Comunicação Na construção do território agroecológico da Borborema.
Dissertação - Juliana Mota de Borborema
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UNIVERSIDADE CIDADE DE SÃO PAULO
PROGRAMA DE MESTRADO EM FISIOTERAPIA
JULIANA MOTA DE BORBOREMA
NEUROPLASTICIDADE FRENTE ATIVIDADE FÍSICA
EM RATOS IDOSOS: EXERCÍCIO EM ESTEIRA E
EXERCÍCIO ACROBÁTICO
SÃO PAULO
2013
JULIANA MOTA DE BORBOREMA
NEUROPLASTICIDADE FRENTE ATIVIDADE FÍSICA
EM RATOS IDOSOS: EXERCÍCIO EM ESTEIRA E
EXERCÍCIO ACROBÁTICO
Dissertação apresentada ao Programa de Mestrado em Fisioterapia da Universidade Cidade de São Paulo, como exigência para obtenção do Título de Mestre, sob a orientação da Profa. Drª. Raquel Simoni Pires .
SÃO PAULO
2013
Ficha Elaborada pela Biblioteca Prof. Lúcio de Souza. UNICID
B726n
Borborema, Juliana Mota de.
Neuroplasticidade frente atividade física em ratos idosos: exercício em esteira e exercício acrobático. / Juliana Mota de Borborema. --- São Paulo, 2013.
73 p.
Bibliografia
Dissertação (Mestrado) – Universidade Cidade de São Paulo - Orientador: Prof. Dr.
1. Plasticidade neural. 2. Exercícios. 3. Envelhecimento. I. Título.
CDD 615.82
JULIANA DA MOTA BORBOREMA
NEUROPLASTICIDADE FRENTE ATIVIDADE FÍSICA EM RATOS
IDOSOS: EXERCÍCIO EM ESTEIRA E EXERCÍCIO ACROBÁTICO
Dissertação apresentada ao Programa de
Mestrado em Fisioterapia da Universidade
Cidade de São Paulo, como requisito para
obtenção do título de Mestre
A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Tese de Mestrado, em sessão
pública realizada a ......../........../............., considerou
( ) Aprovada ( ) Reprovada
Examinadora:.........................................................................................................
Profª.Drª Renata Hydee Hasue Vilibor
Universidade de São Paulo
Examinadora:.........................................................................................................
Profª.Drª Mônica Rodrigues Perraccini
Universidade Cidade de São Paulo
Presidente:.............................................................................................................
Profª.Drª Raquel Simoni Pires
Universidade Cidade de São Paulo
Aos meus pais, ao meu irmão Vasco, e meu namorado Carlos, pelo apoio e incentivo e por estarem presentes em
todos os momentos da minha vida.
AGRADECIMENTOS
À Deus, por ter me dado a benção de conquistar mais um objetivo, e por colocar pessoas maravilhosas em meu caminho, que contribuíram para que isto se concretizasse.
Aos meus pais, que sempre me apoiaram nas escolhas, e mesmo de longe incentivam com suas palavras e atitudes de amor e compaixão.
Ao meu namorado, pelo companheirismo e amor, sempre esteve do meu lado, ajudando no que fosse preciso.
À minha orientadora Profª. Raquel, que proporcionou um grande conhecimento sempre com muita paciência e dedicação.
Ao Prof. Britto, por abrir as portas do seu laboratório para nos receber e adquirir muito aprendizado.
À minha amiga Samira, parceira de mestrado, por estar sempre comigo, pelos vários momentos de alegria, pelo companheirismo.
À Carol, por contribuir com este trabalho, pelos ensinamentos no laboratório, por todo apoio e paciência.
À Priscilla, pela contribuição neste trabalho, pelos ensinamentos, apoio e companheirismo.
À Quilza, pelo apoio, companheirismo, conversas e amizade.
Ao Adilson, com seu jeito alegre, sempre ajudando no que fosse preciso, e transmitindo conhecimento.
À todas as pessoas do laboratório da USP, tornando ambiente muito agradável, sempre todos muito prestativos.
À turma de mestrado da UNICID, que fizeram um ano de mestrado ser muito proveitoso e agradável, pude conhecer pessoas maravilhosas
À todos meus amigos e familiares que direta ou indiretamente contribuíram para este aprendizado.
À FAPESP pelo apoio financeiro.
Obrigada!
RESUMO
O declínio da função do sistema nervoso causado pelo envelhecimento pode
acarretar déficits cognitivos e motores, tais como redução de memória, aprendizado,
equilíbrio e perda de habilidades motoras complexas que podem ser amenizados
com a prática de exercícios físico. Entretanto, até o momento pouco se sabe sobre
os mecanismos neuroplásticos do efeito do exercício sobre o sistema nervoso. O
objetivo deste estudo foi analisar a expressão de proteínas estruturais MAP2 e
neurofilamentos (NFs), e proteínas sinápticas sinapsina I (SYS) e sinaptofisina (SYP)
nas áreas motoras do córtex cerebral, estriado e cerebelo de ratos envelhecidos
submetidos a exercício em esteira (EE) e acrobático (AC). Foram utilizados 39 ratos
idosos machos com 18 meses de idade, Wistar, separados em 3 grupos: controle-
sedentário (SED, N=11), exercício em esteira (EE, N=13) e exercício acrobático (AC,
N=15). No grupo EE, os ratos treinaram em uma esteira com velocidade máxima de
0,5 Km/h por 40 minutos, 3 vezes por semana, durante 4 semanas. No grupo AC, os
ratos passaram por um circuito composto por diversos obstáculos, durante o mesmo
período que o EE. Após 4 semanas de treinamento as análises da expressão das
proteínas foram realizadas pelas técnicas de “immunoblotting" e imuno-histoquímica,
e os dados submetidos à análise estatística, utilizando-se ANOVA e pós-teste de
Tukey quando apropriado. O nível de significância adotado foi p<0,05. Os dados de
“immunoblotting" e imuno-histoquímica revelaram que animais treinados,
independente do tipo de exercício, apresentaram mudanças na expressão de
proteínas estruturais e sinápticas distintas nas áreas estudadas. Os grupos AC e EE
induziram aumento significante de MAP2, NF68 e SYS e diminuição de SYP no
córtex motor, e um aumento de NFs e SYP, com diminuição significativa de MAP2 e
SYS no estriado. Já o cerebelo respondeu com aumento significante de MAP2 e
diminuição de NFs, SYS e SYP. Estes dados parecem sugerir que o córtex motor de
ratos idosos apresenta respostas plásticas distintas das outras estruturas estudadas,
independente da atividade motora, sugerindo maior participação do córtex no
controle motor.
Palavras-Chave: Envelhecimento, marcadores plásticos, neuroplasticidade,
exercício acrobático, exercício em esteira.
ABSTRACT
Age related changes in the nervous system of the individual, may generate cognitive
and motor damage, such as reduction of memory, learning, balance and complex
motor skill can be mitigated with physical exercises. However, so far little is known
about the mechanisms involved in this neuroplastic improves. The objective of this
study was to analyze the expression of structural protein MAP2 and neurofilaments
(NFs), and synaptic proteins synapsin I (SYS) and synaptophysin (SYP) in the motor
areas of the cerebral cortex, cerebellum and striatum of aged rats submitted to
treadmill exercise (TE) and acrobatic exercise (AE). We used 39 elderly male rats
were used with 18-month-old, Wistar, divided into 3 groups: control-sedentary (SED,
N = 11), treadmill exercise (TE, N = 13) and acrobatic exercise (AE, N = 15). In
Group TE, the rats trained on a treadmill with maximum speed of 0.5 Km/h by 40
minutes, 3 times per week for 4 weeks. In the group AE, the rats went through
circuits composed of various obstacles during the same period that the TE. After 4
weeks of training analyses of protein expression were carried out by techniques of
"immunoblotting” and Immunohistochemistry, and data submitted to statistical
analysis using ANOVA and Tukey post-test when appropriate. The level of
significance was p<0,05. The "immunoblotting” and Immunohistochemistry revealed
that trained animals, regardless of the type of exercise, showed changes in structural
protein expression and distinct synaptic in the areas studied. AE and TE groups
induced significant increase of MAP2, NF68 and SYS and SYP in the motor cortex,
and an increase of NFs and SYP, with significant decrease of MAP2 and SYS in
striatum. Already the cerebellum responded with significant increase of MAP2 and
decrease of NFs, SYS and SYP. These data suggest that the motor cortex of aged
rats presents larger plastic responses than compared with other structures studied,
independent of motor activity, suggesting greater participation of the motor cortex in
neuroplaticity.
Keywords: Aging, plastic markers, neuroplasticity, exercise acrobatic, exercise
treadmill.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Imagem da esteira ergométrica adaptada para ratos..........................22
Figura 2 - Imagens digitais dos obstáculos que compõem o circuito para as
atividades acrobáticas.......................................................................................23
Figura 3 - Desempenho dos ratos em diferentes períodos de treinamento acrobático
avaliado pela média do tempo gasto para realização das seis tarefas presentes no
circuito por semana........................................................................................28
Tabela 1 – Níveis de proteínas estruturais e sinápticas nos diferentes tipos de
exercício.............................................................................................................30
Figura 4 – Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína
associada ao microtúbulo (MAP2) no córtex motor (MI e
M2)...............................................................................................................31
Figura 5 – Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína
NF no córtex motor (MI e M2).........................................................................32
Figura 6 – Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína
SYP no córtex motor (MI e M2).......................................................................34
Figura 7 – Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína
SYS no córtex motor (MI e M2).......................................................................35
Figura 8 – Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína da
proteína associada ao microtúbulo (MAP2) no
estriado..............................................................................................................36
Figura 9 – Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína
NF no estriado................................................................................................38
Figura 10 – Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína
SYP no estriado..............................................................................................39
Figura 11 – Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína
SYS no estriado..............................................................................................40
Figura 12 – Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína
associada ao microtúbulo (MAP2) no
cerebelo.............................................................................................................43
Figura 13 – Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína
NF no cerebelo...............................................................................................44
Figura 14 – Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína
SYP no cerebelo.............................................................................................45
Figura 15 – Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína
SYS no cerebelo............................................................................................46
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
- AC: Exercício Acrobático
- EE: Exercício em esteira
- AE: Ambiente Enriquecido
- BDNF: Fator Neurotrófico Derivado do Encéfalo
-GDNF: Fator Neurotrófico Derivado de células Gliais
- Cb: Cerebelo
- CG: Camada Granular
- CM: Camada Molecular
- EG: Externamente Guiado
- GluR: Receptor de Glutamato
- IG: Internamente Guiado
- LTP: Potenciação a Longo Prazo
- MAP: Proteína Associado ao Microtúbulo
- NF: Neurofilamento
- NT: Neurotransmissor
- SED: Sedentário
- SNC: Sistema Nervoso Central
- SYP: Sinaptofisina
- SYS: Sinapsina
- NMDAR1: Subunidade 1 do Receptor de Glutamato do tipo Ácido gama-amino-
butírico
SUMÁRIO
RESUMO...................................................................... Erro! Indicador não definido.
ABSTRACT .................................................................. Erro! Indicador não definido.
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 6
1.1. Envelhecimento e repercussões sobre o SNC .................................................. 6
1.1.1 Alterações Morfológicas ................................................................................. 6
1.1.2. Alterações Funcionais e Neuroquímicas ........................................................... 7
1.2. Neuroplasticidade e Exercício Físico ................................................................. 8
1.2.1. Ambiente Enriquecido ....................................................................................... 9
1.2.2. Exercício Acrobático ........................................................................................ 10
1.2.3. Exercício em Esteira........................................................................................ 12
1.3. Circuitos funcionais ......................................................................................... 13
1.3.1. Aquisição de novas habilidades X Automatizado/rítmico ................................ 13
1.4. Mecanismos neuroplásticos no envelhecimento ............................................. 14
1.4.1. Mecanismo de De-diferenciação ..................................................................... 14
1.4.2. Mecanismo da Compensação ......................................................................... 14
1.5. Estruturas Anatômicas .................................................................................... 15
1.5.1 Córtex Motor ..................................................................................................... 15
1.5.2. Estriado ........................................................................................................... 16
1.5.3. Cerebelo .......................................................................................................... 17
1.6. Marcadores de Plasticidade Sináptica ............................................................... 19
2. JUSTIFICATIVA .................................................................................................... 20
3. OBJETIVOS .......................................................................................................... 20
4. MATERIAIS E MÉTODOS .................................................................................... 21
4.1. Animais ........................................................................................................... 21
4.2. Desenho do estudo ......................................................................................... 21
4.3. Protocolo de Exercício em Esteira (EE) .......................................................... 22
4.4. Protocolo de Exercício Acrobático (AC) .......................................................... 22
4.5. Protocolo de Imuno-histoquímica .................................................................... 23
4.6. Protocolo de “Immunoblotting” ........................................................................ 26
4.7. Análise Estatística .............................................................................................. 27
5. RESULTADOS ...................................................................................................... 28
5.1. DESEMPENHO MOTOR .................................................................................... 28
5.2. EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS .................................................................... 29
5.2.1. Córtex Motor .................................................................................................... 29
5.2.2. Estriado ........................................................................................................... 33
5.2.3. Cerebelo .......................................................................................................... 37
6. DISCUSSÃO ......................................................................................................... 47
6.1. Desempenho Motor ............................................................................................ 47
6.2. Córtex Motor ....................................................................................................... 48
6.3. Estriado .............................................................................................................. 51
6.4. Cerebelo ............................................................................................................. 55
7. CONCLUSÕES .................................................................................................. 58
8. REFERÊNCIAS ..................................................................................................... 59
ANEXO I .................................................................................................................... 65
6
1. INTRODUÇÃO
Uma das maiores conquistas da humanidade foi o incremento na
quantidade de anos vividos, propiciando um aumento da longievidade do
mundo inteiro, ou seja, estes estão vivendo cada vez mais1.
Com o envelhecimento há um declínio nas funções do controle
sensóriomotor, déficit cognitivo, o que pode acarretar diminuição do
desempenho funcional. Esse declínio no controle motor fino, na marcha e
equilíbrio, e um aumento da variabilidade e lentidão dos movimentos, favorece
o risco de quedas atenuando a capacidade dos idosos em exercerem suas
atividades de vida diária (AVD’s) e manter a independência. A causa disto é
multifatorial, e vem com o declínio do sistema nervoso central2, 3.
No entanto, estudos tem descrito que a prática de atividade física é
capaz de promover neuroplasticidade no encéfalo de humanos e animais
amenizando os efeitos do envelhecimento. Várias atividades são descritas por
promover neurogênese no hipocampo, como é o caso da atividade voluntária e
o ambiente enriquecido4, 5 e sinaptogênese frente a exercício em esteira6, entre
outros. Porém essas atividades e seus efeitos serão discutidos em uma sessão
seguinte. Cabe primeiro, destacar algumas mudanças que ocorrem no cérebro
durante o processo do envelhecimento, que incluem alterações morfológicas,
funcionais e bioquímicas7.
1.1. Envelhecimento e repercussões sobre o SNC
1.1.1 Alterações Morfológicas
O envelhecimento é um processo fisiológico normal caracterizado como
um declínio de aspectos estruturais de regiões encefálicas específicas, como o
volume da substância cinzenta, espessura cortical, entre outros 8. Porém ao
contrário do que se imagina o declínio estrutural não reflete apenas a perda
neuronal, como demonstrado por estudos estereológicos em ratos, macacos e
seres humanos visto que esta é mínima em regiões do neocórtex e hipocampo,
podendo ser mais evidente no cerebelo e substância negra9-13.
7
Apesar da perda neuronal não ser de grande relevância, outras
estruturas não menos importantes se encontram reduzidas podendo acarretar
déficits importantes Estudos realizados com a ressonância magnética em
humanos mostram uma redução significativa do volume de massa cinzenta e
branca no córtex cerebral relacionados com o envelhecimento 14, 15. A redução
deste volume não é uniforme em todo o córtex cerebral e parece ser decorrente
de uma redução de espinhos dendríticos, densidade sináptica e também
arborização dendrítica principalmente no córtex pré-frontal, córtex motor e
temporal superior de humanos e primatas idosos 15-17. Vale ressaltar, que os
dendritos neuronais são fundamentais para a formação e manutenção de redes
neurais, regulação da plasticidade sináptica, assim como a integração de
entradas elétricas18. E mais, a extensão da arborização dendrítica de um
neurônio é um determinante para as propriedades sinápticas das células
afetando o processamento e integração da informação 19.
O cerebelo é bastante enfatizado quando se trata das alterações
produzidas pelo envelhecimento. Huang e colaboradores20, relatam que há um
declínio no número de fibras paralelas até 23 meses de idade dos animais, e
consequentemente, diminuição no número de sinapses gerando degeneração
neuronal. Isto reflete funcionalmente na coordenação motora e equilíbrio que
são essenciais na estabilização postural 20.
1.1.2. Alterações Funcionais e Neuroquímicas
As mudanças estruturais que ocorrem nos neurônios durante o
envelhecimento, podem afetar as propriedades eletrofisiológicas9. Há
evidências de que a transmissão sináptica excitatória no córtex pré-frontal de
macacos pode estar atenuada com a idade avançada, o que pode induzir uma
diminuição de espinhos dendríticos, e consequentemente a redução no número
de neurônios que expressam os receptores glutamatérgicos do tipo GluR2 e
NMDAR121, 22. O glutamato e seus receptores estão presentes na maioria das
sinapses excitatórias e são responsáveis pelas funções motoras e cognitivas
que se encontram alteradas com o envelhecimento 23.
8
O processo de envelhecimento normal desencadeia uma série de
mudanças neuroquímicas, tais como: redução das enzimas que sintetizam os
neurotransmissores dopamina, acetilcolina e glutamato, que são responsáveis
pela comunicação neuronal, podendo levar a um comprometimento na
transmissão sináptica e na potenciação e depressão de longa duração
(LTP/LTD), responsáveis pelas disfunções cognitivas e motoras no indivíduo
idoso 7, 24, 25.
Outro aspecto importante durante o envelhecimento é a diminuição dos
fatores neurotróficos tais como, fator neurotrófico derivado de células gliais
(GDNF) e fator de crescimento nervoso (NGF) que desempenham um papel
importante no encéfalo durante o envelhecimento, pois já foi visto que a infusão
desses fatores em encéfalos de animais envelhecidos atenuam os déficits
cognitivos e motores produzidos por alterações nos sistemas colinérgico e
dopaminérgico, respectivamente15.
Outro fator neurotrófico que vem sendo muito estudado é o fator
neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), que tem uma redução significativa
principalmente no hipocampo, podendo levar a disfunções cognitivas 15, 25. Este
tem um papel importante na sobrevivência e/ou crescimento de muitos subtipos
neuronais, incluindo os neurônios glutamatérgicos. Além disso, é um
importante mediador da eficácia sináptica e conectividade 26.
Diante de todas as evidências, que elucidam os motivos pelos quais
indivíduos idosos apresentam uma série de perdas tanto cognitivas quanto
motoras, alguns estudos têm sido realizados na tentativa de mostrar que as
perdas causadas pelo envelhecimento podem ser atenuadas com terapias
medicamentosas no combate ao efeito oxidante nas células27 e também, com a
realização da atividade física para amenizar tais limitações funcionais que o
envelhecimento promove15, 28.
1.2. Neuroplasticidade e Exercício Físico
A neuroplasticidade pode ser definida como uma mudança na estrutura
e função do sistema nervoso, em resposta à ação dos ambientes interno e
externo, ou como resultado de lesões de nível neural7.
9
O exercício físico é considerado uma importante ferramenta capaz de
gerar efeito neuroprotetor, prevenir e proteger as funções do cérebro
principalmente durante o envelhecimento 29. Estudos com animais e humanos
tem evidenciado que o exercício tem um impacto positivo sobre aspectos
cognitivos, emocionais e comportamentais 26, 30, 31. A partir disso, vários
modelos de exercício físico têm sido desenvolvidos em estudos com animais, a
fim de simular atividade física dos humanos. Esses modelos incluem exercícios
de alta e baixa intensidade, intermitente ou contínuo, de curta ou longa duração
além dos diferentes modos de exercício 32.
Antes de citar quais modelos de exercício são mais recentemente
usados em animais para aproximar da atividade em humanos, cabe deixar
claro, os diferentes conceitos de atividade física e exercício físico. Atividade
física é qualquer movimento corporal produzido por músculos esqueléticos
gerando um gasto energético. O exercício físico é um subconjunto da atividade
física, definido como um movimento corporal repetitivo e programado, com o
intuito de melhorar o nível de aptidão física 32.
Diferentes estudos têm utilizado diversas modalidades de exercícios em
animais, tais como: natação, exercício acrobático, exercício voluntário, corrida
forçada em esteira, ambiente enriquecido, entre outros 33.
Estudos que utilizam animais idosos vêm mostrando os benefícios do
exercício físico, tais como as respostas dos animais idosos expostos a um
ambiente enriquecido, comprovando que estes são capazes de manter sua
plasticidade cerebral, assim como, reduzir déficits comportamentais e celulares
associados ao processo normal do envelhecimento 15, 34, 35. A seguir, estão
alguns desses modelos de exercício explicados mais detalhadamente.
1.2.1. Ambiente Enriquecido
No ambiente enriquecido, os animais permanecem numa gaiola que
contém uma variedade de objetos, incluindo brinquedos, túneis, rodas gigantes
para correr, que podem ser substituídos ou reposicionados todos os dias, além
do convívio com outros animais no mesmo ambiente 28, 33. Pelo fato do
ambiente enriquecido oferecer uma série de informações sensório-motoras ao
10
animal, as quais contribuem para o desempenho cognitivo, torna difícil afirmar
o principal fator desse ambiente que leva a essas alterações. Mas acredita-se
que existam múltiplos fatores dentro do ambiente que são responsáveis por
essas mudanças plásticas 36.
O estudo de Leggio e colaboradores37 revelaram que ratos neonatos
expostos ao ambiente enriquecido, demonstraram aumento da densidade de
espinhos em neurônios parietais, sugerindo um maior número de contatos com
outros neurônios e podendo estar relacionado com melhora no desempenho
espacial desses animais37. E ainda, outros estudos revelaram que o ambiente
enriquecido foi capaz de induzir a potenciação de longo prazo (LTP), a
neurogênese e níveis aumentados de neurotrofina e sinaptofisina, entre outros
no hipocampo 38, 39.
Estudos morfológicos indicam que regiões do córtex cerebral se
mostraram mais densas e grossas em ratos expostos a esse tipo de estímulo,
sugerindo a presença de neurogênese de forma acentuada a ponto de exceder
a morte celular por apoptose, ou ainda, que as células aumentaram o contato
com outros neurônios 28. O cerebelo de ratos idosos (24-26 meses de idade)
expostos ao ambiente enriquecido mostraram áreas de arborização dendrítica
mais extensas quando comparado ao controle, e um outro estudo relatou haver
proliferação de novas células no giro denteado de ratos idosos após 4-5
semanas de exposição 31, 40.
1.2.2. Exercício Acrobático
Kleim e colaboradores41 utilizaram o treinamento acrobático como
modelo de exercício para induzir aprendizado motor em animais ao invés de
outros modelos de exercício repetitivo e rítmicos. Este treinamento acrobático
consiste em passar várias vezes por um mesmo percurso composto por vários
obstáculos com diferente tamanhos e graus de dificuldade, estimulando a
resolução de problemas, coordenação e equilíbrio. Segundo Kleim e
colaboradores41 , este tipo de treinamento, ao contrário do exercício em esteira
e exercício voluntário induz um aumento de sinapses em regiões do córtex
11
cerebelar 41. Além disso, o animal precisa iniciar o movimento voluntariamente
para que haja um planejamento motor antes de passar pelos obstáculos 42.
Recentemente um estudo envolvendo exercício acrobático por quatro
semanas de treinamento com ratos adultos jovens revelou aumentos em
proteínas do citoesqueleto (MAP2 e neurofilamentos) e sinápticas (sinapsina I e
sinaptofisina), em regiões do córtex motor e estriado 42. Segundo Churchill e
colaboradores28, o aspecto da atividade acrobática está relacionado à
aquisição de novas habilidades, capaz de induzir modificação sináptica,
podendo ocorrer o fenômeno de sinaptogênese em todo o cérebro 28. No
entanto, aprender novas habilidades não é uma característica exclusiva de
adultos jovens.
É o que mostrou Barnes e colaboradores43, ao relatarem que animais
idosos podem facilmente aprender novas tarefas e tentar usar outras
estratégias de aprendizado que às vezes não são tão eficientes, mas que
podem ser interpretadas de maneira compensatória43. Desta forma, terapias
comportamentais podem ser usadas para atenuar a deterioração neuronal
relacionada com o envelhecimento28.
Em uma abordagem mais atual, vários estudos sobre os mapas de
representação cortical, tanto sensorial quanto motor tem sido abordado com
frequência. O estudo realizado por Tennant e colaboradores44 com dois grupos
de camundongos, adultos jovens e adultos idosos submetidos a treinamento
que requer aprendizado de novas habilidades com as patas anteriores por um
curto e um longo período de treinamento revelou que o grupo dos adultos
jovens foi capaz de aumentar a área de representação cortical da porção distal
(dedos) das patas anteriores utilizada no movimento após curto período de
treinamento. No entanto, após um longo período de treinamento essas áreas
corticais representantes das partes mais distais das patas retornaram a linha
de base. Já nos camundongos idosos, áreas de representação cortical tanto
das partes proximais com as distais envolvidas com o movimento não se
alteraram após qualquer período de treinamento. Além disso, foi observada
uma diminuição das alterações nas representações de dígitos (dedos) e testes
de desempenho sensório-motor. Apesar disso, os animais idosos foram
12
capazes de aprender a executar a tarefa, assim como, os animais adultos
jovens e a reorganização topográfica no córtex motor variou com a idade44.
No entanto, raros são os estudos que utilizaram a atividade acrobática
para analisar quais seriam as repercussões no comportamento e no encéfalo
de ratos idosos. Em contrapartida, vários estudos têm utilizado o exercício
forçado como modelos de pesquisas.
1.2.3. Exercício em Esteira
O exercício em esteira ou exercício rítmico/cíclico é um método comum
utilizado pelos pesquisadores que analisam as adaptações fisiológicas
promovidas pelo exercício45, 46. O uso frequente deste modelo de exercício se
deve a simplicidade e baixo custo, sendo possível treinar vários animais ao
mesmo tempo, definir a duração e intensidade de treinamento, aumentando
progressivamente esses parâmetros de acordo com o protocolo do estudo32.
Diversos estudos tem relatado que o exercício em esteira é capaz de
promover mudanças no sistema nervoso. Uma pesquisa recente envolvendo
este tipo de atividade durante quatro semanas de treinamento mostrou que o
exercício em esteira é capaz de promover mudanças em proteínas sinápticas e
estruturais no córtex motor, estriado e cerebelo42, outros ainda relatam que
promove neurogênese em regiões do hipocampo de ratos envelhecidos47.
O exercício forçado de intensidade moderada por curto período de
tempo demonstrou mudanças na expressão de receptores ionotrópicos de
glutamato em regiões do cerebelo, estriado, córtex motor e hipocampo de ratos
jovens 48. Entretanto, exercícios rítmicos em ratos idosos não foram capazes de
promover efeitos sobre a memória espacial, talvez devido ao alto nível de
estresse causado pela rotina extenuante do exercício49.
O estudo de Albeck e colaboradores50, utilizaram treinamento em esteira
com ratos idosos de intensidade leve para analisar as alterações das
neurotrofinas no prosencéfalo basal. Os autores relataram que não houve
alterações nos níveis de BDNF do grupo treinado comparado ao controle, mas
13
que houve respostas cognitivas de animais que realizaram exercício em esteira
de intensidade leve durante 7 dias de treinamento 50.
Kim e colaboradores36, relataram que o exercício em esteira induziu
aumento da proliferação celular no giro denteado dos ratos idosos, juntamente
com a melhora na memória espacial de curto prazo36. Outros estudos
demonstraram aumento da neurogênese do hipocampo e consequentemente
nas funções cognitivas, potenciação de longa duração e plasticidade
sináptica51-53.
Em resumo, várias terminologias têm sido utilizadas para descrever
esses diferentes tipos de exercício, e levam em consideração a forma como a
tarefa precisa ser executada, algumas requerem maior atenção, outras como é
o caso do exercício em esteira podem ser realizadas de forma mais
automatizada, gerando padrões de ativação nas diferentes áreas cerebrais
compondo circuitos distintos 54, 55.
1.3. Circuitos funcionais
1.3.1. Aquisição de novas habilidades X Automatizado/rítmico
Lewis e colaboradores56, classificaram diferentes tipos de treinamento
em internamente e externamente guiado, tendo como base o recrutamento de
dois principais circuitos motores. Nas tarefas que são internamente guiadas é
necessário um planejamento do movimento, podendo citar como exemplo as
tarefas que requerem a aquisição de novas habilidades, como é o caso do
exercício acrobático, prevalecendo o circuito núcleos da base-tálamo-cortical 56.
Tarefas como o exercício em esteira que não necessitam de muita
atenção e são ajustadas por estímulos externos, pode ser considerado um
exercício aprendido ou automatizado, sendo classificado como externamente
guiado e envolve predominantemente circuito cerebelo-tálamo-cortical.
Segundo alguns autores, uma tarefa externamente guiada por informações
visual ou auditivo são bastante eficientes no treino da marcha e equilíbrio,
especialmente em pacientes com Parkinson 56-58.
14
1.4. Mecanismos neuroplásticos no envelhecimento
O desempenho de tarefas motoras em idosos tem se mostrado
resultante do recrutamento de muito mais áreas encefálicas comparado ao de
jovens. Atualmente, existem duas teorias para explicar os mecanismos
envolvidos no recrutamento dessas várias áreas encefálicas decorrente do
envelhecimento.
1.4.1. Mecanismo de De-diferenciação
Estudos de caráter cognitivo tem demonstrado que indivíduos idosos
revelam um recrutamento não seletivo de regiões encefálica, tornando a
relação estrutura-função do encéfalo menos precisa podendo refletir um
recrutamento ineficiente de áreas adicionais comparado a adultos jovens59.
Uma possível explicação para essa maior ativação cerebral vista em idosos
pode ser pelo fato destes utilizam estratégias diferentes dos adultos jovens,
ocorrendo uma maior ativação ipisilateral no córtex motor como resultado da
diminuição da inibição inter-hemisférica através do corpo caloso, a chamada
hipótese da de-diferenciação60.
A diminuição dessa inibição resulta em movimentos não intencionais do
membro oposto à realização de uma tarefa, o chamado movimento espelho.
Portanto, idosos que mantêm a capacidade de inibir o córtex motor ipsilateral,
podem realizar uma tarefa de maneira eficiente e refinada, evitando
movimentos indesejados do membro oposto 61, 62.
1.4.2. Mecanismo da Compensação
A compensação ou “over-activation” como é também frequentemente
interpretada, vem sendo descrita por autores que demonstram que isto
acontece no cérebro de indivíduos idosos durante realização de tarefas. Mattay
e colaboradores63, observaram que indivíduos idosos recrutam áreas corticais e
subcorticais adicionais quando comparado com indivíduos adultos jovens para
realização de uma tarefa simples com tempo de reação similar, o contrário
15
também foi visto, ou seja, indivíduos idosos com desempenho prejudicado não
apresentaram áreas de ativação diferente dos adultos jovens63.
Indivíduos idosos mostram uma maior ativação das áreas que são as
mesmas usadas por adultos jovens, são elas: lobo anterior bilateral do
cerebelo, córtex pré-motor, córtex parietal, córtex pré-frontal esquerdo e córtex
cingulado anterior. Porém os idosos recrutam regiões que não são utilizadas
pelos adultos jovens como área pré-motora suplementar e lobo parietal
posterior bilateral64.
Heuninckx e colaboradores65 utilizaram movimentos isolados ou
associados da mão/pé no mesmo sentido e em sentidos opostos para
demonstrar que os idosos ativam áreas envolvidas com cognição além
daquelas associadas com a tarefa proposta, enquanto que os adultos jovens o
fizeram como um processo automatizado65. Essa diferença estratégica que
indivíduos idosos utilizam, está associada com um maior recrutamento da
região pré-frontal, pré-motora e área motora suplementar. Idosos promovem
um maior engajamento neural durante a tarefa motora do que adulto jovem,
com recrutamento de áreas não especifica tanto cognitiva quanto motora que
pode ser explicado pela dificuldade durante a realização da tarefa 66.
1.5. Estruturas Anatômicas
1.5.1 Córtex Motor
Como descrito por Lorente Nó66, o córtex cerebral está organizado em
camadas numeradas de I a VI. Em sua composição consta três tipos celulares,
que incluem as células granulares ou estreladas (interneurônios); células
fusiformes e células piramidais (células eferentes corticais). Nas camadas I a III
encontram-se fibras de associação, na IV as fibras aferentes e na camada V as
fibras eferentes que saem em direção ao tronco encefálico, medula espinal,
núcleos da base entre outras.
Há uma subdivisão das áreas motoras do córtex cerebral, em área
motora primária e área motora secundária. A primeira é responsável por
executar o movimento e as áreas motoras secundárias por planejar esses
16
movimentos, incluindo aqueles padrões de movimento mais complexos67. Vale
ressaltar que existe uma representação somatotópica do córtex motor primário,
representando cada região corpórea, isso está presente em qualquer espécie
de animal, inclusive o rato68, variando o tamanho e localização de cada
estrutura de acordo com a importância das ações motoras e grau de
complexidade.
Os neurônios presentes no córtex motor primário recebem aferências do
córtex somatosensorial primário, córtex parietal posterior, envolvida com
modalidades sensoriais utilizada no planejamento motor, além do cerebelo,
núcleos da base, entre outros. As fibras eferentes originadas das células
piramidais da camada V formam o trato corticoespinal que chega até a medula
ativando grupos musculares que participam da execução do movimento67, 69. As
conexões do córtex cerebral são mediadas por impulsos glutamatérgicos
vindos das vias sensoriais, tornando a informação periférica consciente para
ser interpretada e promover uma resposta motora eficiente.
Com intuito de avaliar sinaptogênese e a reorganização cortical, frente a
diferentes períodos de treinamento (3, 7 e 10 dias) de novas habilidades
motoras, Kleim e colaboradores70 revelaram que animais treinados por 7 e 10
dias tiveram um número significativamente maior de formação de sinapses do
que o grupo que não realizou treinamento. Propondo que a formação de
sinapse e reorganização do mapa motor não estão presentes na fase inicial de
aquisição de habilidades motoras, mas que representa a consolidação dessa
habilidade ocorrendo na fase mais tardia do aprendizado 70.
1.5.2. Estriado
Os gânglios da base consistem em uma variedade de grupos celulares
subcorticais envolvidos principalmente no controle motor, além de outras
inúmeras funções, como aprendizado, funções comportamentais e emocionais.
O termo gânglios da base se refere a núcleos que estão presentes nos
hemisférios cerebrais 71.
Esses núcleos podem ser classificados como: núcleos de entrada,
núcleos de saída e núcleos intrínsecos. Os núcleos de entrada recebem
17
informações de diferentes lugares, mas principalmente de origem cortical,
talâmica e nigral e incluem o núcleo caudado, putâmen e núcleo acumbens. Os
núcleos de saída enviam informações do globo pálido ao tálamo e são eles,
globo pálido interno e substância negra parte reticulada. E por fim, os núcleos
intrínsecos (globo pálido externo e substância negra parte compacta) que
situam-se entre a entrada e retransmissão de informações de saída. As
eferências corticais e talâmicas entram no estriado (núcleos de entrada), sendo
processadas dentro do sistema dos gânglios da base, os núcleos de saída se
projetam ao tálamo que por sua vez projeta de volta ao córtex cerebral71.
Para que haja um funcionamento correto dos gânglios da base se faz
necessária a ação da dopamina nos núcleos de entrada. Ou seja, situações
onde há alteração dessa substância estão frequentemente associadas com
distúrbios do movimento, como a doença de Parkinson, coréia, hemibalismo
entre outros 71.
Olhando mais detalhadamente nas funções estriatais, estudos sugerem
que processos envolvidos durante as fases de aprendizado de novas
habilidades podem ser diferentes. No estriado dorsomedial (homólogo ao
caudado nos primatas), por exemplo, que recebe aferências principalmente da
área motora suplementar e córtex pré-frontal, vem sendo descrito que está
envolvido nas fases iniciais de aprendizado visuomotor ou de habilidades
motoras complexas. Enquanto que, o estriado dorsolateral (homólogo ao
putâmen nos primatas) recebe aferências do córtex sensório-motor e é está
envolvido nas aquisições de comportamento habituais e automatizadas 72.
1.5.3. Cerebelo
O cerebelo se localiza posteriormente ao tronco encefálico e se conecta
com este através de três pares de tratos simétricos: pedúnculo cerebelar
inferior, médio e superior. As funções desempenhadas pelo cerebelo incluem
coordenação motora, controle do equilíbrio e funções autonômicas, além de
articulação verbal e controle dos movimentos oculares. Recentes estudos têm
enfatizado o papel do cerebelo no controle de funções cognitivas 67, 73.
18
O envolvimento do cerebelo nessas inúmeras funções se deve as suas
conexões não apenas com áreas corticais motoras, mas também com regiões
do córtex pré-frontal, córtex parietal posterior, temporal superior e regiões
occipto-temporal, que são áreas de associação envolvidas na organização
visuo-espacial, controle do comportamento, além de funções executivas como
memória de trabalho e atenção 73, 74.
O córtex cerebelar é constituído por três camadas nomeadas de
molecular, células de Purkinje e granular. Na camada molecular (mais externa)
é onde ocorrem inúmeras sinapses, estando presentes os dendritos das células
de Purkinje, dendritos das células de Golgi, as células em cesto e células
estreladas, todas essas células fazem sinapses com as fibras paralelas. Na
camada das células de Purkinje se encontram células com grandes corpos
celulares, e constitui a principal eferência (inibitória) do córtex cerebelar tendo
como mediador o neurotransmissor ácido gamaaminobutírico (GABA) 75. Na
camada granular, podemos encontrar em grande número as células granulares
e seus axônios se dirigem para a camada molecular se ramificando e formando
as fibras paralelas que por sua vez, fazem sinapses excitatórias com as células
de Purkinje67, 76.
É importante dizer que o cerebelo recebe duas principais aferências,
fibras musgosas e trepadeiras. As fibras musgosas levam informações
sensoriais da periferia e as provenientes do córtex cerebral, finalizando o
percurso com sinapses excitatórias nos dendritos das células granulares que
estão na camada granular. Já as fibras trepadeiras enviam informações
somatossensoriais, visuais ou do córtex cerebral, fazendo sinapses com as
células de Purkinje. As células de Purkinje sofrem inibição através dos
interneurônios estrelados, em cesto e de Golgi, sendo que os dois primeiros
têm suas atividades facilitadas pelas fibras paralelas67.
Durante o processo do envelhecimento, todo esse funcionamento
complexo do cerebelo pode sofrer alterações que irão refletir no desempenho
motor e cognitivo do indivíduo idoso. Já foi comprovado em pesquisas, que
adultos jovens ao realizarem tarefas consideradas externamente guiadas, ou
seja, que utilizam estímulos visuais ou auditivos, envolvem o circuito cerebelo-
tálamo-cortical, como descrito anteriormente 58. Porém indivíduos idosos ao
19
realizarem esse tipo de tarefa, apresentam pouco envolvimento desse circuito,
ao passo que, aumentam a conectividade cortical inter-hemisférica 77.
1.6. Marcadores de Plasticidade Sináptica
Estudos têm investigado os efeitos do exercício através de marcadores
de densidade sináptica, como proteínas sinápticas, sinapsina I e sinaptofisina,
além de marcadores do citoesqueleto neuronal, tais como os neurofilamentos
(NF’s) e microtúbulos (MAP2) 6, 42.
As sinapsinas representam uma família de quatro fosfoproteínas, que
estão presentes nos neurônios, e desempenham múltiplos papeis na
transmissão sináptica e plasticidade. Essas proteínas estão associadas a
vesículas sinápticas nos terminais nervosos do sistema nervoso central e
periférico. A sinapsina I é a mais abundante delas em neurônios maduros, e em
consequência da entrada de Ca+ na célula através de canais de Ca+ voltagem-
dependente, as vesículas se fundem com a membrana plasmática liberando
neurotransmissores na fenda sináptica 78-80.
A sinaptofisina é uma glicoproteína que está presente nos terminais pré-
sinápticos e é responsável pela biogênese e por ancorar as vesículas
sinápticas ao terminal nervoso assim como recuperar essas vesículas por
endocitose, possibilitando uma neurotransmissão rápida e eficiente. O aumento
da sinaptofisina significa aumento de vesículas nos terminais já existentes ou
formação de novos terminais nervosos, podendo ser consideradas como
marcador de densidade sináptica, sabendo que a densidade sináptica é um
importante preditor da estrutua e função do cérebro 81-83.
Os neurofilamentos compõem o citoesqueleto neuronal, estando
presentes principalmente nos axônios de células neuronais sendo os
responsáveis pela estabilidade do citoesqueleto axonal. Estes são compostos
por três tipos de proteínas: NF-L ou NF68, NF-M ou NF160 e NF-H ou NF200
(polipeptídeos com massas moleculares baixa, média e alta, respectivamente),
que irão formar heteropolímeros, onde o NF68 precisa co-polimerizar com pelo
menos uma das outras proteínas de maior massa molecular 84, 85.
20
A síntese desses neurofilamentos tem um papel importante no controle
do calibre axonal das fibras nervosas mielinizadas, lembrando que o tamanho
do calibre axonal implica na velocidade de condução nervosa. Além disso,
essas proteínas contribuem na diferenciação, crescimento, regeneração e
orientação axonal 86.
Os microtúbulos e proteínas associadas (MAPs) desempenham um
papel no desenvolvimento de axônios e dendritos. A MAP2 está mais
especificamente nos dendritos e apresentam funções de nucleação e
estabilização dos microtúbulos e transporte de organelas dentro de axônios e
dentritos. Em suma, as MAPs participam do processo de crescimento e
arborização dendrítica, manutenção e produção de sinaptogênese 87, 88.
2. JUSTIFICATIVA
O envelhecimento causa alterações estruturais e funcionais do sistema
nervoso induzindo a um declínio na coordenação motora, equilíbrio e
lentificação de movimentos, que são atenuados pelo exercício físico.
Entretanto, até o momento não está claro quais são as respostas plásticas
induzidas por exercício rítmico e por exercícios que requerem uma atividade
motora complexa em animais idosos.
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
Analisar respostas plásticas do sistema nervoso de animais idosos frente
a dois tipos de atividade física, exercício em esteira e exercício acrobático.
3.2. Objetivo Específico
- Analisar a expressão de proteínas estruturais do citoesqueleto (MAP2 e
neurofilamentos) e proteínas sinápticas (sinapsina I e sinaptofisina) de animais
idosos submetidos a diferentes treinamentos, exercício em esteira e exercício
acrobático e compará-los ao controle.
21
- Analisar as respostas plásticas nas áreas envolvidas com controle
motor: córtex motor, estriado e cerebelo.
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Animais
Foram utilizados nesse estudo 39 ratos idosos jovens machos da
linhagem Wistar com 18 meses de idade fornecidos pelo Biotério Central do
Instituto de Ciências Biomédicas da USP. O trabalho foi aprovado pelo CEUA
do ICB/USP (processo n° 186/2011).
Os animais foram mantidos numa sala com ciclo invertido artificialmente
claro/escuro (12/12h), com alimentação e água ad libitum e numa temperatura
constante de 22ºC. Os mesmos foram colocados nesta sala cerca de quinze
dias antes do início do treinamento para adaptação ao ciclo invertido 89, 90.
4.2. Desenho do estudo
O estudo é do tipo experimental longitudinal. Os ratos foram inicialmente
submetidos à adaptação ao exercício na esteira por 10 minutos durante dois
dias na semana, iniciando com uma velocidade de 0,2 km/h, nos primeiros dois
minutos, 0,3km/h nos 3 minutos seguintes e 0,4km/h nos últimos 5 minutos, a
fim de selecionarmos os animais corredores, que então foram divididos
aleatoriamente entre os grupos exercício em esteira (EE, n=13), exercício
acrobático (AC, n=15) e grupo sedentário (SED, n=11) (controle). Os animais
do grupo controle também foram mantidos na sala com ciclo invertido, onde
aconteciam os treinamentos.
22
4.3. Protocolo de Exercício em Esteira (EE)
Os animais deste grupo foram treinados em uma esteira ergométrica
programável (KT 3000 – IMBRAMED) adaptada para ratos. A esteira é
constituída de 8 raias de acrílico transparente pintadas de preto em sua parte
anterior atraindo os animais para essa região da esteira, evitando o uso de
choque elétrico.
O treinamento de corrida na esteira de intensidade leve foi realizado três
vezes por semana durante quatro semanas consecutivas, começando numa
velocidade de 0,3km/h no primeiro minuto, incrementando a velocidade para
0,4km/h no segundo minuto, e a partir disso 0,5km/h nos 38 minutos restantes
com 0º de inclinação. Sendo realizado no período ativo do animal 89. O uso
desta intensidade no exercício foi baseado em Albeck e colaboradores (2006)
que demonstrou que esta intensidade foi capaz de induzir respostas no
encéfalo de ratos idosos 50.
Figura 1: Esteira Ergométrica adaptada para ratos (Garcia et al., 2012)
4.4. Protocolo de Exercício Acrobático (AC)
O treinamento acrobático consistiu em atravessar um circuito constituído
por 6 obstáculos, começando com gangorra, seguido das barreiras, depois as
escada de cordas, trave de madeira roliça, pontes de madeira e por fim, uma
ponte de corda (Figura 2). O circuito foi baseado no utilizado por Kleim e
23
colaboradores, colocados a 1,50m do chão. Os ratos realizaram um período de
adaptação no circuito, passando duas vezes por dia durante dois dias em uma
semana. Feito isso, iniciou-se o treinamento e os ratos passavam cinco vezes
consecutivas pelo circuito a cada dia de treinamento, três vezes por semana
durante quatro semanas. A cada passagem pelo circuito foi registrado o tempo
e quando um animal terminava de treinar foi passado álcool 5% com a
finalidade de remover o odor deixado por ele, o que poderia estressar o
próximo animal que fosse treinar.
Figura 2: Circuito acrobático (Garcia et al., 2012)
É sabido que a intensidade dos dois tipos de exercício não é a mesma,
mas o que levamos em conta foi a escolha de tipos de exercícios com
exigências motoras distintas e capaz de produzir alterações de origem
neurofuncional já relatadas pela literatura.
4.5. Protocolo de Imuno-histoquímica
No último dia de treinamento, em média 45 minutos após terem treinado,
os animais dos 3 grupos foram anestesiados com quetamina (0,15ml/100g) e
xilazina (0,1ml/100g) por via intramuscular e submetidos à perfusão
transcardíaca, com solução salina 0,9%, seguida de solução fixadora
constituída de paraformaldeído 2% dissolvido em tampão fosfato 0,1 M (PB, pH
7,4). Após a perfusão, os encéfalos foram coletados e armazenados em
24
paraformaldeído 2%, durante 4 horas. Após este período, o material foi
transferido para uma solução crioprotetora de sacarose a 30% em PB. Após 36
horas de crioproteção, os tecidos foram cortados em uma espessura de 30 µm
em um micrótomo deslizante de congelamento (CM3050, Leica).
Os cortes histológicos foram colocados em placa de cultivo, em solução
anti-freezer, e mantidos a -20ºC até o momento do procedimento de imuno-
histoquímica. Os cortes contendo as seguintes áreas: córtex motor, estriado e
cerebelo foram selecionados e submetidos à metodologia de imuno-
histoquímica com anticorpos específicos para detecção de sinapsina I
(anticorpo policlonal de coelho dirigido contra proteína SYS – Chemicon,
Temecula, CA, EUA), sinaptofisina (anticorpo policlonal de coelho contra
proteína SYP – DakoCytomation, Glostrup, Dinamarca), MAP2 (anticorpo
monoclonal de camundongo dirigido contra a proteína MAP2 – Chemicon,
Temecula, CA, EUA) e neurofilamentos (NFs) (anticorpo monoclonal de
camundongo dirigido contra NFs – Zymed Labarotories, San Francisco, CA,
EUA). Como o anticorpo dirigido contra NF reconhece região homóloga dos
três neurofilamentos (NF68, NF160 e NF200), não foi possível diferencia-los
com o método de imuno-histoquímica, apenas quando analisados pelo
“immunoblotting”.
No processamento de imuno-histoquímica os cortes selecionados foram
lavados em tampão fosfato (PB 0,1M) por três vezes de 10 minutos, e depois
incubados com anticorpos primários específicos para os anticorpos citados
acima, em diferentes concentrações (1:250-1:1000), em PB com 0,3% de Triton
X-100 por um período de 14 a 18 horas à temperatura ambiente (24ºC).
Na sequência, os cortes foram novamente lavados em PB 0,1M à
temperatura ambiente e incubados por duas horas com anticorpo secundário
biotinilado anti-coelho feito em cabra para anti-SYS, anti-coelho feito em
jumento para anti-SYP, anti-camundongo feito em cabra para anti-NF e anti-
camundongo feito em burro para anti-MAP2 na concentração de 1:200 com PB
com 0,3% de Triton X-100 por duas horas à temperatura ambiente. Após nova
série de lavagens à temperatura ambiente, os cortes foram colocados por duas
horas numa solução, contendo o complexo avidina-biotina-peroxidase (ABC
ELITE kit, Vector Labs.). Após uma série de lavagens, os cortes foram imersos
25
num meio contendo 3-3’diaminobenzidina (DAB- Sigma-Aldrich) 0,05% em
tampão fosfato 0,1M por cerca de 5 minutos. Foram acrescentados a seguir 3
ml de solução de H2O2 a 0,3% em água destilada, mantendo os cortes neste
banho até que a reação fosse evidenciada. Atingida a imunorreatividade
desejada com o desenvolvimento de coloração marrom clara, os cortes foram
removidos da solução com DAB e imersas em tampão PB 0,1M. Depois de
nova série de lavagens em tampão fosfato 0,1M com o objetivo de remoção do
excesso de reagente, os cortes foram colocados sobre lâminas de vidro
gelatinizadas e colocadas em placa quente. Posteriormente, foram hidratadas
em água destilada por 1 minuto, banhadas em solução de tetróxido de ósmio
0,1% por 15 – 30 segundos com intuito de realçar a coloração dos cortes,
desidratadas por uma série de álcoois em concentrações crescentes, banhadas
com Hemo-De (Fisher) e cobertas com lamínulas, tendo como meio de
montagem o Permount (Sigma). A imunorreatividade foi analisada ao
microscópio óptico (E1000,Nikon) acoplado a câmera digital e programa Nikon
Imaging Software ACT-U e as quantificações foram realizadas com o programa
Image J (National Institutes of Health/USA - NIH).
A análise da densidade integrada foi realizada com 4 animais de cada
grupo. Em cada animal foi analisado 5 cortes de cada área estudada, onde
foram coletados vários campos. No córtex motor foram capturados 8 campos
em cada corte, 12 campos no estriado (sendo 8 na região dorsomedial e 4 na
região dorsolateral) e 4 campos no cerebelo (2 na camada molecular e 2 na
camada granular). No córtex motor a região analisada foi M1 e M2 na camada
V e suas imediações 91. No estriado as regiões dorsomedial e dorsolateral
foram analisadas 91. E no cerebelo, a região paramediana, mais
especificamente as camadas molecular e granular 91. No programa Image J
preconizamos áreas em forma de quadrado para demarcar no corte o que iria
ser quantificado, e para cada estrutura foi utilizado uma determinada área. No
córtex utilizamos um quadrado com área de 150µm², realizando 3 medidas de
analise no mesmo campo com este quadrado, os valores foram transferidos
para o programa Excel onde era feita a média dessas 4 medidas. No estriado a
área do quadrado foi de 50µm², sendo realizadas 5 medidas de analise em
regiões diferentes do mesmo corte, e no final feita a média dos valores no
26
programa Excel. E por fim, no cerebelo a área utilizada foi de 125x50µm²
fazendo duas analises de medida na camada molecular e duas na camada
granular e no final feita a média de cada camada.
4.6. Protocolo de “Immunoblotting”
Os animais dos três grupos foram decapitados e as áreas do encéfalo a
serem estudadas foram rapidamente coletadas, congeladas em nitrogênio
líquido e armazenadas no freezer a -80ºC até o uso. As amostras foram
homogeneizadas a 4ºC em tampão de extração (Tris pH 7,4 100mM, EDTA
10mM, PMSF 2nM e aprotinina 0,01mg/ml). Em seguida, foram centrifugados
por 20 minutos a 12.000 rpm em uma centrifuga refrigerada a 4ºC. O
sobrenadante foi separado do “pellet”, sendo utilizada uma pequena amostra
para determinação do conteúdo proteico, e o resto da amostra tratado com
tampão Laemmli contendo DTT 100mM (Laemmi, 1970), fervido em banho-
maria por 5 minutos e armazenado
O conteúdo protéico do material isolado dos diferentes grupos de
animais foi dosado pelo método de Bradford (Amresco, U.S.A) (Bradford,
1976). Quantidades equivalentes a 100 microgramas de proteínas das
amostras previamente armazenadas no Laemmli foram submetidas a
separação por eletroforese com corrente constante de 25mA em géis de
acrilamida de 6,5% e 8% contendo dodecil sulfato de sódio SDS (Bio-rad,
EUA), para as proteínas MAP2 e NF’s, sinapsina I e sinaptofisina,
respectivamente. Após a separação eletroforética, as proteínas foram
transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Millipore, 0,2um de
diâmetro) de acordo com a técnica descrita por Towbin et al. (1979). Os
antígenos presentes na membrana de nitrocelulose foram submetidos à
caracterização imunoenzimática. Após bloqueio com leite desnatado (Molico)
5% em tampão Tris-Salina (Tris 10mM e NaCl 0,15M, pH 7,5), por 2 horas, com
intuito de evitar ligações proteicas indesejadas, as membranas foram
incubadas com os mesmos anticorpos utilizados na imuno-histoquímica por 18
horas a 4ºC, porém em concentrações mais baixas (1:2000), além do anticorpo
27
contra β-actina (Sigma, St. Louis, MO, EUA), estando na concentração de
1:10.000. Em seguida, as membranas foram lavadas com Tris-Salina e
incubadas por 2 horas com um anticorpo secundário marcado com peroxidase
(Amersham Biosciences) diluído em concentração de 1:10.000 em solução
bloqueadora. O excesso de conjugado foi removido com mais um ciclo de
lavagens de solução basal e as membranas foram reveladas utilizando o Kit
ECL (Amersham Biosciences) de quimioluminescência. Depois de ter revelado,
as membranas foram então incubadas com solução de “stripping” por 10
minutos à temperatura ambiente, a fim de remover o anticorpo que havia sido
revelado e a partir disso, incubar com outro anticorpo. Os filmes contendo as
bandas foram escaneados e analisados quanto à densidade óptica da
imunorreatividade utilizando o programa Image J (National Institutes of
Health/USA). A partir do resultado da quantificação, foi feita uma razão entre a
densidade óptica das proteínas estruturais (MAP2 e NFs) e das proteínas
sinápticas (sinapsina I e sinaptofisina) com a β-actina, pois esta não se altera
nessas condições experimentais, funcionando portanto como um controle de
pipetagem. Esses dados foram submetidos às análises estatísticas. Os dados
representados nos gráficos foram normalizados pelo grupo controle
(sedentário) que assumimos valor 1, ou seja, 100%.
4.7. Análise Estatística
Os dados obtidos de densidade óptica relativa e níveis relativos de
proteína foram submetidos à análise estatística utilizando o software GraphPad
Prism5. Sendo utilizado o teste de ANOVA para medidas repetidas e
comparação entre os grupos, seguida do pós-teste de Tukey quando a análise
de variância apresentou diferença estatisticamente significante. Os dados estão
apresentados pela média e erro padrão. Para todos os testes, o nível de
significância estatística adotado foi de p<0,05.
28
5. RESULTADOS
5.1. Desempenho Motor
O desempenho motor dos ratos idosos submetidos a quatro semanas de
treinamento acrobático está demonstrado pelo tempo gasto para executar as
cinco passagens por todo o circuito (Figura 3).
O treinamento acrobático realizado durante um mês revelou que o tempo
gasto na primeira e quarta semanas (98,33±2,96; 102,59±4,45;
respectivamente) foi estatisticamente menor comparado aos da segunda e
terceira semanas (117,92±4,14; 113,03±3,85; respectivamente). Comparando a
primeira semana com as três semanas seguintes, podemos observar que
houve um aumento no tempo gasto para realização das tarefas em relação a
segunda (p<0,01) e terceira semanas (p<0,05). Na quarta semana de
treinamento houve uma diminuição significativa do tempo comparado com a
média de tempo gasto na segunda semana, mas semelhante ao da primeira
semana.
Figura 3. O gráfico demonstra o desempenho motor dos ratos ao longo de quatro semanas de
treinamento do grupo acrobático avaliado pela média do tempo gasto para executar o circuito.
*p<0,05; **p<0,01
29
5.2. Expressão das Proteínas
A expressão das proteínas estruturais e sinápticas avaliadas por
diferentes métodos revelaram que nem todos os dados de “immunoblotting”
foram semelhantes aos revelados pela técnica de imuno-histoquímica (Tabela
1). Essas diferenças são aceitáveis, pois a técnica de “immunoblotting” analisa
o conteúdo proteico de toda a estrutura removida do encéfalo, enquanto a
técnica de imuno-histoquímica permite analisar regiões imunorreativas
especifica do córtex, estriado e cerebelo.
5.2.1. Córtex Motor
As proteínas estruturais MAP2 e neurofilamentos mostraram um padrão
citoplasmático de imunorreatividade em todos os grupos estudados (Figuras 4
e 5). A proteína MAP2 se apresenta expressa ao longo das neurópilas de forma
difusa por toda a camada V do córtex motor primário e secundário do encéfalo
dos animais idosos (Figura 4). Os grupos AC e EE induziram um aumento
significativo da densidade óptica relativa de MAP2 comparado ao grupo
controle (35%, p<0,05 e 56%, p<0,001, respectivamente). Os dados de
“immunoblotting” mostraram aumento de 83% do nível proteico de MAP2 no
grupo AC comparado aos grupos controle e EE (p<0,001) (Figura 4).
Os neurofilamentos (NFs) foram expressos em processos e corpos
celulares em toda a extensão da camada V do córtex motor (Figura 5), sendo
observado um aumento significativo da densidade óptica relativa dessa
proteína no grupo AC comparado ao grupo controle (151%, p<0,001) e grupo
EE (106%, p<0,001). Os dados de “immunoblotting” revelaram que tanto o
grupo AC quanto o grupo EE induziram aumento significativo dos níveis
proteicos de NF68 comparado ao controle (96%, p<0,01 e 243%, p<0,001,
respectivamente). No entanto, os demais subtipos de NFs (NFs 160 e 200)
não sofreram mudanças significativas nos seus níveis proteicos frente aos
treinamentos acrobáticos e em esteira (Figura 5).
30
31
Figura 4. Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína MAP2 no
córtex motor (M1 e M2). A: Imagens digitais de cortes frontais de encéfalo de rato idoso
ilustrando a expressão de MAP2 no córtex motor. B: Análise semi-quantitativa da densidade
integrada de MAP2 pela técnica de imuno-histoquímica. C: Razão da densidade óptica da
expressão de MAP2 analisada pela técnica de “immunoblotting”. SED: sedentário; AC: grupo
acrobático EE: grupo treinado em esteira. *p<0,05; ***p<0,001.
32
Figura 5. Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína NF no córtex
motor (M1 e M2). A: Imagens digitais de cortes frontais de encéfalo de rato idoso ilustrando a
expressão de NF no córtex motor. B: Análise semi-quantitativa da densidade integrada de NF
pela técnica de imuno-histoquímica. C: Razão da densidade óptica da expressão de NF
analisada pela técnica de “immunoblotting”. SED: sedentário; AC: grupo acrobático EE: grupo
treinado em esteira. **p<0,01; ***p<0,001.
33
A sinaptofisina (SYP) e sinapsina (SYS) são expressas de forma difusa
por toda extensão da camada V do córtex motor primário e secundário
revelando uma marcação citoplasmática nos corpos celulares (Figuras 6 e 7). A
análise da densidade óptica relativa de SYP nessa região revelou que o grupo
AC induziu diminuição significativa (44%, p<0,001) comparada ao grupo
controle (Figura 6). Já os dados de “immunoblotting” revelaram que os dois
tipos de treinamentos não foram capaz de induzir mudanças significativas na
expressão de SYP em relação ao controle, apesar do gráfico seguir na mesma
direção dos dados de imuno-histoquímica, houve aumento significativo apenas
do grupo EE em relação ao grupo AC (38%, p<0,05) (Figura 6).
A densidade óptica relativa de SYS revelou um aumento significativo
induzido tanto pelo treinamento acrobático (65%, p<0,001) quanto pelo
treinamento em esteira (72%, p<0,001) comparado ao controle, corroborando
com os dados de “immunoblotting” onde o grupo AC induziu um aumento
significativo dos níveis dessa proteína comparado ao controle (30% p<0,05) e
grupo EE (Figura 7).
5.2.2. Estriado
A imunorreatividade contra a proteína MAP2 esta presente ao longo da
neurópila de forma difusa por toda região rostro-caudal e médio-lateral do
estriado dos animais idosos (Figura 8). A análise da densidade óptica relativa
revelou que o exercício AC induziu diminuição significativa na região
dorsomedial e dorsolateral da proteína MAP2 em relação ao controle (44%,
p<0,05 e 58%, p<0,001, respectivamente) e ao EE (67%, p<0,01 e 39%,
p<0,01, respectivamente). Já os dados de “immunoblotting” mostraram que o
exercício em esteira induziu diminuição significativa dos níveis proteicos de
MAP2 comparado ao controle e ao grupo AC (35%, p<0,01) (Figura 8).
A proteína neurofilamento apresenta uma marcação de forma puntiforme
e aglomerada em todo o estriado, onde possivelmente passam feixes nervosos
(Figura 9). A análise da expressão de neurofilamento (NF) revelou um aumento
34
Figura 6. Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína SYP no córtex
motor (M1 e M2). A: Imagens digitais de cortes frontais de encéfalo de rato idoso ilustrando a
expressão de SYP no córtex motor. B: Análise semi-quantitativa da densidade integrada de
SYP pela técnica de imuno-histoquímica. C: Razão da densidade óptica da expressão de NF
analisada pela técnica de “immunoblotting”. SED: sedentário; AC: grupo acrobático EE: grupo
treinado em esteira ***p<0,001; *p<0,05.
35
Figura 7. Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína SYS no córtex
motor (M1 e M2). A: Imagens digitais de cortes frontais de encéfalo de rato idoso ilustrando a
expressão de SYS no córtex motor. B: Análise semi-quantitativa da densidade integrada de
SYS pela técnica de imuno-histoquímica. C: Razão da densidade óptica da expressão de NF
analisada pela técnica de “immunoblotting”. SED: sedentário; AC: grupo acrobático EE: grupo
treinado em esteira *p<0,05; **p<0,01;***p<0,001.
36
Figura 8. Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína MAP2 no
estriado (dorsomedial e dorsolateral). A: Imagens digitais de cortes frontais de encéfalo de rato
idoso ilustrando a expressão de MAP2 no estriado. B: Análise semi-quantitativa da densidade
integrada de MAP2 pela técnica de imuno-histoquímica. C: Razão da densidade óptica da
expressão de MAP2 analisada pela técnica de “immunoblotting”. SED: sedentário; AC: grupo
acrobático EE: grupo treinado em esteira. *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001.
37
significativo da densidade óptica relativa na região dorsomedial e dorsolateral
induzido pelo exercício acrobático em relação ao controle (128%, p<0,001 e
44%, p<0,01, respectivamente). Aumento da expressão de NF na região
dorsomedial foi observado no grupo exercício em esteira comparado ao
controle (49% p<0,001). Entretanto, com a técnica de “immunoblotting” não
foram observadas mudanças significativas (Figura 9).
No estriado SYP e SYS mostram um padrão de marcação puntiforme, de
maneira arredondada e difusa em toda região (Figuras 10 e 11). O treinamento
acrobático e o exercício em esteira induziram um aumento significativo na
densidade óptica relativa de SYP tanto na região dorsomedial (55% p<0,001 e
64% p<0,001, respectivamente) como na região dorsolateral (78% p<0,01 e
47% p<0,05, respectivamente) (Figura 10). Os dados de “immunoblotting” não
revelaram alterações significativas nos níveis de expressão de SYP no estriado
nos grupos treinados (Figura 10).
Os dados de expressão da proteína SYS revelados pela técnica de
imuno-histoquímica mostraram que tanto o exercício acrobático como o
exercício em esteira induziram uma diminuição significativa na densidade
óptica relativa tanto na área dorsomedial (32%, p<0,001 e 20%, p<0,001,
respectivamente), quanto na área dorsolateral do estriado (34%, p<0,001 e
23%, p<0,01, respectivamente) (Figura 11). A técnica de “immunoblotting” não
demonstrou mudanças significativas na expressão de SYS frente aos
diferentes treinamentos (Figura 11).
5.2.3. Cerebelo
Nesta estrutura observamos que tanto MAP2 quanto NF apresentam um
padrão citoplasmático de marcação nas células de Purkinje. Imunorreatividade
contra MAP2 foi observada ao longo dos processos axonais da camada
granular e dos dendritos na camada molecular, enquanto que NF foi expresso
nos processos axonais da camada granular e molecular (Figuras 12 e 13).
38
Figura 9. Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína NF no
estriado (dorsomedial e dorsolateral). A: Imagens digitais de cortes frontais de encéfalo de rato
idoso ilustrando a expressão de NF no estriado. B: Análise semi-quantitativa da densidade
integrada de NF pela técnica de imuno-histoquímica. C: Razão da densidade óptica da
expressão de NF analisada pela técnica de “immunoblotting”. SED: sedentário; AC: grupo
acrobático EE: grupo treinado em esteira **p<0,01;***p<0,001.
39
Figura 10. Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína SYP no
estriado (dorsomedial e dorsolateral). A: Imagens digitais de cortes frontais de encéfalo de rato
idoso ilustrando a expressão de SYP no estriado. B: Análise semi-quantitativa da densidade
integrada de SYP pela técnica de imuno-histoquímica. C: Razão da densidade óptica da
expressão de SYP analisada pela técnica de “immunoblotting”. SED: sedentário; AC: grupo
acrobático EE: grupo treinado em esteira *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001.
40
Figura 11. Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína SYS no
estriado (dorsomedial e dorsolateral). A: Imagens digitais de cortes frontais de encéfalo de rato
idoso ilustrando a expressão de SYS no estriado. B: Análise semi-quantitativa da densidade
integrada de SYS pela técnica de imuno-histoquímica. C: Razão da densidade óptica da
expressão de SYS analisada pela técnica de “immunoblotting”. SED: sedentário; AC: grupo
acrobático EE: grupo treinado em esteira **p<0,01; ***p<0,001.
41
Os dados de imuno-histoquímica revelaram que o exercício em esteira
induziu um aumento significativo da densidade óptica relativa de MAP2 na
camada granular do cerebelo em relação ao controle (54%, p<0,001), e na
camada molecular tanto o exercício em esteira quanto o exercício acrobático
promoveram aumento significativo dessa proteína (48%, p<0,05 e 77%,
p<0,001, respectivamente) (Figura 12). Dados de “Immunoblotting” não
revelaram mudanças significativas dessa proteína no cerebelo de ratos
treinados (Figura 12).
O exercício acrobático e o exercício em esteira induziram diminuição
significativa da densidade óptica relativa de NF na camada granular (55%,
p<0,01 e 55%, p<0,01, respectivamente) e molecular do cerebelo (17%, p<0,05
e 17%, p<0,05, respectivamente) comparado ao controle (Figura 13). Os dados
de “immunoblotting” revelaram que o exercício em esteira promoveu diminuição
significativa dos níveis proteicos de NF68 (56%, p<0,05) comparado ao
controle, enquanto o exercício acrobático induziu diminuição significativa da
expressão de NF200 (21%, p<0,05) em relação ao controle, e não houve
alteração significativa no NF160 (Figura 13).
Por toda a extensão do cerebelo, tanto SYP quanto SYS revelam um
padrão puntiforme de imunoreatividade nas células de Purkinje, aglomerados
difusos na camada molecular e esparsos na camada granular (Figura 14 e 15).
Os dados da “imuno-histoquímica” revelaram que tanto o exercício
acrobático como o exercício em esteira induziram diminuição da densidade
óptica relativa de SYP na camada molecular cerebelar comparado ao controle
(85%, p<0,001 e 71%, p<0,001, respectivamente), e não houve alteração
significativa na camada granular (Figura 14). Os dados de “immunoblotting” não
revelaram mudanças significativas.
Os dados da densidade óptica relativa de SYS revelaram que o exercício
acrobático induziu diminuição significativa na camada granular e molecular
comparado ao controle (35%, p<0,05 e 89%, p<0,001, respectivamente) e EE
(55%, p<0,01) (Figura 15). O EE induziu diminuição significativa dessa proteína
na camada molecular em relação ao controle (44%, p<0,001). Esses dados
contrastam com os de “immunoblotting” que revelam que o AC induziu aumento
42
significativo na expressão de SYS em relação ao controle (59%, p<0,05)
(Figura 15).
43
Figura 12. Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína MAP2 no
cerebelo (camada molecular e camada granular). A: Imagens digitais de cortes frontais de
encéfalo de rato idoso ilustrando a expressão de MAP2 no cerebelo. B: Análise semi-
quantitativa da densidade integrada de MAP2 pela técnica de imuno-histoquímica. C: Razão da
densidade óptica da expressão de MAP2 analisada pela técnica de “immunoblotting”. SED:
sedentário; AC: grupo acrobático EE: grupo treinado em esteira *p<0,05; ***p<0,001.
44
Figura 13. Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína NF no
cerebelo (camada molecular e camada granular). A: Imagens digitais de cortes frontais de
encéfalo de rato idoso ilustrando a expressão de NF no cerebelo. B: Análise semi-quantitativa
da densidade integrada de NF pela técnica de imuno-histoquímica. C: Razão da densidade
óptica da expressão de NF analisada pela técnica de “immunoblotting”. SED: sedentário; AC:
grupo acrobático EE: grupo treinado em esteira *p<0,05; **p<0,001
45
Figura 14. Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína SYP no
cerebelo (camada molecular e camada granular). A: Imagens digitais de cortes frontais de
encéfalo de rato idoso ilustrando a expressão de SYP no cerebelo. B: Análise semi-quantitativa
da densidade integrada de SYP pela técnica de imuno-histoquímica. C: Razão da densidade
óptica da expressão de SYP analisada pela técnica de “immunoblotting”. SED: sedentário; AC:
grupo acrobático EE: grupo treinado em esteira **p<0,01;***p<0,001.
46
Figura 15. Efeitos dos diferentes tipos de exercício sobre a expressão da proteína SYS no
cerebelo (camada molecular e camada granular). A: Imagens digitais de cortes frontais de
encéfalo de rato idoso ilustrando a expressão de SYS no cerebelo. B: Análise semi-quantitativa
da densidade integrada de SYS pela técnica de imuno-histoquímica. C: Razão da densidade
óptica da expressão de SYS analisada pela técnica de “immunoblotting”. SED: sedentário; AC:
grupo acrobático EE: grupo treinado em esteira *p<0,05;**p<0,01;***p<0,001.
47
6. DISCUSSÃO
Os nossos dados revelaram que tanto o exercício acrobático como
exercício em esteira promoveram mudanças distintas tanto em relação às
proteínas quanto em relação às estruturas encefálicas estudadas revelando
uma capacidade plástica do sistema nervoso de animais idosos frente a
demandas motoras diferentes.
6.1. Desempenho Motor
O desempenho motor durante 4 semanas de treinamento acrobático
demonstrou uma média de tempo na primeira semana estatisticamente menor
em relação a segunda e a terceira semana de treinamento. Nós podemos
seguramente afirmar que este dado não representa o desempenho motor do
rato idoso na primeira semana, pelo fato da dificuldade de se adaptar ao
circuito, sendo conduzido na maior parte do tempo. Já na segunda semana os
animais apresentaram melhor posicionamento das patas, assim como uma
menor condução por parte do treinador sugerindo uma melhora no
desempenho motor dos ratos idosos na realização das tarefas acrobáticas. Nós
percebemos a partir de então uma redução significativa da curva do
desempenho motor, no entanto, não podemos afirmar que o animal aprendeu a
tarefa proposta, mas que seu desempenho apresentou melhora ao final de 4
semanas.
Trabalhos com ratos jovens mostraram que há uma melhora significativa
do desempenho motor ao final de um treinamento que requer aquisição de
novas habilidades, seja a curto prazo ou a longo prazo de treinamento41, 42, 92.
De um modo geral, os nossos dados demonstraram que os ratos idosos
conseguem aprender a mesma tarefa que ratos adultos jovens, porém o tempo
para aquisição ou até consolidação de uma atividade motora é acrescido em
ratos idosos, ou seja, o período de treinamento desse animais idosos precisa
ser prolongado visto que o processo de aprendizado é mais lentificado.
48
6.2. Córtex Motor
De uma maneira geral, nossos dados do córtex motor demonstraram
que ambos os tipos de exercício promoveram aumento das proteínas
estruturais, MAP2 e NF, comparadas ao controle. E mais, que a expressão
dessas proteínas revelada pelas técnicas de “immunoblotting” e imuno-
histoquímica são complementares.
O exercício acrobático foi capaz de gerar maiores mudanças das
proteínas estruturais comparadas ao exercício em esteira, pelo fato do
exercício acrobático induzir aumento de MAP2 e NF em ambas as técnicas
utilizadas, “immunobloting” e imuno-histoquímica, demonstrando que esse
aumento ocorreu tanto no córtex motor como um todo quanto na camada V
dessa região (localização das células piramidais eferentes).
É sabido que a proteína estrutural MAP2 está presente principalmente
nos dendritos de células neuronais participando do crescimento da arborização
dendrítica, estabelecimento e manutenção da sinaptogênese. A partir disso,
podemos sugerir que esse aumento da proteína MAP2 induzida pelo AC
promoveu um aumento de arborização dendrítica, aumentando área de contato
sináptico e gerando um remodelamento estrutural e sinaptogênese envolvida
com planejamento e execução de movimentos mais complexos. Apesar disso,
o estudo de Tennant e colaboradores44, mostrou que camundongos idosos
submetidos ao treinamento de tarefas de alcance refinadas não revelaram
alterações significativas na representação do mapa cortical comparado aos
animais idosos controle apesar de aprenderem a tarefa proposta e realizarem
tão bem quanto os animais jovens.
Portanto, nossos dados não concordam totalmente com os de Tennant e
colaboradores44 já que o aumento de proteínas do citoesqueleto (MAP2 e NF)
descrito por nós pode indicar um aumento da área cortical envolvida no
controle da atividade acrobática com consequente reorganização topográfica.
Mas vale lembrar que uma das formas do encéfalo do idoso compensar a
capacidade de processamento lentificado da área motora primária é recrutar
áreas corticais adicionais ipsilateral e contralateral permitindo que os idosos
realizem as tarefas como os jovens o fazem93. Desta forma, os nossos dados
de aumento de expressão de MAP2 e NF produzidos pelo treinamento
49
acrobático podem estar mais ligados a maior participação das áreas motoras
primárias e secundárias de ambos hemisférios do que um aumento da
representação cortical das partes corporais envolvidas na atividade motora.
Outra possível explicação para essa diferença é que essas duas tarefas tem
exigências motoras distintas, onde uma requer coordenação e equilíbrio dos
quatro membros e a outra requer uma coordenação mais refinada somente dos
membros anteriores. No entanto, a diminuição do limiar para eliciar os
movimentos presente após longos períodos de treinamento nos animais idosos
revelada por Tennant e colaboradores44 parece concordar com a
sinaptogênese decorrente do crescimento da árvore dendritica e
estabelecimento de novas sinapses por nós observada.
Os animais idosos do grupo exercício em esteira apresentaram aumento
significativo dos níveis proteicos de NF68 no córtex motor e da expressão de
MAP2 somente na camada V desse córtex sugerindo um remodelamento
axonal e sinaptogênese nessa área cortical estudada. Trabalhos recentes do
nosso grupo e de nossos colaboradores6, 42 revelaram uma redução nos níveis
de NFs e manutenção da expressão de MAP2 em encéfalos de ratos adultos
jovens submetidos ao exercício em esteira por um curto e longo períodos de
treinamento, possivelmente decorrente de uma menor ativação cortical
decorrente da habituação por se tratar de um exercício automatizado/rítmico94.
Porém, o mesmo não se aplica aos encéfalos de animais idosos, pois a
elevação dos níveis de NFs e MAP2 no córtex motor sugere que esses animais
necessitam da ativação e recrutamento tanto da área motora primária como da
secundária para realizar tarefas motoras simples e rítmicas.
Essa maior ativação cortical induzida pelo treinamento de ratos idosos
em esteira corrobora com os achados de Huang e colaboradores95, que
demonstraram um aumento da densidade de capilares do córtex motor com
consequentemente aumento do fluxo sanguíneo no cérebro de ratas de meia
idade submetidas ao exercício em esteira.
Já foi descrito pela literatura que neurônios piramidais do neocórtex que
contém processos apicais e basais extensos, sofrem mudanças significativas
com o envelhecimento apresentando uma redução progressiva da arborização
dendrítica e espinhos dendríticos refletindo prejuízos na transmissão sináptica
50
glutamatérgica e na plasticidade sináptica, mesmo em condições não
patológicas17, 96. Além disso, alguns estudos tem demonstrado alterações na
integridade de múltiplos feixes de fibras corticais relacionados ao
envelhecimento, reduzindo tanto a quantidade como a qualidade da substância
branca cortical97, 98. Considerando os nossos achados de crescimento da
árvore dendrítica, estabelecimento de novas sinapses decorrente do aumento
de MAP2 e remodelamento axonal com possível aumento do axônio devido
expressão aumentada de NF no córtex, é possível dizer que a prática de
exercício acrobático pode atenuar tais déficits decorrentes do envelhecimento,
que muitas vezes podem trazer consequências nas funções cognitivas e
motoras.
A expressão das proteínas sinápticas SYS e SYP no córtex motor de
ratos idosos submetidos tanto ao exercício acrobático como ao em esteira
revelaram alterações em relação ao grupo sedentário. Porém, novamente o
exercício acrobático induziu mudanças mais expressivas que o EE.
O AC induziu um aumento dos níveis proteicos de SYS no córtex motor
e redução dos níveis relativos da proteína SYP na camada V dessa mesma
região. Considerando que a SYS está envolvida com a formação de sinapses e
liberação de neurotransmissores, o aumento de SYS no córtex motor de ratos
do grupo AC sugere sinaptogênese com aumento da eficiência sináptica.
Nossos dados corroboram com outros estudos, que utilizaram ratos adultos
jovens para realizar exercício acrobático, e encontraram um aumento de
sinaptogênese na camada V do córtex motor após 12 e 28 dias de
treinamento99, 100. Devido a escassez na literatura de dados envolvendo este
tipo de análise com proteína sinápticas em animais idosos realizando algum
tipo de exercício, ainda não é possível comparar os dados do presente estudo.
Inúmeros estudos com ressonância magnética funcional têm sido
realizados com humanos idosos. Taniwaki e col101 utilizaram tarefas
internamente e externamente guiada, e revelaram que os idosos aumentam a
atividade cortical inter-hemisférica ao realizar o movimento solicitado, como
resultado de uma possível resposta compensatória a fim de atender a demanda
da tarefa solicitada, diferentemente dos indivíduos adultos jovens63. Esses
dados estão de acordo com nossos resultados, visto que as maiores alterações
51
induzidas por ambos os exercícios quando comparado ao controle, foram a
nível cortical, ou seja, os animais idosos recrutaram área motora primária e
secundária, ao realizar o exercício acrobático, necessitando de planejamento e
execução motora quando envolve esta habilidade complexa. Por outro lado, o
exercício em esteira também induziu mudanças no córtex motor, sendo mais
evidente na camada V com aumento da arborização dendrítica e o
favorecimento da sinaptogênese na execução da tarefa.
Em resumo, os nossos dados demonstraram que ambos tipos de
treinamento físico promoveram um remodelamento dendrítico e axonal,
juntamente com sinaptogênese e eficiência sináptica no córtex motor de ratos
idosos. Entretanto, os nossos dados revelam que o AC induziu mudanças mais
robustas gerando um crescimento da árvore dendrítica e do axônio, juntamente
com a sinaptogênes e eficiência sináptica em todo o córtex motor envolvido
tanto no planejamento como na execução dos atos motores e não numa
camada cortical específica.
6.3. Estriado
No estriado tanto o EE quanto o AC induziram mudanças na expressão
das proteínas estruturais e sinápticas quando comparadas ao controle que
foram evidenciadas pela técnica de imuno-histoquímica, portanto, foram
mudanças restritas a determinadas porções do estriado. Por outro lado, quando
analisamos a expressão dessas proteínas estruturais e sinápticas na estrutura
como um todo não observamos mudanças.
Inúmeros estudos de ressonância magnética funcional demonstraram
que indivíduos idosos ao executarem uma tarefa motora, de coordenação
manual por exemplo, deixam de recrutar regiões dos gânglios da base, e
ativam bem mais as regiões do córtex motor101, 102. Taniwaki e col.101, relatam
que a ativação dos gânglios da base durante a realização de uma atividade
motora desempenha um papel importante no tempo e execução desta
atividade, e que indivíduos idosos mostram uma diminuição desta ativação
quando realizaram tarefas consideradas internamente guiadas. Portanto, a não
identificação de mudanças na expressão das proteínas por nós estudadas no
52
estriado como um todo pode ser decorrente da singela ativação desta estrutura
ao realizarem o exercício acrobático, mesmo sendo uma tarefa internamente
guiada como descrito anteriormente.
O exercício acrobático não induziu mudanças significativas nas
proteínas estudadas quando analisados seus níveis relativos das proteínas, as
alterações puderam ser encontradas apenas na técnica de imuno-histoquímica,
fornecendo uma análise de áreas especificas do estriado. Dados da imuno-
histoquímica revelaram uma redução da expressão de MAP2 na região
dorsomedial e dorsolateral comparado ao controle, sugerindo uma diminuição
da árvore dendritica nas células dessas duas áreas dorsais do estriado. Por
outro lado, nós observamos um aumento na expressão de NFs, tanto na região
dorsomedial quanto na região dorsolateral induzido pelo AC comparado ao
controle.
Já no grupo EE, a única mudança encontrada com a análise de
“immuno-blotting” foi a diminuição na expressão de MAP2, levando a uma
diminuição de densidade da arborização dendrítica sugerindo uma poda
dendrítica. E a análise da densidade óptica relativa mostrou que o EE induziu
um aumento da expressão do NF na região dorsomedial. Considerando que a
proteína NF está presente no citoesqueleto dos axônios neuronais podemos
sugerir que tanto o AC quanto o EE induziu um remodelamento axonal com
aumento do seu calibre e provavelmente na velocidade de condução do
impulso nervoso no estriado que pode estar associado a uma pequena mas
crescente melhora no desempenho motor observado na realização das tarefas
acrobáticas ao final da quarta semana de treinamento observado por nós.
Autores já haviam descrito que o envelhecimento está associado com
alterações no gânglios da base, ocasionados pela redução do seu volume e
diminuição da neurotransmissão dopaminérgica103, 104, com consequente
redução de ativação desta área possivelmente desencadeando déficits motores
descritos no processo do envelhecimento normal2, 101. Segundo Marchand e
col.105, mecanismos de compensação podem ser uma resposta para poupar o
recrutamento dos gânglios da base durante uma realização da tarefa motora,
porém esse autores concluíram que quando os indivíduos idosos continuam a
recrutar os glânglios da base ao realizarem uma tarefa motora, ou seja,
53
apresentam os núcleos subcorticais (caudado e putamen) fortemente ligados
ao córtex motor primário (M1) e somatossensorial primário (S1), isto vem
associado a um maior número de erros desses idosos, não sendo considerado
portanto um mecanismo de compensação e segundo os autores está ligado
diretamente com a perda de função motora desses idosos105.
A expressão das proteínas sinápticas no estriado dos grupos AC e EE,
revelado pela técnica de imuno-histoquímica mostraram o mesmo perfil
proteico tanto na região dorsomedial como na dorsolateral. O exercício
acrobático e o exercício em esteira induziram um aumento de SYP e redução
de SYP em ambas áreas dorsais do estriado.
O aumento de SYP resultante dos treinamentos acrobáticos e em esteira
revelam um aumento da formação e recaptação de vesículas sinápticas
sugerindo sinaptogênese. Além disso, esse aumento de SYP pode ser
resultante do aumento da liberação de glutamato que mostra-se relacionado à
fosforilação da SYP, sugerindo a indução do mecanismo de potenciação de
longo prazo (LTP). E por fim, os nossos dados de AC e EE estão de acordo
com estudos que expuseram ratos idosos ao ambiente enriquecido e viram que
foi capaz de induzir formação de sinapses nos gânglios da base106.
Autores tem descrito que durante o envelhecimento ocorre uma
diminuição da neurotransmissão dopaminérgica no estriado, decorrente da
perda neuronal observada na substância negra parte compacta107, juntamente
com uma redução de receptores do tipo D1 e D2 proporcionado um aumento
da oscilação postural antero-posterior em indivíduos idosos108, 109. Já os nossos
dados revelaram que ambos os exercício foram capazes de aumentar os níveis
de SYP, sabidamente conhecida como proteína responsável pela formação e
recuperação das vesículas que liberam os neurotransmissores, nós podemos
sugerir que os diferentes tipos de exercício poderiam ser úteis para atenuar tais
déficits induzidos pelo envelhecimento. Por outro lado, ainda nos falta pouco
mais de conhecimento, assim como a realização de novas pesquisas para
elucidar os motivos de ambos os exercícios terem induzidos uma diminuição da
proteína SYS.
Quando tratamos de aprendizado motor ou aprendizagem de novas
habilidades, vários autores relacionam as diferentes fases envolvidas nesse
54
aprendizado com áreas distintas do estriado110, chamadas de fase inicial ou de
aquisição, e fase tardia, também chamada de fase de consolidação. Em
animais jovens, estudos tem mostrado que a região dorsomedial do estriado
está preferencialmente envolvida com a fase inicial (aquisição) do aprendizado
e a região dorsolateral participa da fase tardia (consolidação) do
aprendizado110. Foi o que mostrou o estudo de Garcia e col.42, ao utilizar o
exercício em esteira e exercício acrobático em animais adultos jovens, e
concluí que os animais que realizaram o AC, atividade que requer aquisição de
habilidades motoras mais complexas, induziram mudanças de proteínas
sinápticas e estruturais, claramente na região dorsomedial. Enquanto que o EE,
que é considerada uma atividade automatizada/rítmica, induziram alterações
na região dorsolateral42.
Os nossos dados de ratos idosos mostram uma perda desta
especificidade regional relacionada as diferentes exigências motoras e a fase
de aprendizagem dessa habilidade motora encontrada em animais jovens, ou
seja, não houve distinção entre estas regiões do estriado, já que ambos os
exercícios produziram alterações das proteínas de maneira concomitante nas
regiões dorsomedial e dorsolateral sugerindo que as mudanças plásticas na
fase de aquisição de habilidades motoras complexas em animais idosos parece
se prolongar adentrando na fase de consolidação, recrutando as duas regiões
do estriado simultaneamente tanto para exercícios rítmicos e automatizados
como para os exercícios envolvendo tarefas motoras complexas. Nossos dados
corroboram com o estudo de Robertson e colaboradores111 que observaram
que indivíduos idosos podem facilmente aprender tarefas como os jovens o
fazem na fase inicial do aprendizado, podendo haver ganhos adicionais nesta
habilidade durante a fase de consolidação.
E mais, esse aumento do recrutamento de áreas adjacentes induzido
pelo AC e EE sugere o envolvimento do mecanismo neural de compensação e
não de de-diferenciação, já que o desempenho motor apresentou uma melhora
ao longo de 4 semanas de treinamento.
55
6.4. Cerebelo
Ambos os exercícios foram capazes de induzir mudanças proteicas
nesta estrutura quando comparados ao controle, porém estas mudanças
sugerem um remodelamento plástico pouco satisfatório.
Os exercícios acrobático e em esteira promoveram uma diminuição do
NF200 e NF68 no cerebelo como um todo quando analisamos com a técnica
de “immunoblotting”, corroborando com os dados de imuno-histoquímica, que
demonstraram uma diminuição de NFs tanto na camada granular como na
camada molecular do córtex cerebelar do lóbulo paramediano, sugerindo uma
diminuição do calibre axonal com prejuízos na velocidade de condução por
esses axônios.
Em contrapartida, esses mesmos tipos de exercícios foram capazes de
gerar um aumento da proteína MAP2 na camada molecular, sugerindo um
aumento da arborização dendrítica das células de Purkinje, células em cesto e
estreladas, com consequente aumento do contato sináptico com as fibras
trepadeiras e paralelas. Estes achados corroboram com o estudo feito por
Heuninckx e colaboradores, que através de neuroimagem funcional puderam
ver que indivíduos idosos ao realizarem movimentos coordenados de mão/pé,
recrutam regiões anterior e posterior do cerebelo, bilateralmente65. Esse
aumento de área sináptica decorrente de uma maior expressão de MAP2 pode
ser um dos substratos estruturais responsáveis por essa maior ativação.
O AC revelou através da técnica de “immunoblotting” um aumento nos
níveis da expressão de SYS em relação ao controle. Já os dados de imuno-
histoquímica revelaram uma diminuição de SYS tanto na camada granular
quanto na molecular e de SYP na camada molecular do córtex cerebelar do
lóbulo paramediano. Portanto, esses nossos dados sugerem que os exercícios
acrobáticos e em esteira promoveram um aumento da arborização dendrítica
na camada molecular do córtex cerebelar mas com prejuízo na eficiência
sináptica, e talvez essa fragilidade de respostas plásticas cerebelares dificultam
mas não impedem o aprendizado de novas habilidades motoras, mas com um
desempenho motor aquém do observado nos animais jovens.
É sabido que o cerebelo está envolvido na execução de habilidades
motoras, que se encontram prejudicados no envelhecimento112. Olhando o
56
cerebelo anatomicamente, as maiores mudanças decorrentes do processo de
senescência incluem uma perda no lobo anterior, região envolvida no controle
motor, de aproximadamente 30% do seu volume associada a perda de 40%
nas células de Purkinje e células granulares12. Considerando essas
informações Taniwaki e colaboradores98 sugerem que o circuito cérebro-
cerebelar se encontram comprometidos em indivíduos idosos ao realizarem
uma tarefa externamente guiada, corroborando com nossos dados que indicam
uma reorganização plástica insuficiente comprometendo o recrutamento desta
região após 4 semanas de treinamento, em ambas as atividades envolvidas.
Vale ressaltar que em ratos idosos exercitados em esteira ao longo da
vida, como demonstrado pelo estudo de Larsen e colaboradores109, revelaram
uma reduzida perda de células de Purkinje e ainda que esses ratos ao final de
um longo período de treinamento, tinham o mesmo número de células de
Purkinje de ratos jovens que não realizaram treinamento113. Esses dados
diferem dos nossos, visto que os nossos ratos quando iniciaram o treinamento
já apresentavam perda neuronal no cerebelo. E mais, que o treinamento
proposto pelos autores acima citado foram realizados a partir do 5º ao 23º mês
de vida do animal, o que revela mais uma vez que o sistema nervoso de ratos
idosos apresentaram respostas plásticas distintas das dos jovens.
Autores já haviam descrito que indivíduos jovens ao realizarem tarefas
consideradas como externamente guiadas envolvem predominantemente o
circuito cérebro-cerebelar77, 94. Foi o que mostrou o estudo de Garcia e
colaboradores ao utilizar ratos jovens para realizar um exercício em esteira
considerado uma tarefa externamente guiada. Os dados desse estudo mostrou
que esta atividade induziu grande ativação do cerebelo, mostrada através do
aumento de sinaptogênese, assim como, de proteínas estruturais. Tudo isso
nos faz pensar que ratos idosos, ao realizarem este tipo de atividade, mostram
um padrão de ativação diferente daqueles encontrados em ratos adultos
jovens, visto que demonstraram uma reorganização plástica distinta decorrente
de um menor recrutamento do cerebelo, porém com uma ativação bem maior
de outras áreas promovendo mecanismo de compensação como vimos no
córtex motor.
57
Entretanto, se considerarmos somente as respostas cerebelares frente
as exigências motoras rítmicas e as motoras complexas reveladas por um
aumento da área de arborização dendrítica para estabelecimento de novas
sinapses mas sem a respectiva eficiência sináptica, leva-nos a pensar na
ocorrência de um mecanismo de di-diferenciação no cerebelo frente a um
treinamento por quatro semanas.
58
7. CONCLUSÕES
- As duas modalidades de atividade física empregadas no estudo foram
capazes de gerar mudanças plásticas distintas no córtex motor, estriado e
cerebelo.
- Independente do tipo de treinamento, acrobático ou em esteira, as
maiores mudanças plásticas ocorreram no córtex motor, decorrente de
aumento das proteínas estruturais MAP2 e NF, e da proteína sináptica SYS. O
estriado respondeu aos diferentes treinamentos com aumento de NF e SYP e
redução da expressão de MAP2 e SYS. Já o cerebelo respondeu somente com
aumento de MAP2 e diminuição de NF, SYS e SYP.
Em resumo, estes dados parecem sugerir que o córtex motor de ratos
idosos apresenta respostas plásticas distintas das outras estruturas estudadas,
independente da atividade motora, sugerindo maior participação do córtex no
controle motor.
59
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ANEXO I