Faculdades Integradas do Tapajós

Graduação em Medicina Veterinária

DNA BARCODING

Gildo Gabriel Scotti

Júlio César Saraiva

Leila Macêdo

Santarém – PA

2010

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GILDO GABRIEL SCOTTI

JÚLIO CÉSAR SARAIVA

LEILA MACÊDO

DNA BARCODING

Trabalho apresentado com o objetivo de obter nota parcial na matéria de Genética

Santarém 2010

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SUMÁRIO

INTRODUÇÃO.............................................................................................................3 1 – DNA BARCODING................................................................................................4 1.1 – Definição e emprego...........................................................................................4 1.2 – Procedimento......................................................................................................5 1.3 – Argumentos e Justificativas para o uso do Barcoding........................................5 1.4 – Custos do DNA barcoding..................................................................................6 1.5 – Limitações dos barcodes....................................................................................7 CONCLUSÃO..............................................................................................................9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................................11

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INTRODUÇÃO

A diversidade da vida justifica todos os estudos biológicos, mas também é um grande desafio. Enquanto os físicos lidam com um cosmo constituído de 12 partículas fundamentais, os biólogos confrontam um planeta constituído por milhões de espécies. Essa discriminação não é uma tarefa fácil. De fato, uma vez que poucos taxonomistas podem operacionalmente identificar cerca de 0.01%, das 10-15 milhões de espécies que habitam o nosso planeta, seriam requeridos cerca de 15.000 taxonomistas para identificar vida caso fossem mantidas as nossas esperanças no diagnóstico morfológico.(AZEREDO, 2005)

O uso de um código de barras do DNA para identificação de organismos foi proposto em duas conferências realizadas no laboratório de Cold Spring Harbor, USA, em 2003. O princípio do uso de um código de barras genético seria o de que, em um pequeno trecho do genoma do organismo, específico para cada espécie, geralmente o DNA mitocondrial ou DNA ribossômico, existiria variação suficiente para separar as espécies que habitam o planeta atualmente. (OLIVEIRA; MACHADO; HARAKAVA; KUBO, 2009)

Em 2003, Paul Hebert e colaboradores publicaram um artigo que sugeria que seqüências do gene mitocondrial da CITOCROMO C OXIDASE I (COI) seriam capazes de identificar corretamente filos, ordens e espécies de animais.

Esses pesquisadores utilizaram seqüências disponíveis em um banco de dados (GenBank) e produziram outras seqüências para montar três matrizes de dados:

1) Com representantes dos sete maiores filos de animais (100 seqüências de Annelida, Chordata, Echinodermata, Nematoda, Platyhelmintes, Arthropoda e Mollusca),

2) Com representantes de oito ordens de insetos (100 seqüências de Coleoptera, Diptera, Hymenoptera, Lepidoptera, Blatttaria, Ephemeroptera, Orthoptera e Plecoptera) e

3) Com representantes de 200 espécies próximas de lepidópteros (das superfamílias Geometroidea, Nocturoidea e Sphingoidea).

Filogenias foram reconstruídas por Neighbor- joining utilizando essas matrizes de dados. Seqüências de táxons adicionais foram obtidas para testar se elas seriam corretamente atribuídas ao táxon de origem quando incluídas nessas reconstruções. Os resultados obtidos mostraram que 96,4%, 100% e 100% das seqüências testadas foram corretamente atribuídas ao filo, à ordem e à espécie, respectivamente. Assim, os autores sugerem que seria possível desenvolver um banco de dados para as 10 milhões de espécies animais para constituir a base de um sistema de identificação global.

Assim, foi proposta a construção de um banco de seqüências de um grande número de organismos tendo o COI como gene de referência, ou seja, a seqüência do COI seria usada como um código de barras (barcode) específico para cada espécie. Isso permitiria atribuir indivíduos desconhecidos a espécies e facilitar a descoberta de novas espécies.(MIYAKI, 2007)

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1 – DNA BARCODING 1.1 – Definição e emprego

Este sistema de identificação pretende realizar a discriminação de todas as

espécies vivas do planeta através da utilização de um pequeno segmento padronizado de DNA. Esta abordagem representa uma estratégia extremamente promissora para o diagnóstico da biodiversidade.

A abordagem genômica para diagnóstico de táxon explora a diversidade entre as seqüências de DNA para identificar organismos. Em termos reais, essas seqüências podem ser vistas como um “código de barras” que estão contidos em todas as células. Quando se considera a discriminação da diversidade da vida a partir de uma perspectiva combinatorial, isto é um problema modesto. O Código Universal de Produtos (código de barra universal dos produtos), utilizado para identificar produtos do mercado varejista, emprega 10 números alternados em 11 posições para gerar 100 bilhões de identificadores únicos. Um código de barras genômico tem somente quatro nucleotídeos alternados em cada posição, mas a cadeia de sítios disponíveis para a inspeção é maior. À análise de apenas 15 dessas posições de nucleotídeos, criam 415, portanto 1 bilhão de códigos, isto é, 100 vezes mais que o número requerido para discriminar vida se cada táxon fosse unicamente marcado.

Um sistema taxonômico global para o reino animal provavelmente incluirá pelo menos 10 milhões de espécies distribuídas em mais do que um milhão de gêneros. Devido a esta imensa diversidade, existe um consenso na comunidade científica sobre a necessidade de uma assistência tecnológica para uma descrição inicial e um reconhecimento subseqüente. Investigações mais recentes têm sugerido que a possibilidade de se criar um sistema seguro de identificação consiste na análise de pequenos segmentos de DNA. Foi então proposto que um sistema de código de barras do DNA para o reino animal poderia se basear na diversidade de uma parte da seqüência do gene da subunidade I da citocromo oxidase (COI), um gene mitocondrial (relacionada ao terminal 5’ deste gene). Esta nova iniciativa é conhecida como DNA Barcoding ou “código de barras do DNA” (HEBERT et al., 2003a; BLAXTER, 2004).

Um exemplo prático foi obtido analisando 650 pb do gene COI de várias espécies de borboletas (Leptodoptera) (HEBERT et al. 2003). Foi verificado que a diversidade nas seqüências de nucleotídeos de 650pb do gene COI permitiu a discriminação de espécies proximamente relacionadas de borboletas, um grupo considerado com modestas taxas de evolução molecular e alta diversidade de espécies. Além disso, esses insetos forneceram um teste desafiador para verificar o potencial da diversidade de COI em resolver a barreira das espécies (discriminar as espécies). (AZEREDO, 2005)

Uma vez tendo um banco de seqüências padronizadas, algumas das possíveis aplicações seriam:

1) identificação da espécie de aves envolvidas em colisões com aeronaves, o que permitiria auxiliar no plano de manejo para evitar novas colisões;

2) identificação de restos de alimentos encontrados nos estômagos e fezes de predadores, aumentando o conhecimento acerca da dieta desses organismos;

3) reconhecimento da espécie a partir de carcaças ou outras amostras forenses, em um caso de apreensão de ovos de aves amostras dos embriões que não eclodiram foram identificadas; e

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4) a partir do sangue encontrado em vetores de patógenos (ex. mosquitos com vírus do oeste do Nilo) pode-se chegar à identidade do hospedeiro. (MIYAKI, 2007)

Essa técnica consiste na obtenção de uma seqüência curta de DNA de um indivíduo, sendo uma maneira rápida, relativamente fácil e barata de determinar sua espécie. Isso é possível, graças às inúmeras possibilidades de arranjos que as bases nitrogenadas do DNA (Adenina, Timina, Citosina e Guanina) nos proporcionam, funcionando tal qual um código de barras como aqueles que encontramos nos produtos utilizados diariamente. Cada espécie, sugere o método, possui o seu arranjo específico de seqüências de DNA. As seqüências entre indivíduos da mesma espécie têm, geralmente, menos divergências quando comparadas às seqüências de indivíduos de espécies proximamente relacionada. (MARTELETO, 2008)

1.2 – Procedimento

O procedimento básico para a taxonomia baseada no DNA, DNA Barcoding, é

direto. Uma amostra de tecido seria retirada de um indivíduo coletado e seu DNA extraído. Este tipo de abordagem tem a vantagem de poder ser realizada a partir de pequenas quantidades de tecido biológico, eliminando em muitos casos o sacrifício do animal estudado. Este DNA serve como uma amostra referência para que uma ou várias regiões gênicas possam ser amplificadas pela técnica de PCR e em seguida seqüenciadas. As seqüências resultantes correspondem a uma etiqueta de identificação para a espécie da qual a amostra de DNA foi retirada. Essa seqüência se torna disponibilizada através de um banco de dados, junto com a descrição da espécie e outras informações associadas, que idealmente incluem seu status taxonômico com referências associadas. Esta seqüência se torna um padrão para referências futuras, junto com o espécime tipo e a respectiva preparação do DNA, que será depositada em coleções de museus. Uma vez que um banco de dados de seqüências tenha sido estabelecido, novas amostras podem ser averiguadas contra estas seqüências existentes para auxiliar na re-identificação ou para acessar se a descrição de uma nova espécie poderá ser confirmada. (AZEREDO, 2005)

1.3 – Argumentos e Justificativas para o uso do Barcoding

Sua escolha está baseada em suas características evolutivas (taxa de mutação) e por ser um gene já amplamente estudado. Seu princípio se baseia no fato de que, ao longo da história evolutiva das espécies, as seqüências de DNA vão acumulando mutações que as tornam únicas para cada espécie e, ainda que exista alguma diferença entre indivíduos de uma mesma espécie, essas são em média 10 a 20 vezes menores que as diferenças observadas entre espécies próximas. Essas diferenças são denominadas de divergência genética e formam a base de comparação entre as espécies.

São apontadas pelo menos dez razões para a realização do projeto de Código de Barras dos seres vivos, que são:

1. Trabalho com segmentos – pequenos pedaços ou fragmentos; material não utilizado no processamento de plantas e animais e produtos morfologicamente não reconhecíveis, derivados de espécies protegidas ou reguladas.

2. Trabalho com todos os estágios do ciclo de vida - ovos ou sementes; larvas ou mudas; adultos.

3. Identificação de espécies similares – espécies crípticas.

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4. Redução de ambigüidades - elimina o uso de descrições subjetivas baseadas em gradações de formas e cores, por exemplo.(AZEREDO, 2005)

5. Possibilidade dos especialistas irem mais longe - Os cientistas podem fazer uso do Código de Barras para uma identificação mais rápida dos organismos e também para facilitar um reconhecimento mais rápido de novas espécies que assim podem ser descritas pelos métodos tradicionais.

6. Democratização do acesso - Uma biblioteca padronizada de Código de Barras aumentará muito o número de pessoas capazes de nomear as espécies em volta dela.

7. Abertura de caminhos para criação de um dispositivo portátil para identificação de espécies em campo.

8. Possibilita o crescimento de novas folhas na árvore da vida - estabelecer as similaridades e diferenças entre o Código de Barras das estimadas 10-15 milhões de espécies de plantas e animais ajudará a mostrar onde suas folhas devem estar na árvore da vida.

9. Demonstração do valor das coleções – A compilação de uma biblioteca de Códigos de Barra começa com os milhões de espécimes em museus, herbários, zoológicos, jardins botânicos.

10. Compilação mais rápida da enciclopédia da vida - Uma biblioteca de Código de Barras ligada a espécimes nomeados ampliará o acesso do público ao conhecimento biológico, auxiliando na criação de uma enciclopédia on-line da vida na Terra.

Os principais objetivos do projeto barcode são: criar um sistema de identificação rápido e democrático para todas as espécies já descritas e válidas do planeta e auxiliar na descoberta de possíveis novas espécies.

A vantagem da informação de seqüências de DNA consiste em ser digital e não ficar influenciada por uma análise subjetiva. Esta análise poderá ser reproduzida em qualquer tempo e por qualquer pessoa, e de maneira universal. Conseqüentemente, poderá ser uma ferramenta de comunicação universal e padronizada para auxiliar na taxonomia, a qual poderá estar associada a qualquer tipo de informação biológica ou de biodiversidade. Embora a taxonomia baseada no DNA tenha suas limitações ela tem a vantagem de ser uma ferramenta universalmente aplicável.

Outra vantagem da análise do DNA consiste na facilidade de extração além de ser uma molécula muito estável tanto em soluções tampão, como precipitado no etanol, ou congelado em freezer. Como as amostras de DNA de qualquer organismo têm os mesmos requerimentos para preservação, as amostras poderão ser catalogadas e mantidas na ordem em que elas forem sendo obtidas, simplificando deste modo à organização das coleções. Qualquer amostra deverá ser separada em várias alíquotas que poderão ser assim distribuídas entre os vários museus e pesquisadores para análises mais específicas.(AZEREDO, 2005)

1.4 – Custos do DNA barcoding

Seqüenciamento do DNA é uma tecnologia considerada complexa e cara. Parece que um taxonomista pode identificar espécimes de uma maneira mais rápida e barata quando comparada ao do seqüenciamento. Entretanto, essa percepção comum não é necessariamente acurada. Atualmente nós vivemos numa época onde o custo do trabalho esta aumentando rapidamente, enquanto o custo da automação diminui. Taxonomistas despendem tempo e dinheiro consideráveis para treinamento e este tempo geralmente não é utilizado para realização de identificação de rotina. De fato, taxonomistas utilizam seus conhecimentos especializados para conduzir

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projetos científicos específicos e normalmente não atuam como prestadores de serviços de identificação de espécimes (“facility” de identificação de espécimes). Sob o esquema de uma taxonomia baseada no DNA, a identificação rotineira de espécimes coletados durante um projeto ecológico poderá ser realizada dentro de uma “facility” de seqüenciamento de DNA . Para esta análise, há a necessidade de um seqüenciador automático que atualmente se tornou mais acessível em diversos laboratórios devido aos vários projetos genomas em curso e que poderão ser adquiridos pelos principais museus. Uma alternativa será a associação com outros laboratórios, já detentores destes equipamentos e da capacitação técnica necessária para processar e analisar as amostras.

O estabelecimento de uma “facility de DNA” que poderia rotineiramente analisar aproximadamente 1000 amostras por dia poderá custar um valor aproximado ao de, por exemplo, uma análise através de microscópio de varredura. O custo em laboratórios europeus do material para cada amostra, incluindo a extração do DNA e o seqüenciamento de 2 regiões independentes foi estimado ser em torno de 5 Euro por amostra em cada “facility”.

Ainda assim, o custo para 1000 amostras processadas por dia, parece ser muito para uma escala de museu!, Mas é ainda considerada bem modesto quando comparado com projetos genomas que estão em curso. Evidentemente este custo não deverá ficar sob a responsabilidade de cada museu e ou das instituições de pesquisas mantenedoras das coleções biológicas, mas sim estimular as agências e fundações de financiamento através de parcerias de longo prazo com Universidades e Centros de Biologia Molecular capacitados para operacionalizar grande número de seqüências rotineiramente.

Finalmente, desenvolvimento de novas tecnologias fará o custo desta metodologia diminuir ainda mais.

As principais vantagens de tais facilidades seriam duas: • Primeiro, ela pode fornecer um serviço de custo efetivo para os

pesquisadores ou mesmo amadores, que não tem acesso direto a seqüenciadores automáticos. Isto permitirá que pesquisadores de países em desenvolvimento possam participar diretamente nesse esquema.

• Segundo, eles podem estabelecer um padrão necessário para assegurar seqüências de alta-qualidade das amostras.(AZEREDO, 2010)

1.5 – Limitações dos barcodes

Várias discussões foram geradas após o lançamento da proposta de criação

desse banco de seqüências de COI. Dentre as limitações da proposta se destacam: 1) A baixa diversidade entre seqüências de determinados grupos, como os

cnidários, não permite obter a sua correta identificação (HEBERT et al. 2003a). 2) Espécies que se divergiram recentemente possuem poucas diferenças e

pode ser impossível caracterizá-las como duas linhagens independentes. Seria importante ter estudos em grande escala sobre a divergência entre pares de espécies irmãs para avaliar se o COI é informativo nesses casos e, para isso, seria necessário analisar todos os membros de um determinado gênero.

3) Como apenas um gene é analisado e este pertence a um genoma com herança materna, híbridos não podem ser detectados. Tal limitação ocorreria com qualquer gene com herança ligada ao sexo.

4) Pseudogenes (cópias não ativas de genes) podem atrapalhar a análise. Nos estudos já realizados, os pseudogenes não são mencionados, talvez por que não

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foram detectados e aparentemente isso não prejudicou as análises (HEBERT et al. 2003a, b).

5) Em relação às aves, como até o momento apenas espécies da América do Norte foram analisadas, o real desafio será a análise das que ocorrem nos Trópicos, devido à maior diversidade.

Entre as críticas mais contundentes, está a preocupação de que outros projetos de taxonomia possam ter recursos negados. Em resposta a isso, os pesquisadores que têm gerado os barcodes argumentam que o projeto não tem a pretensão de estudar a taxonomia dos grupos. (MIYAKI, 2007)

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CONCLUSÃO

O cenário atual ao redor do projeto dos barcodes é em vários aspectos semelhante ao que foi gerado quando do lançamento dos grandes projetos de seqüenciamento de genomas. Houve muita polêmica, mas os projetos foram realizados. No final, os genomas estavam seqüenciados e analisados, os grupos que anteriormente não dominavam a tecnologia laboratorial de seqüenciamento de DNA e análise computacional desses dados foram treinados, os laboratórios com infra-estrutura até então deficiente para análises moleculares foram equipados, e como os grupos de pesquisadores estavam voltados para o mesmo objetivo houve grande colaboração.

Pela integração dos avanços em eletrônica e em genética, a obtenção de código de barras auxiliará, de modo rápido e barato, identificar e obter informações sobre espécies descritas. Além disso, milhões de novas espécies ainda não descritas poderão ser identificadas. O código de barras fornecerá novos meios para apreciar e manejar a enorme e dinâmica biodiversidade na Terra.

No caso do código de barras, a padronização deve auxiliar a acelerar a construção de uma biblioteca de referência consistente e abrangente de seqüências de DNA e o desenvolvimento de tecnologias econômicas para a identificação de espécies. O objetivo é permitir que qualquer pessoa, em qualquer lugar, a qualquer momento possa identificar rapidamente e com precisão a espécie de um determinado espécime em qualquer condição de preservação.

Apesar de o objetivo do código de barras ser a identificação de espécimes ao nível de espécie, alguns pesquisadores apresentam os resultados das análises de código de barras em árvores, indicando distâncias evolutivas e relações entre os grupos. Há séculos os biólogos têm buscado obter uma árvore da vida ou filogenia que mostra a história das espécies. Esses estudos se beneficiam da análise de vários caracteres, especialmente ao longo de várias eras e grupos. Nos poucos casos analisados até o momento, as distâncias genéticas entre os códigos de barras são congruentes com o conhecimento gerado pela taxonomia tradicional, indicando que a biblioteca de códigos de barras pode auxiliar em estudos evolutivos.

O Brasil possui a maior biodiversidade do nosso planeta, abrigando a maior diversidade biológica entre os 17 países considerados megadiversos que reúnem 70% de espécies de animais e vegetais catalogadas no mundo. Calcula-se que o país possua o maior número de espécies endêmicas. A Mata Atlântica e o Cerrado foram designados como “hot spots” de biodiversidade pelos estudos da Conservation International. Com isso, o Brasil tem um importante papel na preservação da biodiversidade do nosso planeta. No entanto, estima-se que apenas 10% das cerca de 2 milhões de espécies da fauna e da flora brasileira já foram identificadas (LEWINSOHN e PRADO, 2002). De acordo com estes autores, a cada ano, o total de espécies catalogadas cresce, em média, 0.6%. Esta estimativa lenta é atribuída ao número reduzido de taxonomistas, técnicos em atividade e em número suficiente nos diferentes grupos de organismos e nas diferentes regiões do país, dificultando os inventários sobre a biodiversidade brasileira.

Considerando este cenário que inclui a alta taxa de endemismo, dificuldade de identificação de muitas espécies, grande número de espécies não descritas associado à falta de especialistas para a identificação dos inúmeros espécimes já coletados para assegurar a conservação e o conhecimento da nossa biodiversidade, torna-se estratégico que o Brasil se associe a iniciativas como a proposta pelo Consortium for the Barcode of Life-CBOL.

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No Brasil, com a experiência adquirida na última década por vários grupos de pesquisa na área de genômica e de bioinformática, associada à reconhecida competência de vários pesquisadores na área de biodiversidade e da taxonomia, tem-se as condições essenciais para liderar um inventário sobre a nossa biodiversidade, com um enfoque multidisciplinar e em grande escala. Promover a integração entre pesquisadores destas áreas estratégicas incorporando os avanços e o acesso a ferramentas de informação tais como a do DNA barcoding, através da elaboração de projetos em grande escala sobre a biodiversidade no Brasil deve ser estimulada e fazer parte da agenda das agências brasileiras de fomento nos próximos anos.(AZEREDO, 2005)

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REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

LIVROS

HEBERT, P.D.N.; CYWINSKA, A.; BALL, S.L.; de WAARD, J.R.; Biological identification through DNA barcode. Proc. Of the Royal Soc. Of London. Ser. B, Biological sciences, n.279, p. 313-322, 2003.

LEWINSHOHN, T. M. & P. I. PRADO. Biodiversidade Brasileira: Síntese do estado atual do conhecimento. Ministério do Meio Ambiente- Conservation International do Brasil. Ed. Contexto: 2002. 176p.

PERIÓDICOS

AZEREDO, Ana Maria Lima de. O Código de Barras da Vida baseado no

DNA “Barcoding of Life”:Considerações e Perspectivas. Universidade Estadual de Campinas-ÚNICAMP: 2005. Disponível em http//: <www.sielo.br> acessado em novembro de 2010

MIYAKI, Cristina Yumi. A iniciativa do código de barras em aves e a participação do Brasil. Universidade de São Paulo – USP: 2007. Disponível em http//: <www.sielo.br> acessado em novembro de 2010

OLIVEIRA, C.M.G.; MACHADO, A.C.Z.; KUBO, R.K., HARAKAVA, R. Aplicação da tecnologia do código de barras do DNA no diagnóstico de nematóides em tubérculos de batata-semente. Instituto Biológico, Centro de Pesquisa e Desenvolvimento de Sanidade Vegetal: 2009. Disponível em http//: <www.sielo.br> acessado em novembro de 2010

MARTELETO, Flávio Miranda. Espécies de Prochilodus (Characiformes, Prochilodontidae) cultivados na região do Baixo Rio São Francisco reveladas pela Técnica de DNA Barcode. 2008. 23f. Monografia (Bacharelado em Ciências biológicas – Universidade Federal do Paraná – UFPR, Curitiba 2008.