1Abril 2016

"Edição de genomas,

direcionamento gênico e

biossegurança"Paulo Lee Ho (paulo.ho@butantan.gov.br)

Diretor

Laboratório Especial de Inovação e Desenvolvimento Industr ial

Insti tuto Butantan

Novas Técnicas de Edição Genética

Engenharia Genética de Precisão:

Metodologias que permitem

a modificação de uma sequência genômica de forma precisa,

específica e sítio dirigida

Potencial infinito, necessidade de uma regulação especial?

Por que?

Etapas

1- Dupla quebra do DNA na região desejada (Double strand breaks, DSB):

a) Junções de extremidades não homólogas ou

b) Recombinação homóloga

2- Junção de extremidades não homólogas (Non-homologous end joining, NHEJ):

Reparo do DNA com propensão a erros Dependendo do que se deseja,

pode ocorrer inserções ou deleções (Indels).

Em geral o gene não fica funcional por problemas de fase de leitura.

3- As tecnologias permitem hoje a substituição e edição de genomas por mecanismo

de recombinação homóloga (Homologous recombination, HR)

O gene fica funcional, ao contrário quando ocorre Indels.

Reparo no DNA por mecanismos não homólogos e homólogos

Zinc finger nucleases

2 domínios: domínio nuclease e domínio de ligação (baseado em fatores de transcrição

com domínio zinc fingers)

Domínio de ligação: - reconhece de forma específica 3 nucleotídios

- construção de "arrays" dos domínios de ligação permite

o reconhecimento específico de sequências

Nuclease Fok I: domínio de ligação ao DNA mais domínio nuclease não específico,

cortando a 9 e 13 nt após sequência de reconhecimento. Ativado por dimerização

TALENs (Transcriptional activators like effectors nucleases)

TALEs são proteínas identificadas em bactérias Xanthomonas que possuem um domínio

de ligação a DNA composto de uma série de repetições de 33-35 aas. Cada repetição de

33-35 aas reconhece um nucleotídio específico. TALENs é um TALE acrescido do domínio

nuclease Fok I.

De Alexandre Lima Nepomucemo, 2015

Edição de genomas por CRISPR-Cas9

Bactéria tem sistema imune adaptativo contra fagos!CRISPR - Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats

Edição de genomas por CRISPR-Cas9

gRNA - RNA guia

crRNA - CRISPR RNA

TracrRNA - Transactivator crRNA

PAM - NGG

Edição de genomas por CRISPR-Cas9

Edição de genomas por CRISPR-Cas9

Cas9

crRNA + tracrRNA + loop = sgRNA, RNA guia

pequeno

Protospacer Adjacent Motif (PAM) sequence

NGG (S. pyogenes)

Uso do Small guide RNA (sgRNA) - quimérico e artificialmente sintetizado

Edição de genomas por CRISPR-Cas9

Glicosilação

Mais comum das modificações pós-

traducionais

Ligação covalente de resíduos de carboidratos

a um polipeptídio

Importância:

Dobramento

Estabilidade

Atividade biológica

Direcionamento celular

Imunogenicidade

VARKI et al.,2009.

Humanização específica do sistema de

glicosilação de P. pastoris

Via normalVia sintética

(humanizada)

Humana Pichia Pichia humanizada

Glucocerebosidase

Ribozimas: RNAs autocatalíticos

Ribozymes

Self-cleavage

Adaptado de Gao and Zhao,

2014.

Genes sintéticos

Módulo 1 = HHR + gRNA alg3 - 5’region + HDV

Módulo 2 = HHR + gRNA alg3 - 3’region + HDV

Módulo 3 = HHR + gRNA och1 - 5’region + HDV

Módulo 4 = HHR + gRNA och1 - 3’region + HDV

PARS: Pichia Autonomous Replication Sequence

deleção de alg1

deleção de och1

Reparo por recombinação homóloga

Necessita de um alto grau de homologia à

sequência imediatamente upstream e downstream

da dupla quebra do DNA

Δalg3, Δoch1 e inserção de genes de resistência

Addgene.

https://www.addgene.org/CRISPR/guide/

Genes sintéticos

Antibiótico

No

t I

Xh

o I

Braço direito de homologiaBraço esquerdo de homologia

1 Kb 1 Kb

Bam

HI

Cla

I

Sn

aBI

Pm

e I

Resumindo...

PYZOCHA et al., 2014; RAN et al., 2013

Potencial

Ilimitado?

Genética de Precisão em Doenças genéticas?

Exemplos:

1) Em indivíduos adultos:

Anemia falciforme

2) Embriões, células reprodutivas

Cancer

Problemas:

- Técnicos: efeitos "off target"

- Morais e éticos (crianças sob encomenda)

A Sociedade deve decidir...

ela está preparada? esclarecida?

decisão técnica x cultural x religiosa

CTNBio

Grupo de Trabalho Novas Tecnologias – Saúde Animal/Humana

Edição de Genomas: O céu é o limite?

PREÂMBULO

Em face das novas tecnologias que estão surgindo nos últimos anos, novas

possibilidades de alterações genéticas poderão ter um impacto no meio ambiente, saúde animal e humana de

forma não prevista.

Assim, justifica-se a criação de Grupos de Trabalho visando discutir e aprofundar os

conhecimentos das novas tecnologias e os seus impactos.

Um documento inicial foi criado pelo Grupo de Trabalho da Setorial Humana e Animalno dia 06 de outubro de 2016. Foi a seguir, apresentado e discutido durante a sessão de trabalho da setorialhumana e animal no dia 07 de outubro de 2016 (com a presença dos membros Paulo Lee Ho, HeidgeFukumasu, Maria Lúcia Zaidan Dagli, Jenifer Saffi, Luciana Cezar de Cerqueira Leite, Anibal Eugênio Vercesi,Nadja Cristhina de Souza Pinto, Rafael Diego da Rosa e dos Assessores Rubens José Nascimento, JacksonMartins de Sousa, Pamella Queiroz Meireles, Allan Edver Mello dos Santos, Fabiano Bonfim Carregaro).Durante a discussão houveram várias sugestões que foram incorporados neste documento/apresentação.

1) O que é um OGM? (Várias definições dependem do entendimento do que é um OGM)

A CTNBio define OGM como sendo um organismo cujo material genético – DNA, RNA – tenha sido

modificado por qualquer técnica de engenharia genética (Decreto 5.591, de 22 de novembro de 2005, Capítulo

1, artigo 3). A Lei 11.105 de 24 de março de 2005 também contribui para o esclarecimento do que seria ou não

um OGM e outras definições importantes:

Art. 3o Para os efeitos desta Lei, considera-se:

I – organismo: toda entidade biológica capaz de reproduzir ou transferir material genético, inclusive vírus e

outras classes que venham a ser conhecidas;

II – ácido desoxirribonucléico - ADN, ácido ribonucléico - ARN: material genético que contém informações

determinantes dos caracteres hereditários transmissíveis à descendência;

III – moléculas de ADN/ARN recombinante: as moléculas manipuladas fora das células vivas mediante a

modificação de segmentos de ADN/ARN natural ou sintético e que possam multiplicar-se em uma célula viva, ou

ainda as moléculas de ADN/ARN resultantes dessa multiplicação; consideram-se também os segmentos de

ADN/ARN sintéticos equivalentes aos de ADN/ARN natural;

IV – engenharia genética: atividade de produção e manipulação de moléculas de ADN/ARN recombinante;

V – organismo geneticamente modificado - OGM: organismo cujo material genético – ADN/ARN

tenha sido modificado por qualquer técnica de engenharia genética;

VI – derivado de OGM: produto obtido de OGM e que não possua capacidade autônoma de replicação ou que não contenha

forma viável de OGM;

VII – célula germinal humana: célula-mãe responsável pela formação de gametas presentes nas glândulas sexuais femininas e

masculinas e suas descendentes diretas em qualquer grau de ploidia;

VIII – clonagem: processo de reprodução assexuada, produzida artificialmente, baseada em um único patrimônio genético,

com ou sem utilização de técnicas de engenharia genética;

IX – clonagem para fins reprodutivos: clonagem com a finalidade de obtenção de um indivíduo;

X – clonagem terapêutica: clonagem com a finalidade de produção de células-tronco embrionárias para utilização terapêutica;

XI – células-tronco embrionárias: células de embrião que apresentam a capacidade de se transformar em células de qualquer

tecido de um organismo.

§ 1o Não se inclui na categoria de OGM o resultante de técnicas que impliquem a introdução direta, num organismo, de

material hereditário, desde que não envolvam a utilização de moléculas de ADN/ARN recombinante ou OGM, inclusive

fecundação in vitro, conjugação, transdução, transformação, indução poliplóide e qualquer outro processo natural.

§ 2o Não se inclui na categoria de derivado de OGM a substância pura, quimicamente definida, obtida por meio de processos

biológicos e que não contenha OGM, proteína heteróloga ou ADN recombinante.

Art. 4o Esta Lei não se aplica quando a modificação genética for obtida por meio das seguintes técnicas, desde que não

impliquem a utilização de OGM como receptor ou doador:

I – mutagênese;

II – formação e utilização de células somáticas de hibridoma animal;

III – fusão celular, inclusive a de protoplasma, de células vegetais, que possa ser produzida mediante métodos tradicionais de

cultivo;

IV – autoclonagem de organismos não-patogênicos que se processe de maneira natural.

Assim, a título de esclarecimento, também entendemos que se houver acréscimo de informação genética extra-

cromossômica obtido por engenharia genética de forma estável, o organismo resultante também deverá ser considerado um OGM.

Processos de terapia gênica ou edição de genoma que resultem na alteração do genótipo, seja ele selvagem ou não, os

indivíduos resultantes deste processo serão considerados OGMs.

Células tronco com pluripotência induzida (iPS) quando oriundas de modificações por engenharia genética serão

considerados OGMs.

Por outro lado, a transferência estável de mitocondria de uma célula para outra célula, a célula resultante não é um

OGM.

Não consideramos um OGM, células que recebam algum material genético que não se perpetue através de gerações ou

não é estável no sistema. Um exemplo disto, seria a introdução transitória e não replicativa de micro RNAs na célula para a obtenção

de um fenótipo de silenciamento gênico. Da mesma maneira, o uso de aptâmeros de ácidos nucléicos em terapias não resultam em

OGMs se não forem estáveis e autoreplicativos.

Fenômenos de epigenética, ainda que induzidos por material genético exógeno de forma não estável, as células

resultantes não são OGMs pois o seu material genético não foi alterado.

As células que receberam o material genético por processos naturais de transferência horizontal de genes não são

considerados OGMs.

Algumas considerações derivadas do conceito de OGM

Novas Tecnologias, conceitos, usos,

consequências e recomendações:

1) Reacão Mutagênica em Cadeia (Mutagenic chain

reaction (MCR)) e Direcionamento Gênico (Gene drive);

2) Biologia Sintética;

3) Ganho ou perda de função (Gain or loss of function).

2) Mutagenic chain reaction e Gene drive (Reação mutagênica em cadeia e direcionamento gênico)

Mutagenic chain reaction (MCR) ou Gene drive (GD) é um processo de edição genômica

que tem por princípio a geração de mutações “autocatalíticas” resultando sempre em homozigose

do alelo editado. Inicialmente, a MCR foi desenvolvido usando o sistema CRISPR-Cas9 (Gantz,VM and

Bier E., The mutagenic chain reaction: A method for converting heterozygous to homozygous

mutations. Science 348: 442-444, 2015; ver comentário de John Bohannon, Science 347: 1300,

2015). No entanto, entendemos que outras tecnologias e estratégias de edição gênica poderão ser

usadas para o mesmo fim, não se restringindo apenas a tecnologia de CRISPR-Cas9, como de Zinc

fingers nucleases (ZFN), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), e outras novas

tecnologias que surjam com o progresso da área como a CRISPR-Cpf1 (Zetsche B et al. Cpf1 Is a

Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System. Cell. 2015 Sep 25. pii: S0092-

8674(15)01200-3. doi: 10.1016/j.cell.2015.09.038).

Como resultado desta tecnologia, o processo de MCR transformará sempre o organismo heterozigoto em homozigoto

Em outras palavras, este OGM quando liberado na natureza e for sexualmente competente, poderá potencialmente ao longo das gerações substituir toda a população pelo fenótipo determinado pelo MCR:

Em função deste potencial, consideramos que o uso desta tecnologia deve ser controlado

de forma estrita e caso a caso, uma vez que tem o potencial de substituir todos os alelos selvagens do

gene em uma população, afetando a biodiversidade da espécie e do bioma.

Para os trabalhos de edição gênica, não recomendamos o sistema de MCR.

No caso de necessidade de uso da tecnologia MCR, recomendamos que sejam adotadas

ações que visem controlar o potencial escape de um OGM resultante. Os controles visando o

confinamento deste OGM não devem ser únicos mas pelo menos a combinação de 2 tipos diferentes

de estratégias de controle (Tabela 1), as quais podem ser em nível molecular, ecológico, reprodutivo

e/ou de barreiras físicas. Maiores detalhes podem ser obtidos em Akbari, OS et al, Safeguarding gene

drive experiments in the laboratory. Science 349: 927-929, 2015 (recomendamos também a leitura do

artigo escrito por Esvelt, KM et al, Concerning RNA-guided gene drives for the alterations of wild

populations. eLife 2014;3e03401, DOI: 10.7554/eLife.03401).

Os controles visando o confinamentodeste OGM não devem ser únicos maspelo menos a combinação de 2 tiposdiferentes de estratégias de controle,as quais podem ser em nívelmolecular, ecológico, reprodutivo e/oude barreiras físicas.

Todas as análises de OGMs que

envolvam MCR ou gene drive deverão

ser feitas pela CTNBio, mesmo sendo

de nível 1 de biosegurança.

OBRIGADO!