Relatrio Bioqumica

DOSEAMENTO DE PROTENAS POR ESPECTROFOTOMETRIA MOLECULAR

N.. 3190 Srgio Mendes N.. 3194 Joo Mota

N.. 3210 Ricardo Rei N.. 3249 Eugnio Guedes

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Resumo

Este trabalho tem como objectivo a determinao da quantidade de protena numa amostra por espectrofotometria molecular. Para tal foi utilizado um dos vrios mtodos colorimtricos, o mtodo do Biureto, obtendo-se amostras de azul prpura. Como a reaco do Biureto s ocorre na presena de compostos com duas ligaes peptdicas, quanto menor for a diluio maior ser a intensidade do azul.

Objectivo

O objectivo deste trabalho a determinao de protena numa amostra, utilizando-se o mtodo do Biureto.

Reagentes:

Soluo padro de albumina de soro de bovino (BSA) 2 mg/ml Soluo de protena de concentrao desconhecida Solues de protena da clara do ovo e de soja Reagente do Biureto

Material e equipamento:

Espectrofotmetro marca Hitachi 2001 Tubos de ensaio Pipetas graduadas de 1 cm3/ 2 cm3 Pipetador Clulas de espectrofotmetro

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Introduo

O objectivo do nosso trabalho foi determinar a quantidade de protena numa amostra atravs de um mtodo colorimtrico para o doseamento de protenas em soluo. Neste caso o mtodo que utilizamos na aula foi o mtodo do biureto. Este mtodo reage com todos os conjuntos que contm duas ou mais ligaes peptdicas formando uma cor azul prpura. A soluo proteica tratada com ies Cu (II) num meio moderadamente alcalino. A intensidade da cor produzida proporcional ao nmero de ligaes peptdicas e, assim, ao nmero de molculas peptdicas presentes na soluo.

Para calcular-mos a concentrao de protena numa amostra utilizamos uma curva de calibrao que normalmente feita utilizando uma soluo proteica padro de soluo aquosa de albumina de soro bovino.

A espectrofotometria o mtodo de anlises ptico mais usado nas investigaes biolgicas e fsico-qumicas. O espectrofotmetro um instrumento que permite comparar a radiao absorvida ou transmitida por uma soluo que contm uma quantidade desconhecida de soluto, e uma quantidade conhecida da mesma substncia. Neste trabalho utilizamos um espectrofotmetro de marca Hitachi-2001 de feixe duplo. O seu funcionamento veio simplificar muito a utilizao desta tcnica analtica. Neste tipo de aparelhos uma radiao monocromtica emerge da fonte e atravessa um sistema ptico que designado por beam splitter que divide essa radiao em duas de intensidade exactamente igual. Se o contedo de ambas as clulas for igual, a intensidade do raio final ser nula. Se uma das clulas contiver tudo menos o solvente que o branco e a outra contiver o solvente e a substncia a dosear, o resultado do raio vai estar apenas relacionado com a substncia a dosear. Se tivermos um comprimento de onda pertencente gama do visvel, a substncia a dosear tem que ser corada. Na zona do visvel as clulas podem ser de vidro ou de plstico. No caso de a gama de trabalho ser no ultravioleta, teremos de utilizar clulas de quartzo, uma vez que ocorre interferncia entre a radiao UV e o vidro, no ocorrendo com o quartzo.

O tipo de molculas biolgicas em estudo foram as protenas que so polipptidos de alto peso molecular ligados entre si por ligaes peptdicas. As protenas so as macromolculas mais abundantes e variadas nos seres vivos e neles desempenham funes de extrema importncia. Estas dividem-se em dois grandes grupos: albumina e globulinas quer na forma livre ou actuando como protenas transportadoras.

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Procedimento experimental

A nossa aula prtica foi iniciada com uma breve introduo, feita pela professora, a indicar quais os procedimentos que deveramos ter em relao experincia que iramos realizar, foram distribudas aleatoriamente pelos grupos a elaborao dos tubos de calibrao, ficando o nosso grupo com a elaborao dos tubos 7 e 9, estes contendo respectivamente 1,0 ml de BSA (soluo padro de albumina de soro de bovino 2 mg/ml) e 0,5 ml de gua e o outro 1,5 ml de BSA este sem levar gua. Tivemos tambm de preparar um tubo com a amostra de protena, tendo este 1,0 ml de protena mais 0,5 ml de gua. Para a elaborao dos tubos comeou-se por recolher todo o material que necessitvamos para a elaborao da nossa experincia (vide fig. 1) identificando os tubos com os nmeros identificativos dos tubos de calibrao que nos foram indicados e

identificando as pipetas com o respectivo reagente que foi utilizado em cada uma delas. Com a ajuda de uma pipeta de 1 cm3 e um pipetador retirou-se 1,0 ml de BSA para o tubo 7, depois com outra pipeta de 1 cm3 pipetou-se 0,5 ml de gua destilada (vide fig.2) para o mesmo tubo 7, agitou-se o preparado e ps-se a repousar no suporte para tubos de ensaio. Para a preparao do tubo 9

usou-se uma pipeta de 2 cm3 e um pipetador e pipetou-se 1,5 ml de BSA (vide fig.3) este tubo no levou gua, pousando-o de seguida no suporte de tubos.

Fig.1: Material utilizado para a preparao das amostras. Pipetador, pipetas e tubos de ensaio e seu respectivo suporte.

Fig.2 e 3: Pipetao de gua destilada seguida de pipetao da soluo de BSA

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Posto isto preparou-se o tubo 10 (com a amostra de protena) este contendo 1,0 ml de protena que foi pipetada com uma nova pipeta de 1 cm3 e juntou-se neste tubo 0,5 ml de gua com uma nova pipeta de 1 cm3, homogeneizou-se e pousou-se no suporte para tubos de ensaio. Depois desta fase tivemos de aguardar enquanto os nossos colegas acabavam de fazer a preparao dos seus tubos para a curva de calibrao, devido necessidade que existe em se adicionar o biureto aos tubos de ensaio com as preparaes a todos ao mesmo tempo. Depois da adio do biureto aos tubos de ensaio, que foi pipetado com um pipetador electrnico ajustado para pipetar 1,5 ml deste reagente (vide fig. 4), agitou-se para homogeneizar a preparao e deixou-se

em repouso cerca de 20 minutos.

Depois de todo este procedimento a professora juntou-nos volta do espectrofotmetro para nos dar uma breve explicao de como funcionar com este. Em seguida cada grupo escolheu um comprimento de onda com o qual iria trabalhar para medir os pontos de calibrao em Abs. Ento comeou-se por passar todas as preparaes para clulas do espectrofotmetro, tubo 1 para a clula 1, tubo 2 para a clula 2,

assim consequentemente at ao ltimo tubo, em seguida passou-se para a determinao do branco experimental, para isto, e depois do espectrofotmetro estar ligado, escolheu-se a opo PHOTOMETRY do menu inicial (vide fig.6) e carregou-se Enter e em seguida apareceu-nos outro menu no qual na primeira opo que era DATA MODE (vide fig.7) foi escolhida e aps a verificao do tipo de leitura que queramos fazer, mudou-se para absorvncia devido a estar

Fig.4: Adio do reagente biureto s amostras previamente preparadas.

Fig.6: Imagem do monitor do espectrofotometro, imagem retirada de Santana, M.A., (2003), Como operar com o espectrofotmetro HITACHI U-2001 , Santarm.

Fig.5: Clulas. Imagem retirada de Santana, M.A.; Pinto, M.P., (2008), Doseamento de protenas por espectrofotometria molecular, Santarm.

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configurado para transmitncia e carregou-se enter e seleccionou-se a opo que nos permitia fazer uma leitura em absorvncia (ABS), em seguida voltamos para o menu principal e entrou-se em PHOTOMETRY e seleccionou-se a opo 2 TEST SETUP para se definir o comprimento de onda que se pretende trabalhar, inseriu-se 550 nm porque dentro do espectro com o qual se queria trabalhar foi o que nos pareceu mais correcto, mais uma vez voltou-se ao menu principal e escolheu-se desta vez a opo 8 INST SETUP para se defenir as variveis do aparelho, escolhendo aqui a opo USER esta em que o utilizador que define todas as variveis do aparelho, definindo tambm o On na opo de TEXT PRINT para que sejam impressos os valores medida que vo sendo lidos pelo aparelho. Depois de termos estas opes todas definidas carregou-se no boto Forward para passar ao menu de leitura.

Depois do espectrofotmetro estar configurado para a preparao procedeu-se ento aferio do zero para nos dar apenas a indicao da nossa soluo, ento ps-se uma clula com a soluo branco na cmara da parte de trs e outra clula tambm com a soluo branco na clula da parte da frente e procedeu-se obteno do zero carregando na tecla Auto-zero. Depois de aferirmos o zero do espectrofotmetro comeou-se a fazer as leituras de absorvncia de todos os tubos que foram preparados anteriormente (vide fig.8), tendo o cuidado de limpar com um pouco de papel as clulas antes de as colocar na cmara do espectrofotmetro agarrando pela zona estriada. Depois de termos todos os valores impressos foi s fazer uma

tabela no Excel com os valores dos mg de BSA utilizados em cada amostra e com os valores da absorvncia que nos deu para 550 nm e fazer uma regresso para nos dar um grfico de onde pudssemos aferir se tudo foi realizado conforme o protocolo e se os valores obtidos foram os esperados.

Fig.7: Imagem do monitor do espectrofotometro, imagem retirada de Santana, M.A., (2003), Como operar com o espectrofotmetro HITACHI U-2001 , Santarm.

Fig.8: Colocao das clulas no espectrofotmetro.

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Varivel X 1 Desenho de linha ajustada

00,05

0,10,15

0,20,25

0,3

0 1 2 3 4X 1 - mg de protena

Y - A

bso

rvn

cia

em

n

m

YY previsto

Apresentao e tratamento de resultados

Curva de calibrao

Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 mg protena -- 0,2 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 2.4 3,0 Abs (550nm) -- 0,020 0,042 0,081 0,118 0,162 0,181 0,231 0,275

Soluo de protena de concentrao desconhecida

Tubo 10 ml de soluo 1,0 Abs (550 nm) 0,229

Curva padro das absorvncias em funo de mg de protena

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Sumrio dos resultados

Estatstica de regresso R mltiplo 0,997862507 Quadrado de R 0,995729584 Quadrado de R ajustado 0,995017847 Erro-padro 0,00634853 Observaes 8

gl SQ MQ F F de significncia Regresso 1 0,056385677 0,056386 1399,015 2,43757E-08 Residual 6 0,000241823 4,03E-05 Total 7 0,0566275

RESULTADO RESIDUAL

Observao Y previsto Residuais 1 0,024756637 -0,004756637 2 0,042995575 -0,000995575 3 0,079473451 0,001526549 4 0,115951327 0,002048673 5 0,152429204 0,009570796 6 0,18890708 -0,00790708 7 0,225384956 0,005615044 8 0,28010177 -0,00510177 9 0,249750286 -0,020750286

Clculo da concentrao de protena da soluo desconhecida

y = mx + b y = 0.091x + 0,007 y = 0,091X0,229 + 0,007 y = 0,028 mg/ml

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Discusso e concluso

Depois de todos os procedimentos e clculos efectuados e a regresso linear tambm efectuada podemos afirmar que o mtodo utilizado um mtodo muito sensvel devido facilidade com que pudemos alterar um dos factores, por exemplo o tempo de espera depois da colocao do biureto ou a colocao do biureto nos tubos de ensaio com as preparaes em tempos diferentes, ou no caso de factores qumicos que podem ser responsveis pela alterao dos valores como por exemplo a presena de impurezas no mesmo comprimento de onda que a amostra e concentraes elevadas que tendem a deslocar o equilbrio para valores negativos ou positivos provocando assim a curvatura da recta que est patente no grfico, sendo esta uma das restries da equao de Beer-Lambert. Como no caso da nossa experincia essas variaes no foram muito evidentes, como se pode observar com os resultados obtidos na regresso que fizemos com os valores de absorvncia a 550 nm e com os valores dos mg de protenas utilizadas em cada tubo de ensaio, o que tambm faz com que os desvios lei de Beer-Lambert sejam muito reduzidos, em que nos dado o valor residual que da ordem dos 10-3 em relao ao valor esperado o que muito bom para um mtodo to sensvel como o com o espectrofotmetro, tal como o pequeno valor da ordenada na origem na recta, um bom indicador do sucesso da experincia.

Pode-se concluir assim que a experincia efectuada teve resultados prximos do excelente, devido aos diminutos erros e desvios, o que da tambm advm a qualidade, o cuidado e o rigor dos operadores no cumprimento de todos os passos do procedimento protocolar.

Bibliografia

Santana, M.A., (2003), Como operar com o espectrofotmetro HITACHI U-2001 , Santarm;

Santana, M.A.; Pinto, M.P., (2008), Doseamento de protenas por espectrofotometria molecular, Santarm;

Santana, M.A.; Pinto, M.P., (2007) Noes De Espectrofotometria, Santarm.