DISTRIBUIÇÃO TEMPORAL, DISTRIBUIÇÃO ESPACIAL E POLIMORFISMO DA ISOENZIMA ALFA-ESTERASE (E.C. 3.1.1.1) EM TRÊS ESPÉCIES DE DROSOFILÍDEOS (INSECTA, DIPTERA)

COMUNS NO CERRADO

JULIANA ALVES THOMÉ

Orientadora: Profa. Dra. Rosana Tidon

Dissertação apresentada para

obtenção do Grau de Mestre em Ecologia

Programa de Pós Graduação em Ecologia Instituto de Ciências Biológicas

Universidade de Brasília

Brasília –DF 2005

“BRIDGEKEEPER: What is the air-speed velocity of an unladen swallow?

ARTHUR: What do you mean? An African or European swallow?

BRIDGEKEEPER: Huh? I-- I don't know that! Auuuuuuuugh! [ explodes and dies]

BEDEVERE: How do know so much about swallows?

ARTHUR: Well, you have to know these things when you're a king, you know.”

MONTY PHYTON in THE HOLY GRAIL

- 2 -

Ao meu querido pai Ricardo Thomé DEDICO.

- 3 -

AGRADECIMENTOS

Gostaria de manifestar minha gratidão a todos aqueles que estiveram

comigo durante esses dois anos, colaborando e incentivando para que mais

uma etapa desse grande sonho de fazer ciência se concretizasse. Quero

agradecer àqueles que tanto me ajudaram, direta ou indiretamente, tornando

esse caminho menos árduo e tão mais alegre. Em especial:

À Profa. Dra. Rosana Tidon, pela orientação competente, atenciosa e

dedicada e principalmente pela confiança a mim depositada.

À Profa. Dra. Maria de Nazaré Guimarães Grisólia, do Laboratório de

Genética, pela colaboração valiosa, me acolhendo e me dando bases firmes em

uma área que a mim era quase desconhecida.

Aos Professores Doutores César Koppe Grisólia e Silviene Fabiana de Oliveira, por me acolherem tão bem no Laboratório de Genética, me fazendo

sentir realmente parte da equipe.

Às colegas Renata, Luciana e Roberta do Laboratório de Evolução, que

me acompanharam em grande parte dessa jornada e ouviram pacientemente

minhas reclamações, e principalmente por todas as “horas do chá”

divertidíssimas.

Aos colegas Arthur, Daniela, Luzirlane e Neda do Laboratório de

Genética pelas proveitosas conversas, risadas e principalmente pelo apoio e

companheirismo ao final desse trabalho.

Ao Dr. Luzitano B. Ferreira da USP de Ribeirão preto pela grande ajuda

em momentos cruciais do trabalho de laboratório, principalmente ao procurar e

enviar prontamente um reagente importante para a continuidade da parte

genética laboratorial.

À Dulce Rocha pela ajuda na elaboração do resumo em inglês.

Ao Seu Antonio Brito, técnico do Laboratório de Evolução, pela

companhia em campo e pelo conhecimento repassado, sem ele as coletas não

teriam acontecido.

À Elisa e Ornil, técnicos do Laboratório de Genética, sempre simpáticos

e prontos a ajudar.

- 4 -

Aos funcionários do Departamento de Ecologia Fabiana e Hugo (ex-funcionário), em primeiro lugar por terem sempre me atendido tão bem, pela

simpatia e pela paciência ao ouvirem de mim sempre a mesma frase: “Vim fazer

umas cópias!”.

Aos colegas de turma da Pós em Ecologia de 2003, pela convivência

maravilhosa, pelas trocas de idéias e pela companhia. Em especial aos amigos

Pablo, Ana Paula e Clarissa pela companhia maravilhosa no Congresso de

Ecologia e pela amizade verdadeira que surgiu depois disso.

À minha avó Maria Amélia Ferreira Thomé por ter sido compreensiva e

amorosa em todos os momentos, tanto os difíceis como os alegres desta

jornada, por entendido e apoiado minha escolha de vida.

Ao Aniello O. G. Gréco Junior, companheiro de todas as horas, ombro,

amigo e conselheiro, que me proporcionou os melhores debates sobre ciência

durante esses últimos dois anos e me fez ver durante esse período que as

coisas na vida são muito simples, nós é que as complicamos.

Agradeço também a agencia de fomento CNPq, pela concessão da bolsa

de estudos e ao Programa de Pós-Graduação em Ecologia da Universidade

de Brasília.

Termino agradecendo a oportunidade de estar aqui, fechando um ciclo,

finalmente.

Muito obrigada.

- 5 -

ÍNDICE

1. Introdução

1

2. Objetivos 5

3. Material e Métodos

3.1 Áreas de Estudo 6 3.2 Espécies Estudadas 8 3.3 Métodos de Coleta 9

3.4 Análise da Alfa-Esterase

10

3.5 Análises Estatísticas 14

4. Resultados

4.1 Flutuação Temporal da Abundância das Espécies 15

4.2 Análises Genéticas 19

5. Discussão

27

I. Drosophila mercatorum 28 II. Drosophila simulans 30 III. Zaprionus indianus 31

IV. Drosophila sturtevanti

32

6. Considerações Finais 33 7. Referência Bibliográfica 35 8. Resumo 40

9. Abstract 41

- 6 -

1. Introdução

A evolução de uma população só acontece quando esta apresenta

variabilidade genética. O exame da variabilidade e por conseqüência da

evolução em populações naturais é baseado na heterozigosidade desta

população, que é definida pela freqüência total de heterozigotos de um dado

lócus. Como estas freqüências são relações genotípicas simples, muito

semelhantes àquelas estudadas por Mendel, muitos dos estudos com

populações estão concentrados nesse tipo de característica observada em

diversos níveis de fenótipo, e abrangendo desde a morfologia externa até

seqüência de aminoácidos em enzimas e proteínas (Suzuki et al., 1992).

Sabe-se que a variabilidade genética está extremamente relacionada com

a história natural das espécies. Conhecer a maneira pela qual a seleção natural,

a ecologia e os ambientes heterogêneos agem e interagem é importante para se

obter uma explicação de como esta variabilidade se mantém em uma

população. O estudo dos processos evolutivos, no contexto da genética de

populações, é baseado no entendimento destas variações (Futuyma, 1992) e

pode explicar a existência e manutenção da variabilidade genética em

populações naturais. Diversos estudos estimam a variação genética mediante a

avaliação de polimorfismos tais como Beardmore (1963), Brncic e Napp (1980),

Hedrik (1986), Valente et al. (1993), Borash et al. (1998), Mateus e Sene (2003),

entre outros, integrando assim as áreas da ecologia e da genética de

populações.

Quando se considera que a variação em isoenzimas pode ser

influenciada pela seleção natural, atribui-se um significado adaptativo para a

mesma, portanto, o estudo evolutivo de isoenzimas não é um estudo de um

conjunto de genes ao acaso e sim de genes que atuam em partes específicas

do metabolismo do indivíduo estudado. O equilíbrio genético da variação de

uma enzima é dependente do balanço entre as taxas de mutação, que criam

variabilidade, e a pressão da seleção que mantém a atividade ótima para a

enzima na via catalítica. O funcionamento de uma via metabólica, portanto,

- 1 -

dependeria de como a enzima ou isoenzima modifica a conformação dos

complexos polienzimáticos (com a mudança da carga elétrica destes, por

exemplo) e como estes passam a atuar e chegam ao produto final desta via

(Alfenas, 1998).

Deve-se entender que a seleção natural atuando sobre o fluxo de uma via

catalítica também está atuando sobre sua eficiência, ou seja, produtividade

versus custo energético de manutenção da enzima e ainda, sobre a

concentração dos metabólitos na célula a cada etapa dessa via (Eanes, 1999).

Admite-se, então, que os alelos de isoenzimas representam variações no

funcionamento (catálise) e estrutura tridimensional da enzima em questão,

causando resposta diferencial em termos fenotípicos (valor adaptativo).

A experimentação usando as técnicas eletroforéticas em proteínas,

surgidas na década de 1960 (Hubby e Lewontin, 1966; Lewontin e Hubby, 1966)

revolucionou a genética de populações. Essas técnicas demonstraram que

diferentes tipos isoenzimáticos, ou seja, formas múltiplas de uma mesma

enzima com afinidade individual para um mesmo substrato, podiam ter

diferentes valores adaptativos, os quais podiam inclusive ser correlacionados

com fatores ambientais (Powers et al., 1991). Tais estudos técnicos trouxeram

importantes informações, pois a análise de isoenzimas forneceria dados

genotípicos de grandes quantidades de loci de uma só vez. Como a eletroforese

de proteínas é uma técnica com marcadores co-dominantes (todos os alelos são

evidenciados), é possível calcular-se coeficientes de endogamia, proporção de

loci polimórficos, freqüências gênicas e genotípicas, heterozigosidade e testar o

equilíbrio de Hardy-Weinberg para as populações estudadas (Solferini e Selivon,

2001). A premissa básica adotada ao se utilizar dados isoenzimáticos é que

diferenças na mobilidade de isoenzimas em um campo elétrico (eletroforese)

são resultantes de diferenças ao nível de seqüências de DNA que codificam tais

enzimas, assim, se os padrões de bandas eletroforéticas de dois indivíduos

diferem, assume-se que estas diferenças possuem base genética e sejam

herdáveis.

Baseando-se nos resultados dos trabalhos de Lewontin e Hubby (1966),

tanto Gillespie e Langley (1974) quanto Futuyma (1992) discutiram a

- 2 -

manutenção do polimorfismo de isoenzimas nas populações usando modelos

teóricos, que dependeriam, intrinsecamente, da intensidade da seleção natural e

de sua variância sob flutuações ambientais. A idéia era de que, em ambientes

variáveis e heterogêneos, o polimorfismo de uma população se manteria com

maior facilidade e isso se daria possivelmente pela variação dos valores

seletivos dos genótipos, que mudariam de acordo com a alteração ambiental

(Roughgarden, 1996). Existiria, portanto, uma forte conexão entre ambientes

heterogêneos e manutenção da variabilidade genética.

A presença de variação ambiental seja temporal ou espacial, se torna

particularmente interessante se os valores seletivos mudam de “direção” de

geração para geração, explorando o modelo de um ambiente em mudança

dentro de uma geração da população em vez de estar em um estado fixo, sendo

os genótipos caracterizados como um grupo de valores constantes de

adaptabilidade. Muitos locais possuem estações climáticas extremas ou severas

tais como uma baixa temperatura e umidade ou ainda queimadas constantes

havendo, presumivelmente, genes beneficiados durante estas condições não

usuais que não seriam favorecidos durante condições regulares (Roughgarden,

1996). Nesses locais, a variação ambiental poderia alterar as pressões seletivas

sobre os alelos dos indivíduos da população ao longo do tempo, provavelmente

mantendo o polimorfismo genético da população.

Mateus e Sene (2003), baseando-se na teoria dos ambientes

heterogêneos observaram variação intrapopulacional em Drosophila antonietae,

uma espécie cactofílica da América do Sul, e observaram influência ambiental

(precipitação) ao analisarem a variação enzimática dentro dessas populações.

Outro exemplo baseado em adaptações a ambientes extremos pode ser

observado em Gibert et al. (1998) onde analizou-se as curvas de norma de

reação de pigmentação de abdomens e tórax de indivíduos de duas populações

de Drosophila melanogaster em altas temperaturas. Os resultados obtidos

destas análises indicaram que devido às alterações na forma das curvas de

norma de reação, havendo uma provável reatividade entre pigmentação e

temperatura ambiental.

Dentro desse contexto, a utilização de isoenzimas do tipo hidrolases para

- 3 -

a observação de variação genética ligada a mudanças ambientais em

invertebrados, entre eles drosófilas, é amplamente empregada. O termo

hidrolase engloba enzimas que catalisam a adição de elementos da água em

ligações que conectam as subunidades monoméricas em algumas

macromoléculas. A água e o dióxido de carbono (CO2) são produtos terminais

da oxidação dos combustíveis como a glicose, por exemplo, e essa “água

metabólica” formada a partir dos alimentos estocados é suficiente para permitir

que alguns animais característicos de habitats muito secos, sobrevivam sem

tomar água por longos períodos (Lehninger et al., 1995).

As esterases estão contidas no conjunto das hidrolases e têm a

propriedade de catalisar as ligações ésteres em variados substratos tendo

nesse sentido, semelhança às colinesterases (colesterol) e carboxilesterases

que são encontradas e amplamente estudadas nos humanos (Stryer, 1996). Nos

insetos estas isoenzimas estão relacionadas a diversos processos metabólicos,

tais como digestão de alimentos, degradação de inseticidas organofosforados,

além da degradação de ferormônios e controle do hormônio juvenil (ADH), pela

hidrolise de seu grupo metil-ester. As carboxil /colinesterases são uma família

de grande importância e englobam todas as esterases de Drosophila já

seqüenciadas até o momento. As alfa–esterases (objeto de nosso estudo), da

família carboxil/colinesterase, têm sido caracterizadas em várias espécies de

drosofilídeos (Healy et al., 1991; Lapenta et al., 1995) e suas atividades vem

sendo determinadas também para várias espécies de drosofilídeos, inclusive

relacionando-as com variação temporal (Brncic e Napp, 1980; Pereira et al.,

1981; Carrasco et al., 1984; Mateus e Sene, 2003), entretanto, sua distribuição

tecidual parece ser conhecida apenas para adultos (Lunday e Farmer, 1983).

- 4 -

2. Objetivos

Nesse contexto, os objetivos deste trabalho são:

1. Investigar a distribuição temporal e espacial na abundância de quatro

espécies de drosofilídeos, no período de um ano.

2. Investigar a distribuição temporal e espacial na variabilidade genética

de alelos de três espécies de drosofilídeos, no período de um ano.

- 5 -

3. Material e Métodos

3.1 Áreas de Estudo

Os cerrados são as savanas mais ricas do mundo, exibindo uma grande

diversidade de climas e solos que se reflete em uma impressionante diversidade

genética, formando ecossistemas únicos (Dias, 1985). A região do Distrito

Federal pertence à área nuclear da região do cerrado contínuo, porção central

de um complexo de vegetação que ocupa quase um quarto da superfície do

território brasileiro. Encontram-se, no Distrito Federal, todos os tipos de

vegetação comumente englobados sob o termo cerrado, que encerra uma gama

de aspectos naturais que vão desde o cerrado limpo, muito aberto, até o cerrado

com arvores de porte elevado e alta densidade (Dias, 1985).

O clima do Distrito Federal enquadra-se entre os tipos tropical de savana

e temperado chuvoso de inverno seco, caracterizando-se pela existência bem

nítida de duas estações: uma chuvosa e quente que se prolonga de outubro a

abril, e outra fria e seca que vai de abril a setembro. A temperatura média anual

varia de 18 a 20 0C, sendo que os meses de setembro e outubro são os mais

quentes, com temperaturas medias variando entre 20 e 22 ºC, podendo o

Cerrado do DF ser descrito como um bioma que tem variações sazonais

regulares em sua estrutura temporal, ou seja, possuindo padrões climáticos

bastante constantes.

I. Reserva Ecológica do IBGE (RECOR)

A Reserva Ecológica do IBGE (RECOR) está situada a 35 km ao sul do

centro de Brasília - Distrito Federal-DF, no km zero da BR 251, na estrada de

acesso à cidade de UNAÍ-MG, com coordenadas geográficas de 150 56’ 41 “S e

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470 53’ 07” W. A RECOR faz limites à nordeste e noroeste com o Jardim

Botânico de Brasília, a sudeste com a Fazenda Água Limpa e a sudeste com a

BR-251.

A RECOR é parte da área de Proteção Ambiental (APA) Gama-Cabeça

de Veado e além disso, a RECOR é uma das áreas núcleo da Reserva Biosfera

do Cerrado, criada em 1993 pela UNESCO.

A reserva contém grande parte das fitofisionomias do Cerrado,

representando bem o bioma em questão e foi considerada, por suas

características preservadas, o local de coleta de menor ação antrópica.

II. Cerrado da Universidade de Brasília (CO) Localizado na Universidade de Brasília, o cerrado da Casa do Estudante

Universitário (CEU), constitui-se numa pequena área protegida, porém,

constituída por vegetação de cerrado não preservada, além de espécies

introduzidas (especialmente gramíneas). Próximas ao local, existem edificações

residenciais e há acesso de pessoas, sendo a visitação pública permitida

Considerando-se as características de urbanização do local, comparada

com os outros dois locais, o CO foi classificado como um local de média

urbanização.

III. Áreas Octogonais (Condomínios)

Localizada no Distrito Federal-DF, na Região Administrativa XI-Cruzeiro,

o Setor de Habitações Coletivas - Áreas Octogonais (SHC, AO/Sul), é formado

por oito quadras em forma de octógono e localiza-se entre Cruzeiro Novo, Setor

Sudoeste e Setor de Indústrias. As Áreas Octogonais constituem-se de prédios

residenciais com áreas arborizadas ao redor de pequenos fragmentos de

cerrado antropizado e com vegetação composta basicamente de espécies

introduzidas. Considerou-se devido suas característicasde urbanização o local

de maior ação antrópica.

- 7 -

3.2 Espécies estudadas

A família Drosophilidae deriva da subordem dos dípteros Cyclorrapha,

sendo primitivamente saprofíticas, vivendo em substratos fermentados. Das

mais de três mil espécies nos 61 gêneros da família, cerca de duas mil estão no

gênero Drosophila.

Drosophila é um gênero de fácil cultivo em laboratório e provou ser

altamente versátil no desenvolvimento da genética moderna de populações,

mostrando uma detalhada correlação entre desenvolvimento genético e

citológico (Parsons, 1973). São moscas pequenas, numerosas e com um ciclo

de vida curto, além de serem fáceis de coletar e manipular (Powell, 1997). Por

serem extremamente sensíveis a mudanças nas condições existentes de seus

habitats e ter uma história evolutiva de grande capacidade de se adaptar a

condições climáticas muito diversas, drosofilídeos são modelos bem adequados

ao estudo de ecologia evolutiva (Herrewege e David, 1997).

Drosophila mercatorum pertence ao grupo repleta, subgênero Drosophila,

e com base na morfologia dos cromossomos metafásicos e na distribuição

geográfica a espécie é dividida em duas subespécies: Drosophila mercatorum

mercatorum, que ocorre no Peru, Colômbia, América Central e do Norte, Havaí,

Austrália, África, Europa e Ásia, geralmente estando associada ao homem e

sendo endêmica da região Neotropical; e a Drosophila mercatorum pararepleta,

que ocorre ao leste dos Andes, em áreas de vegetação aberta, áreas secas e

matas.

Drosophila sturtevanti faz parte do grupo saltans, o qual apresenta

acentuada variação sazonal segundo Sene et al. (1981). É uma espécie

neotropical, amplamente distribuída na América Central e do Sul, ocorrendo em

diferentes domínios morfoclimáticos, e tendo grande afinidade pelos cerrados

(Sene et al., 1980). Drosophila mercatorum e Drosophila sturtevanti são as duas

espécies endêmicas mais abundantes no bioma cerrado.

Drosophila simulans pertence ao grupo melanogaster, subgênero

Sophophora e é umas das espécies introduzidas na região Neotropical que

melhor se adaptou, colonizando diferentes regiões fitogeográficas. É freqüente

- 8 -

em regiões abertas onde em muitas coletas é a mais abundante, principalmente

nos meses mais secos do ano (Sene et al., 1980; Tidon-Sklorz e Sene, 1992;

Tidon, 2005).

Zaprionus indianus é um díptero pertencente ao subgênero Zaprionus e é

a espécie desse gênero mais comum na África. Segundo Vilela (1999) o

primeiro registro dessa espécie em território sul-americano foi no ano de 1990 e

desde então tem colonizado diversas regiões do País sendo considerada uma

espécie invasora muito bem adaptada às condições peculiares da região do

Cerrado (Tidon et al., 2003)

3.3 Métodos de Coleta

Em cada local foram colocadas ao acaso 30 armadilhas, as quais foram

construídas a partir de latas com aproximadamente 15 cm de altura, possuindo

vários furos de aproximadamente um centímetro de diâmetro para permitir a

entrada das drosófilas (Sene et al., 1980; Tidon et al., 2003). As armadilhas

foram fixadas em troncos de árvores, preferencialmente em locais sombreados

e na altura média de um metro e meio do chão para evitar o super aquecimento

do ambiente dentro da armadilha.

No interior de cada armadilha foi colocada uma mistura de banana,

laranja e fermento biológico, que funcionou como isca para atrair os insetos. As

drosófilas foram coletadas após dois a três dias, com o auxilio de redes

entomológicas, e transferidas para frascos devidamente etiquetados. O

procedimento foi repetido a cada três meses, a partir de julho de 2003 até abril

de 2004.

No laboratório, as moscas foram imobilizadas com auxilio de CO2 e os

indivíduos de Drosophila mercatorum, Drosophila simulans, Drosophila

sturtevanti e Zaprionus indianus que ocorrem na região foram separados dos

demais indivíduos coletados, através da observação da morfologia externa e/ou

analise da genitália masculina, um excelente caráter diagnóstico para a

identificação das espécies desse grupo (Vilela, 1983). As fêmeas de Drosophila

mercatorum são crípticas com as de Drosophila paranaensis, portanto, a

- 9 -

identificação final dessa espécie só pôde ser obtida para as fêmeas que

ovopositaram e produziram prole masculina.

Os indivíduos parentais, após a triagem de morfologia externa,

pertencentes às espécies citadas, foram congelados e posteriormente

macerados, sendo utilizados nos zimogramas.

3.4 Análise da Alfa-Esterase

O conjunto de bandas coradas que uma enzima forma no gel é chamado

de zimograma. Quando se deseja examinar processos evolutivos que atuam em

uma população, podem-se utilizar como marcadores os loci e os respectivos

alelos identificados pela interpretação do zimograma.

Para a tipagem dos zimogramas as fêmeas coletadas das espécies

Drosophila mercatorum, Drosophila simulans e Zaprionus indianus foram

separadas dos demais e acondicionadas em vidros individuais (uma fêmea em

cada vidro) de onde se obteve uma prole F1 usada para observação dos

genótipos parentais. Foram amostrados aproximadamente 40 indivíduos de

cada espécie, para cada local e para cada período de coleta. Depois dos

zimogramas feitos, o total de indivíduos tipados foi de 1128.

Os zimogramas para Drosophila sturtevanti não foram determinados

devido à dificuldade do desenvolvimento de um protocolo de eletroforese e

coloração adequadas, dentro do período deste estudo.

Para confecção dos zimogramas foram utilizados géis de poliacrilamida a

10% para Drosophila mercatorum e Drosophila simulans e a 12% para

Zaprionus indianus como descritos no quadro 1.

- 10 -

Quadro1. Sistema eletroforético utilizado.

Sistema

Poliacrilamida 10% (D.mercatorum e Drosophila simulans)

Poliacrilamida 12% (Zaprionus indianus)

Tampão de Amostra

0.242g Tris +2 ml Glicerol + 0.2 ml Azul de Bromofenol a

0.01% . Completar para 20 ml.

pH 6.3 (Drosophila mercatorum e Zaprionus indianus)

pH 8.8 (Drosophila simulans)

Tampão do Gel 18.71g Tris. Completar para 100 ml. pH 8.8.

Tampão do Eletrodo 1.15g Tris + 7.21g Glicina. Completar para 1 litro. pH 8.3.

Isoenzima analisada 1-naftil acetato (alfa-esterase)

Nas corridas eletroforéticas, foram utilizados homogeneizados individuais

dos indivíduos coletados da natureza em 40 µL de tampão de amostra (gelado)

para Drosophila mercatorum e Zaprionus indianus e 20 μL de tampão de

amostra (gelado) para Drosophila simulans, centrifugando-se por 5 minutos a

12.000 rpm. Dos 40µL / 20 μL centrifugados de cada indivíduo, 15 µL foram

aplicados nos poços dos géis de poliacrilamida.

Após a corrida eletroforética de 5 horas a 200 V para Drosophila

mercatorum, 6 horas a 200 V para Drosophila simulans e 12 horas a 45 V para

Zaprionus indianus os géis foram submetidos à coloração específica para

esterase, modificada de Lapenta (1998), como descrito abaixo.

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A. Coloração para os Géis de Poliacrilamida

Para cada gel foi utilizado o seguinte protocolo desenvolvido para este

trabalho partindo de Pereira (1979) e Lapenta (1998).

a. Tampões de Coloração

FOSFATO A - 26.4g/L de Fosfato de Sódio Monobásico 0,17M pH 6.2

FOSFATO B - 56,65g/L de Fosfato de Sódio Dibásico 0.15M pH 6.2

aa. Soluções Estoque Alfa-naftil acetato - 1g alfa-naftil diluído em 25 ml de acetona mais25 ml

de água destilada

b. Solução Corante para Drosophila mercatorum

Em uma cuba de vidro adiciona-se: 75 ml de Fosfato A mais 25 ml de

Fosfato B (preparados anteriormente, separando-se 30ml do total para uso

posterior) mais 3 ml de solução de alfa-esterase. Manter o gel por 30 minutos a

37o C no escuro.

Adicionar após os 30 minutos os 30 ml de Tampão Fosfato separados

anteriormente, adicionados de 10 ml de Álcool Isopropílico e 200 mg de Fast

Blue (RR) Salt (filtrar em algodão). O gel revela-se em aproximadamente duas

horas, sob agitação constante.

- 12 -

c. Solução Corante para Drosophila simulans

Em uma cuba de vidro adiciona-se: 75 ml de Fosfato A mais 25 ml de

Fosfato B (preparados anteriormente, separando-se 30ml do total para uso

posterior) mais 4 ml de solução de alfa-esterase. Manter o gel por 30 minutos a

37o C no escuro.

Adicionar os 30 ml de Tampão Fosfato separados anteriormente,

adicionados de 30 ml de Álcool Isopropílico e 300 mg de Fast Blue (RR) Salt

(filtrar em algodão). O gel revela-se em aproximadamente seis horas, sob

agitação constante.

d. Solução Corante para Zaprionus indianus

Em uma cuba de vidro adiciona-se: 75 ml de Fosfato A mais 25 ml de

Fosfato B mais 4 ml de solução de alfa-esterase. Diluir em 30 ml de Álcool

Isopropílico 150 mg de Fast Blue (RR) Salt e misturar na solução anterior.

Manter o gel por 30 minutos a 37o C no escuro. O gel revela-se em

aproximadamente quatro horas, sob agitação constante.

Após a coloração os géis são tratados com uma solução fixadora de

ácido acético, álcool etílico comercial e água destilada na proporção de 2:1:8

durante 2 horas. Após esse procedimento o gel é fotografado e fixado em

glicerol 10%, sendo seco em papel celofane como descrito em Alfenas (1998).

e. Interpretação dos Géis

Os alelos de cada loco foram numerados de acordo com a mobilidade

relativa de suas aloenzimas em cada sistema enzimático específico. O alelo de

maior freqüência foi designado de 1,00 e aos demais se atribuiu valores

arbitrários de acordo com as migrações mais lentas e mais rápidas, baseadas

em Pereira (1979).

- 13 -

3.5 Analises Estatísticas

I. Cálculo da Densidade Relativa

Obtivemos o cálculo da densidade relativa de cada espécie estudada

através da divisão da abundância da própria espécie em três áreas diferentes ao

longo de quatro coletas trimestrais sobre o número total de drosofilídeos

coletados nesse período.

II. Regressão

O calculo da regressão foi gerado usando-se o pacote estatístico

SYSTAT (Wilkinson, 1990). Calculou-se a regressão linear entre a abundância

de cada espécie e variáveis climáticas (umidade relativa do ar e temperatura

média) (IBGE, 2005).

III. Analises Genéticas

Para a verificação de variação eletroforética nas populações estudadas

foi utilizado o programa BIOSYS (Swofford e Selander, 1989), calculando-se

frequências alélicas, distribuição genotípica, equilibrio de Hardy-Weinberg e

heterozigozidade média das amostras a partir dos dados obtidos pelos

zimogramas.

- 14 -

Nas figuras 3 e 4 temos os gráficos da variação da umidade relativa do ar

e precipitação respectivamente. Estes dados foram obtidos acessando a base

de dados da estação climatológica da reserva ecológica do IBGE, nos anos de

2003 e 2004 (IBGE,2005).

Através da análise da regressão linear encontrou-se resultados

significativos apenas para a relação entre umidade e abundância total da

espécie Drosophila sturtevanti, como descrito na tabela 2 e figura 2.

A tabela 1 e a figura 5 mostram as relações entre a abundância relativa

de cada espécie nas sucessivas coletas, e a amplitude dessas variações dentro

da população. A figura 1 mostra a flutuação na freqüência relativa de cada

espécie ao longo do tempo.

No total, foram coletados 11.403 indivíduos neste trabalho, dos quais

aproximadamente 10% foram analisados geneticamente. As quatro espécies de

drosofilídeos mais abundantes (Zaprionus indianus, Drosophila simulans,

Drosophila sturtevanti e Drosophila mercatorum) corresponderam

conjuntamente a 75.93% da amostra capturada. As outras espécies não foram

separadas morfológica ou geneticamente.

4.1 Flutuação Temporal da Abundância das espécies 4. Resultados

- 15 -

† A medida da Estimativa de Afunilamento se dá pela divisão do maior valor de abundância pelo menor valor de abundância em cada local coletado

Tabela 1. Abundância relativa (%) dos drosofilídeos coletados, em três áreas diferentes do DF ao longo de quatro coletas trimestrais.

D. mercatorum D. simulans Z. indianus D. sturtevanti

COLETA CO CND REC CO CND REC CO CND REC CO CND REC

Julho 2003 28 08 30 26 45 03 24 12 94 05 0,2 11 Outubro 2003 06 04 25 58 64 10 26 15 31 01 0,2 14 Janeiro 2004 09 21 32 02 04 10 47 28 38 29 17 07 Abril 2004 07 03 01 07 06 31 33 47 28 45 03 21 TOTAL 11 08 21 17 29 14 39 27 51 24 04 14 Afunilamento† 4,52 4,12 26,2 11,6 20,8 9,8 16,4 5,1 4,7 70,3 68,5 4,9

Tabela 2. Resultados das regressões lineares (R2) para variáveis climáticas e espécies de drosofilídeos coletados, em três áreas diferentes do DF ao longo de quatro coletas trimestrais.

Temperatura Umidade Drosophila mercatorum 0,1671 0,027 Drosophila sturtevanti 0,1896 0,9655*

Drosophila simulans 0,6853 0,5572 Zaprionus indianus 0,6617 0,584 *p < 0,05

- 16 -

Figura1. Freqüência de quatro espécies de drosofilídeos ao longo de quatro coletas trimestrais em três áreas diferentes.

A- D. mercatorum, B-D. simulans, C- D. sturtevanti, D- Z. indianus.

A

00,10,20,30,40,50,6

7

jul/03 out/03 jan/04

Freq

uênc

ia

B

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

jul/03 out/03 jan/04 abr/04

Tempo

Freq

uênc

ias

0,

abr/04

Tempo

CO COND IBGE

C

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

jul/03 out/03 jan/04 mai/04Tempo

Freq

uênc

ia

D

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

out/03 n/04 mai/04

Tempo

Freq

uênc

ia

jul/03 ja

- 17 -

abr/04

jan/04

out/03

jul/03

0 55 60 65 70 75 80 85 90

Umidade relativa (%)

0

300

600

900

5

Abu

ndân

cia

D. s

turt

evan

ti

Figura 2. Linha de tendência (regressão) plotada a partir da relação entre a

abundância total da espécie Drosophila sturtevanti e a umidade relativa do ar

em quatro períodos de coleta consecutivos. Y=25,359-1358 R2=0,9655

p=0,017

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

A M J J A S O N D J F M A

Tempo (Meses)

Um

idad

e R

elat

iva

do A

r (%

)

Figura4. Variação tempor

de 2003 a a

al na umidade relativa do ar na RECOR, entre os meses de abril

bril de 2004. Meses de coleta.

18

19

20

21

22

23

24

25

A M J J A S O N D J F

Tempo (

Tem

pera

tura

Méd

ia

(°C)

Figura3. Variação temporal na temperatura média medida na RECOR, entre os meses

abril de 2003 a abril de 2004. Meses de coleta

M A

meses)

de

0%

20%

40%

60%

80%

100%

CO CND REC

Locais de col

Abu

ndân

cia

Rel

ativ

a (%

)

eta

Figura5. Abundância relativa total (%) de quatro espécies de drosofilídeos em três

áreas diferentes do DF. D.mercatorum D.simulans Z.indianus D.sturtevanti-18-

4.2 Analises Genéticas

Primeiramente foi observado durante a confecção dos zimogramas que

os indivíduos congelados das espécies Zaprionus indianus, D. simulans e D.

mercatorum com tempo de coleta superior a um ano apresentaram perda de

atividade enzimática ao serem submetidos à analise eletroforética , o que foi

resolvido fazendo-se alterações nos protocolos, resultando portanto, nos

protocolos de coloração utilizados neste estudo.

Cada umas das espécies analisadas (Zaprionus indianus, D. simulans e

D. mercatorum), pareceu mostrar três loci para alfa-esterase, dos quais dois

revelariam variabilidade. Entretanto, a amostra obtida para o segundo loco,

apesar de parecer mostrar variabilidade, foi de baixa freqüência em sua

expressão enzimática, e devido a isso não foi possível analisa-la neste estudo,

sendo observados apenas um loco para cada espécie.

As tabelas de 3 a 5 mostram para cada uma das espécies, o nível de

significância do teste de equilíbrio de Hardy-Weinberg (p), assim como a

freqüência de cada alelo observado, a heterozigosidade média e a média das

heterozigosidades com seu respectivo desvio padrão.

Observamos nas tabelas de 5 a 7 os padrões de migração eletroforética

de cada uma das espécies (D. mercatorum, D. simulans e Z. indianus), onde

observamos os alelos amostrados. A nomenclatura dos alelos foi baseada em

Pereira (1979).

Nas figuras 6 a 8 observa-se o padrão isoenzimático geral de migração

da alfa-esterase em D. mercatorum, D.simulans e Z.indianus e nas figuras de

6.1 a 8.1, observamos os padrões de alfa-esterase no loco EST-1.

Nas figuras de 9 a 11 observa-se a oscilação temporal nas freqüências

dos alelos encontrados para cada uma das espécies descritas, além da

heterozigosidade média nos diferentes locais e períodos de coletas

consecutivas.

- 19 -

Tabela 3. Local e período de coleta, número de indivíduos, período de coletas, nível de significância para H-W†, freqüência dos alelos observados e heterozigosidade para D. mercatorum.

D. mercatorum ALELOS

Local Período

N p

A B C D E

H

Jul. 2003 24 0,228 0,292 0,313 0,208 0,104 0,083 0,458

Out. 2003 30 0,952 0,567 0,050 0,183 0,067 0,133 0,567

Jan. 2004 30 0,996 0,583 0,150 0,050 0,200 0,017 0,633 REC

OR

Abr. 2004 10 0,999 0,150 0,250 0,350 0,050 0,200 0,800

Jul. 2003 43 0,111 0,419 0,233 0,070 0,058 0,221 0,628

Out. 2003 37 0,022* 0,122 0,203 0,365 0,216 0,095 0,595

Jan. 2004 37 0,421 0,514 0,095 0,230 0,054 0,108 0,459

CO

Abr. 2004 29 0,008** 0,345 0,259 0,259 0,138 0,000 0,483

Jul. 2003 34 0,380 0,471 0,103 0,191 0,103 0,132 0,588

Out. 2003 30 0,862 0,583 0,083 0,150 0,117 0,067 0,433

Jan. 2004 37 0,912 0,081 0,486 0,095 0,216 0,122 0,378

CO

ND

OM

ÍNIO

Abr. 2004 40 0,033* 0,375 0,438 0,013 0,112 0,063 0,425

Média da heterozigosidade X = 0,53725 ± 0,114532

* p<0,05 **p< 0,01 / †= Equilíbrio de Hardy-Weinberg / A- alelo 1.00, B- alelo 0.95, C- alelo 0.90, D- alelo 0.85, E- alelo 1.05

- 20 -

Tabela 4. Local e período de coleta, número de indivíduos, período de coletas, nível de significância para H-W†, freqüência dos alelos observados e heterozigosidade para D.simulans.

* p<0,05 **p< 0,01 / †= Equilíbrio de Hardy-Weinberg / A- alelo 1.00, B- alelo 0.95, C- alelo 0.90, D- alelo 0.85, E- alelo 1.05

D. simulans ALELOS H

Local Período

N p

A B C D

Jul. 2003 26 0,000** 0,600 0,133 0,067 0,200 0,200

Out. 2003 33 0,008** 0,773 0,152 0,061 0,015 0,152

Jan. 2004 23 0,000** 0,630 0,109 0,261 0,000 0,043 IBG

E

Abr. 2004 22 0,365** 0,727 0,159 0,114 0,000 0,273

Jul. 2003 29 0,003** 0,569 0,207 0,224 0,000 0,276

Out. 2003 39 0,868 0,705 0,013 0,128 0,154 0,359

Jan. 2004 45 0,000** 0,656 0,000 0,189 0,156 0,200

CO

Abr. 2004 21 0,224 0,500 0,143 0,214 0,143 0,429

Jul. 2003 36 0,921 0,736 0,014 0,069 0,181 0,444

Out. 2003 14 0,293 0,643 0,000 0,286 0,071 0,286

Jan. 2004 28 0,161 0,643 0,179 0,054 0,125 0,321

CO

ND

OM

ÍNIO

Abr. 2004 26 0,000** 0,519 0,346 0,058 0,077 0,115

Média da heterozigosidade X = 0,258166667± 0,116896559

* p<0,05 ** p< 0,01 / †= Equilíbrio de Hardy-Weinberg / A- alelo 1.00, B- alelo 1.05, C- alelo 0.90, D- alelo 0.75.

- 21 -

Tabela 5. Local de coleta, número de indivíduos, período de coletas, nível de significância para H-W†, freqüência dos alelos observados e heterozigosidade para Zaprionus indianus.

* p<0,05 **p< 0,01 / †= Equilíbrio de Hardy-Weinberg / A- alelo 1.00, B- alelo 0.95, C- alelo 0.90, D- alelo 0.85, E- alelo 1.05

Z. indianus ALELOS H

local período

N p

A B C D

Jul. 2003 36 0,000** 0,542 0,069 0,278 0,111 0,167

Out. 2003 28 0,003** 0,464 0,143 0,232 0,161 0,393

Jan. 2004 26 0,002** 0,596 0,077 0,096 0,231 0,308 IBG

E

Abr. 2004 35 0,000** 0,400 0,257 0,214 0,129 0,229

Jul. 2003 20 0,800 0,300 0,175 0,225 0,300 0,600

Out. 2003 17 0,032* 0,441 0,294 0,118 0,147 0,235

Jan. 2004 32 0,000** 0,578 0,156 0,109 0,156 0,250

CO

Abr. 2004 56 0,170 0,265 0,205 0,220 0,311 0,563

Jul. 2003 34 0,065 0,456 0,147 0,147 0,250 0,441

Out. 2003 30 0,002* 0,550 0,167 0,133 0,150 0,300

Jan. 2004 29 0,111 0,414 0,052 0,207 0,328 0,448

CO

ND

OM

ÍNIO

Abr. 2004 58 0,020* 0,379 0,310 0,267 0,043 0,448

Média da heterozigosidade X= 0,365166667 ± 0,132308247

p<0,05 **p< 0,01 / †= Equilíbrio de Hardy-Weinberg / A- alelo 1.00, B- alelo 0.94, C- alelo 0.80, D- alelo 0.75.

- 22 -

Figura 6. Migração eletroforética dos alelos de alfa-esterase para Drosophila

mercatorum. A - alelo 1.00, B - alelo 0.95, C - alelo 0.90, D - alelo 0.85, E - alelo 1.05 .

Figura 7. Migração eletroforética dos alelos de alfa-esterase para Drosophila simulans. A - alelo 1.00, B - alelo 1.05, C - alelo 0.90, D - alelo 0.75.

Figura 8. Migração eletroforética dos alelos de alfa-esterase para Zaprionus indianus. A - alelo 1.00, B - alelo 0.94, C - alelo 0.80, D - alelo 0.75.

- 23 -

- 24 -

Figura 6.1. Migração eletroforética dos alelos do loco 1 (EST-1) para Drosophila mercatorum. A - alelo 1.00, B - alelo 0.95, C - alelo 0.90, D - alelo 0.85, E - alelo 1.05 .

+

A

B

D

E

C

-

A B

C

D

-

+ Figura 7.1. Migração eletroforética dos alelos do loco 1 (EST-1) para Drosophila simulans. A - alelo 1.00, B - alelo 1.05, C - alelo 0.90, D - alelo 0.75.

A B

C

D

-

+Figura 8.1. Migração eletroforética dos alelos do loco 1 (EST-1) para Zaprionus indianus. A - alelo 1.00, B - alelo 0.94, C - alelo 0.80, D - alelo 0.75.

Figura 9. Oscilação temporal das freqüências alélicas e da heterozigosidade em Drosophila mercatorum. A- alelo 1.00, B- alelo 0.95, C- alelo 0.90, D- alelo 0.85, E-

alelo 1.05, F- heterozigosidade.

A

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

jul/03 out/ 3 jan/04 abr/04

Tempo

Freq

uênc

ia

0

D

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

jul/03 out/0 jan/04 abr/04Tempo

Freq

uênc

ia

3

E

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

jul/03 out/03 jan/04 abr/04Tempo

Freq

uenc

ia

C

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

jul/03 out/03 jan/04 abr/04

Tempo

Freq

uênc

ia

B

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

jul/03 out/03 jan/04 abr/04

TempoFr

equê

ncia

F

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

jul/03 out/03 jan/04 abr/04

Tempo

Het

eroz

ig. M

édia

IBGE CO CONDOMÍNIOS- 24 -

C

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

jul/03 out/03 jan/04 abr/04

Tempo

Freq

uênc

ia

Figura 10. Oscilação temporal das freqüências alélicas e da heterozigosidade em Drosophila simulans. A- alelo 1.00, B- alelo 1.05, C- alelo 0.90, D- alelo 0.75,

E- heterozigosidade.

D

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

jul/03 out/03 jan/04 abr/04

Tem po

Freq

uênc

ia

B

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

jul/03 out/03 jan/04 abr/04Tem po

Freq

uênc

ia

A

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

jul/03 ou 03 jan/04 abr/04

Tem po

Freq

uênc

ia

t/

E

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

jul/03 out/03 jan/04 abr/04

TempoH

eter

ozig

. méd

ia

- 25 -IBGE CO CONDOMÍNIOS

C

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

jul/03 out/03 jan/04 abr/04

Tempo

Freq

uênc

ia

- 26 -

E

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

jul/03 out/03 jan/04 abr/04

Tempo

Het

eroz

ig. m

édia

D

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

jul/03 out/03 jan/04 abr/04

Tempo

Freq

uênc

ia

v

A

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

jul/03 out/03 jan/04 abr/04

Tempo

Freq

uênc

ia

B

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

jul/03 out/03 jan/04 abr/04

Tempo

Freq

uênc

ia

Figura 11. Oscilação temporal das freqüências alélicas e da heterozigosidade em Zaprionus indianus. A - alelo 1.00, B - alelo 0.94, C - alelo 0.80, D - alelo 0.75,

E- heterozigosidade.

CONDOMÍNIOSCOIBGE

5. Discussão

Sabemos que a heterogeneidade temporal difere da heterogeneidade

espacial, pois, um indivíduo pode mover-se entre as partes do espaço, porém,

não entre as partes do tempo. Embora não possa escolher entre os ambientes

temporais, pode escolher seu comportamento diante as condições que encontra

em qualquer tempo em particular, e algumas vezes, essa sua “escolha”, pode

assumir uma forma evolutiva. A variação temporal requer uma resposta flexível

por parte do organismo que a sofre, cuja natureza depende do curso do tempo,

da previsibilidade e da amplitude de sua variação (Ricklefs, 1996; Futuyma,

1992).

Dentro das populações, os indivíduos podem variar de gênero, forma,

idade, genótipo, e os efeitos acumulados por variações provocadas pelo acaso

influem em como os indivíduos dessa população reagem, ocasionando

diferentes dinâmicas populacionais (Odum, 1988; Ricklefs, 1996; Huston, 1994).

Devido a essas dinâmicas mudarem com o tempo e o espaço a percepção que

se tem de uma população depende de quando e onde ela é observada.

Devido às condições ecológicas variarem espacialmente, a dinâmica de

populações individuais pode diferir de um lugar para o outro, pois, a distância

pode isolar as populações, mesmo estas sendo da mesma espécie, fazendo

com que estas se comportem, pelo menos parcialmente, independentemente

(Huston, 1994).

Sabemos que há uma variedade enorme nas diferenças existentes entre

um ambiente e outro, fazendo com que os indivíduos adotem escolhas

concernentes ao uso desse ambiente. A ação antrópica em um ambiente pode

levar a uma mudança na composição, na abundância e na sobrevivência das

espécies que ali estão. O distúrbio provocado pela ação antrópica seria um fator

que levaria o ambiente em questão a ser, de certa forma, mais suscetível a

espécies invasoras (Ricklefs, 1996; Huston, 1994).

- 27 -

Em nossas observações verificou-se um padrão de maior abundância de

indivíduos no local de coleta Condomínio, sendo este local, dentre os escolhidos

para este estudo, o de maior perturbação antrópica. A alta ação antrópica no

ambiente acarretaria às espécies introduzidas Drosophila simulans e Zaprionus

indianus maior valor adaptativo por serem cosmopolitas, como observado em

Ferreira e Tidon (2004). Isso se verifica nitidamente pela maior abundância

destas espécies neste ambiente (tabela 1).

Para o local de coleta RECOR, um ambiente de baixa ação antrópica

(reserva ecológica), verificou-se o menor nível de abundância geral, entretanto,

as espécies endêmicas (Drosophila mercatorum e Drosophila sturtevanti),

provavelmente mais adaptadas, se fizeram mais presentes e possivelmente

utilizaram melhor os recursos presentes do que o fizeram em locais mais

urbanizados. Analisando a distribuição geográfica da abundância nos três locais

de coleta (RECOR, CO e Condomínio), verificamos que em ambientes de baixa

ação antrópica a espécie D. mercatorum é nitidamente mais presente que em

ambientes mais urbanizados.

A abundância das quatro espécies em relação ao total de drosofilídeos

coletados foi de cerca de 84% no CO, 65% nos condomínios e 87% na RECOR,

indicando que estas espécies são as mais presentes dentro do conjunto de

espécies relacionadas a esses três locais estudados.

I. Drosophila mercatorum

De acordo com dados climáticos obtidos através da estação climatológica

da reserva do IBGE (IBGE, 2005) de janeiro a abril de 2004, o Distrito Federal

se encontrava em plena estação úmida sendo que entre julho e outubro de 2003

localizava-se em uma estação de seca prolongada. As coletas dentro desse

período climático mostraram que em relação à abundância, a população de

Drosophila mercatorum decresceu no período de baixa de umidade (outubro de

2003 e abril 2004) e aumentou com a volta das chuvas (janeiro de 2004). O forte

- 28 -

decréscimo registrado em abril de 2004 pode ser parcialmente explicado pela

queda relativa de umidade em relação a janeiro e fevereiro de 2004, porém, esta

queda acentuada na abundância da espécie no mês de abril não seguiu uma

relação linear com a pequena queda de umidade, tendo sido influenciada,

portanto, por fatores não analisados neste estudo. De acordo com Tidon (2005)

os resultados de queda de abundância nos períodos mais secos e alta de

abundância nos períodos úmidos seriam esperados, pois, em coletas anteriores,

fora observado o padrão de crescimento na população de drosofilídeos no

Distrito Federal com a estação úmida e decréscimo na estação seca.

Provavelmente esse decréscimo na abundância populacional na estação seca

seria regido por algum efeito gargalo que atingiria a população nesse período,

tal como; diminuição dos recursos alimentares ou a própria dissecação devido à

seca duradoura. De acordo com Kimura (1976) e Valente e Araújo (1991),

admite-se que outros fatores complexos tais como a fisiologia do drosofilídeo, a

competição dentro do próprio habitat ou a própria disponibilidade de alimento

podem interferir na visualização de padrões de distribuição da espécie, o que

pode ter acontecido no presente estudo no mês de abril de 2004.

Na Drosophila mercatorum observou-se a maior heterozigosidade média

entre as três espécies analisadas quanto à alfa-esterase, sendo bem próxima a

descrita por Pereira (1979) em seu trabalho também com D. mercatorum no

Distrito Federal. Nesta espécie também se observou o maior número de alelos

dentre as espécies estudadas, sendo um forte indicativo de uma maior

variabilidade genética entre estas espécies. O numero de alelos achados em

nossas analises também foi o mesmo das analises descritas em Pereira (1979).

Drosophila mercatorum também foi observada como a espécie que está

mais próxima do equilíbrio de Hardy-Weinberg, sendo que apenas nos

ambientes mais urbanizados (CO e Condomínios) pudemos notar pequeno

desequilíbrio, mesmo assim, apenas em períodos de relativa queda de umidade.

Isto sugere que sendo uma espécie endêmica, possuiria um maior equilíbrio

genético com o ambiente. É possível que o alto índice de heterozigosidade

média nos alelos de esterase seja uma forma da espécie se mostrar mais

- 29 -

adaptada ao ambiente em que está inserida, mostrando uma maior elasticidade

na população em ambientes de variação de umidade.

Houve alto índice no equilíbrio de Hardy-Weinberg observado nas

populações da RECOR, e uma hipótese para explicar esse equilíbrio seria a de

que esta espécie endêmica estaria parcialmente adaptada a seu ambiente

nativo. Já as populações fora do equilíbrio de Hardy-Weinberg sugerem que

esteja ocorrendo com a Drosophila mercatorum um possível processo seletivo

relacionado com as espécies invasoras nos ambientes urbanos durante a seca.

De acordo com Pereira (1979), esta seria uma hipótese plausível já que em seu

estudo houve indicações que a espécie possui respostas específicas para o

ambiente natural que ela ocupa.

Os alelos de esterase EST-1 1.00 e EST-1 0.95 mostraram-se os mais

freqüentes nas populações de Drosophila mercatorum (figura 4). Em abril

obtivemos os valores mínimos nas freqüências de aparecimento destes alelos,

mas isto pode ter ocorrido devido ao extremamente baixo número de indivíduos

coletados neste período, reduzindo a precisão da amostra. De acordo com

Pereira (1979) EST-1 foi o loco de maior freqüência em todas as populações de

alfa-esterase analisadas no Distrito Federal, obtendo alto polimorfismo.

II. Drosophila simulans

Drosophila simulans é uma espécie introduzida e pode ser encontrada em

todos os tipos de ambiente (Sene et al., 1980), e apresentou neste estudo a

mais acentuada flutuação populacional ao longo do período de coletas em todos

os locais coletados (RECOR, CO, Condomínio). Os picos populacionais mais

elevados verificados nos ambientes urbanos durante períodos de seca podem

indicar uma facilidade em se adaptar a ambientes de pouca umidade como

indicam os estudos de flutuação sazonal em Gladis e Valente (1985), porém,

devemos reforçar que não encontramos uma relação direta entre fatores

- 30 -

ambientais estudados e os dados populacionais, através dos cálculos de

regressão linear, como se pode ver na tabela 2.

A maioria das amostras analisadas desta espécie não se encontra em

equilíbrio de Hardy-Weinberg. As exceções ocorrem apenas nos locais de

coletas de maior ação antrópica, em especial no Condomínio. Isto é um forte

indício indicando que esta espécie pode estar entrando em relativo equilíbrio

nos ambientes urbanizados, o que não seria novidade por se tratar de uma

espécie cosmopolita.

Os valores das taxas de heterozigosidade média das populações na

RECOR são relativamente reduzidos se comparados com os valores desta taxa

do CO e Condomínio, que são aproximadamente iguais entre si. Isto é mais um

indício a favor de uma maior adaptabilidade a ambientes urbanos. Notamos

também que não há perda de variabilidade nos locos de esterase

(heterozigosidade média) na seca, indicando uma possível adaptação a baixa

umidade.

Há uma clara predominância do alelo EST-1 1.00. Em alguns outros alelos

do mesmo loco (EST-1 1.05, EST-1 0.75) há uma forte diminuição da freqüência ou

mesmo o seu desaparecimento, observando-se posteriormente seu retorno. Isto

pode nos indicar uma possível deriva genética destes alelos na população ou

um possível maior valor adaptativo.

III. Zaprionus indianus

Zaprionus indianus mostrou-se a espécie mais abundantemente coletada,

refletindo uma distribuição ambiental ampla. Sabe-se que esta é uma espécie

que foi recentemente introduzida na região de acordo com os dados de sua

abundância em Tidon (2005). Como demonstra seu crescimento exacerbado, a

espécie tem aparecido como uma forte competidora pelos nichos dos

drosofilídeos já presentes no cerrado do Distrito Federal, tendo uma clara

dominância como invasora de acordo com Ferreira e Tidon (2004), inclusive em

- 31 -

ambientes pouco perturbados antropicamente como na RECOR, demonstrando

sua alta flexibilidade a variados tipos de ambientes. Dentro das observações

feitas de outubro de 2003 a janeiro de 2004 houve um aumento em freqüência

da Zaprionus indianus, conjuntamente com uma redução brusca na abundância

da espécie Drosophila simulans, outra espécie também invasora, mostrando que

tem ocupado espaços não só de espécies endêmicas como D. mercatorum ou

D. sturtevanti.

Talvez por ser uma espécie recentemente introduzida no Distrito Federal,

a Zaprionus indianus raramente foi encontrada em equilíbrio de Hardy-

Weinberg. A heterozigosidade média encontrada foi levemente maior que a da

Drosophila simulans, possivelmente possuindo certo valor adaptativo para o

ambiente do Distrito Federal.

Zaprionus indianus está em total desequilíbrio de Hardy-Weinberg na

RECOR, o que nos levaria a crer que a espécie estaria passando por algum

processos evolutivo que a levariam a uma possível adaptação ao ambiente e

explicaria tal facilidade na colonização deste, como mostram os dados de

abundância em Tidon (2005).

IV. Drosophila sturtevanti

Drosophila sturtevanti, espécie endêmica ao Cerrado, foi a única a

apresentar um valor significativo na regressão linear entre abundância total da

espécie e umidade relativa do ar. (figura 2). Essa relação entre abundância e

umidade é uma relação direta, mostrando uma forte dependência desta espécie

com a presença de umidade no ambiente. É interessante observar que o

acréscimo na abundância durante a época mais úmida é muito mais acentuado

nas zonas urbanas que na RECOR.

- 32 -

6. Considerações finais

Embora tenha ocorrido uma variação temporal na abundância das

espécies estudadas, não foi observado um padrão claro que explique a

oscilação de todas as espécies e em todos os locais. Os resultados das

regressões feitas para se observar um possível padrão de variação da

abundância relacionado a variáveis climáticas foi pouco significativo de acordo

com a tabela 2, exceto para a umidade em relação à abundância de Drosophila

sturtevanti. Assim concluímos que, nas condições deste trabalho há uma grande

dificuldade em associar variações na abundância de espécies de drosofilídeos

coletadas com as variáveis climáticas.

Sabe-se que a heterozigosidade é aceita como sendo o mecanismo

primário pelo qual a seleção natural mantém a variação genética em populações

naturais (Lewontin, 1966). Partindo desse pressuposto, e analisando a

heterozigosidade média das populações de Drosophila mercatorum, Drosophila

simulans e Zaprionus indianus, observou-se que a espécie Drosophila

mercatorum possui o índice mais alto de heterozigose em sua população, algo

já esperado por esta ser endêmica no Cerrado. O também elevado índice de

heterozigosidade de Zaprionus indianus pode ser umas das causas do sucesso

desta espécie invasora no cerrado brasiliense.

Concluímos neste trabalho que há uma grande dificuldade em ligar

variações na abundância de espécies de drosofilídeos coletadas neste trabalho

com as variáveis climáticas.

Notamos uma clara relação entre o grau de endemia das espécies das

espécies e a heterozigosidade média observada.

Devido a maior heterozigosidade média da Drosophila mercatorum e por

esta ser uma espécie endêmica, esperávamos encontrar uma maior estabilidade

nos níveis de abundância correlacionados a ela, porém, devido aos discrepantes

- 33 -

resultados em abril de 2004 (chuvas) isto não se verificou. Portanto a alta

heterozigosidade média em abril de 2004 na RECOR poderia ter ocorrido devido

não há um aumento real de heterozigosidade média, mas sim ao pequeno

numero de indivíduos coletados, aumentando o erro experimental.

Os dados do mês de abril, também são altamente variáveis em quase

todas as espécies, ambientes e alelos analisados. Houve uma forte alteração

nos níveis populacionais de todos os drosofilídeos sem uma explicação clara

dentro dos fatores analisados neste estudo.

Para futuros estudo recomendamos uma análise temporal mais longa e

freqüente, verificando uma possível sazonalidade dos dados e não apenas uma

variação temporal nestes. Isto possibilitaria separarmos variações estocásticas

(como a que possivelmente ocorreu em abril de 2004) das variações sazonais.

Seria interessante fazermos mais medidas em futuros estudos para

Drosophila sturtevanti para verificarmos se a relação linear significativa que

encontramos para essa espécie se confirmaria real ao longo dos anos ou se foi

um efeito pontual do período de 2003/2004.

Recomendamos também o estudo de mais localidades com ações

antrópicas semelhantes para uma melhor comparação espacial da variação

genética assim como também o uso de uma variedade maior de marcadores

genéticos para uma verificação mais precisa da ocorrência ou não de processos

evolutivos.

- 34 -

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Resumo

Esterases têm sido amplamente usadas no estudo da variação genética em ambientes

variáveis. Este estudo teve dois objetivos. O primeiro foi investigar a distribuição

temporal a abundância de Drosophila mercatorum e D. sturtevanti, ambas as espécies

endêmicas da Região Neotropical, e D. simulans e Zaprionus indianus, duas espécies

exóticas, comparando três diferentes locais expostos a diferentes graus de

urbanização. Um total de 11000 espécies foram coletadas sendo analisadas

geneticamente um montante de 1000 indivíduos. As quatro espécies estudadas tiveram

maior abundância nas áreas mais antropizadas e Z. indianus foi a espécie dominante

em todos os locais. Explorou-se também a distribuição temporal na freqüência dos

alelos de esterase nos mesmos locais em D. mercatorum, D. simulans e Z. indianus

nos períodos de julho de 2003 a abril de 2004, sendo feitas coletas a cada três meses.

Os padrões de esterase foram separados por eletroforese de poliacrilamida a 10 e 12%

e coradas com coloração enzimo-específica, revelando padrões individuais. A maior

heterozigosidade foi detectada em D. mercatorum. As freqüências alélicas de cada

espécie variaram temporal e espacialmente.

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Summary

Esterases have been widely employed to study genetic variation in relation to

environmental changes. This study has two objectives. First, we investigated the

temporal abundance distribution of Drosophila mercatorum and D. sturtevanti, both

endemic species of the Neotropical region, and D. simulans and Zaprionus indianus,

two exotic species comparing three different places exposed to different degrees of

urbanization. A total of 11000 specimens were collected. The four species studied were

more abundant in the most anthropized of the areas studied. Z. indianus was the

dominant species in all sites. We also explored the temporal distribution in frequency of

esterase alleles in D. mercatorum, D. simulans and Z. indianus collected in the same

sites between July of 2003 and April of 2004. Each place was sampled every three

months. A total of 1000 individuals were analyzed. The esterase patterns were

separated by 10 to 12% polyacrilamyde gel electrophoresis and stained with the specific

substratum to reveal the genetic pattern of each individual. The highest heterozygosity

was detected in D. mercatorum. For each species the allele frequencies varied in time

and space.

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