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Universidade Federal do Piauí Diversidade genética em alho (Allium sativum L.) João Paulo Gomes Viana Dissertação apresentada à Universidade Federal do Piauí como parte das exigências do Programa de Pós-graduação em Genética e Melhoramento, para obtenção do título de “Mestre”. Teresina PI 2013

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Universidade Federal do Piauí

Diversidade genética em alho (Allium sativum L.)

João Paulo Gomes Viana

Dissertação apresentada à Universidade Federal do Piauí como parte das exigências do Programa de Pós-graduação em Genética e Melhoramento, para obtenção do título de “Mestre”.

Teresina – PI

2013

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João Paulo Gomes Viana

Bacharel em Ciências Biológicas

Diversidade genética em alho (Allium sativum L.)

Orientadora:

Prof.ª. Dr.ª Regina Lucia Ferreira Gomes

Coorientadores:

Prof.ª. Dr.ª Ângela Celis de Almeida Lopes

Prof. Dr. Sérgio Emílio dos Santos Valente

Prof. Dr. José Baldin Pinheiro

Dissertação apresentada à Universidade Federal do Piauí como parte das exigências do Programa de Pós-graduação em Genética e Melhoramento, para obtenção do título de “Mestre”.

Teresina – PI

2013

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AGRADECIMENTOS

Primeiramente a Deus, pela minha vida e pela existência de todos os seres que

fizeram de mim quem sou, dando sentido à minha trajetória e que sem os quais não

teria chegado até aqui;

A Universidade Federal do Piauí, pela minha formação acadêmica na graduação em

Ciências Biológicas e no mestrado do Programa de Pós-graduação em Genética e

Melhoramento (PPGM);

A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES, pelo

financiamento do projeto “Cooperação acadêmica para incrementar a formação

pós-graduada em Genética e Melhoramento (PROCAD UFPI/ESALQ)”, que

possibilitou a realização do mestrado sanduíche na Escola Superior de

Agricultura “Luiz de Queiroz” - Universidade de São Paulo (ESALQ/USP), e pela

concessão da bolsa de mestrado;

À ESALQ/USP, especialmente ao Departamento de Genética, pela oportunidade da

realização do mestrado sanduíche, disponibilizando estrutura física, material de

consumo e mão de obra para avaliação agromorfológica e análise molecular das

populações de alho;

À Embrapa Hortaliças, especialmente ao Dr. Francisco Vilela Resende, por terem

cedido variedades de alho utilizadas neste estudo;

A minha orientadora, Prof.ª. Dr.ª Regina Lucia Ferreira Gomes, pelos valiosos

ensinamentos, companheirismo e motivação. Sua fundamental presença diante dos

problemas e das conquistas tornaram esta caminhada muito mais agradável;

Aos meus coorientadores, Prof.ª. Dr.ª Ângela Celis de Almeida Lopes e Prof. Dr.

José Baldin Pinheiro, pelos incentivos e compreensão durante a execução desta

pesquisa;

Ao meu coorientador Prof. Dr. Sérgio Emílio dos Santos Valente, por ter me

apresentado à pesquisa científica e por continuar me incentivando a seguir os

melhores caminhos na carreira científica;

Aos meus professores, Dra. Ana Paula Peron, Dr. Maurisrael de Moura Rocha, Dra.

Gleice Ribeiro Orasmo, Dr. Antônio Aécio de Carvalho Bezerra e Dr. Fábio Barros

Britto, pelos ensinamentos;

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Ao Dr. Kaesel Jackson Damasceno e Silva, pelas valiosas contribuições a minha

formação e por todo o empenho que oferece ao Programa de Pós-graduação em

Genética e Melhoramento;

À Carolline de Jesús Pires, pela agradável companhia, pela ajuda em todas as

etapas deste trabalho, pelos ensinamentos dados e por tornar momentos difíceis e

mais suportáveis;

A todos os alunos da turma de 2011 do PPGM, especialmente a Kaline Aguiar

Gonzalez Vale e Katia Silene Sousa Carvalho, pelo companheirismo durante o curso

das disciplinas.

Aos meus amigos, Hendrie Ferreira Nunes, José Ribamar de Assunção Filho e Ellida

de Aguiar Silvestre pela amizade e apoio durante o mestrado “sanduíche”;

A todos os alunos do Laboratório de Diversidade Genética e Melhoramento do

Departamento de Genética na ESALQ – USP, especialmente a Miklos Maximiliano

Bajay, Alessandro Alves Pereira, Patrícia Sanae Sujii e Ana Paula Mendes Silva, pela

ajuda e incentivo na conclusão desta etapa;

Ao meu pai João Evangelista Viana, a minha mãe Maria Cícera Gomes dos Santos e

ao meu irmão Albert Isaac Gomes Viana, por me apoiarem e incentivarem nesta

caminhada;

A Nelma Neylanne Pinho Muniz Oliveira, Nelma Pinho da Cunha Muniz e Leda Maria

Pinho Muniz Oliveira que assim como minha família compartilharam comigo todas as

etapas desta conquista.

A todos não citados que diretamente ou indiretamente contribuíram para execução

deste trabalho.

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SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ......................................................................................................... 8

2 REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................. 11

2.1 A espécie Allium sativum L. ............................................................................. 11

2.2 Conservação do germoplasma de alho ........................................................... 12

2.3 Caracterização agromorfológica e molecular ................................................... 14

2.4 Marcadores microssatélites ............................................................................. 15

2.5 Metodologias de estudo da diversidade genética ............................................ 16

3 MATERIAL E MÉTODOS ....................................................................................... 20

3.1 Material genético ............................................................................................. 20

3.2 Caracterização e avaliação agromorfológica das variedades .......................... 20

3.2.1 Caracteres avaliados ................................................................................. 22

3.2.2 Análises estatístico-genéticas ................................................................... 24

3.3 Caracterização molecular das variedades ....................................................... 27

3.3.1 Coleta de material botânico e extração de DNA ....................................... 27

3.3.2 Caracterização e genotipagem dos microssatélites .................................. 28

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO .............................................................................. 30

5 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 50

REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 51

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RESUMO

VIANA, J. P. G. Diversidade genética em alho (Allium sativum L.). 2013. 56p. Dissertação (Mestrado em Genética e Melhoramento) – Universidade Federal do Piauí, Teresina, 2013.

O alho é uma das hortaliças mais importantes no mercado brasileiro e mundial. No Piauí, mais especificamente na microrregião de Picos, o alho semi-nobre foi cultivado em larga escala e supria a demanda de vários municípios do estado. Devido à entrada do alho nobre no mercado brasileiro, houve redução na produção de alho semi-nobre que pode ter levado a perda de diversidade genética. O objetivo deste trabalho foi estudar a diversidade genética em doze variedades de alho, sendo quatro de origem piauiense e oito da Coleção de Germoplasma de Alho da Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” – Universidade de São Paulo (ESALQ/USP). Para isto, caracterizou-se o germoplasma com base nos descritores propostos pelo International Plant Genetic Resources Institute (IPGRI), atualmente Bioversity International, e realizou-se a genotipagem das variedades a partir de oito locos SSR. Os caracteres agromorfológicos e a genotipagem dos microssatélites foram eficientes para se estimar a diversidade genética entre as variedades de alho. Os resultados obtidos com a análise morfológica corroboraram com as análises moleculares, evidenciando complementaridade destas dimensões de análise no estudo da diversidade genética em alho. Assim, conclui-se que existe divergência genética entre as variedades de alho estudadas em função da procedência do germoplasma e sugere-se que o material oriundo da ESALQ/USP trata-se de um germoplasma distinto do cultivado no Piauí. As variedades piauienses de Sussuapara e Santo Antônio de Lisboa acumularam diferenças em relação à variedade Branco Mineiro, cultivada no Piauí nos anos 70, enquanto a variedade de Bocaina compartilha alto grau de similaridade, com base nos estudos agromorfológicos e moleculares. A partir da constatação de que existe divergência genética entre as variedades de alho no Piauí, conclui-se que pode haver germoplasma adaptado, que reúna outras características de interesse agronômico, sendo possível a seleção de genótipos superiores que aumentem a competitividade do alho piauiense frente ao alho importado. Palavras-chave: Allium sativum, Diversidade genética, Marcadores microssatélites.

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ABSTRACT

Viana, J. P. G. Genetic diversity in garlic (Allium sativum L.). 2013. 56p. Dissertation (Masters in Genetics and Breeding) - Federal University of Piauí,

Municipality of Teresina, Piauí State, Brazil, 2013.

Garlic is one of the most important crops in Brazil and in the world. In Piauí State, specifically in micro region of Picos, semi-noble garlic was once grown on a large scale and supplied the demand of various municipalities in the state. After the noble garlic was introduced to the Brazilian market, the production of semi-noble garlic reduced which may have led to loss of genetic diversity. This study investigated the genetic diversity in twelve varieties of garlic, four originally from Piauí State and eight from the Garlic Germplasm Collection of the College of Agricultura "Luiz de Queiroz" - University of São Paulo (ESALQ / USP). We characterized the germplasm based on descriptions proposed by the International Plant Genetic Resources Institute (IPGRI), currently Bioversity International, and conducted the genotyping of varieties from eight SSR loci. The agronomic characters and microsatellite genotyping were efficient to estimate genetic diversity among the garlic varieties. The results obtained with the morphological analysis corroborated the molecular analyses, demonstrating complementarity of these analyses dimensions in the study of genetic diversity in garlic. Thus, we concluded that genetic diversity exists among the varieties of garlic studied in terms of the germplasm origin and suggests that the material from the ESALQ / USP is a germplasm distinct from that grown in Piauí State. The varieties from Piauí State Sussuapara and Santo Antônio de Lisboa showed differences compared to the Branco Mineiro variety, grown in Piauí in the 1970s, while the Bocaina variety shows high degree of similarity, based on agronomic and molecular studies. The fact that there is divergence among varieties of garlic in Piauí State allows to conclude that germplasm can be adapted, which satisfies other agronomic characteristics, and it is possible to select genotypes that increase competitiveness of Piauí State garlic against imported garlic. Keywords: Allium sativum, Genetic Diversity, Microsatellite markers.

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1 INTRODUÇÃO

A espécie Allium sativum L., conhecida popularmente como alho, é uma das

hortaliças mais importantes do mercado brasileiro e mundial, por ser bastante

apreciada como condimento alimentar, principalmente devido ao aroma e sabor que

confere aos alimentos, além de ser amplamente usada para fins terapêuticos desde

a antiguidade.

No Brasil, existem dois tipos de alho cultivados, cada um com peculiar

importância social e econômica. O primeiro grupo consiste no alho nobre, que possui

número pequeno de bulbilhos, cultivado por grandes agricultores, cuja produção é

destinada ao mercado formal, possuindo alto valor comercial. No outro grupo,

encontra-se o alho semi-nobre, com aparência mais rústica, produzindo

frequentemente vários bulbilhos estreitos por bulbo, chamados “bulbilhos palitos”,

menos atrativos comercialmente. Por esta razão, sua produção geralmente é

realizada por pequenos agricultores familiares, sendo destinada ao mercado informal

em pequenas feiras.

Segundo Lucini (2008), antes da implantação da cultura de alho nobre no

Brasil, na década de 80, o alho produzido em território nacional era do tipo semi-

nobre e de baixo valor comercial. No estado do Piauí, a cultura teve seu início há

mais de um século, sendo concentrada na cidade de Picos e municípios vizinhos,

localidade conhecida genericamente como microrregião de Picos (VELOSO et al.,

1999).

O alho produzido na citada microrregião sustentava tanto o comércio local

quanto parte da demanda da capital do estado, Teresina. No entanto, com o

aumento das importações do alho nobre, vindos principalmente da Argentina e da

China, os pequenos produtores de alho dessa microrregião se viram forçados a

reduzir a produção do alho semi-nobre para uma escala que garantia apenas a

subsistência e parte do comércio local.

O principal motivo da redução na produção do alho semi-nobre é devido à

falta de competitividade deste com o alho nobre vindo da Argentina e da China, que

por possuir bulbos de tamanho maior, facilita o processo de remoção e debulha dos

bulbilhos, etapa que precede muitas de suas aplicações.

A produção de alho nobre no Piauí é inviabilizada por condições fisiológicas,

geográficas e climáticas, haja vista que para a ocorrência de germinação e

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bulbificação nesse tipo de alho é necessário que as condições de temperatura e

fotoperíodo sejam adequadas, normalmente exigindo temperaturas médias entre

12,8 ºC e 23,9 ºC, que propiciam um desenvolvimento normal da planta (MUELLER

et al., 1990).

Como consequência da crescente redução da produção de alho na

microrregião de Picos, nas últimas décadas, pode ter havido perda da diversidade

genética em relação ao alho produzido nos anos 70. Este fenômeno, aliado à falta

de recombinação meiótica, pode ter levado à erosão genética, o que torna a cultura

do alho semi-nobre, no Piauí, vulnerável a doenças, bem como pode significar perda

de germoplasma adaptado à região e acentuar ainda mais à falta de competitividade

com o alho nobre.

Além disso, como tentativa de competir com o alho nobre, os produtores da

microrregião de Picos selecionam os bulbos com maior tamanho e de melhor

qualidade para o comércio e aqueles de menor tamanho são utilizados para

constituir o plantio seguinte. Este processo de seleção negativa, com o passar dos

anos, aumenta a possibilidade de ocorrência de perdas de germoplasma,

contribuindo também para a falta de competitividade com o alho nobre.

Estudar a diversidade genética do alho cultivado no Piauí é fundamental para

o esclarecimento destas questões. Além disso, Blank et al. (2004) afirmaram que é

essencial ter informações sobre o potencial do germoplasma disponível, pois a

seleção de genótipos com características desejáveis é uma das fases mais

importantes em um programa de melhoramento genético. Este fator é

particularmente bem evidenciado no caso do alho, visto que a ausência de

recombinação meiótica limita o processo de melhoramento nas etapas de seleção

de mutantes na população.

Dentre várias metodologias, a diversidade genética pode ser analisada com o

emprego de marcadores agromorfológicos e moleculares, à semelhança dos

estudos realizados por Almajali, Abdel-Ghani e Migdadi (2012); Chung. López-Pujol

e Chung (2013); Hajmansoor, Bihamta e Alisoltani (2013); Lal (2013); Mellano et al.

(2012); Sartie, Asiedu e Franco (2012).

Portanto, o objetivo deste estudo foi caracterizar a diversidade genética

existente em doze variedades de alho (Allium sativum L.), sendo três destas

oriundas da microrregião de Picos e as outras nove cedidas pelos Bancos de

Germoplasma da Embrapa Hortaliças e da Escola Superior de Agricultura “Luiz de

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Queiroz” / Universidade de São Paulo (ESALQ/USP), por meio de marcadores

agromorfológicos e moleculares.

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2 REVISÃO DE LITERATURA

2.1 A espécie Allium sativum L.

O gênero Allium possui cerca de 750 espécies e com isso é provavelmente o

maior gênero entre as monocotiledôneas petaloides. As espécies desse gênero são

caracterizadas por apresentarem bulbos envoltos por túnicas membranosas

(algumas vezes fibrosas), tépalas livres ou semi-livres e frequentemente a inserção

subginobásica do estilete no ovário. Além disso, muitas espécies produzem

quantidades consideráveis de sulfóxidos de cisteína, grupo de compostos que é

responsável pelo odor e paladar característicos (FRITSCH et al., 2006).

As espécies pertencentes ao gênero Allium possuem um centro de

diversidade principal situado no sudoeste da Ásia e um menor, situado na América

do Norte, onde as espécies se encontram distribuídas pelo hemisfério norte,

principalmente em regiões que sazonalmente passam por períodos de seca (ETOH

e SIMON, 2002; FRITSCH et al., 2006; FRITSCH e FRIESEN, 2002).

Algumas dessas espécies podem ser usadas na alimentação, outras possuem

potencial medicinal, além daquelas que podem ser usadas como plantas

ornamentais. Dentre as espécies com importância econômica estabelecida,

destacam-se a cebola comum, a cebolinha, o alho-poró e o alho (HALNET, 2002;

KAMENETSKY e FRITSCH, 2002).

O alho é uma das mais antigas hortaliças cultivadas e há cerca de 5000 anos,

já era utilizado pelas culturas egípcias e indianas. Além destas, alguns escritos

sugerem que o alho foi cultivado na China, há cerca de 4000 anos (SIMON, 2004).

A espécie Allium sativum L., conhecida popularmente como alho, é a quarta

hortaliça mais importante do Brasil, sendo cultivada em grande parte das regiões

brasileiras e muito usada como condimento no preparo das refeições, principalmente

devido ao aroma e sabor que confere aos alimentos (LUCINI, 2008; MOTA et al.,

2006).

Existem basicamente dois tipos de alho cultivados, um conhecido como alho

nobre, caracterizado pelo tamanho e uniformidade dos bulbos, constituído por

poucos bulbilhos por bulbo e cultivado por grandes agricultores, cuja produção é

destinada ao mercado formal. O outro tipo é o semi-nobre, caracterizado pelo

pequeno tamanho do bulbo, no qual estão inseridos numerosos bulbilhos, dispostos

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sem uniformidade e estreitos, conhecidos como “bulbilhos palitos”. É cultivado por

pequenos agricultores e sua produção frequentemente é destinada à subsistência e

ao mercado local (MELO et al., 2011).

Da planta de alho muito pode ser aproveitado, as folhas e as inflorescências

são consumidas quando ainda verdes, enquanto os bulbos frescos servem como

condimento alimentar. Além disso, preparados envolvendo o bulbo também são

muito utilizados para fins fitoterápicos (KIK e GEBHARDT, 2001).

Sabe-se que a cultura do alho necessita de temperatura e fotoperíodo

específicos para adequada formação dos bulbos e desenvolvimento normal da

planta. No entanto, existe cultivares que respondem de modo distinto a estas

diferenças, havendo, portanto cultivares adaptadas a determinadas regiões e épocas

de cultivo (MUELLER et al., 1990).

O plantio de alho nobre em escala comercial no Brasil teve seu início na

década de 1980. Antes disso, a produção de alho era localizada principalmente nos

estados de Minas Gerais e Goiás, onde se cultivavam alhos comuns, brancos e de

baixo valor comercial (LUCINI, 2008).

No Piauí, mais especificamente na microrregião de Picos, a produção de alho

teve seu início há mais de um século, concentrando-se nos municípios de Picos,

Sussuapara e Bocaina. No entanto, levando-se em conta o histórico da produção de

alho por estes municípios, nota-se que tem havido um grande declínio nas últimas

décadas, fato que tem sido atribuído à redução da área plantada e ausência de

cultivares geneticamente superiores, capazes de competir com o alho chinês,

espanhol e argentino (VELOSO et al., 1999).

Segundo Quiroga et al. (1975), o alho foi uma das culturas de maior

importância econômica nos municípios de Picos e Bocaina, estado do Piauí, e com

base em um levantamento realizado na época, estimou-se em 700, o número de

produtores nestes dois municípios. Além disso, os autores destacaram a importância

da cultura do alho como geradora de emprego, haja vista que Picos é um dos

municípios com maior densidade demográfica no estado.

2.2 Conservação do germoplasma de alho

A preocupação com a prevenção da erosão genética despertou o interesse

pela conservação do germoplasma vegetal há mais de 30 anos, de modo a protegê-

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lo de eventuais perdas e garantir sua utilização sempre que necessário. Os recursos

genéticos de plantas podem ser conservados na forma de sementes, pólen, órgãos

vegetativos e plantios no campo (SOUZA et al., 2009).

Atualmente, o alho silvestre é encontrado na Ásia Central, principalmente na

região do Quirguistão, Tajiquistão, Turquemenistão e Uzbequistão. No entanto, ele

foi encontrado sobre um território mais amplo que se estende da China à Índia,

passando pelo território correspondente à Ásia Central e continuando da Ucrânia ao

Egito. Esta região em que é encontrado alho selvagem é conhecida como sendo seu

centro de diversidade, já que esta é a localidade geográfica onde a cultura se

originou e o único lugar em que a espécie floresceu na natureza (SIMON, 2004).

O alho cultivado se reproduz exclusivamente por meio de propagação

vegetativa através dos bulbilhos e apenas os tipos selvagens desta espécie, ainda

que raramente, produzem sementes. Em função do tipo de propagação, as plantas

filhas correspondem a clones das plantas originais. As populações de clones dentro

desta espécie apresentam um alto grau de diversidade fenotípica, sendo esta

diversidade oriunda de mutações ou da plasticidade fenotípica apresentada por esta

cultura. Logo, genótipos superiores não são obtidos por meio de hibridação, mas

através da seleção de variantes geradas de mutações espontâneas que expressam

características de interesse agronômico (SIMON e JENDEREK, 2003; VOLK; HENK;

RICHARDS, 2004).

A manutenção desta cultura em bancos de germoplasma requer plantio

periódico das variedades no campo, para que não seja perdido o poder germinativo

do bulbilho. Segundo Souza et al. (2009), este processo de manutenção de

germoplasma tem como desvantagem a vulnerabilidade das variedades a uma série

de fatores, tais como a erosão genética devido a não adaptação das espécies e

variedades às novas condições ambientais, o risco de exposição ao ataque de

pragas, doenças e predadores eventuais, intempéries climáticas, problemas edáficos

e vandalismo, podendo as variedades serem perdidas ainda por falhas na

identificação devidas a erro humano ou por problemas de cunho técnico-

administrativo.

Segundo Cunha, Resende e Pinheiro (2012), são exemplos de instituições

que mantém coleções de germoplasma de alho no Brasil: Embrapa Hortaliças,

Instituto Agronômico de Campinas (IAC), Empresa de Pesquisa Agropecuária e

Extensão Rural (EPAGRI), Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” – USP

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(ESALQ – USP), Banco de Germoplasma de Hortaliças da Universidade Federal de

Viçosa (UFV) e recentemente foram introduzidas variedades de alho à Coleção de

Germoplasma de Alho da Universidade Federal do Piauí (UFPI).

2.3 Caracterização agromorfológica e molecular

O potencial do germoplasma coletado só pode ser aproveitado quando ocorre

a devida caracterização do material. Com a caracterização, é possível identificar os

genótipos mais promissores para os trabalhos de melhoramento e também

beneficiar os agricultores, permitindo o uso racional destes genótipos na agricultura

familiar (COELHO et al., 2010).

Blank et al. (2004) afirmaram que é essencial se ter informações sobre o

potencial do germoplasma disponível, pois a seleção de genótipos com

características desejadas é uma das fases mais importantes de um programa de

melhoramento genético. Torres et al. (2008) destacaram que a importância da

caracterização da diversidade agromorfológica, pois a partir dela é possível obter

informações sobre a variabilidade genética de cada material estudado, possibilitando

avanços na descrição da diversidade genética entre linhagens.

A caracterização morfológica consiste em fornecer uma identidade para cada

variedade, por meio do conhecimento de uma série de dados que permitam estudar

a variabilidade genética existente na população (RAMOS e QUEIROZ, 1999).

Geralmente, os dados são coletados através do uso de descritores, que são

compilados e publicados pelo International Plant Genetic Resources Institute

(IPGRI), hoje conhecido como Biodiversity. Tais descritores correspondem a

caracteres altamente herdáveis facilmente detectáveis e que mantenham o mesmo

padrão de expressão em diversos ambientes (IPGRI, 2001). No entanto, muitos

caracteres de importância econômica são determinados por descritores

quantitativos, controlados por vários genes, o que torna sua mensuração trabalhosa

e muito influenciada pelo ambiente, mas que são de grande importância no ponto de

vista agronômico (NASS et al., 2001).

Os marcadores moleculares podem ser utilizados como ferramentas para o

estudo da diversidade genética dentro e entre populações (HONNAY et al., 2007;

LEBRET et al., 2012; MORI et al., 2012), sistema reprodutivo das espécies

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(PRABHA; INDIRA; NAIR, 2011), mapeamento de QTLs (LI et al., 2012; SINGH et

al., 2012; WANG et al., 2012) e mapeamento associativo entre outros.

Um marcador molecular é definido como qualquer fenótipo molecular oriundo

de um gene expresso ou de um segmento específico de DNA. A utilização de

marcadores moleculares tem colaborado de forma significativa como ferramenta

auxiliar na definição do status taxonômico e populacional de várias espécies

vegetais e animais (FERREIRA e GRATTAPAGLIA, 1998).

A caracterização de variedades, linhagens ou híbridos por meio de

marcadores moleculares tem sido de grande importância na proteção do direito

intelectual do melhorista, sendo utilizada como prova legal em processos jurídicos

nos países em que já vigoram as leis de proteção de cultivares. O elevado nível de

resolução genética e a confiabilidade obtida por meio de análises com marcadores

moleculares possibilitam a discriminação entre linhagens ou variedades com base

genética estreita, o que é comum entre variedades comerciais (BORÉM, 2005).

Independentemente da cultura, o sucesso de um programa de melhoramento

genético depende fundamentalmente de algumas etapas, como a escolha de

genitores que produzam indivíduos com a melhor combinação de alelos favoráveis

ou a seleção de genótipos superiores em que há variação genética. Com o advento

das técnicas de biologia molecular, tornou-se possível a manipulação do DNA, que

culminou no surgimento dos vários tipos de marcadores moleculares disponíveis

atualmente (LANZA; GUIMARÃES; SCHUSTER, 2000).

2.4 Marcadores microssatélites

Os microssatélites, ou sequências simples repetidas (SSR), são pequenas

sequências de nucleotídeos repetidas em blocos seguidos no genoma, repetições

ditas em tandem. Elas são bastante frequentes e distribuídas no genoma de

organismos eucarióticos (LIU e WENDEL, 2001).

A unidade que se repete em uma sequência microssatélite é chamada de

motivo e a variação no número de repetições destes motivos corresponde ao

polimorfismo. Desta forma, os microssatélites têm sido usados como marcadores

moleculares e como podem existir diferentes números de repetições em cada

sequência, estes tendem a ser bastante informativos (KIM; JUNG; CHOI, 2012;

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MITSUI e SETOGUCHI, 2012; PARVARESH; TALEBI; SAYED-TABATABAEI, 2012;

PRIORI et al., 2012).

A utilização de marcadores microssatélites em análises genéticas é um

procedimento de baixo custo, haja vista que o maior investimento tende a ser feito

na busca pelos microssatélites no genoma e as sequências que os flanqueiam.

Estas últimas costumam ser específicas para uma espécie ou gênero, logo o

processo de identificação das sequências geralmente tende a ser feito à medida que

se pretende utilizar os marcadores microssatélites para análises genéticas em

espécies cujos marcadores ainda não tenham sido desenvolvidos (BAJAY et al.,

2009; CLIVATI et al., 2012; CUNHA et al., 2012; DONG; ZHANG; YANG, 2012; GAO

et al., 2012).

Ao se identificar as sequências que flanqueiam os microssatélites,

desenvolve-se primers que se anelam a estas sequências para que a região

microssatélite seja amplificada via reação em cadeia da polimerase (PCR). Após a

PCR, é possível que os fragmentos sejam separados por meio de eletroforese e

sejam visualizados de diferentes formas, dependendo da técnica aplicada. A

eletroforese em gel de acrilamida e a coloração com nitrato de prata são

procedimentos bastante utilizados (BASSIL et al., 2013; BENBOUZA et al., 2006;

MENGESHA et al., 2013).

2.5 Metodologias de estudo da diversidade genética

O estudo da diversidade genética é uma etapa importante no melhoramento

de plantas, notadamente nas espécies em que se pratica melhoramento genético

por seleção. Além disso, este conhecimento é importante na compreensão da

estrutura genética populacional, no acompanhamento da transferência de

características desejáveis entre espécies com relevância econômica, no manejo de

espécies ameaçadas ou que estejam submetidas a programas de restauração

florestal (SASAKI, 2005; VARSHNEY; THIEL; SRETENOVIC-RAJICIC, 2008).

O processo para o estudo da diversidade genética dentro e/ou entre

populações geralmente envolve etapas de detecção da existência de variabilidade

genética, cálculo das estimativas de distância genética ou geométrica entre estes

grupos e a aplicação de métodos de classificação ou ordenação. Estas etapas

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básicas podem ser realizadas por um método específico ou por uma combinação de

métodos.

A variação genética expressada é chamada de fenotípica e pode ser

detectada, geralmente, por diferenças em moléculas de proteína, características

fisiológicas e bioquímicas diversas e também por variações cromossômicas,

comportamentais e morfológicas. A variação genotípica se refere primariamente à

informação contida no genoma de cada indivíduo, que é herdada pela prole a partir

de seus genitores, e que pode expressar ou não alguma variação fenotípica, ela é

detectada principalmente através do uso de marcadores moleculares (SANTOS et

al., 2009).

Uma característica que sofre variação mensurável ou não é chamada de

variável e esta pode assumir distribuição contínua ou em classes na população,

dependendo de sua natureza. Geralmente, as variáveis que assumem distribuição

contínua são chamadas de quantitativas ou numéricas (altura da planta, peso dos

grãos, dias do plantio à colheita), enquanto as que formam classes são chamadas

de qualitativas como, por exemplo, a cor da folha e do fruto, presença ou ausência

de uma característica, marcador molecular, dentre outras (BARBÉ et al., 2010;

FRANCO et al., 2001).

De forma geral, os dados qualitativos utilizados nas análises são de natureza

binária, deste modo elas se baseiam na presença (1) ou ausência (0) da

característica em questão. Porém, na caracterização agromorfológica do

germoplasma vegetal frequentemente são utilizadas as variáveis multicategóricas,

ou seja, aquelas que podem assumir mais de duas classes para cada variável

(LEDO et al., 2008).

Além dos dados qualitativos, a caracterização agromorfológica envolve a

coleta de dados quantitativos. No estudo destas características, por partir de

mensurações e, portanto, dificultar o estabelecimento de classes distintas, faz-se útil

o uso de médias, variâncias, coeficientes de regressão, correlações, entre outras

(RAMALHO; FERREIRA; OLIVEIRA, 2000).

Dispondo destes dados, procede-se com as estimativas das distâncias entre

as populações. Para as variáveis quantitativas, estas estimativas podem ser obtidas

por através da distância generalizada de Mahalanobis, enquanto para as variáveis

qualitativas tem-se utilizado o complemento aritmético de Jaccard.

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A distância de Mahalanobis considera a variabilidade existente em cada

unidade amostral, sendo aplicada para dados oriundos de experimentos em que se

fez uso de delineamentos e quando as variáveis são correlacionadas. Quando as

correlações entre as variáveis forem nulas, assume-se que estas variáveis estão

padronizadas, e a distância de Mahalanobis é equivalente à distância euclidiana

simples (CRUZ, 1990).

A análise de agrupamento é uma técnica multivariada que tem por objetivo

proporcionar a organização dos dados em grupos por algum critério de classificação,

de tal forma que exista máxima homogeneidade dentro e máxima heterogeneidade

entre grupos (SNEATH e SOKAL, 1973). Dos métodos de agrupamento, os mais

utilizados são hierárquicos e os de otimização (CRUZ; FERREIRA; PESSONI, 2011).

Nos métodos hierárquicos, os genótipos são agrupados e estes grupos são

dispostos em vários níveis, resultando em um dendrograma, sem levar em conta o

número ótimo de grupos. Entre os hierárquicos, o método da distância média entre

grupos (UPGMA) é o mais simples para a construção de árvores filogenéticas,

utilizando a média das distâncias entre todos os pares de genótipos para formação

de cada grupo (CRUZ e CARNEIRO, 2003).

Dentre os métodos de otimização, destaca-se o algoritmo de Tocher que

consiste em um método de agrupamento que se baseia na formação de grupos em

que as distâncias dentro dos grupos sejam menores que as distâncias entre grupos.

Desta forma, obtém-se o número ótimo de grupos e as variedades contidas em cada

grupo (FARIA et al., 2012).

O uso de técnicas multivariadas na detecção da diversidade genética exige

certo grau de estruturação nos dados. Diante disto, é importante que critérios

diferentes de agrupamento sejam utilizados e que se considere como correta a

estrutura consenso da maior parte deles, para que seja assegurado que o resultado

obtido não seja um artefato da técnica utilizada (ARRIEL et al., 2006).

Além das análises de agrupamento, outras técnicas multivariadas visam à

redução na dimensionalidade das variáveis de forma que a nova combinação de

variáveis lineares não correlacionadas resultante expliquem a estrutura de variâncias

e covariâncias do conjunto de variáveis originais. Dentre estas técnicas

multivariadas, destacam-se a análise de componentes principais (ACP) e a análise

de variáveis canônicas.

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A Análise de Componentes Principais (ACP) tem por objetivos a descrição dos

dados através da redução do número de dimensões da matriz de distâncias entre os

objetos. O processo básico da análise é considerar um conjunto de p variáveis e

encontrar combinações lineares entre elas que produzam índices não

correlacionados (JAMES e McCULLOCH, 1990). Esta análise encontra-se

certamente entre as mais importantes ferramentas da análise multivariada, inclusive

por constituir a base na qual se fundamentam a maioria dos outros métodos

multivariados de análise de dados (LYRA et al., 2010).

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3 MATERIAL E MÉTODOS

3.1 Material genético

Dentre o material genético avaliado no experimento (Tabela 1), três

variedades crioulas de alho foram coletadas junto aos agricultores em área de

cultivo, feiras e mercados populares na Microrregião de Picos-PI. Posteriormente,

estas foram incorporadas à Coleção de Germoplasma de Alho da UFPI e ao Banco

Ativo de Germoplasma de Alho da ESALQ/USP. Utilizou-se também uma variedade

cedida pela Embrapa Hortaliças, que corresponde a um material oriundo de coleta

de germoplasma no Piauí, em 1976. Além disso, utilizou-se oito variedades

procedentes da Coleção de Germoplasma de Alho da ESALQ/USP, que foram

selecionadas por serem semelhantes ao material cultivado no Piauí no que diz

respeito à nomenclatura da variedade, aos aspectos agromorfológicos e

moleculares, de acordo com estudos realizados por Cunha et al. (2012).

Tabela 1 – Identificação das variedades utilizadas nas caracterizações

agromorfológica e molecular de Allium sativum L., avaliadas em

Piracicaba – SP, 2012.

Variedade Procedência

Bocaina – PI Piauí Santo Antônio de Lisboa - PI Piauí Sussuapara – PI Piauí Branco Mineiro - PI Piauí (Embrapa Hortaliças) BGH 0525 ESALQ/USP Catetinho do Paraná 1254 ESALQ/USP Cateto Roxo 99 ESALQ/USP Embrapa Cateto Roxo Livre de Vírus ESALQ/USP Mendonça 5062 ESALQ/USP Roxinho 5063 ESALQ/USP Roxo de Minas (Dr. Joaquim) ESALQ/USP Sergipe ESALQ/USP

3.2 Caracterização e avaliação agromorfológica das variedades

O experimento foi conduzido no Departamento de Genética da ESALQ/USP,

na cidade de Piracicaba - SP, seguindo o delineamento em blocos casualizados com

número diferente de repetições, dependendo da disponibilidade de material. O

plantio foi realizado em canteiros, comuns na cultura de várias hortaliças, sobre eles

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a parcela experimental foi constituída de quatro fileiras de um metro, com

espaçamento de 10 cm entre plantas dentro das fileiras e 25 cm entre cada fileira. A

área útil da parcela foi constituída das duas fileiras centrais (Figuras 1 e 2).

Os bulbilhos de cada variedade utilizada no plantio foram selecionados de

acordo com o tamanho e a qualidade, sendo descartados aqueles que se

apresentavam desuniformes ou chochos.

As capinas foram realizadas manualmente, deixando-se a cultura livre da

concorrência com plantas daninhas, e as pulverizações com fungicida foram

realizadas de acordo com a necessidade da cultura.

Figura 1 – Experimento de alho em blocos casualizados. (a) e (b) Plantio disposto

em canteiros; (c) Disposição do sistema de irrigação; (d) Plantas de alho

com 30 dias após o plantio.

b a

d c

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b a

Figura 2– (a) Plantas de alho aos 90 dias

de plantio. (b) Coleta do alho para avaliação.

3.2.1 Caracteres avaliados

Aos 90 dias após o plantio, foram medidos os seguintes caracteres, em seis

plantas nas duas fileiras centrais, segundo IPGRI (2001):

1 Altura da planta – dimensão referente à medida do solo até a extremidade da

folha superior, em cm;

2 Largura da folha – medida determinada no terço médio da folha superior da

planta totalmente desenvolvida, em cm;

3 Comprimento da folha – medida na folha mais desenvolvida da planta, em cm;

4 Número de folhas – referente à quantidade de folhas que apresentavam

atividade fotossintética;

5 Densidade da folhagem da planta - avaliada de acordo com uma escala de

notas, sendo: (1) muito esparsa, (3) esparsa, (5) média, (7) densa;

6 Atitude da folha -avaliada de acordo com uma escala de notas, sendo: (3) ereta,

(5) semiereta, (7) horizontal;

7 Largura da base do pseudocaule – medida determinada somente em cultivares

que não perfilharam, em cm;

Os caracteres a seguir foram avaliados por parcela, de acordo com as

respectivas escalas de notas:

8 Intensidade da coloração - verde da folha- (3) clara, (5) média, (7) escura;

9 Cerosidade da folha - (3) fraca, (5) média, (7) forte;

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10 Formato da seção transversal da folha - (1) fortemente côncava, (2) levemente

côncava, (3) plana;

11 Intensidade da pigmentação antociânica na base do pseudocaule - (1) ausente

ou muito fraca, (3) fraca, (5) média, (7) forte, (9) muito forte;

12 Avaliação quanto à incidência da ferrugem (Puccinia alli) – (1) presença, (0)

ausência;

No final do ciclo foram coletados os dados dos caracteres relacionados a

seguir:

13 Percentagem de plantas com bulbilhos aéreos – determinada pela percentagem

do número de plantas que emitiram bulbilhos aéreos.

14 Número de dias para a colheita – referente ao período desde o plantio até

quando cerca de 2/3 das folhas começarem a amarelecer e ou secar.

Após a colheita, as plantas foram armazenadas por 30 dias em galpão

ventilado, realizando-se em seguida a toalete, que consistiu em aparar as raízes e

deixar o caule com 2 cm, para determinação das seguintes características:

15 Produtividade total de bulbos – referente à massa dos bulbos colhidos na área

útil e bordadura, transformados em t/ha.

As avaliações a seguir foram realizadas na área útil da parcela:

16 Peso dos bulbos comerciais – referente à massa dos bulbos com diâmetro

superior a 35 mm;

17 Tamanho do bulbo – determinado conforme uma escala de notas, sendo (3)

pequeno, (5) médio, (7) grande;

18 Uniformidade dos bulbos – determinada de acordo com uma escala de notas, na

qual (1) uniforme, (2) normal e (3) muito uniforme;

19 Posição do disco radicular do bulbo – classificado como (1) deprimido, (2) plano,

(3) protuberante;

20 Forma da base do bulbo – classificado como (1) deprimida, (2) plana, (3)

arredondada;

21 Coloração de fundo da túnica do bulbo – sendo (1) branca e (2) branca

amarelada, (3) branca avermelhada;

22 Estrias antociânicas na túnica do bulbo – classificadas como (1) ausentes (2)

presentes;

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23 Formato do bulbo na seção longitudinal – sendo (1) transverso elíptico curto, (2)

transverso elíptico largo e (3) circular;

24 Formato do bulbo na seção transversal – considerado como (1) elíptico e (2)

circular;

25 Aderência das túnicas do bulbo – sendo (3) fraca, (5) média e (7) forte;

Os bulbilhos foram avaliados, tomando-se cinco bulbos aleatoriamente da

parcela útil, para os seguintes caracteres:

26 Cor das folhas externas do bulbilho – classificada como (1) branco; (2) amarelo;

(3) marrom; (4) vermelho; (5) violeta;

27 Número de bulbilhos/bulbo;

28 Tamanho dos bulbilhos -considerando (1) pequeno; (2) médio e (3) grande;

29 Uniformidade dos bulbilhos -foram usadas as categorias (1) uniforme, (2) normal

e (3) muito uniforme;

30 Distribuição dos bulbilhos – sendo (1) radial e (2) não radial;

31 Bulbilhos externos (desencaixados) -classificados como (1) ausentes e (2)

presentes;

32 Facilidade de remoção dos bulbilhos -considerando (1) difícil, (2) normal e (3)

fácil;

33 Tamanho do bulbilho – classificado como (3) pequeno, (5) médio e (7) grande;

34 Cor da túnica do bulbilho – sendo (1) branca, (2) amarelada, (3) rosada, (4)

arroxeada e (5) marrom;

35 Intensidade da cor da túnica do bulbilho – considerando (3) fraca, (5) média e (7)

forte;

36 Estrias antociânicas na túnica do bulbilho – sendo (1) ausentes e (2) presentes;

37 Coloração da polpa do bulbilho – caracterizando como (1) branca e (2)

amarelada.

3.2.2 Análises estatístico-genéticas

Os dados foram testados quanto à normalidade e homogeneidade das

variâncias pelos testes de Barlett e Lilliefors, seguindo as recomendações de Little e

Hills (1978), e submetidos à análise de variância (Tabela 2), considerando-se fixo o

efeito de tratamentos (variedades), de acordo com o seguinte modelo matemático:

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𝑌𝑖𝑗 = 𝑚 + 𝑡𝑖 + 𝑏𝑗 + 𝑒𝑖𝑗

Em que:

𝑌𝑖𝑗 = valor do tratamento i na repetição j;

𝑚 = média geral;

𝑡𝑖 = efeito do tratamento i;

𝑏𝑗 = efeito do tratamento j;

𝑒𝑖𝑗 = erro experimental associado à parcela ij.

Tabela 2 – Esquema da análise de variância, com respectivas esperanças do

quadrado médio.

Fonte de variação GL Quadrado médio E (QM) F

Repetição (j – 1) Q1 𝜎2 + 𝐼𝜎𝑅2 𝑄1/𝑄3

Tratamentos (i – 1) Q2 𝜎2 + 𝐽𝜎𝑇2 𝑄2/𝑄3

Resíduo médio (j – 1) (i – 1) Q3 𝜎2 GL: Grau de Liberdade; E (QM): Esperança do Quadrado médio; F: Teste F.

No estudo da divergência genética entre as variedades de alho, utilizou-se a

distância generalizada de Mahalanobis para os caracteres quantitativos, como

medida de dissimilaridade, enquanto para os caracteres qualitativos utilizou-se o

complemento aritmético de Jaccard. Para os caracteres quantitativos, estão

disponíveis informações de médias, variâncias e covariâncias das populações, que

são úteis para o cálculo das distâncias, pelo uso de medidas de dissimilaridade,

como Penrose (1953) e Mahalanobis (1948). Neste trabalho, utilizou-se da distância

generalizada de Mahalanobis para o cálculo da distância entre as populações, pois,

de acordo com Manly (2008), o fato da distância generalizada de Mahalanobis levar

em consideração a correlação entre as variáveis oferece uma vantagem em relação

à distância de Penrose, pois sem esta informação duas variáveis altamente

correlacionadas contribuiriam individualmente com aproximadamente a mesma

quantidade para as distâncias populacionais como uma terceira variável que não é

correlacionada com todas as outras variáveis. O cálculo das distâncias

generalizadas de Mahalanobis foi efetuado segundo Cruz e Carneiro (2003), por

meio da expressão:

𝐷𝑖𝑖′2 = 𝛿′Ψ

−1𝛿

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Em que:

𝐷𝑖𝑖′2 = distância de Mahalanobis entre os genótipos i e i’;

Ψ = matriz de variâncias e covariâncias residuais;

δ’ = [d1dd...dn];

𝑑𝑣 = 𝑌𝑖𝑣 − 𝑌𝑖′𝑣′;

Yiv: é a média do i-ésimo genótipo em relação a v-ésima característica.

Outra abordagem foi realizada com base nos caracteres qualitativos que,

normalmente, quando utilizados em análises multivariadas são de natureza binária,

isto é, ausência (0) ou presença (1) de uma determinada característica. Porém,

segundo Vendramini et al. (2011), na caracterização agromorfológica de uma

determinada espécie são frequentemente utilizadas as variáveis multicategóricas,

com mais de duas classes por variável. Portanto, para se proceder com a análise, as

variáveis multicategóricas foram convertidas em binárias, segundo o método

proposto por Sneath e Sokal (1973) e calculou-se os coeficientes de dissimilaridade

com base no complemento aritmético de Jaccard, segundo a expressão:

𝑑𝑖𝑗 = 1 − 𝑠𝑖𝑗

Em que:

𝑠𝑖𝑗 =𝑎

𝑎 + 𝑏 + 𝑐

Onde:

a – coincidências do tipo 1 – 1;

b – coincidências do tipo 1 – 0;

c – coincidências do tipo 0 – 1.

Com base nas distâncias calculadas, realizou-se as análises de agrupamento,

seguindo o critério UPGMA, método hierárquico que faz uso da média das distâncias

de todos os genótipos para formação de cada grupo. Portanto, foram gerados

dendrogramas individuais para cada grupo de caracteres (quantitativos e

qualitativos), e em seguida foi obtida uma matriz resultante da soma das matrizes de

distâncias de Mahalanobis e do complemento aritmético de Jaccard, com posterior

submissão desta nova matriz ao método de agrupamento UPGMA.

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Visando melhorar a interpretação dos agrupamentos, utilizou-se o método de

otimização de Tocher, no qual a inclusão de indivíduos em um grupo ocorre quando

a distância média intragrupo não excede a distância intergrupo, ou seja, a

divergência dentro de cada grupo deve ser menor que as distâncias médias entre

quaisquer grupos (CRUZ e CARNEIRO, 2003).

Em função da ocorrência de diferenças significativas entre as variedades de

alho para a maioria dos caracteres quantitativos avaliados, procedeu-se o estudo da

importância relativa destes caracteres na composição da variação existente nas

populações. Para isto, realizou-se a análise de componentes principais, que consiste

em um método multivariado que tem por objetivo a redução da dimensionalidade dos

dados, de tal forma que um conjunto de “p” variáveis correlacionadas seja reduzido

para um número menor de índices não correlacionados (MANLY, 2008). A

identificação das variáveis que mais contribuíram para a divergência entre os clones

foi feita de acordo com Cruz e Regazzi (2001). As análises estatístico-genéticas

foram realizadas utilizando-se o programa SAS (SAS INSTITUTE, 1999).

3.3 Caracterização molecular das variedades

Para aumentar o poder da estimativa da diversidade genética entre as

variedades estudadas, realizou-se a genotipagem das variedades pelo uso de

marcadores microssatélites.

3.3.1 Coleta de material botânico e extração de DNA

Na caracterização molecular, foram estudadas as quatro variedades coletadas

no Piauí e as oito procedentes do Banco de Germoplasma do Departamento de

Genética da ESALQ/USP.

As folhas dos genótipos foram coletadas, armazenadas separadamente em

freezer a -20ºC e posteriormente liofilizadas. Em seguida, foram maceradas com

auxílio de moinho elétrico.

Na extração do DNA genômico dos indivíduos a serem estudados, a partir de

500 mg de tecido fresco, utilizou-se o protocolo descrito por Doyle e Doyle (1990). A

quantificação das amostras foi estimada pela intensidade de fluorescência emitida

pelo brometo de etídio, sob luz ultravioleta em géis de agarose a 0,8%. Essa

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intensidade foi comparada a de padrões com pesos moleculares e concentrações

específicas e conhecidas (DNA de fago λ).

3.3.2 Caracterização e genotipagem dos microssatélites

As amostras analisadas foram constituídas por oito indivíduos de cada uma

das doze variedades, totalizando 96 indivíduos. Este procedimento foi adotado para

possibilitar a estimativa da variação dentro de cada variedade e não apenas entre as

variedades. Utilizou-se oito locos microssatélites, cujas sequências, motivos,

temperaturas de anelamento e tamanhos esperados estão discriminados na Tabela

3.

Tabela 3 – Conjunto de iniciadores desenvolvidos por Cunha et al. (2012), utilizados

na caracterização do germoplasma de alho.

Loco Sequência dos Iniciadores Motivos e

Repetições Ta (ºC)

Tamanho Esperado

Asa 07 F: CTCGGAACCAACCAGCATA

(TG)7 58 229-235 R: CCCAAACAAGGTAGGTCAGC

Asa 08 F: TGATTGAAACGAATCCCACA

(GT)8 56 209-257 R: GGGGTTACCTGAACCTGTTA

Asa 10 F: TTGTTGTTCTGCCATTTT

(AC)7 48 225-239 R: GATCTAAGCCGAGAGAAA

Asa 14 F: TCTATCTCGCTTCTCAGGGG

(GT)7 48 220-234 R: CTGACAGAAGTAGTCTTTCC

Asa 18 F: TCAAGCTCCTCCAAGTGTCC

(TG)8 45 254-264 R: TCGGGATATGACAGCATTTG

Asa 24 F: TTGTTGTGCCGAGTTCCATA (GT)4 (GT)3

(GT)5 48 149-161

R: AGCAATTTACCAAAGCCAAG

Asa 25 F: GCACTTCACTTTCCCCATTC

(CT)3 (CT)27 51 117-127 R: GGCGACGGTGAAGAGAGAG

Asa 31 F: CAGAGACTAGGGCGAATGG

(CTT)7 50 237-243 R: ATGATGATGACGACGACGAG

Ta (ºC): temperatura de anelamento; F: Forward; R: Reverse.

A genotipagem foi realizada em gel de acrilamida 7% e coradas com nitrato de

prata. Foram calculadas as frequências alélicas e genotípicas em cada loco,

utilizando o programa TFPGA (MILLER, 1997). As frequências alélicas, o número de

alelos por loco (A), a heterozigosidade observada (Ho) e esperada (He) foram

estimadas com o auxílio do programa GDA (LEWIS e ZAYKIN, 2000), e as

estatísticas F, θ, f desenvolvidas por Weir e Cockerham em 1984, foram

determinadas utilizando-se o programa FSTAT (GOUDET, 2002).

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A estruturação da variabilidade foi visualizada através de dendrogramas

construídos pela matriz de distâncias genéticas de Rogers (1972), modificadas por

Wright (1978), e pelo critério de agrupamento UPGMA; para isto utilizou-se o

programa NTSYS (ROHLF, 1989). A estabilidade dos agrupamentos foi testada

através de 10.000 reamostragens bootstrap.

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4 RESULTADOS E DISCUSSÃO

As análises de variância para os caracteres avaliados mostram que houve

diferença significativa entre as doze variedades de alho, aos níveis de 5% e 1% de

probabilidade, com exceção de atitude da folha (Tabela 4), evidenciando a presença

de variabilidade entre as variedades.

Quanto ao coeficiente de variação (CV), observou-se que foram baixos os

valores registrados para número de dias para colheita (2,18%), altura da planta

(3,95%), comprimento da folha (4,21%), número de folhas (5,03%), largura da folha

(7,60%) e largura da base do pseudocaule (9,51%); médios para atitude da folha

(13,20%), densidade da folhagem (14,56%) e produtividade total dos bulbos

(15,82%); e altos para número de bulbilhos por bulbo (21,57%), percentagem de

plantas com bulbilhos aéreos (24,53%) e peso dos bulbos comerciais (26,00%).

O coeficiente de variação é um parâmetro utilizado como indicativo de

precisão experimental, de forma que, quanto menor o valor da sua estimativa maior

terá sido a sua precisão. Segundo Pimentel-Gomes (2009), a precisão experimental

de acordo com o coeficiente de variação é alta quando este é inferior a 10%, média

quando o coeficiente de variação se encontra entre 10% e 20% e baixa quando se

encontra entre 20 e 30%. Quando o valor do coeficiente de variação é superior a

30%, diz-se que a precisão experimental é muito baixa para a variável resposta em

questão. Entretanto, essa classificação não leva em consideração as

particularidades da cultura estudada, e, principalmente, não faz distinção quanto ao

tipo de herança do caráter avaliado (COSTA; SERAPHIN; ZIMMERMANN, 2002).

Assim, constatou-se que para a maioria dos caracteres avaliados, a precisão

experimental é classificada como de alta a média.

O caráter atitude da folha não apresentou efeito significativo para tratamentos

e foi descartado das análises subsequentes, pois não contribuiu para a identificação

da variabilidade genética existente entre as variedades.

Um procedimento fundamental da análise de componentes principais envolve

a verificação da existência de correlação entre os caracteres. Por isso, estimou-se

os coeficientes de correlações fenotípicas e genotípicas entre os onze caracteres

quantitativos nas doze variedades de alho (Tabela 5).

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31

Tabela 4 – Resumo das análises de variâncias dos caracteres quantitativos avaliados em doze variedades de alho, no município de Piracicaba – SP, em 2012.

Fonte de variação

GL Quadrados médios

AP LF CF NF DF AF LBP PPBA NDC PTB PBC NBB

Blocos 3 54,83 0,05 61,15 0,25 2,45 0,63 0,04 0,013 0,76 74595,6 9658,7 25,19

Variedades 11 53,74** 0,05** 12,82** 0,57** 17,12** 0,24ns 0,16** 0,098** 76,58** 319398** 60866,8** 217,45**

Resíduos 29 4,97 0,02 2,92 0,17 0,34 0,21 0,01 0,018 9,34 31899,5 13637,8 16,52

Média 56,36 1,81 40,60 8,40 4,03 3,54 1,02 0,549 139,70 1128,8 449,0 18,84

CV(%) 3,95 7,60 4,21 5,03 14,56 13,20 9,51 24,53 2,18 15,82 26,00 21,57 CV(%): Coeficiente de Variação; GL: Graus de Liberdade; ** significativo a 1% de probabilidade; ns: não significativo. AP – altura da planta, LF – largura da folha, CF – comprimento da folha, NF – número de folhas, DF – densidade da folhagem, LBP – largura da base do pseudocaule, PPBA – percentagem de plantas com bulbilhos aéreos, NDC – número de dias para a colheita, PTB – produtividade total de bulbos, PBC – peso dos bulbos comerciais e NBB - número de bulbilhos por bulbo.

Tabelas 5 – Estimativas dos coeficientes de correlações fenotípicas (acima da diagonal) e genotípicas (abaixo da diagonal) avaliados em doze variedades de alho, no município de Piracicaba – SP, em 2012.

Caracteres¹ AP LF CF NF DF LBP PPBA NDC PTB PBC NBB

AP 1 -0,46* 0,67* -0,33* -0,82* -0,64* -0,28* -0,61* -0,37* -0,35* 0,53*

LF -0,58* 1 0,01 0,03 0,75* 0,77* 0,36* 0,23 0,00 -0,02 -0,86*

CF 0,67* -0,14 1 -0,03 -0,29* 0,04 -0,19 -0,25* 0,15 0,18 0,09

NF -0,49* 0,01 -0,13 1 0,38* 0,17 0,15 -0,20 0,70* 0,70* -0,39*

DF -0,86* 0,82* -0,35* 0,45* 1 0,76* 0,39* 0,51* 0,49* 0,45* -0,78*

LBP -0,67* 0,90* 0,07 0,21 0,77* 1 0,32* 0,54* 0,27* 0,28* -0,76*

PPBA -0,29* 0,47* -0,17 0,21 0,43* 0,35* 1 0,12 -0,05 -0,14 -0,51*

NDC -0,64* 0,30* -0,26* -0,20 0,55* 0,57* 0,06 1 0,23* 0,24* -0,10

PTB -0,41* 0,02 0,19 0,82* 0,53* 0,28* -0,10 0,21 1 0,97* -0,13

PBC -0,41* 0,07 0,30* 0,94* 0,51* 0,29* -0,24* 0,21 1,04* 1 -0,11

NBB 0,54* -0,99* 0,07 -0,47* -0,81* -0,80* -0,59* -0,13 -0,16 -0,16 1 1 AP – altura da planta, LF – largura da folha, CF – comprimento da folha, NF – número de folhas, DF – densidade da folhagem, LBP – largura da base do pseudocaule, PPBA – percentagem de plantas com bulbilhos aéreos, NDC – número de dias para a colheita, PTB – produtividade total de bulbos, PBC – peso dos bulbos comerciais e NBB -número de bulbilhos por bulbo. * significativo (p < 0,05) pelo teste t.

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32

Observou-se que grande parte das correlações foram significativas. Em geral,

as correlações genotípicas foram superiores, em valores absolutos, em relação às

correlações fenotípicas. Segundo Churata e Ayla-Osuna (1996), quando os

coeficientes de correlações genotípicas são, em valores absolutos, superiores aos

coeficientes de correlações fenotípicas, se evidencia a maior contribuição dos

fatores genéticos.

Na seleção de genótipos superiores, procedimento fundamental no

melhoramento genético do alho, as correlações genéticas altas podem ser bastante

úteis pela possibilidade de se obter ganhos indiretos ao se selecionar um genótipo

com base em um caráter que possua outro favoravelmente correlacionado (ARRIEL

et al., 1999).

No estudo em questão, a largura da base do pseudocaule mostrou

correlações fenotípicas e genéticas altas (r > 0,7) e positivas com a largura da folha

e a densidade da folhagem. A largura da folha, por sua vez, apresentou correlações

fenotípica e genética altas e positivas com densidade da folhagem. Com o número

de bulbilhos por bulbo, esses caracteres também apresentaram correlações

fenotípicas e genotípicas significativas e altas, porem negativas. Por isso, sugere-se

que largura da base do pseudocaule, largura da folha e densidade da folhagem

sejam em parte controlados por genes presentes em um mesmo grupo de ligação,

ou que apresentem efeito pleiotrópico, podendo ser aplicada seleção indireta com

base em um destes caracteres para seleção de genótipos com características do

tipo nobre, com baixo número de bulbilhos por bulbo.

Ainda com relação ao número de bulbilhos por bulbo, a percentagem de

plantas com bulbilhos aéreos apresentou correlações fenotípicas e genotípicas

significativas, moderadas (0,4 < r < 0,7) e negativas, enquanto a altura da planta,

mostrou correlações significativas e moderadas, porem positivas com esse caráter.

Segundo Melo et al. (2011), o alho semi-nobre é caracterizado pela presença de

numerosos bulbilhos por bulbo. Portanto, é possível, com base nas correlações

descritas acima, serem selecionados genótipos superiores antes que o ciclo se

complete, facilitando o processo de melhoramento da cultura para a característica

em questão.

As estimativas dos coeficientes de correlação genética entre número de

folhas e os caracteres produtividade total de bulbos e peso dos bulbos comerciais,

foram significativas, altas e positivas, enquanto as correlações fenotípicas foram

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moderadas. Por outro lado, as estimativas de correlações fenotípica e genotípica

entre o numero de folha e o numero de bulbilhos por bulbo, significativas, foram

negativas. Tais caracteres relacionados com a produtividade só são verificados ao

final do ciclo da planta. Nesse trabalho, o número de dias para completar o ciclo nas

variedades de alho variou de 120 a 150 dias, já o caráter número de folhas pode ser

aferido aos 90 dias após o plantio. Assim, a seleção de genótipos superiores para

estes caracteres relacionados à produtividade pode ocorrer precocemente através

da seleção de genótipos com maior número de folhas, podendo não haver

necessidade de esperar que se complete o ciclo da planta. Panthee et al. (2006) e

Singh et al. (2011), também observaram que o número de folhas está correlacionado

positivamente com a produtividade, corroborando com os resultados obtidos neste

estudo.

A altura da planta e percentagem de plantas com bulbilhos aéreos também

apresentam correlações genéticas significativas e negativas com os caracteres

relacionados à produtividade. Isso significa que plantas com altura moderada e baixa

percentagem de plantas com bulbilhos aéreos na cultura levam a um incremento na

produtividade. Já os caracteres comprimento da folha, densidade da folhagem e

largura da base do pseudocaule estão correlacionados positivamente com os

caracteres de produtividade. Logo, pode-se inferir que a seleção com base nestes

caracteres vegetativos também podem levar a ganhos moderados na produtividade

de bulbos de alho.

Para o número de dias para colheita, importante na determinação de

genótipos precoces ou tardios, observou-se que existem correlações genéticas

significativas, positivas, moderadas ou baixas (r < 0,4) com largura da folha,

densidade da folhagem e largura da base do pseudocaule, enquanto existem

correlações genéticas, significativas, negativas moderadas ou baixas com altura da

planta e comprimento da folha.

Densidade da folhagem também está correlacionada positivamente com

largura da folha e número de folhas, enquanto está correlacionada negativamente

com altura da planta e comprimento da folha. Isso pode ser facilmente explicado, já

que largura da folha e número de folhas interferem diretamente na área da folhagem

da planta. Como densidade da folhagem é uma medida de disposição da folhas pela

área da planta, aquelas plantas com folhas mais largas e em maior número tendem

a ter maior densidade de folhagem. Além disso, os genótipos mais altos e com

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34

folhas mais compridas tendem a ter folhas mais esparsas, caracterizando baixa

densidade da folhagem.

Panthee et al. (2006), analisando a diversidade genética em alho oriundo do

Nepal com base em descritores agromorfológicos, observaram que a altura da

planta está correlacionada positivamente e moderadamente com o número de

folhas, baixa e positivamente com o número de dias para colheita, moderadamente e

positivamente com número de bulbilhos por bulbo e produtividade. Os resultados

obtidos por Panthee et al. (2006) diferem dos apresentados neste trabalho para as

correlações supracitadas. Sugere-se que estas diferenças tenham sido devidas as

diferenças entre as variedades estudadas.

Singh et al. (2011), estudando as correlações entre os caracteres e análise de

trilha em alho, observaram a existência de correlação alta e positiva entre o número

de bulbilhos por bulbo e os caracteres relacionados com a produtividade, além disso,

houve correlação moderada e positiva entre altura da planta e produtividade total

dos bulbos, diferindo dos resultados apresentados neste trabalho. Ressalta-se que o

material estudado por Singh et al. (2011) correspondia a variedades que, segundo os

próprios autores, já possuíam características desejáveis, enquanto o utilizado neste

estudo corresponde a variedades que não necessariamente passaram por etapas de

seleção, para obtenção de genótipos superiores. Portanto, dentro do material

estudado por Singh et al. (2011), as correlações encontradas podem diferir das

obtidas neste estudo.

A existência de correlação entre os caracteres possibilita a aplicação da

análise de componentes principais, uma vez que aplicar tal análise para caracteres

não correlacionados não traria benefícios às interpretações. A eficiência desta nova

descrição dos dados através dos componentes vai depender da porcentagem de

variação total que cada componente contém, quando arranjados em ordem

decrescente de variância (MANLY, 2008).

Ao se proceder com a análise de componentes principais para os dados

obtidos, observa-se que os três primeiros componentes explicaram 79,48% da

variação (Tabela 6).

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Tabela 6 – Autovalores de cada componente principal e variância acumulada em

relação à variância total, avaliados em 12 variedades de alho. Piracicaba

– SP, 2012.

Componente Variância Variância (%) Variância Acumulada

1 4,821 43,83 43,83

2 2,456 22,33 66,16

3 1,464 13,31 79,47

4 1,179 10,72 90,20

5 0,667 6,06 96,26

6 0,235 2,14 98,41

7 0,094 0,85 99,27

8 0,054 0,49 99,76

9 0,022 0,20 99,97

10 0,002 0,02 99,99

11 0,000 0,00 100,00

A análise dos autovetores associados a cada componente principal (Tabela 7)

mostra que os caracteres altura da planta (0,39) e número de bulbilhos por bulbo

(0,36) foram as que mais contribuíram para formação do primeiro componente

principal. Na formação do segundo componente principal, os caracteres que mais

influenciaram foram largura da folha (0,27) e percentagem de plantas com bulbilhos

aéreos (0,25), enquanto na formação do terceiro componente, os caracteres

comprimento da folha (0,55) e altura da planta (0,38) tiveram as maiores

contribuições.

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Tabela 7 – Conjunto de autovetores associados aos caracteres e a cada

componente principal, avaliado em 12 variedades de alho. Piracicaba

– SP, 2012.

Componente

Caráter1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

AP 0,38 -0,07 0,37 -0,11 -0,15 -0,17 0,27 0,29 0,03 0,00 0,68

LF -0,32 0,27 0,34 -0,16 0,26 -0,37 -0,01 -0,60 0,06 0,22 0,21

CF 0,13 -0,26 0,54 -0,47 -0,22 0,05 0,10 -0,14 -0,14 -0,19 -0,49

NF -0,19 -0,44 0,12 0,46 0,07 0,37 0,41 -0,36 -0,18 -0,15 0,18

DF -0,44 0,01 -0,03 0,00 0,09 -0,47 0,14 0,28 -0,20 -0,65 0,00

LBP -0,38 0,12 0,16 -0,31 -0,01 0,59 -0,41 0,12 -0,09 -0,17 0,35

PPBA -0,19 0,25 0,16 0,37 -0,83 -0,09 -0,13 -0,10 0,06 -0,01 -0,01

NDC -0,24 0,10 -0,46 -0,48 -0,32 0,10 0,57 -0,09 -0,01 0,15 0,08

PTB -0,24 -0,51 -0,05 -0,05 -0,13 -0,26 -0,26 0,15 -0,49 0,48 0,07

PBC -0,24 -0,52 -0,04 -0,10 -0,06 -0,09 -0,12 0,01 0,78 -0,05 0,04

NBB 0,36 -0,17 -0,38 -0,15 -0,16 -0,14 -0,34 -0,51 -0,15 -0,39 0,25 1 AP – altura da planta, LF – largura da folha, CF – comprimento da folha, NF – número de folhas, DF – densidade da folhagem, LBP – largura da base do pseudocaule, PPBA – percentagem de plantas com bulbilhos aéreos, NDC – número de dias para colheita, PTB – produtividade total dos bulbos, PBC – peso dos bulbos comerciais e NBB -número de bulbilhos por bulbo.

Seguindo o critério de normalização de Kaiser (retenção de autovalores

maiores que 1) para escolha do número de componentes principais é possível

explicar a variação total com base em quatro componentes. Assim, como nos três

primeiros componentes explorados anteriormente, explica-se a formação dos

componentes principais com base nos autovetores associados e nota-se que na

formação do quarto componente, os caracteres que tiveram maior influência foram

número de dias para colheita (0,48) e comprimento da folha (0,47).

Para Panthee et al. (2006), a análise de componentes principais revelou que

os quatro primeiros componentes explicaram 86% da variação morfológica total em

variedades de alho. Com base nos autovetores, os autores constataram que o

primeiro componente principal, explicou 44% da variação total, sendo composto de

produtividade (peso dos bulbos comerciais/área da parcela, convertidos em t/ha),

peso total dos bulbos e número folhas, enquanto que o segundo componente

principal, que explicou 23% da variação, foi formado pelos caracteres dias para

emergência, dias para a colheita e período de bulbificação. O terceiro componente

principal explicou 11% da variação e foi composto por dias do plantio à colheita,

número de bulbilhos por bulbo e diâmetro do bulbo, enquanto o quarto componente

principal foi composto pelo número de dias para emergência, número de folhas e

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37

número de bulbilhos por bulbo, explicando 7% da variação total. Além disto, os

autores afirmam que esses caracteres poderiam ser usados para classificar o

germoplasma de alho e que não houve um único caráter qualitativo num

componente principal que explicasse uma medida razoável da variação.

No gráfico contendo os dois primeiros componentes principais é possível

estudar o comportamento das variedades em relação aos caracteres quantitativos

(Figura 3). As variedades Embrapa Cateto Roxo Livre de Vírus, Cateto Roxo 99,

Sergipe e BGH 0525 ficaram agrupadas no sentido da progressão dos caracteres

número de folhas, produtividade total dos bulbos e peso dos bulbos comerciais. Tais

caracteres estão diretamente ou indiretamente associados à produtividade e não por

coincidência estes genótipos foram os mais produtivos.

Observou-se também no gráfico com os dois componentes principais (Figura

3), a formação de dois outros grupos, sendo um composto pelas variedades Santo

Antônio de Lisboa – PI e Branco Mineiro – PI e outro formado por Sussuapara – PI e

Bocaina – PI. Estes grupos, especialmente o formado pelos genótipos Santo Antônio

de Lisboa – PI e Branco Mineiro – PI, estão localizados no sentido do crescimento

de importância do caráter número de bulbilhos por bulbo. É fundamental para o

entendimento deste comportamento citar que o caráter número de bulbilhos por

bulbo implica em numerosa quantidade de bulbilhos por bulbo e na irregularidade

das quantidades dentro de um mesmo tratamento. Os genótipos Mendonça 5062 e

Catetinho do Paraná 1254 ficaram agrupados no sentido de crescimento da

importância do caráter percentagem de plantas com bulbilhos aéreos para a

variação.

Com base no gráfico com os dois componentes principais, verifica-se também

que os genótipos mais precoces foram o Santo Antônio de Lisboa – PI e o Branco

Mineiro – PI. Assim, como no caso dos caracteres analisados anteriormente,

constatou-se que a análise de componentes principais é um método eficiente na

classificação dos genótipos e pode auxiliar na seleção daqueles que reúnem

determinadas características de interesse agronômico.

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-0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4

-0.4

-

0.2

0.

0

0.

2

0.

4

CP1

CP2

1

2

3

4

5

6

7

8 9

10

11

12

-2

0

2

4

-2

0

2

4

AP

LF

NF

DF

PPBA

NDCC

PTB

AP

LF

CF

NF

DF

LBP

PPBA

NDCC

PTB

PBC

NBB

Figura 3 – Gráfico dos dois primeiros componentes principais para as doze

variedades de alho em relação aos caracteres quantitativos1.

Piracicaba – SP, 2012.

1PBC - peso dos bulbos comerciais, NDC - número de dias para colheita, DF - densidade da

folhagem, NF - número de folhas, LBP - largura da base do pseudocaule, AP - altura da planta, PTB

- produtividade total dos bulbos, NBB -número de bulbilhos por bulbo, CF - comprimento da folha,

LF - largura da folha, PPBA – percentagem de plantas com bulbilhos aéreos.

Considerando os oito pares de variedades de alho com as maiores e as

menores distâncias de Mahalanobis para os caracteres quantitativos (Tabela 8),

verificou-se que a variedade oriunda de Sussuapara – PI apresentou a maior

distância em relação às demais. Além disso, essa variedade e aquela coletada em

Santo Antônio de Lisboa – PI apresentaram alta divergência em relação a Catetinho

do Paraná 1254.

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39

Quanto aos pares com as menores distâncias de Mahalanobis, destacam-se

as variedades Embrapa Cateto Roxo Livre de Vírus x Sergipe e Cateto Roxo 99 x

BGH 0525, que, consequentemente, são as menos divergentes geneticamente.

Além disso, um fato interessante sobre a relação das maiores e menores distâncias,

é que apesar da variedade Sussuapara – PI ser a de maior divergência genética em

relação às demais, possui certa semelhança genética com a variedade de Santo

Antônio de Lisboa – PI.

O comportamento descrito acima é esperado para variedades crioulas, que

são mantidas nas mãos de pequenos produtores por muito tempo, pois estas

acumulam diferenças em relação às variedades cultivadas em outros locais, como

as que foram utilizadas nesta análise. Ademais, a baixa divergência entre as

variedades Sussuapara – PI e Santo Antônio de Lisboa – PI também é esperada,

haja vista que esses municípios produtores de alho no Piauí fazem parte da

Microrregião de Picos, na qual o alho obtido pelos pequenos agricultores familiares

dos diferentes municípios é vendido junto em feiras e mercados populares.

As estimativas das distâncias calculadas pelo complemento aritmético de

Jaccard, para os caracteres qualitativos (Tabela 9), resultante da ordenação dos

pares de variedades com maiores e menores distâncias generalizadas de

Mahalanobis para as variáveis quantitativas, mostra que a variedade Sussuapara –

PI apresentou-se entre as mais divergentes. Além disso, os pares Embrapa Cateto

Roxo Livre de Vírus x Sergipe e Sussuapara – PI x Santo Antônio de Lisboa – PI

também apareceram na ordenação das menores distâncias calculadas pelo

complemento aritmético de Jaccard, corroborando com o resultado observado para

os caracteres quantitativos.

O dendrograma obtido no agrupamento dos genótipos, com base na distância

generalizadas de Mahalanobis, para os caracteres quantitativos (Figura 4), mostra a

formação de dois grupos, em nível de 60% de divergência. O corte foi realizado

neste nível levando-se em consideração as informações sobre a procedência das

variedades, se oriundas do Piauí ou da Coleção de Germoplasma de Alho da

ESALQ – USP.

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40

Tabela 8 – Pares de variedades de alho com as maiores e as menores distâncias de Mahalanobis para os caracteres quantitativos

avaliados em Piracicaba – SP, 2012.

Ordem Variedades Maiores Ordem Variedades Menores

1 Sussuapara x Catetinho do Paraná 380,37 1 Embrapa Cateto Roxo LV x Sergipe 6,37

2 Santo Antônio de Lisboa x Catetinho do Paraná 306,36 2 Cateto Roxo 99 x BGH 0525 12,28

3 Sussuapara x Mendonça 5062 300,24 3 Cateto Roxo 99 x Roxo de Minas 17,51

4 Sussuapara x Roxo de Minas 256,49 4 Bocaina x Branco Mineiro – PI 27,34

5 Sussuapara x Embrapa Cateto Roxo LV 244,80 5 Santo Antônio de Lisboa x Bocaina 39,68

6 Sussuapara x Sergipe 239,44 6 Sussuapara x Santo Antônio de Lisboa 50,53

7 Sussuapara x BGH 0525 231,40 7 Mendonça 5062 x Catetinho do Paraná 50,53

8 Sussuapara x Cateto Roxo 99 212,47 8 Roxinho 5063 x Embrapa Cateto Roxo LV 56,07

Tabela 9 – Pares de variedades de alho com maiores e menores distâncias de Jaccard para os caracteres qualitativos avaliados

em Piracicaba – SP, 2012.

Ordem Variedades Maiores Ordem Variedades Menores

1 Sussuapara x Mendonça 5062 0,4348 1 Sussuapara x Santo Antônio de Lisboa 0,0364

2 Sussuapara x Cateto Roxo 99 0,4348 2 Embrapa Cateto Roxo LV x Sergipe 0,0364

3 Mendonça 5062 x Santo Antônio de Lisboa 0,4348 3 Santo Antônio de Lisboa x Bocaina 0,0714

4 Sussuapara x Catetinho do Paraná 1254 0,4118 4 Sussuapara x Bocaina 0,1053

5 Sussuapara X Roxo de Minas 0,4118 5 Bocaina x Branco Mineiro – PI 0,1053

6 Mendonça 5062 x Branco Mineiro – PI 0,4118 6 Cateto Roxo 99 x Roxo de Minas 0,1053

7 Mendonça 5062 x Sergipe 0,4118 7 Roxinho 5063 x Sergipe 0,1695

8 Santo Antônio de Lisboa x Catetinho do Paraná 0,4118 8 Mendonça 5062 x Catetinho do Paraná 0,1695

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Figura 4 – Dendrograma gerado pelo método de agrupamento UPGMA, com base nas distâncias de Mahalanobis, para os

caracteres quantitativos avaliados em doze variedades de alho, em Piracicaba – SP, 2012.

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Um dos grupos é formado apenas pelas variedades provenientes do Piauí,

enquanto o outro agrupa o germoplasma oriundo do BAG de Alho da ESALQ – USP.

A variedade Branco Mineiro – PI, oriunda do BAG de alho da Embrapa Hortaliças,

que corresponde a um material coletado no Piauí, na década de 70, foi alocada no

mesmo grupo do germoplasma proveniente de coletas no Piauí e possui um grau de

similaridade maior com a variedade Bocaina – PI, caracterizando um subgrupo, até o

nível de 15% de divergência. Contudo, o germoplasma oriundo do Piauí não se

apresenta uniforme, mostrando certo grau de divergência entre as variedades

obtidas nos diferentes locais de coleta.

No dendrograma obtido após o agrupamento pelo critério UPGMA (Figura 5),

com base no complemento aritmético de Jaccard, verificou-se que os dois grupos só

foram evidenciados quando o corte ocorreu ao nível de 90% de divergência. Tais

grupos contém as mesmas variedades do agrupamento anterior (Figura 4), havendo

apenas um rearranjo dentro de cada grupo.

No grupo correspondente às variedades do Piauí, aquelas oriundas da coleta

em 2011 se mantiveram agrupadas a partir de aproximadamente 25% de

divergência, sendo que a variedade Bocaina - PI foi a mais divergente. A variedade

Branco Mineiro - PI funcionou como um grupo externo até 40% de divergência, onde

passou a fazer parte de um só grupo contendo todas as variedades oriundas do

Piauí.

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Figura 5 – Dendrograma gerado pelo método de agrupamento UPGMA, com base no complemento aritmético de Jaccard, para os

caracteres qualitativos avaliados em doze variedades de alho, em Piracicaba – SP, 2012.

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Por se tratarem de variáveis diferentes e de natureza também distinta é

aceitável que não haja correspondência total entre o agrupamento obtido com os

caracteres quantitativos e o obtido com os caracteres qualitativos. Sugere-se,

portanto que estes dois grupos de caracteres se complementem para que assim se

possa cobrir um maior número de marcas e consequentemente obter estimativas

mais fidedignas da diversidade genética destas populações.

Segundo Gonçalves et al. (2008), apesar da análise conjunta dos caracteres

quantitativos e qualitativos ser considerada um indicador potencialmente mais

completo da variabilidade existente nos bancos de germoplasma, poucos trabalhos

têm utilizado esta estratégia. Os autores ainda explicam que provavelmente isso

ocorre devido à falta de conhecimento das técnicas estatísticas que permitem essa

abordagem, à carência de softwares livres que analisem esses dados

conjuntamente, bem como pela tendência dos pesquisadores em dar mais

importância àquelas variáveis diretamente relacionadas com caracteres trabalhados

em programas de melhoramento.

No entanto, como neste trabalho há o interesse em conhecer a diversidade

genética existente nestas populações, optou-se por realizar a análise conjunta dos

caracteres quantitativos e qualitativos, através da soma das matrizes de distâncias

generalizadas de Mahalanobis e complemento aritmético de Jaccard. Após este

procedimento, pôde-se gerar o agrupamento com base no critério UPGMA.

O resultado da análise de agrupamento observado no dendrograma (Figura

6), após a obtenção da matriz resultante da soma das distâncias generalizadas de

Mahalanobis e complemento aritmético de Jaccard, mostra que, em geral, alguns

grupos se mantiveram constantes em relação aos dendrogramas gerados nas

demais análises, outros sofreram variação. Aqueles dois grupos citados na análise

de agrupamento das variedades com base nos caracteres quantitativos

individualmente só puderam ser observados a partir de 80% de divergência,

diferindo também do resultado obtido com a análise para os caracteres qualitativos

em que os dois grupos podem ser observados quando o corte é realizado a 90% de

divergência.

Assim, como nos dendrogramas anteriores, os genótipos do Piauí se

alocaram em um mesmo grupo. Além disso, notou-se que a variedade Branco

Mineiro – PI compartilhou certo grau de similaridade com a variedade Bocaina – PI.

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Figura 6 – Dendrograma gerado pelo método de agrupamento UPGMA, com base na soma das matrizes das distâncias

generalizadas de Mahalanobis e complemento aritmético de Jaccard, para os caracteres qualitativos avaliados em

doze variedades de alho, em Piracicaba – SP, 2012.

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O grau de similaridade observado entre as variedades Bocaina - PI e Branco

Mineiro – PI pode ser considerado como um resultado promissor neste estudo, haja

vista que a existência de similaridade entre uma variedade cultivada na atualidade e

uma variedade oriunda de coleta na década de 70, em uma mesma localidade, pode

representar uma perda reduzida de diversidade entre estas duas populações.

No agrupamento obtido pelo método de Tocher, houve a formação de 5

grupos (Tabela 10). É interessante notar que alguns grupos são formados por

variedades que se mantiveram no mesmo grupo quando aplicado o critério UPGMA.

Contudo, verificou-se a ausência do genótipo Sussuapara – PI no grupo 2, no qual

ficaram alocados os outros genótipos coletados no Piauí.

A população de Sussuapara – PI foi a mais divergente em relação às outras

populações estudadas, utilizando-se como critério de análise as distâncias

generalizadas de Mahalanobis, calculadas a partir dos caracteres quantitativos.

Portanto, o resultado observado após o agrupamento pelo método de Tocher

confirma esse aspecto, além dos resultados obtidos em outros agrupamentos com

relação à maioria dos grupos formados.

Tabela 10 – Agrupamento das doze variedades de alho, pelo método de otimização

de Tocher. Piracicaba – SP, 2012.

Grupos Variedades

1 Embrapa Cateto Roxo Livre de Vírus; Sergipe; Cateto Roxo 99; Roxo de Minas (Dr. Joaquim); BGH 0525.

2 Santo Antônio de Lisboa - PI; Branco Mineiro - PI; Bocaina – PI.

3 Mendonça 5062; Catetinho do Paraná 1254.

4 Roxinho 5063 5 Sussuapara – PI

Todos estes locos resultaram em polimorfismo na população (Figura 7), com o

número de alelos por loco variando de 2 a 4, sendo que para a maioria dos locos

obteve-se 3 alelos. Na população de 96 indivíduos, para cada loco, a presença de

dois alelos diferentes já garante o polimorfismo.

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Constata-se que o número de alelos por loco variou de 2 a 4, sendo que para

a maioria dos loco estudados obteve-se 3 alelos por loco. Na população de 96

indivíduos, para cada loco, a presença de dois alelos diferentes já garante o

polimorfismo.

Os dados gerados na genotipagem das variedades pelo uso demarcadores

microssatélites foram submetidos ao método de agrupamento UPGMA, utilizando-se

a matriz de distâncias de Rogers (1972) modificada por Wright (1978). Pelo

dendrograma gerado (Figura 8), observou-se a formação de três grupos, ao nível de

divergência de 78%. Mota et al. (2003), avaliando a diversidade genética existente

entre doze variedades de alho nobre e semi-nobre por meio de marcadores RAPD,

obtiveram coeficientes de similaridade variando entre 0,245 e 0,860, mostrando

haver variedades com alto grau de semelhança e outras muito divergentes.

Segundo Xavier (2001),quando é possível encontrar alta diversidade genética

ao se avaliar um determinado germoplasma, pode-se concluir que se trata de um

material que sofreu pouco processo de seleção e, por conta disto, uma cultura pouco

domesticada pode ter seu polimorfismo facilmente acessado através do uso de

poucos primers.

Dois dos grupos evidenciados no dendrograma são compostos pelos quatro

genótipos oriundos do Piauí, enquanto os demais são formados pelas variedades do

BAG de Alho da ESALQ – USP e do IAC. Notou-se que, assim como na

caracterização agromorfológica, a variedade Bocaina – PI teve maior grau de

similaridade com o Branco Mineiro – PI do que os demais genótipos piauienses.

Sugere-se com base nestas análises que houve pouca diferenciação entre as

variedades Bocaina – PI e Branco Mineiro – PI com o passar dos anos, enquanto as

de Sussuapara – PI e Santo Antônio de Lisboa – PI acumularam um número maior

de diferenças. Além disso, conforme observado nas análises anteriores, houve

segregação dos genótipos piauienses dos demais genótipos avaliados. Jo et al.

(2012), ao estudarem a variação genética em alho por meio de marcadores

microssatélites em germoplasma oriundo de diversos países, encontraram

associação entre a diversidade genética encontrada com a origem do germoplasma.

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Figura 7 – Histogramas referentes às frequências relativas dos alelos encontrados

nos locos microssatélites utilizados na genotipagem de doze variedades

de alho. Piracicaba – SP, 2012.

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Figura 8 – Dendrograma gerado pelo método de agrupamento UPGMA, utilizando-se a matriz de distâncias genéticas de Rogers,

com base na genotipagem em doze variedades de alho, com uso de marcadores microssatélites. Piracicaba – SP, 2012

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5 CONCLUSÕES

Existe divergência genética, com base em marcadores agromorfológicos e

moleculares, entre as variedades de alho estudadas em função da procedência do

germoplasma. Assim, as variedades do BAG de Alho da ESALQ/USP correspondem

a material distinto do germoplasma oriundo do Piauí.

As variedades originárias de Sussuapara – PI e Santo Antônio de Lisboa – PI

acumularam diferenças em relação à variedade Branco Mineiro – PI, coletada na

Microrregião de Picos-PI, na década de 70. Esta por sua vez, compartilha alto grau

de similaridade com a variedade proveniente de Bocaina – PI, mostrando que houve

pouca diferenciação entre os anos 70 e a atualidade.

A existência de divergência genética entre as variedades de alho no Piauí

indica a possibilidade de seleção de genótipos superiores que aumentem a

competitividade do alho piauiense frente ao alho importado.

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