UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICA PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA MOLECULAR

ESTUDOS IN SILICO DA PROTEÍNA AlkB EPROSPECÇÃO DE BACTÉRIAS ALCANOTRÓFICAS EM

SOLOS DA BACIA PETROLÍFERA POTIGUAR

MATHEUS SILVA PEREIRA

NATAL-RN 2007

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA

MOLECULAR

ESTUDOS IN SILICO DA PROTEÍNA AlkB E PROSPECÇÃO DE BACTÉRIAS ALCANOTRÓFICAS EM

SOLOS DA BACIA PETROLÍFERA POTIGUAR

MATHEUS SILVA PEREIRA

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Genética e Biologia Molecular do Centro de Biociências da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre em Genética e Biologia Molecular.

Orientador: Prof. Dr. Carlos Alfredo Galindo Blaha

NATAL-RN 2007

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE BIOCIÊNCIAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA CELULAR E GENÉTICA PROGRANA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA E BIOLOGIA

MOLECULAR

ESTUDOS IN SILICO DA PROTEINA AlkB E PROSPECÇÃO DE BACTÉRIAS ALCANOTRÓFICAS EM

SOLOS DA BACIA PETROLÍFERA POTIGUAR

MATHEUS SILVA PEREIRA

Dissertação apresentada pelo aluno Matheus Silva Pereira ao Curso de Mestrado em Genética do programa de Pós-graduação e Genética e Biologia Molecular do Departamento de Biologia Molecular e Genética, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, foi julgada pelos membros da banca examinadora, na sua redação final, para a conclusão do curso e à obtenção do título de Mestre em Genética.

MEMBROS DA BANCA EXAMINADORA

Prof. Dr. Carlos Alfredo Galindo Blaha DBG/UFRN

Prof. Dra. Valéria Maia de Oliveira CPQAB/UNICAMP

Profa. Dra. Magnólia F. Florêncio de Araújo DMP/UFRN

NATAL-RN 2007

iv

AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus por tudo que me tem dado e sou muito grato por

isso. A Universidade Federal do Rio Grande do Norte pela oportunidade da

realização deste trabalho. Ao Departamento de Biologia Celular e Genética

desta Universidade. Ao Programa de Pós Graduação de Genética e Biologia

Molecular.

Aos laboratórios LBMG, LDIC/DMP por terem cooperado e assim tornar

possível a realização dos experimentos.

Ao programa Capes, por ter cedido a bolsa e ao CT-PETRO/CNPq pelo

financiamento do projeto.

Um agradecimento especial ao grupo CROB, principalmente a Igor,

Carlos, Magda, Leonam, Cataline, Julliane, Carvalho, Moacyr, Bruno e Karol. A

Rodrigo pela grande paciência e amizade, ajudou bastante. E a galera da Pós-

graduação 2005.

A Carlos por ter acreditado e depositado confiança em mim, obrigado

pela paciência e pelo incentivo na minha formação acadêmica. E também como

um amigo que considero.

Aos meus amáveis pais, Antônio (Toinho, “bora chefe”) e Maria de

Lourdes (Malu), que são exemplos da minha vida. obrigado por me terem como

filho, tenho muito orgulho de vocês, pois amo vocês.

Aos meus queridos irmãos Lucas (monstro) e Ariama.

A minha linda e amada esposa Amanda que também é minha amiga,

pelos conselhos, carinhos, beijos e abraços. Te amo!

Ao meu cunhado André e aos meus maravilhosos sogrinhos Amâncio e

Núbia e amável família (Edneide "Neguinha', Zélia, Edna “loooove” e filhos),

obrigado pela compreensão, pois são muito importantes para mim.

Também obrigado muito especial aos meus amigos, por estarem

presentes na minha vida e que sabem da importância que tiveram sobre minha

pessoa nos bons e maus momentos.

A Tobby (cachorro) mesmo não sabendo ler me acompanhava nas

eternas leituras dos artigos nas madrugadas, praticamente saiu mestre

também.

v

LISTA DE FIGURAS

vi

Capítulo 2

vii

LISTA DE TABELAS

viii

LISTA DE ABREVIATURAS

AH – alcano hidroxilase

ARDRA - Análise de restrição de rDNA amplificado

Bdb – Banco de dados

Blast - Ferramenta de procura e alinhamento local de seqüências.

Boe - Barril óleo equivalente

BPP-RN – Bacia Petrolífera Potiguar-RN

ClustalW – Programa de alinhamento de seqüências hospedado em site

ClustalX – Programa de alinhamento para windows

CNTP - Condições normais de temperatura e pressão

CROB - Grupo de pesquisa em Biotecnologia do Petróleo- Cluster for

Research in Oil Biotechnonology

FAME - Análise de ésteres metílicos de ácidos graxos

HMMTP – Programa de hidrofobicidade

M - marcador digerido com PstI.

mDNA - DNA metagenêmico

Nro. – Número

P450 – Citocromo P450

PAGE – Gel de poliacrilamida não desnaturante

PCR-DGGE - Reação em cadeia da polimerase em eletroforese em gel com

gradiente de desnaturação.

PLFA - Análise de ácidos graxos e fosfolipídios

pOCT - Plasmídeo OCT

PREDATOR – Programa de Topologia de análise de estruturas secundárias

ix

rDNA – DNA ribossomal

RISA - Análise de espaçadores intergênicos ribossomais

SARST - Análise serial de etiquetas de seqüências ribossomais

SSCP - Polimorfismo de conformação de fita simples

TOPPRED2 – Programa de hidrofobicidade

T-RFLP - Polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição terminais

x

RESUMO

Alguns microrganismos de ecossistemas virgens são capazes de utilizar

petróleo como fonte de carbono e energia. O conhecimento dessa

biodiversidade microbiana pode revelar vias metabólicas microbianas para

utilizar alcanos que venham a ter importância biotecnológica. Os objetivos do

presente trabalho são: i) realizar estudos in silico da proteína AlkB visando

obter subsídios para a compreensão do mecanismo de seletividade na

utilização de alcanos em bactérias Gram positivas e Gram negativas; ii)

prospectar e avaliar a resposta de comunidades microbianas alcanotróficas de

solos e mangue da BPP–RN e solo da Mata Atlântica na Reserva Horto Dois

Irmãos-PE utilizando o gene alkB como biomarcador molecular, e as técnicas

de PCR e PCR-DGGE.

xi

ABSTRACT

Some microorganisms from virgin ecosystems are able to use petroleum it as

source of carbon and energy. The knowledge of microbial biodiversity can help

to reveal new metabolic systems for utilization alkanes with biotechnological

importance. The aim of this study is: i) Accomplish an in silico study of the AlkB

protein aimed to understand the probable mechanism involved on selectivity of

alkanes in Gram positive and Gram negative bactéria. ii) prospect and analyze

the response of the microbial alkanotrophics communities in soil and mangrove

sediments of BPP–RN and soil of Atlantic forest in the Horto Dois Irmãos

Reserve area/PE using the molecular biomarker, gene alkB; with the PCR and

PCR-DGGE approach.

xii

xiii

1

INTRODUÇÃO GERAL

Atualmente os projetos genomas e diversas pesquisas geram dados

biológicos que estão aumentando exponencialmente a cada ano.

Proporcionalmente, as ferramentas da bioinformática tendem a solucionar

problemas impossíveis de serem abordados nas décadas passadas. Com a

disponibilidade dos Bancos de dados e as ferramentas computacionais é

possível realizar estudos in silico que permitem realizar inferências sobre

processos biológicos com relevância e confiabilidade independente de estudos

laboratoriais. Com esta base, serão realizados estudos in silico visando

identificar possíveis correlações entre propriedades estruturais da proteína

AlkB e a capacidade de utilização de alcanos em bactérias alcanotróficas.

Nosso conhecimento a respeito da diversidade microbiana, bactérias e

fungos, são limitados em parte, principalmente devido à nossa inabilidade em

reproduzir todas as variáveis ambientais dos microrganismos nos diferentes

tipos de ecossistemas. Todos os organismos da biosfera dependem das

atividades microbianas pela sua capacidade no processo de ciclagem de

nutrientes e por, de certa forma, influenciar os ambientes abaixo e acima do

solo. No entanto, diversas atividades antropogênicas como a indústria do

petróleo, podem, potencialmente afetar a biodiversidade microbiana local,

sendo desconhecidas como estas alterações nas comunidades microbianas

podem influenciar os ecossistemas mais profundos e os mais superficiais.

Devido à escassez de informações a respeito dos microrganismos nativos nos

solos de ambientes que não tiveram nenhum tipo de exposição ao petróleo ou

derivados, houve a necessidade da realização de estudos microbiológicos e

moleculares destes microrganismos em diferentes ecossistemas localizados

dentro da Bacia Petrolífera Potiguar - RN, como por exemplo, através de

ensaios de microcosmos com solos de caatinga e de mangue, utilizando a

técnica independente de cultivo PCR-DGGE. Este trabalho é o primeiro estudo

de biodiversidade de bactérias alcanotróficas nativas sob impacto de

contaminação com petróleo em solos continentais e costeiros da Bacia

2

Petrolífera Potiguar (BPP-RN) e Mata Atlântica-PE utilizando o biomarcador

molecular alkB.

CAPÍTULO 1

Utilização de alcanos em bactérias alcanotróficas: Estudos insilico da proteína AlkB

1. INTRODUÇÃO

Os alcanos são compostos químicos que consistem somente dos

elementos carbono e hidrogênio (como por exemplo, os hidrocarbonetos) onde

cada um desses átomos está ligado exclusivamente por ligações simples (por

isso são chamados de compostos saturados). Os alcanos podem ser lineares

(fórmula geral CnH2n+2), cíclicos (fórmula geral CnH2n, n>2) ou ramificados

(fórmula geral CnH2n+2, n>3) (Morrison e Boyde, 1995).

Alcanos lineares (também denominados de n-alcanos assim como

parafinas) são hidrocarbonetos alifáticos saturados, de fórmula geral CnH2n+2.

Estes se apresentam em cadeias lineares ou ramificadas. Os alcanos lineares

são designados, na nomenclatura oficial, através de prefixos, geralmente

gregos, seguidos do sufixo "ano". Eles são menos densos que a água e

praticamente insolúveis na mesma, à medida que o tamanho da cadeia

principal aumenta e seu peso molecular, os seus pontos de fusão e ebulição

aumentam (Masterton et al., 1990). Em CNTP os alcanos de CH4 até C4H10,

são gasosos; do C5H12 até C17H36, são líquidos; e depois de C18H38, se

apresentam no estado sólido. Por conterem ligações simples, os alcanos são

relativamente estáveis, difíceis de quebrar e são apolares (Morrison e Boyde,

1995).

Os alcanos constituem entre 20 e 50% do petróleo, sendo estas

variações dependentes da sua origem. O octano e hexadecano são os alcanos

mais conhecidos. E tais compostos são muitas vezes utilizados como fontes de

carbono pelos microrganismos, uma vez que estes desenvolveram rotas

degradativas na utilização dos compostos alcanos. Os alcanos são

quimicamente inertes, devendo ser ativados antes de serem metabolizados e

na presença de oxigênio isto leva à oxidação dos grupamentos metil terminais,

gerando álcool primário, que logo após são oxidados por desidrogenases até

ácidos graxos que são metabolizados através de -oxidação (Van Hamme et

4

al., 2003).

As monooxigenases que contêm dois átomos de Fe++ e Cu são encontradas

em bactérias metanotróficas como Methylococcus capsulatus (Murrel, 1994).

As Bactérias das classes , ß, e -proteobactéria, como por exemplo,

Acinetobacter, Alcanivorax, Burkholderia, Pseudomonas, e bactérias Gram-

positivas com alto conteúdo de G+C, como por exemplo: Nocardia,

Streptomyces, Bacillus, Rhodococcus possuem uma proteína de membrana

que contém dois átomos de Fe++ (Smits et al., 1999; Van Beilen et al., 2001,

Van Beilen et al., 2003). As leveduras e os fungos possuem citocromo P450

(CYP) de membrana (Ayala e Torres, 2004; Craft et al., 2003; van Beilen e

Funhoff, 2005), que estão envolvidos em degradação de alcanos. A alcano

hidroxilase de P. putida GPo1 e de outras eubactérias têm grande interesse

biocatalítico (Witholt et al., 1990; Van Beilen e Funhoff, 2007) e para aplicações

ambientais (Whyte et al., 2002), e é considerado o protótipo das proteínas non-

heme Ferro oxigenases que incluem as desaturares (proteínas que removem

dois átomos de hidrogênio de um composto orgânico criando uma dupla

ligação entre dois átomos de carbono) e xileno monooxigenases (Shanklin e

Cahoon, 1998).

A enzima AH (alcano hidroxilase) de P. putida GPo1 catalisa a

hidroxilação de compostos alifáticos lineares e ramificados, alicíclicos e aquil-

aromáticos (McKenna e Coon. 1970; Van Beilen et al., 1994), oxidação terminal

de álcoois a aldeídos correspondentes, demetilação de metil-ésteres

ramificados, sulfoxidação de tio-ésteres e epoxidação terminal de olefinas (May

e Abbott, 1972; Katopodis et al., 1984; May e Katopodis, 1986; Katopodis et al.,

1988). Após a primeira descrição de que os genes envolvidos na degradação

de alcanos estavam localizados num plasmídeo em Pseudomonas e a sua

completa descrição dos operons por Eggink et al (1987), o modelo proposto por

Van Beilen et al. (2001) (figura 1), baseado nos estudos de P. putida Gpo1,

também conhecida como Pseudomonas oleovorans, é o melhor modelo

alcanotrófico já proposto.

5

Figura 1. Modelo do sistema alcano hidroxilase descrito por Van Beilen et al. (2001) em Pseudomonas putida Gpo1. São apresentadas as proteínas envolvidas na conversão dos n-alcanos a ácidos graxos.

A P. putida possui um plasmídeo denominado OCT que abriga dois

operons. O primeiro contém os genes alkBFGHJKL que codificam para uma

alcano hidroxilase, duas rubredoxinas, um aldeído desidrogenase, um álcool

desidrogenase, uma Acil-CoA sintetase e uma proteína de membrana externa

de função ainda desconhecida, respectivamente. O segundo operon possui os

genes alkST, codificando uma proteína regulatória da expressão do operon

alkBFGHJKL e uma rubredoxina redutase (Grund et al., 1975). Entre os dois

operons ainda encontra-se o gene alkN o qual codifica para um transdutor

aceptor de grupamentos metil, que pode estar envolvido na quimiotaxia aos n-

alcanos (Smits et al. 1999; Staijen et al., 1998; Van Beilen et al. 1994; 2001).

Recentes pesquisas deram importantes contribuições ao descrever

aminoácidos críticos na proteína AH (Van Beilen et al., 2005) e no citocromo

P450 oxigenase (Funhoff et al., 2006) envolvidos na catálise de alcanos.

Os Citocromos são proteínas, geralmente ligadas a uma membrana, que

contêm grupos heme e que efetuam o transporte de elétrons. São encontradas

sob a forma de proteínas monoméricas (por exemplo, citocromos c) ou como

subunidades de complexos enzimáticos maiores catalisadores de reações

redox. Podem ser encontrados na membrana interior das mitocôndrias e no

retículo endoplasmático de eucariontes, nos cloroplastos de plantas, em

microrganismos fotossintéticos e em bactérias.

6

O citocromo P450 (cuja abreviação é CYP, P450 e menos frequente

CYP450 faz parte da superfamília das hemoproteínas que são encontradas nas

bactérias, Archaea e eucariotos. A reação mais comum catalisada pela

CYP450 é a reação de monooxigenase, que é a inserção de um átomo de

oxigênio em um substrato orgânico (RH) enquanto o outro átomo de oxigênio é

reduzido a água.

RH + O2 + 2H+ + 2e– ROH + H2O

O desconhecimento do mecanismo de discriminação de substrato pela

proteína AlkB ainda persiste atualmente e ainda pode ser estendido para outros

microrganismos que possuem uma AH com diferentes graus de identidade,

porém utilizam substratos específicos ou até mesmo uma grande variedade de

alcanos (C8 a C44). Diversos microrganismos degradadores de alcanos são

detentores do gene alkB, mas o que não se sabe é como uma mesma proteína

(AlkB) que é participante nas etapas iniciais do sistema alcano hidroxilase,

pode se comportar de diversas maneiras em diferentes microrganismos frente

a diferentes substratos.

Utilizando as seqüências de proteínas alcano hidroxilase existentes em

microrganismos degradadores nos bancos de dados e através de uma

abordagem in silico, pretendemos explorar comparativamente utilizando-se das

proteínas AlkB de P. putida GPo1 e a P450 oxigenase da Mycobacterium sp

HXN 1500, as possíveis correlações entre propriedades estruturais da proteína

AlkB e a capacidade de utilização de alcanos em bactérias alcanotróficas.

7

2. OBJETIVOS

Avaliar através de estudos in silico as possíveis correlações entre a

estrutura primária, estrutura secundária, domínios funcionais e topologia

das proteínas AlkB com a capacidade de discriminação de substratos

alcanos em bactérias Gram positivas e Gram negativas.

8

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Construção da base de dados

As seqüências de genes alkB e proteínas AlkB foram obtidas utilizando-

se o pacote BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (NCBI-USA) que

busca similaridades entre uma seqüência alvo (query) e as seqüências dos

bancos de dados e calcula a sua significância estatística. A seqüência do gene

alkB e proteína AlkB da bactéria Pseudomonas putida foram usadas como

seqüências query nas buscas de informações sobre microrganismos

degradadores de n-alcanos, devido ao grande número de informações

disponíveis sobre esta bactéria. Dos grandes bancos de dados (como por

exemplo, o Genbank, UM-BBD, SWISS-PROT) foi obtida uma grande

quantidade de seqüências de genes alkB e de proteínas AlkB com grande

similaridade, porém algumas seqüências foram descartadas, principalmente

aquelas seqüências que se apresentaram incompletas e cujos valores de E-

values maiores do que 1e-20. E com isso foi formada a nossa base de dados,

denominada por Bdbalk.

3.2. Edição das seqüências

Devido a grande quantidade de seqüências e sua dificuldade de

identificação quando analisadas nos programas de bioinformática, como por

exemplo o ClustalW, Predator, Toppred2 e outros. Essas seqüências passaram

por um processo de edição realizada de forma manual. Nesta edição foram

retiradas algumas letras presentes nas principais informações que

identificavam as seqüências depositadas no formato fasta, mas que não

comprometiam a identificação das mesmas. Isso propiciou o manuseio das

seqüências de forma prática e rápida na utilização destas nas diversas

ferramentas de bioinformática.

9

3.3. Análises de domínios conservados e assinaturas protéicas

Foram utilizados diversos bancos de dados especializados em proteínas,

entre eles:

PROSITE – Contém dados de domínios funcionais numa proteína utilizando consensos armazenados no banco de dados.

CDART - Conserved Domain Architecture Retrieval Tool - Detecção de domínios conservados.

CDD - Conserved Domain Database - Detecção de domínios conservados

INTERPRO – é um banco de dados de famílias de proteínas, domínios e sítios funcionais.

PIR - Protein Information Resource - Banco de dados de seqüências de proteínas anotadas funcionalmente.

SWISS-PROT - Banco de dados (Bd) de seqüências de proteínas possui integração com outros Bds.

UM-BBD – University Minnesota Biocatalysis/Biodegradation Database - banco de dados de diversos organismos envolvidos na biodegradação e biocatálise.

3.4. Alinhamentos múltiplos

Para realização dos alinhamentos foram utilizados os programas:

Clustal-W (Higgins e Sharp, 1988) ou Clustal-X, versão para Windows XP

(Thompson, 1997) e depois para melhor visualização foi utilizado o BIOEDIT

(Hall, 1999).

3.5. Análise topológica de proteínas

Foram utilizados os softwares Toppred2 (Claros e Von Heijne,1994) e

HMMTOP (Tusnady e Simon, 2001). Inicialmente foram empregados os dois

softwares para comparação dos resultados gerados, e em virtude da

equivalência dos dados, manuseio fácil e acessibilidade, o programa utilizado

definitivamente foi o Toppred2.

10

3.6. Análise da relação da estrutura primária, secundária e domínios funcionais de proteínas AlkB

Devido ao grande número de seqüências disponibilizadas nos bancos de

dados para as análises in silico da proteína AlkB, foram utilizados os seguintes

critérios: i) A proteína deveria ser completa, ii) não ser uma proteína hipotética

iii) a sua literatura deveria estar disponível.

As seqüências foram inicialmente analisadas pelo programa ClustalW e

os dados visualizados em programa BioEdit (Hall, 1999). Os alinhamentos

múltiplos também foram avaliados com o programa de topologia PREDATOR

(Frishman e Argos, 1996), o qual prediz estruturas secundárias com base nas

seqüências depositadas no programa. Para o alinhamento com o programa

PREDATOR foi incluída uma seqüência de proteína modelo que é, a

CYP153A6 da bactéria Mycobacterium sp HXN 1500. Esta seqüência serviu

como modelo comparativo, pois fornecia informações sobre os aminoácidos

críticos para a funcionalidade da proteína AlkB.

Tabela 1. Proteína CYP153A6 de Mycobacterium sp HXN 1500 modelo conhecido para uso comparativo com as outras proteínas AlkB de Pseudomonas.

11

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Dados protegidos para publicação

25

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W, Lipman, D. J. (1990). Basic

local alignment search tool. Journal of Molecular biology. 215: 403 - 410.

Ayala, M., Torres E. (2004). Enzymatic activation of alkanes: constraints and

prospective. Appl. Catal. A. Gen. 272:1

Benson, D. A., Karsch-Mizrachi, I., Lipman, D. J., Ostell, J., Wheeler, D. L.

(2005). Genbank. Nucleic Acid Research. 33: 34 - 38.

Bock, J. R., Gough, D. A. (2001). predicting protein-protein interactions from

primary structure. Bioinformatics. 17: 455 - 460.

Canhos, P. V., Manfio, G. P. Recursos microbiológicos para a biotecnologia.

http://www.mct.gov.br/Temas/biotec/Tendencias%20_Vanderlei%20Fina_.

pdf.

Chen, S. W., Pellequer, J. L. (2004). Identification of functionally important

residues in proteins using comparative models. Curr. Med. Chem. 11:595 -

605.

Claros, M. G., Von Heijne, G. (1994). TopPred II: an improved software for

membrane protein structure predictions. Comput. Appl. Biosci. 10: 685-6.

Craft, D. L., Madduri, K. M., Eshoo, M., Wilson, C. R. (2003). Identification

and characterization of the CYP52 family of Candida tropicalis ATCC

20336, important for the conversion of fatty acids and alkanes to , -

dicarboxylic acids. Appl. Environ. Microbiol. 69:5983 – 99.

Dayhoff, M. O., Schwartz, R. M., Orcutt, B. C. (1978). A model of evolutionary

change in proteins. In Dayhoff, M. O. Atlas of protein sequence and

structure. Natl. Biomed. Res. Found. 5: 345 - 52.

Eggink, G., Lageveen, R. G., Altenburg, B., Witholt, B. (1987). Controlled

and functional expression of the Pseudomonas oleovorans alkane utilizing

system in Pseudomonas putida and Escherichia coli. J. Biol. Chem. 262:

17712-8.

Frishman, D., Argos, P. (1996) Incorporation of long-distance interactions into

a secondary structure prediction algorithm. Protein Engineering 9: 133 -

142.

Funhoff, E. G., Bauer, U., Garcia-Rubio, I., Witholt, B., van Beilen, J. B.

(2006). CYP153A6, a soluble P450 oxigenase catalyzing terminal-alkane

26

hydroxylation. J. Bacteriol.188:5220 - 7.

Hall, T. A. (1999). BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor

and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser.

41:95 - 98.

Higgins, D. G., Sharp, P. M.(1988). Clustal: a package for performing multiple

sequence alignment on a microcomputer. Gene. 73:237 - 244.

Katopodis, A. G., Smith, H. A., May, S. W. (1988). New oxyfunctionalization

capabilities for -hydroxylases: asymmetric aliphatic sulfoxidation and

branched ether demethylation. J. Am. Chem. Soc. 110:897 - 99.

Katopodis, A. G., Wimalasena, K., Lee, J., May, S. W. (1984). Mechanistic

studies on non-heme iron monooxigenase catalysis: epoxidation, aldehyde

formation, and demethylation by the -hydroxylation system of

Pseudomonas oleovorans. J. Am. Chem. Soc. 106:7928 - 35.

Kopp, M. M., D. A., Sazinsky, M. H., Blazyk, J. L., Muller, J., Lippard, S. J.

(2001). Dioxygen activation and methane hydroxylation by soluble

methane monooxigenase: a tale of two irons and three proteins. Angew.

Chem. 40:2782 - 07

Magot, D., Ostell, J., Pruitt, K. D., Tatusova, T. (2005). Entrez Gene: gene-

centered information at NCBI. Nucleic. Acids. Res. 33: 54 - 58.

Masterton, W. L., Slowinski, E. J., Stanittski, C. L.(1990) Princípios de

Química. 6 ed. Rio de Janeiro, Editora Guanabara Koogan. 681 p.

May, S. W., Abbott, B. J. (1972). Enzymatic epoxidation. I. Alkane epoxidation

by the -hydroxylation system of Pseudomonas oleovorans. Biochem.

Biophys. Res. Commun. 48:1230 - 34.

May, S. W., Katopodis, A. G. (1986). Oxygenation of alcohol and sulphide

substrates by a prototypical non-haem iron monooxigenase: catalysis and

biotechnological potential. Enzyme Microb. Technol. 8:17 - 21.

McKenna, E. J., Coon, M. J. (1970). Enzymatic -oxidation IV Purification and

properties of the -hydroxylase of Pseudomonas oleovorans. J. Biol.

Chem. 245:3882 – 89.

Morrison, R. T. e Boyde, R. N. (1995). Química Orgânica. 5 ed., LisCalouste

Gulbenkian, 1325p.

Murrel, J. C. (1994). Molecular genetics of methane oxidation. Biodegradation

5: 145 - 59

27

Nieder, M., Shapiro, J. (1975). Physiological Function of the Pseudomonas

putida PpG6 (Pseudomonas oleovorans) Alkane Hydroxylase:

Monoterminal Oxidation of Alkanes and Fatty Acids. J. Bacteriol. 122:93 -

98.

Pearson, W. R., Lipman, D. J. (1988). Improved tools for biological sequence

comparison. Proceedings of Nacional Academy of Science USA. 85:2444

- 2448.

Shanklin, J., Achim, C., Schmidt, H., Fox, B. G., Münck, E. (1997).

Mössbauer studies of alkane v-hydroxylase: Evidence for a diironcluster in

an integral-membrane enzyme. Biochemistry. 94:2981 – 86.

Shanklin, J., Cahoon, E. B. (1998). Desaturation and related modifications of

fatty acids. Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant. Mol. Biol. 49:611 - 41.

Shanklin, J., Whittle, E. (2003). Evidence linking the Pseudomonas oleovorans

alkane -hydroxylase, an integral membrane diiron enzyme, and the fatty

acid desaturase family. Febs. 545:188 – 92.

Shanklin, J., Whittle, E., Fox, B. G. (1994). Eight histidine residues are

catalytically essential in a membrane-associated iron enzyme, stearoyl-

CoA desaturase, and are conserved in alkane hydroxylase and xylene

monooxigenase.Biochemistry. 33:12787 - 94.

Simon, D., Lunge, V. R. (2003). Bioinformática - Análise de Seqüências e

Genomas. In: Diagnóstico Genético e Molecular. Editora Ulbra. Canoas.

283 - 96.

Smits, T. H., Röthlisberger, M., Witholt, B., Van Beilen, J. B. (1999).

Molecular screening for alkane hydroxylase genes in Gram-negative and

Gram-positive strains. Environ. Microbiol. 1:307 - 18.

Staijen, I. E., Witholt, B. (1988). Synthesis of alkane hydroxylase of

Pseudomonas oleovorans increases the iron requirement of alk+ bacterial

strains. Biotechnol. Bioeng. 57:228 – 37.

Thompson, J. D., Gibson, T. J., Plewniak, F., Jeanmougin, F., Higgins, D.

G. (1997). The ClustalX windows interface: flexible strategies for multiple

sequence alignment aided by quality analysis tools. Nucleic. Acids.

Research. 24:4876 - 82.

Tusnady, G. E., Simon, I. (2001). The HMMTOP transmembrane topology

prediction server. Bioinformatics. 17: 849 - 50.

28

Van Beilen, J. B., Funhoff, E. G. (2005). Expanding the alkane oxigenase

toolbox: new enzymes and applications. Curr. Opin. Biotechnol. 16:308 -

14.

Van Beilen, J. B., Funhoff, E. G. (2007). Alkane hydroxylases involved in

microbial alkane degradation. Appl. Microbiol. Biotechnol. 74:13-21. Epub

2007 Jan 1

Van Beilen, J. B., Funhoff, E. G., Loon, A. V., Just, A., Kaysser, L., Bouza,

M., Houtackers, R., Röthlisberger, M., Li, Z., Witholt, B. (2006).

Cytochrome P450 alkane hydroxylases of the CYP153 family are common

in alkane-degrading Eubacteria lacking integral membrane alkane

hydroxylases. Appl. Environ. Microbiol. 72:59 – 65.

Van Beilen, J. B., Kingma, J., Witholt, B. (1994). Substrate specificity of the

alkane hydroxylase of Pseudomonas oleovorans GPo1. Enzyme Microb

Technol. 16:904 - 11.

Van Beilen, J. B., Li, Z., Duetz, W. A., Smits, T. H., Witholt, B. (2003).

Diversity of alkane hydroxylase systems in the environment. Oil. Gas. Sci.

Technol. 58:427 - 40.

Van Beilen, J. B., Panke, S., Lucchini, S., Fanchini, A. G., Rothlisberger,

M., Witholt, B. (2001). Analysis of Pseudomonas putida alkane-

degradation gene clusters and flanking insertion sequences: evolution and

regulation of the alk genes. Microbiology. 147: 1621 – 30.

Van Beilen, J. B., Penninga, D., Witholt, B. (1992). Topology of the

membrane-bound alkane hydroxylase of Pseudomonas oleovorans. J.

Biol. Chem. 267:9194 - 201

Van Beilen, J. B., Smits, T. H., Roos, F. F., Brunner, T., Balada, S. B.,

Rothlisberger, M., Witholt, B. (2005). Identification of an amino acid

position that determines the substrate range of integral membrane alkane

hydroxylases. J. Bacteriol. 187:85 - 91.

Wei, L., Chang, J. T., Altman, R. B. (1998) Statistical analysis of protein

structures: using environmental features for multiple purposes. In

Salzberg, S L Searls, D B, Kasif S (Eds) Computational Methods in

Molecular Biology. Elsevier. Science .Amsterdan. Holanda. 371p.

Wheeler, D. L., Barrett, T., Benson, D. A., Bryant, S. H., Canese, K.,

29

Church, D. M., DiCuccio, M., Edgar, R., Federhen, S., Helmberg, W.,

Kenton, D. L., Khovayko, O., Lipman, D. J., Madden, T. L., Maglott, D.

R., Ostell, J., Pontius, J. U.,Pruitt, K. D., Schuler, G. D., Schriml, L. M.,

Sequeira, E., Sherry, S. T., Sirotkin, K., Starchenko, G., Suzek, T. O.,

Tatusov, R., Tatusova, T. A., Wagner, L., Yaschenko, E. (2005).

Database resources of the National Center for Biotechnology Information.

Nucleic. Acids. Res. 33: 39 - 45.

Whisstock, J. C., Lesk, A. M. (2003). prediction of protein function from protein

sequence and structure. Q. Rev. Biophys. 36:307 - 40.

Whyte, L. G., Schultz, A., Van Beilen, J. B., Luz, A. P., Pellizari, D., Labbé,

D., Greer, C. W. (2002). Prevalence of alkane monooxigenase genes in

arctic and antarctic hydrocarbon-contaminated and pristine soils. FEMS

Microbiol. Ecol. 41:141 - 50.

Witholt, B., Smet, M. J., Kingma, J., Van Beilen, J. B., Kok, M., Lageveen,

R. G., Eggink, G. (1990). Bioconversions of aliphatic compounds by

Pseudomonas oleovorans in multiphase bioreactors: background and

economic potential. Trends. Biotechnol. 8:46 - 52.

30

CAPÍTULO 2

Prospecção de bactérias alcanotróficas nativas em solos e mangue da BPP-RN e Mata Atlântica-PE

1. INTRODUÇÃO

1.1. Ecologia microbiana e sua importância

Os estudos de ecologia microbiana têm sua importância pelo fato de os

microrganismos representarem as formas de vida mais abundantes no planeta

e possuírem a maior proporção da diversidade global estimada. A microbiota

dos solos é responsável por transformações fundamentais nos ciclos

biogeoquímicos, reciclando a matéria orgânica, degradando resíduos

industriais e xenobióticos, fixando N2 atmosférico e produzindo gases

relacionados ao efeito estufa, entre outros processos conhecidos. A microbiota

do solo também está associada à formação e manutenção da estabilidade de

agregados, pela produção de proteínas e polissacarídeos extracelulares que

contribuem à diversidade vegetal e de outros organismos que vivem acima do

solo (Hughes et al., 2001; Dabert et al., 2002, Schmidt, 2006).

Os microrganismos têm um papel fundamental na manutenção da

qualidade dos solos. Organizando-se de forma às vezes pouco conhecidas em

diferentes condições edáficas e/ou em resposta a diferentes distúrbios, por

exemplo, contaminação com petróleo, as comunidades microbianas podem ser

utilizadas como indicadoras da qualidade do solo. No entanto, como a maioria

dos microrganismos dos solos não pode ser cultivada nos meios de cultura

convencionais, o entendimento de um microbioma só será possível pela

utilização de técnicas avançadas de biologia molecular, associadas às técnicas

de bio e ecoinformática (Ovreas, 2000; Tyson e Banfield, 2005; Martiny et al.,

2006).

31

1.2. Importância econômica e impactos causados pela indústria do petróleo

O petróleo é um recurso não renovável resultante de processos físico-

químicos e biológicos sofridos pela matéria orgânica. Esta é depositada

juntamente com fragmentos de rochas durante a formação de rochas

sedimentares há milhões de anos. Devido a efeitos mecânicos, ocorre a

migração do petróleo no subsolo, acumulando-se em rochas porosas e

permeáveis, denominadas rochas reservatório. O petróleo é utilizado

principalmente para gerar combustível, contudo possui uma série de

subprodutos que são gerados após o refino e amplamente utilizados pela

sociedade, como por exemplo, lubrificantes, plásticos, fertilizantes,

medicamentos, tintas e tecidos (Magot et al., 2000; Van Hamme et al., 2003;

Head et al., 2003).

O petróleo é explorado comercialmente há mais de 140 anos. Desde o

início da produção comercial de óleo, engenheiros do petróleo têm enfrentado

problemas causados por microrganismos (Magot et al., 2000; Van Hamme et

al., 2003). O Brasil possui 30 bacias sedimentares, ocupando uma área de

4.650.000 km² na parte terrestre e 2.570.000 km² no mar até o limite do mar

territorial, ou seja, 200 milhas da costa. Dentre estas 30 bacias, oito são

produtoras de petróleo e gás natural. O Brasil produziu até hoje mais de cinco

bilhões de boe (barril óleo equivalente) e possui uma reserva total de 15,5

bilhões de boe. O potencial petrolífero, ou seja, o volume remanescente a

descobrir está entre 14 e 177 bilhões de boe. Geralmente, o fator de

recuperação de hidrocarbonetos pode variar entre 10% e 60%, sendo

freqüentemente extraído entre 20% e 30% (www.petrobras.com.br).

As atividades na Bacia Petrolífera Potiguar, on-shore, só foram

efetivamente implementadas quando um leigo descobriu óleo por acaso em um

poço artesiano perfurado para abastecer uma piscina em 1978. Hoje esta bacia

é a maior produtora em terra do país, produzindo 100 mil barris diários (figura

1). Está previsto para o período entre 2004 e 2008 o investimento de 840

milhões de reais na Bacia do Rio Grande do Norte e do Ceará. Desses 840

milhões, 22% serão investidos no mar, 8% na exploração, 13% em Mossoró-

RN, 21% em gás e energia, 11% em suporte, 10% em Guamaré-RN e 15% no

32

município de Alto Rodrigues-RN. Os investimentos serão disponibilizados para

as áreas de exploração, segurança e meio ambiente, comunicações,

informática e suporte, processamento e novas instalações, produção, malha de

gás e Termoaçu. Hoje, a Petrobrás possui no RN e CE 556 km de oleodutos,

542 km de gasodutos; 5.900 km de linhas de surgências, 9 estações de

tratamento de óleo, 2 unidades de processamento de gás, 6.099 poços

perfurados, 4.580 poços produtores, 50 campos de produção no RN e 6 no CE,

17 estações de injeção de vapor, 6 estações de compressão de gás, 67

estações coletoras de óleo e gás. Também possui unidade de produção de

diesel e nafta, 8 equipamentos de perfuração, 17 sondas de intervenção em

poços e 34 plataformas marítimas de exploração, demonstrando que além de

ser uma excepcional produtora on-shore a BPP do RN e CE possui uma

considerável estrutura para a captação de petróleo off-shore (figura 1)

(www.anp.gov.br).

Figura 1. Dados econômicos e setorias óleo e gás da Bacia petrolífera potiguar (ANP)

Desde o primeiro grande acidente em 1969 no canal da Inglaterra e o

desastre de Exxon Valdez no Alaska, ocorreram mais de 40 grandes

derramamentos marinhos de petróleo. Os vazamentos durante o transporte são

33

responsáveis por 45,5% do petróleo lançado ao mar, enquanto que os

vazamentos de atividades em terra vêm em segundo lugar, representando 29%

(Scherrer e Mille, 1989). A contaminação principalmente de manguezais devido

a derramamentos de petróleo é freqüente (Getter et al., 1981), ficando a flora e

a fauna desse ecossistema vulneráveis ao poluente, devido principalmente à

facilidade de sua acumulação no solo (Scherrer e Mille, 1989). As condições de

inundação e as características da vegetação, com suas raízes abundantes

formando uma malha superficial, dificultam o acesso às regiões contaminadas,

impedindo a descontaminação imediata (Getter et al., 1984).

Após a chegada ao ambiente, o petróleo sofre alterações de suas

características originais, devido a fatores físicos (evaporação, dissolução,

dispersão, oxidação fotoquímica, adsorção às partículas) e principalmente

biológicos (biodegradação) (Getter et al., 1984). As transformações físicas e

biológicas são reguladas pelas características específicas do derramamento e

do ambiente atingido. Assim, o grau de impacto ambiental e a persistência do

petróleo no ambiente dependem de fatores como: habitat atingido, tipo e

quantidade do óleo, espécies de organismos atingidos, época do ano,

condições hidrográficas e meteorológicas, clima, freqüência e duração da

exposição ao petróleo e as práticas utilizadas na tentativa da descontaminação

(Getter et al., 1981).

O petróleo e seus derivados podem persistir por mais de vinte anos em

manguezais, antes que a vegetação se recupere totalmente. Esta alta

persistência é explicada pela lenta biodegradação dos hidrocarbonetos devido

à limitação de oxigenação do meio e a lenta ciclagem dos nutrientes,

essenciais para a atividade microbiana aeróbia (Scherrer e Mille, 1989). A

persistência dos hidrocarbonetos depende também da exposição do sítio

contaminado aos fluxos de águas marinhas, influenciados pelas marés. A maior

freqüência de exposição a esses fluxos pode acelerar a remoção dos

hidrocarbonetos, contribuindo para a recuperação da vegetação (Getter et al.,

1984).

Derramamentos de poluentes podem ocorrer com freqüência e são a

principal e mais danosa causa de contaminação de solos e de águas,

entretanto, processos como a bioremediação, onde são utilizados

microrganismos capazes de biodegradar os mais diversos poluentes, podem

34

ser utilizados para minimizar os impactos ambientais causados por tais

desastres (Head et al., 2003). Para um experimento de bioremediação

eficiente, após um derramamento de petróleo, seriam elucidativas informações

prévias sobre o comportamento das populações microbianas com potencial

intrínseco para degradação de hidrocarbonetos no solo impactado.

1.3. Microbiologia do petróleo

Até há poucas décadas, acreditava-se que as profundezas dos

reservatórios de petróleo eram estéreis, e as bactérias isoladas de tais

ambientes poderiam ser apenas de origem exógena. Nossa percepção disto

mudou recentemente com descobertas inesperadas de populações diversas de

microrganismos, realizando uma série de atividades metabólicas diferentes,

expandindo os limites onde seria possível esperar atividade nesses ambientes

extremos de subsuperfície (Pedersen, 2000, Röling et al., 2003; Van Hamme et

al., 2003; Head et al., 2003).

A presença de microrganismos nas reservas petrolíferas pode levar à

biodegradação do petróleo em reservatórios, resultando em um decréscimo do

seu conteúdo de hidrocarbonetos nobres e aumento no conteúdo de enxofre,

na acidez e na viscosidade. Essas modificações têm conseqüências

econômicas negativas para a produção de petróleo e as operações de refino.

Este processo ocorre na maioria das reservas de petróleo do mundo, entre elas

as brasileiras. A presença de bactérias em reservatórios de petróleo tem sido

relatada na literatura e os trabalhos baseiam-se na sua identificação. Vários

gêneros, abrangendo eubactérias e Archaea bactérias, têm sido identificados

em diferentes campos de exploração de petróleo (Magot et al., 2000; Röling et

al., 2003).

Os doadores e aceptores de elétrons disponíveis nos reservatórios de

petróleo determinam o tipo de atividade metabólica dentro desses ambientes.

Os principais doadores de elétrons incluem o CO2, H2 de origem geoquímica ou

bacteriana e inúmeras moléculas orgânicas. Uma vez que os campos de óleo

são ambientes subterrâneos profundos e geralmente são isolados das águas

de superfície, seu potencial redox é muito baixo e, dessa forma, aceptores de

35

elétrons estão freqüentemente ausentes, em particular o oxigênio, nitrato e íons

férricos (Barth e Riis, 1992). Águas profundas geralmente contêm sulfato e

carbonatos em várias concentrações, tais fatores sugerem que os principais

processos metabólicos ocorrentes em tais ambientes são: a redução de sulfato,

metanogênese, acetogênese e fermentação (Barth, 1991; Magot et al., 2000).

As características fisiológicas de microrganismos nativos das reservas de

petróleo podem esclarecer sob quais condições a degradação do petróleo pode

ocorrer e quais os mecanismos envolvidos. Apesar de um grande número de

microrganismos já terem sido isolados das reservas petrolíferas e

caracterizados, o cultivo dessa população microbiológica nativa ainda é um

desafio (Van Hamme et al., 2003). O termo nativo refere-se a microrganismos

que estão presentes nos reservatórios, sem influência de contaminantes

provenientes da perfuração (Grassia et al., 1996).

Muitos dos parâmetros físico-químicos críticos para o estabelecimento

de comunidades microbianas em subsuperfície também são válidos para

comunidades microbianas localizadas em camadas superficiais. Exceto que

não conferem, necessariamente, as condições extremófilas. Portanto elas terão

papel importante sobre a diversidade microbiana nativa e seu papel na

manutenção nos ecossistemas terrestres, de mangue e marinhos, quer sem

impacto quer impactado por petróleo. As potencialidades de sobrevivência

dessas comunidades microbianas sob impacto de diversos poluentes

originários da indústria de petróleo são dependentes de genes que codificam

proteínas envolvidas com a degradação de hidrocarbonetos, alguns deles

utilizados como fonte de carbono. Genes amplamente distribuídos foram

encontrados em bactérias Gram-positivas e Gram-negativas (Lazar et al., 1999;

Smits et al., 1999; Van Beilen et al., 2002; Van Hamme et al., 2003).

Monooxigenases e dioxigenases são enzimas-chave na biodegradação

de uma grande variedade de alcanos e os genes codificantes dessas enzimas

têm sido caracterizados. Entre eles podemos citar: alkB, ndoB, todC1, xylE,

cat23, bphA, etc (Van Hamme et al., 2003).

Em Pseudomonas oleovorans, por exemplo, foram identificados genes

que codificam para uma alcano-hidroxilase responsável pela conversão de

alcanos (C5 - C44) em ácidos graxos (Chen et al., 1996; Whyte et al., 1997;

Staijen et al., 1999; Margesin et al., 2003; Chaillan et al., 2004; Luz et al.,

36

2004). Outros genes de biodegradação de hidrocarbonetos já têm sido

descritos (Vomberg e Klinner, 2000; Belhaj et al., 2002; Kotik et al., 2005).

Recentemente verificou-se que em P. aeruginosa um gene codificador da

alcano hidroxilase é necessário para seu crescimento em óleo cru como única

fonte de energia e de carbono (Belhaj et al., 2002; Siciliano et al., 2003).

1.4. Análises microbiológicas independentes de cultivo

A existência de enorme e desconhecida diversidade de microrganismos

não cultivados em amostras ambientais tem encorajado o desenvolvimento de

novas metodologias para o seu estudo, sem a necessidade de cultivo prévio.

Os métodos mais recentes exploram diferentes moléculas biológicas, incluindo

rDNAs (tabela 1). Juntamente com a bioinformática, as análises estatísticas e

filogenéticas são vistas como as mais promissoras ferramentas nos estudos

visando a caracterização das comunidades microbianas e o papel delas em

diferentes condições ambientais (Ovreas, 2000).

Tabela 1. Técnicas para estudo da microbiota de amostras ambientais

37

O estudo de um grande número de comunidades de microrganismos de

forma independente de cultura através do metagenoma pode brindar

informações únicas ao acessar diretamente a informação genética dos

microrganismos. Duas estratégias podem ser empregadas para melhorar o

rendimento e a pureza do DNA metagenômico (mDNA) recuperado das

amostras, representando de forma mais precisa a diversidade microbiológica: i)

a primeira metodologia consiste na extração direta de ácidos nucléicos de

partículas do solo através de lise celular in situ, seguida de purificação do DNA;

(Ogram et al., 1987; Bruce et al, 1992; Orphan et al., 2000; Kirk et al., 2004). ii)

metodologia baseada na separação bacteriana das partículas do solo, seguida

de lise celular e purificação do mDNA (Yeates et al., 1998; Robe et al., 2003).

O emprego de kits comerciais torna a extração do mDNA onerosa porém

compensatório em termos de pureza e rendimento de mDNA propício para as

reações de PCR (Nakatsu et al., 2000; Fredslund et al., 2001; Martin-Laurent et

al., 2001; Evans et al., 2004a; Evans et al., 2004b; Kaplan e Kitts, 2004 e Mumy

e Findlay, 2004).

Seqüências de DNA genômico (DNAg) e mDNA provenientes de

comunidades bacterianas nativas presentes no solo, sedimento e areia podem

ser amplificadas pelo uso da reação em cadeia da polimerase (PCR) e

analisadas através de DGGE (Muyzer et al., 1993). A utilização de PCR-DGGE

foi disseminada em estudos da diversidade genética microbiana em amostras

ambientais mediante a utilização de primers para o gene 16S rDNA (Bruce et

al., 1992; Amann et al., 1995; Orphan et al., 2000; Watanabe et al., 2001; Robe

et al., 2003; Zhu et al., 2003; Evans et al.,2004a; Evans et al., 2004b; Kirk et al.,

2004; Santos, 2006).

A técnica de DGGE é uma poderosa ferramenta que é comumente

usada na biologia molecular para a caracterização das estruturas e dinâmicas

populacionais dos microrganismos. O fornecimento de dados são bastante

rápidos e eficazes no que diz respeito ao conteúdo global das populações

presentes na área de estudos.

O emprego do DGGE consiste na análise da separação de fragmentos

de bandas de DNA de dupla fita com tamanhos idênticos. Na prática, isso se

refere à separação dos fragmentos de DNAs produzidos por reação de PCR. A

façanha desta técnica (dentre outros fatores) baseia-se na estabilidade do

38

conteúdo GC (seu pareamento, possui três ligações de hidrogênio) em relação

ao pareamento AT (o qual possui duas ligações de hidrogênio). A mistura de

diferentes seqüências de DNAs são eletroforizados em gel de poliacrilamida

contendo um gradiente que aumenta a desnaturação do DNA.

Em geral os fragmentos de DNAs gerados que possuem um alto

conteúdo GC apresentam uma tendência a serem mais estáveis,

permanecendo dupla fita mesmo nos altos gradientes desnaturantes (Muyzer et

al., 1993). Fragmentos dupla fita migram melhor no gel, enquanto moléculas de

DNAs desnaturadas tornam-se efetivamente maiores e migram mais

lentamente. Dessa maneira, fragmentos de DNAs de diferentes seqüências

podem ser separados.

1.5. Diversidade microbiana relacionada a petróleo e derivados

É importante destacar que a maioria dos estudos da diversidade

microbiana biodegradadora de petróleo e/ou seus derivados e xenobióticos

realiza as análises em ambientes associados a petróleo (Smits et al., 1999;

Orphan et al., 2000; Milcic-Terzic et al., 2001; Tanaka et al., 2002; Margesin et

al, 2003; Pepi et al., 2003; Chaillan et al 2004; Luz et al., 2004; Chang et al,

2005, Nievas et al, 2006; Sette et al, 2006). No entanto, praticamente se

desconhece sobre a diversidade de comunidades microbianas nativas de locais

não impactados, porém com elevado risco de impacto ambiental, como os

realizados no Kuwait (Obuekwe et al, 2003) e na Alemanha (Kloos et al., 2006).

Pesquisas sobre a diversidade microbiana nativa em diferentes

ecossistemas em bacias petrolíferas no Brasil são limitadas (Sebastian, 1999;

Evans et al., 2004ab,). Já em ambientes contaminados, vários trabalhos

reportam experiências de isolamento e caracterização microbiológica: Praia do

Recreio dos Bandeirantes RJ, (Del Arco, 1999); Bacia de Campos (Rosa,

2001); Baia de Guanabara - RJ (Santos de Oliveira, 2001); Petrobras, Lagoa de

Baixo, Guamaré, RN (Costa Duarte, 2004); Região de Icapuí-CE (Marques,

2004); Petrobras, Guamaré-RN (Pinto da Silva, 2004), porém somente

Bellicanta (2004) e Luz et al. (2004) realizaram estudos com abordagens

moleculares no sistema estuarino de Santos e São Vicente, SP; Cubatão-SP,

39

respectivamente.

Na Bacia Petrolífera Potiguar-RN (BPP-RN), a mais importante

produtora de petróleo on shore, os estudos são pioneiros, como o de Santos

(2006), que verificou através de PCR-DGGE que a população microbiana

nativa de solos de Macau,RN (caatinga) e de Diogo Lopes-RN (Mangue)

responde à contaminação por petróleo, revelando uma correlação na dinâmica

de comunidades microbianas em função do tempo e tipo de solo impactado

com petróleo, inclusive em amostras de solo da Mata Atlântica na Reserva

Horto Dois Irmãos-PE. Ainda, Coutinho (2005) estudou in vitro a ocorrência de

microrganismos nativos de Diogo Lopes-RN (Mangue) e da Mata Atlântica na

Reserva Horto Dois Irmãos-PE com potencial de crescimento utilizando

petróleo como única fonte de carbono. Silva (2005) observou a ocorrência de

bactérias redutoras de Ferro (III), e prospectando os mesmos microcosmos

experimentais isolou bactérias que também crescem utilizando petróleo como

única fonte de carbono. Souza Junior (2006) avaliou a produção de

biosurfactantes por bactérias biodegradadoras de petróleo isoladas de solos e

de mangue da Bacia Petrolífera Potiguar-RN (BPP-RN), observando que estas

apresentam uma produção aumentada de moléculas biosurfactantes quando

crescem em petróleo como única fonte de carbono.

Neste trabalho, através da aplicação de métodos moleculares como

PCR-DGGE, espera-se contribuir para uma visão particular da diversidade de

microrganismos alcanotróficos de microbiomas nativos da BPP-RN, baseado

na ocorrência de genes catabólicos responsáveis pela biodegradação de

alcanos e inferir suas potenciais aplicações em bioremediação em situações de

impacto ambiental por petróleo e derivados na Bacia Petrolífera Potiguar-RN

(BPP-RN).

40

2. OBJETIVOS

Prospectar bactérias alcanotróficas de solos e mangue da Bacia

Petrolífera Potiguar – RN e solo da Mata Atlântica na Reserva Horto

Dois Irmãos-PE utilizando o gene alkB como biomarcador molecular

Avaliar a resposta de comunidades microbianas alcanotróficas nativas

de solos e mangue da Bacia Petrolífera Potiguar – RN ao impacto de

contaminação por petróleo através de PCR-DGGE

Comparar respostas ao impacto de contaminação por petróleo de

comunidades microbianas da Bacia Petrolífera Potiguar – RN e solo da

Mata Atlântica na Reserva Horto Dois Irmãos-PE.

41

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Locais de amostragem de solos e sedimentos

Foram utilizados como materiais de coleta: luvas, espátulas e

contêineres com a capacidade para 20Kg que foram previamente esterilizados.

Em uma área demarcada de 1m2 e a uma profundidade de 10cm da superfície

foram coletados 20 Kg de amostras de solos de cada ambiente de estudo. Os

locais de amostragens foram escolhidos de forma aleatória, observando-se

apenas o distanciamento do local de possíveis ações antrópicas. A seguir

segue a localização dos pontos com suas respectivas caracterizações:

Distrito de Macau-RN em Diogo Lopes-RN (05°05’39’’ de Latitude Sul e

36°21’33’’ de Longitude Oeste) na área de Proteção Ambiental

(Mangue), pertencente à Bacia Petrolífera Potiguar, sem nenhum

histórico registrado de contaminação por petróleo (figura 2).

Os mangues são árvores ou arbustos que apresentam a característica

idêntica de crescer em águas rasas e lodosas ou salobras, em especial em

costas e estuários de águas tranqüilas. Produzem massas emaranhadas de

raízes arqueadas, que ficam expostas durante a maré baixa. Os manguezais

são alguns dos ecossistemas mais produtivos da natureza, proporcionando

complexas relações ecológicas entre seus componentes e funcionando, por

vezes, como um exportador de matéria orgânica para ecossistemas costeiros

adjacentes. É um ecossistema de transição do ecossistema marinho e terrestre

característico de regiões tropicais e subtropicais, este tipo de ambiente está

sujeito ao regime de marés (recebendo diariamente ação de águas salgadas ou

mesmo salobra) (Pereira e Soares-Gomes, 2002).

Distrito de Macau-RN na “Estrada do Óleo” (05°18’28’’ de Latitude Sul e

36°40’31’’ de Longitude Oeste) pertencente à Bacia Petrolífera Potiguar

(Caatinga). Sem contaminação por petróleo conhecida, embora existam

cavalos mecânicos para extração do petróleo no local (figura 2).

42

O bioma Caatinga é o principal ecossistema existente na Região

Nordeste, estendendo-se pelo domínio de climas semi-áridos, numa área de

73.683.649 ha, 6,83% do território nacional; ocupa os estados da BA, CE, PI,

PE, RN, PB, SE, AL, MA e MG. O termo Caatinga é originário do tupi-guarani e

significa mata branca. É um bioma único, pois, apesar de estar localizado em

área de clima semi-árido, apresenta grande variedade de paisagens, relativa

riqueza biológica e endemismo. A ocorrência de secas estacionais e periódicas

estabelece regimes intermitentes aos rios e deixa a vegetação sem folhas. A

folhagem das plantas volta a brotar e fica verde nos curtos períodos de chuvas.

(www.ibama.gov.br)

Dois Irmãos-PE (08°03’00’’ de Latitude Sul e 34°59’17’’ de Longitude

Oeste) área de Reserva Florestal em remanescente de Mata Atlântica,

localizada fora da Bacia Petrolífera Potiguar, em local selvagem não

afetado por ação antrópica e sem histórico de contaminação por petróleo

(figura 2).

Em termos gerais, a Mata Atlântica pode ser vista como um mosaico

diversificado de ecossistemas, apresentando estruturas e composições

florísticas diferenciadas, em função de diferenças de solo, relevo e

características climáticas existentes na ampla área de ocorrência desse bioma

no Brasil.

O ecossistema de Mata Atlântica compreende a região costeira do

Brasil. O seu clima é equatorial ao norte e quente temperado sempre úmido ao

sul, possui temperaturas médias elevadas durante o ano todo e não apenas no

verão. A alta pluviosidade nessa região deve-se à barreira que a serra constitui

para os ventos que sopram do mar. Seu solo é pobre e a topografia é bastante

acidentada. No interior da mata, devido à densidade da vegetação, a luz é

reduzida. As condições físicas na floresta atlântica variam muito, dependendo

do local estudado, assim, apesar de a região estar submetida a um clima geral,

há micro climas muito diversos e que variam de cima para baixo nos vários

estratos. Os teores de oxigênio, luz, umidade e temperatura são bem

diferentes, dependendo da camada considerada. Os solos da floresta são, via

43

de regra, pobres em minerais e sua natureza é granítica ou gnáissica. A maior

parte dos minerais está contida nas plantas em vez de estar no solo

(www.ibama.gov.br).

Figura 2. Os pontos de amostragens no Rio Grande do Norte e Pernambuco.

3.2. Ensaio de microcosmo

A construção do ensaio de microcosmo foi realizada por Santos (2006)

na qual utilizou os três solos coletados (indicados no item 3.1 deste trabalho)

em contêineres de 20Kg, o ensaio foi realizado em triplicata. Destes foram

utilizados 15Kg, que foram divididos em dois contêineres menores de 7,5Kg,

um mantido puro (nas condições encontradas no ambiente) e o outro foi

contaminado com 3% de petróleo (não havendo reposição durante o

experimento). Posteriormente, foram construídos 42 microcosmos para cada

tipo de solo em estudo, 21 contendo solo puro e 21 contendo solo

contaminado, gerando um total de 126 microcosmos com 250g de solo cada.

Antes da acomodação dos solos nos recipientes, foi efetuada uma

homogeneização tanto dos solos de microcosmos puros, quanto dos solos de

microcosmos contaminados por petróleo, para assim serem mantidos durante

44

todo o experimento. As amostragens dos solos de microcosmos para análises

foram realizadas a cada 2 meses (Tempos 0, 60, 120, 180, 240, 300 e 360

dias), durante um período total de 12 meses de experimento. A seguir segue o

esquema do ensaio do microcosmo (figura 3):

Figura 3. A esquerda uma Ilustração do ensaio de microcosmo e no lado direito desenho esquemático de sua montagem.

3.3. Cultivo de microrganismos em meio de cultura Luria Bertani (LB)

O meio de cultura Luria Bertani (LB) foi preparado segundo Sambrook e

Russell (2001). Para isolamento das colônias foi utilizado o método de

esgotamento. As culturas foram feitas pela semeadura nos meios de cultura

sólidos, distribuídos em placa de Petri e incubados a 37°C. Por se tratarem de

microrganismos desconhecidos até o momento, o tempo de incubação variou

para cada isolado.

3.4. Linhagens bacterianas utilizadas

As cepas bacterianas controle utilizadas foram cedidas pelo pesquisador

Bernard Witholt do Instituto Federal de Tecnologia da Suíça (ETHZ). São elas

Escherichia coli W3110 (pGEc47) contendo o operon alk, Pseudomonas putida

GPo1 (comumente conhecida como Pseudomonas oleovorans GPo1) (pOCT),

45

e P. putida GPo12 (curada do pOCT) (Van Beilen et al, 2001; Smits et al,

2002), utilizadas para verificar a especificidade dos primers construídos, os

quais foram designados como mat. Também foram utilizadas linhagens que

fazem parte da coleção do CROB (Cluster for Research in Oil Biotechnology),

previamente selecionadas por Coutinho (2005) e Santos (2006) (Tabela 2).

Os isolados microbianos 18R – 35 da tabela 2 são provenientes do

microcosmo do solo de Diogo Lopes previamente isolados por Santos (2006). E

os isolados 1.2 - 1.12 (Horto de Dois Irmãos), 2.6 - 2.11 (Diogo Lopes), são

provenientes de microcosmos líquidos contendo petróleo a 3% realizados por

Coutinho (2005).

Tabela 2. Linhagens utilizadas para estudos do gene alkB.

3.5. Desenho de oligonucleotídeos para PCR

Foi construída uma base de dados de genes alk de degradação de

alcanos, através de mineração em bancos de dados: NCBI (The National

Center for Biotechnology Information - USA), KEGG (Kyoto Encyclopedia of

Genes and Genomes - JAPÃO) e UMBBD (University of Minnesota

Biocatalysis/Biodegradation Database - USA). A escolha das seqüências

nucleotídicas para desenho dos primers degenerados mat foi realizada a partir

de alinhamentos múltiplos gerados pelo programa CLUSTALW (Higgins e

Sharp, 1988). Para a construção dos primers específicos para o gene alkB em

Pseudomonas foi utilizado o programa Fast PCR (by Ruslan Kalendar, versão

3.8.82 para windows) e adicionalmente foi sintetizado um grampo de GC com

40 nucleotídeos 5’ CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG

GCA CGG GGG G 3’ como descrito por Nakatsu et al. (2000), ligando a

46

extremidade 5` do primer forward específico, sendo denominado de matg.

Também foram utilizados primers universais baseados no gene 16S rDNA

desenvolvidos por Santos (2006).

3.6. Extração de DNA metagenômico de solos e extração de DNA genômico dos isolados microbianos

O mDNA das amostras de solos puros e contaminados do microcosmo

foram extraídos segundo o método descrito por Ausubel et al., (1995) e/ou

utilizando o kit FastDNA SPIN (BIO101, Carlsbad, CA, USA). As extrações de

DNA genômicos a partir de culturas bacterianas puras foram realizadas de

acordo com o método “extração por fervura”. Foram fervidas as bactérias

crescidas em meios líquidos enriquecidos, retirada uma alíquota de 500 µL das

bactérias crescidas e colocou-se em microtubos de 2 mL, centrifugou-os

durante 5 minutos a 13000 rpm, retirou-se o sobrenadante, ressuspendeu-se

com água deionizada estéril, e furou-se as tampas dos microtubos com agulhas

estéreis. Os microtubos foram colocados em banho-maria, (com a água

previamente aquecida) dentro de um forno microondas em sua potência

máxima por dois ciclos de 5 minutos. Em seguida, os microtubos foram

centrifugados durante 10 minutos e o conteúdo foi recuperado e transferido

para um outro microtubo estéril. A solução de DNA foi estocada no freezer (-

20°C).

3.7. PCR e DGGE

Os produtos gerados nas reações de PCR foram analisados

eletroforeticamente em agarose, como descrito por Sambrook et al. (1989). O

programa de ciclagem (denominado DOWNTM) foi o mesmo para ambos os

pares de primers ISBA (rDNA16S), mat (alkB primer degenerado) e matg (alkB

primer específico), como descrito pela metodologia de Santos (2006).

Para amostras de DNA metagenômicos e DNA genômico de consórcios

bacterianos foi utilizado o seguinte protocolo de PCR:

1 µL de DNA (~40 ng/ µL) , 1 µL de 2,5 mM MgCl2, 2 µL de

47

tampão de PCR10X (Biosystem), 2 µL de primer foward (20

pmol), 2 µL primer reverse (20 pmol), 1 µL DNTPs e 2,5 U de Taq

polimerase (Biosystem).

Para amostras de DNA genômico dos isolados bacterianos crescidos

dos microcosmos que foram extraídas pelo método de “extração por fervura” foi

utilizado o seguinte protocolo de PCR:

5µL ácidos nucléicos dos consórcios, 1 µL de 2,5 mM MgCl2, 2

µL de tampão de PCR 10X (Biosystem), 2 µL de primer foward

(20 pmol), 2 µL primer reverse (20 pmol), 1 µL DNTPs e 2,5 U de

Taq (Biosystem) e/ou GoTaq® Flexi DNA Polymerase

(PROMEGA).

Após a reação de PCR com mDNA, as amostras foram analisadas em

gel de agarose a 1,8%.

Depois da avaliação com gel de agarose, os amplicons foram analisados

pela técnica de PCR-DGGE, utilizando o aparelho DGGE-1001 (C.B.S.,

Scientific Company). As análises foram feitas em poliacrilamida a 8% durante

16 horas a 80 V e 22 mA, com gradiente de desnaturação uréia-formamida de

40% a 60%. Em cada canaleta do DGGE foram aplicados 10 l das reações de

PCR. Os géis foram corados com nitrato de prata a 0,2% e fotodocumentados.

48

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

Dados protegidos para publicação

59

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

Akarsubasi, A. T., Ince, O., Kirdar, B., Oz, N. A., Orhon, D., Curtis, T. P.,

Head, I. M., Ince, B. K. (2005). Effect of wastewater composition on

archaeal population diversity. Water Res. 39:1576 - 84.

Amann, R. I., Ludwing, W. E., Schleifer, K. H. (1995). Phylogenetic

identification and in situ detection of individual cells without cultivation.

Microbiol. Reviews 59:143 - 69.

Anderson, I. C., Cairney J W (2004). Diversity and ecology of soil fungal

communities: increased understanding through the application of

molecular techniques. Environ. Microbiol. 6:769 - 79.

Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G.,

Smith, J. A., Struhl, K. (1995). Current protocols in molecular biology.

John Wiley & Sons Inc. New York..

Baptista, I. I., Peeva, L. G., Zhou, N. Y., Leak, D. J., Mantalaris, A.,

Livingston, A. G. (2006). Stability and performance of Xanthobacter

autotrophicus GJ10 during 1,2-dichloroethane biodegradation. Appl.

Environ. Microbiol. 72:4411 - 8.

Barbosa, V. L., Atkins, S. D., Barbosa, V. P., Burgess, J. E., Stuetz, R. M.

(2006). Characterization of Thiobacillus thioparus isolated from an

activated sludge bioreactor used for hydrogen sulfide treatment. J. Appl.

Microbiol. 101:1269 - 81.

Barth, T. (1991). Organic acids and inorganic ions in waters from petroleum

reservoirs, Norwegian continental shelf: a multivariate statistical analysis

and comparison with American reservoir formation waters. Appl.

Geochem. 6:1 - 15.

Barth, T., Riis, M. (1992). Interactions between organic acid anions in

formation waters and reservoir mineral phases. Organ. Geochem. 19:455 -

482.

Belhaj, A., Desnoues, N., Elmerich, C. (2002). Alkane biodegradation in

Pseudomonas aeruginosa strains isolated from a polluted zone:

identification of alkB and alkB-related genes. Res. Microbiol. 153:339 -

344.

Bellicanta, G. S. (2004). Diversidade de genes catabólicos em amostras de

60

sedimentos do sistema estuarino de Santos e São Vicente, SP. Tese de

Doutorado, USP (Universidade de São Paulo), São Paulo, SP, Brasil.

Borin, S.; Marzorati, M., Brusetti, L., Zilli, M., Cherif, H., Hassen, A.,

Converti, A., Sorlini, C., Daffonchio, D. (2006). Microbial Succession in

a Compost-packed Biofilter Treating Benzene-contaminated Air.

Biodegradation. EpubAlkBead of print.

Brito, E. M., Guyoneaud, R., Goni-Urriza, M., Ranchou-Peyruse, A.,

Verbaere, A., Crapez, M. A., Wasserman, J. C., Duran, R. (2006).

Characterization of hydrocarbonoclastic bactérial communities from

mangrove sediments in Guanabara Bay, Brazil. Res. Microbiol. 157:752 -

62.

Bruce, K. D., Hiorns, W. D., Hobman, J. L., Osborn, A. M., Strike, P.,

Ritchie, D. A. (1992). Amplification of DNA from native populations of soil

bactéria by using the polymerase chain reaction. Appl. Environ. Microbiol.

58:3413 - 16.

Chaillan, F., Le Flèche, A., Bury, E., Phantavong, Y-hui, Grimont, P., Saliot,

A., Oudot, J. (2004). Identification and biodegradation potential of tropical

aerobic hydrocarbon-degrading microorganisms. Res. Microbiol. 155: 587 -

595.

Chakrabarty, A. M., Chou, G., Gunsalus, I. C. (1973). Genetic regulation of

octane dissimilation plasmid in Pseudomonas. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A

70:1137 – 40.

Chang, J. S., Chou, C. L., Lin, G. H., Sheu, S. Y., Chen, W. M. (2005).

Pseudoxanthomonas kaohsiungensis sp. nov., a novel bacterium isolated

from oil-polluted site produces extracellular surface activity. Syst. Appl.

Microbiol. 28: 137 - 44.

Chen, Q., Janssen, D. B., Witholt, B. (1996). Physiological changes and alk

gene instability in Pseudomonas oleovorans during induction and

expression of alk genes. J. Bacteriol. 178:5508 - 12.

Chen, R., LaPara, T. M. (2006). Aerobic biological treatment of low-strength

synthetic wastewater in membrane-coupled bioreactors: the structure and

function of bactérial enrichment cultures as the net growth rate approaches

zero. Microb. Ecol. 51:99 - 108.

61

Chinalia, F. A., Killham, K. S. (2006). 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)

biodegradation in river sediments of Northeast-Scotland and its effect on

the microbial communities (PLFA and DGGE). Chemosphere

EpubAlkBead of print.

Costa Duarte, M. D. (2004). Caracterização Microbiológica de uma Lagoa

Contaminada por Resíduos de Petróleo (Lagoa de Baixo, Guamaré) e seu

Potencial de Biorremediação. Dissertação de Mestrado, UFPB

(Universidade Federal da Paraíba), João Pessoa, PB, Brasil.

Coutinho, L. G. (2005). Avaliação in vitro da diversidade microbiana em solos

de mangue e mata atlântica contaminados por petróleo, monografia

(bacharelado) Centro de Biociências, Departamento de biologia celular e

genética, UFRN, Natal, RN, Brasil.

Dabert, P., Delgenès, Jean-Philippe, Moletta, R., Godon, Jean-Jacques

(2002). Contribution of molecular microbiology to the study in water

pollution removal of microbial community dynamics. Reviews Environ. Sci.

Biotech. 1: 39 - 49.

Del Arco, J. P. (1999) Degradação de hidrocarbonetos por bactérias e fungos

em sedimento arenoso. Tese de Doutorado, UFRJ (Universidade Federal

do Rio de Janeiro), Rio de Janeiro, RJ, Brasil.

Evans, F. F., Rosado, A. S., Sebastian, G. V., Casella, R., Machado, P. L. O.

A., Holmström, C., Kjelleberg, S., Van Elsas, J. D., Seldin, L. (2004a).

Impact of oil contamination and biostimulation on the diversity of

indigenous bactérial communities in soil microcosms. FEMS Microbiol.

Ecol. 49:295 - 305.

Evans, F. F., Seldin, L., Sebastian, G. V., Kjelleberg, S., Holmströn, C.,

Rosado, A. S. (2004b). Influence of petroleum contamination and

biostimulation treatment on the diversity of Pseudomonas spp. in soil

microcosms as evaluated by 16S rRNA based-PCR and DGGE. Lett. Appl.

Microbiol. 38:93 - 98.

Fontana, C., Sandro Cocconcelli, P., Vignolo, G. (2005). Monitoring the

bacterial population dynamics during fermentation of artisanal Argentinean

sausages. Int. J. Food. Microbiol. 103:131 - 42.

Fredslund, L., Ekelund, F., Jacobsen, C. S., Johnsen, K. (2001).

Development and Application of a Most-Probable-Number–PCR Assay To

62

Quantify Flagellate Populations in Soil Samples. Appl. Environ. Microbiol.

67:1613 - 18.

Getter, C. D., Cintron, G., Dicks, B., Lewis, R. R., Seneca, E. D. (1984). The

recovery and restoration of salt marshes and mangrove following an oil

spill. In: Cairns J, Buikema A L Restoration of habitats impacted by oil

spills Boston Butterwoth: 65 - 113.

Getter, C. D., Scott, G. I., Michel, J. (1981). The effects of oil spills on

mangrove forests: a comparison of five oil spill sites in the Gulf of Mexico

and the Caribbean sea. In: The 1981 oill spill conference Baltimore

Washington: 535 - 540.

Grassia, G. S., Mclean, K. M., Glénat, P., Bauld, J., Sheehy, A. J. (1996). A

systematic survey for thermophilic fermentative bactéria and archaea in

high temperature petroleum reservoirs. Fems. Microbiol. Ecol. 21: 47-58.

Halet, D., Boon, N., Verstraete, W. (2006). Community dynamics of

methanotrophic bactéria during composting of organic matter. J. Biosci.

Bioeng. 101:297 - 302.

Hara, A., Baik, S. H., Syutsubo, K., Misawa, N., Smits, T. H., Van Beilen, J.

B., Harayama, S. (2004). Cloning and functional analysis of alkB genes in

Alcanivorax borkumensis SK2. Environ. Microbiol. 6: 191 - 7.

Head, I. M., Jones, D. M., Larter, S. R. (2003). Biological activity in the deep

subsurface and the origin of heavy oil. Nature. 426: 344 - 51.

Heiss-Blanquet, S., Benoit, Y., Mare´chaux, C., Monot, F. (2005). Assessing

the role of alkane hydroxylase genotypes in environmental samples by

competitive PCR. J. Appl. Microbiol. 99:1392–403

Higgins, D. G., Sharp, P. M. (1988). Clustal: a package for performing multiple

sequence alignment on a microcomputer. Gene. 73:237 - 44.

Hughes, J. B., Hellmann, J. J., Ricketts, T. H., Bohannan, B. J. M. (2001).

Counting the uncountable: statistical approaches to estimating microbial

diversity. Appl. Environ. Microbial. 67:4399 - 4406.

IBAMA. (2007). Ecossistemas. Instituto brasileiro do meio ambiente e dos

recursos naturais renováveis. Disponível em http://www.ibama.gov.br.

Acesso em 25/03/2007.

Kaplan, C. W., Kitts, C. L. (2004). Bactérial succession in a petroleum land

treatment unit. Appl. Environ. Microbiol. 70:1777 - 86.

63

Kathiresan, K. (2003). Polythene and plastic-degrading microbes in an Indian

mangrove soil. Rev. Biol. Trop. 51:629 - 33.

Kirk, J. L., Beaudette, L. A., Hart, M., Moutoglis, P., Klironomos, J. N., Lee,

H., Trevors, J. T. (2004). Methods of studying soil microbial diversity. J

Microbiol. Methods 58: 169 - 88.

Kloos, K., Munch, J. C., Schloter, M. (2006). A new method for the detection

of alkane-monooxigenase homologous genes (alkB) in soils based on

PCR-hybridization. J. Microbiol. Methods 66: 486 - 96.

Kotik, M., Brichac, J., Kyslík, P. (2005). Novel microbial epoxide hydrolases

for biohydrolysis of glycidyl derivatives. J. Biotech. 120: 364 - 375.

LaPara, T. M., Klatt, C. G., Chen, R. (2005). Adaptations in bactérial catabolic

enzyme activity and community structure in membrane-coupled

bioreactors fed simple synthetic wastewater. J. Biotechnol. 121:368 - 80.

Lawrence, J. R., Hendry, M. J., Wassenaar, L.I., Germida, J. J., Wolfaardt,

G. M., Fortin, N., Greer, C. W. (2000). Distribution and Biogeochemical

Importance of Bactérial Populations in a Thick Clay-Rich Aquitard System.

Microb. Ecol. 40:273 - 91.

Lawrence, P., Brenna, J. T. (2006). Acetonitrile covalent adduct chemical

ionization mass spectrometry for double bond localization in non-

methylene-interrupted polyene Fatty Acid methyl esters. Anal. Chem.

78:1312-7.

Lazar, I., Voicu, A., Nicolescu, C., Mucenica, D., Dobrota, S., Petrisor, I. G.,

Stefanescu, M., Sandulescu, L. (1999). The use of naturally occurring

selectively isolated bactéria for inhibiting paraffin deposition. J. Petrol. Sci.

Engineer 22:161 - 9.

Lee, T. H., Kurata, S., Nakatsu, C. H., Kamagata, Y. (2004). Molecular

analysis of bactérial community based on 16S rDNA and functional genes

in activated sludge enriched with 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D)

under different cultural conditions. Microb. Ecol. 49:151 - 62.

Lim, S. P., Gan, S. N., Tan, I. K. (2005). Degradation of medium-chain-length

polyhydroxyalkanoates in tropical forest and mangrove soils. Appl.

Biochem. Biotechnol. 126:23 - 33.

Luz, A. P., Pellizari, V. H., Whyte, L. G., Greer, C. W. (2004). A survey of

indigenous microbial hydrocarbon degradation genes in soils from

64

Antarctica and Brazil. Canadian Journal of Microbiology 50:323 - 33.

Macgregor, B. J., Amann, R. (2006). Single-stranded conformational

polymorphism for separation of mixed rRNAS (rRNA-SSCP), a new

method for profiling microbial communities. Syst. Appl. Microbiol.

EpubAlkBead of print.

Macur, R. E., Wheeler, J. T., Burr, M. D., Inskeep, W. P. (2007). Impacts of

2,4-D application on soil microbial community structure and on populations

associated with 2,4-D degradation. Microbiol. Res. 162:37 - 45.

Magot, M., Ollivier, B., Patel, B. K. C. (2000). Microbiology of petroleum

reservoirs. Antonie van Leeuwenhoek. 77:103 - 16.

Margesin, R., Labbe, D., Schinner, F., Greer, C. W., Whyte, L. G. (2003).

Characterization of hydrocarbon-degrading microbial populations in

contaminated and pristine Alpine soils. Appl. Environ. Microbiol. 69:3085 -

92.

Martin-Laurent, F., Philippot, L., Hallet,S., Chaussod, R., Germon, J. C.,

Soulas, G., Catroux, G. (2001). DNA Extraction from Soils: Old Bias for

New Microbial Diversity Analysis Methods. Appl. Environ. Microbiol. 67:

2354 - 59.

Martiny, J. B., Bohannan, B. J., Brown, J. H., Colwell, R. K., Fuhrman, J. A.,

Green, J. L., Horner-Devine, M. C., Kane, M., Krumins, J. A., Kuske, C.

R., Morin, P. J., Naeem, S., Ovreas, L., Reysenbach, A. L., Smith, V. H.,

Staley, J. T. (2006). Microbial biogeography: putting microorganisms on

the map. Nat. Rev. Microbiol. 4:102 - 12.

Milcic-Terzic, J., Lopez-Vidal, Y., Vrvic, M. M., Saval, S. (2001). Detection of

catabolic genes in indigenous microbial consortia isolated from a diesel-

contaminated soil. Biores. Technol. 78: 47 - 54.

Mumy, K. L., Findlay, R. H. (2004). Convenient determination of DNA

extraction efficiency using an external DNA recovery standard and

quantitative-competitive PCR. J. Microbiol. Methods 57:259 – 68.

Muyzer, G., de Waal E.C., Uitterlinden, A. G. (1993). Profiling of complex

microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis

of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA Appl.

Environ. Microbiol. 59:695 - 700.

Nakatsu, C. H., Torsvik, V, Ovreas, L. (2000). Soil Community Analysis Using

65

DGGE of 16S rDNA Polymerase Chain Reaction Products. Published in

Soil. Sci. Soc. Am. J. 64:1382 - 88.

Narihiro, T., Abe, T., Yamanaka, Y., Hiraishi, A. (2004). Microbial population

dynamics during fed-batch operation of commercially available garbage

composters. Appl. Microbiol. Biotechnol. 65:488 – 95.

Neufeld, J. D.; Mohn, W. W., de Lorenzo, V. (2006). Composition of microbial

communities in hexachlorocyclohexane (HCH) contaminated soils from

Spain revealed with a habitat-specific microarray. Environ. Microbiol.

8:126-40.

Nievas, M. L., Commendatore, M. G., Olivera, N. L., Esteves, J. L., Bucala,

V. (2006). Biodegradation of bilge waste from Patagonia with an

indigenous microbial community. Bioresour. Technol. 97:2280 - 90.

Obuekwe, C., Hourani, G., Radwan, S. (2003). Hydrocarbon bioremediation

potential of an unimpacted Kuwaiti oil-field environment. Acta. Microbiol.

Pol. 52:405 - 17.

Ogram, A., Sayler, G. S., Barkay, T. (1987). The extraction and purification of

microbial DNA from sediments. J. Microbiol. Method. 7:57 - 66.

Orphan, V. J., Taylor, L. T., Hafenbradl, D., Delong, E. F. (2000). Culture-

dependent and culture-independent characterization of microbial

assemblages associated with high-temperature petroleum reservoirs. Appl

Environ. Microbiol. 66: 700 - 11.

Ovreas, L. (2000). Population and community level approaches for analysing

microbial diversity in natural environments. Ecol. Lett. 3:236 - 51.

Pedersen, K. (2000). Exploration of deep intraterrestrial microbial life: current

perspectives. FEMS Microbiology Letters 185:9 - 16

Pepi, M., Minacci, A., Di Cello, F., Baldi, F., Fani, R. (2003). Long-term

analysis of diesel fuel consumption in a co-culture of Acinetobacter

venetianus, Pseudomonas putida and Alcaligenes faecalis. Antonie van

Leeuwenhoek 83:3 - 9.

Pereira, R. C., Soares-Gomes, A. (2002). Biologia Marinha. Editora

Interciência. Rio de Janeiro. 382p.

Polymenakou, P. N., Bertilsson, S., Tselepides, A., Stephanou, E. G.

(2005). Links between geographic location, environmental factors, and

66

microbial community composition in sediments of the Eastern

Mediterranean Sea. Microb. Ecol. 49:367-78.

Robe, P., Nalin, R., Capellano, C., Vogel, T. M., Simonet, P. (2003).

Extraction of DNA from soil. Europ. J. Soil. Biol. 39:183 – 90.

Roling, W. F., Head, I. M., Larter, S. R. (2003). The microbiology of

hydrocarbon degradation in subsurface petroleum reservoirs: perspectives

and prospects. Res. Microbiol. 154:321 - 8.

Rosa, A. P. (2001). Processos de Biorremediação na Mitigação do Impacto

Ambiental, Devido a Eventuais Derrames de Óleo na Bacia de Campos –

Experimentos Laboratoriais. Dissertação de Mestrado, Universidade

Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro - Engenharia de Reservatório

e de Exploração, Rio de Janeiro, RJ, Brasil.

Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a

laboratory manual. 2nd ed. Cold Spring Harbor. Cold Spring Harbor, NY.

Sambrook, J., Russell, D. W. (2001). Molecular Cloning A Laboratory Manual.

Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3. ed. Cold Spring Harbor, NY.

Santos de Oliveira, F. J. (2001). Biorremediação de Solo Arenoso

Contaminado por Óleo Cru. Dissertação de Mestrado, UFRJ (Universidade

Federal do Rio de Janeiro), Rio de Janeiro, RJ, Brasil.

Santos, I. L. V. L. (2006). Prospecção de microrganismos e genes envolvidos

em biodegradação de Petróleo. Dissertação de Mestrado, UFRN

(Universidade Federal do Rio Grande do Norte), Natal, RN, Brasil.

Scherrer, P., Mille, G. (1989). Biodegradation of crude oil in an experimentally

polluted peaty mangrove soil. Mar. Pollut. Bull. 20: 430 - 32.

Schmidt, T. M. (2006). The maturing of microbial ecology. Int. Microbiol. 9:217 -

23.

Sebastian, G. V. (1999). Avaliação da população bacteriana presente em um

reservatório de petróleo situado em águas profundas brasileiras, com

principal ênfase no isolamento e caracterização de estirpes de Bacillus.

Dissertação de Mestrado, UFRJ (Universidade Federal do Rio de Janeiro),

Rio de Janeiro, RJ, Brasil.

Sei, K., Inoue, D., Wada, K., Mori, K., Ike, M., Kohno, T., Fujita, M. (2004).

Monitoring behaviour of catabolic genes and change of microbial

67

community structures in seawater microcosms during aromatic compound

degradation. Water Res. 38:4405 - 14.

Sette, L. D., Simioni, K. C., Vasconcellos, S. P., Dussan, L. J., Neto, E. V.,

Oliveira, V. M. (2006). Analysis of the composition of bactérial

communities in oil reservoirs from a southern offshore Brazilian basin.

Antonie Van Leeuwenhoek.

Shi, S., Bending, G. D. (2007). Changes to the structure of Sphingomonas spp.

communities associated with biodegradation of the herbicide isoproturon in

soil. FEMS Microbiol. Lett. EpubAlkBead of print.

Siciliano, S. D., Germida, J. J., Banks, K., Greer, C. W. (2003). Changes in

microbial community composition and function during a polyaromatic

hydrocarbon phytoremediation field trial. Appl. Environ. Microbiol. 69: 483 -

89.

Sigler, W. V., Zeyer, J. (2004). Colony-forming analysis of bactérial community

succession in deglaciated soils indicates pioneer stress-tolerant

opportunists. Microb. Ecol. 48:316 - 23.

Silva, C. L. V. (2005). Estudos de bactérias redutoras de Ferro (III)

relacionadas com petróleo. Monografia (bacharelado), UFRN

(Universidade Federal do Rio Grande do Norte), Natal, RN, Brasil.

Sin, G., Govoreanu, R., Boon, N., Schelstraete, G., Vanrolleghem, P. A.

(2006). Evaluation of the impacts of model-based operation of SBRs on

activated sludge microbial community.

Smith, D., Alvey, S., Crowley, D. E. (2005). Cooperative catabolic pathways

within an atrazine-degrading enrichment culture isolated from soil. Fems.

Microbiol. Ecol. 53:265 - 73.

Smits, T. H., Balada, S. B., Witholt, B., Van Beilen, J. B. (2002). Functional

analysis of alkane hydroxylases from gram-negative and gram-positive

bacteria. J. Bacteriol. 184:1733 - 42.

Smits, T. H., Röthlisberger, M., Witholt, B., Van Beilen, J. B. (1999).

Molecular screening for alkane hydroxylase genes in Gram-negative and

Gram-positive strains. Environ. Microbiol. 1:307 - 18.

Souza Junior, M. J. (2006). Produção de moléculas Biosurfactantes em

bactérias isoladas de solos de mangue da Bacia Petrolífera Potiguar-RN

(BPP-RN) monografia (bacharelado), UFRN (Universidade Federal do Rio

68

Grande do Norte), Natal, RN, Brasil.

Staijen, I. E., Marcionelli, R., Witholt, B. (1999). The PalkBFGHJKL promoter is

under carbon catabolite repression control in Pseudomonas oleovorans

but not in Escherichia coli alk+ recombinants. J. Bacteriol. 181:1610 - 16

Tam, K., Yang, C. H., Matsumoto, M. R., Crowley, D. E., Sheppard, J. D.

(2005). Comparison of PCR-DGGE and selective plating methods for

monitoring the dynamics of a mixed culture population in synthetic brewery

wastewater. Biotechnol. Prog. 21:712 - 9.

Tanaka, Y., Sogabe, M., Okumura, K., Kurane, R. (2002). A highly selective

direct method of detecting sulphate-reducing bacteria in crude oil. Lett

Appl. Microbiol. 35: 242 - 46.

Tyson, G. W., Banfield, J. F. (2005). Cultivating the uncultivated: a community

genomics perspective. Trends. Microbiol. 13:411 - 15.

Van Beilen, J. B., Smits, T. H. M., Whyte, L. G., Schorcht, S., Röthlisberger,

M., Plaggemeier, T., Engesser, K. H., Witholt, B. (2002). Alkane

hydroxylase homologues in gram-positive strains. Environ. Microbiol. 4:676

- 82.

Van Beilen, J. B., Smits, T. H., Roos, F. F., Brunner, T., Balada, S. B.,

Rothlisberger, M., Witholt, B. (2005). Identification of an amino acid

position that determines the substrate range of integral membrane alkane

hydroxylases. J. Bacteriol. 187:85 - 91.

Van Hamme, J. D., Singh, A., Ward, O. P. (2003). Recent advances in

petroleum microbiology. Microbiol. Mol Biol Rev 67: 503 – 49.

Vomberg, A., Klinner, U. (2000). Distribution of alkB genes within n-alkane-

degrading bactéria. J. Appl. Microbiol. 89:339 - 48.

Watanabe, K., Kodama, Y., Harayama, S. (2001). Design and evaluation of

PCR primers to amplify bactérial 16S ribosomal DNA fragments used for

community fingerprinting. J. Microbiol. Methods 44:253 - 62.

Whyte, L. G., Bourbonnière, L., Greer, C. W. (1997). Biodegradation of

petroleum hydrocarbons by psychotrophic Pseudomonas strains

possessing both alkane (alk) and naphthalene (nah) catabolic pathways.

Appl. Environ. Microbiol. 63:3719 - 23.

Whyte, L. G., Smits, T. H. M., Labbé, D., Witholt, B., Greer, C. W., Van

Beilen, J. B. (2002). Gene Cloning and Characterization of Multiple

69

Alkane Hydroxylase Systems in Rhodococcus Strains Q15 and NRRL B-

16531. Appl. Environ. Microbiol. 68: 5933 - 42.

Xia, S., Wang, F., Fu, Y., Yang, D., Ma, X. (2005). Biodiversity analysis of

microbial community in the chem-bioflocculation treatment process.

Biotechnol. Bioeng. ;89:656 - 9.

Xing, D., Ren, N., Gong, M., Li, J., Li, Q. (2005). Monitoring of microbial

community structure and succession in the biohydrogen production reactor

by denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Sci. China. C. Life Sci.

48:155 - 62.

Xu, X. R., Li, H. B., Gu, J. D. (2007a). Metabolism and biochemical pathway of

n-butyl benzyl phthalate by Pseudomonas fluorescens B-1 isolated from a

mangrove sediment. Ecotoxicol. Environ. Saf. EpubAlkBead of print.

Xu, X. R., Li, H. B., Gu, J. D., Li, X. Y. (2007b). Kinetics of n-butyl benzyl

phthalate degradation by a pure bacterial culture from the mangrove

sediment. J. Hazard Mater 140:194 - 9.

Yeates, C., Gillings, M. R., Davison, A. D., Altavilla, N., Veal, D. A. (1998).

Methods for microbial DNA extraction from soil for PCR amplification. Biol.

Proc. Online 1:40-47.

Yu, S. H., Ke, L., Wong, Y. S., Tam, N. F. (2005). Degradation of polycyclic

aromatic hydrocarbons by a bactérial consortium enriched from mangrove

sediments. Environ. Int. 31:149 - 54.

Zhu, X. Y., Lubeck, J., Kilbane II, J. J. (2003). Characterization of microbial

communities in gas industry pipelines. Appl. Environ. Microbiol. 69:5354 -

5363.

70

CONSIDERAÇÕES FINAIS

A biodegradação aeróbica de petróleo, particularmente alcanos é

amplamente divulgada, já o conhecimento sobre os processos biológicos

envolvidos em microrganismos Gram positivos e Gram negativos é restrito a

poucos gêneros bacterianos, sendo Pseudomonas aeruginosa o organismo

melhor estudado. A grande maioria dos microrganismos possuem a proteína

AlkB ou proteínas homológas, no entanto, os mecanismos e/ou processos

envolvidos na preferência ou capacidade de utilizar alcanos específicos ainda

são pouco conhecidos.

As constantes atualizações e disponibilidade de novas ferramentas na

área de bioinformática, bem como as inclusões de novas informações e

seqüências nucleotídicas nos bancos de dados, e novas descrições

microrganismos alcanotróficos, contribuirão para uma análise in silico mais

abrangente e representativa das variações encontradas nas proteínas AlkB dos

distintos gêneros bacterianos utilizadas neste estudo e possíveis correlações

com a habilidade de utilização de substratos alcanos. Novas avaliações,

incluindo modelagem 3D com outras oxigenases, permitirão obter subsídios

para uma melhor compreensão sobre o possível papel da proteína AlkB na

discriminação de alcanos.

Acessar a biodiversidade microbiana de ambientes naturais e conhecer

a resposta dessas comunidades microbianas perante o impacto por

contaminação com petróleo tem grande relevância para a indústria de petróleo.

Nossos resultados sugerem que o emprego de novas estratégias de

enriquecimento devem ser incorporadas e contribuirão para aperfeiçoar a

detecção molecular de bactérias alcanotróficas. A caracterização de

hidrocarbonetos totais do petróleo utilizado contribuirá para estimar quais

comunidades microbianas nativas possam ser bioestimuladas/selecionadas

nos ensaios de microcosmos. A identificação molecular por sequenciamento de

DNA de alguns amplicons de isolados e/ou OTUs originários de DGGE

contribuirão para o conhecimento da biodiversidade de comunidades

microbianas nativas nos ambientes estudados. na Bacia Petrolífera Potiguar –

RN como também da Mata Atlântica na Reserva Horto Dois Irmãos-PE.