ECOTOX CRONICA VFISCHERI

UNIVERSIDADE REGIONAL DE BLUMENAU

CENTRO DE CIÊNCIAS TECNOLÓGICAS

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ENGENHARIA AMBIENTAL

PADRONIZAÇÃO DE UM TESTE DE TOXICIDADE CRÔNICA COM A

BACTÉRIA LUMINESCENTE Vibrio fischeri PARA ANÁLISE DE QUALIDADE DE

ÁGUAS SUPERFICIAIS

VERIDIANA CHAPIEWSKY HARMEL

BLUMENAU

2004


PADRONIZAÇÃO DE UM TESTE DE TOXICIDADE CRÔNICA COM A

BACTÉRIA LUMINESCENTE Vibrio fischeri PARA ANÁLISE DE QUALIDADE DE

ÁGUAS SUPERFICIAIS

Dissertação apresentada como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre ao Curso de Mestrado em Engenharia Ambiental, Centro de Ciências Tecnológicas, da Universidade Regional de Blumenau - FURB.

Jörg Henri Saar - Orientador

Adilson Pinheiro - Co-orientador

BLUMENAU

2004

PADRONIZAÇÃO DE UM TESTE DE TOXICIDADE CRÔNICA COM A BACTÉRIA LUMINESCENTE Vibrio fischeri PARA ANÁLISE DE QUALIDADE DE

ÁGUAS SUPERFICIAIS Por


Dissertação aprovada para a obtenção do título de Mestre no Programa de Pós-Graduação em Engenharia Ambiental - PPGEA, pela banca examinadora formada por:

Presidente: ________________________________________________

Prof. Dr. Jörg Henri Saar – Orientador, FURB

Membro: ________________________________________________

Prof. Dr. Marcos Rivail, FURB

Membro: ________________________________________________

Prof. Dr. Joachim Knie, FATMA

Membro: ________________________________________________

Prof. Dr. William Gerson Matias, UFSC

_________________________________________

Coordenador do PPGEA: Prof Dr. Adilson Pinheiro

Blumenau, agosto de 2004.

AGRADECIMENTOS

A Deus, por cada dia,

Ao meu marido pelo carinho e importante ajuda,

Aos meus pais, pelo ensino oportunizado,

Ao professor Geraldo Moretto, pelo auxílio estatístico,

Aos professores orientadores, pela oportunidade de realização profissional.

RESUMO Testes de toxicidade são experimentos, nos quais organismos vivos são colocados frente à compostos ou substâncias químicas e suas reações são observadas. A bactéria luminescente Vibrio fischeri é conhecida e utilizada em testes de toxicidade aguda. Sua manipulação é pratica e segura, sendo o teste rápido e eficaz.O principal objetivo deste trabalho foi padronizar o meio de reconstituição utilizado para o ensaio crônico, bem como o teste em si, perante substâncias referência. As substâncias referência utilizadas foram o cromo VI na forma de dicromato de potássio, 3,5 diclorofenol e também amostras de água superficial para observar o comportamento do ensaio. Para fins de comparação, o teste de toxicidade aguda foi realizado paralelamente com as mesmas amostras. A análise do crescimento relativo de biomassa foi realizada por espectrofotometria. Ensaios agudos e crônicos com o bioindicador Daphnia magna também foram realizados com fins de comparação de métodos. O ensaio crônico se mostrou instável perante as substâncias referências, ocorrendo crescimento bacteriano. A composição do meio foi variada durante o decorrer dos ensaios levando em consideração a disponibilidade de fonte de carbono para minimizar o crescimento das bactérias nos tubos de ensaio. Com o meio reformulado conseguiu-se a manutenção da luminescência durante o tempo necessário para o ensaio. Os ensaios foram repetidos, mas a instabilidade do sistema teste continuava. Dependendo da movimentação dos tubos do termobloco até o luminímetro o valor de luminescência era alterado, variando muito nos resultados. Os tubos de leitura foram agitados após a leitura de 24 horas por 30 segundos a 156 rpm e uma nova leitura realizada. Os valores de luminescência aumentavam devido a disponibilidade de oxigênio no meio, mas os resultados se mostraram mais coerentes se comparados com a leitura 24 horas sem agitação prévia, onde houve muita variação. Esta observação indica a possível necessidade do ensaio ficar em agitação no período de incubação, para não haver estratificação dentro do tubo e mantê-lo homogêneo. O método utilizado para a medição do ensaio crônico com Vibrio fischeri não demonstrou resultados satisfatórios, ocorrendo grandes variações nas leituras. Por outro lado, usando amostras de água superficial, verificou-se uma diferença significativa entre os resultados do ensaio crônico, comparando-se com o ensaio agudo com V. fischeri, e também se comparado com o bioindicador Daphnia magna. Palavras-chave: Vibrio fischeri; meio de reconstituição; ensaio crônico; toxicidade

ABSTRACT

Biotoxicity assays are experiments, in which living organisms are put into several samples and their reactions are observed. The luminescent bacteria Vibrio fischeri is known and used in acute toxicity tests. Its handling is practical and safe, being fast and efficient. The main objective of this work was to standardize the reactivation solution used for the chronic assay as well as the test itself, with reference substances. The reference substances used were chromium VI in the form of K2Cr2O7, 3,5 dichlorophenol and samples of surface water to observe the behavior of the assay. For comparison reasons, the acute toxicity test was carried out in parallel using the same samples. The analysis of the relative growth of the bacteria was accomplished photometrically. Acute and chronic assays with Daphnia magna were also carried out for methods comparison. The chronic assay showed instability according to the references substances, based on bacterial growth. The composition of the reactivation solution varied during the assays, taking into consideration the availability of the carbon source, to minimize the growth of the bacteria in the test tubes. In an altered reactivation solution the light-emission was kept constant during the necessary period for the test. The assays were repeated, but the instability of the test system continued. Depending on the way, the reaction vials were carried from the incubation block to the measuring instrument, the light-emission suffered alterations, leaving to greatly varying results of luminescence readings. As a consequence, after the 24 hours incubation period, the vials were agitated for 30 seconds in a shaker at 156 rpm, and a new reading were performed. The luminescence values increased due to oxygen availability in the reactivation solution, but, the results showed to be more coherent, if compared with the 24 hours without previous shaking reading, where there had been great variation. This observation shows a possible need of the test to be kept in agitation during the entire incubation period, so that formation of stratification zones in avoided and the suspension kept it homogeneous. The method used to measure the chronic assay with Vibrio fischeri did not show satisfactory results, with great readings variations. However, using samples of surface water, a significant difference was verified among the results of the chronic assay, being compared with the acute assay with V. fischeri, and also if compared with Daphnia magna. Keywords: Vibrio fischeri; reactivation solution; chronic assay

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1 – Autoindutor produzido por Vibrio fischeri, (AI-I) é lactona de β-cetocaproil homoserina. .............................................................................................................................. 27

Gráfico 4.1 – Variação dos valores de inibição da luminescência no ensaio crônico 12, após 24 horas de exposição à substância referência cromo VI sem agitação prévia. ....................... 51

Gráfico 4.2 - Valores de crescimento de biomassa em relação a biomassa inicial, comparados com a concentração de cromo VI na amostra........................................................................... 53

Gráfico 4.3 – Perfil da luminescência durante o período de ensaio utilizando o meio composto por 50% de SSWC e 50% de solução salina 20g/L.(Ensaios 01 e 02) ..................................... 55

Gráfico 4.4 - Valores de crescimento relativo de biomassa em relação a biomassa inicial no sistema teste Abs 585 para o meio reformulado....................................................................... 56

Gráfico 4.5 –Variação dos valores de inibição da luminescência em um ensaio crônico com leitura 24 horas sem agitação prévia, com a substância referência cromoVI. (Ensaio 30, concentração inicial 2 mg/L). ................................................................................................... 58

Gráfico 4.6 –Variação dos valores de inibição da luminescência em um ensaio crônico, após agitação, com a substância referência cromoVI. (Ensaio 30, concentração inicial 2mg/L).... 58

Gráfico 4.7 - Variação dos valores de inibição da luminescência em um ensaio agudo após 30 minutos com a substância referência cromoVI.(2 mg/L) ......................................................... 59

Gráfico 4.8 –Variação dos valores de inibição da luminescência em um ensaio crônico após 24 horas com a substância referência 3,5 Diclorofenol.(Ensaio 24h sem agitação dos tubos, concentração inicial 5mg/L) ..................................................................................................... 62

Gráfico 4.9 –Variação dos valores de inibição da luminescência em um ensaio crônico após agitação dos tubos com a substância referência 3,5 Diclorofenol.(Ensaio 24, concentração inicial 5mg/L) ........................................................................................................................... 64

Gráfico 4.10 - Variação dos valores de inibição da luminescência em um ensaio agudo após 30 minutos com a substância referência 3,5 diclorofenol.(25mg/L) ........................................ 65

Gráfico 4.11 – Curvas de inibição de luminescência no ensaio agudo após 30 minutos para as 3 amostras de água superficial, a) amostra 1, b) amostra 2, c) amostra 3. ............................... 67

Gráfico 4.12 – Curvas de inibição de luminescência no ensaio crônico após 24 horas para as 3 amostras de água superficial.a) amostra 1, b) amostra 2 c) amostra 3. .................................... 69

LISTA DE QUADROS

Quadro 3.1 – Soluções estoque para preparo da água de cultivo (meio M-4)......................... 35

Quadro 3.2 - Volume das soluções estoque necessárias para o preparo de 1000 ml de água de cultivo. ...................................................................................................................................... 36

Quadro 3.3 - Elementos traços e suas respectivas concentrações para preparo da solução estoque. ..................................................................................................................................... 37

Quadro 3.4 – Quantidade de macro-nutrientes para a formação das soluções isoladas e sua quantidade para a posterior formação do Meio M4.................................................................. 38

Quadro 3.5 – Elementos para o preparo das soluções estoque para o meio de cultura (meio CHU) ........................................................................................................................................ 39

Quadro 4.1 – Valores de cromo VI em (mg/L) causadores de aproximadamente 20% de inibição nos ensaios preliminares, agudos e crônicos, com a bactéria Vibrio fischeri............. 49

Quadro 4.2 – Valores de concentração em mg/L de Cromo VI que causaram cerca de 20% de inibição nos ensaios crônicos, com a concentração inicial da amostra de 0,25 gm/L.............. 50

Quadro 4.3 – Valores de concentração de cromo VI em mg/L, que causaram cerca de 20% de inibição no ensaio crônico, antes e após agitação do sistema teste. ......................................... 51

Quadro 4.4 – Valores de luminescência medida em teste de meio de reconstituição utilizando 50% de meio SSWC e 50% de solução salina.(média de 3 ensaios)........................................ 54

Quadro 4.5 – Valores das concentrações de cromo VI em mg/L que causaram aproximadamente 20% de inibição, utilizando o novo meio de reconstituição. ...................... 57

Quadro 4.6 – Concentrações que causaram aproximadamente 20 % de inibição no ensaio agudo, com a substância referência 3, 5 Diclorofenol (valores expressos em mg/L) .............. 61

Quadro 4.7 - Valores da concentração em mg/L, causadora de aproximadamente 20% de inibição, obtidos nos ensaios crônico com a substância referência 3, 5 Diclorofenol. ............ 62

Quadro 4.8 – Valores da CE20 e Fator de diluição para as amostras de água superficial no ensaio de toxicidade aguda. ...................................................................................................... 66

Quadro 4.9 – Valores de CE20 e fator de diluição para as amostras de água superficial no ensaio de toxicidade crônica..................................................................................................... 68

Quadro 4.10 – Valores do ensaio agudo de Daphnia magna com os respectivos percentuais de inibição indicados pela imobilidade dos animais para a substância cromo VI.................... 70

Quadro 4.11 – Valores do ensaio agudo de Daphnia magna com os respectivos percentuais de inibição indicados pela imobilidade dos animais para a substância 3,5 diclorofenol.......... 71

Quadro 4.12 – Valores agrupados dos ensaios agudos de Daphnia magna com os respectivos percentuais de inibição indicados pela imobilidade dos animais para as três amostras de água superficial. ................................................................................................................................ 72

Quadro 4.13 – Número total de filhotes nascidos no período de 21 dias para cada série de diluição e controle.(agrupamento de três repetições) ............................................................... 73

Quadro 4.14 – Número total de filhotes nascidos no período de 21 dias para cada amostra de água superficial com uma série de diluição.............................................................................. 74

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ...............................................................................................................12

1.1 Justificativa ....................................................................................................................14

1.2 Objetivos .........................................................................................................................15

1.2.1 Objetivos Específicos ..................................................................................................15

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA.......................................................................................16

2.1 Generalidades.................................................................................................................16

2.2 Bioensaios.......................................................................................................................18

2.3 Testes de Toxicidade Aguda e Crônica .........................................................................21

2.3.1 Vibrio Fischeri como Bioindicador............................................................................21

2.3.1.1 Sistemas Bioluminescentes ......................................................................................23

2.3.1.2 Bioquímica das Bactérias Luminescentes ................................................................25

2.3.1.3 Sinais Intercelulares, quorum sensing, e os genes Lux.............................................25

2.3.2 Daphnia magna como Bioindicador ..........................................................................27

3 MATERIAIS E MÉTODOS...........................................................................................28

3.1 Procedimento de Cultivo da Bactéria Vibrio fischeri. ..................................................28

3.1.1 Produção de Cepas .....................................................................................................28

3.2 Procedimento Geral de Ensaio com a Bactéria Vibrio fischeri ...................................30

3.2.1 Ensaio Agudo ..............................................................................................................31

3.2.2 Ensaio Crônico ............................................................................................................31

3.2.3 Séries de diluições – Método DIN e Geométrico ......................................................32

3.2.4 Método G1 ...................................................................................................................32

3.2.5 Avaliação da Biomassa e Agitação do teste no Ensaio Crônico..............................33

3.3 Manutenção e cultivo do microcrustáceo Daphnia magna..........................................33

3.3.1 Manutenção das culturas para ensaios de Toxicidade Aguda................................34

3.3.1.1 Reagentes e Soluções Utilizadas ..............................................................................34

3.3.2 Manutenção das Culturas para ensaios de Toxicidade Crônica ............................36

3.3.2.1 Reagentes e Soluções Utilizados ..............................................................................36

3.3.3 Cultivo de Scenedesmus subspicatus..........................................................................38

3.4 Descrição Geral do Ensaio com Daphnia magna.........................................................40

3.4.1 Ensaio Agudo ..............................................................................................................40

3.4.2 Ensaio Crônico ............................................................................................................40

3.5 Amostras Utilizadas........................................................................................................41

3.5.1 Cromo VI na forma de Dicromato de Potássio K2Cr2O7 ........................................41

3.5.2 3,5 Diclorofenol ...........................................................................................................42

3.5.3 Amostras Compostas de Água Superficial ...............................................................42

3.6 Procedimentos de Análise dos dados............................................................................43

3.6.1 Ensaio Agudo com Vibrio fischeri .............................................................................43

3.6.1.1 Critérios de Validação ..............................................................................................45

3.6.2 Ensaio Crônico com Vibrio fischeri ...........................................................................46

3.6.3 Ensaio Agudo com Daphnia magna...........................................................................47

3.6.4 Ensaio Crônico com Daphnia magna .......................................................................47

4 RESULTADOS E DISCUSSÕES .................................................................................48

4.1 Ensaios com Bioindicador Vibrio fischeri ....................................................................48

4.1.1 Ensaios Iniciais com a Substância Referência Cromo VI .......................................48

4.2 Reformulação do Meio de Reconstituição ....................................................................54

4.3 Ensaios utilizando o meio de Reconstituição Reformulado .........................................56

4.4 Substância Referência 3,5 Diclorofenol........................................................................60

4.5 Água Superficial.............................................................................................................65

4.5.1 Ensaios físico-químicos...............................................................................................65

4.5.2 Ensaios Agudos ...........................................................................................................66

4.5.3 Ensaios Crônicos.........................................................................................................67

4.6 Ensaios com o Bioindicador Daphnia magna ..............................................................69

4.6.1 Ensaio Agudo ..............................................................................................................69

4.6.2 Ensaio Crônico ............................................................................................................72

5 CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES .....................................................................76

REFERÊNCIAS .....................................................................................................................79

GLOSSÁRIO ..........................................................................................................................84

APÊNDICES ...........................................................................................................................85

ANEXOS .................................................................................................................................95

12

1 INTRODUÇÃO

A água, um dos recursos naturais mais significativos aos seres humanos, sofre uma

degradação constante devido aos processos antrópicos instalados no meio ambiente. Esta

possue um ciclo extraordinário de movimentação no sistema, onde devido as suas

propriedades, carrega consigo diversas outras substâncias, poluentes ou não.

Para cada uso previsto, existe uma qualidade de água segundo padronização a ser

exigida. O padrão de qualidade da água e efluentes exigidos está baseado em análises

laboratoriais de parâmetros essencialmente físico-químicos. Muitas vezes esses parâmetros

são insuficientes, sendo que se tornaria impossível a determinação química de todos os

componentes existentes em uma amostra de água, por exemplo, para avaliar seu potencial

efeito aos seres. Como saber se determinada amostra causa efeito sobre a biota existente no

local de seu lançamento? Para se avaliar o efeito de certas substâncias sobre a vida aquática

são necessários ensaios complementares onde são utilizados seres vivos como bioindicadores.

Existem no mercado uma diversidade de ensaios com bioindicadores, sendo

classificados em ensaios agudos e crônicos. Os ensaios agudos demonstram a resposta rápida

dos organismos perante alguma amostra num curto período de tempo. Os ensaios crônicos

demonstram a reposta dos organismos em contato a um longo período de tempo abrangendo

parte do seu ciclo de vida ou mais. Assim sendo, tendo-se uma ferramenta de monitoramento

crônico é possível detectar a presença de alterações em longo prazo de concentrações sub-

letais, pois somente organismos vivos têm capacidade de responder a esses estímulos.

De acordo com Baptista et al.(2000), os parâmetros físico-químicos e biológicos

devem ser complementares e indispensáveis como critérios de avaliação para definir a

qualidade e eficiência do tratamento de efluentes empregado pelas indústrias, e não apenas a

realização de testes de toxicidade aguda, mas também análises mais criteriosas quanto a

toxicidade crônica dos mesmos.

Existem diversos seres que podem ser utilizados como bioindicadores, sendo que a

fácil manipulação e a rapidez na realização de um ensaio são pontos chave para sua aplicação

principalmente no âmbito de mercado. A bactéria luminescente Vibrio fischeri é conhecida e

utilizada em testes de toxicidade aguda onde se observa uma resposta rápida dos organismos

perante a amostra. A manipulação da bactéria é pratica e segura, sendo o teste rápido e eficaz.

Ensaios agudos demonstram a reação direta do bioindicador em contato com a

amostra num curto período de tempo, já ensaios crônicos visam a reação do ser em um

13

período de tempo prolongado geralmente em contato com concentrações baixas da amostra,

visando uma resposta de efeito cumulativo da amostra para o ser.

O principal ponto para a possível realização de um teste de toxicidade crônica é a

reprodução do meio em que vive o ser para que o mesmo possa ser acompanhado no período

do ensaio. Com a bactéria Vibrio fischeri este ponto em questão é o desenvolvimento de um

meio de cultura onde elas tenham condições de vida, no caso, o meio de reconstituição onde

as bactérias são ativadas após congelamento e sobrevivem durante o período do ensaio.

Este meio de reconstituição foi obtido na realização do trabalho antecessor a este,

apresentado por Harmel (2002) onde as bactérias conseguiram sobreviver durante o período

do ensaio, no caso as 24 horas, graças à combinação de elementos e de indutores específicos

no meio de reconstituição. O teste de toxicidade crônica a princípio se mostrou sensível para

as amostras testadas parecendo eficaz como complemento nos testes de toxicidade.

Para ser utilizado em testes ecotoxicológicos o organismo teste deve ter uma faixa de

sensibilidade determinada para uma série de substâncias de referência. Para o ensaio de

toxicidade aguda a bactéria luminescente Vibrio fischeri tem as faixas de sensibilidades

padronizadas conforme norma ISO 11348 (1998).

Pela primeira detecção, em trabalho antecessor a este, da possível sensibilidade da

bactéria Vibrio fischeri no teste crônico, foi desencadeada a idéia de padronização deste teste

de toxicidade crônica utilizando-se substâncias referência. Dependendo dos resultados de sua

sensibilidade no ensaio crônico, também desenvolver a possível aplicação no deste ensaio no

biomonitoramento de águas superficiais, onde os elementos são presentes em concentrações

muito baixas, e muitas vezes mascarados às análises correntes.

14

1.1 Justificativa

Os bioindicadores podem detectar a presença de substâncias perigosas que

normalmente não são detectadas, muitas vezes provenientes de reações químicas complexas

no próprio ambiente.

Biotestes são simples, baratos, se comparados com alguns físicos químicos e, são

sensíveis, se tornando a ferramenta ideal para a avaliação da toxicidade perante os seres vivos.

O elevado índice de contaminantes presentes em nossas águas vem aumentando a

cada dia devido ao acúmulo dos mesmos. Esses compostos isoladamente podem não

apresentar perigo num curto espaço de tempo. Mas se tratando de longas exposições, as

características de sua ação podem ser modificadas.

Existem no mercado uma diversidade de ensaios com bioindicadores, sendo

classificados em ensaios agudos e crônicos. Os ensaios agudos demonstram a resposta rápida

dos organismos perante alguma amostra num curto período de tempo. Os ensaios crônicos

demonstram a reposta dos organismos em contato a um longo período de tempo abrangendo

parte do seu ciclo de vida ou mais. Assim sendo, tendo-se uma ferramenta de monitoramento

crônico é possível detectar a presença de alterações em longo prazo, pois somente

organismos vivos têm capacidade de responder a esses estímulos.

Por sua vez ensaios de toxicidade crônica demandam tempo e mão de obra elevados

dependendo do tipo de organismo utilizado para o ensaio. A bactéria luminescente Vibrio

fischeri é de fácil manipulação sendo sua utilização em ensaios de toxicidade crônica

considerado rápido pois tem a duração de 24 horas. Durante este período de tempo poderia-se

se realizar um ensaio de toxicidade crônica que abrangeria aproximadamente 5 ciclos de vida

das bactérias, sendo possível uma rápida resposta dos organismos perante substâncias

presentes no meio, partindo então para análises mais apuradas.

O monitoramento da toxicidade da água pode prevenir danos à saúde humana e ao

ecossistema dependendo do uso destinado à água servindo de indicador de alterações bruscas

num curto período de tempo tanto em águas superficiais, aqüíferos, descargas de efluentes

realizando um controle e conseqüentemente uma melhoria no biosistema.

15

1.2 Objetivos

O objetivo geral é padronizar um teste de toxicidade crônica com a bactéria

luminescente Vibrio fischeri

1.2.1 Objetivos Específicos

Como objetivos específicos são estabelecidos os seguintes:

a) Padronizar o método de ensaio de toxicidade crônica com Vibrio fischeri

utilizando substâncias referências;

b) Padronizar o método de avaliação dos resultados do ensaio de toxicidade crônica

com Vibrio fischeri;

c) Avaliar a sensibilidade do ensaio crônico de Vibrio fischeri perante aos ensaios

agudos com o mesmo bioindicador para as substâncias referências e amostras ambientais;

d) Comparar os métodos do ensaio crônico e agudo de Vibrio fischeri com o método

de ensaio crônico e agudo utilizando o bioindicador Daphnia magna.

e) Gerar dados de ensaio crônico com Vibrio fischeri em comparação com os dados

de monitoramento físico-químico de águas superficiais

f) Avaliar a aplicabilidade do teste crônico com Vibrio fischeri no monitoramento de

hidrossistemas.

16

2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Generalidades

Os elementos químicos essenciais à vida circulam na biosfera em grandes ciclos,

conhecidos como ciclos biogeoquímicos. Essa circulação é fruto de movimentos do ar, água,

solo etc. A sobrevivência dos seres vivos está sujeita a integridade desses ciclos. Qualquer

ação que interfira nesses complexos ciclos de absorção e redistribuição de energia pode afetar

a vida de uma forma ou de outra. (IPEA, 1985). A manutenção do equilíbrio de ecossistemas

aquáticos e terrestres encontra-se associada à qualidade de suas fontes de água. A

sobrevivência de populações pode ser seriamente comprometida em função do volume e da

composição dos resíduos líquidos que são lançados no ambiente sem tratamento adequado.

Os ecossistemas naturais exibem notável resistência e elasticidade para se adequar às

perturbações porque estão naturalmente adaptados a gerar um rápido equilíbrio no sistema;

mas no caso de uma perturbação duradoura e com elevadas cargas de produtos, os efeitos

maléficos podem ser pronunciados e prolongados uma vez que os organismos não possuem

um período evolutivo de adaptação. (ODUM, 1983)

Nos últimos anos, o risco de exposição ambiental a produtos químicos, tornou-se um

dos problemas de maior atenção em todo o mundo, devido à crescente preocupação com a

qualidade de vida no planeta. Estudos sobre os possíveis riscos da exposição ambiental a

agentes naturais ou sintéticos têm sido motivado por fatores tais como a constante expansão

do sistema produtivo, em especial as indústrias químicas, que colocam no mercado cerca de

mil novos produtos a cada ano, e cujo potencial tóxico para o ambiente e para o ser humano é

geralmente ignorado.

Segundo Resolução CONAMA 20/86, nenhum lançamento feito em um corpo

receptor pode acarretar ao mesmo, mudanças em suas condições alterando sua classificação já

existente, bem como não são permitidos lançamentos de matéria e energia em desacordo com

os padrões estabelecidos em lei.

Mas a problemática gira em torno desses lançamentos que muitas vezes são

realizados sem as devidas restrições. Segundo Alba et al.(2001), são introduzidos centenas de

substâncias químicas novas no mercado todos os anos, e estas podem terminar eventualmente

17

no meio ambiente sendo que muitas dessas combinações criadas são tóxicas aos sistemas

vivos.

Tortura et al (2002) descrevem que nos Estados Unidos, industrias geram 265

milhões de toneladas de resíduos perigosos, 80% dos quais vão parar em aterros de resíduos.

Enterrar essas substâncias químicas não as remove do ecossistema, somente as coloca em

outro lugar, onde podem oportunamente penetrar em corpos d’água.

Nos países em desenvolvimento a preocupação com questões ambientais por deveras

fica em segundo plano, sendo que a prioridade é gerar recursos para a sobrevivência no

mercado. Segundo Araújo 1999, o rápido crescimento industrial no Brasil vem gerando sérios

problemas de degradação ambiental, especialmente em áreas costeiras, onde ocorrem,

concomitantemente, as maiores concentrações urbanas e os ambientes mais ricos em termos

de produtividade natural.

A atividade industrial é uma das principais fontes de poluição dos ambientes

aquáticos devido ao lançamento de efluentes líquidos nos corpos receptores. Os efluentes

gerados em áreas industrializadas são formados por misturas complexas de substâncias

químicas, muitas delas tóxicas aos organismos aquáticos. (ROMANELLI, 2002)

Toxicidade é a possível ação que os agentes químicos, que são lançados no meio

ambiente, podem causar efeitos deletérios aos organismos devidos a suas propriedades,

concentrações e combinações. Por exemplo, substâncias que apresentam efeitos sobre as

propriedades químicas e físicas do meio, conseqüentemente podem vir a alterar as condições

de vida dos organismos (Norma DIN, 1994).

Testes de toxicidade consistem em expor organismos teste representativos no

ambiente à várias concentrações de uma ou mais substâncias durante determinado período de

tempo para determinação de seu potencial tóxico, sendo os efeitos detectados através de

respostas nos organismos (CETESB, 1990).

A preocupação crescente envolvendo a contaminação ambiental estimula esforços

rigorosos para estabelecer ensaios de monitoramento fidedignos (EL-ALAWI, 2002).

Somente os sistemas biológicos podem detectar os efeitos tóxicos das substâncias.

Através de testes de toxicidade laboratoriais, o potencial tóxico das substâncias químicas é

colocado contra o sistema de auto proteção dos organismos-teste, que vão reagir de uma

maneira geral a todos os efeitos das substâncias presentes no meio. (Norma DIN, 1994)

18

Detectar poluentes nocivos a vida no solo e na água é necessário para proteger o

homem e o ecossistema em si. Entretanto, após sua detecção, processos de biorremediação

ainda são necessários para remover os poluentes (TORTURA, 2002).

2.2 Bioensaios

Testes de toxicidade, em geral, são usados para avaliar as condições ambientais

apropriadas para a vida aquática, estudar os efeitos relacionando a parâmetros de qualidade

das águas com qualidade de efluentes lançados com toxicidade, estabelecer concentrações

aceitáveis para parâmetros convencionais (pH, temperatura, salinidade, turbidez), avaliar a

toxicidade de efluentes, avaliar o grau de tratamento de efluentes necessário para satisfazer as

exigências do controle de poluição da água, determinar a quantidade de efluente que pode ser

lançado (MAYS, 1996).

Comumente são utilizados no Brasil somente ensaios físico-químicos para a

avaliação dos parâmetros exigidos em lei. Estes somente qualificam e quantificam teores de

certas substâncias no meio, mas não avaliam o impacto que as mesmas podem vir a provocar

na biota presente. Somente alguns estados no país possuem leis que exigem ensaios

ecotoxicológicos.

Nos paises desenvolvidos ensaios ecotoxicológicos são exigidos em lei, apoiados por

normas e padrões, com diversos organismos. No Brasil, de forma geral, as metodologias

empregadas correspondem às utilizadas internacionalmente pela comunidade científica,

apesar de que em termos legais estamos muito atrasados.

Tortura et al.(2002) descrevem que análises físico-químicas tradicionais para

localizar possíveis substâncias nocivas no ambiente são caras e não distinguem entre as

substâncias que afetam sistemas biológicos daquelas que encontram-se inertes no ambiente.

A quantificação e qualificação das mais variadas substâncias químicas presentes no

meio somente com análises físico-químicas é limitada e não consegue abranger a dimensão do

problema que essas substâncias causam aos sistemas vivos e ao meio ambiente em si

dependendo de sua biodisponibilidade.

Análises toxicológicas, por sua vez, demonstram o impacto que substâncias ou

combinações de substâncias tem sobre os seres vivos presentes no meio aquático. Os

bioensaios se tornam ferramentas importantíssimas nessa questão abrangente entrando como

um complemento essencial das análises comumente utilizadas.

19

Somente seres vivos são capazes de indicar a toxicidade de substâncias ou amostras

complexas como efluentes industriais, mas não existe um bioindicador que seja perfeito e

representativo a todos os sistemas terrestres.

Para detecção dos reais impactos ambientais, muito estudos tem incluído avaliações

de genotoxicidade associadas à ensaios de toxicidade crônica e aguda e a caracterização

química dos possíveis elementos causadores do impacto.

Para análises de toxicidade são utilizados organismos representativos e sensíveis a

compostos estranhos ao seu meio, seguindo o raciocínio de que se estes forem afetados muito

provavelmente outros organismos também o serão.

A possibilidade de detectar problemas de poluição no meio aquático e efetuar

medidas corretivas em forma rápida e eficaz está intimamente relacionado com o nível de

organização dos seres vivos. Níveis de organização como o bioquímico e o fisiológico

acusam com maior especificidade e rapidez a presença de compostos tóxicos, e podem ser

usados de forma prospectiva antes que o efeito deletério seja percebido em níveis de

organização superior (MONSERRAT, 2002).

Os organismos utilizados são representativos a biota, preferencialmente que sejam

de fácil aplicação aos testes. Muitas vezes são selecionados mais de um organismo,

abrangendo mais posições dentro da cadeia trófica.

Diversos organismos são utilizados como bioindicadores entre eles alguns exemplos:

Peixes – diversas espécies são utilizadas como bioindicadores; geralmente os

indivíduos são colocados em contato com a substância teste e suas reações são verificadas.

São ensaios com duração de tempo longo, se o objetivo da analise for toxicidade crônica, pois

o período reprodutivo e de vida de peixes é longo se comparados com outros seres como

bactérias por exemplo.

Vibrio fischeri – utilizado amplamente em ensaios de toxicidade aguda com

padronizações internacionais. O ensaio de toxicidade crônico foi desenvolvido pela empresa

alemã Dr. Lange, e pela empresa Microtox. A Dr. Lange atualmente não comercializa este

ensaio.

Eiseia felida (minhoca) – utilizado principalmente para avaliação da toxicidade de

resíduos sólidos. O teste executado nestes organismos é um teste de toxicidade sub-crônica;

enchem-se os recipientes do teste com quantidades apropriadas de misturas das substâncias

testadas e em seguida colocam-se os vermes, que acabam por, ao longo do tempo, ingerindo

20

essa mistura. A duração do teste é de 28 dias e para avaliação são utilizados diversos critérios

como morte, efeitos secundários sub-letais.(DELLICADO, 1999)

Daphnia magna e Daphnia pulex (microcrustáceo) – são realizados testes de

toxicidade aguda e crônica, onde os bioindicadores são expostos às substâncias em sistemas

aquáticos estáticos ou correntes, sendo o objetivo final determinar as curvas de “dose/efeito” e

o valor de EC 50 (concentração da substância testada que provoca imobilidade ou redução na

reprodução 50% de uma população durante a exposição contínua num determinado período

de tempo).

Ceriodaphnia dúbia: é uma das espécies utilizadas em testes de toxicidade crônica,

para avaliar a toxicidade de efluentes e águas receptoras em um invertebrado.

Crassostetrea virginica (ostra) – são realizados dois tipos de teste; toxicidade aguda,

onde o critério usado pra avaliação é o crescimento da concha das ostras desde o momento em

que esta é exposta a substância até o final do teste, 96 horas mais tarde. Testes em ostras são

usados para medir a tendência que as substâncias tem para se bioconcentrar nos tecidos dos

moluscos (DELLICADO, 1999).

Segundo Peinado ( 2002) testes que utilizam bactérias até o presente momento são os

mais amplamente utilizados como técnicas de identificação de toxicidade de substâncias e

produtos comerciais. Ao contrário testes de toxicidade que utilizam organismos mais

complexos como por exemplo mamíferos e peixes se comparados, os que utilizam bactérias

são muito mais rápidos e baratos.

De acordo com Cronin (1997) testes de toxicidade com bactérias tendem a seguir

para uma entre cinco categorias de análise que são, crescimento populacional, energia,

consumo de substrato, respiração e bioluminescência. A popularidade dos ensaios com

bactérias é baseada no fato de que elas são parte integral do ecossistema e os ensaios

realizados em sua maioria são rápidos e simples.

Graças a sensibilidade e relevância ecológica, bioensaios com bioindicadores de

ciclo de vida curtos é de interesse em todas as perspectivas ecológicas, particularmente

quando testam amostras instáveis como efluentes. Algas, bactérias e invertebrados aquáticos

são atrativos porque o aumento de suas gerações é em período curto comparados com

organismos superiores como por exemplo peixes (RADIX, 2000).

Segundo Gutiérrez (2000), é importante a determinação da toxicidade de

contaminantes orgânicos ou inorgânicos em efluentes que são descarregados nas estações de

21

tratamento, pois assim previnem-se danos a microbiota do tratamento. O impacto potencial

dos efluentes é avaliado através de caracterização química e complementado com bioensaios.

Em 24 de abril de 2002, foi publicada a Portaria 017/02 exigindo o uso de bioensaios

para o monitoramento da toxicidade dos efluentes gerados nas indústrias do Estado de Santa

Catarina.

A Portaria aplicada para águas interiores superficiais e subterrâneas baseia-se na Lei

5793/80 da Política Estadual de Meio Ambiente e na Resolução CONAMA 020/86, ambas

exigindo a ausência nas águas de substâncias capazes de causarem efeitos letais ou alterar o

comportamento, reprodução ou fisiologia da vida aquática.

2.3 Testes de Toxicidade Aguda e Crônica

Os testes de toxicidade diferem em sua duração de tempo, sendo agudos ou crônicos.

No efeito agudo, trata-se de uma resposta severa e rápida dos organismos às substâncias, já o

efeito crônico se traduz pela resposta a um estímulo que continua por períodos de tempo mais

extensos, que podem abranger parte ou todo o ciclo de vida dos organismos (CETESB, 1990).

Estudos concluem que o ensaio realizado em 30 minutos (agudo) unificou as análises

de bioluminescência, mas que ao mesmo tempo possuem limitações em efetuar a taxa global

de toxicidade. Há risco de negligenciar real toxicidade analisando-se substâncias que possuam

toxicidade crônica. Os ensaios crônicos utilizando o mesmo organismo teste podem ajudar a

superar estas limitações (FROEHNER et al. 2000).

2.3.1 Vibrio Fischeri como Bioindicador

Vibrio fischeri é uma enterobactéria, Gram negativa, pertencente a família

Vibrionaceae, uma grande família consistindo em muitas espécies, que são caracterizadas pela

cooperação e interação com tecidos de outros animais. Vibrio fischeri tem uma distribuição

global, principalmente em águas temperadas e sub-tropicais onde ocupa uma variedade de

nichos.

A bioluminescência produzida pela bactéria marinha Vibrio fischeri é a base para

vários bioensaios de toxicidade, onde é utilizada para avaliar desde a toxicidade de água

contaminada, sedimentos de solo, água pluvial, entre outros. Em todos esses sistemas a

toxicidade é avaliada medindo até que ponto a substância causa inibição sobre a emissão de

luz pelas bactérias (JENNINGS, 2001).

22

Segundo Froehner et al. (2002), o ensaio de inibição de bioluminescência com

Vibrio fischeri de acordo com a ISO/CD 11348(1994), com um tempo de incubação de 30

minutos, é um bioensaio unificado e mundialmente utilizado para, por exemplo, determinar a

toxicidade de substâncias puras, efluentes e esgotos. Este ensaio não é somente descrito como

rápido, sensível e fácil de executar, mas também como sendo um bioensaio de custo

relativamente baixo, podendo ser recomendado como um valioso método de teste em controle

de poluição de água.

Lappalainen (2000) coloca que o método de inibição da bioluminescência com

Vibrio fischeri é comumente utilizado para estimar a toxicidade de diferentes compostos

químicos e efluentes pela mensuração da redução da luz produzida pelas bactérias em

interação com o composto.

Backhaus et al. (1997) realizaram o teste de toxicidade com Vibrio fischeri, fazendo

uma comparação entre o teste a longo e curto prazo. Este estudo comparou o teste padrão de

30 minutos (agudo) com o ensaio de 24 horas usando o mesmo organismo e os mesmos

parâmetros de teste com diferentes substâncias. Os resultados deste ensaio em longo prazo, 24

horas e a 30 min, mostraram relações de resposta de concentração que permitem a

comparação de toxicidade aguda e crônica no mesmo sistema de teste. Os resultados

indicaram uma incerteza com relação aos testes agudos. A toxicidade de certas substâncias foi

drasticamente menosprezada, enquanto que nos ensaios crônicos houve uma maior

sensibilidade estimada para a toxicidade dessas mesmas substâncias. Sem ensaios de

toxicidade crônica, os efeitos tóxicos de substância de ação específica, por exemplo, não

podem ser reconhecidas e podem ser mal julgados, colocam os autores.

Dos ensaios agudos para os crônicos houve sempre um acréscimo importante nos

valores de toxicidade avaliados através de EC50 para compostos químicos de ação

específicos, sendo que para os alguns compostos de ação não específica houve decréscimos de

toxicidade. Durante as 24 horas, a síntese de proteínas é vital para as células no sentido de

manter as funções fisiológicas normais, incluindo a luminescência, sendo que a toxicidade

teve um acréscimo significativo para os compostos que inibem os processos de síntese

protéica.(BACKHAUS et al.1997)

Backhaus et al. (1997) colocam ainda que a bioluminescência é um complexo

fenômeno regulado na bactéria Vibrio fischeri. Existem vários circuitos de regulação da

quantidade de luz emitida sendo que três principais fatores são conhecidos: toda

luminescência é dependente do status de energia da célula com as reações da luciferase e que

23

são dependentes de ATP e FMNH2; a bioluminescência, como é um processo catalítico

enzimático, é dependente do processo biosintético e em terceiro lugar, a bioluminescência é

regulada pela concentração externa de uma pequena molécula orgânica, o autoindutor.

Froehner et al.(2000) avaliaram a toxicidade com dependência do tempo no ensaio

em longo prazo utilizando Vibrio fischeri. A significância da duração de exposição para a

demonstração de toxicidade foi avaliada em um período de 24 horas, usando placas

“microtiter”. Obtiveram resultados de decréscimo de luminescência em determinados

períodos de tempo seguido de acréscimo além do valor posteriormente. Constataram a

necessidade de fixar pontos finais de análise satisfatórios devido a variação de luminescência.

Gellert (2000) cita que na literatura científica são descritos dois diferentes métodos

de bioensaios crônicos com a bactéria luminescente Vibrio fischeri. Um baseado na inibição

da multiplicação celular (citotoxicidade), e outro baseado na avaliação da inibição da

luminescência, sendo que ambos são potencialmente utilizáveis para detecção de toxicidade

crônica. Seu trabalho foi voltado para avaliação da sensibilidade e significância da bactéria

luminescente no ensaio de toxicidade crônica baseado no crescimento e na luminescência.

A emissão de luz nas bactérias é influenciada pelo fenômeno chamado de “quorum

sensing”, que se traduz em um sinal de concentração celular. Muitas bactérias são capazes de

monitorar suas densidades populacionais utilizando-se para isso de feromônios como, por

exemplo, a N-acilhomoserina lactona. Estes são responsáveis pelo sinal de emissão da

biolumenescência (ZHANG, 2002).

2.3.1.1 Sistemas Bioluminescentes

De acordo com White (2000) bioluminescência é a emissão de luz por organismos

vivos. Dentre os diversos organismos que emitem luz podemos encontrar representantes das

algas (dinoflagelados), fungos, camarões, insetos, peixes e bactérias. Embora alguns vivam no

solo ou em ambientes de água doce, a maioria são organismos marinhos. De fato, a maioria

das espécies que vivem a uma profundidade de aproximadamente 200 – 1000 metros são

bioluminescentes.

A vantagem de sobrevivência de um organismo específico que é bioluminescente sem

dúvida nenhuma reflete no nicho desse organismo. Em alguns casos, bioluminescência é

usada para comunicações intraespecíficas, para caçar ou atrair presas. Com relação a bactéria

luminescente é razoável sugerir que a habilidade para bioluminescência seja um fator para a

24

bactéria ser alojada por um hospedeiro e assim conseguir um benefício no meio ambiente,

inclusive nutrientes. Assim podemos imaginar que a bactéria que normalmente vive no

intestino de peixes pode aumentar a probabilidade de ser ingerida se ela emitir luz num

ambiente escuro de profundezas enquanto coloniza partículas que os peixes poderiam ver com

mais facilidade e então ingeri-las.

Bactérias marinhas luminescentes podem ser isoladas de intestinos de peixes e

invertebrados, em crescimento saprófito em organismos marinhos mortos (peixes, crustáceos),

principalmente em crescimento simbiôntico nos órgãos leves de peixes, camarões em parte do

plâncton. São muitas as vantagens para o organismo que hospeda as bactérias luminescentes.

Algumas espécies de bactérias luminescentes vivem em associação de simbiose nos

órgãos leves de peixes. Órgãos leves nos peixes consistem em tubos ou canais, densamente

preenchidos extracelularmente com bactérias, que conectam com o exterior por poros do qual

a bactéria pode sair nos intestinos ou na água do mar, dependendo da localização do órgão

leve. A maioria dos órgãos que abrigam bactérias, são internos e são derivados de extensões

do trato intestinal. Provavelmente o objetivo desses órgãos internos leves seria no auxílio aos

peixes numa iluminação controlada por eles. A bactéria Vibrio fischeri vive a densidades

muito altas (aproximadamente 10 11 células/mL). Também ocorre em vida livre no oceano,

mas em densidades bem mais baixas (menores de 102 células/ml).

Durante a iluminação controlada, por exemplo, o peixe elimina sua silhueta, que pode

ser produzida através de baixa produção de luz, emitindo luz de seu lado ventral confundindo

assim seus predadores.

Os órgãos leves externos estão na superfície corporal do peixe, por exemplo, bolsas

especiais embaixo dos olhos. Essas bolsas são usadas para visão, para buscar a presa, e

também para comunicação intraespecífica (comunição entre seres de uma mesma espécie).

A luminescência da bactéria é contínua, por isso os peixes evoluíram uma variedade

de mecanismos para controlar o lançamento de luz. Esses mecanismos incluem a utilização de

telas de pigmentos (melanophotos) que bloqueiam, permitem passagem parcial ou refletem a

luz emitida pelas bactérias. Por exemplo, alguns peixes, que possuem bolsas embaixo dos

olhos podem bloquear a luz puxando tecidos sobre a bolsa, como uma pálpebra. Outros peixes

podem rotacionar a bolsa luminescente para baixo de forma que a luz não saia.

Todas as bactérias luminescentes são filogeneticamente agrupadas com

enterobactérias. As que vivem em oceanos pertencem a três gêneros: Vibrio, Photobacterium

e Alteromonas. Como colocado, podem viver de maneira saprófita, em partes de animais

25

mortos, podem existir livremente em partes do plâncton nos oceanos ou podem viver também

nos órgãos de seus respectivos hospedeiros. (Porém, nenhuma bactéria marinha luminescente

que pertence ao grupo V. harveyi é conhecida por colonizar órgãos leves de peixes, embora

essas bactérias vivam no intestino de animais marinhos como também no mar).

As bactérias luminescentes terrestres e dulcícolas são representadas por Xenorhabdus

luminescens e certas espécies de Vibrio cholerae, respectivamente. Vibrio cholerae habita o

intestino humano a pode causar cólera, mas em geral formas luminescentes não são

conhecidas como causadoras de doenças.

2.3.1.2 Bioquímica das Bactérias Luminescentes

Bactérias luminescentes produzem luz quando elas simultaneamente oxidam

riboflavina 5 – fosfato (FMNH2) e um aldeído de cadeia longa (RCHO) como por exemplo,

tetradecanal (C14), na presença de oxigênio. A reação é catalizada por uma enzima do tipo

flavina monooxigenase chamada luciferase.

FMNH2 + RCHO + O2 FMN + H20 + RCOOH + luz A razão porque a luz é emitida é que durante a reação a molécula flavina se torna

eletronicamente excitada e subseqüentemente apresenta fluorescência com o retorno do

elétron ao seu estado inicial. Dos dois átomos de oxigênio em O2, um se torna reduzido em

água, enquanto o outro é incorporado na função aldeídica, o qual transforma-se em ácido

carboxílico.

O aldeído (RCHO) é regenerado do ácido carboxílico (RCOOH) via redução por

NADPH, catalizado por um complexo redutor de acido graxo consistindo de três proteínas

(uma transferase, uma redutase e uma sintetase). O FMNH2 é regenerado pela redução do

FMN por NADH, catalizado por uma NADH-FMN oxiredutase. Advertindo que o caminho

da luciferina pode ser visto como um desvio que conduz da cadeia respiratória do citocromo.

Qualquer alteração no meio, como a presença de um composto prejudicial, vai alterar

ou inibir os processos, conseqüentemente, reduzir a produção de luz pelas bactérias.

2.3.1.3 Sinais Intercelulares, quorum sensing, e os genes Lux

Luciferase

26

Foi descoberto a algum tempo que certas espécies de bactérias luminosas emitem luz

em suspensão celular somente quando a densidade celular alcança um certo valor “quorum”,

de percepção de presença entre organismos. Esta característica está relacionada ao fato de

que, a bactéria não emitirá luz até que haja acumulação no meio extracelular de certa taxa de

concentração de um sinal espécie-espécie para luminescência, chamado autoindutor. Isto

ocorre em populações com concentrações celulares acima de 10 7 / mL.

Os autoindutores identificados até agora são lactona de N-acil-L-homoserina (acil

HSLs), ou seja, homoserina lactona unida a uma cadeia acila lateral, sendo que a estrutura do

qual pode variar com autoindutores específicos.

Para entender como os autoindutores atuam, é preciso se ter conhecimento dos genes

que são responsáveis pela luminescência. Os genes que codificam a proteína luciferase e o

complexo enzimático de redutase de ácidos graxos, são codificados no operon “lux”, o qual

consiste de no mínimo cinco genes que são requeridos para luminescência (luxCDABE).

LuxAB codifica as subunidades α e β, respectivamente da luciferase (um heterodímero), e

lux CDE codifica as três proteínas do complexo enzimático de redutase de ácidos graxos, que

são necessários para a regeneração do aldeído de cadeia longa. (Dependendo da espécie de

bactéria, outros genes podem existir no operon.)

A expressão desses genes é regulada pelos autoindutores. A regulação do operon lux

em duas bactérias luminescentes, V. fischeri e V. harveye, foi estudada em detalhes. De

maneira interessante enquanto ambas as bactérias utilizam (acyl HSLs) para sentir a própria

densidade, o mecanismo do gene lux de regulação em V. fischeri parece ser diferente do que

em V. harveyi.

Segundo (Reverchon,2002) lactonas de N-acil-L-homoserina (acil HSLs), (ver figura

1), são produzidas por uma variedade de bactérias Gram-negativas que as usam como

indicação dos sinais de “quorum” extracelulares.

A luminescência da bactéria somente ocorre nos órgãos transparentes dos peixes

porque ali, o autoindutor produzido pelas bactérias encontra-se em suficiente concentração

para induzir a luminescência. Este autoindutor age como um sinal de densidade populacional.

27

O

O O

O

N

H

Figura 1 – Autoindutor produzido por Vibrio fischeri, (AI-I) é lactona de β-cetocaproil

homoserina.

O autoindutor é sintetizado pelo LuxI (autoindutor sintetase) que é codificado pelo

gene luxI. O autoindutor é uma substância não polar que tem difusão livre pela membrana

celular da bactéria e se acumula no meio extracelular durante o crescimento.

Recentemente verificou-se que Vibrio fischeri produz dois outros autoindutores

adicionais, em menor quantidade. Estes são também derivados de lactona acil homoserina,

que são: AI-2 (lactona N-hexanoil-L-homoserina) e AI-3(lactona N-octanoil-L-homoserina).

2.3.2 Daphnia magna como Bioindicador

Os diferentes procedimentos internacionais padronizados, que incluem dafinídeos

como organismos-teste para avaliação de toxicidade aguda e crônica de substância químicas e

efluentes, recomendam a utilização das espécies Daphnia magna e Daphnia pulex.

A avaliação dos efeitos de substâncias tóxicas em organismos aquáticos geralmente

incluem ensaios de toxicidade crônica bem como ensaios de toxicidade aguda. Dafinídeos,

especialmente Daphnia magna, tem sido utilizados por muitos anos em ensaios padronizados

de toxicidade (OECD,1984) devido a sua grande sensibilidade, fácil manipulação e alta taxa

reprodutiva. (VILLARROEL, 2003)

Hernando (2003) descreve que em se tratando de zooplacton em particular, o gênero

Daphnia, é freqüentemente usado em ensaios ecotoxicológicos devido a este ser um dos

grupos mais sensíveis aos químicos tóxicos, e devido ao fato deste organismo ocupar uma

posição central na cadeia alimentícia de ambientes lênticos.

28

3 MATERIAIS E MÉTODOS

Os ensaios de toxicidade foram realizados no Laboratório de Biotoxicidade da

empresa Umwelt Assessoria Ambiental. Para os procedimentos de ensaio com Vibrio fischeri

teve-se a disposição o luminímetro Lumistox 200 (Dr. Lange GmbH), bem como termobloco,

pipetas automáticas e demais equipamentos necessários ao ensaio.

Para o ensaio com Daphnia magna, o laboratório conta com cultivo permanente

deste bioindicador em condições controladas, com estufas, com e sem fotoperíodo, para

cultivo e ensaios de toxicidade.

3.1 Procedimento de Cultivo da Bactéria Vibrio fischeri.

A cepa original de bactéria é proveniente da empresa alemã Dr. Lange GmbH,

Duesseldorf, sendo que a linhagem é mantida em cultivo no laboratório, segundo técnicas

padronizadas de cultivo e manutenção pela norma ISO 11348-1(1998).

3.1.1 Produção de Cepas

Os principais equipamentos utilizados para o cultivo foram a incubadora com

agitação (shaker), onde as bactérias cresceram em meio de cultivo sob agitação para

oxigenação do mesmo, e centrífuga refrigerada, que foi utilizada para a separação das células

de seu meio de crescimento, além dos componentes necessários ao meio de cultivo. Entre os

compostos utilizados para o meio de cultivo líquido estão:

Cloreto de Sódio (NaCl) 30 g

Dihidrogenofosfato de Sódio monohidratado (NaH2PO4 . H2O) 6,10 g

Hidrogenofosfato de Dipotássio trihidratado (K2HPO4 . 3H2O) 2,75 g

Sulfato de Magnésio heptahidratado (MgSO4 . 7H2O) 0,204 g

Di-Amônio Hidrogenofosfato ((NH4)2HPO4) 0,50 g

Glicerol 3 mL

Caso-peptona 5 g

Extrato de levedura 0,50 g

Estes compostos foram diluídos em água destilada e o pH ajustado para (7,0 + 0,2)

com solução diluída de HCl ou NaOH e o volume elevado a um litro. Após a solução foi

transferida em porções de 50 mL em frascos Erlenmeyer 250 mL de volume tampando a

abertura com chumaço de gaze e proteção de papel alumínio. O meio de crescimento foi

esterilizado em autoclave à 121 oC, durante 20 minutos.

29

Para meio de cultivo sólido adicionou-se 12 g de ágar-ágar por litro de meio de cultivo

líquido.A dissolução foi realizada com auxílio de calor sobre chapa. O meio de cultivo sólido

também foi esterilizado em autoclave a 121oC, durante 15 minutos. Após esterilização o meio

foi transferido na porção de 15 ±3 mL para placas de Petri estéreis de 40 mm de diâmetro.

O meio de proteção é o composto que é adicionado às bactérias após a centrifugação,

que auxilia na manutenção das mesmas durante o período de congelamento. Para preparação

deste meio de proteção foram utilizados:

D-glucose monihidratada (C6H12O6H2O) 33 g

Cloreto de Sódio (NaCL) 2 g

L-histidina (C6H9N3O2) 1 g

Soro de Albumina Bovina (BSA) 0,25 g

Estes reagentes foram dissolvidos a uma temperatura de 37 º C num volume de 25 mL

de água destilada. O pH foi ajustado para 7,0 + 0,2. Após a total dissolução, o volume foi

ajustado para 50 ml.

O procedimento de cultivo propriamente dito foi realizado transferindo-se uma porção

de bactérias do tubo Epperndorf, já condicionado, com auxílio de uma alça de platina, fazendo

estrias sobre o meio de cultivo sólido, em condições estéreis. Após este procedimento, as

placas foram colocadas em estufa a 20 º C, para incubação, por 2 a 5 dias. As colônias em

crescimento foram identificadas através de observações visuais no escuro.

As colônias de maior luminescência, foram transferidas em condições estéreis para um

frasco Erlenmeyer, contendo meio líquido de cultivo, aproximadamente 150 ml. A abertura

foi tampada com chumaço de gaze, sem proteção de alumínio, para dar condições de entrada

de oxigênio. O meio com as bactérias foi mantido em estufa a 20 º C, estático, por um período

de 24 horas.

Após esse período, uma alíquota de 5 ml foi transferida, em condições estéreis, para os

outros frascos Erlenmeyer, contendo meio líquido. Os frascos foram mantidos em agitação a

156 rpm, numa temperatura ambiente entre 15 e 20 º C no máximo.O tempo de agitação foi de

20 horas +1 hora, conforme norma ISO 11348-1(1998).

Finalizado o tempo de agitação, o meio contendo as bactérias foi centrifugado em

centrífuga refrigerada em uma temperatura de 4 º C + 2 º C, por um tempo de 15 a 20 min em

uma rotação de 3000 rpm. O volume total centrifugado foi anotado para o cálculo da

quantidade de meio de proteção, que foi adicionado posteriormente na solução concentrada de

bactérias.

30

As células decantadas foram ressuspendidas em salina 2% gelada, num volume

máximo final de 5 a 10 ml, por 50 ml de meio de cultura, a uma concentração

aproximadamente 10 vezes superior à suspensão mãe.

O meio protetor foi adicionado lentamente às células em agitação e em condições de

baixa temperatura, em um volume equivalente ao inicial centrifugado, em uma proporção de

1/100 ml de meio. A mistura de meio e células ficou em agitação para conseguir uma mistura

homogênea e após, as bactérias foram distribuídas em volumes de 0,1 ml em cada tubo

Eppendorf, que foram congelados e posteriormente utilizados para os ensaios.

3.2 Procedimento Geral de Ensaio com a Bactéria Vibrio fischeri

Todos os materiais utilizados no procedimento de análise de laboratório, devem

estar livres de substâncias tóxicas, que possam vir a afetar os resultados, tendo reação com

organismos ou influenciando nas combinações químicas. Para os ensaios de toxicidade com

Vibrio fischeri, o parâmetro utilizado para verificação de toxicidade é a inibição da

luminescência emitida pelas bactérias quando em contato com alguma substância.

As bactérias são cultivadas em meio líquido e posteriormente concentradas em tubos

Eppendorf e congeladas, a uma temperatura máxima de – 30 C, conforme descrito no item

3.1.1.

Para reativar seu metabolismo e emissão de luz, após o tempo de congelamento, as

bactérias são colocadas em um meio de reconstituição, em um volume de 12 ml, para cada

100 µml de bactérias.

Permanecem, primeiramente, de 15 a 20 minutos no próprio Eppendorf onde é

adicionado 0,5 ml do meio de reconstituição. Passados este tempo, a alíquota de 0,6 ml é

colocada no restante de meio de reconstituição, onde permanece por mais 20 minutos,

aproximadamente. Após este período, as bactérias, em 12 ml de meio, são separadas em

alíquotas de 0,5 ml, em cada um dos 20 tubos de leitura, onde permanecem por mais um

período de tempo para aclimatização. Todo este procedimento é realizado em termobloco com

temperatura estabilizada a 15ºC.

Após o período de aclimatização nos tubos, a luminescência inicial é mensurada e,

posteriormente, a substância teste é adicionada, em uma alíquota de 0,5 ml, ficando o sistema

com 50% da amostra e 50% com bactérias em seu meio. Este método é denominado G2, pois

a substância pura é diluída no sistema sendo que o seu fator de diluição correspondente é 2.

31

Após o período determinado para cada teste (agudo ou crônico) a luminescência é

novamente mensurada tendo assim uma diferença entre luminescência inicial e final, e entre

controles e amostras diluídas.

3.2.1 Ensaio Agudo

O ensaio agudo se caracteriza por demonstrar respostas rápidas do organismo perante

a amostra testada. Ensaios agudos com a bactéria Vibrio fischeri podem ser avaliados com os

tempos de 5min, 15 min ou 30 min após a exposição do organismo à amostra.

Nos ensaios agudos neste trabalho, a leitura foi realizada em tempo 30 min, após a

exposição, sendo a comparação de luminescência realizada entre a luminescência inicial e a

final.

O meio de reconstituição, no ensaio agudo, tem sua formulação orientada para o

manutenção da luminescência, nesse período de tempo. O meio de reconstituição, para o

ensaio agudo, é composto por:

D (+) glicose monohidratada (C6H12O6H2O) 8,0 g

Cloreto de sódio( NaCl) 20,0g

Cloreto de magnésio hexahidratado (MgCl2 6H2O) 2,35g

Cloreto de potássio (KCl) 0,30g

HEPES (Ácido N-(2-hidroxietil) Pipezarina –N(2 Etano Sulfônico) 11,90g

Essas substâncias foram dissolvidas em água destilada, sob agitação por

aproximadamente 30 minutos e o pH ajustado para 7,0 + 0,2 com hidróxido de sódio ou

ácido clorídrico. O volume foi completado para 1 litro e distribuido em porções de 12 ml em

frascos com tampa segura que podem ser estocados até um período de três meses.

3.2.2 Ensaio Crônico

O ensaio crônico, por sua vez, se caracteriza por demonstrar respostas num período de

tempo maior de exposição do organismo perante a amostra testada, período esse que abrange

parte ou todo o ciclo de vida do organismo. No caso da bactéria Vibrio fischeri em

crescimento, são aproximadamente seis gerações que estarão em exposição aos efeitos da

amostra.

Neste ensaio, as leituras foram realizadas antes da adição da amostra, 30 min e 24

horas. A comparação de diferenças de luminescência foi realizada, entre a luminescência do

32

sistema em controle após 30 min e 24 horas, comparando a luminescência das diluições da

amostra.

O meio de reconstituição, para o ensaio crônico, ao contrário do meio para o ensaio

agudo, tem um diferencial que visa a manutenção celular e a condição de sobrevivência e

reprodução dentro do sistema, durante as 24 horas do ensaio. Enfatizando também que se faz

necessária a presença neste meio de autoindutores específicos, que servem de indicativo de

densidade celular e mantém a comunicação intraespecífica entre as bactérias garantindo a

manutenção da luminescência.

O meio desenvolvido por Harmel (2003) tem a seguinte composição (por litro):

Glicerol C3H8O3 6 ml

Cloreto de magnésio hexahidratado (MgCl2 6H2O) 2,0g

Cloreto de potássio (KCl) 0,30g

HEPES Ácido N-(2-hidroxietil) Pipezarina –N(2 Etano Sulfônico) 11,90g

Solução estoque de autoindutores 5 ml

Meio SSWC (2 vezes diluído) qsp 1000 ml com água destilada

Estes compostos foram agrupados num volume final de 1000 ml e este volume foi

separado em porções de 12 ml, que é quantidade necessária para um teste de toxicidade.

3.2.3 Séries de diluições – Método DIN e Geométrico

Para os ensaios foram utilizados os métodos DIN e geométrico de séries de

diluições.

O método geométrico se caracteriza pela simples diluição, em escala de partes

iguais, onde obtém-se uma série de diluições com uma razão de diluição 2.

Já o método DIN se caracteriza por obter-se um espaçamento menor entre as

diluições, sendo que a razão de diluição conseguida com este método é de 1,5. O método DIN

foi utilizado, principalmente, nos ensaios de toxicidade crônica com concentrações sub-letais.

3.2.4 Método G1

No método geométrico (G2), realizado para a maioria das amostras, a maior

concentração da substância testada é de 50% durante o ensaio, pois, uma parte da amostra é

33

adicionada a mesma quantidade de solução contendo bactérias, sendo o menor fator de

diluição correspondente a 2.

Para se conseguir maiores concentrações do agente teste no ensaio, a reativação das

bactérias é feita num volume menor de meio de reconstituição, aumentando a concentração de

bactérias em um volume menor de meio. As bactérias são então reativadas em um volume

inicial de 5 ml de meio de reconstituição e permaneceram no mesmo pelo tempo de 20

minutos. Desse meio concentrado são transferidas alíquotas de 0,2 ml para os primeiros

quatro tubos de leitura, permanecendo 20 minutos no termobloco a fim de estabilizar a

temperatura, onde nesses são adicionados 0,8 ml de amostra, sendo um volume de controle e

outro puro.

Consegue-se, desse modo, um tubo de leitura com 80 % de amostra, que por

normatização, é considerado como 100%. Após este procedimento o restante do meio de

reconstituição é adicionado ao meio, onde procede-se o método G2 padrão.

Este método é recomendado para amostras onde é necessária a avaliação da mesma em

seu estado puro, sem diluições, como no caso de amostras de água superficial ou amostras de

baixa toxicidade.

3.2.5 Avaliação da Biomassa e Agitação do teste no Ensaio Crônico

No decorrer do trabalho realizou-se a avaliação da biomassa nos tubos de leitura do

ensaio crônico, com leitura da absorção da suspensão, Abs a 585 nm, utilizando um

espectofotomêtro CADAS 200 UV/vis (Dr. Lange).

A agitação dos tubos no ensaio crônico foi realizada, deixando-se os tubos ainda

dentro do termobloco, para não haver a variação de temperatura, colocando o mesmo sobre o

agitador shaker durante 30 segundos a 156 rpm e a leitura realizada imediatamente após a

agitação.

3.3 Manutenção e cultivo do microcrustáceo Daphnia magna

Várias técnicas podem ser utilizadas no cultivo de Daphnia sp, desde que sejam

mantidos os padrões de qualidade, sanidade e nutrição dos organismos exigidos na norma

34

NBR 12713 que está em fase de normatização institucional, bem como das normas

internacionais, dentre elas a norma ISO 6341, norma DIN 38412-L30

3.3.1 Manutenção das culturas para ensaios de Toxicidade Aguda

Os organismos foram mantidos em lotes de até 25 adutos/L, sendo colocados em

recipientes de vidro de 2 000 mL, com luminosidade difusa (lâmpadas fluorescentes), com

fotoperíodo de 16 horas de luz e temperatura de 18 °C a 22 °C.

A água de cultivo foi trocada duas vezes por semana evitando diferenças de

temperatura maiores que 2 °C. No manuseio dos organismos adultos foram utilizadas pipetas

de diâmetro adequado com ponta arredondada.

Para garantir a disponibilidade contínua de organismos-teste, para o ensaio, foram

mantidos lotes de diferentes faixas etárias.

Condições ambientais desfavoráveis, incluindo superpopulação e falta de alimento,

podem influenciar a reprodução de Daphnia magna. Nestas condições, podem surgir machos

na cultura, resultando na geração de efípios por reprodução sexuada. Se dois ou mais efípios

surgirem em um lote, os jovens produzidos neste lote não podem ser utilizados no ensaio e o

procedimento de cultivo precisa ser reavaliado.

As águas de cultivo e de diluição utilizadas, foram com dureza total de 175 mg/L a

225 mg/L de CaCO3 e pH 7,5 ± 0,5.

3.3.1.1 Reagentes e Soluções Utilizadas

Para o preparo da água reconstituída que servirá para o cultivo e a diluição da amostra

no momento dos ensaios foram preparadas soluções estoques e armazenadas em recipientes

de vidros ao abrigo de luz. Estas soluções posteriormente combinadas formarão a água de

cultivo e diluição. No quadro 3.1 são apresentados os reagentes para a formação das soluções

estoques.

Solução Reagente Quantidade (mg/L)

1 CaCl2.2H2O 73 500

2 MgSO4.7H2O 123 300

3 KCl 5 800

35

4 NaHCO3 64 800

MnCl2.4H2O 7 210

LiCl 6 120

RbCl 1 420

SrCl2.6H2O 3 040

CuCL2.2H2O 335

ZnCl2 260

5

CoCl2.6H2O 200

NaNO3 548

H3BO3 5 719

NaBr 32

Na2MoO4.2H2O 126

NH4VO3 1,15

KI 6,5

6

NaSe2O3 4,38

7 Na2SiO3 21 465

Na2EDTA.7H2O 500 8

FeSO4.7H2O 199,1

KH2PO4 286 9

K2HPO4 368

Hidrocloreto de Tiamina 750,0

Cianocabalamina

(Vitamina B12) 10,0 10

D (+) Biotina 7,5

Quadro 3.1 – Soluções estoque para preparo da água de cultivo (meio M-4)

Algumas características foram observadas durante o processo, dependendo da solução

a ser preparada. Na solução número 7, os reagentes foram dissolvidos em agitação até haver o

total clareamento da mesma. A solução número 8 foi preparada separadamente, 500 ml de

cada composto. Para finalizar o preparo, as duas soluções foram misturadas e autoclavadas

imediatamente a 121ºC por 15 minutos.

A solução vitamínica, número 10, depois de preparada foi porcionada em volume

adequado para uso dependendo de cada laboratório, e congelada para sua manutenção.

Para o preparo de 1 litro de água de cultivo, foram utilizados os volumes na ordem

descrita no Quadro 3.2.

36

Solução 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Volume (mL) 3,2 0,8 0,8 0,8 0,1 0,5 0,2 5,0 0,5 0,1

Quadro 3.2 - Volume das soluções estoque necessárias para o preparo de 1000 ml de água de

cultivo.

A água de diluição é composta das soluções 1 a 4 nas mesmas proporções da água de

cultivo. Antes de utilizar a água os teores de oxigênio dissolvido, pH e dureza total foram

medidos. Caso o pH esteja fora da faixa de 7,0 a 8,0 o mesmo foi ajustado com soluções de

ácido clorídrico (HCl) ou hidróxido de sódio (NaOH).

A água onde as soluções serão adicionadas foi mantida em aeração antes do seu

preparo para atingir o teor de saturação de oxigênio dissolvido. Após a preparação das águas

de cultivo e diluição, elas não devem mais ser aeradas.

3.3.2 Manutenção das Culturas para ensaios de Toxicidade Crônica

Os procedimentos para realização do ensaio crônico de toxicidade com o

microcrustáceo Daphnia magna são baseados na norma internacional OECD TG 211.

Os componentes utilizados para o cultivo e ensaios crônicos foram basicamente os

mesmos utilizados no ensaio agudo, diferenciando-se em algumas concentrações de

determinados compostos.

3.3.2.1 Reagentes e Soluções Utilizados

Primeiramente, os elementos traços foram preparados separadamente em diluição com

água destilada, e destas soluções estoque de elementos traço, uma segunda solução combinada

foi preparada seguindo as proporções descritas no Quadro 3.3.

Reagente Quantidade (mg/L) Solução estoque II (ml/L)

H3BO3 57 190 1,0

MnCl2.4H2O 7 210 1,0

LiCl 6 120 1,0

37

RbCl 1 420 1,0

SrCl2.6H2O 3 040 1,0

NaBr 320 1,0

Na2MoO4.2H2O 1 260 1,0

CuCl2.2H2O* 335 1,0

ZnCl2 260 1,0

CoCl2.6H20 200 1,0

KI 65 1,0

NaSe2O3 43,8 1,0

NH4VO3 11,5 1,0

FeSO4.7H2O 1 991 -

Na2EDTA.7H2O 5 000 -

Fe-EDTA 20

Quadro 3.3 - Elementos traços e suas respectivas concentrações para preparo da solução

estoque.

Para preparar a solução combinada de elementos, solução estoque II, adicionou-se a

quantia determinada na tabela 3.4 das soluções de elementos traços em água destilada. A

preparação do meio M4 foi realizada utilizando-se 50 ml para cada litro da solução estoque II,

macro-nutrientes e vitaminas. Os macro-nutrientes precisam ser preparados em soluções

isoladas e juntamente da solução vitamínica com a estoque II formarão o meio M4 seguindo a

descrição do Quadro 3.4.

Reagente Quantidade (mg/L) M4* ml/L

CaCl2 . 2H2O 293 800 1,0

MgSO4 . 7H2O 246 600 0,5

KCl 58 000 0,1

NaHCO3 64 800 1,0

Na2SiO3 50 000 0,2

NaNO3 2 740 0,1

KH2PO4 1 430 0,1

K2HPO4 1 840 0,1

Solução Vitamínica - 0,1

Hidrocloreto de Tiamina 750,0 mg -

Cianocabalamina (Vitamina B12) 10,0 mg -

38

D (+) Biotina 7,5 mg -

Quadro 3.4 – Quantidade de macro-nutrientes para a formação das soluções isoladas e sua

quantidade para a posterior formação do Meio M4.

A solução vitamínica foi preparada com a adição das 3 vitaminas, porcionada na

quantidade de 0,1 ml para cada litro de meio M4 e congelada até o momento da utilização.

A água onde as soluções foram adicionadas, como no procedimento de cultivo do

ensaio agudo, foi aerada para garantir saturação de oxigênio. Os parâmetros como dureza,

condutividade e pH foram medidos e se necessário ajustados.

3.3.3 Cultivo de Scenedesmus subspicatus

Vários tipos de algas verdes podem ser utilizados para alimentação de Daphnia

magna, como por exemplo, Scenedesmus subspicatus. As algas podem ser cultivadas por

qualquer método que seja adequado ao seu crescimento, desde que tomados os cuidados

necessários para evitar a contaminação por bactérias e fungos.

Recomenda-se o fornecimento diário de alimento às Daphnias, evitando deixar os

organismos por mais de 2 dias consecutivos sem alimentação. A quantidade a ser fornecida

deve ser de aproximadamente 1 mL de suspensão algácea com densidade em torno de 106

células/mL por organismo adulto.

Para o cultivo das algas, foi necessária a preparação de soluções estoque que, foram

utilizados para a formação do meio de cultivo de algas, chamados de meio CHU como

descrito no Quadro 3.5.

Solução

Reagente Quantidade (mg/L)

1 NaNO3 25 000

2 CaCl2.2H2O 2 500

3 MgSO4.7H2O 7 500

4 K2HPO4 7 500

5 KH2PO4 17 500

6 NaCl 2 500

C10H14N2Na2O8.2H2O 50 000 7

KOH 31 000

39

8 FeSO4.7H2O 4 980

9 H3BO3 11 420

ZnSO4.7H2O 8,82

MnCl2.4H2O 1,44

MoO3 0,71

CuSO4.5H2O 1,57

10

Co(NO3).6H2O 0,49

Quadro 3.5 – Elementos para o preparo das soluções estoque para o meio de cultura (meio

CHU)

Estes elementos foram dissolvidos em água destilada e armazenados ao abrigo de luz.

A partir das soluções-estoque preparou-se o meio de cultura, para manutenção da cultura de

crescimento das algas, que foram servidas frescas diariamente aos organismos.

Para se preparar o meio de cultura líquido (denominado meio CHU), as soluções

previamente preparadas foram adicionadas nas seguintes proporções:

10 mL/litro das soluções 1 a 6

1 mL/litro das soluções 7 a 10

As soluções foram adicionadas uma a uma, misturando-as bem e distribuídas em

frascos tipo lavador de gases de volume de 500 mL, preenchendo apenas ¾ destes. Foram

autoclavadas durante 15 minutos a uma temperatura de 121 oC. O meio pode ser conservado

em refrigerador por no máximo 15 dias. O inoculo foi realizado em meio asséptico e o

volume inoculado permitindo o alcance da concentração de aproximadamente 1 x 107

células/mL em um período de 4 dias a 7 dias.

Para o crescimento algáceo necessário, a relação entre superfície e volume de líquido

no frasco de cultivo não deve ultrapassar os ¾ do seu volume. Os frascos foram mantidos a

uma temperatura de 20 °C a 30 °C, sob iluminação constante e fortemente aerados.

40

3.4 Descrição Geral do Ensaio com Daphnia magna

Neste trabalho os ensaios com Daphnia magna foram realizados com o principal

objetivo de comparação de métodos.

3.4.1 Ensaio Agudo

O parâmetro utilizado para o ensaio agudo com Daphnia magna é a movimentação ou

morte dos filhotes após o contato de 48 horas com a amostra seguindo orientações da NBR

12713.

Um animal deve ser registrado como imóvel, sendo positivo no bioensaio, quando ele

está totalmente imóvel, quando não está apto a nadar, ou quando não há observação de

movimento dos apêndices dentro de 15 segundos após uma leve agitação do recipiente de

ensaio.

Utilizando-se informações conhecidas da amostra, foram preparadas séries de

diluições intermediárias, de razão de diluição 2. Para cada diluição e controle foram

adicionados, no mínimo, 20 organismos distribuídos em pelo menos duas replicatas. Frascos

Becker de 50 ml foram utilizados, e o volume do meio utilizado foi de 40 ml. Após 48 h, foi

realizada a leitura do ensaio, observando e registrando a imobilidade dos organismos em cada

recipiente-teste.

Ao final do ensaio, a porcentagem de imobilidade para cada concentração em relação

ao número total de organismos utilizados no ensaio foi calculada.


No ensaio de toxicidade crônica com Daphnia magna, o parâmetro observado

corresponde a taxa reprodutiva das matrizes.

Os procedimentos de cultivo e análise foram seguidos conforme norma OECD TG

211(1998), ensaio de reprodução de Daphnia magna.

Foram feitas séries de diluições, onde o animal foi alocado individualmente em um

béquer, com volume entre 50-100 ml de amostra adicionado ao meio, sendo que foram

utilizados 10 animais para cada concentração, e também, para o controle.

41

Cada ensaio crônico de toxicidade teve duração de 21 dias. Foram utilizados filhotes

entre 6 a 24 horas, que foram mantidos em observação e alimentação diárias. O ensaio

realizado foi semi-estático sendo necessárias trocas periódicas do meio líquido, no mínimo

duas vezes por semana. Os filhotes produzidos por cada matriz foram retirados e registrados

em tabelas, diariamente no período de 21 dias, duração do teste. (Apêndice F)

A alimentação foi realizada com algas frescas (Scenedesmus subspicatus) no mesmo

padrão de cultura dos organismos. O ensaio foi mantido a uma temperatura de 20 °C + 2°C,

num fotoperíodo de 16 horas luz. Os recipientes do ensaio não podem ser aerados durante o

período do teste. O objetivo do teste é a determinação do efeito da substância no número total

de filhotes vivos por matriz viva no final do teste.

3.5 Amostras Utilizadas

Para as análises de padronização optou-se por utilizar substâncias de referência que

são utilizadas para teste de viabilidade no ensaio agudo. Utilizou-se o Cromo VI, na forma de

Dicromato de Potássio e 3,5 Diclorofenol. Também foram utilizadas amostras de água

superficial, como modelo de matriz mais complexa. Para as amostras de água superficial uma

bateria de análises físico-químicas foram realizadas.

3.5.1 Cromo VI na forma de Dicromato de Potássio K2Cr2O7

O Dicromato de potássio tem aparência de cristais laranja avermelhados brilhantes,

ponto de fusão a 398ºC, ponto de ebulição a 500ºC e densidade (g cm-3) de 2.676.

No ambiente são três os números de oxidação do metal: cromo(0), cromo(III) e

cromo(VI). Cromo(III) tem ocorrência natural no meio ambiente, enquanto cromo(VI) e

cromo(0) são geralmente produzidos por processos industriais. Os compostos hexavalentes de

Cromo são, geralmente, mais tóxicos do que os trivalentes, podendo chegar a ter efeito letal,

se absorvido através da pele, ingerido ou inalado.

42

3.5.2 3,5 Diclorofenol

Os clorofenóis representam uma classe de agentes tóxicos, freqüentemente

empregados em processos industriais, como a produção de biocidas.

Os compostos fenólicos assumem posição de destaque na lista de poluentes, não

somente pela toxicidade, mas pela alta freqüência com que aparecem nas águas residuárias,

uma vez que cerca de 25 diferentes categorias de indústrias manipulam ou produzem

compostos a base de fenóis.

3.5.3 Amostras Compostas de Água Superficial

Para verificar o comportamento dos ensaios com matrizes complexas, foram

utilizadas três amostras de água superficial coletadas no período de três dias, sendo que estas

amostras foram compostas, ou seja, no período de 24 horas houve coletas seqüenciais no local

através de um coletor automático (Cole Parmer).

As amostras foram coletadas no Rio Piçarras, na cidade de Piçarras. Por ser uma

cidade litorânea, o rio onde as amostras foram coletadas sofre influências da maré, sendo o

ambiente com características salobras. Tendo como característica natural, um valor mais

elevado de cloretos em sua composição, foram necessárias adaptações do bioindicador

Daphnia magna para realização dos ensaios, o que não foi necessário para Vibrio fischeri.

As adaptações para o bioindicador Daphnia magna foram realizadas comparando-se valores

de condutividade entre o meio de cultivo e as amostras, realizando-se a aproximação dos

valores para o meio de cultivo com adição de água marinha para igualar a condutividade.

Uma bateria de análises físico-químicas foi aplicada às amostras, como pode ser

observado nos laudos apresentados em anexo.

43

3.6 Procedimentos de Análise dos dados

3.6.1 Ensaio Agudo com Vibrio fischeri

O ensaio com a bactéria luminescente Vibrio fischeri é baseado na diferença de

luminosidade que a bactéria emite no início do ensaio e após o tempo de contato com a

amostra. Para o ensaio agudo o método de análise dos dados do efeito inibitório sobre as

bactérias luminescentes segue a norma ISO 11348(1998).

Os valores de medição inicial e final de luminescência são sujeitos a uma série de

cálculos para apurar os valores de inibição, aplicando-se critérios estatísticos para a validação

dos resultados.

Fator de Correção: Fkt. Este valor serve para corrigir os valores iniciais de emissão de luz (Io)

de todas as amostras testadas, antes que elas sejam utilizadas como valores de referência para

a determinação da intensidade luminosa, levando em conta o possível decréscimo natural da

luminescência.

(1)

Onde:

Fkt é o fator de correção da emissão de luz para os tempos de contato de 15 ou 30

minutos;

Ikt é a intensidade luminosa da suspensão controle após o tempo de contato de 15 ou

30 minutos em unidades de luminescência relativa;

Io é a intensidade luminosa da suspensão controle imediatamente antes da adição do

agente-teste, em unidades de luminescência relativa;

Os valores de Fkt são calculados para as suspensões controle. Após este procedimento,

o Ict (valor corrigido de Io), é calculado para os valores de luminescência inicial.

(2)

Onde: Ict é o valor corrigido do Io para as suspensões teste imediatamente após a adição do

agente-teste;

é média de Fkt

IoIktFkt =

FktIoIct .=

Fkt

44

Io semelhante à equação 01;

Estes valores permitem o cálculo do efeito inibitório do agente-teste.

(3)

Onde: Ht é o efeito inibitório de um agente-teste após o tempo de contato determinado em

percentagem;

Ict semelhante a equação 02;

Iti é a intensidade luminosa da suspensão contendo bactérias e agente-teste após o

tempo de contato determinado, em unidades de luminescência relativa;

A média do efeito inibitório é calculada para cada nível de diluição em porcentagem.

Realizado este cálculo, deve ser calculado o desvio de cada determinação paralela

através de sua respectiva média para as réplicas, e em % para os controles.

O valor de FdB (fator de diluição para o bioindicador fotobactéria), é a primeira de

uma série de diluições, em que se observou menos de 20% de inibição da luminescência,

comparada ao controle.

Para determinar a relação concentração efeito, o valor de gama para cada diluição é

calculado.

(4)

Onde: é o valor de gama do agente-teste após o período de contato de 15 ou 30 minutos;

é a média de Ht conforme equação 03.

Quando uma determinada concentração apresentar 0% ou 100% de inibição da

luminescência, o valor de gama não pode ser calculado. Portanto, normalmente apenas os

valores de entre 10 e 90% são usados no cálculo da relação concentração efeito.

Para determinação dos valores de concentração efetiva deve ser calculado a relação

concentração efeito para cada tempo de exposição utilizando a análise de regressão linear

padrão. A relação concentração efeito em um determinado tempo de exposição pode ser

descrita pela seguinte equação linear:

100xIct

ItiIctHt −=

HtHtTt−

=100

TtHt

Ht

45

(5)

Onde: ct é a porção do agente-teste original na suspensão teste em porcentagem;

Tt conforme equação 04;

b é o valor da inclinação da curva descrita com o eixo x;

log a é o valor da interseção da curva descrita com o eixo y;

Através do teste estatístico dos mínimos quadrados, são calculados os valores de

concentração efetiva (CE20 e CE50), com seus respectivos limites de confiança nos quais:

ct = CE20,t a Tt = 0,25;

ct = CE50,t a Tt = 1,00;

Se a amplitude de pares de valores não puder ser ajustada a curva, os valores de

concentração efetiva podem ser estimados graficamente, a partir da curva traçada

graficamente usando sistema de coordenadas dupla logarítmica.

3.6.1.1 Critérios de Validação

Conforme norma ISO 11348(1998), o teste será válido se:

• O valor de Fkt para 30 minutos de tempo de exposição situar-se entre 0,6 e 1,8;

• As determinações paralelas não desviarem da média em mais 3 pontos

percentuais;

Isto vale para o controle, bem como para as suspensões teste, usadas para

determinação do FdB ou da CE20 e CE50, respectivamente.

• As três substâncias referência abaixo devem produzir 20% a 80% de inibição

após um contato de 30 minutos nas concentrações citadas:

6 mg/L de 3,5 Diclorofenol ( C6H4OCl2)

25 mg/L de Zn+, como Sulfato de Zinco heptahidratado (ZnSO4 7 H2O)

4 mg/L de Cr VI na forma de Dicromato de Potássio ( K2Cr2O7)

Este critério deve ser verificado para cada lote de bactérias produzidas.

aTtbct lglglg +=

46

3.6.2 Ensaio Crônico com Vibrio fischeri

O ensaio de toxicidade crônica utilizando a bactéria luminescente Vibrio fischeri não

possue padronização através de órgãos de normatização internacionais ou nacionais.

As pesquisas relacionadas ao assunto utilizam o critério de avaliação deste ensaio

baseado na análise dos dados do ensaio agudo, sendo os procedimentos semelhantes

divergindo entre pesquisadores e metodologias para o ensaio crônico.

A avaliação dos resultados para o ensaio crônico neste trabalho foi baseada nas

publicações de T. Backhaus, e L.H.Grimme, pesquisadores nesta área, que utilizaram

pequenas modificações em relação aos métodos determinados pela norma para o ensaio

agudo, sendo considerado neste trabalho esta parte também como resultados de pesquisa.

Após o período de exposição de 24 horas a inibição da luminescência foi calculada

por:

(6)

Onde: Ht é o efeito inibitório de um agente-teste após o tempo de contato determinado, em

percentagem;

Iti é o valor da intensidade luminosa após o tempo de incubação i, no caso 24 horas;

Cti é a média aritmética dos valores de luminescência de todos os tubos controles após

o tempo de incubação i;

A diferença significante nesta avaliação é o confronto direto dos resultados dos valores

de intensidade luminosa após as 24 horas nos tubos contendo o agente-teste com os valores de

intensidade luminosa do controle após o mesmo tempo de incubação, não realizando o cálculo

de fator de correção de luminescência como no ensaio agudo.

A luminescência inicial neste caso é necessária para comprovar a viabilidade das

bactérias no início do ensaio, sendo que o valor controle considerado é aquele cujo tempo de

incubação foi igual ao das amostras.

Considerando estes valores, estamos abrangendo a possibilidade de manutenção da

cultura, seu crescimento ou declínio natural no período de 24 horas do ensaio.

)100(100CtiItixHt −=

47

3.6.3 Ensaio Agudo com Daphnia magna

Segundo a norma NBR 12713, para Daphnia magna, no ensaio agudo, o resultado é

direto ao percentual de inibição da movimentação. Ao final do ensaio é calculada a

porcentagem de imobilidade para cada concentração em relação ao número total de

organismos utilizados no ensaio. Determina-se o fator de diluição pela relação direta na

solução mais diluída onde for observada uma imobilidade superior ou igual 10%,

3.6.4 Ensaio Crônico com Daphnia magna

Conforme a norma OECD TG 211, o número total de filhotes vivos por matriz é

registro necessário para cada béquer do ensaio. A média de produção por replicata para cada

concentração através do número de filhotes por béquer deve ser calculada.

Esta média, então, deve ser comparada com a média dos controles utilizando algum

método estatístico de comparação para verificação da homogeneidade, no caso o método

utilizado foi análise ANOVA para a análise de variação. O teste de comparações múltiplas de

Bonferroni foi utilizado para avaliação da variação entre controle e concentrações, auxiliado

pelo programa estatístico Statgraph (MS-DOS). A última diferença significante deve ser

calculada e informada como representativa da mais baixa concentração de efeito observada, e

também a concentração onde nenhum efeito significativo foi observado.

Para o teste ser considerado válido, os seguintes critérios devem ser seguidos:

• Os organismos devem ser expostos ao teste durante 21 dias;

• A mortalidade dos adultos no controle deve ser menor que 20% no final do

teste;

• A presença de efípios no controle deve ser menor que 20% no final do teste;

• O número médio de filhotes por animal no controle maior que 60.

48

4 RESULTADOS E DISCUSSÕES

Serão apresentados e discutidos a seguir os resultados dos ensaios realizados com os

bioindicadores Vibrio fischeri e Daphnia magna perante as substâncias referências utilizadas,

cromo VI , 3,5 diclorofenol e amostras de água superficial. O uso de um novo meio de

reconstituição é apresentado e os resultados obtidos serão discutidos.

4.1 Ensaios com Bioindicador Vibrio fischeri

Para o bioindicador Vibrio fischeri foram realizados ensaios de toxicidade aguda e

crônica. A substância cromo VI foi utilizada nos ensaios preliminares.

4.1.1 Ensaios Iniciais com a Substância Referência Cromo VI

Os ensaios agudos e crônicos inicialmente foram realizados com a substância

referência cromo VI, na forma de dicromato de potássio, com concentrações iniciais de 4mg/L

a 0,25 mg/L. No ensaio agudo, a concentração de 4 mg/L de cromo VI deve causar de 20 a

80% de inibição da emissão de luz após um contato de 30 minutos, como padronizado em

norma ISO 11348 (1998).

Os resultados dos primeiros ensaios de toxicidade com cromo VI estão descritos no

quadro 4.1. Verifica-se que a concentração de cromo VI que causou cerca 20% de inibição,

nos ensaios agudos foi de 0,5 mg/L, e em média de 0,020 mg/L, nos ensaios crônicos. Esses

resultados foram analisados seguindo-se a relação direta entre concentração em mg/L e efeito

inibitório.

Os ensaios agudos demonstraram um padrão de comportamento sem grandes variações

nos valores de inibição comparados com a concentração da amostra.

Os ensaios crônicos preliminares apresentaram, dentro de uma única cinética,

variações elevadas dos valores de inibição. Também foram observadas variações de valores

entre as repetições paralelas, dentro da mesma série de diluição. Foi observado a princípio,

que estas variações eram acentuadas dependendo da manipulação dos tubos no momento da

49

leitura. Não foi descartada a hipótese de interferência da temperatura ambiente sobre o

termobloco, que poderia estar interferindo nos valores de inibição.

Apesar das variações observadas nos resultados destes ensaios, a princípio os valores

de concentração em mg/L de cromo VI que causaram aproximadamente 20% de inibição

foram aceitos.

Agudo Crônico

Nº Ensaio Concentração Nº Ensaio Concentração

01 0,5 04 0,015

02 0,5 05 0,015

03 0,5 06 0,031

Média 0,5 Média 0,020

Desvio Padrão 0 Desvio Padrão 0,009

Quadro 4.1 – Valores de cromo VI em (mg/L) causadores de aproximadamente 20% de

inibição nos ensaios preliminares, agudos e crônicos, com a bactéria Vibrio fischeri.

Com o intuito de confirmar os resultados obtidos nos ensaios preliminares, foram

realizados outros ensaios de toxicidade aguda e crônica com a substância referência cromo

VI.

Para obter menores variações de concentração da amostra entre uma diluição e outra,

foi utilizado o método DIN de diluição, nos ensaios crônicos.

Para excluir as hipóteses de interferência que poderiam ter causado as variações de

valores de inibição nos ensaios crônicos anteriores, alguns cuidados extras foram adotados,

como por exemplo, minimização da oscilação da temperatura da sala onde o teste era

realizado com auxílio de ar condicionado, durante as 24 horas.

Nestes ensaios, iniciando com uma concentração de 0,25 mg/L de cromo VI na

amostra, não houve inibição nos testes de toxicidade aguda realizados.

As concentrações que causaram efeito inibitório de aproximadamente 20% nos ensaios

crônicos estão descritas no quadro 4.2.

50

Ensaio Crônico

Nº Ensaio Concentração

07 0,083

08 0,083

09 0,041

Média 0,069

Desvio Padrão 0,024

Quadro 4.2 – Valores de concentração em mg/L de Cromo VI que causaram cerca de 20% de

inibição nos ensaios crônicos, com a concentração inicial da amostra de 0,25 gm/L.

Agrupando todos os ensaios crônicos realizados, em média, uma concentração de

0.044 mg/L de cromo VI causou a inibição de aproximadamente 20% da emissão de luz do

bioindicador, no ensaio crônico.

Sendo assim, ficou comprovada a maior sensibilidade do teste crônico com relação ao

teste de toxicidade aguda, onde a concentração que causa 20% de inibição, situa-se em torno

de 0,5 mg/L de cromo VI.

Mas, apesar dos cuidados tomados durante a realização do ensaio, (controle da

temperatura ambiente), a variação dos valores de inibição, para uma mesma repetição paralela

dentro da série de diluição, continuaram, evidenciados pela manipulação dos tubos no

momento da medição.

Outro fator observado nos tubos de leitura foi, a formação de áreas concentradas

dentro do tubo, “nuvens brancas”, fato este observado anteriormente no trabalho realizado por

Harmel (2003), indicando crescimento de biomassa.

Com base na variação dos resultados de inibição dentro da mesma cinética e entre as

repetições, decidiu-se que para os ensaios seguintes, seriam registradas as concentrações

celulares (expressas como valores de absorção a 585 nm), as leituras de luminescência no

momento 24 horas, sem agitação prévia dos tubos de ensaio, e após a sua agitação conforme

descrito anteriormente no item 3.2.5.

Os ensaios de toxicidade crônica foram repetidos agora a uma concentração inicial de

1 mg/L de cromo VI. O quadro 4.3 apresenta os valores de concentração de cromo VI

causadores de cerca de 20% de inibição, nos ensaios crônicos, antes e após a agitação do

sistema teste.

51

-30

-20

-10

0

10

20

30

0.0625 0.0833 0.125 0.1667 0.25 0.3333 0.5 0.6667

Concentração CromoVI (mg/L)

Inib

ição

da

Lum

ines

cênc

ia (%

) Para estes ensaios os valores de concentração de cromo VI diferiram dos primeiros

realizados, sendo que no ensaio de número 12 os valores de inibição medidos mostraram um

perfil completamente aleatório, como pode ser visto no gráfico 4.1. Este gráfico demonstra a

relação direta entre concentração da amostra e média da porcentagem de inibição. Os valores

de inibição não seguiram um padrão, ocorrendo inibições elevadas em concentrações

intermediárias, e não ocorrendo inibição maior que 20% nas concentrações mais elevadas da

amostra.

Gráfico 4.1 – Variação dos valores de inibição da luminescência no ensaio crônico 12, após

24 horas de exposição à substância referência cromo VI sem agitação prévia.

Ensaios Crônicos

Nº Ensaio Concentração Concentração após agitação

12 Sem inibição

13 0,33 0,66

17 0,06 0,08

Média 0,19 0,37

Desvio padrão 0,19 0,41

Quadro 4.3 – Valores de concentração de cromo VI em mg/L, que causaram cerca de 20% de

inibição no ensaio crônico, antes e após agitação do sistema teste.

52

A média e o desvio padrão para o quadro 4.3 foram calculados levando em

consideração os ensaios 13 e 17 somente. Com a agitação dos tubos, o valor da concentração

causadora de 20% de inibição foi alterado, mas em média os valores não tiveram diferença

significativa.

Apesar de os ensaios (13 e 17) terem apresentado efeito de inibição, o perfil da

doseXresposta nestes ensaios também foi aleatório. Ocorreram inibições maiores nas séries de

diluição intermediárias, não formando uma curva lógica de inibição.

Após a agitação dos tubos, os valores de luminescência tiveram um acréscimo

chegando a valores 3 vezes superiores aos do que o valor medido sem agitação prévia à

leitura. Por exemplo, se a média de luminescência no tubo controle sem agitação foi de

1666(Irel), após a agitação este valor subiu para 4554 (Irel).

As variações de valores medidos nos ensaios crônicos, dentro da repetição paralela,

para uma mesma série de diluição, ainda estavam ocorrendo como nos ensaios preliminares.

Para o ensaio agudo, por exemplo, conforme norma ISO 11348(1998), o teste é válido se as

determinações paralelas não desviarem da média em mais 3 pontos percentuais. Para o ensaio

crônico o critério de variação ainda não foi determinado, mas seguindo os padrões do ensaio

agudo, esse valor de variação não pode ser elevado.

Deu-se especial atenção ao tipo de manipulação realizada com os tubos do ensaio

principalmente, na leitura de 24 horas. Constatou-se que os resultados ficavam dependentes

do tipo de manipulação exercida sobre os tubos de leitura. Quanto maior a movimentação dos

tubos, maiores eram os valores de luminescência medidos.

Este aumento de luminescência pode estar relacionado ao crescimento da biomassa

bacteriana dentro dos tubos de leitura.

O crescimento das bactérias foi comprovado confrontando o valor da concentração de

biomassa no início do ensaio, com o valor encontrado após 24 horas de incubação.

Para exemplificar, o gráfico 4.2 apresenta os valores de concentração de biomassa

medidos no ensaio 13, no tubo controle no início do ensaio, comparando-se com os valores

medidos após as 24 horas em todo sistema teste.

Após 24 horas de ensaio, a biomassa no tubo controle era mais de 3 vezes maior do

que no início do ensaio. Este crescimento indica que as variações de luminescência, ou

mesmo as variações das médias de inibição da luminescência por parte da amostra, pode estar

sendo causado pelo crescimento demasiado das bactérias dentro do sistema.

53

0

50

100

150

200

250

300

350

400

0.00 0.06 0.08 0.13 0.17 0.25 0.33 0.50 0.67

Concentração Cromo VI (mg/L)

Rel

ação

de

cres

cim

ento

(%)

Tempo 0

Tempo 24 horas

Gráfico 4.2 - Valores de crescimento de biomassa em relação a biomassa inicial, comparados

com a concentração de cromo VI na amostra.

Dentro de um sistema teste, a concentração do bioindicador não deve variar muito,

pois isso muda a relação dose X resposta, no sentido que a dose tóxica por unidade de

indivíduo fica cada vez menor.

Com o crescimento das bactérias dentro dos tubos de leitura, o efeito tóxico é diluído,

ou até mesmo eliminado.

Com relação ao aumento da luminescência, um dos fatores está provavelmente

relacionado devido a disponibilização de oxigênio ao meio durante o movimento dos tubos.

Como se sabe, a produção de luz pelas bactérias é efeito da ação enzimática, da

enzima luciferase, sobre seus três substratos, riboflavina reduzida, o aldeído de cadeia longa e

na presença do oxigênio. O crescimento de biomassa neste caso, também estaria favorecendo

a concentração de enzima luciferase no sistema. Com a agitação dos tubos, homogeneização

do meio e disponibilização de oxigênio, as reações aconteceriam com mais intensidade

aumentando a liberação de luz.

No ensaio agudo, este fato não é evidenciado. A luminescência não altera dependendo

da leve movimentação dos tubos, devido ao fato do meio ainda estar homogêneo e com

oxigênio suficiente para as reações enzimáticas naquele período de tempo de 30 minutos.

Diante desses resultados de variação, conclui-se que os ensaios não podem ser

realizados neste sistema apresentando grandes instabilidades.

Foi necessário reavaliar a composição do meio de reconstituição utilizado, visando

principalmente, a diminuição do crescimento das bactérias. A seção 4.2 descreve o trabalho

desenvolvido neste sentido.

54

4.2 Reformulação do Meio de Reconstituição

Com as causas da instabilidade do meio evidenciadas, a atenção foi voltada à questão

inicial da formulação do meio de reconstituição, que é a base para o ensaio. Partiu-se do

pressuposto que se o meio proporcionava condições de crescimento aos organismos, deveria-

se limitar essas condições até um ponto mínimo de sobrevivência, sem alteração significativa

da luminescência.

O meio de reconstituição, como demonstrado em materiais e métodos, é rico em

carbono (na forma de glicerol), fonte de energia para as bactérias. A primeira tentativa

baseou-se na retirada da fonte extra de carbono e outros componentes adicionados ao meio,

deixando somente o meio mineral diluído à mesma quantidade de solução salina 20 mg/L para

suplementação de nutrientes.

Com o meio reformulado as bactérias mantiveram a luminescência após 24 horas,

mesmo com a fonte de carbono reduzida.

O quadro 4.4 apresenta as médias dos valores de luminescência. Observa-se que a

luminescência se manteve até o final do ensaio, mas ainda aumentando com a agitação dos

tubos.

Sem agitação Tempo de incubação

0 30min 24 h Com Agitação

Luminescência (Irel) 1339,5 1056,16 1840,83 5121,5

Quadro 4.4 – Valores de luminescência medida em teste de meio de reconstituição utilizando

50% de meio SSWC e 50% de solução salina.(média de 3 ensaios)

Gellert et al. (1999), realizou um estudo onde a composição do meio de reconstituição

era modificada, e a toxicidade da bactéria perante algumas substâncias testada. A verificação

da toxicidade era feita através do crescimento das bactérias. O estudo teve como conclusão,

que o nível de toxicidade de algumas amostras para as bactérias depende da composição e

concentração dos ingredientes do meio.

Gellert et al. (1999), comprovou que dependendo das características do meio de

reconstituição, o crescimento das bactérias era alterado com a ação de alguns compostos

químicos, diferindo dos resultados quando o meio em concentrações padrão era utilizado.

55

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0 5 10 15 20 25 30

Tempo (h)

Lum

ines

cênc

ia

Ensaio 01

Ensaio 02

Com a limitação dos nutrientes é possível então, neste caso, diminuir o crescimento

bacteriano, mas com a possibilidade de não haver influências na luminescência, que é o fator

verificado para indicação da toxicidade, e não o crescimento.

Os ensaios foram repetidos e foi observada a mesma configuração de valores que

foram obtidos nos ensaios anteriores de teste de meio de reconstituição, sendo que a

luminescência se manteve ao final das 24 horas, mas aumentando quando exposta à agitação

como pode ser observado no gráfico 4.3.

Gráfico 4.3 – Perfil da luminescência durante o período de ensaio utilizando o meio composto

por 50% de SSWC e 50% de solução salina 20g/L.(Ensaios 01 e 02)

Apesar dos valores de luminescência aumentarem significativamente com a agitação,

devido a disponibilização de oxigênio ao meio, não foi observado nenhum afeito de

crescimento ou acúmulo de biomassa no período de incubação, como nos ensaios anteriores

onde o meio de reconstituição continha fonte de carbono extra na forma de glicerol. Como se

pode observar no gráfico 4.4, após o período do ensaio, a biomassa relativa era 60% da

biomassa encontrada no início do ensaio.

56

0

20

40

60

80

100

120

0

Concentração Amostra (%)

Rel

açao

de

cres

cim

ento

(%)

Tempo 0

Tempo 24 horas

Gráfico 4.4 - Valores de crescimento relativo de biomassa em relação a biomassa inicial no

sistema teste Abs 585 para o meio reformulado.

Pode-se dizer que com o não aumento, ou até o decréscimo de biomassa no tubo teste,

o efeito dose X resposta neste caso, será contrária do que acontecia nos ensaios preliminares,

com um número menor de organismos, o efeito do agente tóxico será maior.

Mas no teste em questão, o indicativo de toxicidade é a luminescência, e esta se manteve até o

final do ensaio mesmo que a biomassa tenha aparentemente sido reduzida.

Segundo White (2000), as bactérias só emitem luz quando estão a uma concentração

celular, que permite a concentração de um sinal espécie-espécie, o autoindutor. E esta

acumulação só ocorre em populações com concentrações celulares acima de 10 7 / mL.

Se o sistema testado manteve a luminescência até o final do ensaio, isto indica que as

concentrações celulares eram suficientes para haver o acúmulo do autoindutor.

Com esta indicação, pode-se concluir que o meio de reconstituição reformulado é apto

a ser utilizado nos ensaios.

4.3 Ensaios utilizando o meio de Reconstituição Reformulado

Com o meio de reconstituição reformulado, voltou-se a realizar ensaios de toxicidade

com as substâncias referência para os mesmos padrões.

Foram utilizadas diversas concentrações iniciais da substância referência cromo VI

para a realização dos ensaios com o meio de reconstituição reformulado, que variaram entre 1

e 8 mg/L.

Para se obter o perfil de inibição no início do teste, a luminescência foi medida no

tempo 30 minutos após a adição da amostra.

57

Nos ensaios com o meio de reconstituição reformulado, as variações dentro de uma

mesma cinética foram menores se comparados com o meio utilizado anteriormente, mas ainda

ocorreram.

Como se pode observar no quadro 4.5, no tempo de incubação de 30 minutos, no

ensaio crônico, não houve inibição acima de 20% da luminescência em nenhum dos ensaios.

Após 24 horas de contato com a substância teste, os resultados sem agitação prévia dos tubos,

foram totalmente aleatórios. Em alguns ensaios não houve um perfil de inibição coerente, e

em outros a queda de luminescência foi muito acentuada, de uma concentração para outra,

não permitindo o cálculo da concentração efetiva.

Verificou-se que em parte, o problema de instabilidade teria sido resolvido, com o

controle de crescimento das bactérias, mas por outro lado os resultados ainda ficavam

dependentes da manipulação dos tubos no momento da leitura sem agitação.

Ensaio Tempo 30 min Sem agitação (24h) Após Agitação (24h)

21 - 0,25 0,25

22 - Sem inibição coerente Sem inibição de 20%

30 - Sem inibição de 20 % 1

31 - 1 0,33

32 - Aumento brusco de inibição 0,66

33 - Aumento brusco de inibição Aumento brusco de inibição

Média - Não possível estabelecer 0,56

Quadro 4.5 – Valores das concentrações de cromo VI em mg/L que causaram

aproximadamente 20% de inibição, utilizando o novo meio de reconstituição.

O valor da média de concentração de cromo VI, após a agitação, foi calculado levando

em consideração apenas os ensaios que demonstraram perfis de inibição mais coerentes,

excluindo os ensaios 22 e 33.

O gráfico 4.5, demonstra um perfil de inibição encontrado em um dos ensaios

realizados, no tempo de leitura sem agitação prévia dos tubos. Não houve inibição acima de

20%, até uma concentração inicial de 1mg/L de cromo VI.

58

-15

-10

-5

0

5

10

15

0.0833 0.125 0.1667 0.25 0.3333 0.5 0.6667 1


Inib

ição

da

Lum

ines

cênc

ia (%

)

-15

-10

-5

0

5

10

15

20

25

0.166667 0.25 0.333333 0.5 0.666667 1


Inib

ição

da

Lum

ines

cênc

ia (%

)

Gráfico 4.5 –Variação dos valores de inibição da luminescência em um ensaio crônico com

leitura 24 horas sem agitação prévia, com a substância referência cromoVI. (Ensaio 30,

concentração inicial 2 mg/L).

Já no gráfico 4.6, pode-se observar, que os valores de inibição da emissão de luz

medidos após a agitação dos tubos demonstraram uma coerência razoável dentro de uma

curva de inibição, mesmo ocorrendo uma certa variação dos valores de inibição.

Apesar dessas questões observa-se um resultado que segue para uma linha de

tendência de inibição após a agitação dos tubos (gráfico 4.6), indicando que com um sistema

homogêneo, apesar do aumento da luminescência, os resultados se mostram mais coerentes se

comparados com o sistema estático.

Gráfico 4.6 –Variação dos valores de inibição da luminescência em um ensaio crônico, após

agitação, com a substância referência cromoVI. (Ensaio 30, concentração inicial 2mg/L).

59

-5

0

5

10

15

20

0.0039 0.0078 0.0156 0.0313 0.0625 0.125 0.25 0.5 1


Inib

ição

da

Lum

ines

cênc

ia (%

)

Froehner et al (2002), utilizaram em seu trabalho, um sistema onde o ensaio era

realizado dentro de placas “microtiter” e estes ficavam em agitação constante. As leituras de

luminescência eram feitas diversas vezes durante o período do ensaio.

Gellert (2000), também utilizou o sistema placas “microtiter” para incubação dos

ensaios. Sua avaliação de toxicidade era baseado na variação do crescimento das bactérias. O

ensaio permanecia em agitação durante todo período de incubação que era de 6 h +1hora.

Esta coerência de resultados alcançada após a agitação dos tubos de leitura, nos

ensaios realizados, talvez demonstre a necessidade do teste ficar em agitação constante,

durante o período de incubação.

No gráfico 4.7, pode-se observar o comportamento de um teste de toxicidade aguda

com a substância cromo VI, com concentração inicial de 2 mg/L. Os resultados dos perfis de

inibição são praticamente iguais aos encontrados no ensaio crônico demonstrado no gráfico

4.6.

Gráfico 4.7 - Variação dos valores de inibição da luminescência em um ensaio agudo após 30

minutos com a substância referência cromoVI.(2 mg/L)

Esta observação permite a conclusão de que, as concentrações de cromo VI que

causam aproximadamente 20% de inibição da luminescência do bioindicador são iguais.

Não houve aumento de biomassa nos ensaios crônicos realizados com o meio de

reconstituição reformulado.

60

Apesar dos resultados sofrerem variação para uma mesma cinética, e alguns dos

resultados não terem uma coerência lógica, para a substância referência cromo VI, nestes

ensaios com meio de reconstituição reformulado, o teste de toxicidade crônica não se mostrou

mais sensível que o teste agudo.

A partir destes resultados, testou-se o ensaio crônico com a segunda substância

referência, o 3,5 Diclorofenol, para observar o comportamento da substância no sistema,

tendo características químicas diferentes da do cromo VI que é um metal.

4.4 Substância Referência 3,5 Diclorofenol

O 3,5 diclorofenol foi obtido para a realização dos ensaios com o auxílio do

laboratório da Universidade do Vale do Itajaí, sendo que a venda dessa substância é

controlada.

No ensaio de toxicidade aguda com o bioindicador Vibrio fischeri, a concentração de 6

mg/L de 3,5 diclorofenol deve causar de 20 a 80% de inibição da emissão de luz conforme

norma ISO 11348(1998).

No ensaio de sensibilidade, em termos de porcentagem, os resultados do ensaio agudo

tiveram, em média, 65% de inibição da luminescência, em contato com 6mg/L de 3,5

diclorofenol, ficando dentro dos limites estabelecidos pela norma ISO 11348(1998).

Para os ensaios de toxicidade aguda neste trabalho, foram utilizadas concentrações

iniciais entre 25 e 50 mg/L.

Os valores obtidos nos ensaios com a substância referência 3, 5 diclorofenol que

causaram cerca 20 % de inibição, são apresentados no quadro 4.6. Os valores foram obtidos

através da relação direta do percentual de inibição, com a concentração do agente teste

utilizado no ensaio.

Os ensaios agudos, com o bioindicador Vibrio fischeri, não indicaram variações,

ficando o ponto de inibição estável em relação à concentração utilizada, demonstrando a boa

reprodutibilidade dos resultados.

61

Nº Ensaio Concentração

25 1,56

28 1,56

29 1,56

Média 1,56

Desvio Padrão 0

Quadro 4.6 – Concentrações que causaram aproximadamente 20 % de inibição no ensaio

agudo, com a substância referência 3, 5 Diclorofenol (valores expressos em mg/L)

Após os ensaios de toxicidade aguda, foram realizados os ensaios de toxicidade

crônica, para a substância referência 3,5 diclorofenol, que seguiram o mesmo padrão do

ensaio empregado para a substância cromo VI.

Para estes ensaios, continuou sendo utilizado o meio de reconstituição reformulado.

Nas séries de diluição foram utilizados o método geométrico e DIN, onde a concentração

inicial da solução teste variou entre 5 a 50 mg/L de 3,5 diclorofenol.

Os resultados de inibição para o ensaio de toxicidade crônica com a substância 3,5

diclorofenol, apresentaram o mesmo tipo de variação, encontradas nos ensaios com a

substância cromo VI.

Em relação ao momento de medição em 24 horas sem agitação prévia dos tubos de

ensaio, os valores de luminescência foram bastante aleatórios, sendo que em alguns ensaios a

inibição não foi coerente, ou seja, oscilações nos valores de inibição, e concentrações mais

baixas com inibições maiores que concentrações elevadas.

Também ocorreram variações acentuadas de inibição, como por exemplo:

Ensaio 26 – 24 horas ( 6,25 mg de concentração = 92% de inibição)

( 3,12 mg de concentração = 19% de ativação)

Ensaio 27 – 24 horas ( 3,12 mg de concentração = 60% de inibição)

( 1,56 mg de concentração = 51% de ativação)

Considerando uma cinética para outra, o valor da inibição aumentava em grandes

proporções, sendo que essas variações acentuadas de inibição na série de diluição geométrica

impossibilitam traçar uma curva de inibição para cálculo da concentração de efeito.

Os resultados são apresentados no quadro 4.7.

62

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0.2083 0.3125 0.4167 0.625 0.8333 1.25 1.6667 2.5

Concentração 3,5 Diclorofenol (mg/L)

Inib

ição

da

Lum

ines

cênc

ia (%

)

Tempo Incubação 30 min Sem agitação (24h) Após Agitação (24h)

Ensaio 23 2,5 2,5 1,25

Ensaio 24 2,5 Sem inibição coerente 1,25

Ensaio 26 1,56 Variação acentuada de inibição 1,56

Ensaio 27 1,56 Variação acentuada de inibição 0,78

Médias 2,03 - 1,21

Quadro 4.7 - Valores da concentração em mg/L, causadora de aproximadamente 20% de

inibição, obtidos nos ensaios crônico com a substância referência 3, 5 Diclorofenol.

O gráfico 4.8, demonstra o perfil aleatório de inibição encontrado no ensaio número

24, onde não ocorreu inibição acima de 20% da luminescência. Este tipo de perfil

impossibilita o cálculo da concentração de efeito.

Gráfico 4.8 –Variação dos valores de inibição da luminescência em um ensaio crônico após

24 horas com a substância referência 3,5 Diclorofenol.(Ensaio 24h sem agitação dos tubos,

concentração inicial 5mg/L)

Seguindo o mesmo padrão dos ensaios com a substância referência cromo VI, nos

ensaios com 3,5 diclorofenol, também houve variações de valores mensurados dentro da

mesma cinética, e nas repetições paralelas, principalmente nas 24 horas sem agitação prévia.

63

Mais uma vez, ficou evidenciado que os valores medidos por luminometria,

dependiam da manipulação dos tubos no momento da medição, o que é uma possível

explicação para grandes oscilações dos valores, como os encontrados no tempo 24 horas sem

agitação.

Apesar da grande variação das medidas no tempo de 24 horas sem agitação do sistema

teste, após a agitação dos tubos (Gráfico 4.9), os valores de inibição traçados formam uma

curva de inibição, sendo possível o cálculo da concentração causadora de inibição. Esse

comportamento também foi observado para a substância referência cromo VI, retomando a

questão do ensaio necessitar agitação durante o período de incubação.

É provável, que no período de 24 horas onde o tubo de leitura fica estático, formem-se

estratificações no próprio meio. As bactérias viriam a decantar, formando uma região mais

densa no fundo dos tubos, que seriam as “nuvens brancas” observadas anteriormente. Após a

reformulação do meio, este fato não foi mais observado com intensidade, mas não significa

que a decantação das bactérias não esteja acontecendo. Nesta decantação das bactérias, poderá

acontecer um déficit de oxigênio nas áreas mais profundas, onde o acúmulo de bactérias é

maior. Quando o tubo é levemente agitado no momento da medição, o oxigênio é

disponibilizado, conseqüentemente havendo um aumento instantâneo de luminescência.

Quando os tubos são agitados no shaker, o sistema teste é homogeneizado e recebe

oxigênio adicional do ar. Com isso, no sistema enzimático, a limitação do substrato oxigênio é

diminuída ou até eliminada.

64

-20

-10

0

10

20

30

40

50

60

70

0.2083 0.3125 0.4167 0.625 0.8333 1.25 1.6667 2.5

Concentração 3,5 Diclorofenol (mg/L)

Inib

ição

da

Lum

ines

cênc

ia (%

)

Gráfico 4.9 –Variação dos valores de inibição da luminescência em um ensaio crônico após

agitação dos tubos com a substância referência 3,5 Diclorofenol.(Ensaio 24, concentração

inicial 5mg/L)

O gráfico 4.10, apresenta uma curva de inibição de um ensaio de toxicidade aguda

para a substância referência 3,5 diclorofenol. Tendo a possibilidade de traçar uma curva de

inibição lógica com os resultados de toxicidade dos ensaios crônicos, após a agitação, foram

calculados, os valores de concentração ajustada de cromo VI em mg/L, que causaram inibição

na CE20. Comparando os resultados das concentrações ajustadas obtidas nos ensaios agudos

temos uma concentração semelhante a concentração ajustada na CE20 para os ensaios

crônicos.

Estes resultados alcançados, tanto na relação direta como na concentração ajustada,

demonstram que são necessárias as mesmas quantidades da substância teste para causar

aproximadamente 20% de inibição, tanto no ensaio agudo, como no crônico.

Mas seria duvidoso afirmar que o ensaio crônico é menos sensível para as substâncias

referências testadas, cromo VI e 3,5 diclorofenol, levando em consideração o método

utilizado, e todas as interferências ocorridas durante o trabalho.

65

-20

0

20

40

60

80

100

120

0.0488 0.0977 0.1953 0.3906 0.7813 1.5625 3.125 6.25 12.5


Inib

ição

da

Lum

ines

cênc

ia (%

)

Gráfico 4.10 - Variação dos valores de inibição da luminescência em um ensaio agudo após

30 minutos com a substância referência 3,5 diclorofenol.(25mg/L)

4.5 Água Superficial

O sistema teste de toxicidade crônica, com a bactéria luminescente Vibrio fischeri, foi

aplicado a uma matriz complexa de água natural superficial. Três amostras compostas de água

de rio foram sujeitas a bioensaios de toxicidade aguda e crônica com ambos os bioindicadores

usados neste trabalho, e a ensaios físico-químicos.

4.5.1 Ensaios físico-químicos

As amostras compostas de rio, foram sujeitas a uma bateria de análises físico-

químicas, que avaliaram os compostos encontrados com objetivo de qualificar as amostras

perante o Decreto 14250/81(SC).

Pelo Decreto 14250/81(SC), o rio onde as amostras foram coletadas, baseando-se no

padrão de qualidade de águas, é classificado como sendo de classe 2. Os resultados das

análises foram comparados com os exigidos pelo Decreto.(Laudos em anexo)

Dentre os resultados das análises realizadas, os itens que ultrapassaram os limites

padronizados pelo decreto foram, a quantidade de detergentes, para as amostras 2 e 3, o valor

de sulfeto de carbono para a amostra 2, e a quantidade de óleos e graxas para todas as

amostras.

66

Para os demais itens analisados, os resultados ficaram dentro dos padrões exigidos

pelo decreto. A princípio, pelos resultados das análises, as amostras não apresentam

características físico-químicas que afetariam o ambiente significativamente.

4.5.2 Ensaios Agudos

As amostras de água de rio foram sujeitas a ensaios de toxicidade aguda, com o

método de diluição G1. Os resultados de fator de diluição e concentração efetiva (CE20%),

foram calculados conforme norma ISO 11348(1998).

Foram observados efeitos tóxicos em duas das amostras testadas no ensaio agudo.

Com estes resultados, pode-se afirmar que nas amostras 1 e 3 houve presença de substâncias

que, isoladamente ou em sinergia, demonstraram alguma influência sobre o sistema de ensaio.

Este impacto não foi detectado pelas análises físico-químicas realizadas com as mesmas

amostras.

Pela Portaria 017/02(FATMA), que estabelece os limites máximos de toxicidade

aguda para efluentes, uma indústria têxtil, por exemplo, não pode lançar ao corpo receptor

um efluente com fator de diluição maior que 2. O resultado de fator de diluição para a amostra

de água superficial número 1, foi de fator de diluição 8. Este resultado é considerado elevado

para uma amostra de água superficial.

A amostra de número 2, por sua vez, não apresentou valores de inibição acima de

20%. Os resultados dos ensaios agudos para as amostras de água superficial testadas neste

trabalho estão apresentados no quadro 4.8.

Número da Amostra Amostra 1 Amostra 2 Amostra 3

Concentração efetiva CE20 (%) 19 n.d 35,9

Fator de diluição FDB 8 1 2

Quadro 4.8 – Valores da CE20 e Fator de diluição para as amostras de água superficial no

ensaio de toxicidade aguda.

67

-10

0

10

20

30

40

50

60

0 20 40 60 80 100 120

Concentração da amostra (%)In

ibiç

ão L

umin

escê

ncia

(%)

-10

0

10

20

30

40

50

60

0 20 40 60 80 100 120

Concentração da amostra (%)

Inib

ição

Lum

ines

cênc

ia (%

)

-20

-10

0

10

20

30

40

50

60

0 20 40 60 80 100 120

Concentração da amostra (%)

Inib

ição

Lum

ines

cênc

ia (%

)

No gráfico 4.11, pode-se observar o perfil da curva de inibição nas três amostras. Para

as amostras 1 e 3, foi possível o cálculo de fator de diluição e concentração efetiva, sendo que

para amostra 2 os valores de inibição não ultrapassaram 20% para todas as diluições testadas.

A B

C Gráfico 4.11 – Curvas de inibição de luminescência no ensaio agudo após 30 minutos para as

3 amostras de água superficial, a) amostra 1, b) amostra 2, c) amostra 3.

4.5.3 Ensaios Crônicos

Ensaios crônicos com a bactéria luminescente Vibrio fischeri, foram realizados com as

amostras de água superficial utilizando o método G1 na presença do meio de reconstituição

adaptado, demonstrado na secção 4.2.

O ensaio crônico para as amostras de água superficial teve um comportamento

satisfatório. Não houve crescimento demasiado de biomassa bacteriana, e também não houve

aumentos muito acentuados de leitura da emissão de luz após a agitação dos tubos.

68

A característica mais importante verificada nos ensaios crônicos foi novamente, a

variação de valores na mesma cinética e entre as repetições paralelas.

Apesar destas variações, foi possível com os resultados obtidos, traçar um perfil de

inibição para as 3 amostras, e , calcular a concentração efetiva e o fator de diluição através da

curva de inibição. Os resultados são apresentados no quadro 4.9.

Perante o ensaio de toxicidade crônica com Vibrio fischeri, todas as amostras de água

superficial apresentaram toxicidade. O valor de toxicidade calculado, foi maior para os

ensaios crônicos se, comparados com os ensaios agudos para a mesma amostra. A amostra

número 2, no ensaio agudo, não apresentou valor de toxicidade, já para o ensaio crônico, foi a

que apresentou os valores mais elevados.

O ensaio crônico neste caso, revela a presença de um efeito tóxico que não foi

encontrado pelo ensaio agudo, demonstrando sensibilidade superior comparado ao ensaio

agudo.

Número da Amostra Amostra 01 Amostra 02 Amostra 03

Concentração efetiva CE20 (%) 15,57 6,31 16,55

Fator de diluição FDB 4 >32 32

Quadro 4.9 – Valores de CE20 e fator de diluição para as amostras de água superficial no

ensaio de toxicidade crônica.

No gráfico 4.12, são apresentadas as curvas de inibição para o ensaio crônico. Para a

amostra número 2, que no ensaio de toxicidade aguda, não apresentou inibição acima de 20%,

no ensaio de toxicidade crônica aqui demonstrado, todos os pontos de inibição ficaram acima

de 20%.

As amostras 1 e 3 mostram um perfil coerente de inibição. A amostra 2 não foi diluída

o suficiente para mostrar o perfil de inibição abaixo de 50%.

Apesar dos ensaios 1 e 3 terem fornecido um perfil de inibição coerente, é preciso

tomar cuidado na interpretação dos resultados, devido a elevada variação dos resultados

ocorridos nas repetições paralelas da mesma diluição.

Isso demonstra talvez que a problemática das variações no ensaio crônico, está mais

voltada para o método utilizado para medição da luminescência, do que para a formulação do

meio de reconstituição.

69

-60

-40

-20

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120

Concentração amostra (%)

Inib

ição

lum

ines

cênc

ia (%

)

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120


Inib

ição

lum

ines

cênc

ia (%

)

0

20

40

60

80

100

0 20 40 60 80 100 120


Inib

ição

lum

ines

cênc

ia (%

)

A B

C

Gráfico 4.12 – Curvas de inibição de luminescência no ensaio crônico após 24 horas para as 3

amostras de água superficial.a) amostra 1, b) amostra 2 c) amostra 3.

4.6 Ensaios com o Bioindicador Daphnia magna

Os ensaios com o bioindicador Daphnia magna foram realizados com o propósito

principal de comparar os métodos utilizados com o ensaio de Vibrio fischeri, suas vantagens,

desvantagens e eficiência, principalmente levando em consideração o ensaio crônico.

4.6.1 Ensaio Agudo

Foram realizados ensaios de toxicidade aguda com as substâncias referência cromo VI,

3,5 diclorofenol e com as amostras de água superficial.

70

Nos quadros 4.10 a 4.12 são apresentados os resultados dos ensaios agudos, para as

duas substancias referencias e as amostras de água superficial.

A primeira substância referência testada foi o cromo VI. Para uma concentração inicial

de 4 mg/L de cromo VI, foram realizadas 7 diluições geométricas, chegando-se a um fator de

diluição de 1 parte para 128, ou seja, aproximadamente 0,03 mg/L de cromo VI, na série mais

diluída. As daphnias foram colocadas em contato com as diluições, e após 48 horas os

resultados observados.

Para o ensaio agudo, considera-se o ponto de inibição da movimentação, onde são

encontrados 10% ou mais dos indivíduos imóveis. No quadro 4.10 são apresentados os

resultados para a substância referência cromo VI. Uma concentração de 0,125 mg/l de cromo

VI na amostra, causou inibição de mais de 50% nos indivíduos. A uma concentração de 0,06

mg/L de cromo VI, não são mais observados resultados de inibição significativos.

Expressando o resultado em fator de diluição, este seria no valor de 64.

Para a substância referência cromo VI, no ensaio agudo, o bioindicador Daphnia

magna se mostrou mais sensível, se comparado com Vibrio fischeri. Em média para Vibrio

fischeri, 0,5 mg/L de cromo VI, causaram 20% de inibição nos ensaios de toxicidade aguda. A

mesma quantidade da substância para o bioindicador Daphnia magna, causa 100% de

imobilidade dos indivíduos.

Fator de Conc. do agente Nº de dáphnias Nº de dáphnias Percentagem dediluição teste (mg/L) imóveis (48h) móveis (48h) Imobilidade (P)

1 4 20 0 100.002 2 20 0 100.004 1 20 0 100.008 0.5 20 0 100.0016 0.25 20 0 100.0032 0.125 11 9 55.0064 0.0625 1 19 5.00

128 0.03125 0 20 0.000 0 0 20 0.00

Quadro 4.10 – Valores do ensaio agudo de Daphnia magna com os respectivos percentuais

de inibição indicados pela imobilidade dos animais para a substância cromo VI.

Os ensaios com a substância referência 3,5 diclorofenol foram realizados nos mesmos

padrões dos ensaios com cromo VI, contendo o mesmo número de série de diluições, sendo

71

Fator de Conc. do agente Nº de dáphnias Nº de dáphnias Percentagem dediluição teste (mg/L) imóveis (48h) móveis (48h) Imobilidade (P)

1 10 13 7 65.002 5 4 16 20.004 2.5 0 20 0.008 1.25 0 20 0.0016 0.625 0 20 0.0032 0.3125 0 20 0.0064 0.15625 0 20 0.00

128 0.078125 0 20 0.000 0 0 20 0.00

que a concentração inicial da amostra foi de 10 mg/L. Os resultados deste ensaio estão

descritos no quadro 4.11.

Para ocorrer uma inibição significativa da movimentação no ensaio agudo com o

bioindicador Daphnia magna, foi necessário a presença de 5 mg/L de 3,5 diclorofenol na

amostra.

Com a concentração de 1,56 mg/L de 3,5 diclorofenol no ensaio agudo com Vibrio

fischeri, ocorreu aproximadamente 20% de inibição da luminescência. Neste caso, para esta

substância referência, o bioindicador Vibrio fischeri foi mais sensível.

Quadro 4.11 – Valores do ensaio agudo de Daphnia magna com os respectivos percentuais

de inibição indicados pela imobilidade dos animais para a substância 3,5 diclorofenol.

Os ensaios de toxicidade aguda com o bioindicador Daphnia magna, também foram

realizados, utilizando-se as três amostras de água superficial. Não foram realizadas diluições

nas amostras, sendo elas testadas puras, perante o controle. Os resultados das 3 amostras são

apresentados no quadro 4.12.

O teste agudo com Daphnia magna, não mostrou efeito tóxico perante as amostras de

água superficial. O valor do fator de diluição para as amostras de água superficial foi de 1, ou

seja, não há afeito tóxico agudo nas amostras perante o bioindicador Daphnia magna

conforme norma. Ocorreram inibições da mobilidade em duas amostras, mas não

ultrapassando a 10% dos indivíduos.

72

Amostra 1

Fator de Conc. do agente Nº de dáphnias Nº de dáphnias Percentagem dediluição teste (%) imóveis (48h) móveis (48h) Imobilidade (P)

1 100 0 20 0.000 0 0 20 0.00

Fator de diluição: 1 Amostra 2 Fator de Conc. do agente Nº de dáphnias Nº de dáphnias Percentagem dediluição teste (%) imóveis (48h) móveis (48h) Imobilidade (P)

1 100 2 18 10.000 0 0 20 0.00

Fator de diluição: 1 Amostra 3 Fator de Conc. do agente Nº de dáphnias Nº de dáphnias Percentagem dediluição teste (%) imóveis (48h) móveis (48h) Imobilidade (P)

1 100 1 19 5.000 0 0 20 0.00

Fator de diluição: 1

Quadro 4.12 – Valores agrupados dos ensaios agudos de Daphnia magna com os respectivos

percentuais de inibição indicados pela imobilidade dos animais para as três amostras de água

superficial.


O ensaio crônico com o bioindicador Daphnia magna foi implantado na Umwelt

Assessoria Ambiental, seguindo os padrões estabelecidos pela Norma EOCD TG 211(1998),

como parte deste trabalho.

Cada ensaio crônico com este bioindicador tem a duração de 21 dias, sendo que por

esse motivo, o ensaio foi somente realizado com a substância referência cromo VI e com as

amostras de água superficial.

A solução teste teve concentração inicial de 4mg/L de cromo VI. As diluições partiram

de valores mais elevados, aonde no ensaio agudo (Quadro 4.10) não se observou morte de

nenhum indivíduo, pois neste ensaio o objetivo é sua manutenção e verificação do número de

filhotes produzidos no final do período.

73

A diluição inicial foi de 1 para 128 vezes, sendo que, na primeira série de diluição,

havia uma concentração 0,03 mg/L da substância referência cromoVI. Foram realizadas 4

séries de diluição geométrica onde a menor concentração ficou em 0,004 mg/L de cromo VI

na amostra. Os resultados são apresentados no quadro 4.13.

Em média para as diluições com a substância referência e controle, 90% dos

indivíduos apresentavam-se prenhes no 5º. dia, tendo seus primeiros filhotes no 6º. dia.

Houve diferença no número de filhotes entre as diluições dentre elas e o controle. Este

resultado pode ser observado no quadro 4.14. Utilizando-se do método estatístico ANOVA

podemos confirmar que existe uma diferença significante entre todas as amostras, com um F=

45.364 e P=0,0000.

O objetivo do ensaio é verificar quais séries de diluições diferem perante o controle.

Sendo que para isto utilizou-se o método estatístico de comparações múltiplas Bonferroni,

onde este afirma que todas as amostras diferem com significância do controle.

A mais baixa concentração de efeito observada para este ensaio foi portanto, de

0,004 mg/L de cromo VI. Todas as diluições testadas apresentaram efeitos tóxicos

significativos, sendo que não foi possível a determinação da menor concentração de efeito da

substância teste.

Os resultados obtidos indicam a grande sensibilidade do bioindicador Daphnia

magna para a substância referência cromo VI, se comparado com Vibrio fischeri. A uma

concentração de somente 0,004 mg/L os resultados indicaram um efeito tóxico significativo

no ensaio com Daphnias,enquanto que para Vibrio fischeri esse valor ficou em torno de 0,5

mg/L. Este valor de concentração encontrado no ensaio com Daphnia magna, corresponde, a

faixa de sensibilidade de um equipamento AAS (Absorção Atômica), na quantificação deste

metal.

Diluição

Controle 128 256 512 1024 Número total

de filhotes 3004 1210 1382 1318 2092

Média 100.1 40.2 46.0 43.9 69.7

Desvio Padrão 23 13.4 17.9 22.6 23.1

Quadro 4.13 – Número total de filhotes nascidos no período de 21 dias para cada série de

diluição e controle.(agrupamento de três repetições)

74

Após os ensaios crônicos com a substância referência cromo VI, foram realizados os

ensaios crônicos com as amostras de água superficial.

Nas amostras de água superficial no ensaio agudo, foi observada morte de pelo

menos 1 animal em alguma amostra, sendo que para o ensaio crônico, estabeleceu-se a

diluição inicial de ½ da amostra para assegurar a sobrevivência dos indivíduos para a

realização do ensaio. Outro fator que levou à diluição da amostra, foi, a característica das

amostras conterem uma alta condutividade, resultado da presença de íons em concentração

elevada. As amostras continham valores mais elevados de cloretos, por serem coletadas numa

região de influência marítima. A diluição da amostra foi necessária, diminuindo a sua

condutividade, para poder ser utilizada com Daphnia magna.

Os resultados do ensaio crônico de toxicidade com o bioindicador Daphnia magna

são apresentados no quadro 4.14.

Através da análise dos resultados ficou definido que não houve diferença estatística

entre o controle e os demais grupos, sendo F= 1.091 e P=0.365. As análises utilizadas

seguiram os mesmos padrões do ensaio com cromo VI, utilizando o teste estatístico ANOVA

e Bonferroni.

Sendo assim, as amostras testadas não influenciaram na reprodução do bioindicador

Daphnia magna.

Comparando os resultados obtidos neste ensaio crônico, o ensaio com o bioindicador

Vibrio fischeri, demonstrou mais sensibilidade para as amostras de água superficial, indicando

resultados de inibição da luminescência.

Controle Amostra 01 Amostra 02 Amostra 03 Número total

de filhotes 677 613 570 541

Média 67.7 61.3 57 54.1

Desvio Padrão 17.6 9.4 15.6 25.2

Quadro 4.14 – Número total de filhotes nascidos no período de 21 dias para cada amostra de

água superficial com uma série de diluição.

Com relação aos métodos utilizados nos ensaios crônicos, comparando-os, o ensaio

com o bioindicador Vibrio fischeri demonstrou algumas variações que resultaram do processo

75

de medição da luminescência, mas em si, após padronizado será um teste de procedimentos

rápidos e simples se comparado com o teste com o bioindicador Daphnia magna.

Um dos fatores que fazem o teste crônico com Daphnia magna exigir uma mão de

obra maior, é o tempo de duração do ensaio. Enquanto um ensaio com Vibrio fischeri tem

duração de 24 horas, com o bioindicador Daphnia magna o ensaio tem a duração de 21 dias.

Ensaios com bioindicadores tem um custo elevado, devido, a mão de obra

especializada que necessitam. Nas condições atuais de mercado, seria inviável

comercialmente oferecer o ensaio crônico com o bioindicador Daphnia magna, com o

objetivo de atender um elevado número de análises.

76

5 CONCLUSÕES E RECOMENDAÇÕES

Este trabalho proporcionou uma série de informações relevantes em relação ao ensaio

crônico com a bactéria luminescente Vibrio fischeri.

A tentativa de padronização do teste crônico com Vibrio fischeri, perante as

substâncias referências, não foi conclusiva devido as influências encontradas no decorrer do

ensaio, que causaram variações nos resultados. Algumas dessas influências foram superadas.

Nos ensaios preliminares, o meio de reconstituição proporcionou o crescimento das

bactérias no sistema teste, ocasionando variações nos valores de luminescência medidos.

Outras hipóteses de interferência externa foram consideradas, como interferência da

temperatura ambiente, mas estas foram eliminadas, ficando o crescimento bacteriano como

principal questão a ser resolvida.

A variação dos valores, também estava associada a manipulação do tubo de leitura no

momento da medição. Para diminuir o crescimento bacteriano, o meio de reconstituição foi

reformulado. A luminescência foi mantida durante o período necessário ao teste, mesmo com

o crescimento bacteriano suprimido.

Os ensaios posteriores de inibição da luminescência na presença de substâncias

referência, utilizando o meio de reconstituição reformulado, tiveram resultados não

reprodutíveis. Outro fator, além do crescimento bacteriano estava influenciando na variação

dos resultados.

A perturbação do meio líquido nos tubos do ensaio, provocada pela movimentação dos

tubos do termobloco até o luminímetro no momento da leitura da luminescência, após o

período de incubação de 24 horas, foi base das incoerências nos valores de medição. Isto

aconteceu devido ao fato que o trajeto permitiu a disponibilização de oxigênio nos tubos

através da movimentação dos mesmos, alterando os resultados reais. O sistema teste é

baseado numa reação enzimática de estrema sensibilidade. A alteração minúscula do teor de

oxigênio dissolvido no meio líquido, aumenta de imediato o “turn-over” do sistema

enzimático da luciferase, resultando num aumento não controlado da emissão de luz.

A análise dos resultados revela que o ensaio crônico com V. fischeri para as

substâncias referências testadas, com o método de avaliação empregado, onde existe a

movimentação do tubo para a leitura e o meio fica estático durante as 24 horas, possivelmente

formando estratificações, tanto ao nível de concentração da biomassa, quanto ao nível de teor

77

de oxigênio dissolvido e consumido no meio líquido, teve muitas variações de valores

mensurados na leitura a 24 horas sem agitação prévia dos tubos.

Apesar dos resultados do período de 24 horas sem agitação prévia não serem

reprodutíveis, os resultados após agitação dos tubos no ensaio, seguiram um padrão, formando

perfis de inibição, o que reflete a possibilidade deste ensaio necessitar de agitação

permanente.

Portanto não fica descartada a possibilidade de utilização de outro método para a

estabilização do sinal de luminescência, como o sistema de placas “microtiter” utilizado por

(Grimme e Backhaus 1999), e por (Gellert, et al. 1999) que utilizou para aferição do

crescimento.

Com relação aos ensaios agudos para V.fischeri e D. magna, estes se mostraram dentro

dos resultados esperados para ambos bioindicadores, sem variações para a substância

referência, e com resultados reprodutíveis.

Comparando os ensaios crônicos com o bioindicador V.fischeri entre si, nos ensaios

preliminares, o ensaio crônico demonstrou ser mais sensível, mas ocorreu o crescimento

bacteriano que influenciou nos resultados, sendo que estes não podem ser considerados como

fidedignos.

Após a reformulação do meio de reconstituição, os resultados no momento de leitura a

24 horas, não puderam ser comparados devido as variações de resultados. Mas após a agitação

dos tubos, foram encontrados resultados, que a princípio tiveram os valores próximos aos do

ensaio de toxicidade aguda.

Com esses resultados não é possível dizer que o ensaio crônico não tenha uma elevada

sensibilidade às substâncias testadas, pois o ensaio teve interferências como crescimento

bacteriano e disponibilização de oxigênio ao meio com a movimentação dos tubos de leitura.

Para as amostras de água superficial, apesar das variações, o ensaio crônico com V.

fischeri se mostrou mais sensível se comparado ao ensaio agudo com o mesmo bioindicador, e

também se comparado ao ensaio agudo e crônico com o bioindicador Daphnia magna.

No ensaio crônico com o bioindicador Daphnia magna, a análise dos resultados

mostra que este bioindicador foi mais sensível a substância referência cromo VI testada. Já

nas amostras de água superficial, Vibrio fischeri se mostrou mais sensível.

Os resultados gerados das análises físico-químicas para as amostras de água

superficial, estão praticamente todos dentro dos limites permitidos em lei. Mas os ensaios de

78

biotoxicidade com o bioindicador V. fischeri demonstraram valores altos de toxicidade para

essas amostras.

Para validar o teste crônico com o bioindicador Vibrio fischeri, os trabalhos

posteriores a este, devem levar em consideração, o fato do ensaio necessitar de saturação de

oxigênio durante o período de incubação, ficando em agitação, ou outro mecanismo de

fornecimento de oxigênio.

A leitura de perfis de luminescência no decorrer de todo o período do ensaio, também

é recomendada, pois com isso pode-se obter uma visão completa do comportamento do

bioensaio durante o período de incubação, o que não acontece quando somente uma leitura

final é realizada.

Pela demonstração de sensibilidade, quando confrontado com amostras de água

superficial, o ensaio crônico com V. fischeri, parece ser indicado no monitoramento de

hidrossistemas, por ser principalmente, um ensaio rápido de ser realizado. Mas para os

resultados serem considerados como válidos, as interferências ainda existentes devem ser

eliminadas.

79

REFERÊNCIAS

ABNT – Associação Brasileira de Normas Técnicas – Projeto NBR 12713, Água - Ensaio de

toxicidade aguda com Daphnia sp (Crustacea, Cladocera), 11º Reunião.1993.

ALBA, Amadeo. R. Fernandez, et al. Comparative evaluation of the effects os pesticides in

acute toxicity luminescence bioassays.Chemosphere, Spain, p.98-102, 2001.

ARAÚJO, Milena Maria Sampaio; NASCIMENTO, Iracema A..Testes ecotoxicológicos

Marinhos: Análise de Sensibilidade. Ecotoxicology and Environmental Restoration, 2,

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84

GLOSSÁRIO

Para clareza das expressões, segue a seguir uma listagem de definição de termos técnicos

comumente utilizados ao longo do trabalho:

Agente-teste: amostras ambientais ou substâncias químicas e formulações que podem causar

efeito deletério sobre o organismo-teste.

Água de Cultivo: água reconstituída ou natural de boa qualidade utilizada para manutenção

das culturas do organismo Daphnia magna.

Água de Diluição: água utilizada na realização dos testes com o organismo Daphnia magna.

CE20 ou CE50: concentração nominal do agente-teste que causa inibição da luminescência a

20% ou 50%, respectivamente, no organismo comparados ao controle, em 24 horas de

exposição à mesma,.

Controle: conjunto de organismos-teste, submetidos as mesmas condições do ensaio, sem a

presença do agente-teste.

Daphnia magna: Microcrustáceo de água doce, sensível e amplamente utilizado em

bioensaios.

FDB: Fator de diluição para bactérias luminescentes –corresponde a quantidade de água em

litros que deve ser adicionado a um litro da amostra para que não se observe mais um efeito

significativo de toxicidade.

FDD: Fator de diluição para Daphnia magna – corresponde a quantidade de água em litros

que deve ser adicionado a um litro da amostra para que não se observe mais um efeito

significativo de toxicidade

Meio de reconstituição: meio líquido solúvel no qual as bactérias encontram condições de

sobrevivência por um período de tempo determinado.

Solução-teste: agente-teste após tratamento necessário para a realização do ensaio (correção

de pH, sedimentção, etc.), e/ou suas diluições nas quais são expostos os organismos-teste.

Organismo-teste: neste trabalho indivíduos de Vibrio fischeri e Daphnia magna

Vibrio fischeri: Bactéria marinha, pertencente à família Vibrionaceae, bioluminescente,

anaeróbia facultativa, gram-negativa.

85

APÊNDICES

Apêndice A – Fotos referentes ao ensaio de toxicidade com o bioindicador Vibrio fischeri Foto 1 – Mestranda realizando ensaio de biotoxicidade com Vibrio fischeri Foto 2 – Workstation composta por termoblocos e luminímetro Dr. Lange

86

Foto 3 – Armazenamento das bactérias em tubos Eppendorf para congelamento Foto 4 – Meio de cultivo da bactéria luminescente Vibrio fischeri

87Apêndice B - Planilha Excel utilizada para análise dos resultados no ensaio agudo com Vibrio fischeri

ISO 11348 Fkt Fator de correção no tempo após 30 minFator de correção Ikt Luminescência no controle após 30 min

Io Luminscência no controle antes da adicão da amostra

Fkt Fkt Ict Ht Ht ΓtTempo T= 0 T = 30 min Fkt Média Fkt Ict % inibição Média% inib Gamma

Média de Fkt perante controle Conc. Mg/lConcentr.%B1 1312 1428 1.09 1.07 1399.03 -2.07 0.00 0.000Ict C1 1243 1298 1.04 1325.45 2.07

B2 1180 1288 1.09 1.03 1258.27 -2.36 2.96 0.0310.0078 0.1953 C2 1273 1245 0.98 1357.44 8.28

Ict= valor corrigido de Io B3 1240 1236 1.00 0.99 1322.25 6.52 7.13 0.0770.0156 0.3906 C3 1298 1277 0.98 1384.10 7.74

% inibição B4 1238 1272 1.03 1.02 1320.12 3.64 4.72 0.0500.0313 0.7813 C4 1127 1132 1.00 1201.76 5.80

B5 1212 1206 1.00 0.99 1292.39 6.68 6.88 0.074Ht efeito de inibição 0.0625 1.5625 C5 1221 1210 0.99 1301.99 7.07Iti luminescencia depois 30 min B6 1141 1148 1.01 1.00 1216.68 5.65 6.52 0.070

0.1250 3.125 C6 1203 1188 0.99 1282.80 7.39Gamma B7 1237 1198 0.97 0.93 1319.05 9.18 12.93 0.149

0.2500 6.25 C7 1281 1138 0.89 1365.97 16.69B8 1259 1183 0.94 0.93 1342.51 11.88 12.89 0.148

0.5000 12.5 C8 1210 1111 0.92 1290.26 13.89B9 1297 1090 0.84 0.84 1383.03 21.19 21.02 0.266

1.0000 25 C9 1256 1060 0.84 1339.31 20.85B10 1298 1037 0.80 0.79 1384.10 25.08 26.09 0.353

2.0000 50 C10 1294 1006 0.78 1379.83 27.09

A =B =

IoIktFkt=

FktIoIct .=

100xIctItiIctHt −

=

HtHtTt−

=100

aTtbct lglglg +=

88

y x

Γt Log Tt Log Conc Log Gama Gama Lin Reg.GammaLog de GammaLog concentração Ajustada0.000

0.031 -1.516 -0.709 -1.5698 0.0269

0.077 -1.115 -0.408 -1.4316 0.0370

0.050 -1.305 -0.107 -1.2934 0.0509

0.074 -1.132 0.194 -1.1552 0.0699

0.070 -1.157 0.495 -1.0171 0.0961

0.149 -0.828 0.796 -0.8789 0.1322

0.148 -0.830 1.097 -0.7407 0.1817

0.266 -0.575 1.398 -0.6025 0.2497

0.353 -0.452 1.699 -0.4644 0.3433

Concentração ConcetraçãoHt Γt Log Tt Ajustada Efetiva20 0.250 -0.602 1.398 25.0330 0.429 -0.368 1.908 80.9440 0.667 -0.176 2.326 211.8550 1.000 0.000 2.709 512.2760 1.500 0.176 3.093 1238.7180 4.000 0.602 4.021 10485.79

A = -1.242 90 9.000 0.954 4.788 61312.50B = 0.4592

aTtbct lglglg +=

y = 0.4592x - 1.2442

R2 = 0.8931

-1.000

-0.900

-0.800

-0.700

-0.600

-0.500

-0.400

-0.300

-0.200

-0.100

0.000

0.0000.2000.4000.6000.8001.0001.2001.4001.600

89Apêndice C - Planilha Excel utilizada para análise dos resultados do ensaio crônico com Vibrio fisheri

Cronico segundo Backhaus

Io Luminscência no controle antes da adicão da amostra

Ht Ht Γt Log TtQtdade defdConcentr.%TempoT= 0 T = 24 h média contro% inibiçãoMédia% inib GammaLog de GammaCromo mg/L B1 763.618371984.50

C C1 771.72132 2015.50% inibição B2 760.823032046.50

C C2 761 1790B3 734 1734 13.97 14.66 0.172 -0.765

0.015625256 0.3906 C3 77.2 1706 15.36B4 754.11524 24.39 26.22 0.355 -0.449

0.03125128 0.7813 C4 765.51450 28.06B5 760.81466 27.26 27.09 0.372 -0.430

Ht efeito de inibição 0.0625 64 1.5625 C5 789.51473 26.92Iti luminescencia depois24h B6 757.81281 36.44 30.19 0.432 -0.364Cti luminescencia do controle após 20.125 32 3.125 C6 780.81533 23.94

B7 749.3751.1 62.73 60.97 1.562 0.1940.25 16 6.25 C7 755.5822.1 59.21

B8 757.6203.8 89.89 88.77 7.904 0.8980.5 8 12.5 C8 781.8248.9 87.65

Gamma B9 770.6104.6 94.81 94.62 17.576 1.2451 4 25 C9 781 112.4 94.42

B10 781.127.14 98.65 98.65 72.828 1.8622 2 50 C10 795.227.46 98.64

FDb 256CE20 0.62

)100(100CtiItixHt −=

HtHtTt−

=100

90

Log Conc Gama Lin Reg.Log concentração

-0.408 -0.7155 0.1925

-0.107 -0.5481 0.2831

0.194 -0.3806 0.4163

0.495 -0.2131 0.6123

0.796 -0.0456 0.9004

1.097 0.1219 1.3241

1.398 0.2894 1.9472

1.699 0.4569 2.8636

Gamma Log gam Conc. AjustadaConcentração Efetiva20 0.250 -0.602 -0.204 0.6230 0.429 -0.368 0.216 1.6540 0.667 -0.176 0.561 3.6450 1.000 0.000 0.878 7.5560 1.500 0.176 1.194 15.6480 4.000 0.602 1.960 91.1790 9.000 0.954 2.593 391.58

aTtbct lglglg +=

y = 0.5564x - 0.4884

R2 = 0.793

-0.900

-0.800

-0.700

-0.600

-0.500

-0.400

-0.300

-0.200

-0.100

0.000

-0.500-0.400-0.300-0.200-0.1000.0000.1000.2000.300

91

Apêndice D - Fotos referentes ao ensaio de toxicidade com bioindicador Daphnia magna Foto 5 – D. magna matriz e seus filhotes no ensaio crônico Foto 6 – Acondicionamento dos frascos Becker no ensaio crônico para serem colocados na estufa

92

Foto 7 – Estufa com fotoperíodo para cultivo e ensaio crônico Foto 8 – Bancada de trabalho, troca de meio no ensaio crônico

93

Dados de Análise Toxicidade aguda com Daphnia magna (Adaptada a dureza 200)

Especificação da Amostra: Dicromato de potássio 4 mg/L Data 7/10/2003Pré-diluição: 1pH: 7

Dureza: 120 Condutividade: 430µS/cm2

Estocagem da amostra: RefrigeradaSensibilidade à substâncias de referência:Observação:

Fator de Conc. do agente Nº de dáphniasNº de dáphniasPercentagem deAgente TesteÁgua de diluição diluição teste (mg/L) imóveis (48h) móveis (48h) Imobilidade (P)

1 0 1 4 20 0 100.001 1 2 2 20 0 100.001 3 4 1 20 0 100.001 7 8 0.5 20 0 100.001 15 16 0.25 20 0 100.001 31 32 0.13 11 9 55.001 63 64 0.06 1 19 5.001 127 128 0.03 0 20 0.000 Controle 0 0 0 20 0.00

Resultados analisados conforme ABNT 12713 FD(D) no teste: 64Os valores para cálculo do Fator de diluição são considerados Pré-diluição: 1a partir de10% ou mais de imobilidade dos organismos FD(D): 64

Partes

Apêndice E – Planilha de análise do ensaio agudo com Daphnia magna para substância Dicromato de potássio

94

Experiência No Data Início: Clone: Média: Tipo de Comida: Substância teste Concentração:

Dia 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9101112131415161718192021

Renovação

novo

velho

novo

velho

novo

velho

Alimentação

No filhotes vivosTotal

Bequer 12345678910

Total

PH

Temp (oC)

No Adultos mortos

O2 mg/l

Apêndice F – Planilha utilizada para controle nos ensaios crônicos com Daphnia Magna

95

ANEXOS

UMWELT Ltda. Assessoria Ambiental CNPJ: 01.452.938/0001-05 - Inscr. Estad.: 253.819.547 - Insc. Munic.:64.428 Rua Quixabás, 245 - Velha - Blumenau/SC Tel/Fax: (47) 325 3703 / 4805 - E-mail: [email protected]

95

ANEXOS

UMWELT Ltda ASSESSORIA AMBIENTAL UMWELT - LABOR

Relatório de análises Número 757

Cliente: ***** Endereço: ***** Piçarras SC

Data: 19/06/04 página: 1 de 2

Especificação: Água de Rio Piçarras – Amostra Composta de 24 horas – Conforme Portaria 14258 Localização: S 26° 45’ 707” - O 48° 40’ 974” Número de registro: 838 Início da amostragem: 02/06/2004 12:00 Final da amostragem: 03/06/2004 15:30 Data da recepção: 03/06/2004 16:30

Análises Físico-Químicas Análise Metodologia Padrões de Qualidade

da Água – Classe 2 – Decreto 14.250 (SC)

Resultado

A001. pH Sonda n.p. 6,81 A002. Temperatura Sonda n.p. 21 ºC A003. Oxigênio dissolvido Sonda não inferior a 5,0 mg/L 5,36 mg/L A004. DQO não filtrada Fotometria n.p. 44,3 mg/L A005. DBO-5 Fotometria 5 mg/L n.d. (< 4 mg/L) A007. Cor aparente - U Pt/Co

Fotometria n.p. 224 U Pt/Co

A014-1. Sólidos suspensos totais - SST

Gravimetria n.p. 66 mg/L

A015. Arsênio AAS 0,1 mg/L n.d. (<0,0015 mg/L) A018. Nitrogênio total Fotometria n.p. n.d. (< 1 mg/L) A019. Nitrato Fotometria 10 mg/L N-NO3 n.d. (<0,23 mg/L) A020. Nitrito Fotometria 1,0 mg/L N-NO2 0,024 mg/L A021. Fósforo total Fotometria n.p. 1,60 mg/L A023. Cianetos - facilmente liberáveis

Fotometria 0,2 mg/L n.d. (<0,025 mg/L)

A024. Sulfato Fotometria/Turbidimetria n.p. 730 mg/L A025. Sulfeto Titulação n.p. n.d. (< 1 mg/L) A026. Alumínio Fotometria n.p. 0,122 mg/L A028-1. Cádmio- AAS AAS 0,01 mg/L n.d. (< 0,005 mg/L) A029-2. Cromo total AAS 0,05 mg/L n.d. (< 0,003 mg/L) A031-1. Cobre AAS 1,0 mg/L n.d. (< 0,0015 mg/L) A032. Ferro total Fotometria n.p. 0,961 mg/L A034-1. Chumbo AAS 0,1 mg/L n.d. (< 0,005 mg/L) A035. Magnésio Fotometria n.p. 156,4 mg/L A038-1. Níquel AAS n.p. n.d. (< 0,006 mg/L) A042-1. Zinco AAS 5,0 mg/L n.d. (0,02 mg/L) A043. Mercúrio AAS 0,002 mg/L n.d. (< 0,00005 mg/L) A046. Bário AAS 1,0 mg/L n.d. (< 0,5 mg/L) A047. Detergentes aniônicos

Fotometria 0,5 mg/L 0,475 mg/L

A054. Fenóis Fotometria / Destilação 0,001 mg/L n.d. (< 0,05 mg/L) A058. Sulfitos Fotometria n.p. n.d (< 0,1 mg/L) A061. Fluoretos Fotometria 1,4 mg/L 0,545 mg/L A062. Óleos e graxas Destilação / Gravimetria virtualmente ausentes 1,2 mg/L A063. Nitrogênio amoniacal


A064. Antimônio AAS n.p. n.d. (<0,005 mg/L)

Anexo A – Laudo de análises físico-químicas da Amostra 1


96

A071. Selênio AAS 0,01 mg/L n.d. (<0,002 mg/L) A072. Sulfeto de Carbono CG 0,005 mg/L n.d. (<0,005 mg/L)




Data: 19/06/2004 página 2 de 2

Análises Microbiológicas Análise Metodologia Padrões de Qualidade


Resultado

M003-2. Coliformes Totais em Água – quantitativo

Membrana filtrante 5 x 103 / 100mL

3,0 x 104 / 100mL

M003-2. Coliformes Fecais em Água – quantitativo


1,9 x 103 / 100mL

Observações: Coletor das amostras: Umwelt Amostra turva pela presença de sólidos em suspensão. A metodologia utilizada na obtenção dos resultados segue os padrões publicados no "Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater" - 20th Ed. (1998). Os resultados dos ensaios têm seu valor restrito às amostras ensaiadas no laboratório da UMWELT. n.d. = não detectado, abaixo do limite de detecção n.p. = não previsto no Decreto 14.250 Condições de coleta: Tipo de amostragem: Composta de 24 horas Tipo de coleta: Coletor automático – Cole Parmer Maré: Alta Chuvas nas últimas 48 horas: sim (14 mm em 24 horas) Chuvas na hora da coleta: sim Temperatura ambiente 21,5°C

_________________________ Nilma J. Furtado Saar Bióloga Responsável

CRB: 28324-03D

_________________________ Dr. Jörg Henri Saar

Diretor Técnico


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Especificação: Água de Rio Piçarras – Amostra Composta de 24 horas – Conforme Portaria 14258 Localização: S 26° 45’ 707” - O 48° 40’ 974” Número de registro: 841 Início da amostragem: 04/06/2004 10:00 Final da amostragem: 05/06/2004 14:15 Data da recepção: 05/06/2004 17:00



Resultado

A001. pH Sonda n.p. 7,07 A002. Temperatura Sonda n.p. 21 ºC A003. Oxigênio dissolvido Sonda não inferior a 5,0 mg/L 4,62 mg/L A004. DQO não filtrada Fotometria n.p. 51,5 mg/L A005. DBO-5 Fotometria 5 mg/L n.d. (< 4 mg/L) A007. Cor aparente - U Pt/Co



Gravimetria n.p. 63 mg/L

A015. Arsênio AAS 0,1 mg/L n.d. (<0,0015 mg/L) A018. Nitrogênio total Fotometria n.p. n.d. (< 1 mg/L) A019. Nitrato Fotometria 10 mg/L N-NO3 0,317 mg/L A020. Nitrito Fotometria 1,0 mg/L N-NO2 0,039 mg/L A021. Fósforo total Fotometria n.p. 2,76 mg/L A023. Cianetos - facilmente liberáveis


A024. Sulfato Fotometria/Turbidimetria n.p. 540 mg/L A025. Sulfeto Titulação n.p. n.d. (< 1 mg/L) A026. Alumínio Fotometria n.p. 0,235 mg/L A028-1. Cádmio- AAS AAS 0,01 mg/L n.d (< 0,005 mg/L) A029-2. Cromo total AAS 0,05 mg/L n.d. (< 0,003 mg/L) A031-1. Cobre AAS 1,0 mg/L n.d. (< 0,0015 mg/L) A032. Ferro total Fotometria n.p. 0,820 mg/L A034-1. Chumbo AAS 0,1 mg/L n.d (< 0,005 mg/L) A035. Magnésio Fotometria n.p. 219 mg/L A038-1. Níquel AAS n.p. n.d. (< 0,006 mg/L) A042-1. Zinco AAS 5,0 mg/L n.d. (< 0,02 mg/L) A043. Mercúrio AAS 0,002 mg/L n.d. (< 0,00005 mg/L) A046. Bário AAS 1,0 mg/L n.d. (< 0,5 mg/L) A047. Detergentes aniônicos


A054. Fenóis Fotometria / Destilação 0,001 mg/L n.d. (<0,05 mg/L) A058. Sulfitos Fotometria n.p. 0,100 mg/L A061. Fluoretos Fotometria 1,4 mg/L 0,607 mg/L A062. Óleos e graxas Destilação / Gravimetria virtualmente ausentes 2,0 mg/L A063. Nitrogênio amoniacal


A064. Antimônio AAS n.p. n.d. (<0,005 mg/L) A071. Selênio AAS 0,01 mg/L n.d. (<0,002 mg/L) A072. Sulfeto de Carbono CG 0,005 mg/L 0,015 mg/L

Anexo B – Laudo de análises físico-químicas da Amostra 2


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Resultado



4,0 x 104 / 100mL



1,0 x 104 / 100mL

Observações: Coletor das amostras: Umwelt Amostra turva pela presença de sólidos em suspensão. A metodologia utilizada na obtenção dos resultados segue os padrões publicados no "Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater" - 20th Ed. (1998). Os resultados dos ensaios têm seu valor restrito às amostras ensaiadas no laboratório da UMWELT. n.d. = não detectado, abaixo do limite de detecção n.p. = não previsto no Decreto 14.250 Condições de coleta: Tipo de amostragem: Composta de 24 horas Tipo de coleta: Coletor automático – Cole Parmer Maré: Alta Chuvas nas últimas 48 horas: não Chuvas na hora da coleta: não Temperatura ambiente 22°C


CRB: 28324-03D


Diretor Técnico


99



Cliente: **** Endereço: ***** Piçarras SC


Especificação: Água de Rio Piçarras – Amostra Composta de 24 horas – Conforme Portaria 14258 Localização: S 26° 45’ 707” - O 48° 40’ 974” Número de registro: 846 Início da amostragem: 06/06/2004 Final da amostragem: 07/06/2004 14:30 Data da recepção: 07/06/2004 18:00



Resultado

A001. pH Sonda n.p. 7,37 A002. Temperatura Sonda n.p. 21 ºC A003. Oxigênio dissolvido Sonda não inferior a 5,0 mg/L 5,25 mg/L A004. DQO não filtrada Fotometria n.p. 51 mg/L A005. DBO-5 Fotometria 5 mg/L n.d. (< 4 mg/L) A007. Cor aparente - U Pt/Co



Gravimetria n.p. 26,5 mg/L

A015. Arsênio AAS 0,1 mg/L n.d. (< 0,0015 mg/L) A018. Nitrogênio total Fotometria n.p. n.d. (< 1 mg/L) A019. Nitrato Fotometria 10 mg/L N-NO3 n.d. (<0,23 mg/L) A020. Nitrito Fotometria 1,0 mg/L N-NO2 0,018 mg/L A021. Fósforo total Fotometria n.p. 3,91 mg/L A023. Cianetos - facilmente liberáveis


A024. Sulfato Fotometria/Turbidimetria n.p. 525 mg/L A025. Sulfeto Titulação n.p. n.d. (< 1 mg/L) A026. Alumínio Fotometria n.p. 0,270 mg/L A028-1. Cádmio- AAS AAS 0,01 mg/L n.d (< 0,005 mg/L) A029-2. Cromo total AAS 0,05 mg/L n.d. (< 0,003 mg/L) A031-1. Cobre AAS 1,0 mg/L n.d. (< 0,0015 mg/L) A032. Ferro total Fotometria n.p. 0,677 mg/L A034-1. Chumbo AAS 0,1 mg/L n.d (< 0,005 mg/L) A035. Magnésio Fotometria n.p. 236,3 mg/L A038-1. Níquel AAS n.p. n.d (< 0,006 mg/L) A042-1. Zinco AAS 5,0 mg/L 0,218 mg/L A043. Mercúrio AAS 0,002 mg/L n.d. (< 0,00005 mg/L) A046. Bário AAS 1,0 mg/L n.d. (< 0,5 mg/L) A047. Detergentes aniônicos


A054. Fenóis Fotometria / Destilação 0,001 mg/L n.d. (<0,05 mg/L) A058. Sulfitos Fotometria n.p. n.d. (< 0,1 mg/L) A061. Fluoretos Fotometria 1,4 mg/L 0,681 mg/L A062. Óleos e graxas Destilação / Gravimetria virtualmente ausentes 3,2 mg/L A063. Nitrogênio amoniacal


A064. Antimônio AAS n.p. n.d. (< 0,005 mg/L) A071. Selênio AAS 0,01 mg/L n.d. (< 0,002 mg/L) A072. Sulfeto de Carbono CG 0,005 mg/L n.d. (<0,005 mg/L)

Anexo C – Laudo de análises físico-químicas da Amostra 3


100



Cliente: **** Endereço: ***** Piçarras SC




Resultado



1,5 x 105 / 100mL



3,0 x 104 / 100mL

Observações: Coletor das amostras: Umwelt Amostra turva pela presença de sólidos em suspensão. A metodologia utilizada na obtenção dos resultados segue os padrões publicados no "Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater" - 20th Ed. (1998). Os resultados dos ensaios têm seu valor restrito às amostras ensaiadas no laboratório da UMWELT. n.d. = não detectado, abaixo do limite de detecção n.p. = não previsto no Decreto 14.250 Condições de coleta: Tipo de amostragem: Composta de 24 horas Tipo de coleta: Coletor automático – Cole Parmer Maré: Baixa Chuvas nas últimas 48 horas: não Chuvas na hora da coleta: não Temperatura ambiente 23°C


CRB: 28324-03D


Diretor Técnico

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