E PERSPECTIVA CLÍNICA ENVELHECIMENTO CUTÂNEO. FISIOPATOLOGIA
DISSERTAÇÃO ENVELHECIMENTO CUTÂNEO
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Universidade do Vale do Paraíba
Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento
João Paulo Alves do Couto
“Análise comparativa da terapia com LED (640±20 nm) e laser (660 nm) sobre o processo de reparação cutânea em ratos idosos”
São José dos Campos, SP 2009
João Paulo Alves do Couto
“Análise comparativa da terapia com LED (640±20 nm) e laser (660 nm) sobre o processo de reparação cutânea em ratos idosos”
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Bioengenharia da Universidade do Vale do Paraíba, como complementação dos créditos necessários para obtenção do título de Mestre em Engenharia Biomédica.
Orientador: Profª. Dra. Renata Nicolau Amadei Co-Orientador: Prof. Dr. Landulfo Silveira Júnior
São José dos Campos, SP
2009
Í
JOÃO PAULO ALVES DO COUTO
"ANÁLISE coMpARATtvA DÂ TERAPIA coM LED (640t20NM) E LASER (660N14) soBRE
O PROCESSO DE REPARACÃO CTJTÂNEA EM RATOS IDOSOS''
Dissertação aprovada como requisito parcial
Biomédica, do Programa de Pós-GÉduação
Desenvolvimento da Universidade do Vale do
banca examinadora:
Prof. Dr. NEWTON SOARES DA SILVA (LINIVAP)
Prof. Dra. RENATA AMADEI NICOLAU (UNIVAP)
Prof. Dr. MIGUEL ANCEL CASTILLO SALGADO (UNESP)
Prof. Dra. Sandra Maria Fonsecâ da Costa
Dirctor do lP&D Univap
São José dos Campos, l7 de março de 2009.
à obtenção do grau de Meste em Engenharia
em Bioengeúaria. do Institulo de Pesquisa e
Paraíba, São José dos CaÍrpos, SP, pela seguinte
DEDICATÓRIA
Este trabalho é dedicado as pessoas mais importantes e mais amadas
de minha vida. Sem eles a realização deste trabalho não seria possível.
AGRADECIMENTOS
Em primeiro lugar, agradeço a Deus, por me guiar e dar forças nos
momentos difíceis de minha vida.
Agradeço aos meus pais pelo alto investimento em meus estudos; e
acima de tudo pelo amor, confiança, apoio e dedicação em todos os momentos
de minha vida.
Agradeço a minha namorada Priscila que esteve ao meu lado auxiliando
e me apoiando em todos os estágios deste trabalho.
Agradeço a minha sogra Ademilde, meu sogro Ponciano e aos
funcionários da UnisulBahia pelo apoio e incentivo
Agradeço a Profª. Dra. Renata Amadei Nicolau pela confiança, paciência
e principalmente pelos ensinamentos passados ao longo do desenvolvimento
deste trabalho.
E a todos aqueles que de alguma forma colaboraram para a elaboração
deste trabalho e não foram citados nominalmente.
“Análise comparativa da terapia com LED (640±20 nm) e laser (660 nm) sobre o processo de reparação cutânea em ratos idosos”
RESUMO
O envelhecimento é um processo dinâmico e progressivo, no qual há modificações morfológicas, fisiológicas e bioquímicas. Observa-se uma menor adesão entre as camadas derme e epiderme, diminuição na taxa de renovação celular e reparação, elevação do tempo de cicatrização de feridas. Atualmente, tem se enfatizado o emprego de novas tecnologias voltadas à geriatria, com vistas à melhoria de qualidade de vida de indivíduos. A fototerapia tem sido uma das áreas de destaque nos avanços tecnológicos, principalmente a aplicação da terapia laser de baixa potência (TLBP) com o objetivo de otimizar o processo de cicatrização tecidual. Os LEDs atualmente são alternativas de baixo custo para as terapias que utilizam luz, contudo poucas pesquisas foram conduzidas até o momento neste sentido. O objetivo do presente estudo foi analisar comparativamente os efeitos da TLBP (660 nm) versus terapia com LED (640±20 nm) sobre o processo de reparação de feridas cutânea em ratos idosos. Foram utilizados 54 ratos albinos, machos da linhagem Wistar, com 14 meses de idade, os quais foram submetidos à retirada da pele no dorso do animal. Os animais foram divididos em nove grupos (n=6 cada); sendo três grupos como controle, três grupos tratados com laser e três grupos tratados com LED. O tratamento com o laser e o LED foi iniciado no pós-operatório com dose de 6 J/cm2 a cada 48 horas, totalizando 3 sessões. Os animais foram sacrificados em 144, 312 e 480 horas após a cirurgia. Os animais controle tiveram simulação da aplicação da terapia com luz, com o aparelho desligado (placebo). Após o sacrifício as amostras de tecido foram submetidas à análise histológica quantitativa e variação clínica macroscópica da ferida. Os resultados mostraram diferenças estatisticamente significantes na contagem de células inflamatórias, vasos sanguíneos, fibroblastos e colágeno, demonstrando que o LED e o Laser melhoram a qualidade da cicatriz de animais idosos. Nenhuma diferença estaticamente significante foi encontrada ao se avaliar o tempo de cicatrização. Palavras-Chave: Epitélio, Laser, LED (Light Emitting Diode), Reparação
tecidual.
“Comparative analisys of therapy with LED (640 ± 20 nm) and Lazer (660 nm) over the process of cutaneous reparation in aging rats”
ABSTRACT
The effect of aging is a dynamic and progressive process in which there are morphological, physiological and biochemical modifications. We perceived a minor adherence between the derm and epidermis with reduction in the renovation cellular rate and reparation raising time of cicatrization of wounds. Actually emphasis in the use of new technologies turned into geriatrics aiming to better quality of life of individuals. The phototherapy has been one of the areas of prominence in the technological advances, especially an applied of Low Level Laser Therapy – LLLT with the objective of creating better conditions of the process of regeneration tissues. The LEDs actually are alternatives of low cost for therapies that uses light, however few researches were conducted until now in this field. The objective of this study was to analyze comparatively the LLLT effects – 660nm versus therapy with LED (640 ± 20 nm) over the process of tissue regeneration in aging rats. There were utilized 54 albine rats, male of Wistar race, with 14 month of age, which were submitted to tenotomy in the dorsum of the animals. These animals were divided in nine groups (n = 6 each) being three groups as of controls. Three groups treated with laser three groups treated with LED. The treatment with laser and the LED was initiated in the post- operating with dosage of 6 J/cm2 every 48 hours, totaling 3 sections. The animals were sacrificed in 144, 312 and 480 hours after surgery. These animals control had simulation of the infliction of therapy with light, with equipment off (placebo). After the sacrifice the specimen’s tissues were submitted to analysis histological quantitative. The results showed differences statically significant in the counting of inflammatory cells, blood arteries, fibroblasts and collagen, demonstrating that the LED and of laser improved the quality of healing of aging animals. No significant statistical differences were found in the evaluation of time healing.
Key Words: Epithelium Laser, LED (Light Emitting Diode), wound healing.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Estrutura esquemática da pele............................................................4
Figura 2: Luz Emissora de Diodo......................................................................25
Figura 3: Aplicação do Laser (A) e do LED......................................................32
Figura 4: Cálculo da área da lesão pelo programa Image J.............................34
Figura 5: Contagem de células inflamatórias, vasos, fibroblastos pelo programa
Image J..............................................................................................................35
Figura 6: Indicação do padrão usado na contagem de células inflamatórias,
fibroblastos, e neovasos ...................................................................................36
Figura 7: Cálculo da área de colágeno pelo programa Image J 1,42d.............36
Figura 8: Área da ferida dos diferentes grupos no decorrer dos 480 horas.....38
Figura 9: Fotomicrografias de derme superficial dos grupos controle (A), grupo
tratado com laser (B) e grupo tratado com LED (C), nos diferentes momentos
de reparação (144, 312 e 480 horas). H&E, 40X.............................................. 40
Figura 10: Fotomicrografias de derme profundal dos grupos controle (A), grupo
tratado com laser (B) e grupo tratado com LED (C), nos diferentes momentos
de reparação (144, 312 e 480 horas). H&E, 40X...............................................42
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Resultado da contagem de células inflamatórias encontradas em
144, 312 e 480 horas.........................................................................................39
Tabela 2 - Resultado da contagem de vasos sangüíneos encontradas em 7°,
144, 312 e 480 horas.........................................................................................41
Tabela 3 - Resultado da contagem de fibroblastos encontrado em 144, 312 e
480 horas...........................................................................................................42
Tabela 4 - Resultado da contagem da quantidade de colágeno encontradas em
144, 312 e 480 horas.........................................................................................43
LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS
UV – Ultravioleta
MMP – Matriz metaloproteinase
DNA – Ácido desoxirribonucléico
RNA – Ácido Ribonucléico
GP – Glicoproteína
ADP– Adenosinadifosfato
ATP– Adenosinatrifosfato
PAF – Fator de ativação plaquetária
TxA2 – Tromboxano A2
TGF – Tumor growth factor ou Fator de crescimento tumoral
TGF β – Transforming growth factor beta ou Fator de crescimento de
transformação Beta
PDGF – Platelet-derived growth factor ou Fator de crescimento plaquetário
CTAP – Peptídeo ativador de tecido conjuntivo
LLLT – Low Level Laser Therapy ou Terapia com laser de baixa potência
TLBP – Terapia laser de baixa potência
HeNe – Hélio Neônio
GaAs – Arseneto de Gálio
GaAlAs – Arseneto de Gálio Alumínio
LED – Light Emitting Diodes ou luz emissora de diodo
IC – injeções de carga
TE – transferência de elétrons
RC – recombinação de carga
VET – volta do elétron transferido
FET – fotoindução da eletrotransferência
J – joules
Hz – hertz
H&E – Hematoxilina e Eosina
PO – Pós-operatório
nm – nanometros
W – watts
mW – milliwatts
KCl – cloreto de potássio
α – alfa
λ – comprimento de onda
µm - micrometro
µm²- micrometro quadrado
“n” – nêutron
“p” – próton
P - probabilidade
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SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO 15
2 REVISÃO DA LITERATURA 17
2.1 Envelhecimento 17
2.1.1 Envelhecimento Cutâneo 18
2.1.1.1 Envelhecimento Intrínseco da Epiderme 21
2.1.1.2 Envelhecimento Extrínseco da Epiderme 22
2.1.1.3 Envelhecimento Intrínseco da Derme 23
2.1.1.4 Envelhecimento Extrínseco da Derme 25
2.1.1.5 Envelhecimento Intrínseco da Hipoderme 26
2.2 Reparação tecidual 26
2.2.1 Fase de homeostasia 27
2.2.2 Fase de Inflamatória 29
2.2.3 Fase de Proliferativa 30
2.2.1 Fase de Remodelação 34
2.3 Terapia Laser de baixa potência 36
2.4 Light Emitting Diode (LED) 38
3 OBJETIVO 43
3.1 Objetivo geral 43
3.2 Objetivos específicos 43
4 MATERIAL E MÉTODOS 44
4.1 Procedimentos Éticos 44
4.2 Modelo experimental 44
4.3 Procedimento cirúrgico 45
4.4 Terapia com LED e Laser 45
4.5 Sacrifício dos animais 46
4.6 Técnica histológica 47
4.7 Análise da área da lesão 47
4.8 Histomorfometria 48
4.9 Análise estatística 51
5. RESULTADOS 52
5.1 Análise Macroscópica 52
5.1.1Cálculo da área 52
5.2 Análise Microscópica 53
5.2.1 Contagem do número de Células Inflamatórias 53
5.2.2 Contagem do número de vasos 55
5.2.3 Contagem do número de Fibroblastos 56
5.2.4 Análise do Colágeno 57
6 DISCUSSÃO 59
7 CONCLUSÕES 64
REFERÊNCIAS 65
Anexo A – Certificado do Comitê de Ética e Pesquisa 72
Anexo B – Tabela de dados da área da lesão dos diferentes grupos experimentais
73
Anexo C – Gráficos do número de células inflamatórias em derme profunda e superficial
74
Anexo D – Gráficos do número de vasos sanguíneos em derme profunda e
superficial
75
Anexo E – Gráficos do número de fibroblastos em derme profunda e superficial
76
Anexo F – Gráficos da quantidade de colágeno em derme profunda e superficial
77
15
1 INTRODUÇÃO
No Brasil, entre as décadas de 40 e 60, ocorreu uma redução
significativa da mortalidade da população e a fecundidade se manteve
constante. A partir da segunda metade da década de 60 essa situação se
manteve levando às alterações da faixa etária da população brasileira1.
Entre os anos 1970 a 2000 a taxa de fecundidade diminuiu em 60% e
somadas à diminuição da taxa de mortalidade fez com que o Brasil
envelhecesse rapidamente. Processo esse que demorou 6 décadas em países
Europeus e no Brasil ocorreu em um quarto de século. Com isso foi observado
que a expectativa de vida, que era em torno de 33,7 anos em 1950/1955,
passou para 50,99 em 1990, chegou até 66,25 em 1995 e deverá alcançar
77,08 em 2020/20252.
Esse envelhecimento cronológico vem acompanhado do envelhecimento
biológico que traz consigo alterações próprias em todos os órgãos e sistemas,
alterando suas estruturas e funcionamento. Alterações essas determinadas por
forças ambientais intrínsecas e extrínsecas3. Uma das alterações mais visíveis
é o envelhecimento da pele que faz com que a mesma se torne mais fraca e
tornando o idoso mais suscetível a lesões dérmicas ao mínimo trauma4,5.
Nas últimas décadas tem-se constatado a eficácia da terapia com laser
operando em baixa potência (TLBP) sobre o processo cicatricial. A energia
depositada nos tecidos pela TLBP é transformada imediatamente dentro da
célula promovendo efeitos biológicos. Estes efeitos podem estar relacionados à
aceleração de reações bioquímicas, contribuindo significantemente no
processo de cicatrização tecidual6,7.
A terapia com LEDs (Light Emitting Diodes ou luz emissora de diodo)
tem sido investigada, não somente pelos efeitos positivos sobre o processo de
reparação tecidual atestados, mas também pelo custo reduzido dos
equipamentos de LED comparados aos equipamentos de laserterapia. Autores
têm observado que a terapia com LEDs pode apresentar resultados superiores
à terapia com laser8,9.
Considerando que, o envelhecimento acarreta mudanças no processo
de cicatrização, e que não foram observados estudos envolvendo o emprego
16
da fototerapia sobre o processo de reparação de feridas em organismos
idosos, novos estudos se fazem necessários neste sentido.
17
2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Envelhecimento
O termo envelhecimento é definido como um evento dinâmico e
progressivo, onde há modificações morfológicas funcionais, bioquímicas e
psicológicas, que determinam a perda gradual da capacidade adaptativa do
indivíduo ao meio ambiente3,5.
O envelhecimento é o acúmulo de diversas alterações deletérias nas
células e tecidos com o avançar da idade. As alterações da idade podem ser
atribuídas de acordo com o desenvolvimento e defeitos genéticos, meio
ambiente, processos patológicos e processos naturais10.
Rebelatto e Morelli11 relatam que várias são as teorias que tentam
explicar o mecanismo pelo qual ocorre o envelhecimento, mas nenhuma delas
consegue por inteiro explicar esse mecanismo, o que reflete a dificuldade de
entender todo o processo. Acredita-se que o envelhecimento seja um processo
dinâmico e progressivo, caracterizado por alterações morfológicas, fisiológicas,
bioquímicas e psicológicas que podem determinar maior vulnerabilidade.
As teorias de fundo biológico tendem a focalizar os problemas que
afetam a precisão do sistema orgânico durante o processo de envelhecimento,
sejam eles de origem genética, metabólica, celular ou molecular. Pode-se
dividí-las em duas categorias: as de natureza genético-desenvolvimentista e as
de natureza estocástica. No primeiro caso, o envelhecimento é visto como um
processo controlado geneticamente e, talvez, programado. Algumas correntes
associam essa possível programação a um desequilíbrio neuroendócrino,
levando a uma diminuição de integração funcional dos sistemas orgânicos. As
teorias estocásticas trabalham com a hipótese de que o envelhecimento
dependeria do acúmulo de agressões ambientais que atingem um nível
incompatível com a manutenção das funções orgânicas e da vida. Alguns
exemplos são as correntes que defendem a existência de mutações genéticas
somáticas progressivas ou erros da cadeia de síntese protéica em virtude da
influência de radiação ou substâncias específicas. Todas essas teorias
carecem de comprovação definitiva, nenhuma delas tendo condições de
sobrepor-se às outras. Há, portanto, muitas dúvidas sobre a real influência das
18
causas por elas apontadas no processo global de envelhecimento biológico,
assim como sobre a forma pela qual poderiam interagir12.
2.1.1 Envelhecimento Cutâneo
A pele é o maior órgão do corpo humano e também o de maior peso.
Além destas características, a pele é o órgão que nos limita do meio exterior.
Sendo desta forma a interface entre os seres humanos e seu meio ambiente,
que protege os outros órgãos do corpo de alterações excessivas de
temperatura, lesão mecânica, irradiação ultravioleta, substâncias químicas
tóxicas, patógenos de origem microbiana13. Moi4 relata em sua dissertação que a pele é caracterizada por três
camadas superpostas: “epiderme” parte externa constituído por um aglomerado
de células dispostas em camadas, não contem vasos sanguíneos, estando em
renovação constante; “derme” camada intermediária composta de fibras de
colágeno e elastina, sendo irrigada por inúmeros vasos sanguíneos e linfáticos
e onde se localizam as terminações nervosas; “hipoderme” camada constituída
por tecido gorduroso (interno) que desempenha importante função de proteção
de órgãos internos contra traumas e perda de calor.
Figura 1: Estrutura esquemática da pele.
Fonte: Guaratini, Medeiros e Colepicolo14.
Todos os tecidos passam por mudanças de acordo com a idade, e na
pele essas alterações são mais facilmente reconhecidas. Durante o processo
19
de envelhecimento a pele sofre alterações, de composição, organização e
tamanho15, 16.
As alterações encontradas na pele do idoso decorrem basicamente da
ação da constituição genética, fatores ambientais, da repercussão cutânea do
envelhecimento de outros órgãos e de efeito de outras doenças cutâneas e
sistêmicas. Assim pode-se classificar o envelhecimento cutâneo em: intrínseco
e extrínseco17, 18.
O envelhecimento intrínseco corresponde ao conjunto de alterações
decorrentes da idade. Apresenta fatores cronológicos (genéticos) e
patológicos19. Hargreaves20 complementa dizendo que o envelhecimento
humano se traduz na pele pelas mais diversas modificações. Surgem então
alterações estruturais que fazem a pele adquirir características próprias no
decorrer da idade. A essas alterações próprias do tempo, denominamos de
envelhecimento intrínseco. O envelhecimento intrínseco é imutável e não
depende de cuidados ou terapias. As suas nuances inter-individuais têm um
componente de penetrância fenotípica própria, o que diferencia entre uma
pessoa e outra em relação a maiores ou menores sinais de envelhecimento.
Papaléo Neto e Borgonovi5 relatam que o envelhecimento é universal,
gradual e inevitável atribuído à passagem do tempo, resultando em alterações
funcionais e da aparência do indivíduo, evidentemente associadas com a idade
avançada.
A exposição aos raios ultravioletas (UV) leva ao envelhecimento
extrínseco da pele caracterizando o fotoenvelhecimento21. O
fotoenvelhecimento afeta todas as camadas da pele, mas a sua maior ação
ocorre no tecido conjuntivo 22,18,23.
Uma vez que nem todas estas alterações são puramente intrínsecas, a
pele é vulnerável a uma série de alterações do meio ambiente, principalmente
da radiação ultravioleta. A exposição crônica e prolongada ao sol leva ao
fotoenvelhecimento. A ação cumulativa da luz do sol promove alterações macro
e microscópicas caracterizadas em parte pela formação de rugas, alterações
na pigmentação e perda de tônus da pele. Estas alterações não são universais
e geralmente podem ser evitadas5.
20
A luz ultravioleta interage com várias células localizadas em diferentes
regiões, dependendo do comprimento da onda. A onda mais curta (280-320
nm) é absorvida na epiderme e afeta os queratinócitos, já a onda mais longa
(320-400 nm) interage com os queratinócitos e os fibroblastos da derme24.
O fator ambiental que acelera o envelhecimento da pele é a radiação
ultravioleta vinda do sol. O fotoenvelhecimento é um processo acumulativo que
depende do sol e o tipo de pele. O componente genético intrínseco do
envelhecimento não é afetado no fotoenvelhecimento, mas os eventos resultam
do acúmulo excessivo de danos celulares (estresse oxidativo). A aceleração do
envelhecimento tecidual causada pela exposição da pele ao sol envolve a
presença no tecido de cromóforos absorvendo radiação ultravioleta, dos raios
solares de comprimento de onda entre 280 a 400 nm, em particular a radiação
UVB (280 a 320nm)25.
Oriá et al.15 explica que para estudar os mecanismos envolvidos no
envelhecimento, portanto, é necessário compreender melhor as mudanças
estruturais e funcionais que ocorrem com o avançar da idade, distinguindo as
alterações que possam representar um processo intrínseco daquelas que
refletem efeitos patológicos cumulativos ou agressões ambientais externas.
Convém ainda considerar que, independente da idade do indivíduo, a
espessura total da pele, espessura relativa da epiderme e derme, distribuição e
fenótipo da população celular na derme, presença de anexos cutâneos e
densidade microvascular e de nervos variam conforme a região do corpo.
Parece claro que muitas mudanças da pele, que são comumente vistas
na velhice, podem não ser resultado do envelhecimento por si só. As
mudanças da pele que são comumente observadas na velhice são melhores
referidas como “associadas a” do que “causadas por” envelhecimento26.
A pele envelhecida frente a fatores intrínsecos apresenta diminuição de
fibras elásticas, com sua fragmentação e desintegração destas, a partir dos 60
anos de idade. Já na pele envelhecida frente a fatores extrínsecos, ocorre
aumento do material elástico da derme, com deterioração e homogeneização
do colágeno4.
Para explicar as alterações visíveis a olho nu, Accursio27 reporta em seu
artigo que os achados histológicos e as funções da pele se encontram
diminuídas nesta faixa etária. Observa-se uma menor adesão entre as
21
camadas derme e epiderme, o que explica a pobre resistência da pele do idoso
a pequenos traumas. Essa alteração também confere uma menor transferência
de nutrientes de uma camada a outra da pele e uma modificação na absorção
de substâncias pela pele do idoso, assim sendo, sabe-se que ocorre uma
diminuição de absorção de substâncias lipofílicas pela pele do idoso. A
diminuição na taxa de renovação celular (30% a 50% entre a terceira e oitava
década de vida) e reparação de pele elevam o tempo de cicatrização das
feridas que pode chegar a duas ou três vezes mais do que o de uma pessoa
jovem.
2.1.1.1 Envelhecimento Intrínseco da Epiderme
A alteração mais evidente e constante é o achatamento da junção
dermo-epidérmica, com o desaparecimento de ambas as papilas dérmicas e as
redes terminais epidérmicas. Em relação à ultra-estrutura, existe também uma
redução nas projeções das vilosidades citoplasmáticas das células basais
epidérmicas no interior da derme. Isto resulta em uma superfície contígua,
consideravelmente menor, entre os dois compartimentos, presumivelmente
uma redução na “comunicação” e passagem dos nutrientes e menos
resistência a força de corte28.
Sauerman et. al.29 complementa descrevendo que a diminuição do
número das papilas dérmicas é um reflexo do aplainamento da junção dermo-
epidérmica, em particular isso não é demonstrado na altura da papila dérmica.
Nascimento30 diz que a zona dermo-epidérmica, de transição entre a
epiderme desprovida de vasos e a derme ricamente vascularizada, é palco de
importantes transformações - aplainamento dos cones interpapilares,
mudanças das lâminas lúcidas e densas, alterações das integrinas e lamininas.
O colágeno do tipo IV, sintetizado pelos fibroblastos, garante estabilidade e
bom funcionamento da junção dermo-epidérmica; nas fibrilas de ancoragem, o
colágeno do tipo VII participa da adesão entre a epiderme e a derme. A perda
da adesão causa diminuição da firmeza e aparecimento de rugas e sulcos. Há
diminuição qualitativa e quantitativa de mucopolissacarídeos
(glicosaminoglicanas), do sulfato de controitina, do ácido hialurônico
(hialunorato), este último muito reduzido ou ausente aos 60 anos de idade. As
22
variações dos diversos tipos de colágeno acontecem durante as várias fases
de degradação da pele fotoexposta ou caduca. Silva e Carneiro 24 afirmam
ainda que junção dermo-epidérmica está achatada e o número células
diminuída, mas a sua estrutura continua a mesma
Oria et al.15 descreve que a avaliação qualitativa dos preparados
histológicos demonstrou acentuada redução da espessura da epiderme na pele
senil e ausência do arranjo compacto dos queratinócitos, especialmente ao
longo do estrato de Malpighi. Além disso, observaram um arranjo
desorganizado e achatamento das células basais, com menor acúmulo de
melanossomas e menor densidade de melanócitos no grupo senil quando
comparado com o grupo jovem ou intermediário. Detectaram ainda redução da
sinuosidade do trajeto da epiderme ao longo do comprimento da superfície
dérmica, ilustrado por uma disposição grosseiramente linear da junção
epidermo-dérmica quando comparado com o grupo jovem. A membrana basal
apareceu mais bem definida na pele senil.
Silva e Carneiro24 explicam que a redução do número de queratinócitos
da epiderme, muda em associação com a idade envolvendo o aplainamento da
região inferior. A redução do número de células Langerhans, o número de
melanócitos e a síntese de melanosomas reduzem a pigmentação.
Já Sauermann et al.29 relatam que não houve alteração da espessura
camada em seu estudo, confirmando achados de estudos preliminares como
os de Kligman em 1986 e o de Grove em 1983. As alterações mínimas na
espessura da epiderme foram consideradas como parte do débito das
alterações encontradas na epiderme. Nos resultados do seu estudo a
espessura da epiderme, imediatamente sobre a papila dermal, pode continuar
consistente com o decréscimo da espessura da epiderme achada por métodos
histológicos, se a diminuição da altura da junção dermo-epidérmica for maior
que duas vezes o decréscimo da espessura da epiderme.
O número de melanócitos enzimaticamente ativos diminui
progressivamente, tornado a barreira de proteção contra a radiação ultravioleta
extremamente prejudicada17, 27.
2.1.1.2 Envelhecimento Extrínseco da Epiderme
23
Histologicamente, a pele fotoenvelhecida apresenta maior compactação
do estrato córneo, aumento da espessura da camada granulosa e menor
concentração de mucina na epiderme. Embora o número de melanócitos esteja
reduzido, as áreas com melanose solar e lentigo apresentam hipertrofia dessas
células no paciente fotoenvelhecido21.
Silva e Carneiro24 complementam explanando que as alterações da
epiderme causadas pelo fotoenvelhecimento são caracterizadas por alterações
na pigmentação associado com hipertrofia ou atrofia da epiderme, e deposição
de fragmentos de fibras elásticas.
2.1.1.3 Envelhecimento Intrínseco da Derme
No envelhecimento cutâneo as maiores alterações são vistas ao nível da
derme. Há uma redução dos fibroblastos e a espessura das fibras colágenas
diminui. Após os 60 anos, o colágeno torna-se rígido e menos elástico em
razão das alterações da substancia fundamental amorfa pela redução dos
mucopolissacarídeos (glicosaminoglicanos) e alterações químicas. As fibras
elásticas mostram alterações químicas na elastina. Há alterações no conteúdo
de hidratos de carbono, lipídeos, ácido glutâmico e lisina. As fibras reticulares
apresentam alterações similares às das fibras colágenas. Há redução de cerca
de 50% na quantidade de mastócitos na pele idosa19.
Oriá et al. 15 confirmam e complementam mostrando em seu artigo que
em toda extensão da derme do grupo senil foi detectada fragmentação
acentuada das fibras elásticas coradas em negro pela coloração de fucsina-
resorcina de Weigert em contraste com o aspecto contínuo das fibras elásticas
dos espécimes do grupo jovem. As fibras elásticas, nos preparados de pele do
grupo dos idosos, apresentavam-se mais frouxamente dispersas e com uma
diminuição no entrançamento em relação às fibras colágenas, conforme
demonstração pelo contraste fluorescente diminuído. Além disso, ao longo das
rasas papilas dérmicas, foi confirmada a deficiência do mecanismo de
ancoragem em ângulo reto das fibras elásticas, ao longo do contorno em
campânula do ápice papilar nos preparados dos indivíduos idosos em contraste
com o arranjo das fibras elásticas dos espécimes do grupo jovem. No grupo
senil, os feixes colágenos estavam menos compactados e ondulados na região
24
média da derme, e o aparelho colágeno-elástico reticular mostrou-se mais
susceptível à dispersão. Contudo, um arranjo mais compacto e espesso do
aparelho colágeno pode ser visto na derme profunda do grupo senil. No grupo
senil, a derme superficial exibiu redução em sua celularidade e extensão em
alça da microvasculatura papilar, revelada pelo discreto declínio da
fluorescência local.
O envelhecimento tecidual está associado com a atrofia da derme, tão
quanto às mudanças na arquitetura e organização. Há uma diminuição na
síntese da matriz na derme e aumento da enzima que degrada a matriz do
colágeno. Radicais livres causam dano no tecido conectivo que compõe a
derme, em particular o colágeno, que aparentemente influencia a interação
com a célula matriz31. A derme papilar perde sua característica morfológica de
cristas onduladas e adquire aspecto plano, acompanhando o desenho da
epiderme superficial, onde os corneócitos passam a apresentar naturalmente
menor interadesão 20.
Ultraestruturalmente, o colágeno diminui 1% ao ano, e as fibras
colágenas remanescentes tornam-se desorganizadas, compactas e
granulosas, modificando a cicatrização da pele do idoso. As fibras colágenas
decrescem em número e em diâmetro, além de apresentarem fragmentação e,
ocasionalmente, calcificação progressiva. Após a sétima década de vida, o
colágeno torna-se mais rígido e menos elástico devido às alterações da
substância fundamental pela diminuição dos mucopolissacarídeos
(glicosaminoglicanas), alterando adversamente o turgor cutâneo. Tais
alterações modificam as propriedades mecânicas cutâneas com perda
progressiva da elasticidade e aumento do tempo necessário para a pele
retornar a sua espessura prévia após traumas21,20.
Essas alterações fazem que a pele perca sua elasticidade retardando a
recuperação de sua forma quando tensionada. A desidratação tissular e a
perda da compressibilidade da pele ocorrem pela diminuição de
glicosaminoglicanos que leva menor capacidade retentora de água na derme.
Assim a derme envelhecida se torna um tecido rígido, inelástico e irresponsível
à tensão, com menor capacidade de resposta ao estresse19.
Silva e Carneiro24 afirmam que imagens computadorizadas no
envelhecimento intrínseco mostraram que as artérias e veias possuem a
25
mesma densidade, mas em ambos os calibres estão diminuídos, se bem que
com o envelhecimento da pele há perda progressiva da vascularização da
derme e do calibre vascular da mesma.
2.1.1.4 Envelhecimento Extrínseco da Derme
As características histológicas mais marcantes do fotoenvelhecimento
são a elastose, representada por acúmulos nodulares de material amorfo,
geralmente na junção da derme papilar e reticular. Há substituição das fibras
colágenas maduras por colágeno com aparência basofílica, formando um
material constituído de elastina degradada e proteínas microfibrilares ligadas à
fibronectina, uma glicoproteína ligada a matriz dérmica. O ácido hialurónico
(Hialuronato), um mucopolissacarídeo (glicosaminoglicano), envolvido na
manutenção do volume e elasticidade da derme diminui com o envelhecimento
da pele, isso pode ser explicado pela diminuição receptor do fator de
crescimento na epiderme, ativado pelos raios UV, e subseqüente inibição do
sistema de hialuronato20, 21,32.
A inicialização da matriz metaloproteinase (MMP) toca a principal regra
na patogênese do fotoenvelhecimento. Existem grupos de enzimas, subfamília
das proteinases, responsáveis pela degradação do colágeno. A luz ultravioleta
modifica a matriz dermal, proteínas e induz a uma ampla variedade de
crescimento da família dos MMPs com atividade proteolítica para degradar a
matriz protéica. Cada MMP degrada diferentes componentes da matriz protéica
dermal, por exemplo, MMP-1 quebra o colágeno I, II e III e MMP-9 degrada
colágeno tipo IV e V 24.
Há diminuição do lúmen vascular, dos capilares na derme com um
número menor de formações glômicas, além de alterações de esclerose dos
vasos. A diminuição do fluxo circulatório cutâneo contribui para menor
intensidade das reações inflamatórias e para menor depuração de substâncias
endógenas ou exógenas depositadas na pele. Os vasos sanguíneos se
rompem com facilidade, promovendo extravasamento de hemácias na pele,
levando a manhas púrpuras facilmente visíveis na superfície19, 33.
26
2.1.1.5 Envelhecimento Hipoderme
Na hipoderme o tecido subcutâneo em geral está diminuído com as
células gordurosas mostrando-se frequentemente com menor volume e
número. O enrugamento cutâneo é também causado por alterações no tecido
subcutâneo e nos tecidos musculares17,27.
2.2 Reparação Tecidual
A capacidade auto-regenerativa é um fenômeno universal nos
organismos vivos. Nos organismos unicelulares, está restrita à presença de
enzimas responsáveis pela recuperação de elementos estruturais (como os
constituintes do citoesqueleto, membranas e paredes celulares) e de moléculas
de alta complexidade (como proteínas de elevada complexidade estrutural,
RNAs e o DNA). Em organismos superiores, além destes, também ocorre o
reparo de tecidos que pode se dar de duas formas: pela regeneração com a
recomposição da atividade funcional do tecido ou pela cicatrização com
restabelecimento da homeostasia do tecido com perda da sua atividade
funcional pela formação de cicatriz fibrótica34.
Segundo Polacow et al.35, o processo de reparo de uma ferida é
complexo e apresenta três fases que se sobrepõem, num processo contínuo:
inflamatória, proliferativa e remodelação. A reepitelização tem por objetivo a
restituição da superfície da pele como uma barreira funcional, onde os
queratinócitos respondem, inicialmente, migrando a partir dos bordos livres da
ferida 12 horas após a lesão. Tal mecanismo favorece o progressivo avanço da
camada epitelial e o fechamento do defeito tecidual.
Eming, Krieg e Davidson36 complementam dizendo que a reparação
tecidual é um processo dinâmico, de ação recíproca à lesão do tecido
envolvendo uma complexa interação entre vários tipos de células, moléculas de
matriz extracelular, mediadores solúveis e citocinas. Porém relatam que o
processo de cicatrização é divido em quatro fases, homeostasia, inflamação,
formação de tecido de granulação (proliferativa) e remodelação.
27
Li, Chen e Krisner37 correlaciona Eming, Krieg e Davidson36 com
Polacow et al.35 explicando que a cicatrização é um processo complexo que
grosseiramente pode ser dividido em três fases sobrepostas: a fase
inflamatória, proliferativa e de remodelação. A fase inflamatória envolve
resposta vascular caracterizada pela coagulação sanguínea e homeostasia
conforme os eventos celulares, incluindo infiltração de leucócitos com uma
variedade de funções antimicrobianas e liberação de citocinas, o qual inicia a
fase proliferativa da reparação da ferida. Alguns autores têm dividido o
processo de reparação tecidual e quatro fases, com o primeiro estágio
começado pela homeostasia elevando a importância da resposta vascular.
Durante a fase proliferativa existe a formação de epitélio para cobrir a
superfície da ferida que acompanha o crescimento do tecido de granulação de
acordo com o espaço da lesão. A formação do tecido de granulação envolve a
proliferação de fibroblastos, deposição de colágeno e outras substâncias
extracelulares da matriz e desenvolvimento de novos vasos sanguíneos. Uma
vez que o novo tecido da lesão foi formando, a fase de remodelação tem inicio
para refazer a integridade estrutural do tecido e sua competência funcional.
2.2.1 Fase de Homeostasia
Segundo Li, Chen e Krisner37 a ruptura dos vasos sanguíneos leva ao
extravasamento do sangue ou apenas perda do plasma para o tecido
adjacente. O primeiro passo para a cicatrização é a homeostasia. Esta fase
consiste em dois processos: o desenvolvimento do coágulo e a coagulação. As
plaquetas são as primeiras células a aparecer após a lesão e ativam a cascata
de coagulação.
Quase concomitante ao estímulo lesivo, e devido à influência nervosa
(descargas adrenérgicas) e ação de mediadores oriundos da degranulação de
mastócitos, ocorre vasoconstrição como primeira resposta. A lesão do
endotélio (ruptura, fissura ou erosão) dispara uma sequência de eventos,
iniciando-se com a deposição das plaquetas, prosseguindo com sua ativação e
posterior recrutamento de novas plaquetas. O resultado é a formação de um
trombo rico em plaquetas, que provisoriamente tampona a lesão endotelial.
Esse trombo rico em plaquetas (trombo branco) é rapidamente infiltrado pela
28
fibrina, transformando-se em um trombo fibrinoso. Logo após, os eritrócitos são
capturados por essa rede fibrinosa e forma-se então o trombo vermelho
principal responsável pela oclusão do vaso sanguíneo rompido. Este, além de
limitar a perpetuação da perda de constituintes circulatórios para os interstícios
celulares, fornece uma matriz preliminar, que alicerçará a migração das células
responsáveis pelo desencadeamento do processo de reparo. A adesão inicial
das plaquetas à superfície lesada ocorre pelas proteínas de adesão presentes
na sua membrana. As principais delas são os receptores da glicoproteína
IIb/IIIa (GP IIb/IIIa). Esse receptor possui sítios de ligação para o fibrinogênio,
fator de Von Willebrand, vitronectina, fibronectina e trombospondina. Em
seguida, as plaquetas são ativadas por um grande número de substâncias
presentes na matriz subendotelial e na corrente sanguínea. O colágeno
subendotelial exposto pela ruptura do vaso e a trombina gerada pelos
processos de coagulação participam da ativação e agregação plaquetárias.
Além disso, a plaqueta ativada aumenta a ação da protrombinase, que
promove maior produção da trombina, a partir da protrombina, criando assim,
condições para a amplificação da adesão plaquetária. O ADP liberado das
hemácias e grânulos densos das próprias plaquetas é outro elemento
amplificador da agregação das plaquetas. Este induz nelas a exposição do
receptor glicoproteína IIb/IIIa ao fibrinogênio e fator de Von Willebrand.
Contribuindo também para a agregação plaquetária, o ácido araquidônico da
membrana das plaquetas em processo de agregação, é convertido em TxA2
pelas enzimas ciclooxigenase e tromboxane sintetase. O TxA2, além de forte
agonista da agregação plaquetária, é um potente vasoconstritor e, também,
indutor da exposição dos sítios de ligação da glicoproteína IIb/IIIa ao
fibrinogênio e fator de Von Willebrand. Outro importante derivado do
araquidonato, que é liberado por macrófagos e mastócitos, plaquetas e outras
células ativadas, é o PAF. Este é um ativador importante de plaquetas e indutor
da sua agregação. Como agonistas da agregação plaquetária, podem também
ser citadas a noradrenalina e a serotonina. Esses mediadores estimulam
diferentes cascatas de ativação plaquetária, porém, a via final comum a todos é
a ativação do receptor da glicoproteína IIb/IIIa que pela interação com o fator
de Von Willebrand e o fibrinogênio é o verdadeiro efetor da agregação e
ativação plaquetária formando assim o coagulo e parando o sangramento38,39.
29
Na segunda fase o fibrinogênio plasmático que está extravasando da
área lesada do vaso e o fibrinogênio plaquetário são induzidos a polimerizar
através das vias intrínsecas e extrínsecas da coagulação. O fator Hageman
ativa via intrínseca e a lipoproteína ativa a via extrínseca da coagulação O gel
extra vascular que ocupa a fenda criada pela lesão é composto de material
proveniente do sangue e por uma matriz extracelular fraca formada de
fibrinogênio, fibronectina e fator Von Willebrand. As plaquetas ativadas liberam
fatores de crescimento como o TGF β e o PDGF, quimiocinas como o CTAP-III
e também outras proteínas como fibrinogênio, fibronectina e tromboplastina
que são encontradas em seus grânulos. A interação das proteínas dos
grânulos plaquetários com proteínas da matriz extracelular somados à massa
de corpos plaquetários agregados, ao se estabilizarem, formam uma matriz
provisória. Esta se torna mais consistente à medida que a fibrina se polimeriza
pelas vias intrínsecas ou extrínsecas da coagulação35.
2.2.2 Fase Inflamatória
Os estímulos necessários para o início da reação inflamatória são
proporcionados logo após o fim a lesão do vaso. A resposta celular à fase
inflamatória é caracterizada pelo influxo de leucócitos para a área lesada. No
inicio da fase inflamatória, neutrófilos e monócitos são as células mais
importantes no local da lesão. Logo após a lesão, neutrófilos e monócitos
começam a emigrar dos capilares para o ferimento, com os neutrófilos sendo
os primeiros a chegar em grande número tendo como função principal neste
processo a eliminação de possíveis microrganismos pela fagocitose.
Posteriormente o número de neutrófilos diminui e os macrófagos, derivados
dos monócitos, passam a predominar com o papel de auxiliar os neutrófilos na
eliminação de microrganismos pela fagocitose. Desta forma, a fagocitose
destas células atua como elo entre o sistema imune inato e o adaptativo. Além
disso, é a célula mais eficiente na eliminação de fragmentos teciduais inclusive
removendo pela fagocitose os neutrófilos que perderam função40.
Os neutrófilos e monócitos são recrutados para o ferimento por um
gradiente de mediadores liberados durante a homeostasia. Os mediadores
gerados durante o processo de coagulação servem para regular a aderência
30
intercelular. A histamina, protease, lecotrienos e citocinas, representam uma
fonte adicional do sinal de recrutamento dos leucócitos. Os fatores de
crescimento PDGF e TGF β são também importantes mediadores para os
leucócitos, uma vez no local da lesão integram os receptores na superfície
celular dos neutrófilos elevando a interação com a matriz celular. A infiltração
de neutrófilos normalmente ocorre em poucos dias, mas a presença de
contaminação no ferimento pode prolongar a permanência dos neutrófilos na
lesão e pode atrasar o processo de cura41,42.
Li, Chen e Krisner37 dissertam que a migração dos monócitos para o
espaço tecidual e a transformação destes em macrófagos, torna este tipo
celular predominante na fase tardia da fase inflamatória. Inicialmente os
monócitos são atraídos para o local do ferimento pelas mesmas substâncias
quimiotáticas que atraem os neutrófilos, e eles são recrutados continuamente
através de sinais deixados pelas substâncias quimiotáticas dos monócitos
específicos, assim como as proteínas quimiotáticas dos monócitos e proteínas
inflamatórias dos macrófagos. A degradação da matriz extracelular produz
fragmentos de colágeno, fragmentos de fibronectina e trombina e também as
substâncias quimiotáticas dos monócitos. Os macrófagos são considerados as
células mais importantes na reação inflamatória. Os macrófagos digerem os
organismos patogênicos; eliminam fragmentos teciduais; e destroem os
neutrófilos remanescentes. Após as células, os tecidos e os microrganismos
serem fagocitados, estes serão destruídos através da liberação de
intermediários biologicamente ativos de oxigênio e proteínas enzimáticas. Todo
este processo é realizado pelos monócitos/macrófagos permitindo a
angiogênese e a formação do tecido de granulação.
2.2.3 Fase Proliferativa
Balbino, Pereira e Curi38, descrevem que a presença local de
macrófagos derivados de monócitos e a produção e liberação dos mediadores
químicos produzidos por eles, a migração e ativação de fibroblastos é
intensificada. Essas células são os principais componentes do tecido de
granulação e após a influência dos fatores de crescimento e demais
mediadores, derivados principalmente dos macrófagos, são ativadas e migram
31
das periferias para o centro da ferida. Isto se dá pela matriz provisória formada
e seguindo a orientação do gradiente químico de substâncias quimiotáticas.
Com o aumento do número de fibroblastos ativados para a produção de
colágeno no local, a matriz extracelular começa a ser substituída por um tecido
conjuntivo mais forte e mais elástico. Este processo é denominado de
fibroplasia e para a sua eficiência é necessária que ocorra em paralelo da
formação de novos vasos sanguíneos, ou seja, é necessária uma “nova
vascularização” da região. Além da ação direta de fatores de crescimento sobre
as células dos vasos, a indução da angiogênese é, em parte, creditada à baixa
tensão de oxigênio.
Com o início da fibroplasia ocorre a formação do tecido de granulação
(por volta do quarto dia) composto por macrófagos, fibroblastos e vasos
neoformados que estão suportados por uma matriz frouxa de fibronectina,
ácido hialurônico (hialunorato) e colágeno tipos I e III. Este tecido é edematoso
e caracterizado pela presença de muitos espaços vazios, devido à imaturidade
dos vasos, os quais são extremamente exudativos e sangram com facilidade. A
“nova vascularização” é essencial neste estágio porque permite a troca de
gases e a nutrição das células metabolicamente ativas. Sob estímulo de fatores
de crescimento e de outros mediadores, as células endoteliais do interior de
capilares intactos nas margens da ferida passam a secretar colagenase e o
ativador do plasminogênio. Essas substâncias promovem aberturas na
membrana basal e permitem a migração das células endoteliais que,
atravessando a parede do vaso e utilizando como substrato a matriz
extracelular provisoriamente produzida, seguem em direção à região da lesão.
Uma vez na região externa do vaso, elas passam pelo processo de
diferenciação para aquisição da capacidade de formação de novos tubos
capilares. As células endoteliais migratórias formam no exterior do vaso um
broto capilar que em seguida une-se ao capilar de onde eram originárias para o
restabelecimento do fluxo sanguíneo 37.
Todo processo lesivo promove a perda de massa do tecido. A área de
uma ferida aberta necessita ser preenchido e para isto são operadas duas
estratégias diferentes. Na primeira, a própria natureza anatômica da lesão
proporciona um estímulo para a migração e proliferação das células (células
epiteliais e fibroblastos) a partir das suas margens. As células basais próximas
32
à região da lesão, ao perderem a interação com as células adjacentes, são
ativadas, adquirem propriedades mitóticas e proliferam em direção ao centro da
lesão. Na segunda, mesmo quando o espaço da lesão está preenchido por
tecido de granulação, as margens se movem uma em direção à outra, como se
houvesse uma força de tração invisível. Isto ocorre devido à diferenciação de
alguns fibroblastos das margens da ferida para miofibroblastos, portanto, para
fibroblastos com capacidade contrátil37, 43.
Balbino, Pereira e Curi38 relatam que com a evolução do processo, a
matriz extracelular, que inicialmente era composta principalmente por proteínas
derivadas de plaquetas e do plasma, passa por modificações em sua
composição. A migração e ativação de macrófagos e fibroblastos para a região,
somada à presença de vasos neoformados, permitem que os componentes da
nova matriz extracelular passem a ser localmente produzidos principalmente
por estas células. Os fibroblastos passam a depositar grandes quantidades de
fibronectina que, embora seja substrato que desempenha outras funções,
basicamente serve para a fixação da própria célula. Outra substância produzida
em grande quantidade neste segundo estágio é o ácido hialurônico, um
polissacarídeo glicosaminoglicano não sulfatado com facilidade de se ligar à
água, que auxilia na resistência do tecido à compressão. Estas duas
substâncias predominam na matriz durante as primeiras fases do reparo, pois
esta combinação propicia um micro ambiente eficiente para a movimentação
das células, necessárias nesta etapa. À medida que o processo de maturação
da ferida avança, a concentração de ácido hialurônico diminui e aumenta a
síntese de proteoglicanos ou glicosaminoglicanos sulfatados. Essa modificação
na composição da matriz extracelular favorece a fixação e imobilidade das
células favorecendo a diferenciação delas para fenótipos mais maduros. As
células endoteliais dos vasos neoformados se diferenciam em células de
revestimento e os vasos neoformados assumem as características funcionais
de capilares. Os fibroblastos são as células que passam por mudanças de
fenótipo mais acentuadas. Do fenótipo de células imaturas migratórias e
replicativas no início do processo, passam para fenótipo característico de
células ativamente engajadas na síntese protéica, ou seja, o seu citoplasma se
torna volumoso e apresenta um retículo endoplasmático rugoso abundante.
Com isto, eles passam a secretar grandes quantidades de colágeno. Este aos
33
poucos substitui os proteoglicanos e a fibronectina até se tornar o principal
componente da cicatriz em formação.
A tensão de oxigênio é um importante mecanismo de regulação do
processo de reparo. No início do processo, a baixa tensão serve como estímulo
ao macrófago para a produção de fatores de crescimento, para a migração e
proliferação centrípeta das células das margens da ferida e faz a indução da
angiogênese. Nesta etapa, é necessária uma alta tensão de oxigênio para a
hidroxilação dos resíduos de prolina e lisina nas cadeias polipeptídicas do
colágeno montadas no citoplasma dos fibroblastos. Isto é proporcionado pela
rede capilar neoformada44,45.
Durante a fixação dos fibroblastos e seu amadurecimento para células
produtoras de colágeno, o processo de contração da ferida alcança a sua
eficiência máxima. Isto ocorre devido à mudança dos fibroblastos das margens
da ferida para miofibroblastos. Os fibroblastos destas regiões marginais
começam a exibir características funcionais similares às células do músculo
liso. Os miofibroblastos são encontrados alinhados ao redor de depósitos da
nova matriz extracelular, fazendo uniões celulares e gerando força de tensão.
Auxilia também no processo de contração da ferida o ressecamento da sua
crosta superficial que durante a desidratação diminui de tamanho e arrasta o
tecido a ela aderido36.
O processo de reepitelização da ferida se inicia imediatamente após a
lesão. Células primitivas da camada basal do tecido epidermal possuem
potencial mitótico latente. Em tecidos normais, este se encontra inibido pelo
contato existente entre as células pela "inibição por contato". Com a ocorrência
de uma lesão, este mecanismo inibitório desaparece e as células entram
imediatamente em processo mitótico. A ineficiência e dificuldade de
constatação do processo mitótico destas células nas etapas iniciais são
devidas à, ainda, inexistência de um substrato adequado para isto na região da
ferida. Este somente é fornecido quando o tecido de granulação alcança o nível
da epiderme. Quando ativadas, as células da epiderme retraem os
tonofilamentos intracelulares, ocorrendo à dissolução dos desmossomas
intercelulares e nas margens do interior da célula se formam filamentos de
actina. Estas alterações permitem sua movimentação em direção ao centro da
ferida. As células migram sobre a matriz celular provisória e, durante sua
34
trajetória, segue depositando quantidades significativas de fibronectina. A
superfície da ferida umedecida e oxigenada é um fator que acelera o processo
de migração. Quando estas células encontram uma crosta recobrindo a região
lesada, promovem uma dissecação entre esta e a matriz, porém, à custa de um
retardo de velocidade de migração. À medida que a região da lesão vai sendo
coberta pelas células epidermais é acionado o mecanismo de "inibição por
contato". As células voltam a apresentar o fenótipo original, a membrana basal
é refeita e os hemidesmossomos e desmossomos são reconstituídos46.
Segundo Balbino, Pereira e Curi38, ao final desta etapa, o leito da ferida
está totalmente preenchido pelo tecido de granulação, a circulação é
restabelecida pela nova vascularização e a rede linfática está passando por
regeneração. Lentamente o tecido de granulação é enriquecido com mais fibras
colágenas o que começa a dar à região lesada a aparência de cicatriz devido
ao acúmulo de massa fibrosa.
2.2.4 Fase de Remodelação
Conforme Li, Chen, Krisner37 comentam a fase de remodelação tem
início por volta do décimo dia, o leito da ferida está totalmente preenchido pelo
tecido de granulação, com uma rede capilar atravessado-a, com a rede linfática
em regeneração. O tecido de granulação vai sendo enriquecido com mais
fibras de colágeno e começa a adquirir a aparência de massa fibrótica
característica da cicatriz. Nesta etapa, surgem as primeiras fibras de colágeno
tipo I. Com a evolução do processo, acentua-se a deposição de colágeno e a
maioria das células desaparecem formando finalmente a cicatriz. É consenso
atualmente, que a resolução completa de uma ferida, somente pode ser
considerada depois de concluída a maturação e remodelagem da matriz
extracelular. Este processo ocorre lentamente levando muitos meses ou às
vezes anos.
Os eosinófilos aparecem nas últimas fases da reparação e presumi-se
que podem estar relacionados à produção de fatores de crescimento. Quando
a ferida completou o seu fechamento e os microrganismos foram eliminados,
os linfócitos constituem o subsistema leucocitário mais abundante em feridas
humanas. Os linfócitos não somente são efetores imunes, mas também,
35
produtores de fatores de crescimento. De forma notável, nesta etapa, eles são
atraídos para a região da ferida em igual número que os monócitos e, a partir
do décimo quarto dia, são os leucócitos que predominam na região38.
Segundo Carvalho39 a resistência de uma cicatriz é dada pela
quantidade de colágeno depositada e pela forma com que as fibras estão
organizadas. Quanto maior o número de ligações covalentes transversais,
maior a resistência da cicatriz. Quando secretado na forma de tropocolágeno,
as ligações transversais das fibras se dão por pontes de hidrogênio. No
processo de amadurecimento da fibra, as lisinas, hidroxilisinas e lisinas
glicosiladas constituintes da molécula de tropocolágeno são oxidadas até
aldeídos pela enzima lisiloxidase. Estes, após a oxidação, se ligam
covalentemente com outros grupos aldeídos ou com lisinas não oxidadas, o
que aumenta a resistência da fibra.
O processo de remodelamento da cicatriz envolve etapas sucessivas de
produção, digestão e orientação das fibrilas de colágeno. Ocorrendo uma
transformação dos tipos de colágenos onde há uma degradação do colágeno
tipo III e aumento da síntese do colágeno tipo I. Este processo de conversão da
derme é consumado através de um controlado sistema de produção de
colágeno e lisina do velho colágeno. A deposição de colágeno é feita a
princípio de maneira aleatória tendo como orientação a organização da
fibronectina e dependente da natureza e direção das tensões aplicadas ao
tecido. Essas fibras são subsequentemente digeridas pela colagenase,
sintetizadas, rearranjadas de acordo com a organização das fibras do tecido
conjuntivo adjacente e lateralmente ligadas por ligações covalentes. Essas
ligações são formadas entre moléculas de tropocolágeno no âmbito da fibrila e
entre as próprias fibrilas. Repetições sucessivas da lise, síntese,
redirecionamento e novas ligações formam fibras maiores de colágeno e
resultam numa configuração mais regular da cicatriz. Isso aumenta a sua
resistência devido à organização das fibras acompanhando as forças
mecânicas a que o tecido está sujeito durante a atividade normal37, 47.
Ao final desta etapa, os anexos da pele, como folículos pilosos e
glândulas sofrem regeneração limitada e a coloração da cicatriz permanece
pálida, pois a regeneração dos melanócitos é deficiente e as cicatrizes são
hipovascularizadas devido ao desaparecimento dos “novos capilares”38.
36
2.3 Terapia Laser de Baixa Potência (TLBP)
Conforme Rosa, Hammerschmitt e Souza 48 os laseres são classificados
em duas famílias, conforme sua potência e capacidade de interação com os
tecidos, sendo divididos em: laseres de baixa potência (< 500 mW) e laseres de
alta potência. A TLBP deve seguir os parâmetros de comprimento de onda,
densidade de energia, densidade de potência, tipo de operação do laser,
freqüência do pulso, número de sessões, características ópticas do tecido
(coeficiente de absorção e espalhamento).
Posten et al. 49 explica que TLBP é definida por vários parâmetros. O
primeiro é a energia de 10-3 a 10-1 W. Outros parâmetros importantes são: o
comprimento de onda (600 a 1000 nm); o pulso que pode ser de 0 (contínuo)
para 5000 Hz; duração do pulso que vai de 1 a 500 milissegundos; o intervalo
entre os pulsos que também varia de 1 a 500 milissegundos; o tempo total de
irradiação que varia de 10 a 3000 segundos; densidade de potência que pode
oscilar entre 10-2 a 100 mW/cm2 e a dose (tempo de energia irradiada/ área
irradiada que pode variar de 10-2 a 20 J/cm2).
Hawkins e Abrahamse 6 elucidam que os efeitos celulares da fototerapia
podem ser classificados em primário (indução da luz), secundários (ocorre em
resposta ao efeito primário) e o efeito terciário. As primeiras reações são
geralmente restritas à absorção do fóton. Os efeitos secundários são em uma
quantidade menor que os efeitos primários. Os efeitos terciários são os de
menor prognóstico
Na resposta primária, os fótons emitidos pelo laser alcançam a
mitocôndria e a membrana celular assim como também os fibroblastos e
queratinócitos aonde a energia foi absorvida e convertida em energia química e
cinética no interior da célula. Esses efeitos modificam a permeabilidade de
membranas, aumentando a formação de óxido nítrico. O aumento do
metabolismo oxidativo pode culminar em aumento da síntese de ATP, o qual
conduz para normalização da função celular 7,50. Hawkins e Abrahamse 6
comentam que reação secundária leva para a amplificação da fotorreação
primária. A cascata de efeitos metabólicos resulta em várias alterações
fisiológicas em nível celular conforme as alterações na permeabilidade das
37
membranas da célula. Cálcio é liberado das mitocôndrias dentro do citoplasma.
Com as alterações nos níveis intracelulares deste íon há o estímulo do
metabolismo celular e regularização do mesmo, sinalizando o caminho
responsável para os eventos necessários na reparação da lesão da mesma
forma que guia a migração celular, a síntese de RNA e DNA, síntese de
proteínas e proliferação celular. O terceiro efeito é produzido em células
distantes. Alguns efeitos são os mesmo efeitos que os secundários. Células
irradiadas ou energizadas comunicam-se umas com as outras e com células
não irradiadas, através do aumento dos níveis de citocinas ou fatores de
crescimento resultando em comunicação intercelular. Existe uma elevação na
resposta imune, com ativação dos linfócitos T e macrófagos, um aumento na
endorfina e diminuição da bradicinina resultando em alivio da dor 51,7.
Segundo Rosa e Hammerschitt52 os fotorreceptores celulares são
sensíveis a certos comprimentos de onda, absorvem os fótons desencadeando
as reações químicas. Assim acelera a síntese de ATP (glicólise e fosforilação
oxidativa) em curto prazo e em longo prazo acelera a transcrição e replicação
de DNA, além de promover os efeitos sistêmicos53. Hawkins e Abrahamse54
explicam que a TLBP na região do vermelho é bastante absorvida por
componentes da cadeia respiratória. Fótons penetram o tecido e são
absorvidos em nível de mitocôndrias e membranas celulares52. A energia dos
fótons é convertida em energia química dentro das células, em forma de ATP,
para a qual conduz para a normalização da função celular. A permeabilidade
da membrana celular se altera e alterações fisiológicas ocorrem. Pequenas
doses de luz intensificam o gradiente protônico na mitocôndria, seguido de
aumento da liberação de Cálcio no citoplasma. Este processo dá início a vários
processos biológicos como síntese de DNA e RNA, mitose celular e células de
proliferação. Altas doses podem liberar muito cálcio, podendo sobrecarregar as
células e inibir o metabolismo celular.
Posten et al.49 descreve que vários elementos têm sido usados para
estabelecer parâmetros para a TLBP. Pesquisas iniciais usaram laseres
baseados em gases inativos (inertes), incluindo Helio-Neônio (He-Ne; 632,8
nm), rubi (694 nm) Argônio (488 e 514 nm). Estudos subsequentes usaram
laseres semicondutores de diodo, incluindo Arseneto de Gálio (GaAs, 904 nm)
e Arseneto de Gálio-Aluminio (GaAlAs; 600 e 1000 nm). A maioria dos estudos
38
da TLBP, possivelmente devido ao custo e a utilidade de uso, tem utilizado o
laser na região visível do espectro eletromagnético. Rosa, Hammerschmitt e
Souza48 afirmam que estes comprimentos de onda têm sido bastante usado
como finalidade terapêutica devido à boa absorção pelos tecidos biológicos.
O laser 660 nm é um laser de baixa potência (radiação eletromagnética
coerente na região do vermelho). O efeito térmico associado com a irradiação
laser de baixa de potência ocorre antes de um minuto, os efeitos fisiológicos
são conferidos diretamente a biomodulação das células expostas. Estudos têm
revelado que a radiação coerente na região visível do espectro eletromagnético
estimula a proliferação celular, atua sobre o sistema imune e estimula a síntese
de colágeno. É observado também que os níveis de ATP celular aumentam em
quase o dobro após a irradiação com laser de He-Ne (632,8 nm) quando
absorvida por células em cultura. Uma possibilidade pode ser que a energia
laser é absorvida pelos cromóforos intracelulares e convertidos em energia
metabólica55, 48.
A radiação eletromagnética coerente na região do vermelho tem efeito
sobre o processo de cicatrização. Estudos com linfócitos mostram que a TLBP
pode levar a um aumento da secreção de imunoglobulinas, liberação de
citocinas, atividade fagocitária e leucocitária. Estudos com macrófagos
demonstraram um aumento na atividade dos lisossomos e fosfatases,
estimulando a liberação de fatores de crescimento e aumentando a atividade
fagocitária55, 57.
Segundo Say et al.58 culturas de linfócitos irradiados com laser na região
do vermelho apresentam aumento na capacidade de fagocitose, incremento da
superfície de contato, bem como afinidade do organismo invasor. Dessa forma
se pode concluir que este tipo de estimulação eleva o reconhecimento de
antígenos por acréscimo na atividade linfocitária.
2.4 Light Emitting Diodes (LED)
Há algum tempo vêm sendo apresentado no mercado aparelhos que têm
sua luz emitida por diodos (light emitting diodes), gerando radiação
eletromagnética não coerente, tanto na região visível quanto infravermelha do
39
espectro eletromagnético, com faixa estreita de emissão (variação na faixa de
20 nm) e alta intensidade (50 a 100 mW)8,9 (figura 2).
Figura 2: Luz Emissora de Diodo, disponível em:
electronics.howstuffworks.com/led3.htm59 acesso em 21 fev. 2008
Medeiros60 confirma relatando que o LED trata-se de um diodo emissor
de luz, que quando energizado emite luz, monocromática e não coerente. É
uma luz com alto grau de pureza. São semicondutores, tendo como
característica principal, conduzir corrente elétrica em um único sentido.
Os LEDs são pequenos meios feitos de material semicondutor,
constituídos por cristais que incluem a combinação de dois ou três elementos.
Esta combinação única de elementos tem uma estrutura cristalina que pode
acomodar ambos os elétrons negativamente alterados e elétrons alterados
vagamente positivos, os quais são separados por um espaço (junção P-N). Os
materiais semicondutores chamados de periféricos possuem um tipo de orbital
“n” que tem um excesso de carga negativa (elétrons) e um tipo de “orbital” “p”
que possui um excesso de carga positiva (espaço), Quando uma transferência
de energia é aplicada nessas estruturas o elétron move-se através da interface
P-N e enche o espaço no lado p, seguindo em direção ao nível de energia
baixa. Idealmente, o excesso de energia da transmissão de cada elétron
resulta em emissão espontânea de fótons 59,61.
Para Namai et al.62 os LEDs são um meio de luminescência artificial que
utiliza ambas injeções de carga (IC) transferência de elétrons (TE),
recombinação de carga (RC) e volta do elétron transferido (VET) em um
40
mecanismo ligado ao envolvimento do processo bioquímico e
eletroquimioluminescência. Uma combinação do TE e VTE está envolvida na
reação de foto indução da eletro transferência (FET) de substratos orgânicos
O processo de emissão de luz pela aplicação de uma fonte elétrica é
denominado “eletroluminescência”. A luz se dá devido ao diodo (junção P-N)
energizado62.
A termoluminescência é um termo dado à emissão de luz,
desencadeada pela atividade térmica. Usualmente a termoluminescência
ocorre quando um estado único de excitação eletrônica de um substrato é
formado pelo VET entre um radical cátion e um radical anion, formado pela
simultânea oxidação e redução do substrato promovido pelo uso de um número
de diferentes métodos de irradiação. Conforme as reações FET da
termoluminescência e eletroluminescência dos LED em tecidos orgânicos
envolvem a TE (ou IC) e VET (ou RC), são os passos chaves do mecanismo. A
maior diferença entre o FET é que as energias deficientes provenientes do VET
para as reações FET causam produção de estados básicos, para onde a
energia suficiente VET ou RC para a termoluminescência ou
eletroluminescência do LED no tecido orgânico podendo estimular a formação
do estado excitado62, 63.
Uma característica observada nesta radiação é a monocromacidade, ou
seja, um único comprimento de onda ou variável em um comprimento estreito.
A cor da radiação LED depende da pastilha do material semicondutor64.
Apesar desse tipo de luz estar presente em nosso cotidiano
(principalmente em eletrônico) já há algum tempo, somente recentemente ele
vem sendo utilizado em e investigado na área biológica60. Em um estudo
recente Faria65 relata que após a utilização do LED na região visível do
espectro eletromagnético em animais tenotomizados foi observado nitidamente
um quadro de hipercelularidade associado à presença de fibras colágenas e
esparsas, já apresentando aspectos morfológicos indicativos de formação das
fibras colágenas com angulação de até 25º comparado ao tecido integro.
Notou-se uma diminuição da presença de substância fundamental amorfa e de
células inflamatórias crônicas e células fagocitárias. O autor observou
resultados superiores atribuídos à terapia com LED quando comparada à
terapia com laser.
41
Outras características interessantes são: a maior seletividade da luz,
maior tempo de vida útil do aparelho e menor custo de energia66. A variação
térmica presente nos aparelhos de LED é incapaz de causar maiores danos
quando o aparelho é usado em tempos prolongados. Em vista dessas
vantagens alem do baixo custo e praticidade os aparelhos de LED vem
conquistando o mercado, assim como sendo cada vez mais estudados67.
Segundo Califano64 a terapia com luz de baixa potência
(fotobiomodulação) consiste da utilização da luz na faixa do vermelho e
infravermelho próximo (600 a 1000nm) para modular várias funções celulares.
Karu68 explica que a fotobiomodulação ocorre devido a luz
monocromática proveniente dos laseres e LEDs que agem diretamente nos
organismos a nível molecular, nos fotorreceptores primários. O mecanismo
fotobiológico universal de ação da luz inicia na cadeira respiratória nos
fotorreceptores, gerando respostas celulares específicas.
A absorção natural da luz de baixa potência por tecidos biológicos é
puramente não coerente (fotobiológica), devido ao espalhamento de luz nas
primeiras camadas de tecido. No nível celular, as respostas biológicas são
determinadas pela absorção da luz nos fotorreceptores moleculares. A
coerência da luz laser e a não coerência dos LEDs, com o mesmo
comprimento de onda, intensidade e dose fornece respostas biológicas
semelhantes64.
Trelles e Calderhead 69 relatam que em seu estudo que a terapia com
LED no vermelho 633 nm, possui uma variedade de efeitos, assim como
atenuação da dor, cicatrização e propriedades anti-virais.
Takezak et al.70 descreve que em nível dos fibroblastos, seus resultados
usando um LED 633 nm demonstram uma elevação do nível de metabolismo,
devido ao acréscimo abundante de mitocôndrias quando comparado como
fibroblastos não irradiados. O aumento no número de mitocôndrias nas células
são indicativos da grande demanda de energia, diretamente relacionada com o
aumento do metabolismo.
Vink et al.71 comenta em seu estudo que a biomodulação positiva da
cicatrização é frequentemente vista com ceticismo. Os benefícios reais da
terapia LED, podem somente ser estabelecidos por investigação histológica e
clínica realizada sobre protocolos controlados. Aplicação LED em feridas
42
cutâneas, em pele humana, pode ser assumida pela aplicação de parâmetros
dosimétricos, mas futuras investigações são necessárias para explicar o
mecanismo de biomodulação e fornecer protocolos para o uso efetivo de
parâmetros de tratamento com LED72.
43
3 OBJETIVO
3.1 Objetivo Geral
Análise comparativa da terapia com LED (640±20 nm) e laser (660 nm)
sobre o processo de reparação de feridas cutânea em ratos idosos.
3.2 Objetivos Específicos
Avaliar quantitativamente:
- O número de fibroblastos;
- O número de células inflamatórias;
- O número de vasos;
- O número de colágeno;
- A área da lesão durante o processo.
44
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Aspectos Éticos
Está pesquisa está de acordo com os princípios Éticos seguindo as
diretrizes nacionais e internacionais da pesquisa envolvendo animais.
Protocolo n°A94/CEP/2007 (anexo A).
4.2 Modelo Experimental
Foram utilizados 54 ratos albinos machos idosos, linhagem Wistar; com
o peso corporal médio de 500g e idade de 14 meses, provenientes do Biotério
da W.C. LirioME (Animais de Laboratório) da cidade de Vitória do Estado do
Espírito Santo
Os animais foram mantidos no Biotério da UnisulBahia Faculdades
Integradas em gaiolas apropriadas de polietileno padrão, em grupos aleatórios
de 6 animais por gaiola, com acesso a água e ração ad libitum, passando por
um período de adaptação de cinco dias. A sala foi mantida com as condições
de iluminação controlada em ciclos de 12 horas claro/12 horas escuro.
Os 54 animais foram aleatoriamente divididos em nove grupos com n=6:
- Grupo Controle 144: animais sem tratamento, sacrificados após 144
horas do procedimento cirúrgico.
- Grupo Controle 312: animais sem tratamento, sacrificados após 312
horas do procedimento cirúrgico.
- Grupo Controle 480: animais sem tratamento, sacrificados após 480
horas do procedimento cirúrgico.
- Grupo Laser 144: animais tratados com Laser, sacrificados após 144
horas do procedimento cirúrgico.
- Grupo Laser 312: animais tratados com Laser, sacrificados após 312
horas do procedimento cirúrgico.
- Grupo Laser 480: animais tratados com Laser, sacrificados após 480
horas do procedimento cirúrgico.
- Grupo LED 144: animais tratados com LED, sacrificados após 144
horas do procedimento cirúrgico.
45
- Grupo LED 312: animais tratados com LED, sacrificados após 312
horas do procedimento cirúrgico.
- Grupo LED 480: animais tratados com LED, sacrificados após 480
horas do procedimento cirúrgico.
4.3 Procedimento Cirúrgico
O procedimento cirúrgico foi realizado no laboratório de Fisiologia da
UnisulBahia Faculdades Integradas. Todos os animais receberam por via
subcutânea, um pré-tratamento com atropina (relaxante muscular), na dose de
0,04 ml para cada 100 g de peso corpóreo, aguardando 15 minutos para o
procedimento anestésico79. As drogas anestésicas foram cloridrato de
Ketamina10% (Syntec), 0,1 ml /100 g de peso corpóreo com xilazina 2%
(Syntec), 0,1 ml / 100 g, por via intramuscular, utilizando-se seringa de insulina
de 1 ml. Após anestesia os animais foram tricotomizados na região dorsal,
realizando a anti-sepsia da região com álcool iodado 2%. Foi realizado uma
incisão circular com um punch 0,8 cm de diâmetro (instrumento estéril para
biópsia) na região tricotomizada, com profundidade de aproximadamente 1
mm.
4.4 Terapia com Laser e LED
Os equipamentos utilizados no estudo foram: laser de escala industrial
(Bio Wave LLLT Dual – Kondortheck, referência em equipamentos
odontológicos) com comprimento de onda de 660 nm, com potência de 30 mW,
área de 0,5 cm2 em contato direto com a pele do animal. O tempo empregado
foi de 100 segundos, obtendo-se uma dose final de 6 J/cm2 por aplicação
pontual. O LED utilizado foi construído no Instituto de Pesquisa e
Desenvovimento (IP&D) da UNIVAP no comprimento de onda de 640±20 nm
com potência de 54 mW, área de 0,5 cm2 em contato direto com a pele do
animal. O tempo empregado foi de 60 segundos, obtendo-se uma dose final de
6 J/cm2 por aplicação pontual. Antes do inicio da terapia, a potência dos
equipamentos foi medida empregando-se um medidor de potência (Broadband
Power/Energy Meter, Modelo 13 PEM 001/J) no IP&D da UNIVAP.
46
O procedimento terapêutico teve início 30 minutos após a lesão
(irradiação única) e se repetiu a cada 48 horas, num total de 3 aplicações.
Todos os animais receberam a mesma manipulação.
Para o procedimento terapêutico, os animais foram posicionados em
uma mesa, em decúbito ventral, imobilizados manualmente. As regiões
lesionadas receberam a aplicação do laser ou LED em contato direto com a
ferida de forma pontual, formando um anglo de 90° em relação à ferida (figura
3) na dosagem de 6 J/cm² durante 100 segundos para o laser e 60 segundos
para o LED. Os equipamentos foram protegidos com filme plástico para evitar
contaminação. A área de lesão dos animais foi fotografada diariamente para
posterior análise métrica por análise de imagem (programa ImageJ).
Figura 3: Aplicação do Laser (A) e do LED (B).
4.5 Sacrifício dos Animais
O sacrifício dos animais e o procedimento terapêutico seguiram o esquema abaixo:
Sacrifício Sacrifício Sacrifício
0 24 48 72 96 120 144 168 192 216 240 264 288 312 336 360 384 408 432 456 480
3ª aplicação
2ª aplicação
Cirurgia e 1ª aplicação
A B
47
Os animais foram sacrificados em 144, 312 e 480 horas após a cirurgia,
sendo três grupos com 144 horas, três grupos com 312 horas e três grupos
com 480 horas após a lesão. Foi utilizado o mesmo procedimento anestésico
empregado para a cirurgia. Depois de anestesiados os animais receberam
cloreto de potássio a 10% (KCl, 1ml) por via intracardíaca. A região da incisão
circular dos ratos foi removida e fixada em solução de formol a 10% por vinte e
quatro horas e posteriormente foi submetida à processamento histológico.
4.6 Técnica Histológica
Após a fixação, as amostras de pele foram enviadas ao laboratório
Histotec na cidade de São Paulo onde foram desidratadas e inclusas em
paraplast, em seguida foram confeccionados os blocos para serem cortados
em micrótomo, de forma semi-seriada com secções de 5 µm de espessura.
Foram obtidos 8 cortes por animal, sendo 4 cortes corados com Hematoxilina e
Eosina e 4 cortes corados com Tricrômico de Masson.
4.7 Análise da área da lesão
Para a análise da área da lesão a série de comandos utilizados após a
calibração foi: brush selection para demarcar toda a circunferência da lesão,
em seguida o comando mensure para obter a área da lesão (Figura 4).
48
Figura 4: Cálculo da área da lesão pelo programa Image J 1,42d.
4.8 Histomorfometria
As lâminas histológicas foram submetidas à análise por microscópica
óptica e a captura digital no laboratório de laser de alta potência do Instituto de
Desenvolvimento e Pesquisa da Universidade do Vale do Paraíba. A captura
das imagens foi efetuada através de uma câmara digital da marca Leica®, com
resolução de 1280 X 1024 pixels e acoplada a um microscópio trinocular. As
fotomicrografias foram obtidas em aumentos de 40, 100 e 200 vezes e
armazenadas no formato TIFF (Tagged Image File Format).
Os cortes forma representativos da região mediana da amostra do tecido
e para a quantificação da quantidade de células inflamatórias,
49
neovascularização, fibroblastos e colágeno, forma digitalizadas quatro campos
por corte, sendo 4 cortes por lâmina, duas lâminas por animal. Todas as
imagens foram digitalizadas através do programa Leica® Qwin, foram também
padronizadas quanto à intensidade da luz do microscópio e altura do
condensador com a objetiva de 40 x. Houve a obtenção de valores médios para
cada corte e depois para cada animal e ao final a média do grupo (controle,
laser ou LED nas diferentes horas pós-operatórias).
O programa utilizado para realizar a contagem das células inflamatórias,
fibroblasto, vasos neoformados e quantidade de colágeno presente na imagem
foi o programa Image J 1,42d. As imagens foram adquiridas através das
seguintes ordens de comando: File, open e o arquivo desejado. Para a
contagem das células a série de comandos utilizados foi: Plugins, Analyze, Cell
Counter, Initialyze e Type (figura 5). Onde type 3 correspondia à contagem de
células inflamatórias (figura 7), type 5 correspondia à contagem de fibroblastos
(figura 6) e type 7 correspondia à contagem de neovasos (figura 6), que foram
contados manualmente. Para medir a quantidade de colágeno, em µm2, o
procedimento foi a sequência de comandos: Image, Type, 8-Bit, em seguida
voltando em Image, Adjust, Threshold. Realizava-se a marcação e clicava-se
em Aply. Para finalização da mensuração da área de colágeno clicava-se em
Messure (figura 7).
Figura 5: Contagem de células inflamatórias, vasos, fibroblastos pelo programa Image J
1,42d.
50
Figura 6: Indicação do padrão usado na contagem de células inflamatórias (3),
fibroblastos (5), e neovasos (7).
Figura 7: Cálculo da área de colágeno pelo programa Image J 1,42d. Seguindo a
sequência A, B, C, D, E e F
3
5
7
A B C
D E F
51
4.9 Análise estatística
Os dados foram avaliados quanto ao coeficiente de variação e a
distribuição amostral para determinação do teste estatístico considerando o
nível de significância estatística de 5% (p<0,05)53. Empregou-se o teste de
ANOVA com pós-teste de Bonferroni.
52
5 RESULTADOS
5.1 Análise macroscópica
5.1.1 Cálculo de área
A análise da área das feridas está cronologicamente representada na
figura 8.
Figura 8. Área da ferida dos diferentes grupos no decorrer de 480 horas. Valores expressos
em média ± erro padrão, * p<0,05.
A área da ferida do grupo irradiado com LED em 96 horas (4 dias) foi
significativamente menor em relação à contração da lesão que o grupo controle
(p<0,001) e o grupo laser (p<0,05), O grupo controle e laser obtiveram redução
da ferida em 50% e 37%, respectivamente, ao passo o grupo LED obteve
53
redução de 26% somente neste período. Este percentual reduzido de
contração da ferida no grupo LED (96 horas) foi compensado em 144 horas em
relação aos outros grupos. Observa-se que após 312 horas os animais já
apresentavam completa oclusão da ferida (anexo B).
5.2 Análise microscópica
Para a contagem de vasos, fibroblastos, células inflamatórias, e
quantidade de colágeno; foram selecionadas duas regiões da derme,
superficial e profundo, sendo os resultados expressos nas tabelas 1 a 4 e
anexos C a F.
5.2.1 Contagem de Células inflamatórias
O resultado da contagem de células inflamatórias está expresso na
tabela 1.
Tabela 1 - Resultado da contagem de células inflamatórias encontradas 144, 312 e 480 horas
pós-lesão, nos grupos controle, laser e LED.
CÉLULAS INFLAMATÓRIAS (n°/área 55.492 µm2) Controle Laser LED
Horas Superficial Profundo Superficial Profundo Superficial Profundo 144 127,0±22,4 110,9±8,0a,b 163,2±21,2a,b 97,0±14,8a,b 219,9±73,9a,b 68,5±5,5b,e 312 48,9±6,2 45,1±3,3 45,1±4,4 60,0±5,3c 56,8±12,2 42,7±3,4 480 34,5±3,4 37,3±2,5 19,5±2,4 23,7±6,3 14,3±2,3 16,1±1,7 Dados expressos em médias e erro padrão. Resultado considerado significativamente quando p<0,05 (a- 144 vs 312, b- 144 vs 480, c- 312 vs 480, d- controle vs laser, e- controle vs LED, f- laser vs LED).
Na avaliação intragrupos as células inflamatórias presentes na derme
superficial do grupo laser 144 foram estatisticamente superiores aos grupos
laser 312 e 480, p<0,05 e p<0,01 respectivamente. O mesmo pode ser
verificado para o grupo LED 144, o qual foi estatisticamente superior aos
grupos LED 312 e 480, p<0,001 para ambos. Na análise intergrupo não foram
observadas diferenças estatisticamente significativas (p>0,05).
54
A maior concentração de células inflamatórias foi encontrada nos grupo
tratado com LED 144 em derme superficial, quando comparado aos demais
grupos (figura 9).
Figura 9. Fotomicrografias de derme superficial dos grupos controle (A), grupo tratado com
laser (B) e grupo tratado com LED (C), nos diferentes momentos de reparação (144, 312 e 480
horas). H&E, 40X.
O grupo tratado com LED, na região da derme superficial, foi o que
apresentou maior redução do número de células inflamatórias ao final do
estudo.
Na avaliação intragrupo, no que se refere à derme profunda, as células
inflamatórias do grupo controle 168 foram estatisticamente superiores aos
grupos controle 312 e 480, p<0,001 para ambos. O mesmo ocorreu para o
grupo laser 144 vs 312 (p<0,05). Nos intragrupos laser 144 vs laser 480; laser
144 vs laser 480 a diferença estatisticamente significativa respectivamente foi
A144 B144 C144
C312 A312 B312
A480 B480 B480
55
de p<0,001 e p<0,05, sendo laser 504 inferior. O grupo LED 144 foi
significativamente superior ao grupo 480 (p<0,001).
Na análise intergrupo do número de células inflamatórias em derme
profunda o grupo LED 144 foi superior (p<0,01) ao controle 144.
5.2.2 Contagem do número de vasos
Nas avaliações intragrupos (comparação entre diferentes períodos de
tratamento no mesmo grupo) e intergrupos (comparação entre os diferentes
grupos) não observou-se diferença estatística significativa quanto ao número
de vasos (p>0,05, tabela 2).
Tabela 2 - Resultado da contagem do número de vasos sanguíneos encontradas 144, 312 e
480 horas pós-lesão, nos grupos controle, laser e LED.
VASOS SANGUÍNEOS (nº/área 55492 µm2) Controle Laser LED
Horas Superficial Profundo Superficial Profundo Superficial Profundo 168 1,8±0,6 3,2±0,7 1,3±0,7 1,3±0,4 1,0±0,4 2,5±0,4 336 1,4±0,4 2,3±0,5 1,7±0,4 3,6±0,3 1,5±0,5 3,1±0,6 504 1,8±0,5 1,9±0,3 2,1±0,5 2,3±0,6 0,9±0,3 2,2±0,7
Dados expressos em médias e erro padrão. Resultado considerado significativamente quando
p<0,05 (a- 144 vs 312, b- 144 vs 4804, c- 312 vs 480, d- controle vs laser, e- controle vs LED, f-
laser vs LED)
Analisando-se os diferentes dias de tratamento os menores valores
foram encontrados no grupo tratado com LED em nível de derme superficial,
principalmente em 480 horas após a lesão.
Observa-se, que o grupo controle apresentou um número mais
expressivo de vasos em derme profunda aos 144 horas. Nos grupos tratados a
concentração maior de vasos ocorre aos 312 horas após a lesão, em nível de
derme profunda.
No grupo tratado com laser, sacrificado aos 312 horas, observou-se uma
maior quantidade de vasos em região de derme profunda, quando comparado
aos demais grupos (Figura 10).
56
Figura 10. Fotomicrografias de derme profunda dos grupos controle (A), grupo tratado com
laser (B) e grupo tratado com LED (C), nos diferentes momentos de reparação (144, 312 e 480
horas). H&E, 40X.
5.2.3 Contagem de número de fibroblastos
A tabela 3 mostra os dados obtidos na contagem de fibroblastos nos
grupos controle, laser e LED.
Tabela 3 - Resultado da contagem de fibroblastos encontrados 144, 312 e 480 horas pós-
lesão, nos grupos controle, laser e LED
FIBROBLASTOS (n°/área 55.492 µm) Controle Laser LED
Horas Superficial Profundo Superficial Profundo Superficial Profundo 144 104,8±19,2d 92,1±5,9b,c,d 39,4±10,0 44,6±2,4 100,2±28,4 106,7±11,4a,b,f
312 85,5±9,2 66,3±4,3 101,1±11,3a 78,3±8,3 99,1±5,1 73,8±5,7 480 56,4±6,4 33,4±3,5 71,6±5,7 61,4±3,8 52,1±6,5 48,6±4,5
Dados expressos em médias e erro padrão. Resultado considerado significativamente quando p<0,05 (a- 144 vs 312, b- 144 vs 480, c- 312 vs 480, d- controle vs laser, e- controle vs LED, f-laser vs LED)
A144 B144 C144
A312 B312 C312
A480 B480 C480
57
Na análise intragrupos o número de fibroblastos na derme superficial
apresentou diferenças significativas (p<0,05) entre os grupos laser 144 horas e
laser 312 horas, sendo superior neste último. Na análise intergrupo, aos 168
horas, o grupo controle foi superior (p<0,05) ao grupo laser, quanto ao número
de fibroblastos em derme superficial (figura 9).
Em derme profunda, na análise intragrupo, os animais controle e
tratados com LED apresentaram diferença estatisticamente significativa. Não
foram observadas diferenças estatísticas entre os diferentes períodos de
estudo do grupo laser. No grupo controle o número de fibroblastos foi superior
aos 144 horas (p<0,01) e aos 312 horas (p<0,05) quando comparados ao
período de 480 horas. O mesmo ocorreu com o grupo LED (144 vs 312 p<0,05
e 144 vs 480 p<0,001). Na avaliação intergrupos em derme profunda observou-
se diferença estatística significante entre os grupos controle 144 vs laser 144
(p<0,001) e laser 144 vs LED 144 (p<0,001), sendo que o grupo laser
apresentou-se inferior a ambos os grupos nesta fase inicial de análise. O grupo
controle apresentou menor número de fibroblastos em 480 horas, tanto na
análise intra como inter grupos. O maior número de fibroblastos foi encontrado
no grupo tratado com LED aos 144 horas, em derme profunda (Figura 10).
5.2.4 Análise do Colágeno
Os dados referentes à quantidade de colágeno em µm2 estão
apresentados na tabela 4.
Tabela 4 - Resultado da quantidade de colágeno 144, 312 e 480 horas pós-lesão, nos grupos
controle, laser e LED
Dados expressos em médias e erro padrão. Resultado considerado significativamente quando p<0,05 (a- 144 vs 312, b- 144 vs 480, c- 312 vs 480, d- controle vs laser, e- controle vs LED, f-laser vs LED)
QUANTIDADE DE COLÁGENO (em µm2 /área 55492 µm2) Controle Laser LED
Horas Superficial Profundo Superficial Profundo Superficial Profundo 144 33775,0±904,6a,b 36976,2±767,4 41785,4±626,8d 39871,0±1.405,4 45747,6±1.613,0e 47257,0±1.291,0e,f 312 40287,2±1768,9 40999,3±1.261,5 46271,1±548,5d 45022,5±943,2 48611,0±1.015,1e 46169,3±1.987,6 480 44264,1±755,7 41998,2±1.785,6 47025,7±610,5 45346,2±829,1 49711,66±247,5e 45790,1±1.627,8
58
O resultado da avaliação intragrupos em derme superficial demonstrou
que a porcentagem de colágeno nos grupos controles 312 e 480 horas são
significativamente maiores (p<0,05 e p<0,001 respectivamente), que o grupo 7
dias.
Na avaliação intergrupo (derme superficial) observou-se diferença
estatisticamente significativa entre o grupo controle 144 e os grupos laser 144
(p<0,01) e grupo LED 144 (p<0,001). Observou-se que o grupo controle 312 foi
significativamente menor que os grupos laser 336 (p<0,01) e grupo LED 336
(p<0,001). O grupo controle 480 se apresentou inferior somente ao grupo LED
480 (p<0,05). Os grupos laser e LED foram superiores ao grupo controle em
todos os tempos observados.
Na derme profunda a análise intragrupos demonstrou ausência de
diferença estatística nos diferentes grupos (p>0,05). Na análise intergrupos
observou-se superioridade no percentual de colágeno para o grupo LED 144
quando comparado ao grupo controle (p<0,001) e ao grupo laser (p<0,05).
Os animais controle, nos diferentes tempos avaliados, apresentaram
menor percentual de colágeno que os animais tratados, principalmente o grupo
144 horas em derme superficial.
Os grupos tratados com LED obtiveram maiores valores quando
comparados aos demais grupos, sendo que o grupo LED 480 apresentou maior
quantidade de colágeno.
59
6 DISCUSSÃO
Segundo Balbino, Pereira e Curi38 a divisão do processo de reparo da
lesão é feita em três fases, sendo considerados, prioritariamente, os aspectos
macroscópicos e histológicos predominantes em cada uma delas. Nessa forma
a visão e a descrição do processo, torna-se secundário as características
assumidas pela lesão, ao longo de sua evolução, resultam da sucessão ou
sobreposição de eventos celulares e tissulares resultantes da ativação celular
por mediadores químicos.
Com o envelhecimento ocorre uma redução das funções corporais em
todos os níveis, bem como a diminuição da velocidade nas reações corporais,
assim levando à diminuição da cicatrização, tendo em vista uma diminuição da
mitose e da vascularização tecidual21.
A primeira fase da cicatrização é chamada de fase inflamatória e é
caracterizada por aumento do fluxo sanguíneo, alterações da
microvascularização, migração de células inflamatórias e acúmulo destes no
local lesão 38,73. Os resultados obtidos no presente estudo demonstraram que
os grupos tratados apresentaram maior concentração de células inflamatórias
no sítio de lesão em nível superficial no estágio inicial de reparação,
principalmente do grupo LED em relação ao grupo controle. Esta proporção é
inversamente proporcional na fase final do estudo (480 horas após a lesão,
fase de síntese eminente). Estes dados corroboram com estudos anteriores,
que empregaram a radiação eletromagnética coerente na região do vermelho
(laseres) para a estimulação do processo de reparo tecidual em feridas
cutâneas em fase inflamatória 54,08. Poucos estudos foram realizados
empregando a terapia com LED que relatam este aumento no número de
células inflamatórias, sendo todos os estudos realizados em animais jovens ou
com um fator agravante e nenhum estudo foi realizado em animais idosos 70,
72,73. A celularidade pró-inflamatória observada nos grupos tratados sugere a
presença de um efeito de quimiotaxia, já descrita na TLBP 49,56, 57, 58, porém não
salientado anteriormente com terapia LED. Esta intensa presença de células
inflamatórias, evidenciadas no grupo LED pode propiciar áreas mais reativas a
processos sépticos, conforme apontam estudos prévios realizados com
radiação eletromagnética no vermelho56, 57. Em nível profundo, as lesões
60
apresentaram-se com menos celularidade nos grupos tratados, inferindo sobre
a normalização de reatividade do tecido, como melhoria do pH, redução de
produção de prostaglandinas, aumento da atividade mitocondrial, aumentando
os radicais oxidantes, que estimulam a cadeia respiratória e a produção de
ATP, que levam a síntese de DNA e RNA, consequentemente acarretando
mitoses e proliferação celular 74, 75. Estes dados apontam para uma otimização
do início do processo de reparo tecidual (fase inflamatória) em organismos
idosos, onde este processo é naturalmente mais lento em relação a
organismos jovens.
Na fase proliferativa de um processo de reparação ocorre formação de
epitélio para recobrir a superfície da ferida. Neste processo estão envolvidos
mecanismos de proliferação de fibroblastos, deposição de colágeno e outras
matrizes extracelulares e desenvolvimento de novos vasos sanguíneos35, 36, 37,
38, 76. A análise da concentração de vasos sanguíneos é extremamente
dificultosa em técnicas histológicas convencionais, considerando as
características topográficas dos vasos. Erros podem ocorrer em suas
contagens, conduzindo a falsos resultados quanto à quantidade de vasos
presentes em um tecido. No presente estudo a contagem do número de vasos
foi empregada com o intuito de, em conjunto com os demais parâmetros de
análise, permitir uma observação sobre a formação de um tecido de granulação
em tecidos tratados com fototerapia. Não foram observadas diferenças
estatisticamente significantes entre os grupos tratados e controle, o que pode
sugerir ausência de estímulo de neoformação vascular com os parâmetros
empregados tanto com a terapia Laser como com a LED. Estes dados vão de
encontro aos resultados encontrados por Rabelo et al. 76 verificou que animais
diabéticos e não diabéticos tratados com laser demonstraram diminuição do
número de vasos durante a primeira semana de reparo tecidual, porém o
número de vasos foi menor nos animais tratados com laser. Na avaliação do
número de vasos no presente estudo observou-se a angiogênse em todos os
grupos sendo expressiva na derme profunda nos grupos tratados em fases
subseqüentes. De forma similar Silva77 observou a presença de angiogênse em
região profunda de animais controle, levemente superior em comparação aos
grupos tratados com luz.
61
Segundo Li, Chen e Kirsner37 a formação de novos vasos ocorrem
devido à pré-existência de vasos adjacentes à lesão. Em resposta à lesão as
células endoteliais iniciam o processo de angiogênse.
Na análise do número de fibroblastos, em fase proliferativa (312 horas),
observou-se ausência de diferença estatística entre os grupos de estudo, o
mesmo ocorrendo nos estudos de Rabelo76 para feridas de animais saudáveis
tratados com radiação eletromagnética coerente na região do vermelho (632,8
nm). Entretanto diferenças significativas do número de fibroblastos foram
observadas no grupo LED 144 horas em relação ao grupo laser em 144 horas,
corroborando com estudos de base realizados por Vinck et al.71. Os autores
verificaram que em 144 horas a radiação eletromagnética não coerente na
região do visível promove aumento do número fibroblastos quando comparados
grupos LED no infravermelho e laser. Ainda que fora da fase proliferativa estes
dados são fundamentais para a compreensão dos resultados obtidos na área
de colágeno obtida na fase de síntese para os grupos tratados com luz.
O fibroblasto desempenha um papel crucial na cicatrização da ferida, a
maioria dos estudos publicados na literatura sobre a TLBP examinaram os
seus efeitos sobre fibroblasto, crescimento celular, migração, e produção de
colágeno52. Autores como Hawkins e Abrahamse6 e Takezai et al. 70
demonstraram aumento do metabolismo celular, com presença de maior
número de mitocôndrias no citoplasma de fibroblastos de animais irradiados em
comparação aos animais controle. O aumento do número de mitocôndrias foi
indicativo de aumento de demanda energética, o que pode ter acarretado a
elevação do número de fibroblastos e/ou aumentado síntese de colágeno.
Esses dados vão ao encontro dos resultados da pesquisa em questão, pois os
grupos controle e LED apresentaram os maiores números de fibroblastos em
144 horas enquanto o grupo tratado com laser apresentou a maior quantidade
de fibroblasto em 312 e 504 horas quando comparado com os outros dois
grupos. Ambos os grupos tratados apresentaram quantidade de colágeno
superior (estatisticamente significantes) ao controle, demonstrando ao aumento
do metabolismo dos fibroblastos como sugerido por Hawkins e Abrahamse6,
Takezai et al.70 e Posten49.
Considerando os efeitos antiinflamatórios da radiação eletromagnética
no vermelho é razoável supor que a radiação laser poderia influenciar a
62
produção de mediadores inflamatórios, como citocinas. O TGF β é uma
importante citocina que age durante o processo de cicatrização, ativando a
proliferação celular. É possível que o laser atue sobre os macrófagos na cadeia
respiratória, reforçando a produção TGF β, o que inibe a diapedese dos
macrófagos no tecido conjuntivo. Este mecanismo pode explicar o reduzido
número de macrófagos e edema na derme irradiada em comparação com a
derme controle. O TGF β tem um elevado número de efeitos biológicos, como a
indução da diferenciação de fibroblastos em miofibroblastos e a angiogênese e
a estimulação da síntese de colágeno 78. Yasukawa79 continua explicando que
observações histológicas demonstraram que após a saída do excesso de
células inflamatórias aumenta a formação de fibras colágenas e retoma a
continuidade do tecido. Em contra mão há indícios que a inflamação leva a
uma pobre formação de fibras colágenas e descontinuidade do tecido
Corroborando os achados desse estudo, onde no grupo tratado com radiação
eletromagnética no vermelho apresentou na fase inicial (144 horas) maior
número de células inflamatórias na derme superficial quando comparado com
os demais grupos e apresentando diferença na quantidade de colágeno sendo
que os maiores depósitos foram observados nos grupos tratados com LED,
seguido do grupo tratado com Laser.
A fase de remodelação é a ultima da fase de cicatrização e é nela que
ocorre a reorganização do colágeno e que levará a uma maior força tensil77.
Ferreira80 diz ainda que por meio da leitura dos cortes histológicos houve
melhor cicatrização do tecido lesado nos grupos tratados, com ênfase no grupo
idoso. A pesquisa em questão confirma os achados de Ferreira80 através da
quantidade de colágeno na área da lesão, pois nos grupos tratados houve uma
quantidade maior de colágeno que nos grupos não tratados, sendo que o grupo
tratado com LED foi mais evidente, seguido pelo grupo tratado com laser.
Inúmeras pesquisas foram feitas com utilização da radiação
eletromagnética no vermelho com o intuito de ver sua ação no processo de
reparação tecidual 49,51,56,60,74,81. O processo de cicatrização por ser um
processo temporal, tem tentado analisar se TLBP acelera cicatrização de
feridas. Estes estudos tentam quantificar a área da superfície de uma ferida
aberta e suas mudanças com o tempo49. Pesquisas, com animais não idosos,
têm mostrado que o tempo de cicatrização é menor nos animais que foram
63
tratados com radiação eletromagnética no vermelho do que os animais que não
utilizaram esse tipo de terapia 49,80,82. Esses dados não são concordantes aos
dados obtidos nessa pesquisa, pois todos tanto os grupos tratados como os
grupos controles tiveram o mesmo tempo de cicatrização. A única diferença
observada em 96 horas após o procedimento cirúrgico, onde os grupos
controle e os grupos tratados com laser tinham uma área de ferida menor que o
grupo tratado com LED, mas após 144 horas do processo cirúrgico não havia
diferença estatisticamente significante no tamanho da lesão entre os três
grupos. Posten et al.49 explica que os efeitos da cicatrização em muitas vezes
são dependente de fatores intrínsecos, tais como a localização e as tensões
sobre a ferida, como muito sobre como a terapia em si. Ferreira80 complementa
relatando dizendo que há atrasos na reepitelização, tanto em humanos quanto
em animais idosos e que este atraso se deve mais ao processo sistêmico do
que ao próprio processo de envelhecimento.
Vários estudos foram realizados visando à melhoria do processo de
reparação da pele através da luz Laser, mas a dificuldade é observada ao
tentar estabelecer os parâmetros que serviram de guias para a pesquisa, visto
os diferentes padrões de utilização da radiação Laser. Recentemente as
pesquisas científicas têm-se voltado para a os efeitos da terapia com LED no
tecido biológico e por esse motivo ainda há uma escassez de pesquisas sobre
seus efeitos. Outro ponto a ser levantado é a grande variedade de parâmetros
e padrões na utilização do LED, o que dificulta estabelecer um padrão para o
tratamento das lesões de pele. Muitos artigos têm como objetivo a melhora da
reepitelização depois de uma lesão, mas são raros aqueles que falam do
assunto no idoso, visto que a população mundial vem envelhecendo. Com isso
faz-se necessário mais pesquisas sobre o assunto aqui abordado.
64
7 CONCLUSÕES
Com os resultados obtidos verificou-se que o tratamento com a Luz
coerente e não coerente favoreceram o processo de reparação epitelial dos
ratos idosos, sendo que os animais tratados com a luz não coerente (LED) no
comprimento de onda do 640±20 nm apresentaram melhores resultados
quando comparados com a luz coerente (Laser) no comprimento de onda no
660nm.
65
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72
Anexo A – Certificado do Comitê de Ética e Pesquisa
73
Anexo B – Tabela de dados da área da lesão dos diferentes grupos experimentais
Grupos 0h 48h 96h 144h 192h 240h 288h 336h 384h 432h 480
Controle 0,5 0,34±0,01 0,17±0,03 0,09±0,01 0,04±0,01 0,006±0,004 0,0015±0 0 0 0 0 Laser 0,5 0,30±0,01 0,19±0,01 0,12±0,01 0,02±0,01 0,003±0,001 0 0 0 0 0
LED 0,5 0,35±0,02 0,26±0,01* 0,13±0,01 0,05±0,01 0,001±0 0 0 0 0 0
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Anexo C – Gráficos do número de células inflamatórias em derme profunda e superficial
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Anexo D – Gráficos do número de vasos sanguíneos em derme profunda e superficial
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Anexo E – Gráficos do número de fibroblastos em derme profunda e superficial
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Anexo F – Gráficos da quantidade de colágeno em derme profunda e superficial