Biossistemas e Biorreações

Prof. Maria Alice Zarur Coelho

Programa de Pós-graduação em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos

Escola de QuímicaUFRJ

Redes de Reações Bioquímicas

Evolução resultou em uma complexa rede metabólica para garantir as funções adequadas das células vivas

Quando o conjunto de reações da rede metabólica éagrupado em uma única reação:

Modelos caixa-preta

utéis para fechar os balanços de massa (carbono) �entrada e saída da célula

Um olhar para dentro da célula

� Aumenta a complexidade do sistema conforme as reações intracelulares são consideradas

� Balanço constante entre a formação e o consumo de metabólitos intracelulares

impõe um grande número de restrições nos fluxosatravés dos diferentes ramos da rede metabólica

Mesmo que a complexidade aumente, o número de grausde liberdade do sistema não necessariamente aumenta!

Conceitos Básicos

Uso dos fluxos de entrada e saída de material da célula: diretamente mensurados

In vivo versus In vitro:Controle enzimático é perdido nas medidas in vitroMedidas de atividade enzimática usam a concentração de

substrato e de todos os metabólitos que influenciam a cinética enzimática

Os fluxos in vivo podem ser calculados através dos diferentes ramos da rede� balanço metabólico

Considere uma rede na qual sejam identificados:

J fluxos ou v1 … vJ taxas de reaçõesN substratosM produtos metabólicos (excretados)µµµµ - taxa específica de crescimento da biomassa

Taxas mensuráveis: r1, …, rN+M+1

Restrições impostas pelos balanços de massa: a concentração de um dado metabólito é constante, i.e., a taxa líquida de produção do metabólito é zero

Formalmente�para todos os metabólitos intracelulares, os fluxos quechegam a um dado metabólito são balanceados pelosfluxos que partem deste metabólito, não havendoacúmulo líquido do mesmo.

EMP - Exemplo

r3PG = 0

Balanço Redox� Resultado da oxidação do substrato a produto� Reações podem envolver mais de um tipo de espécie

redox (NADH ou NADPH)

� Compartimentalização da célula: NADH do citosol versus NADH da mitocôndria

não são intercambiáveis...

“Equivalentes” de energia

Expressos em ATPConversão de um metabólito em outro com menor nível

energético: � liberação de ATP ou� dissipação de calor (diferença energia livre de Gibbs)

Exemplo: Fermentação anaeróbia de levedura

estequiometria:- CH2O + 0.510 CH3O1/2 + 0.275 CO2 + 0.137 X + 0.077 CH8/3O = 0

balanço redox: - 4 x 1 + (6 x 0.510 + 0 x 0.275 + 4.18 x 0.137 + 4.67 x 0.077) = -0.0078 ≈ 0

O grau de redução é especificado pela combinação linear dos balanços elementares onde os fatores de multiplicação, na combinação linear, são os níveis redox (ou grau de redução) dos elementos.

Não introduz nenhum balanço extra... Quando todos os balanços elementares são satisfeitos, o balanço redox fecha automaticamente.

Crescimento EnergéticoConteúdo intracelular de ATP deve ser rigorosamente

controlado.... balanço entre a energia livre produzida pelos processos catabólicos e o subseqüente uso na biossíntese dos constituintes celulares no anabolismo.

turnover de ATP é baixo

Consumo de ATP para manutenção celular

Metabolismo endógeno (Hebert, 1959)resulta no decréscimo da biomassa cuja degradação seria

um processo de 1ª ordem:µe = taxa específica de degradação da biomassa

(-rS) = YXS µ + YXS µe

parte associada ao crescimento

mS � coeficiente de manutenção celular(Pirt, 1965)

degradação da massa celular

Processos de manutenção celular

� Manutenção de gradientes (H+) e potencial elétrico através da membrana celular

� Ciclos fúteis:geração de calor na hidrólise de ATPfrutose-6P ! frutose 1,6-P ! frutose-6P

� Turnover de macromoléculas (p.ex. mRNA)

ATP

Altas taxas de crescimento: maior turnover de macromoléculasaumento da atividade intracelularmaior perda de energia em ciclos fúteis

ATP requerido para síntese da biomassa

determinado com precisão em condições anaeróbicas

rATP = YX,ATP µ - mATP

Meios complexos fornecem valoresmenores que em meios mínimos

Energética de Processos Anaeróbios

� Nao há consumo de oxigênio� Obtém ATP para crescimento ao nível da fosforilação do

substrato (usa outros aceptores finais de elétrons)� Muitos microrganismos anaeróbios facultativos não

possuem a via da fosforilação oxidativa

bactérias do ácido lático � ausência de citocromo Cpresença de O2 ajuda a manter baixos os níveis de NADH

através da ação das NADH-oxidases que usam O2 comoaceptores de elétrons

� Produtos finais do catabolismo em crescimentoanaeróbico: etanol, ácido lático e acetato

� Outros produtos como acetoína, acetona e butanolpodem ser formados em condições anaeróbicas(Clostridium acetobutylicum)

� Microrganismos heterofermentativos ! formam mais de um produto para balancear co-fatores NADH e NADPH (exceto para crescimento em meio rico)

Rede metabólica mais complexa

Produção de ácido lático correlacionada com a produção de ATP(1 mol de ATP por mol de ác. lático produzido):

µ> 0.3 h-1 YX,ATP = 15 mmoles ATP (g p.s.)-1 mATP = 18 mmoles ATP (g p.s. h)-1

Meio rico, i.e. célula usa ATP para reações de polimerização

µ < 0.3 h-1 YX,ATP = 50 mmoles ATP (g p.s.)-1 mATP = 7 mmoles ATP (g p.s. h)-1

Exaustão de um ou mais componentes do meio - uso de ATP para crescimento é maior

Célula demonstra habilidade em se ajustar ao ambiente hostil,

reduzindo o consumo de ATP nos processos de manutenção celular

� Obtém mais energia pela completa oxidação do substrato

� ATP é formado na fosforilação oxidativa� Processo de crescimento celular começa com a

formação de precursores metabólicos (1); blocos de construção são sintetizados (2) a partir destesprecursores; e depois polimerizados emmacromoléculas (3)

Energética de Processos Aeróbios

(1) CO2 e NADH são obtidos como co-produtos(2) NADPH e ATP são requeridos(3) requer ATP

Síntese de Biomassa:

biomassa + Yxc CO2 + YX,NADH NADH � (1+YXC) CH2O � YX,ATP ATP � YX,NADPH NADPH = 0

Redes Metabólicas Simples

(i) Crescimento anaeróbio de S. cerevisiae

Etanol = principal produto metabólicoGlicerol = formado como resultado do balanço redox

(balancear nível de NADH)

di-hidroxi-acetona fosfato glicerol � 3P glicerol

NAD NADH

V1: -1.12 CH2O + CH1.74O0.6N0.12 + 0.12 CO2 + 0.15 NADH � 2.42 ATP = 0

V2: -1.5 CH2O + CH2O0.5 + 0.5 CO2 + 0.5 NADH + 0.5 ATP = 0

V3: - CH2O0.5 + CH3O0.5 � 0.5 NADH = 0

V4: - CH2O + CH8/3O � 0.333 NADH � 0.333 ATP = 0

V5 = V2 – V3

Glicose (s)

Biomassa (x)

v1

Glicerol (g)

v4

v2

P

v3

Etanol (p)

v5Acetaldeído (a)

Análise de fluxos em grandes redes metabólicas

� Identificação da estrutura da rede metabólica (topologia)� Quantificação dos fluxos através dos ramos da rede

Ensaios enzimáticos para confirmar presença de enzimasespecíficas e determinar as exigências em co-fatores;

Substratos marcados (glicose � 13C)

Emprego de taxas mensuráveis

Abordagem similar aos modelos de redes metabólicassimplificadas, e.g.

" EMP" Ciclo TCA" Via do glioxilato" Carboxilação do piruvato" Formação de macromaléculas (proteínas,

carboidratos e lipídios)

� 16 compostos� 8 metabólitos intracelulares� Taxas de formação e consumo mensuráveis para:

glicose, amonia, CO2, citrato, isocitrato, proteína, carboidratos e lipídios

� Pseudo estado estacionário para os metabólitosintracelulares: glicose – 6P, piruvato, acetil-CoA, 2-oxoglutarato, succinato, malato, oxaloacetato e glioxilato.

� Citrato e isocitrato constantemente produzidos

Com 15 fluxos e 8 equações de balanço = 7 graus de liberdade� 7 taxas de reação a serem especificadas, a saber:

1. Consumo de glicose2. Produção de CO2

3. Produção de acido cítrico4. Produção de isocitrato5. Síntese de proteína6. Síntese de carboidrato

Impor uma restrição colocando uma das taxas da rede igual a zero (Aiba e Matsuoka, 1979)

Modelo 1: via do glioxilato inativa; v11 = 0Modelo 2: piruvato carboxilase inativa; v4 = 0Modelo 3: ciclo TCA incompleto; v8 = 0

Medidas in vitro das atividades das enzimas piruvato carboxilase, citrato sintase, isocitrato desidrogenase e isocitrato liase

Via do glioxilato é inativa ou opera com uma taxa reduzida emC.lipolytica sob condições de produção de ácido cítrico

Emprego de substratos marcados

O enriquecimento dos metabólitos intermediários

de uma via depende daatividade desta via.

Biossíntese de lisina

Fluxo relativo aumenta com o aumento da concentração de amôniae ao mesmo tempo eleva a secreção de lisina ! super-produção