UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MONTES CLAROS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS – PPGCB

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BÁRBARA RAYANE RAMOS MUNIZ

DIVERSIDADE GENÉTICA DE Attalea vitrivir (ARECACEAE):

SUBSÍDIOS PARA CONSERVAÇÃO

Montes Claros – MG Fevereiro 2016

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BÁRBARA RAYANE RAMOS MUNIZ

DIVERSIDADE GENÉTICA DE Attalea vitrivir (ARECACEAE):

SUBSÍDIOS PARA CONSERVAÇÃO

Co-orientador: Dr. Márcio de Carvalho Moretzsohn – EMBRAPA/DF

Co-orientadora: Dra. Vânia Cristina Rennó Azevedo – EMBRAPA/DF

Montes Claros – MG

Fevereiro 2016

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

Graduação em Ciências Biológicas, área de

concentração em Genética da Conservação da

Universidade Estadual de Montes Claros, como parte

dos requisitos para obtenção do título de Mestre em

Ciências Biológicas.

Orientador: Dr. Marcio Antonio Silva Pimenta

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Dedicatória

Dedico este trabalho à minha mãe Bárbara Soraya e à minha avó Gê que sempre me fizeram

acreditar na concretização dos meus sonhos e colaboraram muito para que eu pudesse realizá-

los; estando sempre ao meu lado, entendendo-me nos momentos de ausência, dando-me

apoio, amor e carinho.

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Agradecimentos Agradeço, primeiramente, a Deus, por estar comigo em todos os momentos e iluminando-me, sendo meu refúgio e fortaleza durante esta caminhada. A ele, minha eterna gratidão. À diversidade da vida por todas as possibilidades de investigação: a busca por respostas e a formulação de novas perguntas. Agradeço, especialmente, à minha família, afilhados, amigos e incentivadores do meu trabalho; pessoas maravilhosas que sempre estiveram ao meu lado. Ao meu noivo Júnior, cujo, o amor, dedicação e apoio sempre se fizeram presentes nessa trajetória. Ao Professor Marcio Antonio Silva Pimenta pela orientação, dedicação, paciência e amizade, será sempre uma referência de pessoa e profissional. Possibilitou-me aprendizagens únicas, por meio do grande incentivo durante essa jornada. À Universidade Estadual de Montes Claros (UNIMONTES) e ao Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas (PPGCB), através dos professores e funcionários, pela qualidade formação, logística e apoio no decorrer do mestrado. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela concessão da bolsa de mestrado. À EMBRAPA Recursos Genéticos e Biotecnologia - CENARGEN pelo apoio ao desenvolvimento do projeto nessa Unidade. Em especial ao Márcio de Carvalho Moretzsohn, que não mediu esforços para concretização desse projeto e a Vânia Cristina Rennó Azevedo. Ao Murilo, pela parceria e importante participação na realização desse trabalho.

Ao Elder (Dim), pela amizade e apoio constante em minha vida desde a infância. Aos colegas do Laboratório de Genética Vegetal da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia - CENARGEN que colaboraram; em especial a Bruna Jaqueline, Lorena, Pétala, Anadria e Lucineide; vocês foram fundamentais para o desenvolvimento do trabalho. Aos colegas do Laboratório de Genética da Conservação pelo convívio, amizade e apoio incondicional.

A todos vocês, muito obrigada!

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“A persistência é o caminho do êxito”.

Charles Chaplin

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SUMÁRIO 1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 3

2 METODOLOGIA ............................................................................................................... 5

2.1 Área de Estudo e Coleta .................................................................................................. 5

2.2 Extração, Amplificação do DNA e Genotipagem ........................................................... 7

2.3 Análises dos Dados .......................................................................................................... 8

3 RESULTADOS ................................................................................................................. 9

3.1 Diversidade Genética ....................................................................................................... 9

3.2 Estrutura Genética das Populações ................................................................................ 10

3.3 Distância Genética ......................................................................................................... 12

4 DISCUSSÃO .................................................................................................................... 13

5 SUBSÍDEOS PARA CONSERVAÇÃO .......................................................................... 16

6 REFERÊNCIAS ............................................................................................................... 17

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RESUMO

O babaçu (Attalea sp.) é uma palmeira nativa, pertencente a família Arecaceae, com

ampla distribuição pelo Brasil. A espécie Attalea vitrivir Zona ocorre na região Norte no

estado de Minas Gerais e Sudoeste Baiano, onde o Cerrado é o bioma predominante. O

babaçu é considerado o maior recurso oleífero nativo do mundo e um dos principais produtos

extrativos do Brasil, além de contribuir significativamente para a economia de alguns estados

brasileiros. Diante da importância econômica e social do babaçu, a análise da estrutura e

diversidade genética de populações de A. Vitrivir foi realizada em cinco áreas de duas regiões

distintas, para caracterizar geneticamente a espécie. Foram utilizados 21 pares de primers

microssatélites (SSR) transferidos com sucesso de espécie Orbignya phalerata (sinonímia

Attalea speciosa) para a espécie Attalea vitrivir. Altos valores de diversidade genética foram

encontrados (He: 0,633-0,750), maior dentro das populações do que entre as mesmas,

provavelmente, devido ao isolamento. O software STRUCTURE revelou que as cinco

populações amostradas foram reunidas em dois grupos distintos (K = 2). Coincide com as

regiões norte (maior diferenciação) e sul, e corroborou com os resultados da análise de

variância molecular (AMOVA) que indicou a maior proporção da variabilidade genética entre

indivíduos dentro das populações (93,29%) do que entre populações (6,71%). A alta

diversidade genética nas populações não incluídas na área de proteção ambiental evidencia a

necessidade de novas propostas de ampliação das áreas de conservação, uma vez que, a

ocorrência da espécie é restrita.

Palavras-Chave: Babaçu, Estrutura Genética, SSR, Conservação.

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ABSTRACT The babassu (Attalea sp.) is a native palm tree belonging to Arecaceae family, with wide

distribution in Brazil. The Attalea vitrivir Zona occurs in the northern region in the state of

Minas Gerais and Bahia Southwest, where the Cerrado is the predominant biome. The

babassu is considered the largest native oil resource in the world and one of the main forest

products in Brazil, and to contribute significantly to the economies of some states. Given the

economic and social importance of babassu, analysis of the structure and genetic diversity of

populations of A. vitrivir was carried out in five areas of two distinct regions, to characterize

genetically the species. Twenty one pairs of microsatellite primers (SSR) were used success

transferred species Orbignya phalerata (synonymy Attalea speciosa) for the species Attalea

vitrivir . High genetic diversity values were found (He: 0.633 to 0.750), most within

populations than between them, probably due to the isolation. The STRUCTURE software

revealed that five populations sampled were grouped into two separate groups (K = 2).

Coincides with the northern regions (greater differentiation) and south, and corroborated the

results of the analysis of molecular variance (AMOVA) indicated that most of the genetic

variability among individuals within populations (93.29%) than among populations (6,71%).

The high genetic diversity in populations not included in the environmental protection area

shows the need for further expansion of proposed conservation areas, since the occurrence of

the species is restricted.

Key-Words: Babassu, Genetic structure, SSR, Conservation.

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1 INTRODUÇÃO

A família Arecaceae, inicialmente classificada como Palmae, é composta por um

grupo de espécies conhecidas como palmeiras. É um dos principais troncos da evolução das

monocotiledôneas e, atualmente, é constituída por 252 gêneros e aproximadamente 2.600

espécies (Dransfield et al. 2008). A ocorrência natural no Brasil é de 38 gêneros e cerca de

270 espécies (Lorenzi et al. 2010). As palmeiras representam a terceira família botânica mais

importante para o ser humano (Johnson, 1998) e conforme Noblick (1996) depois das

gramíneas é o segundo grupo das monocotiledôneas em importância econômica (cosméticos).

Possuem ampla distribuição, abundância, produtividade e diversidade de usos, grande

importância alimentar, medicinal, sociocultural e econômica para populações locais

(Zambrana et al. 2007). Entretanto, a considerar a relevância, a diversidade e complexidade

sobre a família Arecaceae, estudos ainda são incompletos (Orozco-Segovia et al., 2003; Panza

et al., 2004; Eslabão et al. 2015).

O babaçu (Attalea sp.) é uma palmeira nativa, pertencente a família Arecaceae, com

ampla distribuição pelo Brasil. É considerado o maior recurso oleífero nativo do mundo e um

dos principais produtos extrativos do Brasil, que contribui de maneira significativa para a

economia de alguns Estados da Federação (Alves, 1984; Arrudas et al., 2014). Segundo

Teixeira e Milanez (2003), os babaçuais se distribuem em área de aproximadamente 14,5

milhões de hectares, por sete estados brasileiros (Maranhão, Tocantins, Piauí, Goiás, Minas

Gerais, Mato Grosso e Espírito Santo). O Maranhão é responsável por 90% da produção

nacional do Brasil, local em que se encontra a maior concentração e exploração da espécie

(Lorenzi et al., 1996; Matos et al., 2010). Segundo Frazão (2001), registra-se a ocorrência de

babaçus também no Suriname e na Bolívia (Beni, Pando e Santa Cruz). A palmeira babaçu é

um dos principais recursos naturais não madeireiros no Brasil e é utilizada por milhões de

pequenos agricultores como fonte de renda e alimentação (May et al., 1985; Neves et al.,

2013).

A classificação taxonômica das espécies de babaçu é complexa, uma vez que, foram

realizados poucos estudos do gênero, fato que dificulta a identificação adequada de tais

espécies (Anderson e Balick, 1988). A classificação do babaçu (Attalea sp.) inclui quatro

gêneros: Orbignya, Maximiliana, Scheelea e Attalea (Glassman; 1999). Os gêneros

classificados foram anteriormente considerados correlacionados com Attalea, com diferenças

observadas nas características das flores estaminadas (Henderson, 1995; Pintaud, 2008). No

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entanto, a partir de 2008, a maioria dos taxonomistas concordou que estes três gêneros

deveriam ser incluídos em Attalea, razão pela qual a nova edição do livro “Genera Palmarum

(2008)” não mais os consideram válidos (Lorenzi et al., 2010). Na região norte do estado de

Minas Gerais, segundo Lorenzi et al. (2010), duas espécies são encontradas, Attalea vitrivir

Zona e Attalea compta Mart. . A Attalea vitrivir Zona é encontrada no norte do estado de

Minas Gerais e sudoeste da Bahia.

O Babaçu (Attalea vitrivir) ocorre na região norte no estado de Minas Gerais e

sudoeste baiano, onde o Cerrado é o bioma predominante (Lorenzi, 1996). Apresenta caule

solitário, pode chegar a 20 m de altura e 50 cm de diâmetro. Os frutos medem de 10 a 14 cm

de comprimento; com mesocarpo branco, farináceo e seco; endocarpo lenhoso, possuem entre

4 e 6 sementes, com endosperma branco e muito oleoso, folhas pinadas, flores pistiladas

(Lorenzi et al, 2010). De acordo com Araújo (2008), o fruto possui amêndoas comestíveis e

alto teor de óleo utilizado na alimentação, empregado em produção de cosmético,

medicamentos e possibilidade de uso para fabricação de biocombustíveis.

Devido à importância econômica e social do Babaçu (A. vitrivir), programas de

melhoramento genético vêm sendo desenvolvidos para aumentar a eficiência do sistema

produtivo (Souza et al., 2008; Silva, 2006). Uma forma eficiente de auxiliar os programas de

melhoramento e conservação da espécie é a análise da variabilidade genética, por meio de

marcadores moleculares, em que é possível detectar dissimilaridades entre diferentes acessos

em nível de DNA.

Os marcadores moleculares podem ser definidos como todo e qualquer fenótipo

molecular oriundo de um gene expresso ou de segmento específico do DNA. É considerado

ferramenta que pode acelerar a obtenção dos índices de diversidade genética (Aguiar, 2012).

Grande variedade de marcadores moleculares está disponível para as diferentes espécies de

vegetais (Borém; Caixeta, 2006). Dentre estes, os microssatélites ou SSR (Simple Sequence

Repeats) são os marcadores moleculares mais ricos em informações e eficientes em análise

genômica minuciosa, uma vez que, são codominantes presentes tanto nas regiões codificadas

como não codificadas distribuídas ao longo do genoma e possuem um alto grau de

polimorfismo, bem como requerem pequena quantidade de DNA pelo uso da técnica PCR

(Polymerase Chain Reaction) (Ritschelet et al., 2004; Agarwal, 2008; Lin et al., 2010; Kalia

et al, 2011).

O emprego da tecnologia de microssatélites envolve algumas limitações, como alto

custo e a grande quantidade de trabalho necessário para o desenvolvimento de primers

específicos para os locos de microssatélites de cada espécie. A presença de sítios

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microssatélites conservados entre espécies relacionadas, possibilita o aproveitamento de

primers, denominados heterólogos. Dessa forma, primers que foram desenvolvidos para uma

espécie podem ser empregados nas demais espécies do gênero (Ferreira; Grattapaglia, 1998;

Barbará et al., 2007; Rivas et al., 2013).

Muitas transferências de primers microssatélites de plantas tiveram resultados

positivos (Ritschel et al., 2004; Chen et al., 2010; Mnejja et al., 2010; Mistura et al., 2012,

Soares et al., 2013). A transferibilidade de marcadores microssatélites entre espécies

próximas evolutivamente favorece a obtenção rápida de informação genética e permite o

acesso à diversidade da espécie que se deseja estudar. Pode auxiliar no estabelecimento de

estratégias eficientes para conservação tornando-se uma alternativa econômica, além de

rápida para disponibilizar marcadores para a espécie desejada e potencializar estudos da

variabilidade genética (Ritschel et al., 2004; Leite et al., 2007; Peixoto et al., 2009; Rivas et

al., 2013). A transferência de primers da espécie Orbignya phalerata para a espécie A. vitrivir

foi obtida com sucesso, onde 21 pares de primers foram identificados para a espécie.

Assim o presente trabalho busca avaliar a diversidade genética em subpopulações

naturais da espécie A. vitrivir por meio da amplificação de regiões de microssatélites do DNA.

Para isso, serão investigadas as seguintes questões: (i) Qual o nível de variabilidade genética

de A. vitrivir dentro e entre as subpopulações estudadas? (ii) Existe isolamento genético entre

as áreas e/ou regiões? (iii) Os níveis de diversidade genética nas subpopulações localizadas na

Área de Proteção Ambiental do Rio Pandeiros (APA-Pandeiros), localizada no município de

Januária-MG, são suficientes para a conservação da espécie no local?

2 METODOLOGIA

2.1 Área de Estudo e Coleta

Foram selecionados babaçus localizados entre os municípios de Januária (Minas

Gerais) e Cocos (Bahia). A amostragem foi realizada em duas regiões principais, separadas

por aproximadamente 90 km, entre as quais não foi registrada a presença da espécie. As áreas

foram denominadas como região Norte (N), e Sul (S) (Figura 1).

Foram amostradas três populações de ocorrência de A. vitrivir na região Norte (N1,

N2, N3) e duas áreas na região Sul (S1 e S2) (Figuras 1 e 2). Na região Norte as áreas

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distanciam em torno de 22,4 Km, considerando a distância mínima de 16,5 Km entre N2 e N3

e a máxima de 33,6 Km entre N1 e N3.

Figura 1. Locais de amostragem (N1, N2, N3 e S1, S2). A área sombreada – amarelo corresponde a Área de Proteção Ambiental (APA- Pandeiros). Fonte: Google earth, 2015.

Figura 2. Imagens de satélite das populações estudadas N1, N2, N3, S1 e S2. Fonte: Google Earth, 2015.

N1 N3 N2

S2 S1

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As populações da região Sul estão localizadas na Área de Proteção Ambiental do Rio

Pandeiros – MG, que abrange os municípios de Januária, Cônego Marinho e Bonito de Minas

(Nunes et al., 2009). Em cada uma das cinco populações foram amostrados entre 25 a 38

indivíduos, obedecendo a uma distância mínima de 50 metros entre árvores (Tabela 1).

Tabela 1. Localização das populações amostradas.

Área N Localização Latitude (S) Longitude (W) Altitude (m)

N1

25

Montalvânia – MG

14º31’34,0”

44º38’38,8”

616

N2 26 Montalvânia – MG 14º23’12,7” 44º35’25,5” 586

N3 38 Cocos – BA 14º14’45,6” 44º31’27,8” 518

S1 26 Januária – MG 15º25’26,7” 44º40’55,0” 563

S2 26 Bonito de Minas-MG 15º19’01,3” 44º43’45,5” 612

N: número de indivíduos analisados.

Foram coletadas folhas jovens de indivíduos adultos em estágio reprodutivo,

conservadas em sílica gel e conduzidas ao Laboratório de Genética da Conservação da

Universidade Estadual de Montes Claros, onde ficaram mantidas em freezer (-20◦C) até o

momento da extração do DNA.

2.2 Extração, Amplificação do DNA e Genotipagem

A extração de DNA foi realizada no Laboratório de Genética Vegetal da Embrapa

Recursos Genéticos e Biotecnologia de acordo com a metodologia descrita Doyle e Doyle

(1987), modificado. As folhas foram trituradas com Minibeater (Biospec Products Inc.) e

incubadas por 45 min a 65°C em uma solução com 700µL de CTAB 2% e 1% de β-

mercaptoetanol. Em seguida, foi acrescentado CIA (clorofórmio: álcool isoamílico, 24:1), que

promove a extração dos lipídios, proteínas e polissacarídeos-fase inferior- enquanto que o

DNA permanece na fase aquosa, superior. Foi realizada a homogeneização da solução e

centrifugação dos tubos para separação em duas fases. Em seguida adicionou-se álcool

isopropílico para precipitação do DNA e etanol para lavagem. Utilizou-se 50 µL de tampão

Tris-EDTA para ressuspender o DNA. Posteriormente, foi efetuada a quantificação utilizando

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gel de agarose 1% e analise de comparação das amostras em relação à concentração da

amostra conhecida de DNA lambda.

Para caracterização genética A. vitrivir foram utilizados 21 pares de primers

microssatélites, desenvolvidos para a espécie Orbignya phalerata (Attalea speciosa) e

transferidos para a espécie em estudo. No total, foram genotipados 141 indivíduos da espécie,

nas cinco populações estudadas.

As reações de PCR foram realizadas com a utilização de Tampão [(10X Platinum HF

com MgCl2 600 mM, Tris-SO4 (pH 8,9), 180mM (NH4)2SO4, MgSO4)] na concentração de

1X; dNTPs na concentração de 1,3 mM; BSA na concentração de 1,3 mg/mL; primer

forward no concentração de 0,5 µM; primer reverse no concentração de 0,5 µM; Taq

polimerase na concentração de 0,2 u, DNA na concentração de 3 ng e água ultrapura (5,6

µL). O volume total de cada reação foi 13,0 µL; os primers foram marcados com

fluorescências 6-FAM (azul), HEX (verde). As amplificações foram realizadas em

termociclador ABI 9700 (Applied Biosystems), nas seguintes condições: 94ºC por 1 minutos

(1 ciclo), 95ºC por 1 min., 50-60°C por 1 min., 72°C por 1 min. (30 ciclos); e uma extensão

final a 72°C por 20 minutos (1 ciclo). Foram adicionados a 1µL do DNA amplificado, 8,5 µL

de Hi-Di formamida e 0,5 µL do padrão com comprimentos de fragmentos conhecidos,

marcado com fluorescência ROX. Para verificar o êxito da amplificação utilizou gel de

agarose 1% (corado com brometo de etídio) e o DNA lambda visualizados em

transiluminador de luz ultravioleta (UV) modelo Gel logic.

As amostras foram submetidas à eletroforese capilar em sequenciador automático de

DNA ABI-3730 (Applied Biosystems), pertencente ao Laboratório de Genética Vegetal, da

Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia. Os dados foram analisados pelo programa

GeneMapper (Applied Biosystems).

2.3 Análises dos Dados

Com o auxílio do software GDA (Lewis, 2002) foram estimados o número de alelos

por loco, as frequências alélicas, a heterozigosidade esperada pelo equilíbrio de Hardy-

Weinberg (He) de Nei (1978), a heterozigosidade observada (Ho) e o índice de fixação

intrapopulacional (f). Através do software Arlequin versão 3.1 (Excoffier et al., 2005), foi

realizada a Análise de Variância Molecular (AMOVA) para verificar a distribuição da

diversidade genética entre e dentro das populações. O software STRUCTURE (Prichard et al.,

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2000) foi utilizado para investigar a estrutura das populações e inferir o número de

agrupamentos geneticamente distintos (K) mais provável de todo o conjunto de dados.

Através do método de Nei (1978) foram obtidas as análises de diversidade genética de A.

vitrivir . O programa HICKORY (Holsinger e Lewis, 2005), foi utilizado para gerar valores de

heterozigosidade genética total (Ht) e heterozigosidade média dentro das populações (Hs),

pelo método Bayesiano; de diferenciação da população (GST-B) (Holsinger et al., 2002) e do

fluxo gênico (Nm) estimado pela fórmula Nm = 0.25(1−GST-B)/GST-B (McDermott, McDonald;

1997). A similaridade genética entre as matrizes de A. vitrivir foi calculada pelo coeficiente

de similaridade de Jaccard com o emprego do software NTSys (Rohlf, 2000) que gerou

dendrograma baseado no agrupamento UPGMA da distância genética θB. O programa Barrier

2.2 (Manni et al., 2004) foi utilizado para analisar a presença de descontinuidades genética

entre as populações no espaço, por meio da triangulação de Delaunay verificadas pelo

algoritmo de Monmonier (Manni et al., 2004) pelas coordenadas geográficas adquiridas pelo

sistema de posicionamento global (GPS) e das distâncias genéticas θB. O Teste de Mantel foi

aplicado com o programa PC-Ord 4.14 (McCune,Mefford; 1997) para verificar a correlação

entre a matriz de distância genética (θB) e a matriz de distância geográfica.

3 RESULTADOS

3.1 Diversidade Genética

Foi observado que a população S1 possui maior índice de diversidade gênica (He:0,750)

e o menor índice (He: 0,633) corresponde à população S2, ambas incluídas na área de

proteção ambiental. As populações N1, N2 e N3 apresentaram maior valor de

heterozigosidade observada (Ho) comparadas com a população S1 que está incluída na área

de proteção. Apesar das populações N1 e N2 não estarem dentro da área de proteção, as

mesmas apresentaram índices de diversidade gênica altos He: 0,735 e 0,714; respectivamente

(Tabela 2).

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Tabela 2. Estimativa de diversidade genética para cinco áreas de Attalea vitrivir estudadas

com vinte e um locos microssatélites geradas pelo GDA.

População A He Ho f N1 7,333 0,735 0,505 0,318

N2 7,190 0,714 0,540 0,247

N3 7,952 0,684 0,527 0,231

S1 8,476 0,750 0,480 0,367

S2 5,523 0,633 0,537 0,154

Média 7,295 0,703 0,518 0,267

Abreviaturas: A, número médio de alelos por loco; He, diversidade gênica de Nei (1978); Ho, heterozigosidade observada; f, índice de fixação.

O índice de diversidade genética médio dentro das populações (Hs) foi de 0,753; o

índice bayesiano similar ao GST de Nei (GST-B) foi de 0,079; fluxo gênico (Nm) foi de 2,914 e

a heterozigosidade total (Ht) baseado em frequências alélicas médias foi de 0,818.

3.2 Estrutura Genética das Populações

A Análise de Variância Molecular (AMOVA) mostrou que a maior proporção da

variabilidade genética ocorre entre indivíduos dentro das populações (93,29%) do que entre as

populações (Tabela 3). Da diversidade genética total, 6,7% da variação ocorreu entre as

populações.

Tabela 3. Análise da variância molecular (AMOVA) obtida com marcadores microssatélites

em 141 indivíduos de Attalea vitrivir utilizados no estudo.

Fonte de Variação GL SQ VC %VT

Entre populações 4 8,167 0,029 6,7**

Dentro de populações 277 112,500 0,406 93,3**

Total 281 120,667 43,536 100

Graus de liberdade (GL), soma dos quadrados (SQ), componentes de variância (VC), percentagem da variação total (%VT), **significativo ao nível de 1% de probabilidade de erro.

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A variabilidade genética, avaliada pelo programa STRUCTURE (Pritchard et al. 2000),

mostrou que as cinco populações amostradas (Figura 3-A) foram reunidas em dois grupos

distintos (Figura 3-B: K = 2). Os dois grupos coincidiram com as regiões norte e sul, sendo S1

e S2 mais homogêneos e as demais populações misturadas (3-A).

Figura 3. Conjunto de populações agrupado pelo método bayesiano realizado pelo STRUCTURE onde K = 2 (B) e K= 5 (A). As linhas verticais coloridas simbolizam cada indivíduo. Indivíduos de cor semelhante indicam que eles pertencem ao mesmo grupo.

Alguns indivíduos apresentam mais de uma cor, isso ocorre devido à porcentagem do

genoma que foi herdada de cada agrupamento, podendo ser observado numa escala de 0 a

100% (Prichard et al., 2000).

A análise usando as distâncias FST por meio da triangulação de Delaunay verificadas

pelo algoritmo de Monmonierno software Barrier 2.2 (Manni et al., 2004 ) confirmaram a

análise do STRUCTURE, mostrando a existência de dois principais aglomerados

populacionais geográficos (norte e sul).

(A)

(B)

N1 S2 S1 N2 N3

N1 N3 N2 S1 S2

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3.3 Distância Genética

A análise do software Barrier revelou semelhança entre as três populações do norte e as

duas populações situadas ao sul, ou seja, a triangulação de Delaunay indicou a presença de

barreira (Figura 4) que separa as populações do norte (N1, N2 e N3) das populações do sul

(S1 e S2).

Figura 4. Barreira traçada pelo software BARRIER.

Figura 5. A - Mapa físico indicando bacias hidrográficas brasileiras. Fonte: IBGE, 2013.

B - Mapa de unidades de relevo do Brasil. Fonte: IBGE 2006.

O dendrograma (Figura 6) indica a constituição de dois grandes agrupamentos, um

composto pelas populações situadas na região norte e outro formado pelas demais populações,

corroborando assim com o resultado de K=2 originada pelo STRUCTURE (Prichard et al.

2000), onde o valor de K corresponde ao número real de grupos genéticos.

A B

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Figura 6. Dendrograma baseado no agrupamento UPGMA da distância genética θB da Attalea

vitrivir amostrados nas cinco populações.

4 Discussão

Os valores encontrados de heterozigosidade observada (Tabela 2) são altos

considerando o padrão já relatado em outras espécies como Cocos nucifera com variação

entre 0,09 e 0,71; Bactris gasipaes entre 0,18 e 0,65; Euterpe edulis entre 0,42 e 0,47

(Giombini et al., 2012) e Pseudophoenix sp. (Rodriguez, 2014) entre 0,33 e 0,44.

O índice de fixação para alelos por locos (Rajesh et al., 2008) é também conhecido

como índice de diversidade genética. Conforme Nöel et al. (2011), é uma estimativa de

diferenciação intrapopulacional e interpopulacional com variações de 0,37 a 1,0 e quando os

valores de FST são maiores do que 0, indica que as subpopulações são diferentes. Segundo

Hernan (2009) e Azevedo (2014), os valores de Fst variam de 0 (indica que não houve

diferenciação) a 1 ( indica diferenciação total ) entre um grupo específico e os subgrupos

originados dele. Deste modo, o valor médio de FST igual a 0,42 informado por Rajesh et al.

(2008) e de 0,46 encontrado por Nöel et al. (2011) indica que as subpopulações avaliadas no

presente trabalho apresentam um nível baixo de diferenciação (FST = 0,140) e,

consequentemente, essa informação demonstra a grande diversidade dentro delas. Segundo

Yeh (2000), o nível de diversidade genética obtido é moderado, uma vez que, considera uma

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faixa de valores de FST em relação ao nível de diferenciação genética (0,0-0,05 baixo; 0,05-

0,25 moderado; > 0,25 alto).

Altos índices de diversidade genética foram encontrados para A. vitrivir na maior parte

das populações estudadas, exceto nas populações S2 e N3 (He: 0,633; He: 0,684

respectivamente) onde fatores como o isolamento genético, a alta taxa de fragmentação

(Santos et al., 2015) principalmente próximo aos locais estudados; a possível existência de

exploração nesses remanescentes devido a expansão urbana e impactos que alterem as áreas

de ocorrência dessa espécie e/ou comportamento de seus agentes polinizadores podem ser os

responsáveis pela baixa diversidade.

O fluxo gênico (Nm) pode ser considerado como o número absoluto de indivíduos

migrantes que adentram nas subpopulações a cada nova geração (Hartlet. al., 2010).

Conforme Wright (1931), caso o fluxo gênico seja menor que um (Nm<1), a deriva genética

ocasionará em diferenciação populacional substancial, ou seja, a deriva genética tem maior

atuação, resultando em significativa diferenciação genética entre as populações. O fluxo

gênico (Nm) de 2,914 neste trabalho, indica dois migrantes por geração. De acordo com

Wright (1951), valores de Nm maiores que 4,0 migrantes por geração conseguem conter os

efeitos do cruzamento de indivíduos próximos, possíveis de acontecer no interior das

populações.

Baseado na diferenciação genética das regiões estudadas neste trabalho acredita-se que

há duas grandes unidades potenciais para a conservação da espécie: as regiões norte e sul. É

aconselhável que a região Norte (N1, N2 e N3), por apresentar alto índice de diversidade

genética e requerer uma maior atenção, seja incluída em futuros planos de gestão e

conservação da espécie.

Os resultados encontrados para o agrupamento de populações (Tabela 3) assemelham-

se aos encontrados em outras espécies perenes e de fecundação cruzada (Perera et al., 1999;

Lebrun et al., 2005; Mistura et al., 2012; Azevedo, 2014). A alta divergência genética

encontrada entre as populações (Norte e Sul) pode estar associada ao isolamento reprodutivo

das mesmas. Os resultados estão em conformidade com os obtidos por Büttow et al. (2010)

que, em estudo com Butiá capitata, observaram maior variação molecular (83,68%) dentro

das populações. Os mesmos autores também relatam que eficientes mecanismos de dispersão

de pólen e sementes, como se acredita que seja o caso de A. vitrivir, faz com que a

variabilidade dentro das populações seja maior. A distância entre as áreas também deve ser

considerada, uma vez que, favorece o fluxo gênico entre as áreas avaliadas, como relata Boyle

et al. (1990). Silva (2006) estudou a diversidade e estrutura genética da palmeira Geomonas

15

Chottiana Mart. e obteve 86,5% de variabilidade genética dentro de populações,

demonstrando a alta variação genética dentro das populações.

Conforme Lorenzi et al. (2010) A. vitrivir possui ocorrência em uma região geográfica

pequena e fragmentada. A fragmentação e limitação de dispersão de pólen/frutos podem ser

fatores contribuintes para a diferenciação entre as áreas (Figuras 3 e 6). Apesar da ausência de

informações sobre os polinizadores específicos de A. vitrivir, normalmente os besouros da

família Nitidulidae (Mytrops mexicana) atuam como mediadores de polinização em palmeiras

(Henderson, 1995; Gitzendanner et al., 2000; Silberbauer-Gottsberger, 1990; Santos et al.,

2015).

Segundo Silvius (2002), os mamíferos se alimentam dos frutos das palmeiras

(inclusive a do gênero estudado) e os frutos possuem sementes, consideravelmente grandes,

que limitam a dispersão para apenas dispersores maiores (Jordano, 2000). Os roedores são

bastante atraídos pelo mesocarpo de tais frutos (Lorenzi et al., 2004). Duas espécies de

roedores estocadores, Clyomys bishopi e Dasyprocta azarae, são fundamentais na dispersão

de Attalea geraensis (Vieira, 2002). Sendo assim, a atuação de mamíferos e insetos poderia

ter elevado a diferenciação entre as áreas, uma vez que, muitas dessas espécies ficam

confinadas aos fragmentos remanescentes, o que reflete no fluxo gênico entre populações

(Smythe, 1978). A alta diferenciação genética entre os grupos (Figuras 3 e 6) está conforme a

análise realizada pelo software Barrier, o que sugere a existência de barreiras ao fluxo gênico,

como por exemplo, à presença de depressão da bacia hidrográfica do rio São Francisco, de

uma cadeia de montanha ou mesmo limites da fisionomia vegetação de cerrado com a

caatinga, como sugere Brandão (2012) ao trabalhar com Ceiba puiflora.

De acordo com o Teste de Mantel não houve nenhum indício para a correlação entre a

matriz de distância geográfica e estrutura genética (r = 0,212, p = 0,357). As possíveis

barreiras para o fluxo gênico entre as populações devem ser as mesmas citadas conforme a

análise do Barrier.

Segundo o dendrograma gerado pelo software NTSys (Figura 6), há uma tendência de

agrupamento de acordo com a origem das populações. A ausência de correlação entre as

distâncias genéticas e geográficas de A. vitrivir entre fragmentos pode ser explicado pela

baixa divergência genética entre as populações (Tabela 3) que exibem níveis elevados de

fluxo de genes.

As análises com a utilização de marcadores microssatélites (SSR) realizadas revelaram

alta diversidade genética dentro das populações. Conforme os resultados obtidos, infere-se

que as populações remanescentes analisadas conservam variabilidade genética da espécie,

16

sendo relevante para a sobrevivência de A. vitrivir. Os resultados também são pertinentes para

subvencionar medidas de conservação, uma vez que, os níveis de diversidade genética nas

populações localizadas na Área de Proteção Ambiental do Rio Pandeiros (APA-Pandeiros)

não são suficientes para a conservação da espécie.

5 SUBSÍDEOS PARA CONSERVAÇÃO

As análises realizadas indicaram altos níveis de heterozigosidade esperada e

observada, principalmente em indivíduos presentes em áreas não incluídas no ambiente de

proteção ambiental, revelando que parte da variabilidade genética da espécie encontra-se em

áreas fora desse ambiente. As cinco populações avaliadas foram reunidas em dois grupos

(K=2) distintos, coincidindo com as regiões Norte e Sul; sendo que a maior diversidade

genética foi encontrada na população S1 e a menor na população S2. Portanto é necessário

atenção para com a população S2, embora tenha apresentado menor índice de fixação. Os

níveis de diversidade genética encontrada para A. vitrivir foram considerados altos, sendo

maior dentro das populações do que entre as mesmas, provavelmente, devido ao isolamento

reprodutivo.

A alta diversidade genética nas populações não incluídas na área de proteção (N1, N2 e

N3), evidenciam a necessidade de novas propostas de ampliação das áreas de conservação,

uma vez que, sua ocorrência é restrita e as populações S1 e S2 não terem apresentado

diversidade genética suficiente para a conservação da espécie. Além disso, sugere-se para

conservar a variabilidade genética da espécie, a criação e manutenção de bancos de

germoplasma e a dispersão de sementes nas populações como S2 e N3. Sugere-se também o

estabelecimento de programas de educação ambiental nessas áreas (norte e sul) bem como

estudos que descrevam a biologia reprodutiva de A. vitrivir para compreender melhor a

dinâmica dessa espécie.

17

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