Efeito ansiolítico do extrato etanólico de Pluchea ... ALVES_RODRIGUES.pdf · Programa de...

RENORBIO

Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia

Efeito ansiolítico do extrato etanólico de Pluchea sagittalis (Lam.)

Cabrera, Asteraceae, em modelos comportamentais.

Sheyla Alves Rodrigues

São Cristóvão – SE

Setembro – 2011

Rede Nordeste de Biotecnologia – RENORBIO

Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia



Tese apresentada como pré-

requisito para obtenção do título de

Doutor pelo Programa de Pós-

Graduação em Biotecnologia da pela

RENORBIO, Ponto Focal – São

Cristóvão – Sergipe.

Área de concentração: Biotecnologia

em Recursos Naturais.


Orientador: Prof. Dr. Lauro Xavier-Filho

São Cristóvão – SE

Setembro – 2011

FICHA CATALOGRÁFICA

R696e Rodrigues, Sheyla Alves.


Cabrera, asteraceae, em modelos comportamentais. / Sheyla Alves

Rodrigues; orientador Lauro Xavier Filho. – Aracaju, 2011.

104 f.: il.

Inclui bibliografia

Tese apresentada como pré-requisito para obtenção do titulo de

Doutor pelo Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia da rede

nordestina de Biotecnologia RENORBIO, Ponto Focal – São Cristovão –

Sergipe. Area de concentração: Biotecnologia em recursos naturais.

1. Pluchea sagittalis. 2. Ansiolítico. 3. Sono induzido.

4. Anticonvulsivante. 5. Fototerapia. I. Xavier Filho, Lauro (orientador).

II. Titulo

CDU : 615.322.03




Tese apresentada como pré-

requisito para obtenção do título de

Doutor pelo Programa de Pós-

Graduação em Biotecnologia da

RENORBIO, Ponto Focal – UFS –

São Cristóvão – Sergipe.

Área de concentração: Biotecnologia

em Recursos Naturais.

Aprovada em: ____/____/____

_________________________________

Prof. Dr. Lauro Xavier-Filho

(Unit/ITP)

Orientador

________________________________

Prof.ª Maria Estrella Legaz

(UCM/Espanha)

________________________________

Prof.ª Dr.ª Margarete Zanardo Gomes

(UNIT/ITP/Aracaju)

________________________________

Prof. Dr. Charles dos Santos Estevan

(UFS/São Cristóvão)

________________________________

Prof. Dr. Roberto Rodrigues de Souza

(UFS/São Cristóvão)

“Escolhas um trabalho que gostes e não

terás que trabalhar nem um dia em tua vida”

Confúcio

Agradecimentos

A Deus, luz eterna que guia nossas vidas e nos mostra os caminhos nos

momentos de felicidade e de aflição. Glória a Vós, Senhor!

Aos meus pais, Mandaley Alves Rodrigues e João Rodrigues Sobrinho, pelos

ensinamentos, dedicação, carinho e por entender os momentos em que estive

ausente. Agradeço a Deus todos os dias por tê-los em minha vida. À minha avó, por

compreender a distância e ausência em ocasiões especiais. E, claro, ao meu

irmãozinho Jan Kleber, que para mim sempre será aquele azedinho e travesso,

embora hoje mais velho e estressado. Amo vocês!

Ao meu esposo, Francisco Lopes de Sousa Júnior, pelo companheirismo,

compreensão e participação nos vários momentos importantes da minha vida, sempre

me apoiando na tomada de decisões.

Aos meus familiares, tios e primos, minhas desculpas pelos momentos

ausentes e meu muito obrigada por sempre incentivarem a busca por novos caminhos

que me guiaram e fizeram de mim a pessoa que sou hoje. Só vocês sabem como cada

um teve uma participação especial na minha vida.

Ao meu orientador, Lauro Xavier-Filho, pelo estimulo inicial na minha carreira

acadêmica até a confiança a mim atribuída nos dias de hoje. Muito obrigada pelas

portas que foram abertas, pelos ensinamentos e oportunidade.

Aos meus amigos, Sheila Brito, Marcus Bancilon, Juliana Acioli, Shirlene,

Michele, em especial à Cândida Rosa, que através da universidade tive a

oportunidade de conhecer o outro lado de minha prima, e Américo Souza, pelos vários

momentos partilhados, e, claro, como esquecer as madrugadas de trabalho duro para

chegar a essa tese? Todos vocês são inesquecíveis em minha vida!

Às minhas eternas amigas, quase irmãs, Cynthia Pagliari, Synara Alexandre e

Cristiane Soares (claro que Giovana vem no anexo da nova geração!), pelos lindos 12

anos de convivência, quer tenham sido longe ou perto, sempre seremos as mesmas e

poderemos contar umas com as outras.

Ao Instituto de Tecnologia e Pesquisa e à Universidade Tiradentes pelo espaço

concedido, no qual tive a oportunidade de evoluir e chegar à profissional que sou hoje

e de maravilhar-me com pessoas Magníficas como nosso Reitor, Prof. Jouberto Uchoa

de Mendonça, que em seus simples gestos nos mostra que a humildade é um fator

fundamental para ser alguém na vida.

Aos meus queridos alunos, estagiários e mestrandos do LPNB, lembrem que

esse momento na universidade em que vocês se encontram é passageiro, espero que

saibam aproveitar cada ensinamento e oportunidade, pois quero ter a honra de vê-los

como profissionais realizados e reconhecidos em sua carreia.

Aos amigos ex-professores, se é que esse termo existe, pois serão meus

mestres por toda a vida.

Agradeço aos professores Dr. Charles dos Santos Estevan e Dr. Lucindo

Quinstas-Júnior, e Marília Trindade, que abriram as portas dos seus laboratórios na

Universidade Federal de Sergipe e me auxiliaram na realização de alguns

experimentos.

Aos professores, Dr. Carlos Vicente Córdoba e Dr.ª Maria Estrella Legaz, e aos

seus alunos Eva María, Borja e Mara Sacristán, por me acolherem em seu laboratório

na Espanha, transmitindo carinho, amizade e inúmeros ensinamentos. Agradecerei

sempre pela oportunidade concedida.

E, por fim, aos meus coleguinhas de doutorado, Ana Guedes, Plácia Barreto,

Ana Paula Prata, Malone Pinheiro, Isamar Dantas, Marise do Vale, Wanessa Lordelo e

Maxwell Silveira. Finalmente consegui, agora espero por vocês, com menos

ansiedade, pois estou utilizando o chá da minha planta!!!

Muito obrigada a todos!!!


EPÍGRAFE

“Quando a última árvore tiver caído,

...quando o último rio tiver secado,

...quando o último peixe for pescado,

...o homem perceberá que o dinheiro não se come.”

RESUMO

Pluchea sagittalis (Lam.) Cabrera, Asteraceae, é conhecida popularmente como

quitoco, arnica ou erva lucera. Seu caule e folhas são utilizados em infusão para

tratamento de dores corporais, inflamação, dispepsias nervosas e histerismo. O

objetivo desse trabalho foi isolar e identificar os constituintes químicos do extrato

etanólico das folhas de P. sagittalis, verificando o potencial farmacológico desse

extrato, em especial, sobre a ansiedade. A planta foi coletada no Bairro Japãozinho,

Aracaju – SE. As folhas selecionadas foram secas em estufa a 40ºC, com circulação

de ar, trituradas e submetidas à extração com etanol P.A., em soxleht. O extrato obtido

foi fracionado por cromatografia em coluna e analisados em HPLC. O extrato etanólico

e frações: aquosa, etanólica e acetônica obtidas, foram submetidas ao screening

fitoquímico e a triagem farmacológica comportamental, na dose de 100 mg/kg, v.o. A

atividade motora dos animais foi observada nos testes Open Field e Rota Rod. O

efeito hipnótico/sedativo foi avaliado no teste Tempo de Sono Induzido por Barbitúrico

e a atividade ansiolítica verificada no teste de Labirinto em Cruz Elevado e

Anticonvulsivante induzido por Pentilenotetrazol. Nas análises fitoquímicas identificou-

se a presença de fenóis, flavonóides, terpenos e esteróides, sendo isolado um

sesquiterpeno. Na triagem farmacológica comportamental observou-se o potencial

efeito depressor do Sistema Nervoso Central (SNC) de todas as amostras testadas.

No Open Field, verificou-se que os animais tratados com a dose de 200mg/Kg do

extrato etanólico bruto apresentaram aumento no número de quadrantes e tempo de

deslocamento, não sendo observada alteração na coordenação motora ou

relaxamento muscular no Rota Rod. As doses de 100 e 200 mg/Kg demonstraram-se

indutoras e potencializadoras do sono induzido por barbitúrico. A ação ansiolítica foi

observada na dose de 200 mg/Kg no labirinto em cruz elevado. Além do efeito protetor

contra convulsões induzidas por ptentilenotetrazol, das doses de 100 e 200 mg/Kg.

Conclui-se que o extrato etanólica de P. sagittalis ação ansiolítica, sendo possível a

participação de terpenos nesse efeito.

Palavras-chave: Pluchea sagittalis, ansiolítico, sono induzido, anticonvulsivante.

ABSTRACT

Pluchea sagittalis (Lam.) Cabrera, Asteraceae, popularly known as quitoco, arnica,

yerba lucera. Its stem and leaves are used in infusion to treat body pain, inflammation,

nervous dyspepsia and hysteria. The purpose of this study was to isolate and identify

the chemical constituents of the ethanol extract of leaves of P. sagittalis by checking

the pharmacological potential of this extract, in particular on anxiety. The plant was

collected in neighborhood Japãozinho, Aracaju - SE. The selected leaves were dried at

40 ° C with circulating air, ground and subjected to extraction with ethanol PA, soxleht.

The extract was fractionated by column chromatography and analyzed by HPLC. The

ethanol extract and fractions: aqueous, ethanol and acetone obtained were subjected

to phytochemical screening and behavior pharmacological screening at a dose of 100

mg/kg, p.o. The motor activity of animals was found in the Open Field and Rota Rod

test. The potential sedative hypnotic activity was evaluated in Barbiturate Induced

Sleeping Time test. The anxiolytic activity was evaluated in Elevated Plus Maze test

and Anticonvulsivant-induced for Pentilenotetrazol. In phytochemical analysis identified

the presence of phenols, flavonoids, terpenes and steroids, was isolated a

sesquiterpene. Pharmacological behavioral screening showed the potential depressant

effect on the central nervous system (CNS) of all samples tested. In the Open Field, it

was found that animals treated with a dose of 200 mg of crude ethanolic extract

showed an increase in the number of walks and time shifting, with no observed change

in motor coordination or muscle relaxation in Rota Rod doses 100 and 200 mg/kg

proved to be inducing and potentiating barbiturate-induced sleep. The anxiolytic action

was observed at a dose of 200 mg / kg in the labyrinth crux high. In addition to the

protective effect against seizures induced by ptentilenotetrazol, doses of 100 and 200

mg/kg. It is concluded that the ethanolic extract of P. sagittalis presents anxiolytic

action, with the possible participation of terpenes in this effect.

Keywords: Pluchea sagittalis, anxiolytic, induced sleep, anticonvulsivant.

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1: Pluchea sagittalis (Lam.) Cabrera 32

FIGURA 2: Aparelho de campo aberto “Open Field” 45

FIGURA 3: Aparelho de Rotarod 46

FIGURA 4: Aparelho do teste de labirinto em cruz elevado 47

FIGURA 5: Avaliação motora, em camundongos previamente tratados com o

extrato etanólico das folhas de P. sagittalis

53

LISTA DE TABELA

TABELA 1: Condições de realização das análises em HPLC 40

TABELA 2: Prospecção Fitoquímica de Pluchea sagittalis (Lam.) Cabrera,

na forma de extrato etanólico bruto (EEB) e suas respectivas frações aquosa

(Faq), etanólica (FEt) e acetônica (FAc)

49

TABELA 3: Tabela comparativa com tempo de retenção (T. Ret.) e

quantidade de área, dos picos determinados por HPLC separados por

diferentes misturas de solventes

50

TABELA 4: Alterações comportamentais observadas após administração do

extrato etanólico bruto e respectivas frações aquoso, etanólica e aquosa das

folhas de P. sagittalis. no teste de triagem farmacológica comportamental

51

TABELA 5: Efeito da administração do extrato etanólico bruto de P. sagittalis

no teste de campo aberto

52

TABELA 6: Efeito da administração do extrato etanólico bruto de P.

sagittalis, no teste de tempo de sono induzido por pentobarbital

54


no teste de labirinto em cruz elevado

55


no teste anticonvulsivante induzido por pentilenotetrazol

55

SUMÁRIO

1. Introdução 13

2. Revisão da Literatura 16

2.1. Transtorno de ansiedade 16

2.2. Tratamento do transtorno de ansiedade 18

2.3. Plantas Medicinais: Breve Histórico 21

2.4. Fitoterapia 25

2.5. O gênero Pluchea Cass. 29

2.6. Pluchea sagittalis (Lam.) Cabrera e sua ação farmacológica 31

3. Objetivos 36

4. Metodologia 37

4.1. Material botânico 37

4.2. Fracionamento do extrato etanólico 37

4.3. Prospecção fitoquímica 38

4.4. Isolamento dos compostos químicos do extrato etanólico 39

4.5. Condições de realização da análise em HPLC 40

4.6. Extração de fenóis totais 41

4.7. Identificação de Stigmasterol e β-amirina no extrato etanólico de P. sagittalis

41

4.8. Cromatografia em coluna (CC) e cromatografia em camada delgada (CCD)

42

4.9. Análise dos compostos por RMN 42

4.10. Ensaios comportamentais com animais 42

4.10.1. Animais 42

4.10.2. Preparação das amostras 43

4.10.3. “Screening” farmacológico comportamental 43

4.10.4. Teste de Campo Aberto 44

4.10.5. Teste de Rota Rod 45

4.10.6. Teste tempo de sono induzido por barbitúrico 46

4.10.7. Teste de labirinto em cruz elevado 46

4.10.8. Teste anticonvulsivante induzido por pentilenotetrazol 47

4.11. Análise estatística 48

5. Resultados 48

5.1. Caracterização química do extrato etanólico de P. sagittalis 48

5.2. Ensaios comportamentais com animais 51

6. Discussão 56

7. Conclusão 61

8. Referências 62

9. Anexos 75

Efeito ansiolítico do extrato etanólico de Pluchea sagittalis (Lam.) Cabrera, Asteraceae, em modelos comportamentais

13

1. Introdução

Os distúrbios da ansiedade, especialmente a ansiedade generalizada, os

distúrbios do pânico, o transtorno obsessivo-compulsivo, as fobias ou o estresse pós-

traumático, são os tipos mais comuns de transtornos mentais na sociedade atual

(RABBANI et al., 2007). O transtorno de ansiedade generalizada (TAG) está entre os

distúrbios mentais mais frequentemente encontrados na clínica (SCHWEIZER et al.,

1995).

Esse tipo de transtorno apresenta-se como um importante problema de saúde

pública, visto que é o segundo transtorno mais prevalente em locais de assistência à

saúde pública, representando cerca 11,5% dos atendimentos (GONÇALVES;

KAPCZINSKI, 2008). Avalia-se que o TAG é uma doença crônica, associado a uma

morbidade relativamente alta, com altos custos individuais e sociais (SCHWEIZER et

al., 1995).

Os benzodiazepínicos (BDZs) correspondem ao primeiro grupo de fármacos

extensivamente utilizados nos últimos 45 anos para tratar as diversas formas de

ansiedade, sendo, até pouco tempo, a única alternativa (RABBANI et al., 2007).

Atualmente, no Brasil, outro fármaco também tem sido utilizado, a buspirona,

pertencente ao grupo das azapirona (azaspirona, azaperona ou azaspirodecanodiona).

Este medicamento não só é considerado ineficaz em alguns casos, como também

apresenta uma demora variável na observação do seu efeito (FAUSTINO et al., 2010).

O uso constante de BDZs no tratamento das TAGs, tem demonstrado efeitos

colaterais inconvenientes, incluindo sedação, relaxamento muscular, amnésia,

dependência física, síndrome de abstinência e interações com agentes depressores

do sistema nervoso central (SOUSA et al., 2008), levando ao uso de plantas

medicinais como terapia complementar no tratamento da ansiedade (ERNST, 2006).


14

Com o objetivo de reduzir a carência de informações científicas sobre plantas

medicinais utilizadas popularmente, pesquisadores de várias áreas de conhecimento,

como a botânica, a química e a farmacologia, trabalharam em equipes

multidisciplinares, com o apoio da Organização Mundial da Saúde (OMS), na intenção

de melhorar as condições de qualidade, eficácia e segurança desses medicamentos à

base dessas plantas (SOARES et al., 2006).

As plantas medicinais são, frequentemente, apresentadas como um grande

potencial para a origem de novos fármacos (CRAGG et al., 1997), sendo consideradas

a maior fonte de novas substâncias bioativas, cuja as atividades variam desde

antimicrobianos, antiinflamatórios até substâncias antitumorais, muitas vezes utilizadas

nas sociedades como complementares à medicina tradicional (VENDRUSCOLO;

MENTZ, 2006).

Entre as vantagens da utilização de espécies vegetais como fonte de

desenvolvimento de novos fármacos, destaca-se a possibilidade de estudar

mecanismos de ação ou receptores, ainda que estes não sejam conhecidos

(FAUSTINO et al., 2010).

A biodiversidade biológica brasileira é considerada uma das mais importantes

do mundo, embora estejam limitadas às ações realizadas que visam a sua

preservação. Em 1987, Hedberg expunha, metaforicamente, que a cada curandeiro

tradicional que morre, uma grande biblioteca entra em chamas (VENDRUSCOLO;

MENTZ, 2006).

Resguardar a sabedoria popular é de fundamental importância para a obtenção

de informações decisivas para a descrição científica das propriedades terapêuticas de

plantas medicinais que podem resultar na origem de novos fármacos. Tendo em vista

ainda à valorização de medicamentos a base de plantas, que em 2002 movimentou

cerca de 20 a 40 bilhões de dólares, apenas com a comercialização de fitoterápicos

pelo mercado farmacêutico mundial (PERECIN et al., 2002).


15

Pluchea sagittalis (Lam.) Cabreira é indicada no tratamento de dores, distúrbios

gástricos, dispepsias nervosas e histerismo. Atualmente, o conhecimento científico

sobre as ações farmacológicas desta planta, relacionam-se principalmente à atividade

anti-inflamatória, analgésica, carminativa estomática, antioxidante e anti-tumoral

(LORENZI; MATOS, 2002).

Estudos farmacológicos da P. sagittalis demonstraram a atividade anti-

prolifrativa em células tumorais humanas (MONKS et al., 2002), a contribuição do

mecanismo antioxidante na atividade anti-inflamatória (PÉREZ-GARCÍA et al., 1996), a

inibição da expressão da proteína hsp72 em neutrófilos humanos (PÉREZ-GARCÍA et

al., 2001), além dos efeitos analgésico e depressor central (RODRIGUES, 2007). O

extrato etanólico da planta apresentou ação sobre a hematopoiese, durante infecção

bacteriana induzida (QUEIROZ et al., 2000), atividade anti-inflamatória e anti-

nociceptiva na dor induzida (BARROS et al., 2006), além da gastroproteção em

animais tratados com o extrato e submetidos a lesão por etanol (FIGUEREDO et al.,

2011).

Com base no exposto, esse trabalho objetivou não só isolar e identificar os

principais constituintes químicos do extrato etanólico das folhas de Pluchea sagittalis

(Lam.) Cabrera, como também avaliar a atividade ansiolítica desse extrato em

modelos comportamentais.


16

2. Revisão da Literatura

2.1. Transtorno de ansiedade

De acordo com o “Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders”, o

transtorno de ansiedade corresponde ao estado de preocupação exacerbado, que

pode abranger diversas atividades ou eventos da vida do indivíduo. Pode ser

caracterizado como crônico quando ocorre na maior parte dos dias da vida de um

indivíduo, em um período médio de seis meses (AMERICAN PSYCHIATRIC

ASSOCIATION, 2002).

O transtorno de ansiedade generalizada (TAG) é avaliado como um dos

distúrbios mentais de maior frequência clínica. Embora descrito como um transtorno

leve, atualmente se avalia que o TAG é uma doença crônica, associado a uma

morbidade relativamente alta, acarretando altos custos individuais e sociais

(SCHWEIZER et al., 1995).

Os diferentes tipos de transtornos de ansiedade caracterizam-se pela presença

de sintomas de ansiedade crônicos, clinicamente significativos e constituem o grupo

mais prevalente dentre os transtornos psiquiátricos. Como exemplos, temos a

ansiedade generalizada, o distúrbios do pânico, o transtorno obsessivo-compulsivo, as

fobias e o stress pós-traumático, que são caracterizadas como algumas das doenças

mais comuns da sociedade moderna (RABBANI et al, 2007).

O impacto das TAGs, no sistema de saúde, relaciona-se aos gastos com o

tratamento e com a busca frequente por atendimento médico, em decorrência de

sintomas físicos resultantes do quadro de ansiedade. Pacientes portadores desses

transtornos apresentam redução significativa da qualidade de vida como: menor

produtividade, maior morbidade e mortalidade, e maiores taxas de co-morbidade. Vale


17

ressaltar que, em muitos casos, ocorrem subdiagnósticos, agravando o

desenvolvimento da doença (BYSTRISKY, 2006).

Insônia é uma das queixas de sono mais frequentes na população em geral,

com uma prevalência que pode chegar a 60% do valor amostral. Indivíduos que

relataram sono perturbado estão mais propensos a desenvolverem problemas

emocionais e problemas de saúde recorrentes. Pesquisas têm demonstrado que a

privação do sono gera um grande impacto na vida diária de indivíduos saudáveis,

afetando o estado de alerta, atenção, concentração, habilidades cognitivas, de

memória, humor e dor (KIM et al., 2007).

A compreensão dos mecanismos relacionados aos transtornos de ansiedade

apresenta alguns limites, em decorrência de ser um conceito que descreve um estado

subjetivo e considerado como uma característica humana. Entretanto, nos últimos

anos, vários modelos animais de ansiedade têm sido validados farmacologicamente

usando os ansiolíticos clássicos (benzodiazepínicos). Além disso, esses agentes têm

sido usados como padrão de comparação com novas drogas, propostas como efetivas

para controle da ansiedade (ANDREATINI et al., 2001).

Modelos animais de ansiedade vêm sendo utilizados na investigação não só

pré-clínica, para a seleção de novos fármacos com potencial terapêutico no tratamento

dos transtornos de ansiedade, como também na investigação de seus respectivos

mecanismos de ação, ou ainda para testar hipóteses sobre a fisiopatologia desses

transtornos (GRAEFF; ZANGROSSI, 2002).

Por serem menos práticos, de custo elevado, e, sobretudo, por limites éticos,

os experimentos que induzem ansiedade ou emoções correlatas em seres humanos

são pouco realizados. Contudo, alguns autores apontam a importância desses

experimentos não só para a diferenciação terapêutica dos tipos de transtornos de

ansiedade, como também para a pesquisa básica (em animais) e testes terapêuticos

conduzidos em pacientes (GRAEFF, 2007).


18

2.2. Tratamento do transtorno de ansiedade

Várias substâncias são conhecidas por sua ação sobre o SNC. Dentre elas

destacam-se dois grupos: os sintéticos, a exemplo da anfetamina e

benzodiazepínicos; e os naturais, como a cafeína, a morfina e o canabinol, que

possuem efeito analgésico. Muitas drogas de origem natural agem sobre o SNC, em

receptores específicos, modulando a transmissão sináptica e produzindo sensações

como sedação, hipnose, analgesia e alívio da ansiedade (KATZUNG, 2003 apud

RESENDE, 2004).

As substâncias de ação depressora caracterizam-se por proporcionarem uma

diminuição na atividade do sistema nervoso central, apresentando como

consequências sinais e sintomas de sonolência, lentidão psicomotora, entre outras.

Algumas dessas substâncias são de extrema importância em medicamentos para o

tratamento de patologias como epilepsia, insônia e transtornos de ansiedade, a

exemplo dos benzodiazepínicos e dos barbitúricos (CARLINI et al., 2001).

A ação de drogas ansiolíticas pode envolver mecanismos de bloqueio da dor,

principalmente quando esta acontece por via do SNC. São descritas duas vias: a

aferente, quando os mecanismos inibitórios do sistema podem estar diretamente

relacionados à liberação de neurotransmissores, no contato entre os neurônios na

medula espinal; e a via descendente, através de mediadores como serotonina e

encefalina ou estimulação adrenérgica. O balanço entre excitação e inibição é

influenciado pela agilidade do neurônio em levar a informação ao SNC. O bloqueio

farmacológico dos mediadores GABA e Glicina, produz inibição da liberação desses

neurotransmissores, provocando uma dor similar à neuropática (WOOLF, 2004).

Do ponto de vista farmacológico, os transtornos de ansiedade são classificados

em dois estados neurobiológicos distintos, diferenciados pela resposta aos fármacos:

o TAG e a ansiedade são aliviados utilizando doses relativamente baixas de

ansiolíticos benzodiazepínicos (BZDs). Enquanto o transtorno do pânico (TP) e o


19

transtorno de ansiedade social (TAS) respondem melhor aos tratamentos prolongados

com antidepressivos (GRAEFF, 2007).

Antidepressivos tricíclicos utilizados no tratamento do transtorno de ansiedade

agem em nível pré-sináptico, bloqueando a recaptura de monoaminas, principalmente

norepinefrina (NE), serotonina (5-HT) e, em menor proporção, dopamina (DA). Essas

aminas terciárias inibem, preferencialmente, a recaptura de 5-HT e, secundárias, a de

NE. Contudo, a depender do sistema neurotransmissor envolvido na atividade pós-

sináptica, podem ser observados diferentes efeitos colaterais como: boca seca,

retenção urinária (anticolinérgicos), sedação, náusea (histaminérgicos), tremores,

taquicardia e tontura (alfa-1-adrenérgicos) (MORENO et al., 1999).

Dentre as substâncias empregadas no tratamento de transtornos de ansiedade

generalizada, os benzodiazepínicos (a exemplo do diazepan e clonazepan) são

considerados o grupo de fármacos mais importantes. Entre os efeitos produzidos

sobre o organismo, pode-se observar a depressão da atividade do Sistema Nervoso

Central (SNC), caracterizando a diminuição da ansiedade, indução do sono,

relaxamento muscular e redução do estado de alerta. Além desses efeitos, observa-se

também uma redução nos processos de aprendizagem e memória que, para algumas

substâncias, correspondem ao aspecto prejudicial de sua utilização (CARLINI et al,

2001).

A necessidade de tratamento prolongado é considerada um dos maiores

problemas na terapêutica das TAGs. A preocupação com o uso de benzodiazepínicos

está associada aos riscos de abuso, dependência, sedação e amnésia que essa droga

provoca (ANDREATINI et al., 2001, SOUZA et al., 2008).

Já a buspirona apresenta limites de eficácia e início tardio da ação, quando

comparada a outros tratamentos (SCHMITT et al., 2005).


20

Os antidepressivos utilizados, como a venlafaxina, a paroxetina e a imipramina,

tendem a provocar disfunção sexual e redução da geração de memória, apresentando

alta incidência de não-adesão ao tratamento (FAUSTINO et al., 2010).

Devido aos efeitos adversos desses medicamentos, aproximadamente 43%

dos pacientes utilizam terapias complementares no tratamento da ansiedade, a

exemplo das plantas medicinais (ERNST, 2006).

As plantas medicinais têm despertado grande interesse na pesquisa científica,

uma vez que algumas substâncias têm demonstrado potencial ansiolítico, atuando

através de mecanismos diferentes de drogas convencionais benzodiazepínicas, na

busca por alternativas que provoquem menos efeitos colaterais.

Algumas das plantas utilizadas no tratamento de transtornos de ansiedade são,

por exemplo, a Piper methysticum (kava-kava), a Passiflora incarnata, a Valeriana

officinalis, a Ginkgo biloba, a Galpinia glauca e a Matricaria recutita (camomila)

(FAUSTINO et al., 2010).

Nas duas últimas décadas, um número crescente de estudos vem sendo

realizado para avaliar a atividade farmacológica de plantas medicinais. Contudo, a

maior parte desses estudos tem caracterizado plantas candidatas a futuras

investigações por seu potencial ansiolítico, sendo observada a necessidade do

reconhecimento dos mecanismos de ação, assim como das substâncias responsável

por seus efeitos (SOUZA et al., 2008).

Para realização de estudos com plantas medicinais em modelos

comportamentais é necessária a padronização da extração para garantir a

uniformidade de composição de extrato. A realização de estudos pré-clínicos, em

modelos animais de ansiedade ou depressão deve seguir ensaios controlados e

randomizados (RIBEIRO, 2000). Modelos animais de ansiedade devem reproduzir

características comportamentais e patológicas da síndrome de ansiedade, permitir a


21

investigação de mecanismos neurobiológicos que não são facilmente estudados no

homem, permitir avaliação confiável de agentes ansiolíticos, assim como identificar

efeitos ansiogênicos de drogas e toxinas. Nos vários modelos de ansiedade os

bezodiazepínicos (BDZ) são utilizados como droga padrão, sendo utilizado na

validação de vários desses modelos, especialmente por sua ação sobre os receptores

GABAa (ANDREATINI et al., 2001).

2.3. Plantas Medicinais: Breve Histórico

Desde épocas remotas, as plantas medicinais desempenham um importante

papel na humanidade. Registros da medicina demonstram que os povos egípcios,

persas, hebraicos, hindus e chineses utilizavam ervas para a cura de quase todos os

tipos de enfermidades, conhecendo seus benefícios e malefícios através de relatos de

determinadas plantas com capacidade de matar se utilizadas de forma errada

(VIEIRA, 2001).

Os hindus e chineses foram os primeiros povos a utilizarem o poder curativo

das plantas. Esse conhecimento foi disseminado há 3.000 a.C. pelo Imperador Chinês

Cho-Chein-Kei, que estimulou o cultivo delas. Em cerca de 2.300 a.C., os egípcios não

só cultivavam algumas espécies e fabricavam purgantes e vermífugos, como também

foram os primeiros a introduzirem os conhecimentos das ervas na Escola de Medicina.

Na Grécia Antiga, Hipócrates passou a tratar as enfermidades com ervas medicinais,

utilizando os efeitos do calor tóxico e terapêutico de muitas plantas (MELLO; XAVIER-

FILHO, 2000).

Na Idade Antiga, dentre todas as coletâneas referentes ao uso de plantas

medicinais, a que mais teve destaque foi a História Natural escrita por “Gaius Plinius


22

Secundus”, de Roma. Nesta coletânea, encontram-se várias notas de plantas usadas

em rituais místicos, lendas e superstições (LOW; ROOD; BERESFORD, 1999).

Em 78 d.C., o botânico grego Pedanios Dioscorides descreveu cerca de 600

plantas medicinais, além de produtos minerais e animais no tratado De Materia

Medica. Este tratado permaneceu como fonte de referência por mais de catorze

séculos (TYLER, 1996).

No século XVI, o médico suíço Philippus Aureolus Theophrastus Bombastus

von Hohenheim, conhecido como Paracelsus (1493-1541), formulou a “Teoria das

Assinaturas”, baseada no provérbio latim similia similibus curantur, “semelhante cura

semelhante”. Esta teoria provava que a forma, a cor, o sabor e o odor das plantas

estavam relacionados com as suas propriedades terapêuticas, podendo dar indícios

de seu uso clínico. Algumas destas plantas passaram a fazer parte das farmacopéias

alopáticas e homeopáticas a partir do século XIX, quando se começou a investigar

suas bases terapêuticas (ELVIN-LEWIS, 2001).

O processo cultural de utilização das plantas medicinais, na prevenção e cura

de enfermidades, é baseada na troca de conhecimentos entre diferentes culturas e da

transmissão desses conhecimentos por ancestrais. Esta é uma utilização empírica,

sem base científica, mas que faz parte de um conjunto de princípios dos povos que as

utilizam (MELLO; XAVIER-FILHO, 2000).

Mas, mesmo sendo uma prática antiga, a utilização de plantas medicinais nem

sempre está relacionada à cura de enfermidades. Plantas como a mirra, por exemplo,

já foi muito utilizada em cerimoniais religiosos nos quais, segundo relatos, elas eram

capazes de exercer contato entre os homens e os deuses. Atualmente, há rituais de

limpeza do espírito como o ayuaska, no qual os membros fazem ingestão de um chá

de raízes e folhas de plantas da Floresta Amazônica (RODRIGUES, 2007).


23

A utilização de plantas, com finalidades medicinais, pelo homem, corresponde

a uma das práticas mais antigas de tratamento de enfermidades de todos os tipos,

hábito presente há muitos séculos na história da humanidade (MORAES; SANTANA,

2001).

No Brasil, devido à sua biodiversidade, à tradição na utilização de plantas

medicinais e à deficiência dos serviços de saúde públicos, a aplicação da medicina

natural como alternativa terapêutica, abrange toda sua extensão territorial. As formas

mais divulgadas dessa utilização são os chás, infusões, banhos, pomadas, entre

outros, manipuladas, muitas vezes, por raizeiros, que associam determinadas plantas

à cura de certas enfermidades, baseados no conhecimento empírico passado de

geração a geração (SOUZA et al., 2004).

A partir do conhecimento e do uso popular, as plantas não só passaram a ser

observadas como uma rica fonte de compostos bioativos para indústria farmacêutica,

com substâncias diversificadas e de amplo potencial biológico, como também

passaram a fazer parte do nosso cotidiano, mesmo de forma indireta, a exemplo dos

salicilatos e digitálicos, medicamentos muito utilizados na medicina tradicional,

(BOTSARIS; MACHADO, 1999).

O isolamento da morfina da Papaver somniferum, em 1803, pelo farmacêutico

Friedrich Wilhelm Adam Sertürner, marcou o início do processo de extração de

princípios ativos de plantas. A partir de então, outras substâncias foram isoladas,

como, por exemplo, a quinina e a quinidina, obtidas da Cinchona spp, em 1819, e a

atropina da Atropa belladona, em 1831, que passaram a ser utilizadas em substituição

aos extratos vegetais (SCHULZ, HÄNSEL, TYLER, 2001).

Independe do grupo cultural ou étnico, as plantas medicinais são amplamente

utilizadas nas sociedades como recurso terapêutico, sendo empregadas como forma

alternativa ou complementar da medicina tradicional. Isso implica na necessidade de

valorização dos diferentes conhecimentos populares, assim como na importância da


24

comprovação científica das aplicações atribuídas a elas (VENDRUSCOLO; MENTZ,

2006).

Ao longo do Século XX, as pesquisas químicas e farmacêuticas possibilitaram

a descoberta de compostos que permitiram o alívio para vários males que assolaram a

humanidade por séculos, tais como: a tuberculose, a sífilis, o câncer e a hanseníase.

Também foi possível o tratamento de enfermidades do mundo moderno como

cardiopatia, viroses, depressão e ansiedade.

Entretanto, a oferta de medicamentos alopáticos não resolveu os problemas de

saúde da maior parte da população (VEIGA-JÚNIOR, 2008). Em vários países do

mundo, a maioria das pessoas não possui acesso à assistência básica. Para elas, as

terapias alternativas são as principais formas de tratamento, sendo as plantas

medicinais a principal fonte de medicamentos (VENDRUSCOLO et al., 2005; CARLINI

et al., 2006; AGRA et al., 2007; BIAVATTI et al., 2007).

Embora existam fatos descritos na história sobre o uso de plantas, ou mesmo

animais, em atividades psicofarmacológicas, não há exatidão de quando os homens

descobriram o poder curativo desses recursos, podendo ter ocorrido desde a evolução

deles como bípedes. Sabe-se, porém, que os primeiros registros datam da idade

antiga, pelos egípcios, como o uso de atropina extraída do meimendro (ALMEIDA,

2006; RAVEN, 2003).

Carlini et al (2001) relata que algumas plantas, com efeito psicoativo,

apresentam, como consequência do uso contínuo, a dependência do organismo pela

substância. Sabe-se que a Cannabis sativa L., historicamente utilizada pelos incas

durante os períodos de caçada, apresenta sustâncias ativas sobre o SNC, tais como: o

alcalóide canabinol e THC (Delta-9-tetraidrocanabinol).

No Brasil, a utilização de plantas medicinais está relacionada aos vários

aspectos como diversidade, hábitos, tradições e costumes, que precisam ser


25

incorporados e respeitados no cotidiano. O conhecimento e uso dessas plantas têm

sido estimados baseando-se em algumas variáveis sociais. Entretanto, para uma

utilização segura das plantas medicinais no tratamento de enfermidades, faz-se

necessário levar em consideração a sua eficácia, o baixo risco de uso, assim como

reprodutibilidade e constância de sua qualidade (ARNOUS et al., 2005).

O aproveitamento adequado dos princípios ativos de uma planta medicinal

exige o preparo correto, ou seja, atenção a cada parte a ser usada, o grupo de

princípio ativo que se deseja extrair ou doença a ser tratada. Para isso, existem formas

de preparo e uso mais adequados para cada planta (ARNOUS et al., 2005). Porém,

vale ressaltar que o uso indiscriminado de plantas medicinais pela população tem

levantado o interesse da ciência, principalmente na intenção de desmistificar alguns de

seus efeitos e comprovar suas indicações (OLIVEIRA et al., 2008).

2.4. Fitoterapia

A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que 80% da humanidade não

têm acesso ao atendimento primário de saúde, por estarem muito distantes dos

centros de saúde ou por não possuírem recursos para adquirir os medicamentos

prescritos (VEIGA-JÚNIOR, 2008). A maior parte dessas pessoas encontra-se nos

países subdesenvolvidos ou em desenvolvimento, e a utilização de plantas medicinais

corresponde a melhor alternativa terapêutica (BORGES et al., 2006). Se os países

mais pobres utilizam as plantas medicinais por tradição e ausência de alternativas

econômicas viáveis, nos países mais desenvolvidos observa-se um maior uso de

fitomedicamentos, influenciado por modismos de consumo de produtos naturais

(VEIGA-JÚNIOR et al., 2005).


26

O modismo, associado às promessas de cura de males da modernidade, tais

como: impotência, obesidade e ansiedade, fez com que a utilização das plantas

medicinais fosse difundida entre diferentes sociedades. Contudo, nesta época, surgiu

o conceito de que as plantas medicinais não representam quaisquer riscos para a

saúde humana (VEIGA-JÚNIOR, 2008).

A crença de que medicamentos à base de plantas são isentos de riscos à

saúde faz parte da bagagem cultural da população afeita ao seu uso. No entanto, o

caráter "natural" de tais produtos não é garantia da isenção de reações adversas e

outros problemas decorrentes de tal medicina (LANINI et al., 2009).

A crença de que "o que vem da terra não faz mal", diretamente relacionada à

utilização das plantas medicinais, vem sendo desmentida cientificamente por

pesquisadores há vários anos, em muitos países (MARLIÉRE et al., 2008; SILVEIRA

et al., 2008).

Os principais fatores que corroboram para este fato são: a falta de informações

adequadas sobre as propriedades das plantas medicinais, seu consumo associado

aos medicamentos tradicionais (alopáticos), à perda do conhecimento sobre os efeitos

medicinais e tóxicos das plantas, à identificação inadequada da espécie vegetal e à

automedicação (ALBUQUERQUE; HANAZAKI, 2006).

Com a ampliação do conhecimento científico sobre as plantas, surge a

fitoterapia. Termo de origem grega Phyton, que significa planta, e Terapeía, que

significa terapia. Esse termo foi utilizado pela primeira vez pelo médico francês Henri

Leclerc (1870-1955), sendo conceituada como: “fitoterapia é a ciência que se ocupa do

emprego do medicamento vegetal para a cura de enfermidades humanas e animais”.

Suas experiências foram registradas no livro “Lineamento di Fitoterapia”, que se tornou

um clássico na medicina (WEISS, 1991).


27

A fitoterapia permite que o ser humano se reconecte com o ambiente,

acessando o poder da natureza, para ajudar o organismo a normalizar funções

fisiológicas prejudicadas, restaurar a imunidade enfraquecida, promover a

desintoxicação e o rejuvenescimento (FRANÇA et al., 2008).

São genericamente denominados fitoterápicos todos os medicamentos

originados de plantas, voltados à ação terapêutica a partir de princípios biologicamente

ativos. Em 1997, no Brasil, já se registrava a comercialização de vários medicamentos

fitoterápicos com origem em extratos de plantas, compostos isolados ou mesmo a

parte da planta triturada, com ações anti-depressora, analgésica, vasodilatadora, anti-

inflamatória, calmante, entre outras (VAZ; MATA; CALIXTO, 1997).

O avanço dos medicamentos fitoterápicos caracteriza-se pela busca de

produção em escala industrial, diferentemente das formas artesanais que

caracterizaram os estágios iniciais de sua utilização (TUROLLA; NASCIMENTO,

2006). Estima-se que cerca de 60% dos fármacos com atividades antitumorais e

antimicrobianas, já comercializados ou em fase de pesquisa clínica, sejam de origem

natural (SHU, 1998).

A problemática do consumo de fitoterápicos está relacionada à automedicação,

particularmente preocupante quando é realizada em conjunto com outros

medicamentos, podendo levar a efeitos sinérgicos e interações não esperadas pelo

médico (VEIGA-JÚNIOR, 2008). Nesse contexto, diversos estudos realizados com

fitoterápicos comerciais demonstraram provocar complicações cardíacas, hepáticas,

renais, hematológicas e intestinais (LANINI et al., 2009). Deve-se ressaltar que, tanto a

planta medicinal, quanto os produtos de sua biotransformação são agentes

xenobióticos, sendo caracterizados como potencialmente tóxicos. Seus efeitos não

ocorrem somente de forma imediata ou ao longo do tempo, podendo desencadear

quadros de assintomáticos (DE SMET, 2004).


28

Relatos da literatura enfocam a susceptibilidade dos fitoterápicos não só à

contaminação fúngica durante o processo de plantio e colheita, como também à

contaminação secundária durante a manipulação e o armazenamento inadequado

destes produtos (SOUZA et al., 2006). Os chás de ervas vendidos em farmácias

podem ser fonte de intoxicação por vírus, bactérias e fungos contaminantes, pois não

existem estudos de segurança, eficácia e qualidade de grande maioria das plantas

(ROCHA et al., 2004).

Diante da grande importância dos medicamentos fitoterápicos na sociedade,

vários países europeus buscaram unificar a legislação referente a esses

medicamentos amplamente comercializados. Enquanto nos Estados Unidos as

preparações à base de plantas são classificadas como suplementos nutricionais, não

sendo necessário submeter dados de segurança e eficácia ao Food and Drug

Administration (FDA) para a comercialização destes produtos (TUROLLA;

NASCIMENTO, 2006).

Esta preocupação das autoridades regulatórias com a normatização dos

medicamentos fitoterápicos propicia a avaliação de aspectos importantes, como a

eficácia e segurança do uso destes medicamentos. O uso tradicional de diversas

plantas medicinais baseado em conhecimentos populares, aliado à crença de que, por

ser natural não causa reações adversas, fez com que poucas plantas medicinais

fossem avaliadas através de estudos pré-clínicos e clínicos, a fim de comprovar sua

eficácia e segurança (CARVALHO et al., 2008). Dessa forma, as drogas vegetais são

caracterizadas como a planta medicinal ou suas partes, após processo de coleta,

estabilização e secagem, podendo ser íntegra, rasurada, triturada ou pulverizada

(BRASIL, 2004).

Com o crescimento do uso de fitoterápicos no Brasil, a partir do século XIX,

criou-se a Portaria nº22, editada em 30/10/1967, elaborada pelo Ministério da Saúde,

pelo já extinto Serviço Nacional de Fiscalização da Medicina e da Farmácia, que


29

estabeleceu as primeiras normas para emprego de preparações fitoterpápicas. Essa

portaria foi substituída pela Portaria nº 6, de 31 de janeiro de 1995, da ANVISA, e

renovada pela Resolução RDC nº 17, de 24 de fevereiro de 2000 (CARNINI, 2009a).

A legislação brasileira para medicamentos fitoterápicos sofreu algumas

modificações nos últimos anos. A Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA)

vem elaborando normas para a regulamentação destes medicamentos, desde a

Portaria n. 6 de 1995, que estabeleceu prazos para que as indústrias farmacêuticas

apresentassem dados de eficácia e segurança dos medicamentos fitoterápicos,

passando pela RDC n. 17 de 2000, e a Resolução RDC n. 48 de 16 de março de 2004,

atualmente em vigor, que dispõe sobre o registro de medicamentos fitoterápicos

(TUROLLA; NASCIMENTO, 2006).

Em 2006, foi aprovada a Política Nacional de Plantas Medicinais e

Fitoterápicos (CARLINI, 2009b), que estipula a inserção de terapias alternativas e

práticas populares (entre elas a fitoterapia) no Sistema Único de Saúde (SUS). Desde

então, práticas relacionadas à distribuição de fitoterápicos e a implantação das

"Farmácias Vivas" vêm se tornando uma realidade no país. Sendo assim, a

necessidade de estudos toxicológicos e a implantação de políticas de

fitofarmacovigilância devem ser tomadas como prioridade para a saúde pública

(LANINI et al., 2009).

2.5. O gênero Pluchea Cass.

Asteraceae é considerada a maior família de plantas Angiospermas,

compreendendo cerca de 1.535 gêneros, com aproximadamente 23 milhões de

espécies descritas, distribuídas em três subfamílias e 17 tribus (BREMER, 1994).


30

Sua distribuição cosmopolita advém da sua capacidade de adaptação

ambiental, sendo encontrada nas regiões de clima tropical, subtropical e temperado.

Entre os fatores importantes para o sucesso biológico e grande capacidade de

dispersão, descreve-se a presença de pápus plumosos, apêndices, estruturas de

aderência e os metabólitos secundários (VENABLE; LEVIN, 1983).

No Brasil, em especial na Região Sul, a flora asterológica é considerada densa

e diversificada, com maior número de representações das tribos: Astereae, Inuleae,

Helenieae e Mutisieae (MATZENBACHER, 2003). De acordo com a classificação

usual, o gênero Pluchea Cass. esta incluído na família Asteraceae, subfamília

Asteroideae, tribo Inuleae (DALPIAZ; RITTER, 1998), compreendendo 80 espécies de

ampla distribuição geográfica na América do Sul, África, Ásia e Austrália (BREMER,

1994; VILLASEÑOR; VILLAREAL, 2006).

O gênero Pluchea Cass. inclui ervas perenes ou arbustos, com caules

frequentemente alados; folhas alternas, glandulosos-pontuadas, inteiras e de margens

denteada a serreadas. A inflorescência é formada por capítulos solitários ou disposta

em corimbos terminais, heterógamos, com flores pistuladas férteis. Invólucro

campanulado, com até 10 séries de brácteas paleáceas, receptáculo plano e glabo.

Corola com flor pistilada filiforme, arquênio de 4 a 5 ângulos, com pápus alongado e

filiforme com uma única série de cerdas capilares (CANCELI et al., 2006).

Várias espécies do gênero Pluchea são amplamente utilizadas como plantas

medicinais, por apresentarem importantes propriedades medicinais. Dentre as várias

atividades cientificamente comprovadas das espécies desse gênero, grande parte

delas tem demonstrado potencial antimicrobiano e antioxidante. Em Cuba as espécies

P. odorata e P. carolinensis são utilizadas na medicina popular como digestivo e

antipirético. Enquanto a P. rosea como vermífugo, além da atividade antimicrobiana e

antioxidante dos extratos etanólico e n-butanólico dessas plantas (CÓRDOVA et al,

2010). A P. lanceolata é utilizada na Índia como: antipirético, analgésico, antireumático


31

e calmate (KHAN et al., 2010). Estudos demonstraram a atividade indutora do sono e

a diminuição da atividade locomotora de ratos tratados com extrato de Pluchea indica

Less. (THONGPRADITCHOTE et al., 1999).

Estudos realizados com as partes aéreas de espécies de Pluchea têm

demonstrado a identificação de vários compostos bioativos. Os grupos de compostos

frequentemente encontrados são os eudemanes, flavanóides, fenóis, terpenos,

taninos, alcalóides e saponinas, sendo os dois últimos obtidos no extrato aquoso

(REYES-TREJO; JOSEPH-NATHAN, 1999). Em P. odorata, P. carolinensis e P. rosea

foram identificados os flavanóides: quercitina, kaempferol e myrcetina, extraídos

dessas espécies de planta (CÓRDOVA et al., 2006; CÓRDOVA et al, 2010). Em P.

lanceolata foi identificado α-amyrin, β-amyrin, caproate, stigmasterol, triterpenos,

neolupenol, quercitina, acetato de taraxasterol e isorametina (KHAN et al., 2010). No

México, estudos com a espécie Pluchea sericea demonstraram a presença de

terpenos, flavanóides e sesquiterpenos (REYES-TREJO; JOSEPH-NATHAN, 1999).

2.6. Pluchea sagittalis (Lam.) Cabrera e sua ação farmacológica

Pluchea sagittalis (Lam.) Cabrera, vulgarmente conhecida por quitoco, madre

cravo ou tabacarana (ver figura 1), é uma planta da Família Asteraceae que possui

como sinonímia os nomes: Gnaphalium suaveolens Vell., Pluchea quitoc DC., comum

da região tropical, sendo facilmente encontrada em vários países da América Latina,

inclusive no Brasil (BARROS et al., 2006).

A Pluchea sagittalis (Lam.) Cabrera é uma planta perene, de tamanho variando

entre 0,30m e 0,90m de altura, com folhas simples e alternas e flores de coloração

branca com lilás. Seu caule e folhas são muito utilizados na forma de chá para

tratamento de dores corporais, inflamações e alguns distúrbios nervosos (COELHO de


32

SOUZA, 2004). Em estudos fitoquímicos realizados com as partes aéreas dessa

planta, foram isolados os compostos: α-pineno, campheno, cineol p-cymeno, linalol, l-

campherol, α-terpineol, borneol, caryophylleno e humuleno (LORENZI; MATOS, 2002).

A atividade analgésica e anti-inflamatória das folhas de Pluchea quitoc DC.,

sinonímia P. sagittalis, é atribuída à presença das substâncias triterpênicas:

stigmasterol, ß-amirina, taraxasterol e pseudo-taraxasterol que foram recentemente

isoladas das folhas desta planta (BURGER et al., 2000; BARROS et. al., 2006).

Os componentes químicos, encontrados no óleo essencial da P. sagittalis

(Lam.) Cabrera extraído das folhas e caule por cromatografia gasosa, acoplada à

espectrometria de massa, foram 1,8-cineol-eucalipitol, copaeno, β-cariofileno, α-sileno-

nafitaleno, nafitalenol, fitol, além de apresentar atividade antimicrobiana em

Staphylococcus aureus, Streptococcus epidermidis, Micrococcus luteus e Candida

albicans do óleo essencial puro, e atividade em concentrações de 50 a 12,5% no MIC

(concentração inibitória mínima) (FERREIRA et al., 2004).

Figura 1 – Pluchea sagittalis (Lam.) Cabrera.

Fonte: http://www.herbotecnia.com.ar/aut-lucera.html

As folhas e caules da P. sagittalis (Lam.) Cabrera são utilizadas na forma de

chá para tratamento de enfermidades como dores estomacais, náuseas, vômitos,

distúrbios digestivos e hepáticos, assim como estimulante intestinal atuando no


33

controle de edemas e cólicas intestinais. A mistura das folhas dessa planta com as

flores de Rosa banksiae resulta em uma solução de efeito laxativo e anti-ulcerativo.

Quando misturada as folhas de Malva parvifolia e galhos de Anethum graveolens,

relata-se efeito anti-reumático (BURGER, 1995).

A Pluchea sagittalis (Lam.) Cabrera é utilizada popularmente, na forma de chá

das folhas e talos, como alternativa terapêutica para tratamento de distúrbios

digestivos, enfermidades estomacais e hepáticas, flatulências, dispepsias nervosas,

inflamação uterina, renal e de bexiga, reumatismo e tratamento de distúrbios nervosos

característicos da histeria (LORENZI; MATOS, 2002).

Na avaliação da atividade farmacológica de algumas plantas medicinais de

origem brasileira, demonstrou-se que o extrato aquoso de P. sagittalis (Lam.) Cabrera

possuía efeitos anti-inflamatórios, cicatrizantes e diarréicos, havendo descrição

popular desta planta no tratamento destes males (SOUZA et al., 2004, FIGUEDERO et

al., 2011).

Peréz-García e colaboradores (1996) demonstraram que o extrato aquoso de

P. sagittalis (Lam.) Cabrera possui acentuado efeito anti-inflamatório, em diferentes

formas de testes de edema de pata, induzido por dextran e carragenina. A atividade

antioxidante em leucócitos sanguíneos foi observada nos testes “in vitro” e “in vivo”,

verificando-se também a redução de radicais livres, junto ao efeito anti-inflamatório

desta planta (PÉREZ-GARCÍA et al., 2005).

Estudos realizados com o extrato aquoso de P. sagittalis (Lam.) Cabrera

demonstraram haver atividade citotóxica deste, em teste “in vitro”, com linhagens de

células de tumor sólido humano de adenocarcinoma de cólon HT29 e células de

câncer de pulmão NCL-H460, fator este ocorrido pela presença de princípios ativos

com capacidade de inibição da proliferação das células tumorais testadas (MONKS et

al., 2002).


34

Experimentos realizados, utilizando extratos metanólicos de plantas medicinais

brasileiras para avaliação do estresse, demonstraram que algumas plantas

apresentaram atividade inibitória na síntese da proteína 72 KD, produzida pelo corpo

em momentos de estresse, cuja estimulação foi realizada através de testes

submetendo o animal ao estresse por calor, sendo mencionada a eficiência de P.

sagittalis (Lam.) Cabrera (PEREZ-GARCIA et al., 2001).

Souza e colaboradores (2004), ao avaliarem os extratos metanólicos de plantas

do Rio Grande do Sul, na prospecção microbiológica, observaram que a Pluchea

sagittalis (Lam.) Cabrera era uma das plantas mais ativas na inibição do crescimento

de leveduras em culturas “in vitro”, assim como a Malva sylvestris, Senna neglecta,

Ocotea odorífera, entre outras.

O extrato etanólico das partes aéreas da Pluchea quitoc DC., sinonímia P.

sagittalis, demonstrou efeito anti-inflamatório e antinociceptivos, frente a diferentes

agentes químicos ou térmicos, quando administrado pela via oral, confirmando a

utilização empírica da população no tratamento da dor (BARROS et. al., 2006).

A aplicação do extrato etanólico de Pluchea sagittalis (Lam.) Cabrera, em

animais infectados com Listeria sp., demonstrou sua atividade sobre o sistema

hematopoético. Os ratos foram infectados por via intraperitoneal e o grupo tratado com

o extrato por três dias consecutivos, por via oral, apresentou uma elevação no número

de granulócitos e macrófagos. Como consequência, houve aumento significativo da

sobrevivência dos ratos infectados, quando comparados com o grupo controle. Assim,

o extrato etanólico da planta foi considerado um estimulador da produção de

granulócitos e macrófagos (QUEIROZ et al., 2000).

Testes realizados com algumas espécies da Família Asteraceae, no modelo

tipo ROS (espécies reativas de oxigênio) e RNS (espécies reativas de nitrogênio),

demonstraram que o extrato diclorometano de Baccharis grisebachii e P. sagittalis


35

(Lam.) Cabrera, assim como o extrato aquoso dessa última, apresentaram atividade

inibitória da oxidação nos dois sistemas. (PÉREZ-GARCIA et al., 2001).

São descritas também a atividade antiinflamatória de Pluchea indica Less.,

inibindo agentes como carragenina e cróton, no que se refere à ação exsudativa,

proliferaiva e estágios crônicos da inflamação (SENT; NAG CHAUDHURI, 1991).

Para fins terapêuticos um dos fatores de importância nos experimentos

farmacológicos e toxicológicos é a determinação da dose-resposta (variação das

concentrações para determinação da menor dose com efeito terapêutico e a maior

dose sem efeito tóxico), essa é representada pela curva gaussiana, embora pouco

realizada na prática (OGA, 1996).

A avaliação da toxicidade de extratos ou compostos isolados, segundo Padilla

(1999), é necessário para o reconhecimento dos possíveis efeitos tóxicos de espécies

vegetais como fator importante para posterior aplicação de doses terapêuticas. Com

relação à P. sagittalis, estudos relatam que o extrato aquoso das folhas dessa planta

em doses de 1, 2 e 3 g/Kg por via i.p., representam baixo risco de toxicidade na forma

aguda por não demonstrarem sinais de toxicidade (RODRIGUES, 2007), assim como

a administração oral, nas doses de 1 e 2g/Kg do extrato etanólico também não

demonstraram ser tóxicas, em estudos realizados por Barros et al. (2006).


36

3. Objetivos:

Geral:

Isolar e identificar os principais constituintes químicos do extrato etanólico das folhas

de Pluchea sagittalis (Lam.) Cabrera, e avaliar a atividade ansiolítica desse extrato em

modelos comportamentais.

Específicos:

- Realizar o fracionamento do extrato etanólico de P. sagittalis;

- Determinar os tipos de compostos químicos presentes no extrato etanólico bruto e

suas respectivas frações;

- Isolar os componentes químicos do extrato etanólico de P. sagittalis;

- Identificar os compostos majoritários do extrato etanólico de P. sagittalis;

- Verificar as frações com possível efeito sobre o sistema nervoso central em animais

pelo teste de triagem farmacológica comportamental;

- Avaliar a atividade motora dos animais após administração do extrato etanólico de P.

sagittalis;

- Avaliar o efeito ansiolítico do extrato etanólico de P. sagittalis em modelos

comportamentais.


37

4. Metodologia

4.1. Material botânico

As espécimes de Pluchea sagittalis (Lam.) Cabrera foram coletadas no Bairro

Japãozinho, na Região metropolitana de Aracaju, Estado de Sergipe. Após a coleta, foi

realizada a identificação da planta pelo Prof. Dr. Lauro Xavier Filho, do Laboratório de

Produtos Naturais e Biotecnologia, do Instituto de Tecnologia e Pesquisa – ITP, e a

confirmação pelo herbário da Universidade Federal de Sergipe, com os registros nº

02829 de 17/11/1982 e nº 03048 de 01/11/1988 (Anexo 1 e 2).

As folhas frescas foram selecionadas, limpas e secas em estufa à temperatura

de 40°C, com circulação de ar, trituradas. Foram utilizadas 13,61g do pó em refluxo

contínuo por 6h, com álcool etílico P.A. 98% (VETEC®), em aparelho do tipo Soxleht.

O extrato foi rotaevaporado e obteve-se a amostra seca de p=27,78g. O rendimento

da amostra foi calculado pela fórmula: R=ES/P*100, onde R entende-se por

rendimento, ES por extrato seco (liofilizado) e P por peso das folhas, obtendo-se o

R=27,27%.

4.2. Fracionamento do extrato etanólico

Considerando a necessidade de remover a clorofila do extrato etanólico bruto,

realizou-se uma cromatografia reversa, impregnando o extrato etanólico em carvão

ativado. Em seguida, aplicou-se em uma coluna de sílica gel com 60 mesh.

(VETEC®), eluído com água destilada, etanol P.A. 98% (VETEC®) e acetona P.A.


38

(VETEC®), respectivamente. As frações obtidas foram rotaevaporadas (frações

etanólica e acetônica) ou liofilizada (fração aquosa). Com cada fração obtida foi

realizado a prospecção fitoquímica e utilizados na triagem farmacológica

comportamental.

4.3. Prospecção fitoquímica

Amostras de 100 mg de extrato etanólico bruto e das frações aquosa, etanólica

e acetônica, foram ressuspensas em etanol e analisadas quanto à presença de

compostos bioativos, segundo HERNANDEZ-TERRONES; RADI (2005).

Alcalóides: 2,00 mL da solução etanólica, adiciona-se 2,00 mL de HCL (10%)

e aquece a mistura por 10 minutos. Após resfriamento, filtra-se, separando em três

tubos de ensaios e acrescenta-se 05 gotas de reativos: Dragendorff, Mayer e Wagner.

Cumarinas voláteis: 2,00 mL da solução etanólica em um tubo, tampar com

papel de filtro impregnado em solução 10% de NaOH, colocar em banho-maria por 10

minutos. Revelar o papel de filtro em luz ultravioleta.

Taninos: 2,00 mL da solução etanólica, acrescentar 5,00 mL de água

destilada, filtrar a mistura e adicionar 2 gotas de solução de cloreto férrico a 10%.

Saponinas: 2,00 mL da solução etanólica, adicionar 5,00 mL de água fervente,

esfriar, agitar vigorosamente e deixar em repouso por 20 minutos.

Triterpenos e esteróides: 1 mL do extrato etanólico em tubo de ensaio,

adicionar 2 mL de anidrido acético, com agitação. Pelas paredes do tubo, adicionar 0,5

mL de ácido sulfúrico concentrado.

Antraquinonas: 1 mL do extrato etanólico e adicionar 2 mL de hidróxido de

amônio 10%, agitar e observar.


39

Flavonóides: Colocou-se em um tubo 2,00 mL da solução etanólica, alguns

fragmentos de Mg e agregou-se,pelas paredes do tubo, algumas gotas de HCL diluído.

Observou-se a coloração, que varia para diferentes estruturas.

Triterpenos e/ou esteróides: Colocou-se 2,00 mL da solução etanólica,

adicionou-se 5,00 mL de clorofórmio, filtrou-se e dividiu-se o filtrado em duas porções.

Em cada um dos tubos, realizaram-se as reações de Liebermann-Burchard e

Salkowski.

4.4. Isolamento dos compostos químicos do extrato etanólico

No laboratório de Liquen and Cane Team da Faculdad de Biología da

Universitad Complutense de Madrid, Espanha, realizou-se os procedimentos de

isolamento dos compostos químicos presentes no extrato etanólico bruto. Alíquotas de

0,025 g do extrato bruto foram ressuspensas em 7 diferentes misturas de solventes

com diferentes polaridades, sendo hexano 100% (E°0,01); hexano:xileno a 80:20 (E°

0,13); hexano:clorofórmio 50:50 (E° 0,25); clorofórmio 100% (E° 0,40); clorofórmio:

acetato de etila 70:30 (E° 0,45); acetonitrilo:acetona 30:70 (E° 0,59) e acetonitrilo

100% (E° 0,65).

Após a diluição, as amostras permaneceram em banho-maria a 35°C, por 3

horas. Em seguida, o precipitado foi descartado e o sobrenadante foi transferido para

um tubo de peso conhecido, para retirada do solvente por evaporação. As amostras

secas foram pesadas e subtraídas do peso inicial para saber o volume diluído.

As amostras diluídas foram colocadas em capela com ar para completa

evaporação dos respectivos solventes. Em seguida, foram ressuspensas em solução

de água a 4% de ácido acético e acetonitrilo, na proporção 80:20, depois agitadas em

vortex e centrifugadas a 4°C, 14500rpm, por 10 minutos. Após esse procedimento, as


40

amostras foram injetadas em cromatógrafo líquido de alta eficiência (HPLC), fazendo

uma corrida de 60 minutos.

4.5. Cromatografia de Líquidos de Alta Resolução

As análises cromatográficas foram realizadas no aparelho Spectra Physics

8810 (Thermo Electron Corporation, Asheville, NC, USA) com um “loop” de injeção de

20 µL., Bomba: SP 8810 LC (Thermo Electron Corporation, Asheville, NC, USA),

elétrica de pistão alternante recíproco. Foi utilizada como fase estacionária a coluna

Mediterranea sea C18 (Teknokroma, S.C.L. Spain), tipo Fase Reversa, longitude (L):

120 mm, diâmetro de partícula (dp): 5μm, diâmetro interno (di): 4,6 mm, temperatura:

25°C, fluxo da fase móvil: de 0,2 mL•min-1 a 1,0 mL•min–1. Detector SP 8490 UV-

Visível (Thermo Electron Corporation, Asheville, NC, USA). Longitude de onda de

análise: 256 nm (segundo o máximo de absorbância obtido no espectro de

absorbância). Range (UAFE): 0,005 unidades. Sistema de integração: DataApex

Clarity LiteTM software para Windows (DataApex Ltd., Praha, Czech Republic). As

análises do extrato foram realizadas segundo gradiente da tabela 1, sendo a pressão

mínima de 10 atm e máxima de 250 atm; λ= 254 nm e range de 0,05.

Tabela 1 – Condições de realização das análises em HPLC.

Tempo Solvente A – água Solvente B – acetonitrilo Fluxo

0 100 0 0,7

30 20 80 0,7

45 20 80 0,7

60 100 0 0,7

Após a obtenção dos cromatogramas, os picos de todas as amostras

analisadas foram comparados em uma tabela, verificando-se a relação de quantidade


41

de área do pico com o E° do solvente utilizado e com o tempo de retenção da

substância em cada amostra.

4.6. Extração de fenóis totais

Utilizou-se alíquotas de 10 mg do extrato, ressuspensas em 10 ml de água

destilada, agitada por 15 min, e descartado o preciptado. A fase dissolvida em água foi

submetida à extração liquído-líquido, com uma solução de éter dietílico e acetato de

etila, na proporção de 65:35, e agitado por 5 minutos. Foram realizadas 3 repetições

da extração com volume total de 10 ml (1:1), sendo retirado o sobrenadante a cada 30

minutos de repouso da amostra. Após a secagem, as amostras de fenóis totais obtidas

foram diluídas em água deionizada, obtendo-se duas soluções a 28 e 56 mg/L. A

determinação da extração dos fenóis totais foi realizada pelo método de Lowry e

colaboradores (1951), modificado por Potty (1969).

4.7. Identificação de Stigmasterol e β-amirina no extrato etanólico de P. sagittalis

Os padrões Stigmasterol e β-amirina (Sigma-Aldrich-USA), foram dissolvidos à

proporção de 0,5 mg/mL em Acetonitrilo. Após este procedimento, realizou-se uma

leitura de varredura em espectrofotômetro, com λ variando de 190 a 650 nm. Uma vez

determinados os melhores comprimentos de onda de leitura, realizaram-se novos

cromatogramas com os fenóis totais obtidos no teste anterior, em comparação com os

padrões e, em seguida, com as amostras.

As soluções dos padrões de Stigmasterol e β-amirina foram submetidas à

cromatografia em HPLC, com análise isocrática de 100% Acetonitrilo (ACN), com

λ=215 nm e range de 0,01, em coluna de fase reversa C18.


42

4.8. Cromatografia em coluna (CC) e cromatografia em camada delgada (CCD)

Com base nos resultados obtidos, realizou-se uma coluna cromatográfica com

sílica 60 Mesh (Merck), eluída com volumes fixos das misturas de solventes

hexano:xileno (80:20), hexano:clorofórmio (50:50), clorofórmio:acetato de etila (70:30),

acetonitrilo:acetona (30:70) e acetonitrilo (100%). As frações obtidas foram submetidas

à cromatografia em camada delgada, em placa de Sílica Gel 60 Mesh, F254, Merck,

para observação das frações a serem submetidas à nova análise em HPLC, com

intenção de obter as frações referentes aos picos majoritários do extrato em estudo.

4.9. Análise dos compostos por Ressonância Magnética Nuclear

As três amostras isoladas por CC foram diluídas em clorofórmio e submetidas

ao Espectrômetro supercondutor de RMN Multinuclear, com Transformada de Fourier,

modelo AC300F MHz (Bruker), para obtenção dos espectros de RMN H1 e C13,

realizados no Laboratório de Espectroscopia da Universidade do Vale do Itajaí, Itajaí -

SC. Os espectros obtidos foram analisados com auxílio do Prof. Dr. José Maria

Barboa-Filho, do Laboratório de Tecnologia Farmacêutica da Universidade Federal da

Paraíba, João Pessoa - PB.

4.10. Ensaios comportamentais com animais

4.10.1. Animais

O manejo dos animais ocorreu de acordo com as normas de práticas didático-

científicas e com aprovação prévia do projeto pelo Comitê de Ética em Pesquisa da

Universidade Tiradentes – UNIT, nº 070209, aprovado em 06/05/2009 (Anexo 3).


43

Foram utilizados camundongos albinos Swiss machos, com peso entre 25-30 g

e ratos machos Wistar, com peso entre 200-230 g, cedidos pelo Biotério da UNIT e

acomodados em gaiolas pequenas (n=6). Os mesmos foram mantidos com água e

alimento ad libitum, sendo submetidos a jejum alimentar por 4 a 6 horas antes da

realização dos experimentos. Após cada ensaio farmacológico, os animais foram

sacrificados por administração de tiopenal sódico e acondicionados em freezer para

posterior descarte. Entretanto, os animais submetidos aos testes de campo aberto e

labirinto em cruz elevado, foram sacrificados por deslocamento cervical, com intuito de

retirar o cérebro para posterior utilização na avaliação imunohistoquímica, como uma

tentativa de identificar as áreas de afinidade do extrato em questão.

4.10.2. Preparação das amostras

O extrato etanólico de P. sagittalis e respectivas frações foram diluídos em

água destilada com 5% de DMSO (v/v), e administrados aos animais dos grupos

experimentais, as concentrações utilizadas do extrato foram baseadas nos trabalhos

de Rodrigues (2007) e Barros et al. (2006) que realizaram estudos com os extratos

aquoso e etanólico desta planta, respectivamente. Os animais do grupo controle

receberam água destilada com 5% de DMSO (v/v) (veículo). Os animais do grupo

padrão receberam diazepan, sendo a concentração variável a depender do protocolo

experimental.

4.10.3. “Screening” farmacológica comportamental (CARLINI, 1972)

Esse teste foi realizado como pré-teste, a fim de avaliar o perfil farmacológico

do extrato etanólico de P. sagittalis e suas respectivas frações. Foram utilizados 5

grupos, com 3 animais cada. Os animais dos grupos 1, 2, 3 e 4, receberam,

respectivamente, a administração de 100 mg/mL do extrato etanólico bruto das folhas


44

de P. sagittalis e as frações aquosa, etanólica e acetônica, respectivamente, e o grupo

controle recebeu o veículo todos por via intra-peritoneal (i.p.). O comportamento dos

animais de cada grupo foi monitorado durante o período de 4 horas e enquadrado em

categorias que estão descritas no Anexo 4. Após esse período, os animais foram

mantidos com água e ração ad libitum, observados após 24 horas e sacrificados ao

término de 14 dias.

Na triagem farmacológica foram observados os parâmetros de alterações

comportamentais de efeitos estimulantes como: hiperatividade, irritabilidade,

agressividade, tremores, convulsões, auto-limpeza e piloereção; de efeitos

depressores como: hipnose, ptose palpebral, sedação, anestesia, resposta diminuída

ao toque, reflexo auricular e força ao agarrar; bem como de efeitos autossômicos: tipo

de fezes, respiração forçada, micção excessiva, entre outros. Comparando-se os

grupos experimentais com o controle.

4.10.4. Teste de Campo Aberto (TABARELLI et. al., 2004)

Para realização do teste de campo aberto, os animais foram utilizados em

grupos (n=6), os quais receberam a administração do extrato por via oral (p.o.), nas

concentrações de 10, 50, 100 e 200 mg/mL. Após 30 minutos da administração dessas

substâncias, os animais foram colocados no centro do campo aberto quadrado de

72x72 cm (Figura 2), dividido internamente em 16 quadrantes iguais, no qual os

animais permaneceram por 5 minutos. Foram computados o tempo de movimentação

dos animais, o número de auto-limpeza e o número de quadrantes percorridos. Como

droga padrão, utilizou-se Diazepan Cristalia (5 mg/Kg) e solução salina 0,9%, como

controle. A observação da ambulação dos animais permite não só a avaliação da

atividade motora, quando associada ao número de auto-limpeza, como também torna

possível a identificação dos sinais de ansiedade.


45

Figura 2 – Aparelho de campo aberto “Open Field”.

Fonte: brc.riken.jp

4.10.5. Teste de Rota Rod (OLIVEIRA et al., 2008)

Para realização desse teste os animais foram utilizados em grupos com (n=6),

os quais receberam a administração do extrato por v.o., nas concentrações de 10, 50,

100 e 200 mg/mL. Os animais foram submetidos ao treino na barra giratória 24 horas

antes do experimento e 30 minutos após a administração das substâncias (v.o.),

sendo avaliados o número de quedas e o tempo de permanência na barra giratória

(Figura 3). O número máximo de quedas permitido foi de 3, sendo que, após a terceira

queda, o animal não mais era reconduzido ao rota-rod. O tempo máximo de

permanência permitido no rota-rod foi de 3 minutos. Como droga padrão, utilizou-se

Diazepan Cristalia (2 mg/Kg) e solução salina 0,9%, como controle. O

comprometimento motor é observado por menor tempo de permanência dos animais

no aparelho.


46

Figura 3 – Aparelho de Rotarod.

Fonte: tmc.sinica.edu.tw

4.10.6. Teste de Tempo de Sono Induzido por barbitúrico (CARLINI,

BURGOS, 1979)

Esse modelo apresenta duas etapas distintas de observação após a aplicação

do tiopental: o tempo de latência e o tempo de duração do sono. Os animais foram

separados em grupos (n=6), os quais receberam a administração do extrato por v.o.,

nas concentrações de 10, 50, 100 e 200 mg/mL. Após 30 minutos, receberam a

administração do tiopental sódico ABBOTT (40 mg/Kg) via i.p., e observou-se o tempo

de latência e duração do sono. O tempo máximo de sono considerado foi 120 minutos.

Como droga padrão, utilizou-se Diazepan Cristalia (5 mg/Kg) e solução salina 0,9%,

como controle.

4.10.7. Teste de Labirinto em Cruz Elevado (BLATT; TAKAHASHI, 1999)

Para realização desse teste os animais foram utilizados em grupos (n=6), os

quais receberam a administração do extrato por v.o., nas concentrações de 10, 50,

100 e 200 mg/mL. Após 30 minutos da administração das substâncias os animais

foram colocados no aparato com braços abertos e fechados, medindo 1 m de

comprimento, 10 cm de largura e 50 cm de altura (Figura 4). Os animais


47

permaneceram no aparelho por 5 min., sendo computados o tempo de movimentação

do animal e o número de vezes que eles entram em cada braço. Como droga padrão,

utilizou-se Diazepan Cristalia (2 mg/Kg) e solução salina 0,9%, como controle.

Nesse teste, o aumento no número de entradas e no tempo de permanência

dos animais nos braços abertos, em comparação ao grupo controle, corresponde a

parâmetros indicadores da redução da ansiedade dos animais.

Figura 4 – Aparelho do teste de labirinto em cruz elevado.

Fonte: jsw.lifesciences.com

4.10.8. Teste anticonvulsivante induzido por Pentilenotetrazol (LÖSCHER;

SCHIMIDT, 1988)

Para realização desse teste os animais foram utilizados em grupos (n=6), os

quais receberam a administração do extrato por v.o., nas concentrações de 10, 50,

100 e 200 mg/mL. Após 30 minutos, receberam pentilenotetrazol (PTZ) SIGMA (60

mg/Kg) via i.p., e foram observados os tempos de latência para o início das

convulsões e de morte dos animais. Como controle será utilizado Diazepan Cristalia (3

mg/Kg). Os animais foram observados por 20 minutos, para a determinação do

número de convulsões, do tempo de duração das convulsões e do número de animais

mortos. Considera-se que, uma substância ansiolítica, com ação via sistema


48

GABAérbico, está associada a um efeito protetor, em animais submetidos à convulsão

induzida pelo PTZ.

4.11. Análise estatística (Magalhães & LIMA, 2009)

Os valores obtidos nos testes foram expressos como a média e, + o erro

padrão da média. Utilizou-se o teste de análise de variância (ANOVA), associado ao

pós-teste de comparações de múltiplas médias de Tukey, utilizados para a verificação

das significâncias estatísticas entre os grupos experimentais. Apenas no teste de

convulsão induzida por PTZ foi utilizado o pós-teste de Duncan. Considerou-se

significativo os valores de p<0,05.

5. Resultados

5.1. Caracterização química do extrato etanólico de P. sagittalis

O extrato etanólico bruto e as respectivas frações aquosa, etanólica e

acetônica de P. sagittalis demonstraram, na prospecção fitoquímica, a presença dos

compostos: alcalóides, cumarinas, flavonóides, taninos, saponinas e triterpenos

(Tabela 2), compostos equivalentes aos compostos encontrados em outras espécies

do mesmo gênero.

Após a caracterização fitoquímica, o extrato e as respectivas frações foram

avaliadas no teste de “screening” farmacológico comportamental para verificação da

amostra mais promissora para estudos farmacológicos. Nesse teste observou-se não

haver diferença comportamental significativa entre os grupos, optando-se por trabalhar

com o extrato bruto nos ensaios pré-clínicos em animais (Tabela 4).


49

Tabela 2 – Prospecção fitoquímica de Pluchea sagittalis (Lam.) Cabrera, na forma de extrato etanólico bruto (EEB) e suas respectivas frações aquosa (Faq), etanólica (FEt) e acetônica (FAc).

Teste de reconhecimento

EEB FAq FEt FAc

Alcalóides + + + - Cumarinas voláteis + + + - Flavonóides + + + + Taninos + + + + Fenóis + + + + Saponinas + + - - Triterpenos e/ou Esteróides

+ - + +

Obs.: Os resultados foram expressos como positivo (+) ou negativo (-).

Utilizando o extrato etanólico bruto, realizou-se a separação de compostos por

solventes de diferentes polaridades e as frações obtidas foram análises em HPLC. A

partir dos espectros (Anexos 5 a 11) foi possível observar o perfil de afinidade química

dos compostos presentes no extrato. Os solventes, cuja força de extração (Єº) variou

entre 0,13 e 0,65, demonstraram capacidade de carrear praticamente os mesmos

compostos químicos, quando comparados os tempos de retenção de cada pico obtido.

Quando submetido à extração com o hexano 100%, o extrato apresentou um

comportamento diferente das demais frações, arrastando algumas substâncias de

muito baixa polaridade (Tabela 3).

Com base na literatura, foram realizados os espectros dos padrões β-amirina e

stigmasterol (Anexo 12). Quando comparados os pontos de retenção dos padrões, em

comparação com os espectros do extrato em estudo, não foi possível identificar os

picos referentes a essas substâncias.

Considerando a afinidade dos padrões β-amirina e stigmasterol por solventes

de baixa polaridade, o extrato etanólico de P. sagittalis submetido à extração de fenóis

totais foi analisado por HPLC, possibilitando assim a identificação dos picos referentes

a esses compostos.


50

Tabela 3 – Tabela comparativa com tempo de retenção (T. Ret.) e quantidade de

área, dos picos determinados por HPLC, separados por diferentes misturas de

solventes. Entede-se por E°0,01 (hexano 100%), E° 0,13 (hexano:xileno a 80:20),

E° 0,25(hexano:clorofórmio 50:50), E° 0,40 (clorofórmio 100%), E° 0,45

(clorofórmio: acetato de etila 70:30), E° 0,59 (acetonitrilo:acetona 30:70) e E°

0,65 (acetonitrilo 100%).

E° 0,01

E° 0,13

E° 0,25

E° 0,40

E° 0,45

E° 0,59

E° 0,65

Pico

Rf

(min.)

Área

(%)

Rf

(min.)

Área

(%)

Rf

(min.)

Área

(%)

Rf

(min.)

Área

(%)

Rf

(min.)

Área

(%)

Rf

(min.)

Área

(%)

Rf

(min.)

Área

(%)

A -- -- 19,74 8,13 -- -- -- -- -- -- -- -- 21,78 12,05

B -- -- 21,3 9,11 21,43 12,79 21,66 13,62 21,73 13,62 21,84 11,76 22,94 15,45

C -- -- 21,88 10,59 21,99 2,33 22,23 2,11 22,3 2,24 22,4 1,07 22,4 2,05

D -- -- 22,45 5,17 22,58 5,12 22,83 6,10 22,89 5,69 22,98 8,02 -- --

E 23,32 5,65 23,33 12,81 23,48 14,65 23,71 15,26 23,76 15,04 23,86 16,04 23,8 13,86

F 24,46 4,92 -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- --

G 25,3 10,20 25,45 54,19 25,62 65,12 25,83 62,91 25,87 63,41 25,97 63,10 25,93 56,59

H 26,99 62,66 -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- --

I 30,17 13,48 -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- --

J 31,13 3,10 -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- -- --

Considerando a afinidade dos padrões β-amirina e stigmasterol por solventes

de baixa polaridade, o extrato etanólico de P. sagittalis submetido à extração de fenóis

totais foi analisado por HPLC, possibilitando assim a identificação dos picos referentes

a esses compostos.

Na análise das frações obtidas por CC e CCD em HPLC, verificou-se três picos

isolados com diferentes pontos de retenção. As frações foram secas e armazenadas

para posterior análise por Ressonância Magnética Nuclear. Através dos espectros

realizados foi possível verificar a presença de grupo químico característico de

compostos terpênicos. A quantidade da amostra e o método de análise não permitiram

a identificação estrutural das moléculas completa da molécula, mas os pontos de

retenção no espetro de RMN demonstrou similaridade com os eudesmanes descritos

por Guilhon & Müller (1998).


51

5.2. Ensaios comportamentais com animais

No “screening” farmacológico comportamental foi observado o potencial

depressor do extrato etanólico bruto de P. sagittalis e suas respectivas frações:

aquosa, etanólica e acetônica, em comparação à administração do veículo. As

alterações observadas, como redução da atividade motora, menor força ao agarrar e

diminuição do reflexo auricular, são características comportamentais da ação de

drogas depressoras do SNC, a exemplo dos benzodiazepínicos e analgésicos de ação

central. Todas as amostras avaliadas demonstraram apresentar efeito semelhante

(Tabela 4). Entretanto, na fração etanólica o efeito sobre o animal foi um pouco mais

prolongado.

Tabela 4. Alterações comportamentais observadas após administração do extrato

etanólico bruto e respectivas frações aquoso, etanólica e aquosa das folhas de P.

sagittalis, na prospecção farmacológica comportamental.

A tabela 5 corresponde aos parâmetros avaliados no teste de campo aberto ou

“Open Field”. Os animais foram submetidos a tratamento prévio (60 min) com o EEB

(10, 50, 100 e 200 mg/Kg), e comparados com animais controle com administração do

veículo e o grupo padrão que recebeu diazepam (2 mg/Kg). Os animais que

receberam as doses de 100 e 200 mg/Kg do EEB apresentaram atividade motora e

Doses Tempo Efeito

100 mg/kg Extrato Etanólico Bruto

Ptose, diminuição da resposta ao tato, sedação, diminuição da defecação, diminuição da força ao agarrar, diminuição do tônus muscular, diminuição do reflexo.

100 mg/kg Fração Acetônica Ptose, diminuição da resposta ao tato, sedação, diminuição da defecação, diminuição da força ao agarrar, diminuição do tônus muscular, diminuição do reflexo.

100 mg/kg Fração Etanólica Ptose, analgesia, diminuição da atividade motora, diminuição da resposta ao tato, sedação, diminuição da defecação e micção, diminuição da força ao agarrar, diminuição do tônus muscular, diminuição do reflexo.

100 mg/kg Fração Aquosa Analgesia, diminuição da resposta motora, diminuição da resposta ao tato, diminuição do tônus muscular, diminuição da força de agarre, diminuição do reflexo.


52

exploratória semelhante aos animais que receberam a droga padrão, chamando à

atenção para os parâmetros de tempo de atividade e nº de quadrantes percorrido

pelos referidos animais. A observação da redução do número de auto-limpeza

realizada pelos animais é uma das principais características que demonstra a redução

dos sinais de ansiedade nos animais tratados com as doses de 100 e 200mg/Kg do

extrato.

Tabela 5 – Efeito da administração do extrato etanólico bruto (EEB) de P. sagittalis, nas

doses de 50-200 mg/Kg, em comparação com a administração do veículo, controle, e da

droga padrão, diazepam (2 mg/Kg), no teste de campo aberto.

Letras diferentes como expoente na mesma coluna indicam valores estatisticamente diferentes.

No teste Rota Rod (Figura 5), os animais previamente tratados, por via oral,

com extrato de P. sagittalis (10, 50, 100 e 200 mg/Kg), permaneceram na barra

giratória até o final do tempo, nos períodos de 0, 60 e 90 minutos após a

administração do extrato. Não foi observada diferença significativa entre os grupos

experimentais e o controle, com relação ao tempo de permanência no aparelho,

caracterizando, assim, ausência de efeito sedativo e do relaxamento muscular dos

animais tratados com o extrato. Os valores obtidos foram estatisticamente

significativos quando comparados o grupo controle com o grupo tratado com a droga

padrão (Diazepam 2 mg/Kg).

Parâmetros avaliados

Grupos Tempo em movimento

(seg) Tempo parado

(seg) Nº de quadrantes

internos Nº de quadrantes

externos Nº de auto-

limpeza

Veículo 167,2 + 3,11A 131,2 + 5,07

A 17,6 +2,07 76,4 + 4,72 8,6 + 1,52

Pluc 10 251,8 + 4,66B 48,2 + 4,66

B 25,8 + 3,63 129,6 + 14,93

B 10,6 + 1,14

Pluc 50 257,0 + 12,71B 43,2 + 12,79

B 30,4 + 9,63

A 144,4 + 18,78

A 10,2 + 3,42

Pluc 100 211,0 + 11,2C 89,0 + 11,2

C 14,0 + 5,34

B 106,6 + 34,48 3,8 + 1,64

A

Pluc 200 205,0 + 6,20C 95,0 + 6,2

C 25,2 +2,28 133,8 + 4,21

A 6,0 + 3,16

DZP 2 206,4 + 6,23B,C

88,4 + 5,81C 21,8 + 4,15 130 + 6,89

A 5 + 2,74


53

Figura 5 – Avaliação motora, em camundongos previamente tratados (60 min) pela via

p.o. do veículo (n=6), com o extrato etanólico das folhas de P. sagittalis (10, 20, 100 e 200

mg/kg, n=6) ou diazepam (DZP; 5 mg/kg, n=6). As colunas e barras verticais representam

as médias ± EPM, sendo ** p<0,01.

Os resultados de ambulação no teste de campo aberto e o comportamento

observado no rotarod demonstraram que o extrato não provoca alteração na

capacidade motora dos animais, assim como ausência de sedação.

Os animais que receberam doses de 50, 100 e 200 mg/Kg do extrato etanólico

de P. sagittalis apresentaram uma diminuição na latência e um aumento no tempo de

sono induzido por pentobarbital (Tabela 6), demonstrando o efeito depressor do

extrato, semelhante ao observado nos animais tratados com diazepam 5 mg/Kg.

O labirinto em cruz elevado é, atualmente, um dos modelos animais mais

utilizado para avaliar o efeito de substâncias sobre a ansiedade, tendo sido

empregado por muitos laboratórios em pesquisas, na última década, para uso em

ambos os ratos e camundongos, apoiadas pela utilização de um ansiolítico clássico, o

diazepam (ESPEJO, 1997).


54

Tabela 6 – Efeito do extrato etanólico de P. sagittalis (Lam.) Cabrera, Asteracea, no teste

de tempo de sono induzido por pentobarbital (40 mg/kg i.p.) em camundongos, em

comparação com o grupos controle (veículo) e diazepam (DZP).

Grupos Latência do sono (min) Duração do sono (min)

Veículo 2,68 + 0,2 27,4 + 5,03

Pluc 10 2,61 + 0,2 36,3 + 4,31

Pluc 50 2,30 + 0,07* 76,7 + 6,94*

Pluc 100 1,80 + 0,09* 114,7 + 5,65*

Pluc 200 1,80 + 0,05* 118,2 + 3,25*

DZP 5 1,30 + 0,07* 120,0 + 0*

Valores expressos em média + erro padrão da média. Valore * p<0,01, comparado com o

controle.

No teste de labirinto elevado, na tabela 7, os resultados mostram que há

semelhança de comportamento entre os animais que receberam administração de

diazepam, em comparação aos animais tratados com o extrato etanólico de P.

sagittalis na dose de 200 mg/Kg. Observa-se que o tempo gasto nos braços abertos,

pelos animais que receberam essa dose do extrato (178,60+9,15 seg.), mantém-se

estatisticamente semelhante ao tempo gasto pelos animais que receberam o

diazepam (184,20 + 38,68 seg.). Com base no efeito observado nas outras doses

administradas do extrato, verifica-se um possível efeito dose-dependente, no qual a

dose de 200 mg/Kg, por ser a mais elevada, tenha produzido o melhor efeito nesse

teste. Além disso, houve aumento significativo (p<0,01) no número de entradas nos

braços abertos pelos animais submetidos a essa dose.


55

Tabela 7 – Efeito da administração do extrato etanólico bruto de P. sagittalis, nas doses

de 10-200 mg/Kg, em comparação com a administração do veículo, controle, e da droga

padrão, diazepam (2 mg/Kg), no teste de labirinto em cruz elevado.

Parâmetros avaliados

Grupos Permanência em

braço aberto Permanência em

braço fechado Nº de entradas no

braço aberto Nº de entradas no

braço fechado

Veículo 58,60 + 19,48A 241,40 + 22,03

A 3,2 + 1,3

A 6,6 + 1,14

Pluc 10 73, 60 + 16,62A 227,60 + 17,52

A 5,2 + 0,84

A 8,2 + 0,84

Pluc 50 157,20 + 19,59B 154,20 + 29,35

B 6,8 + 1,48

B,C 7,8 +0,84

A

Pluc 100 131,80 + 12,99A 160,20 + 29,54

B 3,2 + 1,48

A 5,6 + 0,89

B

Pluc 200 178,60 + 9,15B,C

121,40 + 9,15B,C

6,2 + 0,84B,C

5,2 + 0,84A,C

DZP 2 184,20 + 38,68B,C

97,00 + 17,72B,C

7,0 + 1,0B,C

3,6 + 0,89A,C

Letras diferentes como expoente na mesma coluna indicam valores estatisticamente diferentes.

O extrato etanólico de P. sagittalis nas doses de 100 e 200 mg/Kg teve efeito

protetor, observado pelo curto tempo de duração das convulsões e da ausência de

morte dos animais tratados com essas doses, em comparação com os animais do

grupo controle (Tabela 8).

Tabela 8 – Efeito da administração do extrato etanólico bruto de P. sagittalis, nas doses

de 50-200 mg/Kg, em comparação com a administração do veículo, controle, e da droga

padrão, diazepam (3 mg/Kg), no teste anticonvulsivante induzido por pentilenotetrazol.

Grupos Animais N° de

convulsão Duração da convulsão

Animais/ convulsão Morte Proteção

Veículo 6 20,2 153,3 6 6 0

Pluc 10 6 22,0 97,6 6 1 83,3

Pluc 50 6 22,4 27,2* 6 1 83,3

Pluc 100 6 5,8* 12,6* 6 0 100

Pluc 200 6 0,6* 2,8* 1 0 100

Diaz 3 6 0* 0* 0 0 100

Valores expressos em média + erro padrão da média. Valore * p<0,05, comparado com o

controle.

A atividade anticonvulsivante do extrato na dose 200 mg/Kg demonstrou ser

capaz de proteger os animais na latência da convulsão, uma vez que, apenas um


56

animal desenvolveu as contrações tônicas, resultado semelhante ao observado com

os animais tratados com diazepam 2 mg/Kg.

6. Discussão

Transtorno de ansiedade é uma das doenças mentais mais comuns

manifestadas no homem (RABBANI et al., 2007). Os benzodiazepínicos são utilizados

como o principal grupo de medicamentos no tratamento de diferentes formas de

ansiedade. Apesar de seus benefícios, existem vários efeitos colaterais, como

sedação, relaxamento muscular, amnésia e dependência física (SOUZA et al., 2008).

Os mecanismos mais explorados para compreensão e tratamento da ansiedade,

relacionam-se à ação de drogas nos sistemas gabaérgico (UHLENHUTH et al., 1999)

e serotoninérgico (PINHEIRO et al., 2002, ANDREATINI et al., 2001).

A busca por novas alternativas terapêuticas no tratamento das TAGs, que

resultem em maior eficácia e menos efeitos colaterais, em comparação aos

tratamentos tradicionais, provocou um aumento no número de pesquisas utilizando

plantas medicinais com essa finalidade, nas últimas décadas (SOUSA et al., 2008). Na

medicina popular, algumas espécies de plantas são usadas como calmante, devido a

sua potencial ação depressora sobre o sistema nervoso central, tais como Passiflora

incarnata, Valeriana officinalis e Piper methysticum (kava-kava) (QUINTANS-JÚNIOR

et al., 2008, TABACH et al. , 2009).

Drogas vegetais são caracterizadas, no Brasil, como a planta medicinal ou

suas partes, após processamento, na forma triturada ou pulverizada (BRASIL, 2004).

Quando essas substâncias apresentam efeitos associados ao SNC, são

caracterizadas como drogas psicoativas, e, sua ação pode proporcionar alterações

fisiológicas e comportamentais no ser humano, interferindo na capacidade cognitiva,


57

nos padrões de pensamento e humor, sendo classificadas como: estimulantes,

depressoras ou alucinógenas (ALMEIDA, 2006). A investigação farmacológica de

produtos naturais, que apresentam atividade sobre o SNC, tem auxiliado a

compreensão das bases neuroquímicas de muitas doenças (PASSOS et al., 2009).

As espécies da família Asteraceae são amplamente estudadas por

apresentarem componentes químicos de interesse farmacológico, a exemplo de

poliacetilenos, lactonas, óleos essenciais e terpenos, do tipo sesquiterpenos

(STEFANELLO, 1993). Com relação ao gênero Pluchea, é descrita a presença de

flavanóides e terpenos como compostos característicos do grupo (REYES-TREJO,

JOSEPH-NATHAN, 1999), como arguticinina (AHMAD, FIZZA, 1998) e pluchecinina

(AHMAD et al., 1989). Neste estudo, determinou-se a presença de alcalóides,

cumarinas, flavanóides, taninos, fenóis, saponinas e terpenos no extrato etanólico de

P. sagittalis. Estes resultados estão em correspondência com os estudos de outras

espécies do gênero, que destacam a presença de alcalóides em P. odorata e P.

tomentosa (CÓRDOVA et al., 2006), lactonas, taninos, terpenos e flavanóides em P.

carolinensis (CÓRDOVA et al., 2006, PEREIRA et al., 2007) e fenóis, como ácido

cafeiolquinico em P. sagitallis (MARTINO et al., 1979).

Barros et al. (2006), descrevem a possibilidade dos constituintes β-amirina,

stigmasterol e taraxasterol estarem relacionas à ação farmacológica da planta. Na

análise realizada para identificação dos compostos presentes no extrato etanólico de

P. sagittalis, verificou-se que a ß-aminina e stigmasterol estão presentes em

concentrações muito baixas, sendo observada apenas quando o extrato é fracionado

com solventes de muito baixa polaridade (hexano), sugerindo que estes não sejam,

necessariamente, os compostos responsáveis pelos efeitos farmacológicos

observados com esse extrato.

Nas análises de RMN de três compostos isolados do extrato etalólico de P.

sagittalis, identificou-se a presença de compostos terpênicos, do tipo sesquiterpenos.


58

Em estudos com o extrato hexânico desta planta, foram identificados sesquiterpenos

derivados eudesmane, stigmasterol, ß-amirina, taraxasterol e pseudo-taraxasterol,

entre outros (GUILHON, MÜLLER, 1996, GUILHON, MÜLLER,1998, VERA et al.,

2008).

Os compostos terpênicos são substâncias do metabolismo secundário das

plantas derivados da biossíntese dos isoprenos. Na medicina popular, assim como na

terapêutica, plantas contendo derivados terpênicos têm sido usadas por apresentarem

atividades sedativas, tranqüilizantes e anticonvulsivantes. Entre os vários

sesquiterpenos de ação sobre o SNC, o ácido valerênico é um dos compostos

responsáveis pelos efeitos da Valeriana officinalis, cuja ação ocorre sobre o sistema

GABAérgico (PASSOS et al., 2009).

Estudos farmacológicos de plantas do gênero Pluchea têm demonstrado

atividade anti-inflamatória e analgésica de P. quitoc (BARROS et al., 2006), antioxidant

de P. carolinensis (PEREIRA et al., 2006), e atividade indutora do sono e redutora da

atividade motora de Pluchea indica (THONGPRADITCHOTE et al., 1999). Utilizada na

medicina tradicional da América do Sul, a Pluchea sagittalis é empregada no

tratamento de doenças do aparelho digestivo. Entretanto, efeitos anti-inflamatórios

foram demontrados em estudos de triagem de plantas medicinais, com características

semelhantes às outras espécies do gênero como P. lanceolata e P. indica (PÉREZ-

GARCÍA et al., 1996).

O extrato etanólico de P. sagittalis e respectivas frações demonstram potencial

efeito depressor do SNC no “screening” farmacológico comportamental. Este teste de

caráter preliminar é utilizado para avaliar as possíveis ações farmacológicas de extrato

de plantas medicinais e respectivas frações, através de observações detalhadas do

comportamento animal.

Nesse teste é possível caracterizar os prováveis efeitos da planta sobre o SNC,

frente a um agente psicofármaco. São observados parâmetros que caracterizam


59

toxicidade e ação estimulante ou depressora de plantas medicinais (CARLINI, 1972).

Os modelos comportamentais de ansiedade têm se demonstrado eficientes na

perspectiva de investigar novos compostos com potencial farmacológico sobre os tipos

de TAGs (GRAEFF; ZANGROSSI, 2002, LOLLATO et al., 2010).

Os resultados obtidos nos testes comportamentais demonstraram que o extrato

etanólico de P. sagittalis, especialmente na dose de 200 mg/Kg, apresenta potencial

efeito depressor sobre o SNC, agindo como indutora e potencializadora do sono,

ansiolítica e capaz de proteger os animais contra convulsões induzidas por

pentilenotetrazol. Além de apresentar uma vantagem de não provocar sedação ou

perda da coordenação motora, quando comparados com as agentes farmacológicos

tradicionais, a exemplo dos bezodiazepínicos.

Sedação e déficit psicomotores podem ser produzidos pela exposição aos

benzodiazepínicos, aumentando os riscos de acidentes de viação e fraturas em

idosos, como consequência dos seus efeitos sobre o SNC (OTOBONE et al., 2005).

Em campo aberto e testes rotarod, os animais tratados com o extrato etanólico de P.

sagittalis demostraram uma redução dos comportamentos de ansiedade, sem

comprometer a atividade motora dos animais, sendo esta uma vantagem considerável

da utilização dessa planta, em relação a outras terapêuticas utilizadas como

ansiolítica. Estes testes permitem avaliar a coordenação motora dos animais após

administração de fármacos, seja por sedação e/ou por relaxamento muscular.

Os resultados obtidos no teste do sono induzido por pentobarbital mostrou que

o extrato etanólico de P. sagittalis foi capaz de reduzir a latência do sono e

potencializar o sono induzido por pentobarbital em camundongos. O efeito observado

nos animais tratados com o extrato demonstrou-se semelhante quando comparado ao

grupo diazepam. Este efeito pode ser observado em muitos ansiolíticos, hipnóticos e

drogas anti-epiléticas que foram administradas para causar prolongamento do

pentobarbital, induzidas por tempo de sono (KIM et al., 2007).


60

Estudos realizados com Cinnamomum cassia Blume demonstraram que

animais tratados com o extrato etanólico apresentaram aumento no número de

entradas e no tempo gasto nos braços abertos no teste de labirinto em cruz elevado,

mas não alterou a atividade locomotora no campo aberto. A ação ansiolítica observada

com o extrato dessa planta é regulada pelos sistemas gabaérgico e serotonérgico,

comprovada pelo uso de drogas antagonistas seletivas (YU et al., 2007).

Os comportamentos observados nesse estudo são compatíveis com os dados

obtidos com o extrato etanólico de Pluchea sagittalis. A associação entre os efeitos

ansiolíticos, hipnóticos e anticonvulsivantes observados aqui, sugerem a ação do

extrato sobre o sistema GABAérgico, uma vez que este receptor tem uma interação

direta de compostos benzodiazepínicos e barbitúricos, e as substâncias que interagem

no mesmo local podem promover e prolongar o sono comportamentos para reduzir

ansiedade.

Contudo, a ação do extrato sobre o sistema serotoninérgico é descartada, uma

vez que os efeitos de sedação e alterações motoras esperados na modulação do

sistema GABAérgico não são observados com a administração do extrato em questão,

sendo necessário a realização de estudos com antagonistas desses receptores para

confirmação dos mecanismos de ação do extrato desta planta.


61

7. Conclusão

Conclui-se que o extrato etanólico de Pluchea sagittalis (Lam.) Cabrera

apresenta atividade depressora do sistema nervoso central reduzindo os sinais de

ansiedade, sem causar alterações motoras ou sedação, efeitos possivelmente

resultante da participação dos compostos terpênicos presentes no extrato.

Com base nos efeitos observados, acredita-se que a ação desse extrato seja

sobre o sistema GABAérgico, não descartando a possibilidade de interação com o

sistema serotoninérgico, tendo em vista que, algumas plantas medicinais, que

provocaram as mesma alterações de comportamento em animais, agem nos dois

sistemas.

Sugere-se a realização de novos estudos fitoquímicos do extrato etanólico de

Pluchea sagittalis, que permitam a identificação dos compostos. Indica-se também

realização de experimentos utilizando drogas antagonistas em modelos

comportamentais pré-clínicos na tentativa de compreender melhor os mecanismos de

ação desse extrato sobre o sistema nervoso central.


62

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75

9. Anexos


76

Anexo 1 – Registro da P. sagittalis no herbário da Universidade Federal de Sergipe em 1982.


77

Anexo 2 – Registro da P. sagittalis no herbário da Universidade Federal de Sergipe em 1988.


78

Anexo 3 – Liberação do Comitê de Ética em Pesquisa – CEP-UNIT.


79


80

Anexo 4 – Parâmetros Avaliados na Prospecção Farmacológica Comportamental

PROSPECÇÃO FARMACOLÓGICA COMPORTAMENTAL

Nome da planta :___________________________Dose:___________Parte usada:_______

Veículo:_______________Data: ___/___/___Via de administração:___________________

Espécie animal:_____________________Sexo:____Responsável técnico:______________

Grupos:___________________________________________________________________

Atividade

farmacológica

Instantes de observações

0,5h 1h 2h 3h 4h

1-SNC

a)Estimulante

Hiperatividade

Irritabilidade

Agressividade

Tremores

Convulsões

Piloereção

Mov. Int. vibrissas

b)Depressora

Hipnose

Ptose palpebral

Sedação

Anestesia

Ataxia

Refle. Endireita.

Catatonia

Analgesia

Res.Toque dimin.

Refl. Corne dim


81

Refl. Auri.dimi.

c)outros

Ambulação

Bocejo excessivo

Auto limpeza

Levantar

Escalar

Vocalizar

Sacudir a cabeça

Contorção abdom

Abdução posterior

Pedalar

Estereotipia

2-SNA

Tipo de fezes

Respiração forçada

Lacrimejamento

Micção

Salivação

Cianose

Tono muscular

Força para agarrar

Quantificação dos efeitos: (0): sem efeito; (-): efeito diminuído; (+): efeito presente; (++): efeito

intenso.


82

Anexo 5 – Cromatograma do extrato etanólico de Pluchea sagittalis extraído com Hexano 100%.


83


84

Anexo 6 - Cromatograma do extrato etanólico de Pluchea sagittalis extraído com Hexano:Xileno 80:20

(v/v).


85


86

Anexo 7 - Cromatograma do extrato etanólico de Pluchea sagittalis extraído com Hexano:Clorofórmio

50:50 (v/v).


87


88

Anexo 8 - Cromatograma do extrato etanólico de Pluchea sagittalis extraído com Clorofórmio 100%.


89


90

Anexo 9 - Cromatograma do extrato etanólico de Pluchea sagittalis extraído com Clorofórmio:Acetato

de etilo 70:30 (v/v).


91


92

Anexo 10 - Cromatograma do extrato etanólico de Pluchea sagittalis extraído com Acetonitri-

lo:Acetona 30:70 (v/v).


93

Anexo 11 - Cromatograma do extrato etanólico de Pluchea sagittalis extraído com Acetonitrino 100%


94


95

Anexo 12 - Cromatograma dos fenóis totais obtidos do extrato etanólico de Pluchea sagittalis

apresentando os picos referentes à β-amirina estigmasterol.

86

Anexo 13 – Espectro de RMN C13 da fração F1 isolada do extrato etanólico por Cromatografia em coluna.

87

Anexo 14 – Espectro de RMN 1 da fração F1 isolada do extrato etanólico por Cromatografia em coluna.

* Corresponding author. Tel.: +55 79 32182190; Fax: +55 79 32182190. E-mail addresses: [email protected]

Anxiolytic effect of the ethanolic extract of the Pluchea sagittalis (Lam.) Cabrera, Asteraceae,

in behavioral models.

S. A. Rodrigues1*, A. A. Souza2, M. Z. Gomes1, L. Xavier-Filho1

1 Instituto de Tecnologia e Pesquisa (ITP), Universidade Tiradentes (UNIT), Av. Murilo Dantas,

300, Farolândia, 49032-490, Aracaju, Sergipe, Brazil.

2 Departamento de Fisiologia, Universidade Federal de Sergipe (UFS), Campus Universitário

“Prof. Aloísio de Campos”, 49100-000, São Cristóvão, Sergipe, Brazil.

Abstract

Pluchea sagittalis (Lam.) Cabrera, Asteraceae, is one medicinal plant of South American, used

to treatment of digestive disease and inflamations. In the study, the anxiolytic effect of

ethanolic extract (EE) from leaves of the P. sagittalis was evaluated using behavioral models in

animal. The EE (200 mg/Kg) know anxiolytic effect observed with increased the number of

entries and the time they remained into the open arms in the elevated plus maze test,

prolonged the during of sleep in pentobarbital-induced sleep test (100 e 200 mg/Kg). In the

open field and rotarod tests, not was observed sedation or motor impairment of animals

treated with EE. The behavioral observed in this study, suggest the potential anxiolytic and

sleep-inducing caused by EE of Pluchea sagittalis.

Keywords: Pluchea sagittalis; elevated plus-maze; pentobarbital-induced sleep; anxilytic.

1. Introduction:

The plants of the genus Pluchea, a member of the family Asteraceae, tribu Inuleae, consist of

appromately 80 species distributed in the countries of South American, Asian, Africa and

Australia (Venable, Levin, 1983; Bremer, 1994). Pluchea sagittalis (Lam.) Cabrera, known as

“yerb lucero”, “quitoc” or “tabacarana”, and synonymous: Gnaphalium suaveolens Vell.,

Pluchea quitoc DC. Infusions from aerial parts of the plant is widely used in traditional

medicine as a chest, carminative, stomach agent, digestive disease and dolorous processes

(Lorenzi, Matos, 2002).

Phytochemical studies report the presence of eudesmane-type sesquiterpeniods (Guilhon,

Müller, 1996), flavanoids (Martino et al., 1976), caffeoylquinic derivatives (Martino et al.,

1979) and taraxasteryl acetate (Pérez-García et al., 2005).

Pharmacological studies has shown the anti-proliferative activity against human tumour cell

lines (Monks et al., 2002), the contribuition of an antioxidant mechanism to the anti-

inflammatory activity the aquous extract (Pérez-García et al., 1996), inhibition the expression

of the protein hsp72 in human neutrophilis whith dichloromethane extract (Pérez-García et

al., 2001), besides prolonged the sleep time indiced (Rodrigues, 2007). The ethanolic extract

from aerial parts of P. quitoc known to have action in control the hematopoietic response

during bacterial infection (Queiroz et al., 2000), anti-inflamatory and anti-noceptive activity


against pain induced (Barros et al., 2006) and the oral treatment, the extract know

gastroprotective action against gastric lesions induced by ethanol (Figueredo et al., 2011).

Therefore, considering the therapeutical attribuited to this plant, the main objective of this

work was to investigate the possible anxiolytic effects of the ethanolic extract from leaves of

the Pluchea sagittalis (Lam.) Cabrera.

2. Materials and Methods

2.1. Plant material

The specimens of P. sagittalis were collected in neighborhood Japãozinho, Aracaju, Sergipe,

Brazil. A voucher specimen (ASE 03048) was deposited in the Herbarium of the Department of

Botany, Federal University of Sergipe.

2.2. Extract preparation

The dry leaves of Pluchea sagittalis (1000 g) were powdered and ethanolic extact was

prepared by Soxleht extraction (8 h), then concentrated under reduced pressure, below 40°C.

2.3. Animals

In these experiments were using adult male Swiss mice (25-30 g) and male Wistar rats (200-

250 g) obtained from the Animal House of Tiradents University (UNIT). The animals were kept

in polypropylene cages at a room temperature of 22 + 2 °C with 12-h light/dark cicle and with

free Access to food and water. The animals were habituated to the laboratory condictions for

24 hours before testing. The experiments were always conduced between 14:00 and 18:00 h.

The experiments were approved by the Research Ethics Committe of the Unit (Protocol n°

070209). The animals was used only once during the experiments.

2.4. Extract administration

The EE was dissolved in destilled water with 5% DMSO (v/v) before experiments. Control group

were treated with vehicle and diazepam (DPZ, Roche). The all substances was administered

orally (p.o., gavage) 30 min before the experiments.

2.5. Behavioral evaluation

2.5.1. Elevated plus-maze


The Wistar rats were distributed in six groups of 6 animals treated with EE (10, 50, 100 and 200

mg/Kg, oral), control and diazepam (2 mg/Kg) were submitted to the elevated plus maze. The

number of entries into in the closed and open arms as well as how long they stayed there

within were registred for 5 min. The higher the entries and the time remained in the open

arms were considered lower their level of emotionality (Lister, 1987).

2.5.2. Pentobarbital-induced sleep

Mice were distributed in six groups of 6 animals treated with EE (10, 50, 100 and 200 mg/Kg,

oral), control and diazepam. The animals recived 50 mg/Kg of sodium pentobarbital (Cristália)

injected intraperitoneally (i.p.). The latency and duration of sleep were registered for time limit

fixed at 2 hours (De-Paris et al., 2000).

2.5.3. Open Field

Mice treate with EE (10, 50, 100 and 200 mg/Kg, oral), control and diazepam. Affter 30 min, all

animals were submitted to the open-field test, during for 5 min. Were registered the number

of grooming and ambulation (Tabarelli et. al., 2004).

2.5.4. Rotarod

This method was used to observe motor activity and sedation of animals. Mice was trained on

a rotarod for 3 min, three times on the day prior to the experiment. The animals were

submitted at rotarod after 30, 60 and 90 min the administration the substances (EE, vehicle

and diazepam). The times that the mice remained on the rotating rod were recorded. The time

limit was fixed at 3 min (Oliveira et al., 2008).

2.6. Statistical analysis

The results were presented as means + S.E.M. for six animals per group. Differences between

control and treatment groups were tested for significance P<0,05 by ANOVA followed by Tukey

test.

2.7. Results

In table 1, the results of the EE in elevated plus maze test showed an increase of time spent

and numbers of entries in the open arms in groups treated with EE using doses 200 mg/kg

(p.o.). This behavioral was similar results occur in standard group (DZP 2 mg/kg, p.o.). The

anxiolytic effect is driven by the conflict between fear (open space and novelty) and

exploration (novelty). Anxiolytic drugs increase the number of entries into and/or time in open


arms. The outher doses tested did not had statistical significance in comparasion with control

group.

TABLE 1

Administration of the EE of the P. sagittalis caused a decrease in the latency and an increase

on the sleeping time induced by pentobatbital (Table 2). The results demonstrated the

depressant effect of the extract, similar to that observed in animals treated with diazepan.

TABLE 2

Table 3 shows the motor activity the animals submitted of open field test, were analyzed the

number of crossings and the ambulation time. The treatment with EE (10-200 mg/Kg, p.o.) did

not show alter the ambulation of mice in the open Field test.

TABLE 3

In the rotarod test were evaluated the motor activity parameters, since the EE of P. sagittalis

prolonged sleep time of the animals, featuring the hypnotic effect of the plant. In this test, it

did not alter any parameters evaluated (Figure 1), demonstrating that it does not impair the

motor coordination of the animals and does not manifest neurotoxic effects as well,

confirming the effect of the open field test.

FIGURE 1

2.8. Discussion

Anxiety disorder is one of most common mental diseases manifested by humans (Rabbani et

al., 2007). Benzodiazepines are used as the main group of drugs in the treatment of different

forms of anxiety. Despite its benefits, there are several side effects such as sedation, muscle

relaxation, amnesia and physical dependence (Souza et al., 2008). These effects are resulting

from the action of these drugs on the GABAergic system in the central nervous system

(Uhlenhuth et al., 1999).

The need for alternative therapies that result in fewer side effects has stimulated the conduct

of research using medicinal plants in treating anxiety disorders. In folk medicine some species

are used for their potential on the central nervous system controlling the signs of anxiety, such

as Passiflora incarnata,Valeriana officinalis and Piper methysticum (kava-kava) (Quintans-

Júnior et al., 2008, Tabach et al., 2009).

The plants of genus Pluchea are used in the treatment of several conditions, including

desorders of the bowel and kidney (Sen et al., 2002). Extract of the Pluchea indica Less.

demonstrated sleep-inducing activity and decreased locomotor activity of rats

(Thongpraditchote et al., 1999).

The results obtained in the pentobarbital-induced sleep test showed that EE of the P. sagittalis

potentiates pentobarbital-induced sleep behaviors in mice, the effect observed in animals

treated with EE demonstrated decreased similarly when compared to diazepam. This effect


can be observed in many hypnotic, antianxiety and antiepilepsy drugs have been shown to

cause prolongation of pentobarbital-induced sleep time (Kim et al., 2011).

The association between anxiolytic and hypnotic effects observed in this study suggest the

action of the EE on the GABA receptor, since this receptor has direct interaction of

benzodiazepines and barbiturates compounds, and substances that interact on the same site

can promote and prolong sleep behaviors to reduce anxiety (Möhler et al., 2002).

Sedative and psychomotor deficits produced by benzodiazepine exposure are associated with

an increased risk of motor vehicle accidents and hip fracture rates in the elderly, especially

with longer acting compounds (Otobone et al., 2005). In open field and rotarod tests, the

animals treated with EE showed a reduction in anxiety jams without compromising motor

activity, so the EE P. sagittalis had a considerable advantage over other herbal extracts used

for this purpose.

2.9. Conclusion

In synthesis, the present study shows that EE was able in reducing the anxiety of the animals

when assessed in the behavioral models. This anxiolytic effect can be observed in other plants,

though the Pluchea sagittalis brings the advantage of the absence of sedative effects and

relaxing common between plants considered anxiolytic.

Acknowlegement

The authors are grateful to the RENORBIO and Instituto de Tecnologia e Pesquisa (ITP) for

infrastructure and financial support. The authors like to express their sincere thanks to Marília

Trindade and Prof. Dr. Lucindo J. Quintans-Júnior from Universidade Federal de Sergipe.

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