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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR CHRISTIANY DO NASCIMENTO TAVARES EFEITO DA INOCULAÇÃO DO FUNGO TRICHODERMA HARZIANUM RIFAI NO DESENVOLVIMENTO DE UMA VARIEDADE DO FEIJOEIRO COMUM (PHASEOLUS VULGARIS L.) Goiânia – GO 2007
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE GOIÁS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: BIOLOGIA CELULAR E MOLECULAR
CHRISTIANY DO NASCIMENTO TAVARES
EFEITO DA INOCULAÇÃO DO FUNGO TRICHODERMA
HARZIANUM RIFAI NO DESENVOLVIMENTO DE UMA VARIEDADE DO FEIJOEIRO COMUM (PHASEOLUS VULGARIS L.)
Goiânia – GO
2007
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CHRISTIANY DO NASCIMENTO TAVARES
EFEITO DA INOCULAÇÃO DO FUNGO TRICHODERMA
HARZIANUM RIFAI NO DESENVOLVIMENTO DE UMA VARIEDADE DO FEIJOEIRO COMUM (PHASEOLUS VULGARIS L.)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Biologia
Orientador: Prof. Dr. Tomás de Aquino Portes e Castro Co-orientador: Prof. Dr. Cirano José Ulhoa
Goiânia – GO 2007
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CHRISTIANY DO NASCIMENTO TAVARES
EFEITO DA INOCULAÇÃO DO FUNGO TRICHODERMA
HARZIANUM RIFAI NO DESENVOLVIMENTO DE UMA VARIEDADE DO FEIJOEIRO COMUM (PHASEOLUS VULGARIS L.)
Dissertação defendida no Curso de Mestrado em Biologia da Universidade Federal de Goiás, para obtenção do grau de Mestre, aprovada em _________ de _________, pela Comissão Examinadora constituída por:
---------------------------------------------------------------------- Prof. Dr.Tomás de Aquino Portes e Castro
Orientador/Presidente UFG
----------------------------------------------------------------------- Prof. Dr. Agostinho Dirceu Didonet
Membro Titular UFG
------------------------------------------------------------------ Dr. Adilson Lopes Lima
Membro Titular
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“Dedico esse trabalho à Deus, aos meus pais, Francisco e Gertrudes, e às minhas irmãs Emmanuelly e Kelly, que sempre deram força e ânimo em minha caminhada. Agradeço-lhes todo amor e todo carinho.”
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AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de Goiás pela estrutura oferecida para realização deste trabalho.
Ao órgão financiador CAPES que me auxiliou com o fornecimento da bolsa de mestrado.
Ao professor e orientador dessa dissertação, Dr. Tomás de Aquino Portes e Castro.
Ao professor e co-orientador dessa dissertação, Dr. Cirano José Ulhoa.
Ao pesquisador da Embrapa Arroz e Feijão, Dr. José Benedito Trovo, pelo auxílio na
utilização do programa SAS.
Ao pesquisador da Embrapa Arroz e Feijão, Dr. Nand Kumar Fageria, e ao Prof. Dr.
Wilson Mozena Leandro pelos ensinamentos sobre solo.
Aos amigos e colegas do laboratório de Fisiologia Vegetal Cíntia, Daiana, Joyce,
Leandro, Maloni, Michele e Rodrigo pelo companheirismo e ajuda durante este trabalho.
Aos amigos e colegas do Laboratório de Enzimologia.
Ao meu namorado, Wesley, pela ajuda e carinho durante o desenvolvimento deste
trabalho.
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"Se você tem uma maçã e eu tenho uma maçã, e trocarmos estas maçãs, então eu e você teremos ainda apenas uma maçã. Mas se eu tenho uma idéia e você tem uma idéia, e trocarmos nossas idéias, então cada um de nós terá duas idéias." George Bernard Shaw
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SUMÁRIO LISTA DE TABELAS.................................................................................................. 7 LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS.................................................................... 8 RESUMO ..................................................................................................................... 9 ABSTRACT ............................................................................................................... 10 1 – INTRODUÇÃO.................................................................................................... 11 2 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .............................................................................. 13
2.1-Cultura do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.) ......................................... 13 2.2 - Gênero Trichoderma ....................................................................................... 17 2.3 - Aplicação do Trichoderma na agricultura........................................................ 19
2.3.1 - Controle biológico.................................................................................... 19 2.3.2 - Promoção de crescimento ......................................................................... 23
3 - OBJETIVO............................................................................................................ 28 3.1 - Objetivos gerais .............................................................................................. 28 3.2 - Objetivos específicos ...................................................................................... 28
4 – MATERIAL E MÉTODOS................................................................................... 29 4.1 - Local de condução do experimento ................................................................. 29 4.2 - Solo ................................................................................................................ 29
4.2.1-Preparo do solo .......................................................................................... 29 4.3 - Origem e manutenção dos fungos.................................................................... 30 4.4- Sementes.......................................................................................................... 30
4.4.1 - Esterilização das sementes........................................................................ 31 4.4.2 - Tratamento das sementes.......................................................................... 31
4.5 - Teste de germinação in vitro ........................................................................... 31 4.6 - Plantio ............................................................................................................ 31 4.7 - Análise do material vegetal ............................................................................. 32
4.7.1- Estimativa da área foliar ............................................................................ 32 4.7.2 – Avaliação direta da planta........................................................................ 33
4.7.2.1 – Área foliar................................................................................. 33 4.7.2.2 – Volume radicular....................................................................... 33 4.7.2.3 – Massa seca ................................................................................ 33
4.8 - Avaliação do solo............................................................................................ 34 4.8.1 - Determinação de atividade da fosfatase ácida do solo............................... 34 4.8.2 – Determinação do pH do solo.................................................................... 35 4.8.3 – Determinação do fósforo disponível no solo ............................................ 35 4.8.4 – Determinação da massa orgânica do solo (MOS) ..................................... 35 4.8.5 - Recuperação de isolados de Trichoderma a partir de solo ......................... 36
4.9 - Análise estatística dos dados ........................................................................... 36 5- RESULTADOS ...................................................................................................... 37 6 – DISCUSSÃO ........................................................................................................ 47 7 – CONCLUSÃO...................................................................................................... 55 8 – PERSPECTIVAS.................................................................................................. 56 9 - REFERÊNCIAS .................................................................................................... 57 ANEXOS.................................................................................................................... 66
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LISTA DE TABELAS TABELA 1 – Atributos físico-químicos do solo avaliados antes do plantio em
profundidade de 0 a 20 cm.
TABELA 2 - Análise de variância da regressão para determinação de área foliar
estimada.
TABELA 3 – Taxa de germinação in vitro de sementes de feijão inoculadas com
isolados de Trichoderma harzianum
TABELA 4 – População de Trichoderma harzianum contida nas amostras de solo
coletadas aos 45 e 66 DAE do feijoeiro.
TABELA 5 - Área foliar das plantas de feijão submetidas ao tratamento das sementes
com diferentes isolados de Trichoderma harzianum.
TABELA 6 – Altura das plantas de feijão submetidas ao tratamento das sementes com
diferentes isolados de Trichoderma harzianum.
TABELA 7 – Massa seca final das plantas de feijão submetidas ao tratamento com
diferentes isolados de Trichoderma harzianum.
TABELA 8 – Atividade de fosfatase ácida do solo da rizosfera das plantas de feijão
tratadas com diferentes isolados de Trichoderma harzianum obtidos aos 45 e 66 DAE.
TABELA 9 – Conteúdo de fósforo disponível em amostras de solo coletadas da
rizosfera das plantas de feijão aos 45 e 66 DAE tratadas com diferentes isolados de
Trichoderma harzianum.
TABELA 10 – Valores de pH e matéria orgânica do solo da rizosfera das plantas de
feijão tratadas com diferentes isolados de Trichoderma harzianum obtidos aos 45 e 66
DAE.
TABELA 11 – Correlação entre dados da planta e dados do solo coletados aos 45 DAE.
TABELA 12 – Correlação entre dados da planta e dados do solo coletados aos 66 DAE.
TABELA 13 – Correlação entre as variáveis analisadas do solo coletado aos 45 DAE.
TABELA 14 - Correlação entre as variáveis analisadas do solo coletado aos 66 DAE.
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
°C Graus centígrados
p/v Parte/volume
MOS Matéria orgânica do solo
MS Massa seca
P Fósforo
K Potássio
ρ-NP ρ-nitrofenol
ρ-NPP ρ-nitrofenilfosfato
µL Microlitro
mL Mililitro
mM Milimolar
mm Milímetro
min Minutos
N Normal
rpm Rotações por minuto
ufc Unidade formadora de colônia
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RESUMO
O presente trabalho teve por objetivo verificar a capacidade de isolados de Trichoderma
harzianum Rifai de solos do cerrado em promover o crescimento de feijoeiro. Este experimento foi conduzido em casa de vegetação para avaliação do efeito da inoculação das sementes com esporos de quatorze isolados de T. harzianum. O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, constando de quinze tratamentos (sementes inoculadas com ALL-05, ALL-08, ALL-15, ALL-20, ALL-21, ALL-22, ALL-24, ALL-28, ALL-38, ALL-42, ALL-43, ALL-47, ALL-49, ALL-52 e semente não inoculada) e quarto repetições. Somente os isolados T. harzianum ALL-15, ALL-42 e ALL-43 foram capazes de se estabelecer no solo até o final do experimento. Não foram verificados efeitos na taxa de germinação das sementes in vitro, na altura, área foliar e massa seca das plantas durante o cultivo. A avaliação da atividade de fosfatase ácida do solo mostrou redução devido ao tratamento com alguns isolados de T. harzianum em relação ao controle. A medida final do pH, material orgânica e fósforo disponível do solo não foi alterada pelos tratamentos. Os isolados testados não foram eficientes em colonizar o solo e melhorar o desenvolvimento do feijoeiro de acordo com os parâmetros avaliados. Palavras-chave: Trichoderma harzianum, feijoeiro, promotor de crescimento e fosfatase ácida.
10
ABSTRACT
The present work aims to verify the capacity of isolates of Trichoderma harzianum Rifai from Cerrado’s soil to promote growth of bean plants. This experiment was conduced in a greenhouse conditions to evaluate the effects of bean´s seed inoculation with spores from fourteen isolates of T. harzianum. The experimental design was completely randomized with fifteen treatments (seeds inoculated with isolates ALL-05, ALL-08, ALL-15, ALL-20, ALL-21, ALL-22, ALL-24, ALL-28, ALL-38, ALL-42, ALL-43, ALL-47, ALL-49, ALL-52 and non inoculated seeds) and four replications. Only the isolates T. harzianum ALL-15, ALL-42 e ALL-43 were capable to establish in the soil until the end of the experiment. Effects in vitro were not verified in the rate of germination of the seeds, on height, leaf area and dry matter of the plants during cultivation. The evaluation of the soil phosphatase acid activity showed reduction due treatment with some T. harzianum isolates related to the control. The final measure of the pH, organic matter and phosphorous available on soils were not altered by the treatments. The isolated ones tested were not efficient in colonizing the soil and they were not capable to improve the development of the bean plant according to the evaluated parameters. Keywords: Trichoderma harzianum, bean plant, growth promoter and acid phosphatase.
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1 – INTRODUÇÃO
Trichoderma harzianum Rifai é um fungo imperfeito, habitante
principalmente do solo, matéria orgânica e árvores em decomposição (Samuels, 1996;
Gams & Bisset, 1998). É um fungo bastante estudado na atualidade devido às suas
aplicações na agricultura e na indústria.
A aplicação de T. harzianum como agente de controle biológico tem
mostrado bons resultados no controle de fitopatógenos que comprometem a produção
do feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) e de outras plantas. Esses efeitos já vêm sendo
observados a um tempo significativo, como por exemplo, temos os resultados
observados por Hadar et al. (1979), onde verificou que a podridão radicular causada por
Rhizoctonia solani na cultura do feijoeiro, tomate e berinjela foi controlada pela adição
de T. harzianum ao solo. Hoje, existem no mercado vários produtos formulados a base
de Trichoderma para serem aplicados no cultivo das plantas para redução de
fitopatógenos.
T. harzianum tem mostrado ainda, associação positiva com outros
organismos como observado por Jayanthi et al. (2003), onde T. harzianum mostrou
estimular a colonização das raízes das plantas por micorriza e a esporulação de Glomus
mossea.
A aplicação de Trichoderma em plantas de feijão, milho, trigo, alface,
tomate, algumas espécies de flores, dentre outras, tem se mostrado eficaz em promover
aumentos em massa seca e em produtividade de frutos e grãos destas espécies. Vários
mecanismos têm sido sugeridos como possíveis explicações para este fenômeno, como:
controle de patógenos menores, produção de hormônios vegetais, produção de
vitaminas, conversão de materiais não utilizáveis em formas que possam ser utilizadas
pela planta, e aumento da absorção e translocação de minerais (Baker, 1989; Kleifeld
and Chet, 1992). Porém, um dos principais mecanismos apontados como responsáveis
pela promoção de crescimento em plantas é a disponibilização de fósforo para as
mesmas à partir da ação solubilizadora de Trichoderma sobre compostos fosfatados
encontrados em formas não assimiláveis pelas plantas.
O fósforo participa dos vários processos fisiológicos e bioquímicos nas
plantas, porém, sua influência na cultura do feijoeiro está no aumento da produção de
massa seca da parte aérea, no aumento do número de vagens e da massa de grãos, que
são os principais determinantes do aumento da produtividade (Fageria et al., 2004).
12
Como a maioria dos solos brasileiros apresenta altos teores de P total, mas a
maior parte se encontra sob formas pouco solúveis, indisponíveis para os vegetais, a
aplicação de fertilizantes fosfatados tem sido utilizada para suprir a deficiência de P do
solo. Porém, uma parte considerável é convertida a compostos insolúveis de Fe e Al, em
solos ácidos, ou de Ca, em solos com reação neutra a alcalina (Raji, 1991).
O feijoeiro apresenta grande importância na alimentação dos brasileiros,
contudo, necessita de aumentos na qualidade e produtividade de grãos para que possa
atender melhor ao mercado consumidor. Considerando-se que um dos fatores que mais
limitam o desenvolvimento e a produtividade do feijoeiro é a quantidade de fósforo no
solo, foi de interesse do presente trabalho aplicar T. harzianum durante a fase inicial de
cultivo do feijoeiro esperando-se um aumento na solubilização do fósforo, tornando-o
absorvível pelas raízes e provendo, assim, melhor condição nutricional e um
conseqüente ganho em produtividade.
A aplicação de diferentes isolados de T. harzianum neste trabalho buscou a
identificação de potenciais promotores de crescimento de plantas. Podendo estes, a
partir de estudos mais aprofundados, ser aplicados no cultivo das plantas em escala
comercial em substituição ou em conjunto aos insumos já aplicados, com conseqüente
redução do custo de produção e menores danos ao meio ambiente.
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2 – REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1-Cultura do feijoeiro comum (Phaseolus vulgaris L.)
O feijoeiro (Phaseolus vulgaris L.) está classificado como pertencente ao
gênero Phaseolus, subclasse Rosidae, ordem Fabales, família Fabaceae (Cronquist,
1988 apud Silva et al., 2003). É uma planta de ciclo curto, considerada exigente em
nutrientes e com sistema radicular pequeno e superficial (Moraes, 1988) e de
metabolismo C3.
Os cultivares de feijoeiro são classificados segundo seu hábito de
crescimento em tipo determinado e indeterminado (Portes, 1988). Embora haja variação
na duração do ciclo da cultura do feijoeiro dentre os hábitos de crescimento, as
variedades cultivadas de feijão mais comuns apresentam um ciclo com duração média
de 90 dias (Almeida & Bulisani, 1980), iniciando o período de florescimento,
normalmente, a partir dos 40-45 dias após a emergência (DAE), para depois entrarem
nas fases de granação e de maturação.
As variedades de feijoeiro são muitas, de 1981 até o presente, no Brasil, as
comissões técnicas de feijão lançaram cerca de 45 cultivares, sendo quase a totalidade
de grãos consumida internamente. Dominam as áreas de cultivo no Brasil as variedades:
Carioca, Pérola, IPR-Uirapuru e BRS Valente (Kluthcouski et al., 2007).
O feijão comum (P. vulgaris L.) é uma importante fonte de proteínas e
calorias na dieta humana em países tropicais e subtropicais em desenvolvimento,
particularmente nas Américas e na África. Segundo Fageria (2002), é a leguminosa mais
importante para o consumo humano, principalmente nos países em desenvolvimento.
Segundo o nono levantamento da safra de grãos 2006/2007, realizado pela
Companhia Nacional de Abastecimento (CONAB), a área total de cultivo no Brasil na
safra 2006/07 é de 46,07 milhões de hectares. Desse total, o feijão ocupa 9,1%
(aproximadamente 4,19 milhões de hectares), tendo para a primeira, segunda e terceira
safra uma área de 1,33; 1,95 e 0,91 milhões de hectares, respectivamente.
A produção nacional do feijão na safra 2006/2007 está estimada em 3365,8
milhões de toneladas. Sendo 1456,8; 1159,6 e 749,4 mil toneladas a produção da
primeira, segunda e terceira safra, respectivamente. Esse incremento deve-se,
principalmente, ao aumento da produção nos estados do Paraná e Goiás.
14
O Paraná é o maior produtor nacional de feijão 1ª safra (422,3 mil toneladas)
representando 37,2% do total (1,14 milhões de toneladas) e 28,3% da área cultivada. O
estado é líder também na produção de feijão 2ª safra, com uma área plantada de 172 mil
hectares e produtividade de 1720 kg/ha. O centro-oeste apresenta maior produtividade
na 3ª safra com 2845 kg/ha. Considerando-se a produção total de feijão, o sul do país
apresenta maior produção com 1174,4 mil toneladas e o centro-oeste apresenta maior
produtividade com 1967 kg/ha.
O feijão é cultivado em mais de 100 países, porém, 63% da produção
mundial são obtidos em apenas cinco, sendo o Brasil o maior produtor e consumidor de
feijão-comum (P. vulgaris L.). Apenas 8% a 10% da produção mundial destinam-se à
exportação. Não obstante o grande volume de produção nacional, o Brasil é importador
desse produto. A quantidade importada varia em função dos resultados das safras. Nos
últimos anos foram importadas, em média, cerca de 100 mil toneladas. Da quantidade
importada, a maior parte é de feijão preto, seguida pelo feijão de cores. Os outros tipos
de feijões representam menos de 1% do total (Embrapa, 2007).
Mudanças importantes ocorreram na cultura do feijão. Em muitas
propriedades o seu cultivo se tornou altamente tecnificado e deixou de ser uma cultura
de subsistência. Para se ajustar a essa nova condição, os programas de melhoramento do
feijoeiro de várias instituições, além de objetivarem a produtividade e a resistência a
doenças, têm procurado obter cultivares que apresentem porte ereto e grãos com maior
aceitação comercial (Collicchio et al., 1997). Graças à abundância de radiação solar e a
pouca variação de temperatura durante as estações tropicais, a cada dia, novos recordes
de produtividade são alcançados, desde que o solo esteja adequadamente corrigido e
práticas adequadas de manejo sejam aplicadas (Kluthcouski et al., 2007).
Embora o feijão seja um dos alimentos básicos dos brasileiros e de outros
povos da América Latina, sua produtividade é baixa, sendo os fatores responsáveis por
isso a baixa fertilidade e a alta acidez dos solos, a deficiência hídrica, a suscetibilidade
da cultura a doenças e pragas e o uso da baixa tecnologia pelos produtores devido às
suas condições socioeconômicas (Fageria et al, 2004).
O feijoeiro é cultivado em diferentes tipos de solos nas várias partes do
mundo. Porém, nas regiões tropicais e subtropicais das Américas, inclusive no Brasil,
onde se encontra aproximadamente 47% da produção mundial, os solos
predominantemente são os Oxissolos, Ultissolos e Inceptissolos, que são ácidos, de
baixa fertilidade natural e possuem elementos tóxicos, como alumínio e manganês
15
(Fageria et al., 2004). A alta capacidade de fixação de fósforo (P), aliada a valores
extremamente baixos de P solúvel, tem sido considerada uma das limitações mais sérias
para o desenvolvimento das culturas nestes solos. O P é o elemento que mais limita a
produtividade do feijoeiro em um Oxissolo de Cerrado, seguido por nitrogênio e
potássio (Fageria et al., 2004). Vários estudos têm sido realizados no intuito de
identificar genótipos eficientes na utilização e absorção de fósforo como uma
ferramenta complementar para aumentar a produtividade e reduzir custos de produção
(Fageria, 1998).
O feijoeiro é considerado uma planta sensível ao estresse hídrico, tanto à
deficiência hídrica quanto ao excesso de água no solo (Nóbrega et al., 2001),
principalmente em virtude da baixa capacidade de recuperação após a deficiência
hídrica e sistema radicular pouco desenvolvido (Guimarães, 1996).
A adubação nitrogenada inadequada é outro fator que muitas vezes
determina o insucesso no cultivo do feijoeiro. Enquanto alguns produtores continuam
aplicando doses excessivas de N, outros aplicam quantidades insuficientes desse
elemento, limitando a produtividade da lavoura mesmo que outros fatores sejam
otimizados (Guerra et al., 2000). Segundo Portes (1996), embora o rendimento de grãos
de feijão tenha crescido acentuadamente nas últimas décadas, problemas de deficiência
nutricional ainda são freqüentes.
O baixo uso de tecnologia e a fragilidade agronômica da lavoura, que não
resiste bem à seca, ao excesso de chuvas e, ainda, é facilmente acometida por pragas e
doenças, provocaram frustrações freqüentes nas safras passadas, que resultaram em
disparadas de preços seguidos de super ofertas na safra seguinte. Esse excesso deprimia
os preços e desestimulava novamente os produtores. O comportamento ciclotímico da
produção e a possibilidade de produção de feijão em todos os estados, em várias épocas
do ano, começaram a despertar o interesse de um outro perfil de produtores, que
entraram na atividade com um sistema produtivo mais tecnificado (Kluthcouski et al.,
2007).
Outra característica importante no cultivo do feijoeiro é o insipiente uso de
sementes de qualidade. Estima-se que em apenas 10% da área cultivada no Brasil é
utilizada semente certificada sem, contudo, tratar-se de sementes livres de patógenos.
Estima-se também que o uso de sementes sadias possa resultar num aumento de
rendimento de grãos de até 45% (Kluthcouski et al., 2007). Com exceção da ferrugem e
16
do mosaico dourado, todas as doenças de importância econômica do feijoeiro são
transmissíveis pela semente (Sartorato & Rava, 1994).
O feijoeiro é muito suscetível a doenças e pragas, que acarretam maior ou
menor grau de comprometimento na produção de acordo com a época de incidência,
com a resistência da cultivar utilizada e com as condições do solo e clima. São várias as
espécies de fungos que habitam a planta do feijoeiro, estando várias delas relacionada
por Mendes et al. (1998). Costa et al. (2002) estudando a presença de fungos e
leveduras, isolou em sementes de feijão Penicillium spp., Aspergillus spp., Phoma spp.,
Ryzopus spp., Alternaria spp., Helminthosporium spp., Cladosporium spp., Botrytis
spp., Fusarium spp., Trichoderma spp., Curvularia spp. e Dreschelera spp.
Sartorato & Rava (1994) citam, para a safra da seca, a ocorrência freqüente
de pragas como a lagarta do elasmo, cigarrinha verde e a mosca branca, esta última
como vetora do vírus do mosaico dourado causando, portanto, um dano indireto à
cultura.
Furlan et al. (2007) citam que as doenças podem ser consideradas um dos
principais fatores de redução de produtividade e de qualidade de grãos ou semente do
feijoeiro. Sartorato & Rava (1994) citam como uma das principais doenças a antracnose,
incitada pelo fungo Colletotrichum lindemuthianum (Sacc. & Magn.) Scribner, a
mancha angular incitada pelo fungo Isariopsis griseola Sacc., a ferrugem do feijoeiro
causada pelo fungo Uromyces appendiculatus (Pers.) Unger, o crestamento bacteriano
causado por Xanthomonas campestris pv. Phaseoli (Smith) Dye (XCP), o mofo branco
causado por Sclerotinia sclerotiorum, a mela causada por Thanatephorus cucumeris, as
podridões radiculares causadas por Rhizoctonia solani e Fusarium solani e outras.
Na cultura do feijão com alta tecnologia, são realizadas, em média, 3 a 4
pulverizações de fungicidas visando o controle do complexo de doenças fúngicas
(Barros & Furlan, 2004). São 35 ingredientes ativos de fungicidas, em 74 produtos
comerciais, para o controle de 12 fungos e 8 ativos registrados para o tratamento de
sementes de feijão, em 16 produtos comerciais, visando-se o controle de 12 fungos. A
dose dos produtos, ao longo do tempo, foi reduzida drasticamente, prevalecendo
atualmente o uso de produtos recomendados em menores doses (Zuppi et al., 2005). É
fato que a aplicação cada vez maior de fungicidas e inseticidas tem causado poluição
ambiental, perda da produtividade e aumento dos custos de produção do feijoeiro.
Vários autores recomendam o tratamento químico das sementes de feijão,
ressaltando a importância de certos fungicidas na sanidade das sementes (Machado et
17
al., 2002), porém, o uso de agentes de controle biológico se mostra como uma
alternativa para a redução das dosagens aplicadas de tratamento químico, além de
diminuir da quantidade de resíduos no solo advindos de vários insumos utilizados ao
longo das safras.
2.2 - Gênero Trichoderma
Trichoderma spp. são fungos pertencentes à classe Deuteromiceto, sub-
classe Hifomiceto, ordem Monilialles. São fungos que se reproduzem assexuadamente,
através de conidióforos, originados nas hifas, que produzem conídios. Caracterizam-se
por utilizarem uma grande variedade de compostos como fonte de carbono e nitrogênio
e por desenvolverem-se melhor em condições ácidas. São mesófilos, sensíveis a altas
temperaturas e a pH extremos, são resistentes a inibidores produzidos por outros
microrganismos e tolerantes a diferentes tipos de fungicidas (Melo, 1996). Trichoderma
produz três tipos de propágulos: hifas, clamidósporos e conídios (Papavizas, 1985).
O gênero Trichoderma foi introduzido por Persoon a mais de 200 anos atrás
(Persoon, 1794 apud Lima, 2002) e consiste de um fungo anamórfico, habitante
principalmente do solo, matéria orgânica e árvores em decomposição (Samuels, 1996;
Gams & Bisset, 1998), podendo viver saprofiticamente ou parasitando outros fungos.
Há poucos relatos sobre a ocorrência de doenças de plantas causadas por
Trichoderma (Melo & Azevedo, 1998), sendo uma das doenças conhecidas a do mofo
verde em cultura de cogumelo (Agaricus bisporus) (Munpuni et al, 1998).
O sistema taxonômico mais amplamente utilizado para a classificação de
Trichoderma reconhece nove espécies agregadas (Rifai, 1969). Trichoderma
caracteriza-se por apresentar colônias com considerável variação macroscópica,
podendo ser de coloração verde clara, verde escura ou verde amarelada, as quais
normalmente formam anéis de intensa conidiação (Rifai, 1969), os quais são induzidos
principalmente pelo efeito da luz (Betina & Farkas, 1998). A maioria dos isolados de
Trichoderma não são encontrados associados com seus estágios sexuais, sendo
considerados fungos de reprodução clonal (mitóticos) (Samuels, 1996).
Descobertas recentes vêm mostrando que Trichoderma é um simbionte
oportunista e que pode parasitar outros fungos (Harman et al, 2004b). Alguns isolados
estabelecem uma colonização duradoura na superfície das raízes e penetram dentro da
epiderme e em algumas células acima deste nível, aparentemente produzindo pequenas
18
quantidades de enzimas que hidrolizam parede celular (Yedidia, 1999). Esses
organismos são conhecidos como bons produtores de enzimas líticas de interesse
biotecnológico, como glucanases, quitinases, xilanases, proteases (Lorito et al., 1993;
Ulhoa & Peberdy., 1992; Maringer & Wong, 2004; Haran et al., 1996).
Trichoderma harzianum é um fungo filamentoso, considerado um dos mais
comuns do gênero, sendo facilmente isolado dos mais variados tipos de solo (Rifai,
1969; Bisset, 1991a). Caracteriza-se principalmente por apresentar conídios pequenos e
subglobosos, fazendo com que seja diferenciada de outras espécies do gênero (Bisset,
1991b). É considerada uma das mais importantes do gênero, uma vez que apresenta
isolados frequentemente utilizados no controle biológico de fungos fitopatogênicos
(Hjeljord & Tronsmo, 1998).
Vários trabalhos vêm sendo realizados no sentido de caracterizar isolados
selvagens de T. harzianum quanto as suas características morfológicas (Peres & Melo,
1995; Lima, 2002) além de estudos envolvendo técnicas de biologia molecular, no
sentido de elucidar e distinguir com certa segurança espécies do gênero Trichoderma e
suas possíveis aplicações.
Para o presente trabalho foram escolhidos quatorze fungos que fazem parte
de um grupo de isolados que foram obtidos a partir de amostras de solo do cerrado e
caracterizados com bases em aspectos morfológicos, culturais e moleculares (análise da
seqüência da região 1 e 2 do espaço transcrito interno – ITS 1 e 2 – do rDNA) por Lima
(2002).
Estes isolados foram considerados bons para uso como agentes de controle
biológico. Neste trabalho de Lima (2002), foi avaliada a freqüência de enrolamento de
T. harzianum sobre a hifa de Rhizoctonia solani, e foi verificado que hifas de isolados
de T. harzianum diferiram em sua capacidade de enrolar sobre hifas de R. solani. Dos
isolados utilizados T. harzianum ALL-42 e ALL-43 foram os antagonistas mais efetivos
uma vez que produziram enrolamento em todos os campos. ALL-20, ALL-22 e ALL-28
foram os menos efetivos. Os demais apresentaram capacidade de enrolamento
intermediária. Para estes foi também avaliada a produção e atividade enzimática de
quitinase e β-1-3-glucanase, e foi verificado que todos os isolados foram capazes de
produzir enzimas β-1-3-glucanases, e com exceção do ALL-21 os demais isolados
produziram quitinases.
Um destes isolados, T. harzianum ALL-42, foi estudado por Lima (2006),
que verificou que este fungo foi capaz de produzir e secretar fosfatase ácida, fosfatase
19
alcalina, celulase, lipase, β-1,3 glucanase e β-glicosidase no sobrenadante de cultura
líquida contendo farelo de soja e de milho.
2.3 - Aplicação do Trichoderma na agricultura
2.3.1 - Controle biológico
Controle biológico foi conceituado por Cook & Baker (1983) como a
redução da soma de inóculo ou das atividades determinantes da doença provocada por
um patógeno, realizada por ou através de um ou mais organismos que não o homem.
Ou, como vem sendo aceito pela maioria dos fitopatologistas, controle biológico de
doenças de plantas é o controle de um microrganismo através de outro microrganismo
(Bettiol & Ghini, 1995). É um importante meio de reduzir os danos causados por
patógenos.
Os mecanismos das interações entre microrganismos patogênicos e
antagônicos podem ser divididos em antibiose, competição, parasitismo, hipovirulência,
predação e indução de defesa do hospedeiro (Bettiol & Ghini, 1995).
O tratamento de sementes com microrganismos antagônicos
(microbiolização de sementes) pode proporcionar controle dos patógenos habitantes da
espermosfera (superfície de sementes) e de patógenos veiculados pelo solo (Bettiol &
Ghini, 1995). Desde sua descoberta em 1937, a microbiolização de sementes é a tática
de controle biológico mais atrativa e de maior sucesso no mundo (Frighetto, 2000). A
microbiolização é definida como a aplicação de microrganismos vivos às sementes para
o controle de doenças e/ou para promover o crescimento de plantas (Melo, 1996). Trata-
se de um sistema ideal de introdução de bioprotetores para o controle de doenças das
sementes, do tombamento, e morte de plântulas e das podridões radiculares.
A agricultura moderna é altamente dependente do uso de pesticidas
químicos no controle de patógenos das plantas. Fungicidas têm efeitos drásticos sobre a
biota do solo, poluem a atmosfera, prejudicam o meio ambiente. O uso repetido de
produtos químicos leva ao desenvolvimento de resistência nos organismos alvo
(Goldman et al, 1994), o que leva ao uso cada vez maior de pesticidas. A integração de
agentes de biocontrole com reduzidas doses de agentes químicos têm o potencial de
controlar os fitopatógenos com um menor impacto ambiental (Chet and Inbar 1994).
20
O processo de micoparasitismo envolve a utilização de enzimas
hidrolíticas para a penetração do antagonista na hifa hospedeira. Assume-se que os
isolados de T. harzianum com elevada produção deste tipo de enzima possam ser mais
efetivos na degradação do hospedeiro, aumentando assim sua capacidade antagônica. A
interação inicial entre espécies de Trichoderma e o fitopatógeno hospedeiro é
caracterizada por crescimento quimiotrófico da hifa do antagonista em direção a do
hospedeiro. Quando o antagonista atinge o hospedeiro, suas hifas frequentemente
enrolam-se e são fixadas ao hospedeiro através de estruturas semelhantes a ganchos
(Elad et al., 1982). Após esta interação inicial, o antagonista penetra na hifa do
hospedeiro, aparentemente, por degradação parcial da parede celular, sendo que a hifa
hospedeira rapidamente mostra sinais de vacuolização, paralisa seu crescimento e,
finalmente, desintegra-se (Benhamou & Chet, 1993). Como enzimas do sistema
quitinolítico são de fundamental importância para o processo do micoparasitismo,
vários trabalhos foram conduzidos com o objetivo de elucidar o papel dessas enzimas
produzidas por Trichoderma nesse processo (Ulhoa & Peberdy., 1992; Lorito et al.,
1993; Lima, 2002).
A importância da aplicação das várias espécies do fungo Trichoderma no
controle biológico por meio da inoculação de sementes depende de fatores como: idade
do esporo (Kommedhal et al., 1981), concentração do inóculo, tipo de solo (Hadar et al.,
1984), pH, temperatura, umidade, da técnica de incorporação dos esporos junto às
sementes e do vigor das sementes utilizadas (Harman, 2000). Segundo Melo (1991) T.
harzianum é mais ativo como antagonista em solo com pH igual ou menor que 6,5 e em
temperaturas acima de 22°C.
As inúmeras estratégias de sobrevivência e proliferação de espécies de
Trichoderma, como o rápido crescimento, produção de clamidósporos, capacidade de
produzir antibióticos e atacar outros fungos, bem como sua elevada capacidade de
degradar carboidratos estruturais e não estruturais (Jeffries & Young, 1994), o tornam
de elevado interesse para fins de controle biológico, uma vez que essas características
ecológicas o possibilitam competir, colonizar e proteger importantes cortes de infecção
do hospedeiro, como raízes, lesões e tecido em senescência (Hjeljord & Tronsmo,
1998). De acordo com Melo (1996), esses fungos além de apresentarem um bom
desempenho no biocontrole, também são inócuos ao ser humano e não apresentam
impacto negativo ao meio ambiente, além de possuir meia vida de prateleira, quando
formulado, razoavelmente longa e com boa viabilidade.
21
Nos estudos feitos por Matsumura et al. (2002), Trichoderma spp.
apresentaram variação populacional em solo com diferentes tratamentos de adubação
orgânica (húmus de minhoca, esterco de gado, suíno e aves, além de solo não adubado)
e também, ao longo do tempo (120 dias após a inoculação) demonstrando que, embora o
manejo do solo influencie na sua sobrevivência e desenvolvimento, a população tende a
voltar a concentração inicial, mantendo o equilíbrio natural
Diversos produtos à base de Trichoderma têm sido comercializados no
Brasil para uso em substrato de produção de mudas e tratamento de sementes, além de
outros. Existem hoje no mercado, vários produtos formulados com a adição de
microorganismos biologicamente ativos, indicados para o controle biológico.
Isolados de T. harzianum têm diferido na sua capacidade de atacar certos
fungos fitopatogênicos, tais como: Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani e Pythium
aphanidermatum (Elad et al., 1982, Herrera-Estrela & Chet, 1998). Tem-se ainda,
verificado ao longo dos experimentos, que há grande variação nas respostas
apresentadas pela inoculação das plantas com diferentes espécies de microrganismos
testados como agentes de controle biológico.
Furlan et al. (2005) avaliou o efeito de Bacillus subtilis, associado ou não a
Trichoderma spp., ambos formulados e aplicados em tratamento de sementes na cultura
do feijão, visando o controle de C. lindemuthianum, na germinação e na emergência das
plântulas, comparados a outros dois produtos químicos recomendados. Nenhum dos
tratamentos erradicou o fungo das sementes. Thiram + thialbendazole foi o único
tratamento que mostrou eficiência contra o patógeno da antracnose. Os tratamentos
biológicos das sementes de feijão não apresentaram efeito significativo na redução do
inóculo C. lindemuthianum, indicando somente uma tendência a queda comparado à
testemunha.
As plantas são capazes de produzir resposta imune após a primeira infecção
por patógeno, o que é conhecido como resistência sistêmica adquirida. Rizobactérias e
fungos não patogênicos podem induzir resistência em plantas, que é fenotipicamente
similar à resistência sistêmica adquirida (van Loon et a., 1998).
Dentre as aplicações do Trichoderma, tem sido citada sua ação como elicitor
de resistência sistêmica e localizada em plantas a uma variedade de fitopatógenos. Ao
contrário do que se pensava anteriormente sobre os mecanismos de controle biológico, o
efeito direto sobre os fitopatógenos é somente um dos mecanismos de controle, e talvez
seja menos importante do que a resistência induzida. A indução de resistência em
22
plantas por Trichoderma spp. tem sido pouco estudada comparado às respostas que se
tem sobre a indução por rizobactérias, talvez porque a comunidade de pesquisa sobre
Trichoderma tenha focado em fatores que estão associados com efeitos diretos em
outros fungos, especialmente micoparasitismo e antibiose (Harman et al, 2004a).
Foi verificado que a resistência induzida promoveu controle biológico em
locais da planta espacialmente e temporalmente distantes do seu ponto de aplicação, ao
menos com o isolado T-22, pois apesar dos isolados de Trichoderma serem conhecidos
por colonizar raízes de plantas, a aplicação dos seus conídios têm sido feita em frutas,
flores e folhas, resultando em controle das doenças das plantas pela sua aplicação em
qualquer um desses locais (Harman, 2000).
Isolados de Trichoderma não só produzem substâncias antibióticas, mas
também estimulam as plantas a produzir seus próprios compostos antimicrobianos. Os
resultados obtidos com a inoculação de T. asperellum T-203 em pepino mostraram a
produção de substâncias inibitórias para uma ampla gama de fungos e bactérias. T.
asperellum ativa vias metabólicas em pepino envolvidas na sinalização e biossíntese em
plantas, levando primeiramente a uma acumulação sistêmica de fitoalexinas (Yedidia et
al., 2003). Fitoalexinas são compostos antimicrobianos de baixo peso molecular, que
são sintetizadas pelas plantas e se acumulam nas células vegetais em resposta à infecção
microbiana (Paxton, 1981).
O sistema indutor de resistência em plantas é complexo, mas tem sido
parcialmente elucidado em várias espécies de plantas. Existem normalmente três vias de
indução de resistência em plantas. Duas dessas vias envolvem a produção direta de
proteínas relacionadas à patogênese; em uma via, a produção de proteínas relacionadas
à patogênese é geralmente o resultado do ataque de microrganismos patogênicos, e na
outra via, as proteínas relacionadas a patogênese são produzidas em resultado a um
ferimento, como ataque de um inseto, embora essas vias possam ser induzidas por
outros mecanismos (Harman et al, 2004a).
O terceiro tipo de resistência induzida tem sido melhor descrito como
sendo induzido por bactérias não patogênicas associadas com raízes, que são descritas
como rizobactérias indutoras de resistência sistêmica. Este sistema é fenotipicamente
similar à resistência induzida pelos ácidos jasmônico e salicílico, resultando na
resistência sistêmica pela planta, mas é funcionalmente muito diferente, pois, as
proteínas relacionadas à patogênese e às fitoalexinas não são induzidas pela colonização
23
da raiz pela rizobactéria na ausência do ataque da planta por microrganismos
patogênicos. (Harman et al., 2004a).
2.3.2 - Promoção de crescimento
Efeitos benéficos de microrganismos específicos no crescimento de plantas
têm sido verificados em várias espécies vegetais. Tais organismos têm sido chamados
de bactérias promotoras de crescimento e fungos promotores de crescimento em plantas.
Podendo estes, atuar por meio de numerosos mecanismos, que incluem a proteção das
raízes contra a infecção por patógenos (Whipps, 1997, 2001), aumento na
disponibilidade de nutrientes para a planta hospedeira, diminuição dos níveis de etileno
dentro da planta ou pelo aumento da produção de compostos estimulatórios, como os
reguladores de crescimento vegetal (Antoun Prévost, 2005 apud Gravel, 2007).
A capacidade de espécies de Trichoderma em promover o crescimento
direto, aumentar a germinação e o florescimento de plantas foi demonstrado por
diversos autores, como Paulitz et al. (1986), Baker (1989), Martins & Melo (1989),
Lynch et al. (1991), Okleifeld & Chet (1992), citados por Melo (1996). Este aumento no
crescimento ocorreu mesmo em cultivos livres de patógenos realizados com solo estéril
(Whindham et al., 1986), o que mostra ser uma ação diferenciada deste microrganismo,
não explicada por um possível mecanismo de controle biológico.
Resultados consideráveis foram obtidos com a aplicação de Trichoderma no
solo, tanto em condições de campo quanto em estufa, onde além da redução de
incidência de doenças ocorreu o aumento do crescimento de plantas (Chang et al., 1986;
Harman et al., 2004b; Ousley et al., 1994; Yedidia et al., 2001). Bons resultados
também têm sido encontrados para o cultivo hidropônico (Yedidia et al., 2001).
Chang et al. (1986), utilizando tratamento de solo com suspensão de
conídios de T. harzianum, observaram aumentos na massa seca de 10% para o feijoeiro,
8% para a planta do rabanete, 37% para o tomateiro, 42% para a pimenteira e 93% para
o pepineiro. Sivan & Harman (1991), tratando sementes de milho e algodão com os
isolados de T. harzianum T12, T95, e T22 (fusão dos dois anteriores) observaram que o
isolado T22 promoveu crescimento das raízes, em relação à testemunha, de 31% em
milho e 60% no algodoeiro.
Foram encontrados resultados positivos por Inbar et al. (1994), em
tratamento de solo com isolados de T. harzianum, nos quais o pepineiro (aos 18 dias) e
24
pimenteira (aos 30 dias) tiveram aumento significativo quanto à altura das plantas em
24 e 17% e peso de massa seca em 25 e 29%, respectivamente.
Altomare et al. (1999) estudando T. harzianum Rifai 1295-22 (T-22),
verificou que tal fungo foi capaz de solubilizar, in vitro, MnO2, Fe2O3, zinco metálico, e
fosfato de rocha, sendo este o primeiro relato da habilidade de Trichoderma em
solubilizar minerais insolúveis ou pouco solúveis. A liberação de ácidos orgânicos que
seqüestram cátions e acidificam o microambiente perto das raízes é pensado ser o
principal mecanismo de solubilização de P via plantas e fungos. Entretanto, o
mecanismo pelo qual T. harzianum aumenta a solubilização de nutrientes e a absorção
de nutrientes ainda precisa ser entendido.
Naseby et al. (2000) utilizaram isolados de Trichoderma do tipo selvagem
com atividade de biocontrole já conhecida e verificaram seus efeitos sobre o
crescimento da ervilha, sobre a microflora e sobre as enzimas do solo, na presença e
ausência de Pythium ultimum. Os isolados utilizados foram T. harzianum T4, T12, N47
e TH1 e T. pseudokoningii To10. T4 e T47 tiveram os melhores resultados, ambos
aumentaram o crescimento das plantas na ausência de Pythium e reduziram os danos na
planta na presença de Pythium. Todos os isolados diminuíram a população de bactérias
do solo. T4 e T12 aumentaram a população de fungos no solo. Os isolados TH1 e T12
aumentaram a emergência das plântulas de ervilha. N47 aumentou o peso úmido da
parte aérea. Entretanto, nenhum dos isolados aumentou a massa seca. T4 e N47
promoveram aumento do peso úmido das raízes em 21% e 8% respectivamente, em
relação ao controle. TH1 e N47 aumentaram o comprimento das raízes, o número de
nódulos da raiz e o número de raízes laterais.
O isolado de T. harzianum Rifai 1295-22 (T-22), isolado este conhecido pela
sua capacidade de colonizar todo o sistema radicular do vegetal, foi efetivo na indução
de formação de raízes de soja e milho tratadas com o referido isolado e maior
produtividade de pimentão comparado com testemunhas não tratadas (Harman, 2000).
A interferência de Trichoderma em plantas e o aumento na produtividade ocorrem
segundo Harman et al. (2004a), devido à sua capacidade em colonizar raízes. Um
grande número de isolados selvagens de Trichoderma avaliados apresentaram limitada
capacidade de colonizar a rizosfera (Papavizas, 1985), sendo buscado a alteração
genética (Lynch et al., 1991) para a obtenção de isolados com melhor capacidade de
crescer junto às raízes durante o crescimento das raízes da planta.
25
Yedidia et al. (2001) também encontraram excelentes resultados no
cultivo de pepino, através da inoculação de T. harzianum T-203, verificando que no
cultivo no solo apresentou 30% de aumento na emergência, 95% na superfície radicular
e 75% no comprimento radicular. Foi observado ainda, aumento de 80% da massa seca,
45% da altura e 80% da área foliar, além do aumento no conteúdo de fósforo e ferro nos
tecidos da planta. Estas melhorias no crescimento foram confirmadas com o cultivo da
ervilha em hidroponia, onde também houve aumento da quantidade de nutrientes
contidos na parte aérea e radicular, além do aumento de sua massa seca.
Vesterg et al. (2004) realizaram experimentos utilizando o sistema de
micropropagação em plantas de morango e analisaram o efeito da inoculação de cinco
microrganismos, Glomus mosseae BEG29, Bacillus subtilis M3, Trichoderma
harzianum BD11, Pseudomonas fuorescens C7r12 e Gliocladium catenulatum
Gliomix® usados individualmente ou em mistura de dois deles, na presença ou ausência
de Phytophthora cactorum e P. fragariae. A inoculação de dois microrganismos ao
mesmo tempo não aumentou o crescimento em relação à inoculação individual destes
microrganismos. B. subtilis foi o microrganismo mais promissor na promoção do
crescimento. Os microrganismos não interferiram negativamente uns sobre os outros e
estavam em concentrações suficientes um mês após a inoculação, o que mostrou que
eles podem ser usados juntos num mesmo substrato. Quando os efeitos da aplicação do
microrganismo individualmente ou misturados foram observados do ponto de vista da
promoção de crescimento e resistência e do controle de doenças, T. harzianum foi o
microrganismo mais promissor com efeitos positivos na maioria dos experimentos. A
população de Trichoderma variou muito entre um experimento e outro, sendo muito
baixa em alguns deles, o que pode ter ocorrido devido aos nutrientes do substrato
utilizado. Para a promoção de crescimento e o controle das doenças consideradas, a
inoculação individual de T. harzianum, G. catenulatum e B. subtilis assim como a
mistura de T. harzianum + G. catenulatum foram os tratamentos mais promissores neste
estudo.
Resende et al. (2004), em experimento em casa de vegetação utilizando
sementes de milho tratadas com ou sem fungicidas inoculadas ou não com Trichoderma
harzianum, verificaram maior acúmulo de massa seca nas raízes provenientes de
sementes inoculadas, não havendo efeito significativo em altura e massa seca da parte
aérea.
26
Rudresh et al. (2005) investigaram a habilidade de solubilização de P por
diferentes isolados de Trichoderma in vitro e in vivo como um possível mecanismo de
promoção de crescimento de plantas. Avaliaram a solubilização de fosfato de rocha,
crescimento da planta e absorção de P pela planta. Utilizaram isolados de T. harzianum
Rifai, T. viride, T. virens e T. ramatum, que foram comparados à bactéria Bacillus
megaterium subsp. phospaticum PB usada como referência em relação a solubilização
de fosfato in vitro. Testaram a habilidade de Trichoderma em liberar fosfato inorgânico
a partir de fosfato tricálcico e verificaram que os isolados de Trichoderma solubilizaram
menos P e reduziram menos o pH da cultura do que B. megaterium. Trichoderma foi
considerado como um moderado solubilizador de P, pois solubilizou 70% de P em
relação à B. megaterium. Dentre os resultados do experimento in vivo, concluiu-se que
porcentagem de germinação de sementes de grão-de-bico (Cicer arietinum L.) não
apresentou diferença significativa entre os tratamentos.
Ogut et al. (2005) não obtiveram ganhos na produção de grãos de trigo, mas
obtiveram ganhos em produção de sementes de feijão em condições de campo e casa de
vegetação quando inoculadas com T. harzianum Rifai 1295-22. Entretanto não
obtiveram ganhos em massa seca para as plantas de feijão e trigo.
Corrêa (2006) realizou experimentos com alface em cultivo hidropônico
com aplicação de Trichoderma na solução nutritiva nas concentrações de 103, 104, 105,
106 e 107 conídios/mL. Na avaliação das plantas determinou-se a massa fresca da parte
aérea e do sistema radicular, e também a massa seca do sistema radicular. Foi também
monitorada a população de Trichoderma na solução nutritiva. Apesar da baixa
sobrevivência de Trichoderma sp. na solução nutritiva verificou-se intensa colonização
das raízes de alface, marcada pela coloração verde do fungo nas concentrações de 106 e
107 conídios/mL. Neste trabalho Trichoderma sp. não foi capaz de promover o
crescimento das plantas de alface cultivadas em sistema hidropônico em nenhuma das
concentrações de esporos. A concentração de 107 conídios/mL causou drástica redução
no desenvolvimento das plantas de alface, diminuindo acentuadamente a massa média
das plantas de alface.
Gravel et al. (2007) verificaram a capacidade de Pseudomonas putida
subgrupo B isolado 1 e Trichoderma atroviride em promover o crescimento reprodutivo
de plantas de tomate sob condições típicas de crescimento hidropônico. Atribuíram esse
crescimento ao resultado dos numerosos modos de ação exibidos pelos organismos
testados, incluindo a regulação da concentração de ácido indolilacético na rizosfera e
27
regulação da concentração de etileno nas raízes. Verificaram a capacidade destes
microrganismos em produzir ácido indolilacético (AIA) in vitro a partir de diferentes
precursores, aumentando a produção de AIA na presença de seus precursores e
aumentando o peso fresco e comprimento do caule e raízes quando foi aumentada a
concentração de L-triptofano para 0,75mM. Estes microrganismos apresentaram
atividade de ACC desaminase quando crescidos in vitro, sugerindo que esses são
capazes de regular a quantidade de etileno pela redução da presença de seus precursores.
Mesmo se pensando que a solubilização de fósforo esteja sempre associada com a
promoção de crescimento de plantas (Richardson, 2001), neste experimento em
particular, o P na solução nutritiva estava prontamente disponível para a planta,
reduzindo a possibilidade desse mecanismo ter efeito nos resultados observados. Nos
testes in vitro P. putida nem T. atroviride não foram capazes de solubilizar fósforo.
28
3 - OBJETIVO
3.1 - Objetivos gerais
Verificar os efeitos da inoculação de 14 isolados do fungo Trichoderma
harzianum Rifai no desenvolvimento e crescimento do feijoeiro comum (Phaseolus
vulgaris L.) variedade rudá do grupo carioca.
3.2 - Objetivos específicos
• Avaliar a produção de massa seca, área foliar e altura do feijoeiro em
decorrência da inoculação do feijoeiro com o fungo Trichoderma harzianum;
• Identificar se há efeito diferenciado dos isolados no desenvolvimento do
feijoeiro;
• Verificar a alteração nos valores das variáveis: pH, matéria orgânica, fósforo
disponível e atividade de fosfatase ácida do solo.
• Verificar se há correlação entre a atividade de fosfatase ácida solo e o ganho de
massa seca do feijoeiro.
29
4 – MATERIAL E MÉTODOS
4.1 - Local de condução do experimento
O experimento foi realizado em casa de vegetação do Departamento de
Biologia da Universidade Federal de Goiás (UFG). As análises foram desenvolvidas nos
Laboratórios de Fisiologia Vegetal e Laboratório de Enzimologia do Instituto de
Ciências Biológicas.
4.2 - Solo
O solo para o enchimento dos vasos utilizados no experimento foi retirado
em área próxima ao Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Goiás,
Campus de Goiânia, local onde se localiza a casa de vegetação onde foi desenvolvido o
experimento.
As características físico-químicas do solo utilizado no experimento foram
analisadas pelo Laboratório de Análises de Solo e Foliar (LASF) da Universidade
Federal de Goiás, segundo Silva (1999) (TABELA 1).
TABELA 1 – Atributos físico-químicos do solo avaliados antes do plantio em
profundidade de 0 a 20 cm.
Características físico-químicas do solo antes do plantio
Argila
(%)
Silte
(%)
Areia
(%)
MO
(%)
pH
(CaCl2)
P disponível
(mg/dm3)
K
(mg/dm3) Solo inicial
52 19 29 2,8 5,6 3,2 54
4.2.1-Preparo do solo
Foi feita a calagem com calcário dolomítico numa proporção de 1,25 g/Kg
de solo, cerca de 30 dias antes do plantio. O solo foi adubado com a fórmula NPK 4-30-
10 numa proporção de 0,526 g por Kg de solo. Foram utilizados vasos plásticos com
capacidade para 10 kg de solo. O solo não foi esterilizado para simular as condições
reais de campo.
30
4.3 - Origem e manutenção dos fungos
Foram utilizados quatorze isolados de fungos da espécie Trichoderma
harzianum, sendo eles: ALL-05, ALL-08, ALL-15, ALL-20, ALL-21, ALL-22, ALL-
24, ALL-28, ALL-38, ALL-42, ALL-43, ALL-47, ALL-49, ALL-52. Estes isolados são
pertencentes à coleção do Laboratório de Enzimologia do Instituto de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Goiás (ICB/UFG) e foram isolados, purificados
e caracterizados por Lima (2002). Esses fungos foram coletados de amostras de solo de
mata nativa, milho, arroz, soja, pomar de goiaba e sorgo forrageiro cultivados no estado
de Goiás.
Os fungos foram repicados em placas de Petri contendo o meio MYG. Este
meio é composto por 0,5% (p/v) de extrato de malte (malt), 0,25% (p/v) de extrato de
levedura (yeast), 1,0% (p/v) de glicose (glucose) e 2% (p/v) de ágar.
As placas de Petri contendo os isolados de T. harzianum foram incubadas
em estufa BOD (Eletro Lab) por 7 dias a uma temperatura de 28°C. Após o período de
incubação, foram adicionados cerca de 3 mL de solução salina a 0,9% estéril em cada
placa de Petri e a superfície do meio foi raspada levemente com o auxílio de uma alça
de platina liberando micélio e conídios. Do conteúdo raspado nas placas foi retirado 10
µL e completou-se para 990 µL de solução salina a 0,9%. Retirou-se 10 µL dessa
diluição para efetuar a contagem desses conídios em câmara de Neubauer. A partir da
concentração de esporos foi obtida a solução para uma concentração final de 108
conídios/mL. Foram preparados 4 mL de volume final da solução de esporos, na
concentração 108 conídios/mL, para realizar a embebição das sementes a serem
utilizadas no experimento.
4.4- Sementes
Foram utilizadas sementes de feijão comum (Phaseolus vulgaris L.) da
variedade rudá do grupo carioca, cedidas pela Embrapa Arroz e Feijão, Santo Antônio -
GO. A origem do Rudá é CIAT (Centro Internacional de Agricultura Tropical) (A285-
Carioca x Rio Tibagi). Esta variedade possui crescimento indeterminado (II/III) e porte
ereto.
31
4.4.1 - Esterilização das sementes
As sementes de feijão foram esterilizadas superficialmente por 16h usando
gás cloro produzido pela mistura de 3,5 mL de HCL 12N com 100 mL de água sanitária
comercial (HClO a 2%) segundo a metodologia de Paz et al. (2004). Este ambiente foi
criado dentro de um dessecador e as sementes a serem esterilizadas foram colocadas em
placa de Petri.
4.4.2 - Tratamento das sementes
As sementes foram imersas em solução de goma arábica a 20%, com a
função de fixar os esporos nas sementes utilizadas no experimento, e em seguida
imersas em solução de esporos de concentração 108esporos/mL. Sendo cada um dos
fungos utilizados um tratamento e tendo como testemunha a semente sem a presença de
inóculo. A concentração de 20% foi escolhida a partir de testes prévios onde foi
observada a não inibição do crescimento de colônias de T. harzianum em meio de
cultura contendo goma arábica nesta concentração.
4.5 - Teste de germinação in vitro
A avaliação da germinação das sementes de feijão in vitro se deu com a
utilização das sementes esterilizadas e tratadas da mesma maneira que foi citado
anteriormente para o plantio em casa de vegetação.
O tratamento foi feito com a inoculação de cada um dos 14 isolados e
testemunha, tendo 4 repetições por tratamento. Foram utilizadas 10 sementes para cada
tratamento, que foram colocadas em placas de Petri contendo papel germiteste. As
sementes foram molhadas com água estéril e a germinação foi avaliada no quarto dia
contando como germinada a semente que emitiu radícula. A taxa de germinação foi
tomada adotando-se a germinação das 10 sementes utilizadas como 100% de
germinação (%G = SG/TS x 100%). Sendo % a porcentagem de germinação, SG o
número de sementes germinadas e TS o total de sementes colocadas para germinar.
4.6 - Plantio
Após o preparo do solo, acondicionamento nos vasos e tratamento das
sementes, foi realizado o plantio. Foram preparados 4 vasos para cada tratamento, os
quais constaram da inoculação das sementes como os isolados ALL-05, ALL-08, ALL-
32
15, ALL-20, ALL-21, ALL-22, ALL-24, ALL-28, ALL-38, ALL-42, ALL-43, ALL-47,
ALL-49, ALL-52 e a testemunha, repetidos 4 vezes, totalizando 60 vasos. Foi chamado
de testemunha o tratamento cuja semente foi imersa em goma arábica e que não foi
inoculada com nenhum fungo. Foram semeadas seis sementes de feijão por vaso em 05
de agosto de 2006, com posterior desbaste para obtenção de plantas por vaso.
A irrigação foi feita diariamente de forma manual.
O delineamento adotado no experimento foi inteiramente casualizado
constando de 15 tratamentos e 4 repetições.
4.7 - Análise do material vegetal
4.7.1- Estimativa da área foliar
Foram utilizadas 2 plantas de feijoeiro da variedade rudá das quais foram
retirados 68 folíolos com tamanhos variados. Foi medido com régua a largura maior e
comprimento desses folíolos e, então, a área foliar do respectivo folíolo, determinada
utilizando-se o aparelho medidor de área foliar modelo Li-Cor 2000 (Li-Cor
Corporation, USA). Testou-se a correlação entre a largura (L), comprimento (C),
produto (C x L) e a área foliar do folíolo medido. Verificou-se que a melhor equação foi
y = -0,9038969 + (0,5474285)x, sendo “y” a área foliar e “x” o produto L x C, obtida
correlacionando-se o produto L x C com a área foliar, que resultou em um R = 0,9810,
significativo ao nível de 5% pelo teste de F. Para o ajuste da equação de regressão para
os dados foi utilizado o software AJUSTE. A partir desta equação foram estimadas as
áreas foliares das plantas oriundas dos tratamentos tomando o produto C x L dos
folíolos.
TABELA 2 - Análise de variância da regressão para determinação de área foliar
estimada.
FV GL SQ QM F Regressão 1 19247,41 19247,41 1650,498 * Resíduo 66 769,6642 11,661
Total 67 20017,07 * Significativo pelo teste de F a 5% de significância
Para estimar a área foliar por tratamento foram feitas medidas do
comprimento e largura dos folíolos contidos nas plantas de cada vaso durante sete
33
semanas. Este método apresenta a vantagem de ser não-destrutivo e visa estimar a área
foliar através das medidas lineares tomadas das folhas, não havendo necessidade de
destruição do material vegetal e podendo-se assim acompanhar o ganho de área foliar da
planta ao longo do seu ciclo de desenvolvimento. As medidas foram tomadas somente
até os 52 DAE. Sendo assim, as avaliações se deram aos 10, 17, 24, 31, 38, 45 e 52 dias
após a emergência (DAE).
Simultaneamente a avaliação das medidas das folhas, foi feita avaliação da
altura da planta com o auxílio de uma régua milimetrada, medindo-se do colo da planta
até a inserção da última gema apical (gema terminal). As alturas foram analisadas
somente durante as sete primeiras semanas, devido ao fato de ter havido quebra das
hastes de muitas amostras. Estas avaliações se deram aos 10, 17, 24, 31, 38, 45 e 52
dias após a emergência (DAE).
4.7.2 – Avaliação direta da planta
4.7.2.1 – Área foliar
No dia 19 de outubro (66 DAE) foram retiradas as plantas dos vasos para a
avaliação da área foliar de forma direta, da massa seca das folhas, raízes, hastes e
vagens, e do volume de raiz.
A avaliação da área foliar de forma direta foi feita com o uso do medidor
automático de área foliar modelo Li-Cor 2000 (Li-Cor Corporation, USA). Estes
procedimentos foram realizados no Laboratório de Fisiologia Vegetal do Instituto de
Ciências Biológicas da UFG.
4.7.2.2 – Volume radicular
A medida de volume de raiz foi feito por deslocamento de volume.
Utilizou-se uma proveta para 500 mL, que foi completada com 400 mL de água
destilada, e colocou-se então a raiz de cada tratamento, e observou-se o quanto do
volume foi deslocado, adotando-se esse valor como o volume da raiz. Após essa medida
as raízes foram separadas para secagem e medida da massa seca.
4.7.2.3 – Massa seca O material coletado foi separado em haste, folhas, vagens e raízes. As raízes
foram lavadas para retirada do solo. Para a determinação da massa seca as raízes e a
parte aérea da planta foram acondicionadas em saco de papel e, em seguida, secas em
34
estufa com circulação forçada de ar regulada a uma temperatura de 65ºC. Após o
material atingir peso constante foi realizada a pesagem em balança semi-analítica.
4.8 - Avaliação do solo
Foram feitas duas coletas para as análises do solo contidos nos vasos. A
primeira coleta das amostras de solo se deu aos 45 DAE, período de início da floração.
Sendo considerado o início da floração quando 50% das plantas apresentam a primeira
flor aberta. A segunda coleta do solo foi realizada aos 66 DAE, período em que as
vagens estavam na fase de enchimento de grãos.
No intervalo entre a coleta e a análise, as amostras de solo foram mantidas
sob refrigeração a 4°C para evitar o crescimento de microrganismos. Foram realizadas
análises de fósforo disponível, matéria orgânica e pH segundo Silva (1999), sendo estas
realizadas no laboratório de análise de solo do Departamento de Agronomia da
Universidade Federal de Goiás.
4.8.1 - Determinação de atividade da fosfatase ácida do solo
A atividade da fosfatase, das duas épocas de coleta, foi determinada
segundo Tabatabai e Bremner (1969) modificado, segundo os quais se faz a
determinação do ρ-nitrofenol (ρ-NP) liberado pela hidrólise enzimática do ρ-
nitrofenilfosfato (ρ-NPP) (Sigma Chemical Company®) a 5 mM.
O solo foi peneirado usando peneira de 4 mm para retirar raízes, tecido de
plantas e outros materiais orgânicos grosseiros que poderiam interferir na análise.
Coletou-se 250 mg de amostra de solo peneirado, que foram colocados em ependorff.
Adicionou-se 500 µL de tampão citrato pH 6,2 e 250 µL de ρ-NPP (menos nos
brancos). Foi feito um branco para cada amostra de solo. As amostras foram então
colocadas em banho-maria por 1h a 37ºC. Adicionou-se então, 500 µL de NaOH a 0,5
M, 125 µL CaCl2 a 0,5 M em todas as amostras, e 125 µL de ρ-NPP aos brancos.
Centrifugou-se as amostras à 10000 rpm durante 10min e retirou-se o sobrenadante para
leitura em espectrofotômetro a 410nm. A leitura obtida foi transformada em ρ-NP/g de
solo utilizando a fórmula y = 18,206. x + 0,0564 (R2 = 0,9929), obtida através da curva
padrão.
A atividade enzimática foi expressa em unidade de enzima. Uma unidade é
a quantidade de enzima que hidroliza 1,0 µmol de ρ-NPP min-1. Para a análise dos
35
dados a atividade enzimática foi expressa em µmol de ρ-NP liberado por hora em 1g de
solo.
4.8.2 – Determinação do pH do solo
Utilizou-se 10g de solo seco ao ar adicionado de 25 mL de solução de
cloreto de cálcio 0,01M, colocados sob agitação por 10min e repouso por 30min,
seguindo-se então a leitura no pHmetro.
4.8.3 – Determinação do fósforo disponível no solo
A extração do fósforo disponível foi realizada utilizando o extrator Mehlich
1, também chamado de extrator duplo ácido ou de solução Norte Carolina. A solução de
Mehlich 1 consiste da mistura de 4,15 mL de ácido clorídrico concentrado preparado a
0,05N mais 0,69 mL de ácido sulfúrico concentrado a 0,025 N preparado para um litro
de solução. Mede-se 10 cm3 de terra fina seca ao ar e adiciona-se 50 mL de solução de
Mehlich. Coloca-se em um agitador circular horizontal durante 10 min. Deixa decantar
por um período de 12 h. Retira-se 5 mL de extrato sobrenadante de cada amostra e
transfere-se para tubos de ensaios. Adiciona-se 10 mL da solução ácida de molibdato de
amônio diluída e 0,2 g de ácido ascórbico. Em seguida, faz-se uma agitação manual do
tubo de ensaio, deixando desenvolver a cor durante 30 min. Faz-se a leitura da
absorbância a 660 nm.
4.8.4 – Determinação da massa orgânica do solo (MOS)
O método utilizado consiste da oxidação da matéria orgânica pelo ácido
crômico e ácido sulfúrico. O carbono é oxidado a CO2 e o cromo é reduzido, havendo
mudança na cor da solução utilizada que adquire cor esverdeada e que é medida por
colorimetria. Esse procedimento é feito utilizando-se 1 g de solo seco ao ar, onde
adiciona-se 50 mL de solução de dicromato de sódio preparada em ácido sulfúrico a
10N. Essa mistura é colocada por 10 min em um agitador circular horizontal e deixada
em repouso por 1h. Em seguida, adiciona-se 50 mL de água destilada, agita-se e deixa-
se em repouso por um período de 12 a 14h. Transfere-se o sobrenadante para um tudo
de ensaio e faz-se a leitura em espectrofotômetro a 660 nm.
36
4.8.5 - Recuperação de isolados de Trichoderma a partir de solo
Os isolados de T. harzianum previamente aplicados ao solo tiveram suas
populações monitoradas por meio da técnica de diluição seriada (Tortora et al., 2000).
Essa metodologia tem por finalidade a redução dos propágulos de microrganismos para
um dado volume, facilitando, dessa maneira, sua contagem individualizada. Assim,
inicialmente, 1g de solo foi transferido para um tubo de cultura contendo 9 mL de
solução salina esterilizada (diluição de 1:10). Após a adição do solo ao tubo de cultura,
este foi manualmente agitado e, posteriormente, uma alíquota de 1 mL dessa solução
inicial foi transferida para um novo tubo de cultura contendo 9 mL de solução salina
esterilizada para obter-se a diluição de 1:100. Finalmente, 0,1 mL dessa diluição (1:100)
foi transferida e distribuída, com auxílio de uma alça de Drigalsky, sobre a superfície de
placas de Petri contendo meio seletivo para crescimento de Trichoderma (TSM) (Smith
et al., 1990), adaptado de Davet (1979), as quais foram incubadas em B.O.D. ajustada
para uma temperatuda de 25 ± 1°C, durante 9 dias. Após o período de incubação,
colônias características do gênero em questão foram identificadas e computadas para
obter-se o número ufc de Trichoderma por grama de solo inoculado. Todos os ensaios
destinados à recuperação dos isolados utilizados no presente estudo foram conduzidos
em triplicata.
4.9 - Análise estatística dos dados
As análises de variância (ANOVA) foram realizadas com a utilização do
programa SAS para verificar as diferenças entre as médias de área foliar, altura, massa
seca, atividade de fosfatase ácida, fósforo disponível, matéria orgânica e pH, para todos
os tempos analisados. Em seguida, foi aplicado o teste de Tukey ao nível de 5% de
probabilidade. As correlações entre as variáveis analisadas na planta e no solo foram
feitas utilizando o programa Microsoft Office Excel 2003.
37
5- RESULTADOS
A taxa de germinação das sementes de feijoeiro in vitro não foi
significativamente influenciada pela inoculação com os isolados de Trichoderma
harzianum (TABELA 3).
TABELA 3 – Taxa de germinação in vitro de sementes de feijão inoculadas com
isolados de Trichoderma harzianum
Tratamento Taxa de germinação (%) ALL-05 95,0 ALL-08 92,5 ALL-15 90,0 ALL-20 92,5 ALL-21 90,0 ALL-22 85,0 ALL-24 85,0 ALL-28 85,0 ALL-38 85,0 ALL-42 85,0 ALL-43 82,5 ALL-47 92,5 ALL-49 92,5 ALL-52 90,0
Testemunha 95,0 Média 89,0 CV% 10,9
F calculado 0,739 NS NS: não significativo; *: F calculado significativo a 5% de probabilidade.
38
A avaliação da população T. harzianum contida no solo mostra que grande
parte dos isolados não permaneceram ativos no solo até os 45 e 66 dias após a
emergência (DAE) do feijoeiro (TABELA 4). Aos 45 DAE, já não foi observada
população ativa de ALL-08, ALL-28, ALL-38 e ALL-47. Aos 66 DAE observou-se
que somente ALL-15, ALL-42 e ALL-43 permaneceram ativos no solo.
TABELA 4 – População de Trichoderma harzianum contida nas amostras de solo
coletadas aos 45 e 66 DAE do feijoeiro.
Tratamento População de T. harzianum (ufc/g de solo) 45 DAE 66 DAE
ALL-05 1,0 x 103 0 ALL-08 0 0 ALL-15 4,3 x 103 0,7 x 103 ALL-20 0,3 x 103 0 ALL-21 0,3 x 103 0 ALL-22 0,3 x 103 0 ALL-24 1,0 x 103 0 ALL-28 0 0 ALL-38 0 0 ALL-42 5,5 x 103 0,7 x 103 ALL-43 2,7 x 103 1,0 x 103 ALL-47 0 0 ALL-49 0,3 x 103 0 ALL-52 1,3 x 103 0
Testemunha 0 0 ufc = unidade formadora de colônia
39
A área foliar das plantas de feijoeiro, cujas sementes foram inoculadas com
os isolados de Trichoderma harzianum ALL-05, ALL-08, ALL-15, ALL-20, ALL-21,
ALL-22, ALL-24, ALL-28, ALL-38, ALL-42, ALL-43, ALL-47, ALL-49, ALL-52,
não apresentou diferença significativa até os 45 DAE. Houve efeito significativo
(P>0,05) somente para a área foliar aos 52 DAE, onde observou-se, porém, que todos as
médias de tratamentos apresentaram ganho de área foliar igual ao da testemunha. Aos
66 DAE não foi verificada diferença entre as médias de tratamento para área foliar
(TABELA 5).
TABELA 5 - Área foliar das plantas de feijão submetidas ao tratamento das sementes
com diferentes isolados de Trichoderma harzianum.
Área foliar das plantas do feijoeiro (cm2/planta) Tratamento 10DAE 17DAE 24DAE 31DAE 38DAE 45DAE 52DAE 66DAE
ALL-05 37,1 128,8 345,4 484,4 520,9 842,1 988,6 ab 2008,6 ALL-08 39,7 107,7 292,8 430,7 557,2 730,9 835,8 ab 1588,4 ALL-15 41,8 114,2 304,8 442,9 541,3 723,7 760,7 ab 1728,4 ALL-20 38,3 139,3 345,0 529,8 649,9 833,2 1058,1 ab 2198,0 ALL-21 31,5 84,6 245,7 405,3 528,2 826,0 946,2 ab 1716,0 ALL-22 38,5 98,3 292,6 454,3 567,0 772,2 850,6 ab 1458,5 ALL-24 42,9 99,5 242,3 351,4 462,3 615,9 707,1 b 1299,0 ALL-28 35,3 93,7 269,8 423,7 532,4 698,9 804,7 ab 1446,0 ALL-38 37,6 93,3 296,1 398,3 515,7 651,1 686,8 b 1438,4 ALL-42 52,7 116,0 306,8 416,0 532,8 685,5 777,1 ab 1869,4 ALL-43 37,5 111,7 338,5 491,3 598,3 795,1 986,5 ab 2139,0 ALL-47 40,0 129,4 426,8 646,6 683,7 924,9 1121,6 a 2179,3 ALL-49 54,6 99,3 305,1 420,4 483,7 701,0 839,0 ab 1911,0 ALL-52 43,1 117,1 315,8 446,3 559,0 694,6 794,5 ab 1291,2
Testemunha 40,2 118,7 312,8 464,9 526,5 766,2 813,3 ab 1972,4 Média 41,1 110,1 309,4 453,7 550,6 750,8 861,1 1749,6 CV% 32,1 42,0 30,9 22,9 21,0 16,0 16,9 22,4
F calculado 0,78 NS 0,44 NS 0,88 NS 1,73 NS 0,99 NS 1,89 NS 2,63* 2,81* Médias seguidas pela mesma letra nas colunas não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade; NS: não significativo; *: F calculado significativo a 5% de probabilidade.
40
A presença dos isolados de T. harzianum não alterou a altura das plantas
(P>0,05) avaliadas aos 10, 17, 24, 31, 38, 45, 52 e 66 DAE (TABELA 6).
TABELA 6 – Altura das plantas de feijão submetidas ao tratamento das sementes com
diferentes isolados de Trichoderma harzianum.
Alturas das plantas do feijoeiro (cm/planta) Tratamento 10DAE 17DAE 24DAE 31DAE 38DAE 45DAE 52DAE
ALL-05 6,6 8,2 11,9 16,6 37,1 81,2 87,7 ALL-08 4,8 7,6 9,7 16,8 41,7 85,6 105,2 ALL-15 5,1 8,5 10,1 17,5 39,5 90,9 88,3 ALL-20 5,4 7,8 11,6 18,3 49,9 95,6 106,4 ALL-21 4,2 6,4 8,6 13,4 30,7 77,1 81,8 ALL-22 5,3 7,1 10,4 19,3 46,3 90,9 94,6 ALL-24 5,0 7,7 9,9 15,9 38,8 72,6 83,6 ALL-28 5,2 7,9 10,6 17,8 40,9 88,7 102,6 ALL-38 4,3 7,3 9,4 15,2 36,8 75,7 78,1 ALL-42 7,2 9,0 12,9 21,2 49,1 92,3 102,2 ALL-43 6,7 9,2 13,2 21,8 45,9 90,7 97,3 ALL-47 5,0 8,9 12,9 24,9 58,6 109,4 112,6 ALL-49 5,5 7,5 11,7 19,1 44,7 88,0 93,3 ALL-52 6,1 8,8 11,9 20,2 44,3 77,4 94,3
Testemunha 5,4 7,6 11,9 20,9 45,9 89,2 95,6 Média 5,5 8,0 11,1 18,6 43,3 87,0 94,9 CV% 21,7 23,8 23,8 24,2 25,8 17,5 14,8
F calculado 1,93 NS 0,71 NS 1,13 NS 1,7 NS 1,42 NS 1,51 NS 1,94* NS: não significativo; *: F calculado significativo a 5% de probabilidade.
41
A inoculação dos isolados de T. harzianum teve efeito significativo na
massa seca de raiz, porém não houve diferença entre as médias de tratamento pelo teste
de Tukey (P>0,05). Não foi observado efeito significativo dos tratamentos na massa
seca de vagem e na relação parte aérea/parte radicular. Já para massa seca da folha
observa-se que o tratamento com ALL-20 apresentou maiores médias em relação a
ALL-24, ALL-28 e ALL-38, porém nenhuma média diferiu significativamente da
testemunha (TABELA 7).
Para a massa seca de haste verificou-se que os tratamentos ALL-20 e ALL-
47 apresentaram médias superiores aos tratamentos ALL-24 e ALL-38, porém nenhuma
das médias de tratamento diferiu da média apresentada pela testemunha. Na avaliação
de massa seca da parte aérea verificou-se que todas as médias foram iguais a da
testemunha, e que o ALL-47 apresentou maior média em relação a ALL-24, ALL38 e
ALL-52. A massa seca total não diferiu entre os tratamentos com Trichoderma e
testemunha, no entanto, ALL-20 promoveu maior ganho de massa seca em relação a
ALL-24, ALL38 e ALL-52 (TABELA 7).
TABELA 7 – Massa seca final das plantas de feijão submetidas ao tratamento com
diferentes isolados de Trichoderma harzianum.
Massa seca final das plantas do feijoeiro (g/planta) Tratamento Msraiz Msfolha Mshaste Msvagem Msaérea Mstotal Msae/MSr
ALL-05 5,303 7,885 ab 7,844 ab 11,907 27,635 abc 32,939 ab 5,596 ALL-08 4,020 5,550 ab 6,130 ab 11,441 23,121 abc 27,142 ab 6,060 ALL-15 4,066 5,886 ab 6,121 ab 10,982 22,989 abc 27,055 ab 5,965 ALL-20 4,798 9,369 a 9,319 a 10,430 29,118 ab 33,916 a 6,135 ALL-21 3,492 5,792 ab 6,233 ab 13,362 25,387 abc 28,879 ab 7,596 ALL-22 3,908 4,991 ab 7,045 ab 11,885 23,921 abc 27,829 ab 6,112 ALL-24 3,536 4,318 b 4,708 b 10,655 19,681 c 23,217 b 5,943 ALL-28 2,997 4,420 b 5,261 ab 12,368 22,050 abc 25,048 ab 8,336 ALL-38 3,248 4,480 b 4,890 b 11,130 20,499 bc 23,748 b 6,421 ALL-42 4,635 6,823 ab 7,014 ab 8,698 22,535 abc 27,170 ab 5,058 ALL-43 4,252 7,914 ab 8,340 ab 11,504 27,758 abc 32,011 ab 6,604 ALL-47 5,185 7,385 ab 9,313 a 13,015 29,713 a 34,898 a 5,733 ALL-49 3,272 7,604 ab 7,369 ab 9,079 24,052 abc 27,325 ab 7,416 ALL-52 3,244 5,053 ab 5,394 ab 10,031 20,477 bc 23,722 b 6,507
Testemunha 3,835 7,854 ab 8,262 ab 10,966 27,082 abc 30,917 ab 7,050 Média 3,986 6,355 6,883 11,163 24,401 28,387 6,436 CV% 23,2 30,0 24,6 20,0 14,3 13,8 25,9
F calculado 2,47* 2,75* 3,21* 1,34 NS 3,43* 3,72* 1,05 NS Médias seguidas pela mesma letra nas colunas não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade; NS: não significativo; *: F calculado significativo a 5% de probabilidade.
42
Para atividade de fosfatase ácida do solo coletada aos 45 DAE do feijoeiro,
observou-se que a testemunha apresentou a maior média juntamente com ALL-05,
ALL-20, ALL-21, ALL-22, ALL-28, ALL-42, ALL-43 e ALL-47. Aos 66DAE
observou-se que a atividade de fosfatase ácida teve as melhores médias para os
tratamentos ALL-05, ALL-08, ALL-15, ALL-20, ALL-21, ALL-28 e testemunha
(TABELA 8).
TABELA 8 – Atividade de fosfatase ácida do solo da rizosfera das plantas de feijão
tratadas com diferentes isolados de Trichoderma harzianum obtidos aos 45 e 66 DAE.
Atividade de fosfatase ácida (µmol ρ-NPP/g de solo/h) Tratamento 45DAE 66DAE
ALL-05 2,781 abcd 9,630 abc ALL-08 2,020 cde 10,520 a ALL-15 1,280 e 10,455 a ALL-20 2,760 abcd 9,513 abcd ALL-21 2,700 abcd 9,432 abcd ALL-22 2,776 abcd 7,636 cdef ALL-24 1,624 de 7,494 def ALL-28 2,659 abcd 8,918 abcde ALL-38 2,534 bcd 7,247 ef ALL-42 3,096 abc 6,365 fg ALL-43 2,902 abc 7,644 cdef ALL-47 3,218 ab 8,202 bcdef ALL-49 2,453 bcde 7,526 cdef ALL-52 1,971 cde 4,452 g
Testemunha 3,841 a 9,990 ab Média 2,574 8,335 CV% 15,4 8,4
F calculado 7,9* 16,89* Médias seguidas pela mesma letra nas colunas não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade; *: F calculado significativo a 5% de probabilidade.
43
A leitura do fósforo disponível aos 45 DAE apresentou leituras mais altas
para os tratamentos ALL-08, ALL-15, ALL-21, ALL-24, ALL-42, ALL-43, ALL-47,
ALL-49, ALL-52 e testemunha. A análise do fósforo disponível das amostras coletadas
66 DAE mostrou que a média apresentada pela testemunha não diferiu em relação aos
tratamentos com inoculação de fungo, e apresentaram um coeficiente de variação muito
alto, não sendo ideal para fornecer uma resposta segura (TABELA 9).
TABELA 9 – Conteúdo de fósforo disponível em amostras de solo coletadas da
rizosfera das plantas de feijão aos 45 e 66 DAE tratadas com diferentes isolados de
Trichoderma harzianum.
Fósforo disponível (mg/dm3) Tratamento 45DAE 66DAE
ALL-05 22,5 b 1,2 b ALL-08 43,2 ab 9,7 a ALL-15 26,9 ab 1,9 b ALL-20 18,8 b 2,6 ab ALL-21 33,3 ab 3,9 ab ALL-22 14,4 b 1,9 b ALL-24 37,7 ab 1,2 b ALL-28 17,7 b 2,6 ab ALL-38 17,5 b 1,2 b ALL-42 29,2 ab 1,1 b ALL-43 40,1 ab 2,8 ab ALL-47 29,7 ab 2,1 b ALL-49 29,7 ab 2,3 ab ALL-52 52,1 a 2,0 b
Testemunha 26,2 ab 6,9 ab Média 29,1 2,9 CV% 39,1 104,8
F calculado 3,49* 2,48* Médias seguidas pela mesma letra nas colunas não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade; *: F calculado significativo a 5% de probabilidade.
44
As leituras do pH do solo aos 45 DAE mostraram diferença significativa
entre as médias de tratamento, apresentando as menores leituras nos tratamentos ALL-
05 e ALL-43. Não houve diferença estatística significativa entre os tratamentos para a
variável pH aos 66DAE (TABELA 10).
A variável matéria orgânica do solo (MOS) não apresentou diferença
significativa nem para 45 DAE e nem para 66 DAE (TABELA 10).
TABELA 10 – Valores de pH e matéria orgânica do solo da rizosfera das plantas de
feijão tratadas com diferentes isolados de Trichoderma harzianum obtidos aos 45 e 66
DAE.
pH (CaCl2) MOS (%) Tratamento 45DAE 66DAE 45DAE 66DAE
ALL-05 6,4 d 5,7 a 2,4 2,8 ALL-08 6,7 abc 6,3 a 2,0 2,5 ALL-15 6,7 bc 5,8 a 1,9 3,1 ALL-20 6,7 abc 5,9 a 1,7 2,9 ALL-21 6,8 abc 6,0 a 2,1 2,6 ALL-22 6,8 abc 5,7 a 2,0 2,6 ALL-24 6,9 a 5,4 a 1,4 2,6 ALL-28 6,8 abc 5,6 a 2,0 2,6 ALL-38 6,9 a 5,4 a 2,0 2,8 ALL-42 6,8 abc 5,4 a 1,6 2,6 ALL-43 6,6 cd 5,5 a 2,2 3,1 ALL-47 6,7 abc 6,2 a 1,9 3,3 ALL-49 6,9 ab 6,0 a 2,4 3,1 ALL-52 6,9 a 5,7 a 2,1 3,0
Testemunha 6,9 ab 6,2 a 2,3 3,6 Média 6,8 5,8 2,0 2,9 CV% 1,4 6,6 20,6 17,8
F calculado 8,32* 2,64* 1,8 NS 1,6 NS Médias seguidas pela mesma letra, entre colunas, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade; *: F calculado significativo a 5% de probabilidade.
45
Foram feitos testes de correlações entre as variáveis massa seca, altura e
área foliar do feijoeiro, atividade de fosfatase ácida, P disponível, MOS e pH do solo,
avaliadas aos 45 e 66 DAE.
Verificou-se correlação positiva entre área foliar aos 45 DAE e atividade de
fosfatase ácida, e correlação negativa entre área foliar aos 45 DAE e pH. Para os demais
parâmetros avaliados aos 45 DAE não foi observada correlação (TABELA 11). Não
houve correlação entre as variáveis fosfatase, fósforo disponível, pH e MO para o solo
coletado aos 45 DAE (TABELA 13).
Verificou-se correlação positiva entre volume de raiz e atividade de
fosfatase ácida, entre área foliar e MO, entre área foliar e fósforo disponível, entre
fosfatase e fósforo, entre fosfatase e pH, e entre fósforo disponível e pH. Observou-se
ainda correlação positiva entre massa seca da vagem e MO, massa seca de folha e MO,
massa seca da parte aérea e pH do solo, e entre volume de raiz e pH do solo (TABELA
12).
TABELA 11 – Correlação entre dados da planta e dados do solo coletados aos 45 DAE.
Correlação entre os parâmetros avaliados aos 45 DAE P disponível Atividade de fosfatase ácida pH MOS
Altura -0,299 NS 0,437 NS -0,281 NS -0,008 NS Área foliar -0,186 NS 0,502 * -0,552 * 0,317 NS
* Correlação significativa a 5% de probabilidade; NS: Não significativo a 5% de probabilidade.
TABELA 12 – Correlação entre dados da planta e dados do solo coletados aos 66 DAE.
* Correlação significativa a 5% de probabilidade; NS: Não significativo a 5% de probabilidade.
Correlação entre os parâmetros avaliados aos 66 DAE P disponível Atividade de fosfatase ácida pH MOS
MS raiz 0,091 NS 0,271 NS 0,161 NS 0,140 NS MS folha 0,075 NS 0,273 NS 0,364 NS 0,513 * MS haste 0,081 NS 0,258 NS 0,444 NS 0,521 * MS vagem 0,170 NS 0,446 NS 0,306 NS 0,053 NS MS aérea 0,143 NS 0,434 NS 0,510 * 0,474 NS MS total 0,105 NS 0,422 NS 0,466 NS 0,431 NS MS ae/MSr 0,216 NS 0,121 NS 0,209 NS 0,088 NS Vol. Rad 0,425 NS 0,664 * 0,537 * 0,258 NS Área foliar 0,501 * 0,354 NS 0,370 NS 0,501 *
46
TABELA 13 – Correlação entre as variáveis analisadas do solo coletado aos 45 DAE.
45DAE C R
Fosfatase ácida x P disponível -0,360 NS Fosfatase ácida x MOS 0,314 NS Fosfatase ácida x pH -0,070 NS P disponível x MOS 0,005 NS P disponível x pH 0,147 NS
NS: Não significativo a 5% de probabilidade.
TABELA 14 - Correlação entre as variáveis analisadas do solo coletado aos 66 DAE.
66 DAE C R
Fosfatase ácida x P disponível 0,524 * Fosfatase ácida x MOS 0,067 NS Fosfatase ácida x pH 0,550 * P disponível x MOS 0,080 NS P disponível x pH 0,704 *
* Correlação significativa a 5% de probabilidade. NS: Não significativo a 5% de probabilidade.
Houve correlação positiva entre P disponível e fosfatase ácida, entre
fosfatase ácida e pH do solo, e entre P disponível e pH do solo avaliados aos 66 DAE
(TABELA 14).
47
6 – DISCUSSÃO
A utilização de microrganismos como agentes de controle biológico ou
produtores de fatores de crescimento em plantas tem sido realizada através de
inoculação direta de esporos direto no solo ou substrato (Inbar, 1994; Rudresh et al.,
2005), adsorvidos na semente (Resende et al., 2004; Harman et al., 2004), ou mesmo
aplicado na plântula (Gravel et al., 2007). A aplicação dos esporos dos microrganismos
diretamente na semente visa um contato mais próximo entre o fungo, a planta e o solo.
Este procedimento pode favorecer um crescimento populacional do fungo juntamente
com o desenvolvimento das raízes da planta. Sendo esperado através dessa associação,
que as plantas inoculadas sejam beneficiadas desde sua emergência.
Através dos resultados dos testes de germinação in vitro das sementes de
feijão tratadas com esporos de isolados de Trichoderma harzianum verificou-se que não
houveram ganhos ou perdas significativos em sua taxa de germinação (Tabela 3),
provavelmente pelo fato das sementes selecionadas já apresentarem uma boa
germinação. Segundo Machado et al. (2002), somente são observados efeitos na
germinação quando as sementes tratadas apresentam moderados níveis de qualidade
fisiológica. Os resultados deste trabalho estão de acordo com os observados por
Rudresh et al. (2005), que não observaram efeitos diferenciais na taxa de germinação de
sementes de grão-de-bico, em função da inoculação de sementes com isolados de
Trichoderma. Entretanto, outros autores relataram resultados positivos na germinação
de sementes de diferentes plantas tais como pimenta, vinca, crisântemo (Chang et al.,
1986) e milho (Harman et al., 1989) após inoculação com T. harzianum.
Para a aderência dos esporos nas sementes de feijoeiro utilizou-se goma
arábica a 20%. Testes preliminares mostraram que esta concentração não inibiu o
crescimento dos isolados de Trichoderma. Nossos resultados estão de acordo com os
descritos por Ogut et al. (2005), que utilizaram goma arábica na concentração de 40%
em sementes de milho e feijão.
Com objetivo de avaliar a sobrevivência dos isolados de T. harzianum
inoculados no solo, amostras foram coletadas e a população destes avaliada (Tabela 4).
Observamos que a população de T. harzianum contida no solo aos 45 dias após a
emergência (DAE) do feijoeiro foi relativamente baixa. Grande parte dos isolados
utilizados neste estudo não apresentaram boa capacidade de estabelecimento no solo sob
as condições experimentais utilizadas. Contudo, observou-se que aos 66 DAE do
48
feijoeiro ainda houve crescimento dos isolados ALL-15 (0,7 x 103 ufc/g de solo), ALL-
42 (0,7 x 103 ufc/g de solo) e ALL-43 (1,0 x 103 ufc/g de solo) (Tabela 4). Estudos de
Lima (2002) demonstraram que os isolados de T. harzianum ALL-42 e ALL-43
apresentaram boa capacidade micoparasítica e de produção de enzimas hidrolíticas
(quitinases e β-1,3-glucanases).
Um dos trabalhos que associam crescimento vegetal e população de
microrganismos em sistema de micropropagação de morango foi realizado por Vesterg
et al. (2004). Foi verificado ao longo de vários experimentos que a população de T.
harzianum foi variável, com valores de densidade populacional variando de 2 x 102 a
8,7 x 107 ufc/g de solo seco. Estes sugeriram que uma provável razão para a baixa
população encontrada pode ser atribuída propriedade biológica e nutricional do
substrato utilizado parta crescimento do fungo.
Jayanthi et al (2003), durante pesquisa de promoção de crescimento em
sistema de micropropagação, avaliaram a recuperação da população de T. harzianum,
Glomus mosseae e Bacillus coagulans presentes na raiz de plantas de Ficus benjamina e
observaram, para o tempo avaliado, que não houve crescimento de colônias de T.
harzianum quando este foi aplicado isoladamente ao solo. Entretanto, populações de T.
harzianum de até 6,7 x 105 ufc/g de solo foram observadas quando os três
microrganismos foram aplicados em conjunto. O que mostra que a interação entre T.
harzianum e os outros microrganismos influencia no seu estabelecimento no solo.
A sobrevivência de Trichoderma no solo ou substrato pode também ser
influenciada por fatores como temperatura, umidade, nutrientes, tipo de solo,
microbiota, aeração, pH e teor de matéria orgânica (Melo, 1991; Howell, 2003).
Segundo Chet e Baker (1981), Trichoderma spp. são ativos em solos ácidos. O pH do
solo encontrado neste experimento (TABELA 10) deve ter sido um dos fatores
responsáveis para o baixo estabelecimento dos isolados no solo, visto que seus valores
aos 45 DAE do feijoeiro estão acima dos considerados idéias para os isolados de T.
harzianum utilizados neste trabalho como visto por Lima (2002). Embora Melo (1991)
sugira que T. harzianum é mais ativo como antagonista em solo com pH 6,5 ou mais
baixo em temperatura acima de 22°C, esse valor de pH não deve ser considerado o ideal
para a sobrevivência de todos os demais isolados de T. harzianum.
A presença de adubação fosfatada também pode ter implicado na redução da
população de T. harzianum. Nahas et al. (1994) verificou uma diminuição da população
de fungos em solos onde foi aplicado superfosfato. Machado et al. (1983) sugeriu que o
49
aumento das populações de microrganismos solubilizadores decorreu da baixa
disponibilidade de fósforo em solo adicionado de fosfato natural.
A forma e quantidade de aplicação de Trichoderma nas plantas difere
bastante entre os trabalhos, e muito provavelmente, este é um fator que influencia
significativamente nas diferentes respostas obtidas com a inoculação de Trichoderma.
Ogut et al. (2005) aplicaram na base do caule de feijão 1mL de solução T. harzianum a
6,3 x 105 ufc/mL durante estudo em casa de vegetação e para condições de campo
utilizou 5,3 x 104 ufc/semente. Harman et al. (2004b) verificaram crescimento de plantas
de milho a partir da inoculação de Trichoderma em pó numa concentração de 1 x 109
ufc/g. Rudresh et al. (2005), conseguiram obter ganhos no crescimento da planta quando
utilizou 3g de isolados de Trichoderma em pó por quilo de semente, numa concentração
de 6 x 107 ufc/g. É bastante dificultada a comparação entre os resultados obtidos nestes
trabalhos anteriores e no presente trabalho em virtude de haver tão grande diferença na
quantidade e modo de aplicação de esporos inoculados nas plantas.
Nos trabalhos citados na literatura observou-se a aplicação de Trichoderma
no solo em concentrações acima dos valores utilizados neste trabalho (108 conídios/mL),
e muitas vezes utilizando substratos para as plantas que servem como fonte de
nutrientes para o fungo, proporcionando condições para o crescimento dos mesmos, o
que não reflete as encontradas no cultivo em campo. Todos os trabalhos avaliados
mostram que é de fundamental importância que os fungos inoculados recebam
condições ideais para se multiplicar em quantidade suficiente para competir com a
população microbiana já residente.
Dentre as variáveis medidas ao longo do crescimento dos feijoeiros foram
utilizadas: altura, área foliar e massa seca. Observou-se que não houve ganho
significativo na altura das plantas analisadas (TABELA 6). Entretanto, Rudresh et al
(2005) observaram aumento das alturas das plantas de grão-de-bico cultivadas em
campo quando as sementes foram tratadas com diferentes isolados de Trichoderma.
Porém, nos experimentos de casa de vegetação não foram observadas diferenças
significativas na altura das plantas. Inbar (1994) observou aumento na altura de
plântulas de pepineiro (23,8%) e pimenteira (17,2%) após tratamento com T.
harzianum.
A importância da área foliar de uma cultura é amplamente conhecida por ser
um parâmetro indicativo da produtividade, pois o processo fotossintético depende da
interceptação da energia luminosa e a sua conversão em energia química (Portes et al.,
50
2003). Quanto maior for o investimento em área foliar, espera-se uma maior captação
de luz e conversão da energia luminosa em química, proporcionando altas taxas de
crescimento e maiores ganhos de carbono (Grime & Hunt, 1975). Porém, além do
índice de área foliar ótimo, o autossombreamento reduz as taxas assimilatórias líquidas
resultando em prejuízo às plantas (Portes et al., 2003).
As medidas de área foliar realizadas nos diferentes tempos do crescimento
do feijoeiro não foram alteradas em virtude do tratamento com T. harzianum (Tabela 7).
Embora tenha havido diferença significativa no ganho de área foliar na avaliação de 52
DAE, este efeito não foi observado na produção final de área foliar aos 66 DAE.
Contudo, Inbar et al. (1994), observaram alterações em área foliar de pepineiro (96,1%)
e em pimenteira (50%), após aplicação de T. harzianum T-203 em substrato estéril,
numa concentração de 5 x 109 conídios/g.
A análise de massa seca das raízes das plantas mostrou que os isolados
testados não foram capazes de promover ganho radicular no feijoeiro. A massa seca das
folhas confirmou que não houveram ganhos significativos em sua massa em virtude da
presença de T. harzianum em relação à testemunha. Os resultados da avaliação da
produção de massa seca das plantas do feijoeiro quando tratadas com T. harzianum,
mostraram que nenhum dos isolados foi capaz de promover ganho significativo em
massa seca.
Esses resultados estão de acordo com os obtidos por Ogut et al. (2005), que
não observaram ganhos em massa seca total, raiz, e caule das plantas de feijão,
cultivadas em casa de vegetação e em campo, e trigo, cultivado em campo, quando
inoculados com T. harzianum Rifai 1295-22 (T-22). Porém esses autores observaram
aumento da massa e número de nódulos nas plantas de feijão e elevação do conteúdo de
nitrogênio nas sementes de trigo (Ogut et al. 2005). Corrêa (2006) observou redução da
massa seca do pepineiro cultivado em hidroponia em conseqüência da aplicação de
Trichoderma na solução nutritiva na concentração de 107 conídios/mL. Entretanto,
Harman et al, (2004), observaram em plantas de milho, tratadas com T. harzianum T-22
aumento de caule, raízes primárias e secundárias e pêlos radiculares. Dados semelhantes
foram relatados por Chang et al (1986), que observaram um ganho de 10% em massa
seca de feijoeiro tratado com Trichoderma.
É conhecido na literatura que microrganismos encontrados no solo são
importantes nos mecanismos de disponibilização de fósforo para as plantas. Segundo
Dick e Tabatabai (1993), os microrganismos seriam as fontes mais expressivas de
51
fosfatases no solo, por causa da sua grande biomassa, alta atividade metabólica e curto
tempo de vida, com várias gerações, permitindo a produção e a liberação de quantidades
elevadas de enzimas extracelulares em comparação com as plantas. Portanto, fosfatases
ácidas microbianas têm sido descritas como mais eficientes na hidrólise de P quando
comparadas com as originadas das plantas (Tarafdar et al., 2001). Entretanto, estudos da
dinâmica da produção da fosfatase microbiana do solo mostram que essas geralmente
sofrem interferência da alta atividade das fosfatases produzidas pelas raízes das plantas
(Juma & Tabatabai, 1977).
Provavelmente, a atividade de fosfatase ácida do solo encontrada no
presente trabalho, foi proveniente da planta do feijoeiro e dos microrganismos presentes
no solo, uma vez que T. harzianum manteve uma baixa população no solo nas épocas
em que foi avaliada a atividade de fosfatase.
Fungos do gênero Trichoderma, principalmente T. harzianum, são
conhecidos como solubilizadores de fósforo na rizosfera de algumas plantas (Rudresh,
2005; Lima, 2006). Esta é uma característica interessante, pois podem auxiliar na
nutrição vegetal através da disponibilização de fósforo não solúvel por ação de enzimas
denominadas de fosfatases ácidas e alcalinas. Fosfatases ácidas são enzimas que
catalisam a hidrólise de uma variedade de compostos fosfatados orgânicos, com a
produção de fósforo solúvel, contribuindo para o metabolismo energético, transdução de
sinal (Dickman & Yarden, 1999) ou aquisição de fósforo com propósito nutricional
(Walsh et al., 1994). São enzimas que estão amplamente distribuídas na natureza, e têm
sido encontradas em bactérias, fungos, protozoários, animais e plantas (Criquet et al.,
2004).
Considerando que a determinação desta enzima no solo pode ser utilizada
como marcador de crescimento de microrganismos no solo, fez-se uma avaliação da
atividade de fosfatase ácida de amostras do solo aos 45 e 66 DAE. A leitura da fosfatase
ácida das amostras do solo coletadas aos 45 DAE do feijoeiro mostrou que os solos
oriundos dos tratamentos com ALL-08, ALL-15, ALL-24, ALL-38, ALL-49 e ALL-52
apresentaram valores de atividade inferiores à apresentada pela testemunha. Nas
amostras de solo tratadas com ALL-22, ALL-24, ALL-38, ALL-42, ALL-43, ALL-49 e
ALL-52, aos 66 DAE também apresentaram leituras de atividade de fosfatase ácida
inferiores as apresentadas pela testemunha. Entretanto, todas as outras amostras tiveram
valores significativamente iguais aos valores encontrados para amostras de solo não
tratada com Trichoderma (TABELA 8).
52
Um fator que pode ter influenciado a atividade de fosfatase é o fato de ter
sido aplicado fósforo na adubação do solo, e este poder ter inibido a secreção de
fosfatases por parte de T. harzianum. Fosfatases ácidas produzidas por microrganismos
são reprimidas por concentrações crescentes de fosfato no solo (Nahas, 1982). Esta idéia
foi reforçada pelos dados de Clarholm (1993) que mostraram que a fertilização com
fósforo inibe a atividade de fosfatase em amostras de solo. Tarafdar & Yadav (2001)
citam que a secreção máxima de fosfatase ácida pelas plantas foi observada em
condições de deficiência de fósforo e que a menor taxa de secreção foi observada na
presença de fósforo inorgânico, sugerindo que PO43-inorgânico pode ser um inibidor
competitivo de fosfatase. Lima (2006) verificou que a atividade de fosfatase ácida
isolada de T. harzianum ALL-42, um dos isolados utilizado no presente trabalho, foi
inibida em meio de cultura contendo NaH2PO4.
A determinação do conteúdo de fósforo disponível nos solos aos 45 e 66
DAE das plantas de feijoeiro inoculadas com Trichoderma não mostrou variação
significativa, quando os tratamentos foram comparados (TABELA 9). O método
utilizado no presente trabalho para a avaliação de fósforo disponível (Mehlich 1), utiliza
um extrator ácido, que extrai mais P ligado a Ca e apenas pequena proporção do
elemento ligado a Fe e Al. As leituras do fósforo disponível no solo apresentaram um
coeficiente de variação muito grande, não sendo possível afirmar com segurança que os
resultados obtidos foram devidos aos tratamentos. Os resultados obtidos podem ter sido
prejudicados devido à presença de adubos aplicados na forma de grânulos, que se
fixaram às partículas de solo próximas às raízes.
A leitura do pH de amostras de solo coletadas 45 DAE foram iguais entre a
maioria dos tratamentos, mantendo um valor médio de 6,8 (TABELA 10). A
manutenção deste valor foi importante, pois estão dentro da faixa ideal (6,5 a 7,0)
sugerida para o crescimento do feijoeiro (Fageria et al., 2004). Porém, estiveram acima
do ideal para o crescimento dos isolados de T. harzianum utilizados. Somente os solos
oriundos dos tratamentos com ALL-05, ALL-43 apresentaram menor acidez em relação
à testemunha. Aos 66 DAE houve uma redução no valor médio do pH entre os
tratamentos para 5,8; e não houve diferença significativa no pH entre os diferentes
tratamentos.
O pH do solo é uma das mais importantes propriedades químicas que
influenciam a solubilidade dos nutrientes e, portanto, a disponibilidade de nutrientes
para as plantas. A disponibilidade de P e N é baixa em pHs baixos, e aumenta em pH
53
em torno de 7,0. A disponibilidade de P está associada com a neutralização de
compostos de Al, Mn e Fe, que fixam fósforo em pH baixo (Fageria & Stone, 2006). Os
valores apresentados de pH do solo deste experimento aproximam-se do valor ideal para
uma boa solubilização de P, possibilitando uma alta quantidade de P assimilável, o que
exige menor atividade das fosfatases na solubilização dos compostos fosfatados
presentes no solo.
O conteúdo de matéria orgânica do solo (MOS) avaliado nas amostras
coletadas aos 45 e 66 DAE não diferiu entre os tratamentos, porém observa-se um
aumento do conteúdo de MOS entre os 45 e 66 DAE (TABELA 10). Aumento esse, que
pode ser atribuído à liberação de exsudatos ao longo do período de crescimento das
plantas permitindo um aumento na população microbiana local, além da deposição de
restos vegetais devido à queda das folhas mais antigas.
Os testes de correlação para as avaliações aos 45 DAE mostram correlação
positiva entre produção de área foliar e atividade de fosfatase ácida, e correlação
negativa entre produção de área foliar e pH do solo (TABELA 11). Não houve
correlação entre atividade de fosfatase ácida e pH do solo, sugerindo que não se pode
atribuir o aumento da atividade de fosfatase à diminuição no pH do solo (TABELA 13),
embora se observe uma redução do pH dos 45 aos 66 DAE, os valores se mantiveram
acima do valor de pH ideal de 6,5 indicado para ação da fosfatase ácida no solo segundo
Tabatabai & Bremner (1969).
Já para as avaliações realizadas aos 66 DAE não foi verificada correlação
entre área foliar e fosfatase ácida (TABELA 13). Foram observadas correlações
positivas entre atividade de fosfatase ácida e fósforo disponível, entre atividade de
fosfatase ácida e pH, e entre fósforo disponível e pH (TABELA 14). Essa correlação
positiva entre fosfatase ácida e pH está em desacordo com o esperado, pois valores
decrescentes de pH deveriam estimular a atividade da enzima.
Seria interessante fazer a inoculação de T. harzianum em solos adubados em
diferentes concentrações e em diferentes formas de fósforo, principalmente formas
pouco solúveis, como do fosfato de rocha, para poder então chegar a resultados mais
claros sobre a capacidade de T. harzianum em solubilizar compostos fosfatados, pois os
resultados obtidos em meio de cultura, apesar de mostrarem a capacidade de
solubilização desses microrganismos, não refletem as condições do fósforo aplicado no
solo, que sofre processos como adsorção e precipitação.
54
A determinação dos efeitos do Trichoderma no crescimento de plantas é de
difícil análise devido às várias interações entre este microrganismo, o solo, outros
organismos, mudanças no ambiente do solo e as raízes das plantas (Bailey & Lumsden,
1998). Além disso, é provável que um aumento no crescimento de plantas seja mais
evidente sob condições de estresse, pois quando as plantas são crescidas em condições
ótimas há menor oportunidade de incremento na produção.
A partir dos resultados aqui apresentados, verificou-se que não houve
promoção de crescimento do feijoeiro em função da inoculação de isolados de T.
harzianum nas condições experimentais adotadas. Porém, não foi observada diminuição
do crescimento em função da inoculação na semente do feijoeiro. Sendo possível
selecionar os isolados ALL-15, ALL-42 e ALL-43 como isolados a serem estudados
mais profundamente devido ao seu melhor estabelecimento no solo, e devido a
capacidade micoparasítica do ALL-42 e ALL-43 demonstrada anteriormente (Lima,
2002).
Os dados obtidos neste trabalho contribuíram para um melhor entendimento
das potencialidades de aplicação dos isolados de T. harzianum naturais do cerrado no
crescimento do feijoeiro. O tempo de estabelecimento desses fungos no solo é
determinante para uma melhor avaliação de seus efeitos. Sendo necessário estudar
condições de aplicação, que possam ser compatíveis com uma futura aplicação no
campo, para prover crescimento das colônias de T. harzianum em condições e
quantidades suficientes para proporcionar benefícios para plantas ao longo do seu
período de cultivo. Entretanto, outros trabalhos precisam ser realizados para que se
possa conhecer um pouco mais sobre a ecologia desses isolados e consequentemente
utilizá-los em escala comercial.
55
7 – CONCLUSÃO
• Não há aumento de produção de massa seca, área foliar e altura das plantas do
feijoeiro quando tratadas com os isolados de Trichoderma harzianum ALL-05,
ALL-08, ALL-15, ALL-20, ALL-21, ALL-22, ALL-24, ALL-28, ALL-38,
ALL-42, ALL-43, ALL-47, ALL-49, ALL-52 nas condições experimentais aqui
adotadas;
• Os isolados ALL-15, ALL-42 e ALL-43 são capazes de se estabelecer no solo
por maior tempo do que ALL-05, ALL-08, ALL-20, ALL-21, ALL-22, ALL-24,
ALL-28, ALL-38, ALL-47, ALL-49 e ALL-52;
• A atividade de fosfatase ácida do solo foi reduzida no tratamento com alguns
isolados de T. harzianum;
• Não há correlação entre atividade de fosfatase ácida do solo e ganho de massa
seca pelo feijoeiro.
56
8 – PERSPECTIVAS
• Avaliar os isolados de Trichoderma harzianum ALL-15, ALL-42 e ALL-43 em estudos futuros de promoção de crescimento.
• Avaliar o crescimento de T. harzianum em solos submetidos a diferentes fontes de fósforo e em diferentes doses.
• Desenvolver um substrato ideal para proporcionar condições para o crescimento de T. harzianum no solo
• Avaliar concentrações ideais de esporos de T. harzianum a serem aplicadas no solo.
• Verificar o efeito de diferentes pHs do solo no crescimento de T. harzianum.
• Desenvolver experimentos com T. harzianum em condições de temperaturas
controladas
57
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66
ANEXOS TABELA 1 - Análise de variância da germinação in vitro de sementes de feijão inoculadas com isolados de Trichoderma harzianum.
FV GL SQ QM F Pr > F Tratamento 14 983,333 70,238 0,739 NS 0,724
Resíduo 45 4275,000 95,000 Total 59 5258,333 CV % 10,93
NS= não significativo TABELA 2 – Análise de variância da área foliar aos 10DAE
FV GL SQ QM F Pr > F Trat 14 1901,746486 135,839035 0.78NS 0,6816
Resíduo 41 7121,088019 173,684915 Total 55 9022,828019 CV % 32,09739
NS= não significativo TABELA 3 - Análise de variância da área foliar aos 17DAE
FV GL SQ QM F Pr > F Trat 14 13303,0538 950,2181 0,44 NS 0,9499
Resíduo 45 96279,372 2139,3416 Total 59 109573,4258 CV % 42,0038
NS= não significativo TABELA 4 - Análise de variância da área foliar aos 24DAE
FV GL SQ QM F Pr > F Trat 14 112585,8782 8041,8484 0,88 NS 0,5839
Resíduo 45 411032,7754 9134,0617 Total 59 523618,6537 CV % 30,89381
NS= não significativo TABELA 5 - Análise de variância da área foliar aos 31DAE
FV GL SQ QM F Pr > F Trat 14 261989,0754 18713,5054 1,73 NS 0,0818
Resíduo 45 485545,8912 10789,9087 Total 59 747534,9666 CV % 22,8927
NS= não significativo TABELA 6 - Análise de variância da área foliar aos 38DAE
FV GL SQ QM F Pr > F Trat 14 185631,7078 13259,4077 0,99 NS 0,4772
Resíduo 45 601679,1055 13370,6468 Total 59 787310,8134 CV % 21,00104
NS= não significativo
67
TABELA 7 - Análise de variância da área foliar aos 45DAE
FV GL SQ QM F Pr > F Trat 14 382341,383 27310,099 1,89 NS 0,054
Resíduo 45 650353,694 14452,304 Total 59 1032695,077 CV % 16,01285
NS= não significativo TABELA 8 - Análise de variância da área foliar aos 52DAE
FV GL SQ QM F Pr > F Trat 14 5635814,3 402558,16 2,63* 0,0071
Resíduo 45 6888649,24 153081,09 Total 59 12524463,54 CV % 16,891
*Significativo a 5% de probabilidade TABELA 9 - Análise de variância da área foliar aos 66DAE
FV GL SQ QM F Pr > F Trat 14 833597,658 59542,69 2,81* 0,0054
Resíduo 39 825165,043 21158,078 Total 53 1658762,701 CV % 16,89119
*Significativo a 5% de probabilidade TABELA 10 - Análise de variância da altura aos 10DAE
FV GL SQ QM F Pr > F Trat 14 37,98980655 2,71355761 1,93 NS 0,0513
Resíduo 41 57,59479167 1,40475102 Total 55 95,58459821 CV % 21,68679
NS= não significativo TABELA 11 - Análise de variância da altura aos 17DAE
FV GL SQ QM F Pr > F Trat 14 35,6573333 2,5469524 0,71 NS 0,7525
Resíduo 45 161,343125 3,5854028 Total 59 197,0004583 CV % 23,77544
NS= não significativo TABELA 12 - Análise de variância da altura aos 24DAE
FV GL SQ QM F Pr > F Trat 14 110,5615 7,89725 1,13 NS 0,3595
Resíduo 45 314,345 6,9854444 Total 59 424,9065 CV % 23,77867
NS= não significativo
68
TABELA 13 - Análise de variância da altura aos 31DAE FV GL SQ QM F Pr > F Trat 14 482,09975 34,435696 1,7 NS 0,0889
Resíduo 45 909,994375 20,222097 Total 59 1392,094125 CV % 24,18663
NS= não significativo TABELA 14 - Análise de variância da altura aos 38DAE
FV GL SQ QM F Pr > F Trat 14 2475,209333 176,800667 1,42 NS 0,1841
Resíduo 45 5608,433125 124,631847 Total 59 8083,642458 CV % 25,7583
NS= não significativo TABELA 15 - Análise de variância da altura aos 45DAE
FV GL SQ QM F Pr > F Trat 14 4870,43983 347,88856 1,51 NS 0,1477
Resíduo 45 10389,815 230,88478 Total 59 15260,25483 CV % 17,46573
NS= não significativo TABELA 16 - Análise de variância da altura aos 52DAE
FV GL SQ QM F Pr > F Trat 14 5392,36433 385,16888 1,94* 0,0465
Resíduo 45 8911,89 198,042 Total 59 14304,25433 CV % 14,82954
*Significativo a 5% de probabilidade TABELA 17 – Análise de variância de massa seca radicular
FV GL SQ QM F Pr > F Trat 14 29,5476519 2,110547 2,47* 0,0111
Resíduo 45 38,4575165 0,854611 Total 59 68,0051684 CV % 23,19015
*Significativo a 5% de probabilidade TABELA 18 – Análise de variância de massa seca da folha
FV GL SQ QM F Pr > F Trat 14 140,3746814 10,02676 2,75* 0,0052
Resíduo 45 164,1816648 3,648481 Total 59 304,5563462 CV % 30,05767
*Significativo a 5% de probabilidade
69
TABELA 19 – Análise de variância de massa seca da haste FV GL SQ QM F Pr > F Trat 14 128,7479834 9,196285 3,21* 0,0015
Resíduo 45 129,1072715 2,869051 Total 59 257,8552549 CV % 24,60933
*Significativo a 5% de probabilidade TABELA 20 – Análise de variância de massa seca da vagem
FV GL SQ QM F Pr > F Trat 14 94,2118457 6,729418 1,34 NS 0,2206
Resíduo 45 225,271775 5,006039 Total 59 319,4836207 CV % 20,04238
*Significativo a 5% de probabilidade TABELA 21 – Análise de variância de massa seca da parte aérea
FV GL SQ QM F Pr > F Trat 14 585,005597 41,78611 3,43* 0,0008
Resíduo 45 547,78601 12,17302 Total 59 1132,791607 CV % 14,29849
*Significativo a 5% de probabilidade TABELA 22 – Análise de variância de massa seca total
FV GL SQ QM F Pr > F Trat 14 803,445856 57,38899 3,72* 0,0004
Resíduo 45 695,026113 15,44503 Total 59 1498,471969 CV % 13,84419
*Significativo a 5% de probabilidade TABELA 23 – Análise de variância de massa seca da relação parte aérea/parte radicular
FV GL SQ QM F Pr > F Trat 14 40,8993992 2,921386 1,05 NS 0,4266
Resíduo 45 125,388317 2,786407 Total 59 166,2877162 CV % 25,9382
NS= não significativo TABELA 24 – Análise de variância do volume radicular
FV GL SQ QM F Pr > F Trat 14 2556,892655 182,6352 1,27 NS 0,266
Resíduo 44 6344,666667 144,197 Total 58 8901,559322 CV % 40,30057
NS= não significativo
70
TABELA 25 - Análise de variância de fosfatase ácida da avaliação aos 45DAE FV GL SQ QM F Pr > F Trat 14 17,41586 1,24399 7,9* <0,0001
Resíduo 30 4,725566 0,157519 Total 44 22,14142 CV % 15,41724
*Significativo a 5% de probabilidade TABELA 26 - Análise de variância de fosfatase ácida da avaliação aos 66DAE
FV GL SQ QM F Pr > F Trat 14 117,3298 8,380699 16,89* <0,0001
Resíduo 30 14,88568 0,496189 Total 44 132,2155 CV % 8,451243
*Significativo a 5% de probabilidade TABELA 27 - Análise de variância de fósforo disponível na avaliação aos 45DAE.
FV GL SQ QM F Pr > F Trat 14 6339,164 452,7974 3,49* 0,0007
Resíduo 45 5839,87 129,7749 Total 59 12179,03 CV % 39,1339
*Significativo a 5% de probabilidade TABELA 28 - Análise de variância de fósforo disponível na avaliação aos 66DAE
FV GL SQ QM F Pr > F Trat 14 313,576 22,39829 2,48* 0,0108
Resíduo 45 406,89 9,042 Total 59 720,466 CV % 104,7732
*Significativo a 5% de probabilidade TABELA 29 - Análise de variância do pH na avaliação aos 45DAE.
FV GL SQ QM F Pr > F Trat 14 1,054333 0,07531 8,32* <0,0001
Resíduo 45 0,4075 0,009056 Total 59 1,461833 CV % 1,407355
*Significativo a 5% de probabilidade TABELA 30 – Análise de variância do pH na avaliação aos 66DAE
FV GL SQ QM F Pr > F Trat 14 5,274333 0,376738 2,64* 0,007
Resíduo 45 6,425 0,142778 Total 59 11,69933 CV % 6,556266
*Significativo a 5% de probabilidade
71
TABELA 31 – Análise de variância da MO aos 45DAE FV GL SQ QM F Pr > F Trat 14 4,223333 0,301667 1,8 NS 0,0696
Resíduo 45 7,5625 0,168056 Total 59 CV % 20,58305
NS= não significativo TABELA 32 – Análise de variância da MO aos 66DAE
FV GL SQ QM F Pr > F Trat 14 5,779 0,412786 1,6 NS 0,1178
Resíduo 45 17,424 0,258778 Total 59 CV % 17,78679
NS= não significativo
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