do Rio Grande do Norte(UFRN).Para as etapas de cross-linking,

imobilização com corante reativo e avaliação da capacidade de adsorção do adsorvente

pelicular foram utilizados frascos Erlenmeyer de 50 mL a agitação foi realizada em incubador

rotativo.

3.1.2 Métodos

3.1.2.1 Síntese do adsorvente pelicular

O método empregado para a síntese do adsorvente pelicular baseia-se no procedimento

descrito por Asgari et al.(2014). Seguiu-se o método com algumas modificações conforme

descrito abaixo:



Os adsorventes peliculares foram sintetizados em escala de laboratório seguindo o

método de emulsificação água em óleo mencionado acima. Neste trabalho, 400 mL de óleo de

girassol foram colocados em um recipiente cilíndrico de polipropileno, conforme Figura 3.1,

juntamente com uma quantidade pré-definida do surfactante Span 80 (12,8 g/L). Ambos

foram aquecidos a 90°C, sob agitação a 1600 rpm durante cerca de 10 min. Um tubo tipo

Falcon foi usado para a preparação do gel de agarose, conforme ilustrado na Figura 3.2. Nesse

tubo, as esferas de zircônia estabilizadas com ítria foram misturadas com 40 mL de solução de

agarose pré-preparada (4%, v/v) a 85 °C sob agitação por cerca de 40 min. A fração do

volume de sólido na suspensão (0,2 v/v) foi mantida constante em todos os ensaios. A

uniformidade da pasta foi visualmente monitorada e mantida pelo ajuste da temperatura e

agitação. Após esse tempo, a suspensão de agarose (40 mL) foi transferida para a fase óleo

(primeiro recipiente, Figura 3.1) obtendo-se 10% (v/v) de dispersão aquosa em óleo e mantida

a 90 °C a 1600 rpm por 30 min. Após esse período, o recipiente contendo o óleo e as

partículas com agarose foi arrefecido até atingir a temperatura de 20 °C, sendo mantida por 30

min sob mesma agitação. As partículas, que compreendem um núcleo de zircônia revestido

com uma camada de agarose, foram deixadas em repouso e a fase de óleo removida. Os

adsorventes foram, subsequentemente, lavados com acetona e água deionizada até que o óleo

residual fosse completamente eliminado. As partículas foram armazenadas em solução

contendo etanol (20% v/v) até serem utilizadas nos experimentos.

3.1.2.2 Caracterização física dos adsorventes peliculares

As principais propriedades físicas do adsorvente como composição, densidade e

geometria foram analisadas.

A forma e aparência dos adsorventes peliculares foram observadas utilizando um

microscópio óptico Olympus, modelo BX51 equipado com uma câmera UC30 e software

Analysis. A distribuição de tamanho de partícula e o diâmetro médio (dm) foram

caracterizados pelo Analisador granulométrico CILAS, modelo 1180.

As propriedades físicas foram definidas e calculadas como segue. A densidade

aparente ρp (g/ml) das partículas de zircônia ítria -agarose foi estimada através da seguinte

equação proposta por Li (2006):



𝜌𝑝 = [𝑅𝑐

3.𝜌𝑐+(𝑅𝑝3−𝑅𝑐

3).𝜌𝑔𝑒𝑙]

𝑅𝑝3 (3.1)

sendo 𝜌𝑝, 𝜌𝑔𝑒𝑙 e 𝜌c (g/mL) a densidade aparente do adsorvente pelicular, a densidade da

agarose e a densidade do núcleo (zircônia ítria), respectivamente. Rp e Rc representam os raios

da partícula e do núcleo, respectivamente.

O teor de água w (%) foi obtido por desidratação a 105 °C por 5 horas, sendo

monitorado até a massa ficar constante, e foi calculado segundo Asgari et al. (2014) como

segue:

𝑤 (%) =𝑚2−𝑚3

𝑚2− 𝑚1 𝑥 100 (3.2)

sendo que 𝑚1, 𝑚2 e 𝑚3 (g) representam a massa do frasco, da matriz e do frasco antes da

secagem e da matriz e do frasco após a secagem, respectivamente. Considerando que todos os

poros nas matrizes adsorventes foram preenchidos com água, a porosidade P (%) representa a

porcentagem do volume de poro por volume de matriz e foi calculada, de acordo com Asgari

et al. (2014), como segue:

𝑃 =𝑤𝜌𝑝

𝜌𝑤 𝑥 100 (3.3)

A fração de volume de agarose (f) no adsorvente sintetizado foi calculada por balanço

de massa, conforme Asgari et al. (2014), usando dados de densidade como a seguir:

𝑓 =𝜌𝑐− 𝜌𝑝

𝜌𝑐− 𝜌𝑔𝑒𝑙 𝑥 100 (3.4)

sendo 𝜌𝑐 a densidade da esfera de zircônia (g/mL), 𝜌𝑝 significa a densidade aparente da

matriz adsorvente e 𝜌𝑔𝑒𝑙 representa a densidade da agarose (1,03 g/mL, de acordo com Zhou

et al. (2004)).



3.1.2.3 Reticulação química das partículas (cross-linking) e imobilização com corante

reativo

O aumento da resistência estrutural e mecânica das partículas adsorventes foi

alcançado pelo emprego de reticulação química, usando-se epicloridrina conforme o

procedimento de Asgari et al. (2014) com modificações.

As partículas (1,5 g) foram suspensas em10 mL de NaOH a 0,5 M com agitação de

150 rpm, a temperatura ambiente, por 30 minutos. Após esse período, 0,2 mL epicloridrina foi

adicionada e a reação prosseguiu durante 6 h na mesma temperatura. As partículas que

reagiram foram lavadas exaustivamente com água deionizada para remover os reagentes que

não reagiram e a estabilidade térmica das partículas reticuladas na presença de NaOH 0,5 M

foi testada visualmente após autoclavagem a 121 °C durante 1 h.

O método utilizado para a imobilização dos corantes reativos foi o mesmo reportado

por He et al. (1997). Uma solução com concentração de 30,0 g/L de cada corante reativo foi

preparada utilizando água deionizada. Um volume de 5,0g de adsorvente pelicular foi

misturado em 5,0 mL da solução corante sob agitação por 15 minutos. Em seguida, foram

adicionados 1,5 g de NaCl e 6,0 mL de Na2CO3 (1,0 M), misturando-se por 30 e 5 minutos,

respectivamente. O frasco foi mantido a 30 °C sob agitação a 150 rpm por 4 horas. Após a

reação, as partículas imobilizadas com o corante foram lavadas diversas vezes com uma

solução de etanol 25% contendo NaCl (1 M) e água destilada a fim de remover o corante não

reagido.

3.1.2.4 Densidade ligante

A densidade ligante foi realizada a partir do método descrito por Chambers (1977)

com alterações. A técnica consiste na liberação do ligante da matriz de agarose por hidrólise

ácida e quantificação do corante liberado por espectrofotometria. Nesse caso, 10,0 mg das

partículas imobilizadas com os três corantes utilizados (Azul RN, Turquesa G e Amarelo

Ouro) foram suspensas em 5,0 mL de HCl 6,0 M. Incubou-se à temperatura ambiente sob

agitação fixa a 150 rpm por 15 minutos. Em seguida, uma alíquota de cada solução foi

retirada e quantificada por espectrofotometria usando os seguintes comprimentos de onda:

Azul Brilhante de Remazol RN, 595 nm; Remazol Azul Turquesa G 133%, 625 nm e



Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado, 410 nm. A faixa de concentração utilizada para a

curva padrão dos corantes foi 2,5 a 100 µg/mL, mantida a mesma para os três corantes

estudados.

3.1.2.5 Determinação da concentração de proteínas totais

A Albumina de Soro Bovino (BSA) foi utilizada como proteína modelo nos ensaios de

adsorção e o método de Bradford (1976) foi utilizado para determinação do conteúdo

protéico. Todas as amostras foram analisadas adicionando-se 1,0 mL do reagente de Bradford

a 250,0 μL de amostra, deixando-se em contato por 15 minutos aproximadamente. Após esse

período, a mistura foi analisada por espectroscopia no comprimento de onda de 595 nm. A

concentração de proteínas foi obtida por análise da curva padrão usando-se a própria BSA; a

faixa usada foi 0,125 a 0,5 mg/mL.

3.1.2.6 Triagem dos corantes reativos

Para determinação das condições iniciais do adsorvente pelicular, antes da operação

em leito expandido, foram realizados ensaios de adsorção em batelada. De modo a conhecer o

comportamento da interação ligante-proteína, fez-se uma triagem utilizando a solução tampão

acetato de sódio na faixa de pH de 3,5 a 6,0, cuja força iônica da solução foi fixada em 0,05

M e as resinas imobilizadas com três corantes reativos: Azul Brilhante de Remazol RN,

Remazol Azul Turquesa G133% e Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado, além disso

avaliou-se a interação não específica (usando partículas não imobilizadas). Em frascos

Erlenmeyer de 50,0 mL, foram adicionados 10,0 mL da solução de acetato de sódio - BSA

com concentração 1,5 mg/mL juntamente com 0,5 g da resina. Os frascos foram mantidos sob

agitação constante de 150 rpm e temperatura ambiente (25 °C + 1) por 6 horas. Em seguida,

as alíquotas retiradas foram quantificadas pelo método de Bradford (1976), conforme descrito

no item anterior.



3.1.2.7 Cinética de adsorção

Com o intuito de analisar o comportamento da interação proteína-resina com o tempo,

avaliou-se a cinética de adsorção. Em Erlenmeyers de 250 mL foram adicionados 100 mL da

amostra, com concentrações 0,25 e 0,5 mg/mL, respectivamente, juntamente com tampão

acetato de sódio 0,05 M e pH 4,5 na qual se adicionou 0,5 g do adsorvente pelicular

imobilizado com o ligante (corante reativo) que apresentou o melhor desempenho na triagem

dos corantes reativos. Retiraram-se alíquotas em intervalos pré-determinados ao longo de 10

h, verificando-se a concentração de proteína final com relação à inicial em função do tempo.

A quantidade de proteína adsorvida na fase sólida foi calculada de acordo com a Equação 3.5.

A quantidade de proteína (BSA) retida na fase sólida foi calculada, por um balanço de

massa, conforme Equação 3.5:

𝑞 = 𝑉(𝑐0−𝑐)

𝑉𝑎𝑑𝑠 (3.5)

sendo q a quantidade de proteína adsorvida na resina (mg), V o volume (mL) da solução de

proteína (BSA), c0 o valor da concentração inicial de proteína (mg.mL-1

), c o valor da

concentração de proteína remanescente na fase líquida e Vads o volume de adsorvente (mL).

3.1.2.8 Isoterma de adsorção

Isotermas de adsorção são curvas que descrevem o comportamento da adsorção de

solutos por sólidos, ou seja, a relação de equilíbrio entre a concentração na fase fluida e a

concentração nas partículas adsorventes, a uma temperatura constante. Uma isoterma de

adsorção mostra a quantidade de um determinado soluto adsorvida por uma superfície

adsorvente, em função da concentração de equilíbrio do soluto. Para gases, a concentração é

dada em porcentagem molar como uma pressão parcial. Para líquidos, a concentração

geralmente é expressa em unidades de massa. A técnica usada para gerar os dados de

adsorção é, a princípio, bastante simples, pois uma quantidade conhecida do soluto é

adicionada ao sistema contendo uma quantidade conhecida de adsorvente. Admite-se que a

diferença entre a quantidade adicionada e a remanescente na solução encontra-se adsorvida na

superfície adsorvente (Alleoni et al., 1998).



Há muitos fatores que influenciam a adsorção de proteínas, os principais são a

afinidade da proteína com o adsorvente, a distribuição desigual do ligante na superfície da

proteína, a competição com outras espécies e as interações entre os solutos adsorvidos ou em

solução (Cano et al., 2005).

Os modelos mais comumente encontrados para descrever as isotermas de adsorção de

bioprodutos são as de Freundlich, a de Langmuir e a linear. Para cada isoterma, a abscissa

mostra a concentração de soluto na solução, geralmente em massa de soluto por volume de

solução, enquanto a ordenada dá a concentração de soluto na superfície do adsorvente, mais

comumente em unidades de massa de soluto por massa de adsorvente.

O modelo de adsorção linear é dado pela Equação 3.6, a seguir:

q*=K C* (3.6)

sendo q* é a concentração da espécie de interesse adsorvida na fase sólida, C* é a

concentração do composto de interesse na solução e K é a constante de equilíbrio. No entanto,

essa isoterma é pouco usual.

O modelo de Freundlich é bastante semelhante ao linear, sendo dado por:

q* = K.C n (3.7)

As constantes K e n são determinadas experimentalmente. Se a adsorção é favorável,

n<1 e se é desfavorável, n>1 (Moraes, 2009).

O modelo de Langmuir é usado para representar a adsorção para a maioria das

proteínas. Este modelo foi originalmente desenvolvido para representar a adsorção em

monocamada sobre uma superfície ideal, onde o calor de adsorção deve ser independente da

cobertura da fase sólida. O modelo de Langmuir pode ser estendido para a adsorção em

sistemas binários ou multicomponentes. O modelo é dado pela Equação 3.8:

𝑞∗ =𝑞𝑚𝐶∗

𝐾𝑑 + 𝐶∗ (3.8)

Sendo q* correspondente à quantidade de proteína adsorvida no adsorvente (mg.mL-1

de

adsorvente), c* é a concentração da proteína em solução (mg.mL-1

), qm é a capacidade

máxima do adsorvente (mg.mL-1

de adsorvente) e Kd é a constante de dissociação (mg.mL-1

).



Preparou-se soluções com diferentes concentrações de BSA em tampão acetato de

sódio pH 4,5 e força iônica 0,05 M, com concentrações iniciais que variaram de 0,15 a 2,5

mg/mL. Colocou-se, em cada Erlenmeyer de 50 mL, 0,25 g da resina e 10,0 mL da solução de

BSA. Ensaios com adição de NaCl nas concentrações 0,5 e 1,0 M também foram realizados.

Os frascos foram vedados e mantidos sob agitação a 25 °C por 6 h. Após este período, a

concentração da proteína no sobrenadante foi quantificada e a quantidade de proteína

adsorvida na fase sólida foi calculada de acordo com a Equação 3.5.

Com os valores da concentração de proteína no equilíbrio, tanto para fase líquida

como para a fase sólida, os modelos de isotermas de Freundlich e Langmuir foram aplicados e

os parâmetros dessas isotermas foram estimados, usando-se um ajuste não linear por meio do

software Origin 6.0 (Microcal, MA/USA).

3.2 Adsorção em Leito Expandido

3.2.1 Material

Uma coluna de vidro com diâmetro interno igual a 1,0 cm e 60,0 cm de altura,

especialmente projetada para este trabalho, foi utilizada para a operação em leito expandido.

A porção inferior da coluna foi preenchida pelo adsorvente sintetizado. O distribuidor

selecionado foi um prato perfurado de 1,5 cm de diâmetro, com 5 furos de 1,0 mm. A

transferência do tampão foi realizada pela bomba peristáltica TE-BP-01 (Tecnal). A Figura

3.3 ilustra o aparato experimental, podendo-se visualizar a coluna e a bomba utilizadas.



Figura 3.3 – Aparato experimental para os ensaios de adsorção em leito expandido.

3.2.2 Métodos

3.2.2.1 Expansão do leito

A análise das características de expansão do leito foi realizada usando a coluna,

projetada para este trabalho, preenchida com 10,0 cm de altura da resina sintetizada e

imobilizada com o ligante que apresentou a melhor capacidade de adsorção na triagem dos

corantes reativos. O tampão acetato de sódio, pH 4,5 e 0,05 M, foi utilizado em todos os

ensaios e alimentado na coluna com uma vazão crescente até que a superfície do leito não

apresentasse alteração na altura ou aspecto instável. Foram realizados ensaios com tampão

bem como na presença de glicerol 10 e 15%.Para permitir a estabilização do leito, manteve-se

um intervalo de 20 minutos antes da alteração da vazão. As medições de altura foram feitas

dentro desse intervalo. Para determinar o coeficiente de Richardson-Zaki e a velocidade

terminal da partícula, fez-se a linearização da velocidade superficial e da porosidade do leito

e, através de regressão linear, os parâmetros foram encontrados (Kalil, 2000). Os ensaios

foram realizados utilizando a proteína modelo, Albumina de Soro Bovino (BSA).



3.2.2.2 Curva de ruptura

Para obtenção da curva de ruptura, manteve-se a altura do leito em 10,0 cm, com a

vazão de alimentação mantida de modo a operar no grau de expansão 1,4. Tampão acetato de

sódio, pH 4,5 e 0,05 M, foi alimentado até equilibrar a resina. Posteriormente, a vazão de

alimentação foi aumentada gradativamente de forma a se obter o grau de expansão desejado.

Em seguida, aplicou-se a solução com a proteína modelo e alíquotas foram retiradas na saída;

a cada 10 mL passante descartava-se 8 mL e recolhia-se 2 mL para análise. O volume foi

quantificado através de proveta graduada. Utilizou-se o método integral da área sob a curva

para calcular a capacidade dinâmica do adsorvente.

CAPÍTULO IV

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Resultados e discussões 52


4 Resultados e discussão

Neste capítulo são apresentados e discutidos os resultados de síntese e caracterização do

adsorvente pelicular desenvolvido a partir de zircônia e agarose. Avalia-se a capacidade de

adsorção da BSA ao se utilizar ensaios em tanques agitados. Apresentam-se também os

resultados obtidos ao se utilizar diferentes modelos para ajustar os dados da isoterma e

dados obtidos no processo ALE.

4.1 Síntese do adsorvente

4.1.1 Morfologia do adsorvente pelicular

Os adsorventes peliculares foram preparados a partir do método de emulsificação água em

óleo. As partículas são compostas por um núcleo de zircônia estabilizado com ítria e uma

cobertura de agarose. Durante a fase inicial deste trabalho, outros núcleos foram testados, mas

não atenderam os requisitos necessários para o processo: esferas de vidro não apresentaram

bom desempenho uma vez que quebravam ao atingirem a parede do recipiente devido a alta

agitação requerida; pó de aço inoxidável e de zinco também foram testados, mas não foram

utilizados porque não havia uniformidade na superfície da estrutura (não eram esféricos).

Então, a escolha do núcleo foi feita tomando-se como referência os trabalhos de Sun et al.

(2001) e de Jahanshahi et al. (2008) e a disponibilidade do mercado em oferecer micro esferas

com densidade elevada.

A Figura 4.1 mostra a aparência da partícula sintetizada. Pode-se observar claramente que

os adsorventes sintetizados apresentam-se na forma pelicular e possuem diâmetros variados,

característica favorável à operação em leito expandido (Asgari et al., 2014). Destaca-se,

entretanto, que a espessura da película de agarose que reveste a partícula de zircônia não se

apresenta uniforme. Durante o processo para obtenção dos adsorventes peliculares, a agitação

foi mantida a 1600 rpm, e o impelidor foi ajustado bem próximo ao fundo a fim de que todas

as partículas, independente do tamanho, se mantivessem em suspensão nesta etapa,

acarretando em pouca ou nenhuma agregação das partículas, formando poucos complexos

aglomerados, em que se observa a junção de duas ou mais esferas de zircônia ligadas por uma

camada espessa da matriz de agarose. Conforme se pode observar na Figura 4.2.



Figura 4.1 – Aparência da partícula zircônia - agarose a partir de microscópio óptico (20x).

Figura 4.2 – Formação de complexo aglomerado.



Destaca-se, também, que foi observada a formação de pequenas esferas sem o núcleo de

zircônia. A existência dessas partículas, também chamadas de contínuos homogêneos é

reportada na literatura (Sun et al., 2001). Essas pequenas esferas formadas apenas por agarose

foram encontradas em praticamente todas as bateladas e a maior parte delas era eliminada no

processo de lavagem com acetona e água destilada para retirada do óleo. O aspecto dos

contínuos homogêneos é ilustrado na Figura 4.3.

Figura 4.3 – Formação do Contínuo homogêneo

O processo de obtenção de adsorventes peliculares é sensível a alguns fatores como, por

exemplo, a agitação das fases e o preparo da pasta de agarose. Estes dois elementos são

cruciais para uma síntese satisfatória. Na Figura 4.1, pode-se observar que a camada de

agarose apesar de não estar distribuída uniformemente pela superfície das esferas de zircônia

conseguiu revestir praticamente todas as partículas proporcionando assim a possibilidade de

se imobilizar o corante. O aspecto do adsorvente sintetizado neste trabalho e o das resinas

reportadas em Jahanshahi et al. (2008), Aghari et al. (2012) e Asgari et al. (2014) são

semelhantes evidenciando que o processo de obtenção da resina foi satisfatório.

Na Figura 4.1, pode ser observado um deslocamento da camada de polímero em algumas

partículas. Isso ocorreu, provavelmente, devido a dificuldades na operação de mistura do



reator, a não utilização de defletores e a alta velocidade de agitação durante a etapa de

resfriamento. Vale salientar que estas são hipóteses não testadas. Com isso, as possíveis

soluções para que esse efeito seja minimizado podem ser: a inserção de defletores para

melhorar a mistura dentro do reator, a redução da velocidade de agitação durante o processo

de resfriamento, além de um planejamento experimental para avaliar os parâmetros do

processo. A falta de uniformidade da cobertura de agarose nas esferas de zircônia ocasionou a

formação de uma estrutura um pouco fragilizada uma vez que apresentou possibilidades ao

deslocamento da película de agarose, sendo possível o arraste da cobertura caso o adsorvente

pelicular seja submetido a condições mais severas de agitação. Esse efeito é minimizado após

a realização da etapa de reticulação química (cross-linking). Com relação ao núcleo, durante

todo o processo, as esferas de zircônia se mantiveram estáveis não apresentando sinais de

fragmentação.

Para a síntese do adsorvente pelicular utilizou-se uma razão de partículas de zircônia

(núcleo) por agarose (matriz) de 0,20 (v/v). Essa razão foi escolhida a partir da análise dos

dados referenciados em outros trabalhos, conforme exposto na Tabela 4.1.Os valores listados

nesta tabela mostram que o diâmetro médio da partícula utilizada neste trabalho, zircônia

estabilizada com ítria, é semelhante ao diâmetro dos núcleos referenciados em Jahanshahi et

al. (2008), Asghari & Jahanshahi (2012) e Asgari et al. (2014), inclusive em Jahanshahi et al.

(2008) é apresentada uma densidade de núcleo (ρc) igual a 3,8 g/mL semelhante a deste

trabalho (ρc = 3,816 g/mL). Como nesses trabalhos utilizou-se uma razão de 0,22 (v/v), 0,20 e

0,15 (g/g), escolheu-se 0,20 (v/v) por estar dentro da faixa normalmente praticada e também

por proporcionar um bom rendimento por batelada.

Outro ponto relevante para a seleção da relação núcleo/matriz é exposto nos estudos

realizados por Asghari & Jahanshahi (2012), os autores testaram diversas razões de

núcleo/agarose e verificaram que 0,20 (v/v) fornecia melhor resultado durante os ensaios em

leito expandido. Dessa forma, a escolha da razão do núcleo esférico para agarose do presente

trabalho permite comparar às propriedades físicas das partículas obtidas, principalmente com

relação aos que utilizam zircônia, como apresentadas a seguir.

Na Tabela 4.1 estão algumas relações encontradas na literatura que auxiliaram na escolha

da razão núcleo (esferas) por agarose:



Tabela 4.1 – Relação núcleo esférico por agarose encontradas na literatura.

Referência Núcleo

esférico

Diâmetro médio

(dp)

Densidade

do núcleo

Razão

núcleo/agarose

Palsson et al.

(2000) Aço inox 32-50 µm 8,00 g/mL 0,42 (v/v)

Sun et al. (2001) Zircônia-sílica 98,90 µm 3,80 g/mL 0,14 (v/v)

Tong & Sun

(2001) Nd-Fe-B 43,00 µm 7,40 g/mL 0,08 (v/v)

Jahanshahi et al.

(2008) Zircônia-sílica 120,00 µm 3,80 g/mL 0,22 (v/v)

Asghari &

Jahanshahi

(2012)

Pó de zinco 140,54-191,11 µm 7,14 g/mL 0,20 (g/g)

Asgari et al.

(2014) Pó de níquel 126,81-151,47 µm 8,90 g/mL 0,15 (g/g)

4.1.2 Reticulação química (cross-linking) e imobilização das partículas

Segundo reportado por Berger et al. (2004), a reticulação das cadeias poliméricas de

biopolímeros como a agarose, processo também denominado de reação de entrecruzamento, é

um tipo de modificação química que visa unir suas cadeias poliméricas, ou ainda, ligar suas

cadeias às de outros polímeros gerando redes poliméricas híbridas.O processo de reticulação

por epicloridrina (haleto de epóxi-alquila) foi utilizado porque une covalentemente as cadeias

poliméricas da agarose por meio de uma reação de eliminação do haleto, seguida de abertura

do epóxido, com consequente formação do entrecruzamento. Essa reação ocorre unindo de

forma permanente sítios reativos das cadeias poliméricas da agarose através de ligações

intermoleculares, ou regiões distintas de uma mesma cadeia por meio de ligações

intramoleculares.



A etapa de reticulação foi realizada visando principalmente modificar determinadas

propriedades do biopolímero, tais como, estabilidade química e térmica, que são essenciais ao

processo de fabricação de um adsorvente. Como o processo de reticulação sofre influência

tanto de algumas características físico-químicas da agarose quanto das condições reacionais

adotadas, o tempo reacional utilizado foi elevado, a fim de favorecer as reações e

consequentemente promover um bom grau de reticulação (Gonsalves et al., 2011).

Diversos testes foram realizados com o intuito de conseguir a estabilidade mecânica e

térmica das partículas sintetizadas. Inicialmente, foram utilizadas as seguintes condições: 1,0

mL de partículas com igual volume de NaOH 1,0 M contendo 5,0 g/L de boro hidreto de

sódio, adicionando-se 2 % (v/v) de epicloridrina após 30 minutos da reação; testou-se também

essa mesma condição adicionando epicloridrina simultaneamente ao NaOH 1,0 M; outro teste

foi realizado utilizando 1,0 mL de adsorvente com igual volume da solução de NaOH 1,0 M e

boro hidreto de sódio com adição de 0,2 mL de epicloridrina. Durante esses ensaios,

verificou-se a total solubilização da matriz de agarose, retirando o revestimento da partícula e

deixando apenas o núcleo de zircônia ítria, antes mesmo do teste em autoclave. O processo

não foi bem sucedido possivelmente pela não uniformidade da camada de agarose e

concentração elevada do NaOH. Como esta etapa é de suma importância, visto que

proporciona aos adsorventes sintetizados maior estabilidade e resistência durante os ensaios

tanto em batelada quanto em coluna para leito expandido, fez-se uma modificação nas

condições do procedimento de reticulação, alterando-se a concentração do hidróxido de sódio

de 1,0 M para 0,5 M, e estabelecendo-se um volume fixo para a epicloridrina (0,2 mL) para

cada 10 mL de solução de NaOH. Com essas alterações, conseguiu-se obter a resistência

térmica dos adsorventes sendo verificada pelo teste em autoclave e a resistência mecânica foi

observada durante os testes em batelada e em leito expandido.

Após a etapa de cross-linking, imobilizou-se a matriz com os corantes reativos: Azul

Brilhante de Remazol RN, Remazol Azul Turquesa G 133%e Remazol Amarelo Ouro RGB

Concentrado. Conforme Pinheiro (2011), a imobilização ocorre porque os corantes reativos

podem formar ligações covalentes com grupos hidroxilas da fibra celulósica, com grupos

aminos, hidroxila e tióis das fibras protéicas, assim como com grupos aminos das poliamidas,

uma vez que há a presença de um grupo eletrofílico em sua composição; o grupo reativo

presente na estrutura do corante é o que favorece a interação com as moléculas de interesse,

neste trabalho, a interação do grupo funcional ocorre com os grupos hidroxila da agarose.



Nas Figuras 4.4 a 4.6, pode ser observada a aparência dos adsorventes peliculares após

imobilização com os ligantes. Foi verificado que todos os corantes utilizados se ligaram a

agarose de forma bastante satisfatória e não foram evidenciadas partículas revestidas de

agarose sem a ligação com o corante reativo.

Figura 4.4 – Estrutura da partícula zircônia - agarose imobilizada com o corante Azul

Brilhante de Remazol RN, a partir de microscópio óptico (20x).



Figura 4.5 – Estrutura da partícula zircônia - agarose imobilizada com o corante Remazol

Azul Turquesa G 133%, a partir de microscópio óptico (20x).

Figura 4.6 – Estrutura da partícula zircônia - agarose imobilizada com o corante Remazol

Amarelo Ouro RGB Concentrado, a partir de microscópio óptico (20x).



4.1.3 Densidade ligante

Avaliou-se a densidade ligante das partículas imobilizadas com os três corantes reativos:

Azul Brilhante de Remazol RN, Remazol Turquesa G133% e Remazol Amarelo Ouro RGB

Concentrado, a fim de identificar a massa de corante ligada por miligrama do adsorvente. Os

dados da Tabela 4.2 mostram que o corante Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado

obteve o melhor resultado durante a imobilização, ligando-se mais a superfície da agarose, o

que pode favorecer uma maior capacidade de adsorção da proteína modelo. Observa-se

também que a massa molar do corante, conforme estruturas apresentadas nas Figuras 2.5 a 2.7

parece ser o fator mais importante para garantir a imobilização do corante à agarose, uma vez

que a massa molar do Remazol Amarelo Ouro RGB concentrado é menor do que a do

Remazol Turquesa G133% e a do Azul Brilhante de Remazol RN e obteve o melhor

desempenho durante a imobilização, como pode ser observado na Tabela 4.2. Observa-se

também que muito embora a densidade ligante do corante Amarelo Ouro seja 2,3 vezes maior

que a do Remazol Turquesa G 133% sua massa molar não mantém essa proporção, ou seja,

apesar do Turquesa G possuir a maior massa molar, 764,5 g/mol, ele não apresenta o pior

resultado quanto à imobilização, sendo este atribuído ao Azul Brilhante RN com densidade

ligante de 0,25 µg/mg e massa molar de 660,0 g/mol,isto pode ser um indicativo de que além

da massa molar, a distribuição de cargas e o grau de hidrofobicidade do corante também

parecem ser importantes.

Tabela 4.2 – Densidade ligante dos corantes reativos testados

Corante Massa de

corante (µg)

Densidade ligante

(µg/mg)

Massa molar

(g/mol)

Azul Brilhante de

Remazol RN 50,30 0,25 660,00

Remazol Turquesa G

133% 65,70 0,33 764,50

Remazol Amarelo Ouro

RGB Concentrado 151,40 0,76 481,00



4.2 Propriedades físicas da partícula

A Figura 4.7 ilustra a distribuição de tamanho das partículas para o adsorvente pelicular

sintetizado e para as partículas de zircônia sem agarose. A distribuição de tamanho realizada

em Granulômetro Cilas mostra que a maioria das partículas adsorventes possui diâmetro entre

112 – 400 µm, com diâmetro médio de 197,54 µm e 202,25 µm, para partículas de zircônia e

para o adsorvente pelicular, respectivamente. Para formar um leito expandido estável, a

distribuição de tamanho deve estar entre 65 – 300 µm. Dessa forma, com a distribuição de

tamanho e diâmetro médio de partículas verifica-se que o adsorvente pelicular permite sua

aplicação em ALE. Observa-se, também, na Figura 4.7 que as partículas do adsorvente

pelicular apresentam uma distribuição bi-modal, com uma pequena população com diâmetro

médio de aproximadamente 60,0 µm. Entretanto, como as menores partículas de zircônia

possuem tamanho acima de 100,0 µm, logo esse primeiro pico refere-se às partículas de

agarose formadas sem a zircônia, ou seja, os contínuos homogêneos reportados por Sun et al.

(2001), conforme ilustrado na Figura 4.3.

Figura 4.7 – Distribuição de tamanho das partículas com e sem revestimento.



Algumas propriedades físicas importantes de adsorventes peliculares referenciados na

literatura foram listadas na Tabela 4.3. Os valores evidenciados em outros trabalhos mostram

que há uma redução considerável da densidade quando a partícula é revestida pela matriz

insolúvel. Isso ocorre porque a densidade da agarose é baixa (ρgel = 1,03 g/mL) e o

revestimento faz altera o volume total do composto, ocasionando mudança na densidade. Com

isso, observa-se que a fração de agarose influencia na densidade da partícula, uma vez que a

cobertura faz aumentar o volume do composto e, consequentemente, faz diminuir a densidade

do adsorvente pelicular.

Tabela 4.3 – Referências da literatura sobre dados de propriedades físicas dos adsorventes

Referência Matriz

Densidade

do núcleo

(g/mL)

Densidade

úmida /

aparente*

(g/mL)

Teor de

água (%)

Porosidade

(%)

Fração

de

agarose

(%)

Asghari &

Jahanshahi

2012

Pó de zinco-

agarose 7,14 1,33 75,00 95,00 95,00

Asgari et al.

2014

Pó de

níquel-ágar 8,90 1,64 62,74 98,00 92,00

Este

trabalho

Zircônia

ítria-agarose 3,82 3,63* 10,98 40,84 6,30

*A densidade da partícula zircônia – agarose (este trabalho) é a aparente (g/mL) e foi calculada de

acordo com a Eq. 3.1. Para os dois trabalhos referenciados a densidade mensurada é a densidade

úmida realizada por picnometria (g/mL).

O valor da densidade aparente (ρp) do adsorvente pelicular sintetizado neste trabalho

foi calculado de acordo com a Equação 3.1, sendo o valor encontrado igual a 3,626 g/mL, não

muito diferente da partícula sem cobertura (ρc = 3,816 g/mL). Comparando os resultados

obtidos com os de outros trabalhos (Tabela 4.3), verifica-se que os valores encontrados estão

abaixo dos referenciados, principalmente no item fração de agarose, o qual se refere ao



percentual de agarose presente no adsorvente pelicular. As propriedades expostas na Tabela

4.3 estão relacionadas com parâmetros fundamentais como a densidade do núcleo, da

partícula revestida e a espessura da cobertura. Como esta última é pequena, a densidade

encontrada para o composto sintetizado foi baixa e, consequentemente, a fração de agarose, a

porosidade e o teor de água também foram, uma vez que esses fatores são dependentes de

uma relação entre a densidade do núcleo e da matriz revestida. Portanto, atribui-se essa

diferença nos valores a ausência de uma camada mais espessa e ao não revestimento de

partículas de maior diâmetro o que justifica a densidade do adsorvente pelicular tão próxima a

densidade do núcleo, algo que não é evidenciado em outros trabalhos conforme pode ser visto

na Tabela 4.3.

4.3 Triagem dos corantes e cinética de adsorção

Para a realização do estudo cinético de adsorção foi realizada a uma triagem dos

adsorventes peliculares por adsorção específica (imobilização com os três corantes estudados)

e não específica (sem presença de corante) nos pHs de 3,5 a 6,0. Foi utilizada a proteína

modelo BSA e tampão acetato 0,05 M.

Figura 4.8 - Triagem dos adsorventes peliculares por adsorção específica e não específica

em diferentes pH.



A Figura 4.8 mostra que o pH igual 4,5 apresentou melhores resultados tanto para a

adsorção específica quanto para a não específica. O ligante Azul Brilhante de Remazol RN

obteve um melhor resultado quando atuou no pH 4,5 (107,47 mg/mL de adsorvente), uma vez

que possui um grupo SO3- disponível para ligação com a BSA, além de apresentar mais

grupos hidrofóbicos do que o Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado. No entanto, este

último ligante apresentou uma quantidade adsorvida muito próxima ao primeiro (94,49

mg/mL de adsorvente) e se mostrou mais estável na faixa de pH 4,5 a 5,0; o que não ocorre

com os demais. Com base nesse resultado, escolheu-se este último para efetuar os

experimentos em leito expandido. Sendo o pI da BSA igual a 4,9, em pH 4,5 a mesma

apresenta distribuição de carga positiva facilitando sua ligação com o SO3- disponível. Dessa

forma, ao se aumentar o pH (maior que 5,0) reduz-se a capacidade de ligação da BSA ao

corante devido a maior repulsão das cargas da proteínas, pois tem predomínio de cargas

negativas. Comportamento semelhante é reportado por Asgari et al. (2014).

Comparando o resultado obtido com o corante reativo Remazol Amarelo Ouro RGB

Concentrado com os dados disponíveis na literatura para o corante Reativo azul 4, uma vez

que não há registros dos corantes selecionados em outros trabalhos, observa-se que a

quantidade adsorvida pelo adsorvente pelicular sintetizado é superior a obtida com a

Streamline DEAE® e também quando comparado a outro adsorvente pelicular. Com relação à

espessura da camada de agarose do adsorvente pelicular zircônia-ítria-agarose, sintetizado

neste trabalho, evidencia-se que mesmo com uma cobertura significativamente menor do que

a referenciada em Asgari et al. (2014), conforme Tabela 4.4, obteve-se uma quantidade

adsorvida elevada devido a forte interação entre o ligante e a proteína modelo.

Tabela 4.4 – Dados de capacidade de adsorção experimental.

Referência Matriz qexp (mg/mL)

Asgari et al.(2014) Pó de níquel-ágar-Reativo azul 4 64,01

Asgari et al.(2014) Streamline-Reativo azul 4 54,00

Este Trabalho Zircônia ítria – agarose – Amarelo Ouro 94,49



Para alcançar um bom desempenho durante a operação de adsorção em leito

expandido é necessário conhecer as condições iniciais do processo, visto que a interação entre

o adsorvente e o adsorbato é definida por estes fatores. Para as proteínas, o pH e o tipo de

ligante selecionado exercem forte influencia sobre a estrutura da biomolécula, bem como em

sua carga líquida e, por isso, atuam de forma decisiva sobre a adsorção em resinas de

afinidade (Padilha, 2013).

O estudo cinético foi realizado com o corante Remazol Amarelo Ouro RGB

Concentrado uma vez que demonstrou ter melhor desempenho. A Figura 4.9 ilustra as curvas

cinéticas de adsorção para as concentrações iniciais de 0,25 e 0,50 mg/mL de BSA. Observa-

se que o decaimento assumiu comportamento característico a este tipo de ensaio, atingindo o

equilíbrio após 30 minutos, para C0 = 0,25 mg/mL e 60 minutos, C0 = 0,50 mg/mL. Segundo

Hu et al. (2014), concentrações diferentes desencadeiam tempos de equilíbrio diferentes,

quando a concentração inicial é maior o tempo requerido para atingir o equilíbrio é mais

elevado.O conhecimento da cinética de adsorção é uma importante informação para a

concepção de sistemas de adsorção, visto que fornece dados de equilíbrio.

Figura 4.9 – Cinética de adsorção da BSA em tampão acetato 0,05 M e pH 4,5.



4.4 Isoterma de adsorção

Os dados de isoterma de adsorção foram obtidos conforme descrito anteriormente,

utilizando tampão acetato de sódio (0,05 M), pH 4,5 a 25°C.Ensaios com adição de NaCl 0,5

e 1,0 M foram realizados a fim de avaliar o efeito da força iônica na capacidade de adsorção

da proteína modelo. Os dados da isoterma de adsorção sem e com adição de sal, assim como

os ajustes pelos modelos de Langmuir e de Freundlich são mostrados na Figura 4.10. Como

pode ser visto na figura, com o aumento da concentração de sal de 0,0 para 1,0 M, houve um

descrécimo na capacidade de adsorção da BSA pelo adsorvente imobilizado com o ligante

Amarelo Ouro de 88,108 para 21,141 mg/mL de adsorvente. Evidenciando-se que o aumento

da força iônica ocasiona a diminuição da capacidade de adsorção do adsorvente. A capacidade

de adsorção e afinidade da BSA pelo corante ligado a matriz de agarose diminuem com o

aumento da concentração de sal devido a diminuição das interações eletrostáticas entre o

ligante e as moléculas da proteína. Comportamento semelhante pode ser observado em Asgari

et al. (2014).

Figura 4.10 – Isotermas de adsorção da BSA com o corante Remazol Amarelo Ouro RGB

Concentrado.



A Tabela 4.5 mostra os dados encontrados das constantes para as diferentes forças iônicas,

sendo possível observar que a equação de Langmuir se ajustou bem aos valores

experimentais. A variação de qm e Kd é oposta, pois o valor de Kd apresenta um aumento com

a concentração de sal enquanto que o valor da capacidade máxima de adsorção diminui.

Resultados semelhantes são reportados em Zhou et al. (2004) e Asgari et al. (2014). Os

resultados mostram que para um baixo valor da constante de dissociação, o ligante apresenta

maior afinidade e para valores mais elevados de Kd apresentou menor afinidade, indicando

que soluções com alta concentração de sal irão favorer a eluição da proteína modelo.

Observou-se que a quantidade máxima adsorvida de BSA para adsorvente pelicular com

Remazol Amarelo Ouro sem adição de NaCl encontrado pelo ajuste de Langmuir foi de

102,328 mg/mL de adsorvente, ficando próximo ao valor real de 88,108 mg/mL de

adsorvente. Esses valores podem ser evidenciados na Tabela 4.5.

Tabela 4.5 – Comparação das constantes das isotermas de Langmuir e Freundlich para

adsorção da BSA com o adsorvente pelicular sintetizado.

NaCl

(M)

qexp

(mg/mL)

Modelo Langmuir Modelo Freundlich

R² Kd

(mg/mL)

qm

(mg/mL) R² n Kf

0,0 88,108 0,856

0,0956

+ 0,041

102,328

+ 3,012

0,633

0,234

+ 0,101

90,893

+ 3,215

0,5 22,942 0,831

0,658

+ 0,574

40,115

+ 4,850

0,773

1,632

+ 0,588

6,743

+ 1,047

1,0 21,141 0,952

1,784

+ 1,281

39,521

+ 3,971

0,913

1,478

+ 0,461

3,614

+ 0,527



4.5 Adsorção em Leito Expandido

4.5.1 Expansão do leito e efeito da viscosidade

Segundo Jahanshahi et al. (2008), a expansão do leito contribui para a eficiência de

adsorção como uma função da distribuição do líquido, viscosidade do líquido, propriedades

de partícula e a características da coluna em termos de efeitos de parede e do distribuidor.

Características de expansão do leito e a relação entre a velocidade de alimentação e taxa de

expansão do leito os adsorventes peliculares sintetizados foram analisados sob condição

normal de operação para ALE. Os resultados são mostrados na Figura 4.11. Observa-se a

partir da figura que houve uma relação linear relativa entre o grau de expansão e velocidade

de operação para o adsorvente sintetizado. O grau de expansão ideal para aALEsitua-se na

faixa entre 2 e 3, de acordo com os resultados obtidos é possível observar que o adsorvente

alcançou grau 2 com uma velocidade de fluxo de 4.625,1 cm/h (ρp = 3,63 g/mL), sendo

bastante elevada quando comparada ao que foi reportado por Asgari et al. (2014) que obteve

1.517,83 cm/h (ρp = 2,78 g/mL). Essa diferença é justificada uma vez que a resina sintetizada

neste trabalho possui alta densidade, fazendo com que ela se apresente mais estável durante a

operação de ALE e favoreça a utilização de um fluxo elevado da fase móvel.

A viscosidade do fluido passante é um importante parâmetro que afeta as propriedades

de expansão do leito. No presente trabalho, soluções de glicerol, 10% e 15% (v/v), foram

aplicadas na coluna a fim de se analisar o comportamento da dispersão do leito expandido.

Como esperado, verificou-se que os adsorventes expandem-se mais facilmente no fluido com

viscosidade superior uma vez que sua velocidade terminal será menor, conforme Equação

2.13. Dessa forma, uma mesma partícula submetida a uma mesma velocidade supercial porém

em meio mais viscoso se expandirá mais. Com a adição de glicerol, o grau de expansão 2 foi

obtido mais facilmente e com menor velocidade (2.742,75 cm/h para 15% de glicerol e

3.161,05 cm/h para 10% de glicerol). Neste estudo, os resultados mostraram que a resina

sintetizada tem uma boa característica de expansão e pode ser utilizada a uma velocidade de

operação elevada.



Figura 4.11 – Grau de expansão do leito para o adsorvente pelicular em função da velocidade

do fluido.

4.5.2 Correlação da porosidade do leito e velocidade de operação

Para determinar o coeficiente de Richardson-Zaki e a velocidade terminal da partícula,

plotou-se os parâmetros ln (U) versus ln (ε),representado na Figura 4.12. Observa-seque a

porosidade do leitoaumenta com o aumentodavelocidade do fluido. Resultados semelhantes

foram relatados em Asgari et.al. (2014).

Figura 4.12 – Correlação de Richardson-Zaki entre a velocidade do fluido e a porosidade do

leito.



Baseado na relação entre a porosidade do leito expandido (ε) com velocidade

superficial do líquido (U), a velocidade terminal da partícula (Ut) e o coeficiente de expansão

(n) foram calculados. A porosidade do leito pode ser estimada a partir da Equação 4.1.

GE=1− 𝜀0

1− 𝜀 (4.1)

A porosidade do leito sedimentado é comumente assumida como 0,4 (Asghari &

Jahanshahi, 2012).

Os parâmetros de correlaçãoforam encontrados por regressão lineare estão listados na

Tabela 4.6.

Tabela 4.6 – Parâmetros Ut e n correlacionados pela equação de Richardson-Zaki.

Fase líquida Ut exp (cm/h) n R²

Tampão 15.229,660 3,785 0,961

Glicerol 10 % 11.070,070 3,575 0,983

Glicerol 15% 13.932,790 4,765 0,992

Os valores de n estão na faixa de3,575 a 4,765, e os coeficientes de regressão (R²)

foram: 0,961, 0,983 e 0,992. A velocidadde terminal da partícula está na faixa de 11.070,070

a 15.229,660 cm/h. Os valores para Ut foram bem elevados devido à alta densidade da resina;

para a fase com glicerol, a velocidade terminal estimada da resina é menor do que para a

solução contendo apenas tampão, o efeito da viscosidade afeta a velocidade terminal da

partícula favorecendo a sua diminuição quando comparada a fase móvel sem adição de

glicerol, esse comportamento é semelhante ao exposto por Kalil (2000). Com isso, um

adsorvente com maior densidade, como o sintetizado neste trabalho, requer maior velocidade

de operação (Tabela 4.7) e, consequentemente, terá uma velocidade terminal elevada

conforme é visto em Asgari et al. (2014). A Tabela 4.7 relaciona algumas velocidades de

fluxo com a densidade de suas respectivas matrizes para um grau de expansão igual a 2.



Tabela 4.7 – Comparação da velocidade superficial da agarose-zircônia (este trabalho) com

outras matrizes.

Referência Matriz U (cm/h) ρp(g/mL)

Este trabalho Agarose-

zircônia 4.625,10 3,63

Asgari et al.

(2014) Agar-níquel 1.517,83 2,78

Asghari et al.

(2012) Agarose-níquel 1.344,60 2,56

Asghari &

Jahanshahi (2012) Agarose-zinco 777,55 2,01

4.5.3 Curva de ruptura

A curva de ruptura permite avaliar a capacidade dinâmica do adsorvente operando em

um determinado leito, seja fixo ou expandido. O experimento foi realizado utilizando-se uma

altura do leito de 10,0 cm e aplicando-se 200 mL da amostra (solução de BSA com

concentração inicial de 1,953 mg/mL). Utilizou-se tampão acetato de sódio a pH 4,5 e 0,05 M

sem adição de NaCl e manteve-se o grau de expansão em 1,4durante o processo (para

alcançar esse grau a velocidade empregada foi 2.724,8 cm/h). A Figura 4.13 ilustra a curva de

ruptura obtida e mostra que ao se operar nessa faixa de velocidade é possível obter uma

capacidade dinâmica de 7,832 mg de BSA/mL de adsorvente, apesar da diminuição da

capacidade dinâmica, pela elevada velocidade usada, o adsorvente sintetizado se mostra

promissor para o processo de ALE. Em Asgari et.al. (2014) também é vista uma diminuição

da capacidade de adsorção quando o adsorvente é submetido a processos dinâmicos.



Figura 4.13 – Curva de ruptura da BSA ao se utilizar o adsorvente pelicular zircônia - agarose

imobilizado com o corante Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado.

CAPÍTULO V

CONCLUSÕES

Conclusões 74


5 Conclusões

Neste trabalho, foram sintetizadas partículas esféricas de zircônia estabilizadas com ítria e

revestidas com uma camada de agarose, para utilização como adsorvente no processo de

recuperação e purificação de biomoléculas por ALE. Para avaliar as características do

composto sintetizado foram analisadas algumas propriedades físicas e também o seu

comportamento em leito expandido.

Os adsorventes peliculares foram sintetizados pelo método de emulsificação água em

óleo. O objetivo foi alcançado, mas outros estudos ainda devem ser realizados, uma vez quea

morfologia da partícula pode ser melhorada com a aplicação de planejamento experimental a

fim de verificar a influência dos parâmetros envolvidos no processo como, por exemplo,

agitação e temperatura, assim como a inserção de defletores para melhorar a dispersão das

partículas.

A análise das características físicas do adsorvente pelicular mostrou que a maioria das

partículas possui diâmetro entre 112 e 400 µm, com diâmetro médio de 197,54 µm e 202,25

µm, para as partículas de zircônia e para o adsorvente pelicular, respectivamente. A espessura

da matriz de agarose foi de aproximadamente 5,0µm. A partícula apresentou uma fração de

agarose de 6,3%, conteúdo de água de 10,98% e porosidade de 40,84%. Comparando os

resultados obtidos com os valores referenciados em outros trabalhos, é possível ver que apesar

das condições não ideais do adsorvente pelicular sintetizado, ele obteve bons resultados, visto

que a interação do ligante Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado com a fração de agarose

de apenas 6,3% apresentou uma capacidade de adsorção (em batelada) de 88,108 mg de

BSA/mL de adsorvente, enquanto que Asgari et.al. (2014) relata uma capacidade de adsorção

de 64,01 mg de BSA/mL de adsorvente para uma fração acima de 70% com o corante Reativo

azul 4.

Resultados de cinética e isoterma de adsorção mostraram que o adsorvente pelicular

sintetizado neste trabalho tem comportamento semelhante aos demais adsorventes

referenciados em outros trabalhos. Os dados experimentais indicaram que o equilíbrio de

adsorção segue o modelo de Langmuir fornecendo um qm igual a 102,328 mg/mL de

adsorvente e R² igual a 0,856. Os ensaios com adição de NaCl mostraram que com o aumento

da concentração de sal de 0,0 para 1,0 M, houve um descrécimo na capacidade de adsorção da

Conclusões 75


BSA pelo adsorvente imobilizado com o ligante Amarelo Ouro de 88,108 para 21,141 mg/mL

de adsorvente, sendo evidenciado que a capacidade de adsorção e afinidade da BSA pelo

corante ligado a matriz de agarose diminuem com o aumento da concentração de sal devido a

diminuição das interações eletrostáticas entre o ligante e as moléculas da proteína. Os

resultados também mostraram que para um baixo valor da constante de dissociação, o ligante

apresentou maior afinidade e para valores mais elevados de Kd apresentou menor afinidade,

indicando que soluções com alta concentração de sal irão favorer a eluição da proteína

modelo.

O grau de expansão para o adsorvente alcançou grau 2,0 com uma velocidade de fluxo de

4.625,1 cm/h (ρp = 3,63 g/mL). Com a adição de glicerol, o grau de expansão 2 foi obtido

mais facilmente e com menor velocidade 2.742,75 cm/h. Neste estudo, os resultados

mostraram que a resina sintetizada tem uma boa característica de expansão e pode ser

utilizada a uma elevada velocidade de operação. No entanto, apresentou durante o processo de

operação em leito expandido um decréscimo acentuado da sua capacidade de adsorção de

88,108 para 7,832 mg de BSA/mL de adsorvente, isso se deve a elevada velocidade aplicada

ao processo.Com isso, mais estudos devem ser feitos a fim de analisar melhor esta etapa do

processo e melhorar a sua produtividade.

REFERÊNCIAS

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_____________________________________________

APÊNDICE

Apêndice 87


Apêndice

Apêndice A – Curva padrão dos corantes reativos

As figuras A.1 a A.3 apresentam as curvas padrão para cada corante reativo utilizado

neste trabalho. A faixa de concentração utilizada foi a mesma para todos os corantes 2,5 a 100

µg/mL.

Figura A.1 – Curva padrão do corante Azul Brilhante de Remazol RN

y = 408,0.x – 6,053

R² = 0,999

Apêndice 88


Figura A.2 – Curva padrão do corante Remazol Azul Turquesa G 133%.

Figura A.3 – Curva padrão do corante Remazol Amarelo Ouro RGB Concentrado.

y= 103,2.x – 2,287

R² = 0,997

y= 117,9.x – 5,282

R² = 0,997

Apêndice 89


Apêndice B – Curva padrão da BSA

As figuras B.1 e B.2 mostram as curvas padrão para a BSA nas faixas de concentração

indicadas.



y = 0,5665.x – 0,5039

R² = 0,985

y = 0,178.x – 0,021

R² = 0,971

DISSERTAÇÃO DE MESTRADO - Universidade Federal do Rio ... · Palavras-chave: adsorventes,...

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