Dra. Márcia Melhem Seção de Micologia Instituto Adolfo Lutz Outros testes de sensibilidade a...
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Dra. Márcia MelhemSeção de Micologia Instituto Adolfo Lutz
Outros testes de sensibilidade a antifúngicos
Métodos para avaliar a resistência a antifúngicos
Quando avaliar a resistência a antifúngicos
Isolamento de um fungo
Como realizar os testes
Testes
Problemas ainda existentes no método de referência...
Fenômeno trailing ou arraste observado para azóis e 5-fc
Interpretação dos resultados de MIC (g/L)Sensititre YeastOne
Resultado SDD
Comparação de métodos
Indicações do teste de sensibilidade
Espécies
Critérios clínicos para indicação do teste de sensibilidade
Considerações finais
índice
Métodos para avaliar a resistência a antifúngicos
Difusão a partir de discos
Difusão a partir de fitas
Diluição em agar
Diluição em meio líquido
em tubos = macrodiluição
em placas = microdiluição
Infecção ou colonização?
Critérios microbiológicos e clínicos para indicação do teste de sensibilidade a antifúngicos
Quando avaliar a resistência a antifúngicos?
LeveduraFungo Filamentoso (bolor)
Isolamento de um fungo
Microbiota humana transiente ou permanente
(pele, mucosas, TR, TGI, TU)
Microbiota transiente (pele, mucosas, TR)
MICROBIOTA
AGENTEETIOLÓGICO
MEIO AMBIENTE
+ MEIO AMBIENTE
+ MEIO AMBIENTE
Como realizar os testes?Como realizar os testes?
Manutenção Freezer a -20 -
80°cPlaqueamento
Cultura mista é uma causa
comum de erro!
Colônia pura
Suspensãode células do fungo
Solução-padrão=
106 ufc/mL
Comparação para ajuste de turbidez:
espectrofotômetro ou visual
= INÓCULO
Como realizar os testes? 1.Inóculo
Como realizar os testes? 2. Condições
INÓCULO ANTIFÚNGICO (s)X = Sensibilidade
Meio Líquido (caldo)
Meio Sólido (agar)
CONDIÇÕES PARA O TESTE: temperatura, tempo e meio de cultura
Método de Difusão por Discos
Vantagens
Parâmetros definidos para Candida e FZ (M44P)
Fácil de realizar
Similaridade com antibiograma
Desvantagens
Falta padronização para outras drogas
Resultado somente em 3 categorias que não indicam pequenas alterações ou tendência para ®
Não fornece a concentração inibitória mínima (MIC), apenas correlaciona MIC com diâmetro do halo
... técnicas em agar... técnicas em agar
Método de difusão por fitasMétodo de difusão por fitas
Vantagens:
Resultado em CIM = MIC
Facilidade de execução
Disponível no comércio
Desvantagens:
Produto importado (custo)
Trailling
Leitura subjetiva
Inóculo variável
... técnicas em agar... técnicas em agar
Diluição em ágar
Diversas placas, cada uma contendo agar com diferentes concentrações de um AFGInóculo na superfície (fungos de crescimento lento, dermatófitos, agentes de cromomicose)
Observa-se a inibição do fungo na CIM (Vantagem sobre técnica de disco)
Técnicas em agarTécnicas em agar
fungo
Placa com agar e afg64 32 16 8 4 2 1 0,5
(g/mL)
Variante do teste em placa: Teste Rápido para leveduras frente a FZ
Variante do teste em placa: Teste Rápido para leveduras frente a FZ
Agar com FZ (8g/mL)
Colônias pequenas: sensíveis
Colônias grandes: resistentes
Mas,
requer ainda melhor avaliação com cepas R
Em tubos = macrodiluição ou macrométodo
Em placas de microtitulação = microdiluição ou micrométodo
Em tubos = macrodiluição ou macrométodo
Em placas de microtitulação = microdiluição ou micrométodo
Testes em meio líquido
Método de Referência para leveduras
(Candida spp e Cryptococcus neoformans)
Doc. M27-A, 2002- NCCLS
Método de Referência para Fungos Filamentosos
(Aspergillus, Fusarium, Rhizopus e Scedosporium)
Doc. M38-P, 2002- NCCLS
Série de 10 tubos com várias concentrações do antifúngico + inóculo do fungo
Após 24 a 72 h observa-se os tubos em que houve inibição de crescimento
Entre esses tubos, o que contém a menor concentração corresponde ao MIC
Macrométodo
Micrométodo em placa
MICMIC
INÓCULOS
CONCENTRAÇÕES DECRESCENTES DO ANTIFÚNGICO
Controle de
esterilidade do meio
Controle de crescimento dos inóculos
Inóculos cepas ATCC
Automatização = resultados acurados
Meio RPMI + 2% glicose em tampão MOPS = inerte
Placas de microtitulação, 96 orifícios= economia de reagentes
Placas contendo [FZ] de 0,12 até 64g/mL; [IZ] e[ AB] de 0,015 a 8g/mL= armazenadas e congeladas, prontas para uso
Leitura da inibição: visual ou espectrofotométrica com valor da d.o.impressa em fita = rastreabilidade de resultados
Determinação do MIC:
Para azóis = desprezar crescimento residual devido ao trailing MIC é concentração que inibe 50% do crescimento, em relação ao controle positivo (coluna 12)
Para AMB: concentração que inibe 100% do crescimento
Automatização = resultados acurados
Meio RPMI + 2% glicose em tampão MOPS = inerte
Placas de microtitulação, 96 orifícios= economia de reagentes
Placas contendo [FZ] de 0,12 até 64g/mL; [IZ] e[ AB] de 0,015 a 8g/mL= armazenadas e congeladas, prontas para uso
Leitura da inibição: visual ou espectrofotométrica com valor da d.o.impressa em fita = rastreabilidade de resultados
Determinação do MIC:
Para azóis = desprezar crescimento residual devido ao trailing MIC é concentração que inibe 50% do crescimento, em relação ao controle positivo (coluna 12)
Para AMB: concentração que inibe 100% do crescimento
Micrométodo em placa
Micrométodo em placa
Vantagens: acurácia (procedimento e leitura)
Problemas ainda existentes no método de referência...Problemas ainda existentes no método de referência...
16 µg/ml 8 4 2 1 0.5 0.25 0,12 0,06 C+
CIM
64 µg/ml 32 16 8 4 2 1 0,5 0,25 C+
CIM
AB
100%
de inibição
(NCCLS)
90%
(EUCAST)
AB
100%
de inibição
(NCCLS)
90%
(EUCAST)
Azóis
80%
Inibição
(MACRO)
50% de inibição
(MICRO)
Azóis
80%
Inibição
(MACRO)
50% de inibição
(MICRO)
Fenômeno trailing ou arraste observado para azóis e 5-fc
Fenômeno trailing ou arraste observado para azóis e 5-fc
E ainda...E ainda...
Método tem baixa sensibilidade p/ identificar cepas resistentes à anfotericina B - AMB.
Não é viável para laboratório de análises clínicas (complexidade e custo). Algumas espécies de leveduras não crescem bem nas condições de incubação (T , t, meio de cultura?)
Outros métodos denominados NCCLS-like :
Europa: comitê da ESCMID = EUCAST (modificações na microdiluição: adição de glicose ao meio de cultura, suspensão mais concentrada do fungo, leitura antecipada, agitação das placas, etc...).
Interpretação dos resultados de MIC (g/mL)
AfgS SDD R
FZ < 8 16 - 32 > 64
IZ < 0,25 0,25-0,5 > 1
AMB < 2 - > 2
S = sensível; R = resistente; SDD = sensibilidade dependente da dose:
100 mg/dia= 6-7 ug/mL de soro
FZ 400 mg/dia= 20 ug/mL de soro
800 mg/mL=50-60 ug/mL de soro
NCCLS 2002
Sensititre YeastOne
• Indicador Alamar Blue (oxidação-redução)• 2 cepas/placa x IZ, FZ, 5FC• Película selante. Incubação 35°C/24h – 48h
• Indicador Alamar Blue (oxidação-redução)• 2 cepas/placa x IZ, FZ, 5FC• Película selante. Incubação 35°C/24h – 48h
negativo
inibição parcial ( trailing)
positivo
Crescimento:
Resultado SDD
Concentrações séricas de FCZ
Dose diária de FZ (mg/dia) Concentração sanguínea (g/mL)
100 6
400 20-30
800 40-60
Comparação de métodosComparação de métodos
• 5 cepas ATCC
• Correlação boa: • AMB = 85 %• FZ = 74 %
Maiores erros:
• Apenas 1/17 indicou C.krusei FZ®
• Nenhum indicou C.lusitaniae AMB®
• 5 cepas ATCC
• Correlação boa: • AMB = 85 %• FZ = 74 %
Maiores erros:
• Apenas 1/17 indicou C.krusei FZ®
• Nenhum indicou C.lusitaniae AMB®
E-test (3/17)E-test (3/17)
Microdiluição (14/17)Microdiluição (14/17)
[Ramani & ChatuRverdi JCM 2003;41]
17 laboratórios de Nova York, USA
Pfaller et al., 2003
E-test com azul de metilenoE-test com azul de metileno
MicrodiluiçãoMicrodiluiçãoDifusão por discos Difusão por discos
235 cepas de Candida glabrata
FZ = 91-96% VZ = 93-95%
Pfaller et al., 2002
E-test E-test
726 cepas de Candida sp
Caspofungina = alta correlação, exceção C.lusitaniae
MicrodiluiçãoMicrodiluição
Comparação de métodosComparação de métodos
Chryssanthou, E & Cuenca-Estrella JCM 2002;40
E-testE-test MicrodiluiçãoMicrodiluição
102 cepas Candida spp e Saccharomyces cerevisiae
Correlação E test x NCCLS VZ = 100%
Correlação E test x NCCLS Caspofungina = 89%
Comparação de métodosComparação de métodos
Indicações do teste de sensibilidade
Critério microbiológico: depende da identificação da espécie
Após a identificação da espécie....Após a identificação da espécie....
1. Espécie reconhecidamente, resistente ® aos azóis ou anfotericina B
2. Espécie sensível
Espécies: 3 tipos ®Espécies: 3 tipos ®
® INTRÍNSECA: todos os membros são ®
Ex.: fungos filamentosos e levedura Candida krusei
frente ao fluconazol (FZ)
Há indicação do teste de sensibilidade ao FZ ? não
E para outros azóis? sim
® NATURAL: alguns membros são ®
Ex.: Candida glabrata ao FZ
C.lusitaniae, Aspergillus, Rhizopus à anfot.B (AMB)
Espécies ®Espécies ®
Há indicação do teste de sensibilidade ? sim
® ADQUIRIDA: após exposição à droga, alguns membros, ou todos, tornam-se ®
Ex.: C.glabrata,C.albicans,C.parapsilosis, C.tropicalis e outras espécies
a FZ, itraconazol e cetoconazol
Há indicação do teste de sensibilidade ? sim
Espécies ®Espécies ®
Candida glabrata Candida glabrata
Desenvolve ® de modo muito rápido, poucas horas de exposição ao FZ.
Não se recomenda tratar infecções caudadas por C.glabrata com FZ.
Espécies reconhecidamente, sensíveisEspécies reconhecidamente, sensíveis
Avaliação da sensibilidade in vitro não precisa ser feita de
rotina, para a orientação terapêutica.
A identificação da espécie, em regra, é suficiente para
manter ou re-orientar tratamento.
Critérios clínicos para indicação do teste de sensibilidade
Critérios clínicos para indicação do teste de sensibilidade
Paciente com histria de profilaxia com azól.
Caso de falha terapêutica.
Caso com infecção por espécie com perfil de sensibilidade desconhecido ou pouco estudado.
Considerações finais
1. Testes em agar podem ser úteis para triagem de cepas resistentes, desde que, realizadas dentro de um protocolo rígido, com cepas-padrões e monitorados por um laboratório de referência (método NCCLS ou NCCLS-like).
2. Os métodos de referência não são aplicáveis a todas as espécies de fungos.
3. Não existe um método com boa sensibilidade para identificar cepas AMB ®.
4. A aplicação clínica de testes de sensibilidade a antifúngicos é limitada.