EFEITO DE FRAÇÕES ULTRAFILTRADAS DO CULTIVO...
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UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ CURSO SUPERIOR DE TECNOLOGIA EM ALIMENTOS PATRÍCIA SIMER EFEITO DE FRAÇÕES ULTRAFILTRADAS DO CULTIVO DE Hansenula wingei NO CONTROLE DE Penicillium expansum E Apergillus ochraceus TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO II FRANCISCO BELTRÃO 2013
Transcript of EFEITO DE FRAÇÕES ULTRAFILTRADAS DO CULTIVO...
1
UNIVERSIDADE TECNOLÓGICA FEDERAL DO PARANÁ
CURSO SUPERIOR DE TECNOLOGIA EM ALIMENTOS
PATRÍCIA SIMER
EFEITO DE FRAÇÕES ULTRAFILTRADAS DO CULTIVO DE
Hansenula wingei NO CONTROLE DE
Penicillium expansum E Apergillus ochraceus
TRABALHO DE CONCLUSÃO DE CURSO II
FRANCISCO BELTRÃO
2013
2
PATRÍCIA SIMER
EFEITO DE FRAÇÕES ULTRAFILTRADAS DO CULTIVO DE
Hansenula wingei NO CONTROLE DE
Penicillium expansum E Apergillus ochraceus
Trabalho de Conclusão de curso apresentado ao
Curso Superior de Tecnologia em Alimentos da
Universidade Tecnológica Federal do Paraná,
como requisito parcial para a obtenção do título
de Tecnólogo em Alimentos.
Orientador: Prof. Dr. Alexandre Rodrigo Coelho
Co-orientador: Profa. Dra. Alessandra
Machado-Lunkes
FRANCISCO BELTRÃO
2013
3
FOLHA DE APROVAÇÃO
EFEITO DE FRAÇÕES ULTRAFILTRADAS DO CULTIVO DE
Hansenula wigei NO CONTROLE DE
Penicillium expansum E Apergillus ochraceus
Por
Patrícia Simer
Trabalho de Conclusão de Curso aprovado como requisito parcial para a obtenção do
título de Tecnólogo em Alimentos, no Curso Superior de Tecnologia em Alimentos da
Universidade Tecnológica Federal do Paraná.
BANCA AVALIADORA
______________________________________________
Profª Dr. Alexandre Rodrigo Coelho
Universidade Tecnológica Federal do Paraná – UTFPR
(Orientador)
______________________________________________
Profª Drª Alessandra Machado Lunkes
Universidade Tecnológica Federal do Paraná – UTFPR
(Co-orientadora)
_______________________________________________
Prof. Dr. Hernan Vielmo
Universidade Tecnológica Federal do Paraná – UTFPR
_______________________________________________
Prof. Dr. Cleusa Inês Weber
Universidade Tecnológica Federal do Paraná – UTFPR
(Coordenador de curso)
Francisco Beltrão, Abril de 2013.
“A folha de aprovação assinada encontra-se na coordenação do curso”.
4
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5
AGRADECIMENTOS
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6
“A menos que modifiquemos nossa maneira de
pensar, não seremos capazes de resolver os
problemas causados pela forma como nos
acostumamos a ver o mundo”.
(Albert Einstein)”
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RESUMO
SIMER, Patrícia. Efeito de frações ultrafiltradas do cultivo de Hansenula wingei no
controle de Penicillium expansum e Apergillus ochraceus. 2013. Trabalho de Conclusão de
Curso (Curso Superior de Tecnologia em Alimentos). Universidade Tecnológica Federal do
Paraná. Francisco Beltrão.
O Brasil se classifica entre os quatro maiores produtores mundiais de frutas, juntamente com
China, Índia e EUA. Porém, a competitividade das frutas frescas brasileiras no mercado
internacional é bastante vulnerável. Isto ocorre devido a sua susceptibilidade à infecção
fúngica no campo, assim como ataque durante o armazenamento, acarretando em
consideráveis perdas econômicas. Aliado ao interesse dos consumidores por produtos naturais
e mais saudáveis se faz necessário uma maior atenção quanto à qualidade das frutas frescas
que serão exportadas, devido a sua exposição prolongada em condições propícias a
proliferação de fungos deteriorantes/micotoxigênicos. Assim o biocontrole empregando
leveduras antagonistas, com ênfase em linhagens killer, em função da baixa possibilidade de
resíduos tóxicos, se mostra como uma relevante alternativa em relação ao tratamento químico
tradicional, diminuindo a quantidade de fungicidas utilizados no tratamento de frutos na pós-
colheita. Desta maneira, objetivou-se estudar o biocontrole de Aspergillus ochraceus e
Penicillium expansum (fungos filamentosos) pela levedura antagonista Hansenula wingei
(AM2-2
). A levedura H. wingei mostrou-se killer positiva perante as leveduras sensíveis
Candida glabrata NCYC 366 (K3), C. albicans 12A (K8) and Pichia kluyveri (CAY-15). No
antifungigrama em meio líquido (caldo MPL) o sobrenadante do cultivo de H. wingei (AM2-2
)
(25°C/96 horas) inibiu 100% da germinação de esporos e do desenvolvimento de hifas de P.
expansum. Com a utilização da mesma levedura contra o fungo A. ochraceus observou-se
uma inibição no desenvolvimento de hifas de 59,26% (25°C/120 horas) e inibição na
germinação de esporos de 90,92% (25°C/72 horas). A diferença entre os sobrenadantes
obtidos do cultivo da levedura isoladamente e em interação com o fungo teste foi significativa
(P < 0,05) na maioria dos ensaios. Quando da utilização das frações filtradas para a realização
do antifungigrama em meio líquido observou-se 75,02% de inibição do desenvolvimento de
hifas (membrana de 10kDa) e 90% de inibição da germinação de esporos (membrana de
5kDa) de A. ochraceus, sugerindo que possivelmente os compostos antifúngicos com maior
ação sobre este fungo apresentam peso molar entre 3 e 10kDa. Já em relação ao
desenvolvimento de hifas e germinação de esporos de P. expansum observou-se inibição total
(100%) com a utilização de todas as frações, sugerindo-se assim que o composto antifúngico
de maior ação para P. expansum tenha peso molecular inferior a 3kDa. De acordo com os
resultados obtidos, conclui-se que a aplicação de leveduras antagonistas constitui ferramenta
promissora no controle biológico de P. expansum e A. ochraceus em pós-colheita de frutas.
Palavras-chave: Biocontrole; Frutas; Levedura; Massa molar.
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ABSTRACT
SIMER, Patricia. Effect of ultrafiltradas fractions growing of Hansenula wingei in the
control of Penicillium expansum and Apergillus ochraceus. 2013. Monography (College of
Food Technology). Federal Technological University of Paraná. Francisco Beltrão.
The Brazil ranks among the four largest producers of fruit, along with China, India and USA.
However, the competitiveness of Brazilian fresh fruit in the international market is very
vulnerable. This is due to their susceptibility to fungal infection in the field, as well as attack
during storage, resulting in significant economic losses. Allied to consumer interest in natural
products and healthier is needed more attention on the quality of fresh fruit to be exported due
to prolonged exposure to conditions conducive to proliferation of spoilage fungi /
mycotoxigenic. So biocontrol using antagonistic yeasts with emphasis on killer strains, due to
the low possibility of toxic residues, shown as a relevant alternative to the traditional chemical
treatment, decreasing the amount of fungicides used in the treatment of post-harvest fruit.
Thus, the objective was to study the biocontrol of Aspergillus ochraceus and Penicillium
expansum (filamentous fungi) by antagonistic yeast Hansenula wingei (AM2-2). Yeast H.
wingei showed positive killer against sensitive yeasts Candida glabrata NCYC 366 (K3),
Candida albicans 12A (K8) and Pichia kluyveri (CAY-15). In vitro antifungal susceptibility
in liquid (broth MPL) the culture supernatant of H. wingei (AM2-2) (25 ° C for 96 hours)
100% inhibited spore germination and hyphal development of P. expansum. With the use of
the same yeast against the fungus A. ochraceus observed a reduction in the development of
hyphae of 59.26% (25 ° C/120 hours) and inhibition of spore germination of 90.92% (25 °
C/72 hours). The difference in the supernatants obtained from the yeast culture alone and in
interaction with the test fungus was significant (P <0.05) in most experiments. When using
the fractions filtered to carry out the in vitro antifungal susceptibility liquid medium was
observed 75.02% inhibition of the development of hyphae (10kDa membrane) and 90%
inhibition of spore germination (5kDa membrane) A. ochraceus, possibly suggesting that the
antifungal compounds with higher activity on this fungus have molecular weight between 3
and 10kDa. In relation to the development of hyphae and spores germination of P. expansum
total inhibition was observed (100%) with the use of all fractions, thus suggesting that the
antifungal compound of greater activity for P. expansum has a molecular weight below 3kDa.
According to the obtained results, it is concluded that the application of antagonistic yeast is a
promising tool for the biological control of P. expansum and A. ochraceus in postharvest fruit.
Key words: Biocontrol, fruits, yeast, Molar mass.
9
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - a) deterioração em uvas por Aspergillus sp.; b) imagem de microscópio óptico
de Aspergillus ochraceus; c) colônia típica de A. ochraceus. Fonte: NIHS
(2012)....................................................................................................................................
19
Figura 2 - a) deterioração em maçã por Penicillium expansum; b) imagem de P.
expansum por microscópio óptico; c) colônia típica de P. expansum. Fonte: AGES
(2012)....................................................................................................................................
19
Figura 3 - Exemplos de células de leveduras e sua reprodução por brotamento
originando novas células. Fonte: NIHS (2012)....................................................................
20
Figura 4 - Efeito inibitório do cultivo de H. wingei (AM2-2) e da interação H. wingei/P.
expansum no desenvolvimento de hifas e germinação de esporos de P. expansum (105
esporos), após 12 horas/25°C...............................................................................................
35
Figura 5 - Efeito inibitório do cultivo de H. wingei (AM2-2) e da interação H.wingei/A.
ochraceus no desenvolvimento de hifas e germinação de esporos de A. ochraceus (105
esporos), após 12 horas/25°C...............................................................................................
36
Figura 6 - Efeito inibitório do sobrenadante de H. wingei (AM2-2) (S + A) e das frações
filtradas (F + A) sobre o desenvolvimento de hifas e germinação de esporos de A.
ochraceus (105 esporos), após 12 horas/25°C. ....................................................................
39
10
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Fungos e deterioração em frutas......................................................................... 17
Tabela 2 - Antifungigrama em meio líquido com sobrenadante do cultivo obtido da levedura H.
wingei e da interação levedura/P. expansum.....................................................................................
34
Tabela 3 - Antifungigrama em meio líquido com sobrenadante do cultivo obtido da levedura H.
wingei (AM2-2
) e da interação levedura/A. ochraceus......................................................................
34
Tabela 4 - Antifungigrama em meio líquido com sobrenadante do cultivo obtido da levedura H.
wingei (AM2-2
) e filtrados obtidos a partir do extrato bruto, contra A. ochraceus...........................
38
Tabela 5 - Antifungigrama em meio líquido com sobrenadante do cultivo obtido da levedura H.
wingei (AM2-2
) e filtrados obtidos a partir do extrato bruto, contra P. expansum............................
38
11
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ........................................................................................................................... 12
2 OBJETIVOS ................................................................................................................................ 14
2.1 Objetivo geral ................................................................................................................................ 14
2.2 Objetivos específicos ..................................................................................................................... 14
3 REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................................. 15
3.1 PRODUÇÃO E COMERCIALIZAÇÃO DE FRUTAS FRESCAS ......................................... 15
3.2 DETERIORAÇÃO DE FRUTAS ................................................................................................ 16
3.3 PRODUÇÃO DE MICOTOXINAS ............................................................................................. 17
3.4 CONTROLE DE FUNGOS .......................................................................................................... 19
3.4.1 Controle biológico ...................................................................................................................... 20
3.5 ATIVIDADE KILLER................................................................................................................... 24
4 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................................ 27
4.1 Fungo teste ..................................................................................................................................... 27
4.2 Análise do Potencial Killer ............................................................................................................ 27
4.3 Cura da levedura Killer................................................................................................................. 28
4.4 Obtenção do extrato bruto ........................................................................................................... 29
4.5 Antifungigrama em Meio Líquido ............................................................................................... 29
4.6 Purificação parcial de composto antifúngico .............................................................................. 31
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................................... 33
CONCLUSÃO ..................................................................................................................................... 41
REFERÊNCIAS .................................................................................................................................. 42
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1 INTRODUÇÃO
No Brasil, a agricultura apresenta-se como uma das bases mais potentes de economia
com fornecimento contínuo garantido de cereais, hortaliças, oleaginosas, frutas e derivados
processados (COELHO; HOFFMANN; HIROOKA, 2003). A exportação brasileira de frutas
frescas vem aumentando no decorrer dos últimos anos, sua produtividade supera os 41
milhões de toneladas, classificando o país entre os quatro maiores produtores mundiais
juntamente com China, Índia e EUA. As frutas mais produzidas e exportadas são basicamente
melão, manga, maça e banana (IBRAF, 2012; FAO, 2012).
Entretanto, aproximadamente 30% do total de frutas frescas produzidas no Brasil
nunca chegam ao consumidor final devido a grande susceptibilidade das mesmas à infecção
fúngica (CHITARRA; CHITARRA, 2005). Sendo que, de modo geral a infecção fúngica
geralmente está correlacionada a fatores ambientais como temperatura e umidade e a danos
mecânicos ocorridos durante colheita, transporte e estocagem (SILVEIRA et al., 2005).
Dentre os deteriorantes mais comumente encontrados em frutas frescas estão os
fungos dos gêneros Aspergillus e Penicillium. As espécies de Penicillium principalmente são
as mais importantes deterioradoras de frutas in natura, além de produção de micotoxinas
(BATISTA; FREITAS, 2000), que são substâncias nocivas à saúde humana e animal. Porém
para a realização do controle destes fungos utilizam-se fungicidas, de modo a aumentar ainda
mais a quantidade de químicos presentes no organismo humano.
Certas espécies de leveduras apresentam habilidade de produção de compostos
antimicrobianos, como por exemplo, a toxina killer, que tem ação sobre outras espécies de
leveduras, fungos filamentosos e bactérias podendo causar a morte dos mesmos (ROSA,
2009). Assim uma alternativa ao tradicional tratamento químico (utilização de fungicidas)
pós-colheita de doenças em frutos, destaca-se o controle biológico com a utilização de
leveduras antagonistas, principalmente as das linhagens killer, devido a sua baixa
possibilidade de resíduos tóxicos e mostrando-se inócua perante processos fermentativos
(COELHO et al., 2011).
Assim de acordo com o pressuposto, este trabalho objetivou avaliar a inibição de
Aspergillus ochraceus e Penicillium expansum por toxina killer produzida pela levedura H.
wingei (AM2-2
), bem como realizar ultrafiltração com o intuito de se purificar parcialmente
13
substâncias killer de amplo espectro de ação para aplicação no controle biológico de pragas e
doenças que diminuem a qualidade de frutas na pós-colheita.
14
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Avaliar a inibição do crescimento dos bolores deteriorantes Aspergillus ochraceus e
Penicillium expansum por frações ultrafiltradas obtidas do cultivo de Hansenula wingei
(AM2-2
).
2.2 Objetivos específicos
- Determinar se há expressão de caráter killer pela levedura Hansenula wingei (AM2-2
).
- Avaliar possível diminuição de produção da toxina killer após realização de tratamento
térmico.
- Avaliar o antagonismo da levedura killer no desenvolvimento dos bolores P. expansum e A.
ochraceus, por meio de análise microscópica, observando-se a atuação sobre o
desenvolvimento de hifas e sobre a porcentagem de germinação de esporos.
- Purificar parcialmente o composto antifúngico com maior potencial antagônico, pela
levedura, por meio de etapas de ultrafiltração.
15
3 REVISÃO DE LITERATURA
3.1 PRODUÇÃO E COMERCIALIZAÇÃO DE FRUTAS FRESCAS
Observando-se as condições climáticas e extensão territorial, grandemente favorável,
o Brasil apresenta condições ótimas de modo a se tornar um dos maiores polos produtivos
para o mercado mundial de frutas, se beneficiando da onda “naturalista” que vem sendo
observada no mundo todo (NACHREINER; SANTOS; BOTEON, 2003).
A exportação brasileira de frutas frescas vem aumentando no decorrer dos últimos
anos, sua produtividade supera os 42,6 milhões de toneladas (2010) em uma área de 2,2
milhões de hectares, classificando o país em 3° lugar na produção mundial, perdendo para 1°
China e 2° Índia e seguido pelos Estados Unidos (BRAZILIAN FRUIT, 2012), como pode-se
observar no Gráfico 1. As frutas mais produzidas e exportadas são basicamente melão,
manga, maça e banana (IBRAF, 2012; FAO, 2012).
Gráfico 1: Produção mundial de frutas no ano de 2010. Fonte: FAO (2012) modificado.
Porém, da produção brasileira de frutas, apenas uma pequena parcela é exportada,
sendo a grande parte ainda destinada ao mercado interno. Estima-se que do total produzido,
16
53% destina-se ao mercado interno in natura, 46% a indústria processadora e apenas uma
pequena parcela é destinada à exportação, menos de 2% do total de frutas frescas produzidas,
mesmo assim, a cadeia produtiva das frutas é considerada um dos setores do agronegócio
nacional com maior potencial (INTEC, 2005; IBGE, 2012). As frutas frescas tiveram aumento
na exportação no decorrer dos anos, porém após um pico de exportação em 2007 com 918 mil
toneladas, observou-se um queda constante chegando em 2010 a 759 mil toneladas
exportadas, diminuição em 3 anos de 17% das exportações (IBRAF, 2012; IBGE, 2012).
A exportação de frutas brasileiras apresenta fatores limitantes de competitividade
relacionados à qualidade, como preços praticados, condições de armazenamento, falta de
organização dos produtores, falta de apoio do governo e alta perecibilidade. Outro fator
determinante é a variação de ano para ano do volume de frutas exportadas, implicando em
baixa confiabilidade na exportação brasileira em relação à regularidade de fornecimento
frente a importadores estrangeiros (LACERDA; LACERDA; ASSIS, 2004) e a ausência de
suprimentos regulares, consistentes e de boa qualidade, o que ainda dificulta o
desenvolvimento a longo prazo da indústria de frutas (INTEC, 2005).
3.2 DETERIORAÇÃO DE FRUTAS
Aproximadamente 30% da produção de frutas nunca chegam ao consumidor final,
devido a perdas no campo e pós-colheita, sendo que para algumas em especial como, por
exemplo, a banana e morango os valores são ainda mais relevantes atingindo 38 e 40%
respectivamente (CHITARRA; CHITARRA, 2005). Frutas são produtos considerados
altamente perecíveis, principalmente pós-colheita onde são susceptíveis a doenças de ordem
microbiológica (CHAN; TIAN, 2005). Estas doenças estão ligadas ao fato de que após a
colheita diferente dos produtos de origem animal, as frutas e hortaliças continuam vivas,
mantendo seus processos biológicos vitais ativos (CASA et al., 2006).
Os países em desenvolvimento são fortemente afetados, com grandes perdas devido a
instalações, armazenamento e transporte inadequados (EL GHAOUTH; WILSON;
WISNIEWSKI, 2004). A deterioração das frutas tem seu início durante a colheita, assim
quanto mais cuidados forem tomados perante os procedimentos, menor será o processo de
deterioração nas etapas seguintes. Devido à composição nutricional das frutas estas são
17
capazes de sustentar o desenvolvimento de bactérias, bolores e leveduras, contudo, o seu pH
desfavorece o crescimento bacteriano, de modo que sua ampla faixa de pH facilita o
crescimento de bolores e leveduras propiciando que estes atuem realizando alterações em
frutas (PARIZ, 2011).
Consideráveis perdas nos cultivos de importância econômica são resultado da
vulnerabilidade das frutas à infecção fúngica geralmente ligada a fatores ambientais como
temperatura e umidade e a danos mecânicos ocorridos durante colheita, transporte e
estocagem (FAZIO, 2009). Os gêneros com espécies produtoras de patulina e ocratoxina A
demonstram certa tendência a preferir substratos constituintes de frutas frescas (MOAKE;
PADILLA-ZAKOUR; WOROBO, 2005), como se observa na tabela 1.
Tabela 1 - Fungos e deterioração em frutas.
Gênero Alterações em frutas
Alternaria spp Putrefação mofosa negra em figo, uva, banana,
maçã e tâmara.
Aspergillus spp Podridão negra em frutas cítricas.
Botrytis spp Putrefação cinzenta em grande parte das frutas.
Colletotrichum spp Putrefação antrocnósica em frutas cítricas, banana
e abacate.
Fusarium spp Podridão marrom em cítricos e abacaxis, além de
alteração peduncular.
Penicillium spp Podridão azul e verde em cítricos, e azul em maçã,
uva, pera e banana. Além de causar podridão
marrom em abacaxi.
Rhyzopus spp Putrefação mole em vários tipos de frutas.
Fonte: Evangelista (2008) modificado.
3.3 PRODUÇÃO DE MICOTOXINAS
As micotoxinas, origem das palavras gregas mikes e toxina que significam
respectivamente fungo e veneno, são compostos produzidos quando a fase de crescimento
atinge a sua fase final e durante a fase estacionária do bolor ( CASTILHO et al., 2007).
Uma grande variedade de fungos produz metabólitos secundários, podendo
apresentar potencial toxigênico (produção de micotoxinas) tendo representatividade na
contaminação de alimentos de consumo humano e animal (CELLI, 2006) como forma direta
ou indireta, através de tecidos de animais, leite e ovos (UEKANE; BANDEIRA; SILVA,
18
2010), vindo a causar desde uma simples náusea, alucinações, dermatites, carcinomas ou até
mesmo a morte (OGA; CAMARGO; BATISTUZZO, 2008). As micotoxinas também podem
causar a neoplasia maligna, por serem elementos carcinogênicos (ASTOVIZA; SUÁREZ,
2005).
A contaminação dos alimentos por micotoxinas resulta, geralmente, da infecção do
alimento por fungos toxigênicos durante fases distintas da produção como o cultivo, colheita,
armazenamento, transporte e processamento desses alimentos (ASAE, 2009) bem como,
sempre que condições básicas favoráveis de umidade, temperatura e pH, estiverem presentes
(NUNES, 2008). Mas, é importante se observar que nem todas as cepas de uma mesma
espécie são toxigênicas, ou seja, a presença de microrganismos patogênicos representa uma
possibilidade de contaminação, não confirmando a presença efetiva de micotoxinas
(DUARTE, 2010). Os gêneros mais importantes de fungos micotoxigênicos são Aspergillus,
Penicillium e Fusarium, com contaminação de alimentos em várias etapas da cadeia alimentar
(BRYDEN, 2007).
Fatores como a umidade, temperatura, co-cultura, disponibilidade de nutrientes e a
atmosfera de crescimento, podem ser considerados como os principais fatores relacionados ao
aparecimento de toxinas fúngicas em alimentos, sendo necessária a adoção de medidas que
zelem pela manutenção desses fatores, impedindo a presença dessas toxinas garantindo um
aproveitamento melhor desses alimentos (BAPTISTA; HORII; BAPTISTA, 2004).
Mais de 300 substâncias já foram identificadas como micotoxinas, seu estudo tem
elevada importância devido à gravidade das doenças causadas, caracterizando-se assim como
um problema de saúde pública (PERREIRA; SANTOS, 2011). Há uma variada gama de
micotoxinas, mas apenas algumas são mais frequentes e de importância à segurança alimentar
como, por exemplo, as aflatoxinas, a ocratoxina A, tricotecenos, patulina, zearalenona e as
fumonisinas (ASAE, 2009).
A gravidade dos efeitos gerados pelas micotoxinas é dependente da sua toxicidade,
grau e tempo de exposição, idade e do estado nutricional do indivíduo, entre outros fatores
(NOGUEIRA; OLIVEIRA, 2006). Devido a grande variedade de fungos no meio ambiente, as
micotoxinas podem ser consideradas como contaminantes inevitáveis de alimentos e rações
assim, portanto, necessitando-se de medidas eficazes no estabelecimento de níveis razoáveis
de ingestão para se garantir a manutenção da saúde pública (XU et al., 2006).
O substrato não é o que determina singularmente o desenvolvimento satisfatório de
um determinado grupo fúngico e consequente produção de micotoxinas, mas também há
19
relação com as características da espécie predominante (COELHO, 2005). Sendo assim,
maior ênfase é dada aos gêneros Aspergillus (Figura 1) e Penicillium (Figura 2) devido a sua
preferência na participação da deterioração e consequente produção de micotoxinas em frutas.
Figura 1 - a) deterioração em uvas por Aspergillus sp.; b) imagem de microscópio óptico de
Aspergillus ochraceus; c) colônia típica de A. ochraceus. Fonte: NIHS (2012).
Figura 2 - a) deterioração em maçã por P. expansum; b) imagem de P. expansum por
microscópio óptico; c) colônia típica de P. expansum. Fonte: AGES (2012).
3.4 CONTROLE DE FUNGOS
Buscando-se a redução das podridões pós-colheita, várias tecnologias têm sido
utilizadas como, por exemplo, “controle químico (inibidores de amadurecimento, fungicidas
sistêmicos e protetores), controle biológico (antagonistas), controle físico (tratamento térmico,
a b c
a b c
20
radiação, atmosfera controlada e modificada) e indução de resistência (elicitores bióticos e
abióticos)” (SILVEIRA et al., 2005). Visando assim um planejamento mais sustentável do
sistema agroindustrial, diminuindo impactos ao meio ambiente.
O uso de fungicidas sintéticos ainda é um dos controladores pós-colheita mais
utilizados em frutas (CASTORIA et al., 2001). Entretanto, o uso indiscriminado dos mesmos
vem acarretando um aumento da resistência microbiana ao tratamento, bem como, riscos a
saúde humana e ecossistema (SUGAR; SPOTTS, 1999; KORSTEN; BEZUIDENHOUT;
KOTZE, 1988). Assim, para a obtenção de um produto com o mínimo possível de
contaminantes, bem como o acúmulo dessas substâncias tóxicas no ambiente (CAMILO et al.,
2000; SILVEIRA et al., 2005), tem-se iniciado a aplicação do controle biológico, com ênfase
em pesquisas relacionadas ao antagonismo de leveduras killer, buscando-se a solução para
este problema sem perdas de qualidade do produto final (JANISIEWICZ; KORSTEN, 2002).
As leveduras (figura 3) são fungos unicelulares não-filamentosos, apresentados
caracteristicamente sob formas esféricas ou ovais, com reprodução assexuada por brotamento
ou fissão e formação de colônias com aspectos pastosos ou cremosos (ICB/UFMG, 2012).
Elas preferem para sua sobrevivência substratos açucarados e ricos em água como os frutos,
por exemplo, também em sucos de frutos danificados, podendo também se desenvolver em
condições extremas (BECZE, 1955).
Figura 3 - Exemplos de células leveduras e sua reprodução por brotamento originando novas
células. Fonte: NIHS (2012)
3.4.1 Controle biológico
Atualmente, produtores e pesquisadores se deparam com o desafio da substituição do
uso de produtos químicos por produtos alternativos de controle, substâncias estas livres de
21
resíduos tóxicos ou através da tecnologia do biocontrole (ROSA, 2009), ou seja, utilização de
agentes naturais para controlar pragas ou patologias de plantas (BLEVE et al., 2006). O
controle biológico tem elevada importância devido ao seu significativo potencial, tanto em
termos de questões ambientais e econômicas, quanto para incorporação de sistemas de
produção orgânicos e convencionais de frutas (BHARAT, 2011).
Segundo Cook e Baker (1983) controle biológico é definido como “a redução da
soma de inóculo ou atividades determinantes da doença provocada por um patógeno, realizada
por um ou mais organismos que não o homem”. Em geral, o controle biológico mostra-se
como uma forma de combate as doenças, tanto no campo como também na pós-colheita,
substituindo ou com ação conjunta aos agroquímicos, tornando a produção de alimentos mais
sustentável e ecológica (ROSA, 2009).
A utilização de organismos no controle de outros que estejam causando danos a
culturas diferenciadas, seja por antibiose, predação, indução a resistência, competição por
nutrientes, é denominado controle biológico (JANISIEWICZ; KORSTEN, 2002; ARAÚJO,
2007). Métodos de controle biológico constituem, quando comparados aos químicos
tradicionais, alternativas viáveis de aplicação pós-colheita principalmente por não deixarem
resíduos tóxicos no alimento (WILSON; WISNIEWSKI, 1994). De acordo com Wilson e
Wisniewski (1994), o método de utilização pós-colheita de leveduras antagonistas é o melhor
e mais prático no controle biológico em frutas e vegetais. Para Janisiewicz e Korsten (2002),
as condições de meio que favorecem tanto o agente patogênico, quanto o agente com
potencial antagonista, devem ser as mesmas ou muito semelhantes para a obtenção de um
controle eficaz.
A utilização de leveduras antagonistas tem sido muito estudada para aplicação no
controle biológico em frutos, devido às características adequadas das mesmas para este papel
(JANISIEWICZ; KORSTEN, 2002), já que em sua maioria apresentam requisitos nutricionais
simples, podendo colonizar superfícies secas por períodos elevados de tempo, sendo
relevantes na seleção de novos controladores (CHANCHAICHAOVIVAT et al., 2007; EL-
TARABILY; SIVASITHAMPARAM, 2006).
Já é possível encontrar no mercado a presença de biopesticidas, composto por
microrganismos antagonistas ativos, mesmo que o maior uso desta tecnologia ainda se
concentre em laboratórios de pesquisas (ROSA, 2009). Um destes mecanismos de controle
biológico é o BIOSAVE
(Ecoscience, Worcester, MA), à base de estirpes de Pseudomonas
syringae, (JANISIEWICZ; KORSTEN, 2002; CONWAY et al., 2004), utilizado no controle
22
de P. expansum e Botrytis cinerea com aplicação em maçãs e peras armazenadas (SUGAR;
SPOTTS, 1999; KINAY; YILDIZ, 2008). Há também um fungicida israelense, o ASPIRE
(Ecogen, Langhorne, PA), com base na estirpe I-182 de Candida oleophila, registrado no
controle pós-colheita de P. expansum em peras e maçãs (SUGAR; SPOTTS, 1999;
BENBOW; SUGAR, 1999; KINAY; YILDIZ, 2008).
Há alguns anos houve o desenvolvimento de um novo produto, o YIELD PLUS
(Ancor Yest, Cape Town, Solth Africa) constituído de Cryptococcus albidus e com utilização
no controle pós-colheita de maçãs (SUGAR; SPOTTS, 1999; KINAY; YILDIZ, 2008).
Resultados como os citados, vêm reforçando o biocontrole como método alternativo ao
tradicional tratamento químico, necessitando-se apenas melhoria e redução de custos para
melhor viabilidade (TAVARES, 1996).
Chanchaichaovivat e Ruenwongs (2008) na utilização de 4 leveduras antagonistas
isoladas de frutas e verduras tailandesas obtiveram inibição do crescimento de Colletotrichum
capsici de 66 a 93%. Scherm et al. (2003) em trabalho visando a inibição de P. expansum em
maçãs por cepas da levedura Candida guillermondii obteve 100% de eficácia, na aplicação da
levedura sozinha ou mesmo na presença de aditivos.
Santos, Sanchez e Marquina (2004) relataram a inibição de Botrytis cinerea por
Pichia membranifaciens utilizando-se tanto células íntegras (diâmetro de inibição de 32 mm),
com a toxina killer pura. Entretanto, Zhang et al. (2005) não obtiveram resultados satisfatórios
quando da utilização do sobrenadante cultivo de Cryptococcus laurenti, no controle de B.
cinerea, embora obtivesse o controle total ao utilizar suspensão de células íntegras,
constatando-se ação por competição de nutrientes.
Na Argentina Robiglio et al. (2011) em estudo buscando a redução pós-colheita de P.
expansum e Botrytis cinerea em pêras armazenadas à frio, apresentaram maior eficácia no
controle biológico utilizando as leveduras Aureobasidium pullulans e Rhodotorula
mucilaginosa do que uma levedura comercial. Vários mecanismos têm sido relatados como
operadores do biocontrole, incluindo antibiose (JANISIEWICZ; ROITMAN, 1988),
resistência induzida (EL-GHAOUTH; WILSON; WISNIEWSKI, 1998), parasitismo
(WINIEWSKI et al., 1991), bem como competição por espaço e nutrientes (WILSON;
WISNIEWSKI, 1989).
O modo de ação de influência que microrganismos antagonistas exercem na presença
de patógenos ainda não está bem esclarecido (SHARMA; SINGH; SINGH, 2009), isto
23
decorre, devido às poucas tentativas de trabalhos que tentem explicar estes mecanismos para
melhorar o controle na pós-colheita (JANISIEWICZ; KORSTEN, 2002).
Um método alternativo para redução da quantidade de inoculo utilizado para o
controle de fungos deteriorantes é a integração da atividade antimicrobiana de antagonistas
com cálcio, análogos de açúcar e compostos nitrogenados, desenvolvendo-se assim novos
produtos para a proteção de frutos (EL GHAOUTH et al., 2001). Zhang et al. (2005) após
estudo relataram que obtiveram maior eficiência com aplicação de Cryptococcus laurentii
contra fungo deteriorante de peras, B. cinerea quando em associação com 2% de CaCl2, após
7 dias de incubação a 25ºC.
Em testes realizados por Droby et al. (1997) observou-se a inibição significativa de
Penicillium digitatum em uvas quando da aplicação da interação de Pichia guilliermondii e
cloreto de cálcio. Wan e Tian (2005) mostraram efetividade na redução de P. expansum e
Alternária alternata no controle pós-colheita de peras, com a utilização do aditivo molibdato
de amônio (NH4Mo) juntamente com a levedura antagonista Rhodotorula glutinis. Na
utilização do biocontrolador, Candida sp em suspensão com sorbato de potássio, Karabulut,
Lurie e Droby (2001), obtiveram considerável controle do decaimento de qualidade de doces
de cerejas.
Controle efetivo também foi obtido por Janisiewicz et al. (2003), quando da
combinação de M. pulcherrima T5-A2 com aquecimento dos frutos (38ºC por 4 dias) contra
Colletotrichum acutatum e P. expansum em maçãs. Em estudo realizado por Calegari, et al
(2012) com a utilização das leveduras H. wingei e S. cerevisiae PF23 aplicadas em sinergismo
com o fungicida Tecto® em baixa dosagem em maçãs, foram eficientes no controle in vivo
de P. expansum, indicando a possibilidade de aplicação no controle pós-colheita. Oliveira et
al. (2011) obteve 100% de positividade para o fator killer quando do isolamento de 24
leveduras a partir de morango tradicional e orgânico contra ao menos uma das leveduras
sensíveis padrão utilizadas.
Estudos realizados por Coelho (2005) e Coelho et al. (2011) mostraram a inibição de
58,15% da germinação de esporos de Penicillium expansum com sobrenadante do cultivo de
Candida guilliermondii obtido após 72 horas a 25oC, enquanto que Pichia ohmeri (25
oC/48
horas) inibiu o desenvolvimento de hifas do mesmo fungo em 64,37%, ambos associados ao
fator killer. Walker et al. (1995) observaram que leveduras killer mostraram grande potencial
de inibição do crescimento micelial de Heterobasidion annosum, Rhizoctonia solani,
Fusarium equiseti, entre outros fungos filamentosos patogênicos.
24
Em trabalho realizado por Portes (2011) de 41 leveduras isoladas, 24 (58,5%)
apresentaram inibição contra P. expansum, 25 (61,0%) contra A. ochraceus A152 e 25
(61,0%) contra F. verticillióides 103F em antifungigrama em meio sólido. Sendo que no
antifungigrama em meio líquido, a cepa PF413, identificada como Kluyveromyces sp.,
controlou significativamente tanto a germinação de esporos como o desenvolvimento de hifas
de P. expansum e A. ochraceus, quando comparado ao controle, com inibição da germinação
dos esporos de P. expansum e A. ochraceus de 93,33 e 86,44% respectivamente
(96horas/25°C).
A constatação da letalidade do fator killer por certas leveduras contra fungos
filamentosos tem ampliado ainda mais, no biocontrole de bolores deteriorantes em alimentos e
fitopatógenos, as perspectivas de aplicação (JACOBS; VAN VUOREN, 1991). Em suma, o
emprego de procedimentos, para uma prevenção precoce da proliferação/invasão de agentes
deteriorantes/micotoxigênicos, na superfície das frutas não afetando assim suas características
internas bem como sua qualidade nutricional, seria de grande valia para a saúde humana
(COELHO; HOFFMANN; HIROOKA, 2003).
Antagonistas, sejam integrados através de misturas de leveduras, integração do
controle químico/biológico ou integração do controle físico/biológico podem melhorar a
eficácia do controle (ARAÙJO, 2007), de modo a tornar ainda mais promissora a utilização
dos mesmos.
3.5 ATIVIDADE KILLER
Alguns microrganismos antagonistas podem produzir substâncias com capacidade de
inibição do crescimento e multiplicação de outros microrganismos denominando-se assim um
mecanismo de antagonismo (ROMEIRO, 2007), como por exemplo, a toxina killer que tem
ação sobre outras espécies de leveduras, bolores e bactérias podendo levar as outras a morte
(ROSA, 2009). Estas substâncias, denominadas metabólitos secundários, são produzidas pelos
fungos durante o abrandamento de seu crescimento (MAIN, 2000), ou fase estacionária de
crescimento.
Segundo Sallen et al. (2010) mais de 300 metabólitos antimicrobianos naturais tem
sido relatados, sendo que dentre eles estão os carotenoides e polipeptídeos, geralmente
isolados de plantas e microrganismos, os quais apresentam ampla atividade antimicrobiana
25
(SENTER, 2010). O uso destas substâncias antimicrobianas, isoladas de alguns
microrganismos, se aplica não somente no tratamento humano (penicilina entre outros), mas
também podem ser empregadas no combate de algumas pragas, que causam milhões em
danos na agricultura, consumindo parte considerável do total produzido no mundo todo
(OLIVEIRA, 2009).
A capacidade de produção de toxina killer foi descrita pela primeira vez em
linhagens de Saccharomyces cerevisiae, em que cepas de S. cerevisiae foram classificadas em
três fenótipos: killer, sensível e neutra. Quando as células killer e sensíveis cresciam em um
mesmo meio de cultura, certa quantidade das células de leveduras sensíveis era destruída,
sendo que as células neutras não matavam células sensíveis e não eram mortas por células
killers (BRITES, 2003). Observou-se então que o efeito “killer” era causado por uma proteína
extracelular que se apresentava sensível ao calor e ação de proteases, além de depender de
condições de pH e oxigênio (WOODS; BEVAN, 1968; VAZ et al., 2002).
O fenômeno killer é amplamente difundido entre muitos gêneros de leveduras, como
Sacchamomyces, Candida, Cryptococcus, Debaryomyces, Hanseniaspora, Kluyveromyces,
Pichia, Williopsis, Zygosacchoromyces, Hansenula, Kloeckera, Metschnikowia,
Rhodothorula, Schwanniomyces, Torulopsis, Trichosporon, Ustilago e Zigowillopsis
(MORACE et al., 1984; CHEN et al., 2000; FAZIO, 2009).
Muitas toxinas produzidas por leveduras são glicoproteínas formadoras de prótons
capazes de originar canais iônicos, causando desestabilização do potencial eletroquímico da
membrana podendo causar morte celular (MARTINAC et al., 1990, GOLUBEV, 1998).
As toxinas killer são compostas de um peptídeo tóxico, produzido em nível
extracelular, com capacidade de inibição de crescimento outros microrganismos (COELHO et
al., 2009; SENTER, 2010). Algumas linhagens de leveduras killer matam outras leveduras
sensíveis a ela, através da secreção de uma toxina de caráter protéico (ROSA, 2009). As
toxinas killer em sua maioria possuem massa molar que varia de 18 a 300 kDa, dependendo
da espécie de levedura correspondente (SOARES e SATO, 2000).
Mesmo com a investigação extensiva da atividade killer em leveduras desde 1963,
quando foi descoberta por Bevan e Makower (BEVAN; MAKOWER, 1963), pouco se sabe
ainda sobre seu mecanismo de ação (RADLER et al., 1993). Evidências indicam que há uma
atuação na membrana de células sensíveis, diminuindo o pH intracelular com consequente
extravasamento de íons potássio e ATP (MARTINAC et al., 1990). Sua ação também pode
estar baseada em diferentes modos como hidrólise, inibição de síntese da β1-3 glucana,
26
principal componente da parede celular, ou até mesmo causando a saída de íons pelo
rompimento da membrana plasmática (KAGAN, 1983).
A inibição da síntese da β1-3 glucana foi descrita por Rosa (2009), em que na
composição da parede celular, de 80 a 90% são carboidratos, estando entre eles a quitina e a
β-1,3-glucana bem como algumas proteínas e lipídios, possibilitando assim que o organismo
antagonista, produtor de enzimas como quitinase e β-1,3-glucanase, torne-se capaz de atuar
inibindo e controlando o desenvolvimento fúngico. Masih e Paul (2002) observaram a
produção da enzima β-1,3-glucanase pela levedura Pichia membranifaciens, com ação sobre o
fungo B. cinerea, e notaram que a enzima causou coagulação e rompimento citoplasmático
das hifas fúngicas.
27
4 MATERIAL E MÉTODOS
A levedura H. wingei (AM2-2
), previamente isolada de 15 amostras de milho em
trabalho realizado por Gasperini (2011) a partir de uma cooperativa do município de
Francisco Beltrão – PR foi analisada em relação à presença de fator killer, resistência do fator
ao tratamento térmico e inibição por produção de compostos extracelulares bioativos em
relação a P. expansum e A. ochraceus.
O antifungigrama em meio líquido foi realizado por se tratar de um teste sensível,
tornando possível uma quantificação na germinação de esporos e no desenvolvimento das
hifas fúngicas (JANISIEWICZ; TWORKOSKI; SHARER, 2000).
4.1 Fungo teste
Os micélios fúngicos de Penicillium expansum n. 2 e Aspergillus ochraceus,
foram isolados a partir de maçã e frutos de café respectivamente no laboratório de
Microbiologia do Departamento de Tecnologia de Alimentos da UEL (Universidade Estadual
de Londrina), sendo provenientes de cultura monospórica (NELSON; TOUSSON;
MARASAS, 1983), consistiram de cepas básicas utilizadas frente ao efeito de antagonistas,
quanto a inibição de crescimento.
Os fungos foram mantidos em Ágar Batata Dextrose - BDA inclinado a 4oC na
ausência de luz, e o inoculo padronizado com auxílio de câmara de Newbauer (105
esporos/mL) para os testes subsequentes.
4.2 Análise do Potencial Killer
A levedura promissora no controle biológico de Penicillium expansum e Aspergillus
ochraceus foi caraterizada quanto ao fator killer. A levedura sensível, foi previamente
suspensa em 3 mL de solução salina a 0,85% e padronizada na Escala n.o 1 de McFarland (3,0
28
x 106 células), e então plaqueada por profundidade em placas de Petri contendo 20 mL de ágar
Sabouraud adicionado de 0,003% de azul de metileno (POLONELLI et al., 1983).
Após a solidificação do ágar, foi inoculada uma alçada de leveduras teste,
previamente cultivadas em tubos de Ensaio com ágar Sabouraud glicose, formando pequenos
pontos (2,0 mm de diâmetro) na superfície do meio. A leitura foi realizada após incubação a
20o
C por 72 horas, a presença de fator killer se representou pela formação do halo de inibição
em torno das leveduras teste (WALKER et al., 1995).
O controle positivo utilizado como cultura padrão consistiu de Saccharomyces
cerevisiae NCYC-738 e as padrões sensíveis utilizadas para a caracterização do fator killer
consistiram de Candida glabrata NCYC-366, C. glabrata NCYC-388, Candida albicans-
12A, Pichia kluyveri CAY-15 e Saccharomyces cerevisiae NCYC-1006.
4.3 Cura da levedura Killer
A cura da levedura foi realizada com o intuito de associar o caráter killer quanto a
possibilidade da perda de atividade antagônica, ou seja, indicando se a toxina killer é
codificada por genes plasmidiais ou cromossomais, conforme descrito por Petering et al.
(1991).
O processo de cura consistiu no pré-cultivo da levedura a 25oC overnight em meio
YPD “Yeast Peptone Dextrose” (extrato de levedura 1,0%, peptona bacteriológica 2,0%,
glicose 2,0%, ágar 2,0%) com posterior padronização na escala n.o 1 de McFarland,
procedendo-se diluições decimais seriadas de 10-1
até 10-4
. Então uma alíquota de 0,1 mL
(aproximadamente 3,0 x 102 células) foi semeada na superfície de placas contendo meio YPD,
seguido de incubação sob tratamento térmico de 37 e 40oC por 48 horas.
Após a realização da cura as cepas termorresistentes foram novamente submetidas ao
teste killer e ao antifungigrama em meio líquido, para observar se a levedura manteve suas
propriedades inibitórias.
29
4.4 Obtenção do extrato bruto
Para o pré-inóculo, uma alçada de levedura foi transferida para Erlenmeyer com 25
mL de Caldo Meio Para Levedura (Caldo MPL - glicose 2%, extrato de levedura 0,5%,
cloreto de sódio 1%, sulfato de amônio 0,5% e fosfato de sódio monobásico 0,23%) e
incubado a 25ºC por 24 horas. O inóculo foi preparado baseando-se na escala de McFarland
para bactérias (INSTITUTO DE TECNOLOGIA DE ALIMENTOS-ITAL, 1995) adaptada
para leveduras, recalculando-se para obter os valores de 3 x 107 (escala nº 1) a 3 x 10
8
leveduras/mL (escala nº 10), considerando que o tamanho de uma levedura equivale a 10
vezes ao bacteriano (LEVY, 2003). A seguir 3,0 x 106 células de leveduras (100 L) foram
inoculadas em 5 Erlenmeyers contendo 50 mL de Caldo MPL e em 5 Erlenmeyers contendo
50 mL do mesmo caldo com 105 esporos de P. expansum e em 5 Erlenmeyers contendo 50
mL do mesmo caldo com 105 esporos de A. ochraceus. Após 24, 48, 72, 96 e 120 horas a
25ºC, os cultivos foram centrifugados (6.500 x g/15 min., 10ºC) e o extrato bruto obtido.
4.5 Antifungigrama em Meio Líquido
O antifungigrama em meio líquido foi baseado essencialmente nas metodologias
descritas por Janisiewicz, Tworkoski e Sharer (2000) e Chen et al. (1999), seguido de análise
microscópica. O extrato bruto filtrado (membrana “Millipore” 0,20 μm) foi inoculado em
volume igual (1,0 mL) de Caldo MPL previamente inoculado com 105 esporos de fungo teste.
Os tubos de Ensaio foram incubados a 25oC e analisados em microscópio após 12 horas,
determinando-se a germinação dos esporos e tamanho das hifas. Paralelamente preparou-se o
controle (branco), inoculando-se 105 esporos de fungo em tubos de ensaio contendo 1,0 mL
de Caldo MPL e 1,0 mL de água destilada estéril.
30
Fluxograma 1 - Quantificação de atividade fúngica por meio da porcentagem de germinação de
esporos e comprimento de hifas de A. ochraceus e P. expansum em relação ao
sobrenadante de levedura. Fonte: Coelho modificado (2005).
Ativação
Caldo MPL/25°C/24 h.
Escala McFarland nº 1
100 L (3,0 x 106 células)
25°C
24, 48, 72, 96, 120 horas
50 mL
Caldo MPL
(Controle)
50 mL Caldo MPL
+ A. ochraceus
(105 esporos)
6500 x g/15 min., 10°C
Filtração (Micropore 0,22 m)
1,0 mL sobrenadante
+ 1,0 mL MPL
+ 105 esporos P. expansum
25°C/12 horas
MICROSCOPIA
Germinação esporos (%)
100 células
Hansenula wingei (AM2-2
)
50 mL Caldo MPL
+ P. expansum
(105 esporos)
1,0 mL sobrenadante
+ 1,0 mL MPL
+ 105 esporos P. expansum
25°C/12 horas
Comprimento de Hifas
(m) 40 células
31
Os resultados foram obtidos perfazendo-se três repetições cada, constituída de quatro
dados para a porcentagem de esporos germinados e 40 para a determinação do tamanho de
hifas. A determinação do comprimento das hifas foi realizada por meio da medida de 40 hifas
selecionadas ao acaso, e a média aritmética utilizada para a comparação. A porcentagem de
germinação dos esporos foi baseada na contagem de 100 células, incluindo-se os esporos
germinados e os não germinados.
Os dados da atividade antifúngica exercida pelas leveduras antagonistas sobre a
germinação de esporos e o desenvolvimento de hifas de P. expansum e A. ochraceus foram
analisados pelo programa ANOVA/MANOVA (STATISTICA 5.0, 1995) mediante teste de
Tukey (P < 0,05).
4.6 Purificação parcial de composto antifúngico
A substância inibitória, produzida pela levedura potencialmente antagônica, foi
extraída a partir do sobrenadante dos cultivos da levedura. Para tanto o mesmo foi submetido
a etapas de ultrafiltração como descrito por Coelho (2005) utilizando-se membranas de
exclusão molecular de 30, 10, 5 e 3 kDa (celulose, “Millipore”) e as frações ultrafiltradas
submetidas ao ensaio antifúngico em meio líquido conforme item 4.5, sendo que as mesmas
foram codificadas conforme Fluxograma 2.
Os dados da atividade antifúngica das frações ultrafiltradas sobre a germinação de
esporos e o desenvolvimento de hifas de P. expansum e A. ochraceus foram analisados pelo
programa ANOVA/MANOVA (STATISTICA 5.0, 1995) mediante teste de Tukey (P < 0,05).
32
Fluxograma 2 – Purificação parcial do composto antifúngico da levedura para posteriores
análises.
Ativação
Caldo MPL/25°C/24 h.
Escala McFarland nº 1
100 L (3,0 x 106 células)
Incubação
25°C/96horas
10 Erlenmeyer com
50 mL de Caldo MPL
Total de 1000mL de cultivo
6500 x g/15 min., 10°C
Filtração (Micropore 0,22 m)
Hansenula wingei (AM2-2
)
Ultrafiltração 10°C
Membrana de 30kDa
FRAÇÃO I congelamento e
acondicionamento ≥ 30 mL
Ultrafiltração 10°C
Membrana de 10kDa
Ultrafiltração 10°C
Membrana de 5kDa
Ultrafiltração 10°C
Membrana de 3kDa
FRAÇÃO II congelamento e
acondicionamento ≥ 30 mL
FRAÇÃO III congelamento
e acondicionamento ≥ 30 mL
FRAÇÃO IV congelamento
e acondicionamento ≥ 30 mL
33
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A obtenção da levedura H. wingei (AM2-2
) deu-se através de trabalhos previamente
desenvolvidos no grupo de pesquisa, sendo que a mesma foi isolada, a partir de amostras de
milho adquiridas no município de Francisco Beltrão – PR, por Gasperini (2011).
Cepas de leveduras são classificadas como killer, quando o inóculo é cercado por
uma zona clara, na qual não se observa crescimento das cepas sensíveis, delimitado por uma
zona de células mortas que pode ser percebido quando na presença de azul de metileno.
Quando submetida à análise de potencial killer a levedura H. wingei (AM2-2
)
mostrou-se positiva perante as leveduras sensíveis Candida glabrata NCYC 366 (K3), C.
albicans 12A (K8) e Pichia kluyveri (CAY-15), com formação de zona mais clara somente
após 120 horas. Quando leveduras atuam contra mais de uma levedura sensível, sugere-se
produção de toxina killer com amplo espectro de ação, ou então produção de mais de uma
toxina killer, a exemplo de toxinas K1, K2 e K28 produzidas por Saccharomyces cerevisiae
(SCHMITT, BREINING, 2002).
O fator killer é um elemento geralmente pertencente à categoria de substâncias
oriundas de expressão com característica plasmidial, assim podendo ser susceptível a perda de
atividade produtora, pela ação do calor, ou mudança das propriedades do meio (GASPERINI,
2011). Após aumento de temperatura de incubação (25°C para 40°C) a levedura H. wingei
(AM2-2
) continuou produzindo zona mais clara contra as sensíveis Candida glabrata NCYC
366 (K3), C. albicans 12A (K8) e Pichia kluyveri (CAY-15) demonstrando que a mesma não
perdeu sua capacidade de produzir substâncias killer mesmo após a realização do tratamento
térmico.
As tabelas 2 e 3 apresentam as médias gerais dos resultados de três repetições, do
antifungigrama em meio líquido com sobrenadante do cultivo de H. wingei (AM2-2
) contra a
germinação de esporos e desenvolvimento de hifas dos fungos teste A. ochraceus e P.
expansum. Em adição, cultivou-se H. wingei (AM2-2
) com interação com P. expansum e A.
ochraceus, e os sobrenadantes obtidos foram inoculados novamente com o fungo, visando
estimular uma maior produção de substância antagônica, associada a um processo induzido.
34
Tabela 2 - Antifungigrama em meio líquido com sobrenadante do cultivo obtido da levedura H.
wingei (AM2-2
) e da interação levedura/P. expansum. Hansenula wingei (AM2
-2) X P. expansum
Incubação Comprimento de hifas (m) Germinação de esporos (%)
(horas) Controle Sobrenadante
levedura
Sobrenadante
Levedura/P.
expansum
Controle Sobrenadante
levedura
Sobrenadante
Levedura/P.
expansum
24 92,5425,71 aC* 54,6124,94 dA 63,6423,90 bB 46,679,35 aA 38,0014,64 bA 41,1711,89 dA
48 93,2331,22 aB 48,2119,87 cA 48,7921,90 aA 49,336,62 aC 6,332,34 aA 25,502,43 bcB
72 109,1144,02 bC 37,8213,70 bA 51,4117,43 aB 45,5013,11 aC 1,501,22 aA 26,334,93 cB
96 92,2026,42 aC 0,000,00 aA 47,4115,91 aB 52,177,19 aC 0,000,00 aA 14,676,74 abB
120 100,8828,76 abC 41,9316,32 bA 48,9017,57 aB 47,339,44 aB 2,331,36 aA 6,831,47 aA
Ensaio realizado em caldo MPL incubado a 25ºC/12 horas; cada valor corresponde à média dos valores de 120 dados para
crescimento de hifas (triplicata, 40 dados por repetição) e 6 dados para germinação de esporos (triplicata, 2 dados por
repetição). *Letras minúsculas iguais na mesma coluna e letras maiúsculas iguais na mesma linha não diferem
significativamente pelo teste de Tukey (P > 0,05).
Tabela 3 - Antifungigrama em meio líquido com sobrenadante do cultivo obtido da levedura H.
wingei (AM2-2
) e da interação levedura/A. ochraceus. Hansenula wingei (AM2
-2) X A. ochraceus
Incubação Comprimento de hifas (m) Germinação de esporos (%)
(horas) Controle Sobrenadante
levedura
Sobrenadante
Levedura/A.
ochraceus
Controle Sobrenadante
levedura
Sobrenadante
Levedura/A.
ochraceus
24 85,5625,30 aB* 71,6426,75 cA 80,54 27,16 cB 48,1711,42 aA 43,3316,03 bA 41,5 18,55 bcA
48 95,2923,09 bC 58,7321,27 bA 70,49 27,44 bB 51,675,43 aB 37,505,79 bA 39,17 8,13 bcA
72 105,8026,61 cC 67,2922,34 cA 75,06 25,38 bcB 57,009,36 aB 5,173,25 aA 50,83 1,94 cB
96 96,6625,44 bC 43,9915,38 aA 73,46 17,75 bcB 48,333,78 aC 16,503,15 aA 29,67 5,05 bB
120 98,1524,95 bcB 39,9912,76 aA 40,33 13,45 aA 50,502,74 aB 14,002,00 aA 12,00 5,73 aA
Ensaio realizado em caldo MPL incubado a 25ºC/12 horas; cada valor corresponde à média dos valores de 120 dados para
crescimento de hifas (triplicata, 40 dados por repetição) e 6 dados para germinação de esporos (triplicata, 4 dados por
repetição). *Letras minúsculas iguais na mesma coluna e letras maiúsculas iguais na mesma linha não diferem
significativamente pelo teste de Tukey (P > 0,05).
No ensaio realizado contra P. expansum em relação à inibição do desenvolvimento
de hifas, houve uma diferença significativa (P < 0,05) entre o tratamento com sobrenadante da
levedura e controle em todos os tempos (24-120h) de incubação, apresentando inicialmente
(24h) 40,98% de inibição do desenvolvimento de hifas em relação ao controle, com aumento
considerável ao longo dos tempos chegando a inibição máxima de incubação em 96h (inibição
de 100% do desenvolvimento de hifas), sendo que em 120h houve uma expressiva queda para
o nível de 58,53% (Figura 4).
35
Figura 4 - Efeito inibitório do cultivo de H. wingei (L + P) e da interação H. wingei
(AM2-2
)/P. expansum (LP + P) no desenvolvimento de hifas e germinação de esporos de
P. expansum (105
esporos), após 12 horas/25°C.
A utilização do cultivo da levedura na interação com os fungos visando indução a um
estímulo adicional à antibiose se mostrou ineficaz, de modo que ambos os sobrenadantes
apresentaram atividades similares ou mesmo inferiores, confirmando que a produção de
substâncias antagônicas não é estimulada pela presença do fungo teste, conforme relatado por
Coelho et al. (2009).
A inibição da germinação de esporos e a inibição do desenvolvimento de hifas, na
maioria dos tempos de cultivo, se mostraram significativamente maior quando da utilização
do sobrenadante obtido exclusivamente do cultivo de H. wingei (AM2-2
) (P < 0,05, tabela 2),
sugerindo que a presença do fungo teste e produção de metabólitos do mesmo, interferiram
sobre a ação desempenhada pela substância antagônica produzida pela levedura (MADIGAN;
MARTINKO; PARKER, 2003).
O cultivo da interação levedura/P. expansum, diferiu significativamente (P < 0,05)
do cultivo de sobrenadante de levedura na maioria dos tempos (24, 72, 96 e 120h); por outro
lado, não houve diferença significativa entre os dois tratamentos no cultivo de 48h (P > 0,05)
(tabela 2). O ensaio do sobrenadante de levedura/P. expansum também diferiu
significativamente do controle em relação ao desenvolvimento de hifas em todos os tempos
(24-120h), porém apresentando inibição inferior em todos os tempos levando-se em conta o
sobrenadante de levedura. O melhor tempo de inibição da interação levedura/P. expansum
apresentou-se em 72h (52,88%) para o desenvolvimento de hifas.
Em relação à germinação de esporos de P. expansum em relação ao sobrenadante da
levedura, observou-se que inicialmente (24h - 17,87% de inibição da geminação) a inibição
foi menos eficaz não apresentando diferença significativa em relação ao controle. Porém, a
36
partir do cultivo de 48h houve diferença significativa, apresentando aumento considerável da
inibição (87,17%), chegando às 96h com 100% de inibição da germinação de esporos,
mostrando total eficácia, com uma pequena queda posterior em 120h chegando a 95,08% de
inibição da germinação de esporos. Testes de antifungigrama em meio líquido realizados por
Janisiewicz, Tworkoski e Sharer (2000) com leveduras do gênero Aureobasidium spp.
incubados a 25ºC/24 horas, inibiram a germinação dos esporos de P. expansum em 98%.
O cultivo da interação levedura/P. expansum em relação ao cultivo do sobrenadante
da levedura apresentou valores inferiores de inibição da germinação de esporos. No entanto
obteve-se diferença significativa (P < 0,05) apenas nos tempos de 48, 72 e 96h, com maior
porcentagem de inibição em 120h (84,85%) (figura 4).
Já no ensaio realizado contra A. ochraceus os resultados apresentaram-se um pouco
inferiores, tanto em relação à germinação de esporos quanto, em relação à inibição do
desenvolvimento de hifas, comparando-se com os resultados obtidos contra P. expansum. O
sobrenadante de levedura obtido contra A. ochraceus apresentou diferença significativa (P <
0,05) em relação ao controle em todos os tempos (24-120h) (figura 5), apresentando-se
inibição inicial (24h) de 16,26%, com breve aumento em 48h (38,36%) vindo a culminar em
um pico de 59,26% (120h). Os tempos de 96 e 120h não apresentaram diferença significativa,
com 54,49 e 59,26% de inibição do desenvolvimento de hifas de A. ochraceus.
Figura 5. Efeito inibitório do cultivo de H. wingei (AM2-2
) (L + A) e da interação
H.wingei (AM2-2
)/A. ochraceus (LA + A) no desenvolvimento de hifas e germinação de
esporos de A. ochraceus (105
esporos), após 12 horas/25°C.
Quando se observou a interação levedura/A. ochraceus presenciou-se diferença
significativa entre os tratamentos (cultivo da levedura e interação levedura/bolor) nos tempos
de 24-96h, não observando-se diferença apenas em 120h (figura 5). Tal fato evidenciou, de
37
modo geral que a interação levedura/fungo teve ação inferior ao tratamento com o extrato
bruto obtido do cultivo da levedura isoladamente, tanto o desenvolvimento de hifas, quanto a
germinação de esporos.
Observando-se a inibição da germinação de esporos de A. ochraceus com a utilização
do cultivo do sobrenadante de levedura, não se observou diferença significativa apenas no
cultivo de 24h. Houve um aumento da inibição culminado em 72h, um pico de 90,92% da
germinação de esporos, com uma posterior pequena queda (96h-65,86%; 120h-72,27%)
(figura 5), sendo que a mesma não foi significativa em teste Tukey (P > 0,05).
O cultivo da interação levedura/A. ochraceus diferiu significativamente do
tratamento do cultivo da levedura isoladamente apenas nos períodos de 72 e 96h,
apresentando valores inferiores de inibição da germinação de esporos. Tendo-se assim o pico
de inibição em 120h com 58,91% de inibição da germinação com a utilização da interação
levedura/bolor (figura 5).
De acordo com os resultados obtidos, selecionou-se o cultivo isolado de H. wingei
(AM2-2
) (25°C/96 horas) para a etapa de ultrafiltração, com vistas da utilização das frações
parcialmente purificadas no controle de A. ochraceus e P. expansum, que além de inibir a
germinação dos esporos e retardar o crescimento de hifas de P. expansum e A. ochraceus, não
conteriam metabólitos dos fungos testes, como a patulina e a ocratoxina, micotoxinas
geralmente encontradas em frutas, e estudadas por diversos autores devido aos riscos à saúde
causados pelas mesmas a humanos e animais (MOAKE, PADILLA-ZAKOUR, WOROBO,
2005).
As tabelas 4 e 5 apresentam as médias gerais dos resultados de três repetições, do
antifungigrama em meio líquido com as frações ultrafiltradas do sobrenadante do cultivo de
H. wingei (AM2-2
) contra a germinação de esporos e desenvolvimento de hifas dos fungos
teste A. ochraceus e P. expansum.
A atividade antifúngica com as frações II e III apresentaram maior eficácia para A.
ochraceus no desenvolvimento de hifas e germinação de esporos, com diminuição da
atividade na fração IV (figura 6). Tal fato sugere que os compostos anti-Aspergillus
ochraceus possivelmente apresentem massa molar entre 3 e 10kDa.
38
Tabela 4 - Antifungigrama em meio líquido com sobrenadante do cultivo obtido da levedura H.
wingei (AM2-2
) e filtrados obtidos a partir do extrato bruto, contra A. ochraceus.
DESENVOLVIMENTO DE HIFAS DE A. ochraceus
Tratamentos FRAÇÃO I FRAÇÃO II FRAÇÃO III FRAÇÃO IV
Controle de Aspegillus 112,7619,87 cA*
109,7922,12 cA
112,1918,35 cA
112,5418,21 cA
Sobrenadante + Aspergillus 63,1815,01 bA
59,5219,34 bA
59,0714,95 bA
61,1519,51 bA
Filtrado + Aspergillus 35,3015,73 aB
27,427,19 aA
32,566,20 aB
47,1817,19 aC
GERMINAÇÃO DE ESPOROS DE A. ochraceus
Controle de Aspegillus 77,172,48 cA
75,332,42 cA
75,001,41 cA
75,671,87 cA
Sobrenadante + Aspergillus 46,831,60 bA
48,671,96 bA
47,831,21 bA
48,67 2,04bA
Filtrado + Aspergillus 19,001,41 aC
11,00 2,61aB
7,500,75 aA
28,001,41 aD
* Letras minúsculas iguais na mesma coluna e letras maiúsculas iguais na mesma linha não diferem significativamente pelo
teste de Tukey (P > 0,05).
Tabela 5 - Antifungigrama em meio líquido com sobrenadante do cultivo obtido da levedura H.
wingei (AM2-2
) e filtrados obtidos a partir do extrato bruto, contra P. expansum.
DESENVOLVIMENTO DE HIFAS DE P. expansum
Tratamentos FRAÇÃO I FRAÇÃO II FRAÇÃO III FRAÇÃO IV
Controle de Penicillium 96,3117,83 cA*
98,8315,83 cA
98,6019,26 cA
94,6016,25 cA
Sobrenadante + Penicillium 0,000,00 bA
0,000,00 bA
0,000,00 bA
0,000,00 bA
Filtrado + Penicillium 0,000,00 aA
0,000,00 aA
0,000,00 aA
0,000,00 aA
GERMINAÇÃO DE ESPOROS DE P. expansum
Controle de Penicillium 58,832,87 bA
57,51,17 bA
62,171,47 bA
60,671,41 bA
Sobrenadante + Penicillium 0,000,00 aA
0,000,00 aA
0,000,00 aA
0,000,00 aA
Filtrado + Penicillium 0,000,00 aA
0,000,00 aA
0,000,00 aA
0,000,00 aA
* Letras minúsculas iguais na mesma coluna e letras maiúsculas iguais na mesma linha não diferem significativamente pelo
teste de Tukey (P > 0,05).
Inicialmente (fração I) evidenciou-se que a ação antifúngica sobre o
desenvolvimento de hifas (A. ochraceus) do filtrado em relação ao extrato bruto aumentou de
43,96% para 68,69%, culminando em uma inibição de 75,02% (fração II) e vindo a diminuir
sua ação inibitória com a utilização das frações III e IV. Como se observou, a maior inibição
do desenvolvimento de hifas de A. ochraceus ocorreu quando da utilização da fração II
(75,02%) (figura 6). A fração I poderia ter a presença de substâncias interferentes no meio que
impediram uma boa atuação, sendo parcialmente eliminadas após a passagem pela membrana
de 10 kDa. Tal fato explica a melhor ação desta fração, quando comparada com a anterior.
39
Já na inibição da germinação de esporos observou-se maior inibição com a utilização
da fração III (90%), sugerindo-se assim que possivelmente o composto antifúngico de maior
ação contra A. ochraceus tem massa molar inferior a 10kDa e superior a 3Kda. Porém, como
constata-se que a inibição a partir da fração IV não foi suspensa, sugere-se a presença de
outros compostos antifúngicos com massas molares menores, de maneira que os filtrados da
membrana utilizada posteriormente continuariam inibindo tanto a germinação de esporos,
quanto o desenvolvimento de hifas de A. ochraceus, mesmo que com menos eficácia (Figura
6).
Figura 6 - Efeito inibitório do sobrenadante de H. wingei (AM2-2
) (S + A) e das frações
filtradas (F + A) sobre o desenvolvimento de hifas e germinação de esporos de A.
ochraceus (105
esporos), após 12 horas/25°C.
Observou-se que a inibição, tanto para o desenvolvimento de hifas quanto para a
germinação de esporos de A. ochraceus, pelo sobrenadante da levedura quando da utilização
como controle para a realização do teste com as frações ultrafiltradas, apresentou uma
pequena queda, que poderia ser explicado pelas ações repetidas de congelamento e
descongelamento do extrato bruto durante a realização dos experimentos com as frações
ultrafiltradas.
Quando observa-se o resultados obtidos com o Penicillium, nota-se que mesmo após
a realização das ultrafiltrações o fungo continuou a ser inibido totalmente (100% de inibição),
tanto para a germinação de esporos quanto para o desenvolvimento de hifas, como ocorreu
com o extrato bruto da levedura (25°C/96h). Sugere-se assim que isto pode ter ocorrido
devido a grande sensibilidade do P. expansum o fator killer, bem como devido a possível
presença de um ou mais compostos antifúngicos com massa molar inferior a 3kDa, além do
composto que teve grande ação sobre o A. ochraceus, necessitando-se de estudos posteriores
para uma maior análise.
S + A
S + A
40
Segundo Chen et al. (2000) são conhecidos dez diferentes grupos de toxinas killer,
sendo que a maioria dessas toxinas tem massa molecular situada entre 10 e 20kDa (RADLER
et al., 1993). Santos e Marquina (2004) em estudo sobre a toxina killer produzida pela
levedura Pichia membranifaciens 1106 CYC determinaram que a massa molar da mesma é de
18kDa. Radler et al. (1993) através de purificação da toxina killer secretada pela levedura
Zygosaccharomyces builii evidenciaram a presença de proteína com uma massa molecular de
cerca de 10 kDa.
A produção de um composto antifúngico com massa molar inferior a 3kDa também
foi relatado por Coelho et al. (2009) onde as toxinas killer, produzidas pelas leveduras Pichia
ohmeri 158 e Candida guilliermondii P3, parcialmente purificadas apresentaram peso
molecular inferior a 3kDa. Assim, as toxinas produzidas por estas cepas de leveduras
aparentam ser diferentes às toxinas killer já relatadas na literatura, indicando a descoberta de
toxinas killer de pequena massa molecular.
Deste modo, sugere-se a aplicação da fração III para a inibição da germinação de
esporos e desenvolvimento de hifas de A. ochraceus e P. expansum, já que para P. expansum
a inibição foi total (100%) na utilização de qualquer uma das frações bem como na utilização
do extrato bruto, pois se busca a inibição dos dois fungos simultaneamente. Necessitam-se,
porém de estudos adicionais para que se obtenha a efetiva purificação e concentração de todos
os compostos antifúngicos produzidos pela levedura, bem como um maior conhecimento
sobre a toxigênicidade dos mesmos à saúde humana, para sua posterior aplicação direta em
frutas frescas na pós-colheita.
41
CONCLUSÃO
H. wingei (AM2-2
) mostrou antagonismo potencial contra P. expansum e A.
ochraceus, associando ao fator killer.
Quando da utilização do cultivo da levedura, obteve-se uma maior ação da mesma
sobre os fungos testados, indicado a possível produção de compostos antifúgicos pela mesma.
Os compostos antifúngicos parcialmente purificados por ultrafiltração foram mais
eficientes quando comparados aos resultados encontrados na utilização do extrato bruto
isoladamente.
A utilização de compostos antifúngicos naturais se mostra promissor para aplicação
contra fungos deteriorantes/micotoxigênicos pós-colheita de frutas, necessitando-se a
realização de ensaios in vivo para avaliar a compatibilidade da antagonista com o hospedeiro,
bem como a caracterização estrutural para que se entenda seu modo de ação, toxidade e
mecanismos, já que se busca aplicação direta em alimentos.
42
REFERÊNCIAS
AGES (AUSTRIAN AGENCY FOR HEALTH AND FOOD SAFETY). Disponível em:
http://www.ages.at/ages/en/ages-austrian-agency-for-health-and-food-safety/> Acesso em: 02
Jul. 2012.
ARAÚJO, E. C. D. de. Controle biológico da antracnose no mamão, utilizando-se
leveduras antagonistas ao Colletrotrichum gloeosporioides. Monografia (Especialista em
Microbiologia Ambiental e Indústrial) – Universidade Federal de Minas Gerais, Belo
Horizonte, 2007, 34p.
ASAE (Autoridade de Segurança Alimentar e Econômica). Perfil de risco dos principais
alimentos consumidos em Portugal. Lisboa, Abr. 2009.
ASTOVIZA, M. B.; SUÁREZ, M. M. S.; Micotoxinas y cáncer. Revista Cubana
Investigaciónes Biomedicas. Cuidade de la Habana, v.24, n°1, Jan/Mar. 2005.
BATISTA, L. R.; FREITAS, R. F. de. Avaliação da produção de aflatoxinas por espécies do
fungo Aspergillus associados ao café. Revista Brasileira de Armazenamento, v.18, n.1, p.
44-49, 2000.
BAPTISTA, A. S.; HORII, J.; BAPTISTA, A. S. Fatores físico-químicos e biológicos
ligados à produção de micotoxinas. B.CEPPA, Curitiba, v. 22, n. 1, p. 1-14, jan. /jun. 2004.
BECZE, G. I. de. A Microbiological Process Report: Yeasts I. Morphology. Jun. 1955.
BENDO, M. I.; VIECELLI, C. A. Controle biológico de Rhizopus nigricans em pós-colheita
de morango pela utilização da levedura Saccharomyces cerevisiae e leite in natura.
Cultivando o Saber, Cascavel, v.2, n.3, p.23-35, 2009.
BENBOW, J. M.; SUGAR, D. Fruit Surface Colonization and Biological Control of
Postharvest Diseases of Pear by Preharvest Yeast Applications. Plant Disease, v. 83, n. 9. 839
– 844, 1999.
BHARAT, N. K. Biological control of diseases in temperate fruit. University of
Horticulture and Forestry. v. 2, p.422 – 431, Índia, 2011.
43
BLEVE, G.; GRIECO, F.; COZZI, G.; LOGRIECO, A.; VISCONTI, A. Isolation of epiphytic
yeasts with potential for biocontrole of Aspergillus carbonarius and A. niger on grape.
International Journal of Food Microbiology, p.204–209, 2006.
BRAZILIAN FRUIT - Programa de Promoção das Exportações das Frutas Brasileiras e
Derivados. Disponível em: <http://www.brazilianfruit.org/NewBrazilianfruit.asp> Acesso em:
21 Mai. 2012.
BRITES, A.S. M.. Seleção de linhagens de Sacchamomyces cerevisiae potencializadas pelo
fator killer, H2S e o caráter floculante. 2003, 60f. Dissertação (Mestrado em Ciências:
Ciência e Tecnologia de Alimentos) Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz,
Piracicaba.
BRYDEN, W. L. Mycotoxins in the food chain: human health implications. Asia Pacific
Jornal of Clinical Nutrition, n.16, p.95-101, 2007.
CALEGARI, R. P.; PORTES,
C. S.; GASPERINI, A. M.; HASHIMOTO, E. H.; COELHO,
A. R. Estudo do sinergismo entre leveduras antagonistas e fungicida em baixa dosagem no controle in vivo de Penicillium expansum. Simpósio em Tecnologia Química, Set. 2012.
CAMILO, S. B.; ONO, C. J.; UENO, Y.; HIROOKA, E. Y. Anti-Fusarium moniliforme
activity and fumonisin biodegradation by corn and silage microflora. Brazilian Archives of
Biology and Technology, v.43, n.2, p.159-164, 2000.
CASTILHO et al.; Micotoxinas Em Alimentos. Editora Dias e Santos, 2007.
CASA, J.; FUJITA, E.; EVANGELISTA, R. M.; CÂMARA, F. L. A. Vida útil e
percentagem de perda de massa em diferentes variedades de tomate. UNESP/FCA,
Depto. de Produção vegetal, Botucatu, SP. 2006.
CASTORIA, R., DE CURTIS, F., LIMA, G., CAPUTO, L., PACIFICO, S.; DE CICCO, V.
Aureobasidium pullulans (LS-30) an antagonist of post-harvest pathogens of fruits: study on
its modes of action. Post-harvest Biology and Technology, v. 22, p. 7-17, 2001.
CELLI, M. G.; Patulina em maçãs e em produtos derivados. Aspectos sanitários e
controle empregando Saccharomyces cerevisiae. 2006. 85f. Dissertação (mestrado em
Ciência e Tecnologia de Alimentos) - Universidade Estadual de Ponta Grossa, Ponta Grossa,
2006.
44
CHAN, Z.; TIAN, S. Interaction of antagonistic yeasts against postharvest pathogens of apple
fruit and possible mode of action. Postharvest Biology and Technology, p.215–223, 2005.
CHANCHAICHAOVIVAT, A., RUENWONGS, P., PANIJPAN, B. Screening and
identification of yeast strains from fruits and vegetables: Potential for biological control of
postharvest chilli anthracnose (Colletotrichum capsici). Biology Control n.42, p.326–335,
2007.
CHEN, W.B.; HAN, Y.F.; JONG, S.C.; CHANG, S.C. Isolation, purification, and
characterization of a killer protein from Schwanniomyces occidentalis. Applied and
Environmental Microbiology, v.66, n.12, p.5348-5352, 2000.
CHITARRA, M. I. F.; CHITARRA, A. B. Pós-colheita de frutas e hortaliças: fisiologia e
manuseio. 2°ed. Editora UFLA. Lavras - MG, 2005.
COELHO, A.R. Controle de Penicillium expansum/biodegradação de patulina: perfil
cromatográfico de composto bioativo de leveduras killer visando aplicação pós-colheita. Tese
(Doutorado em Ciência de Alimentos) - Universidade Estadual de Londrina, Londrina, PR,
2005. 122 p.
COELHO, A. R. ; TACHI, M. ; PAGNOCCA, F. C. ; NÓBREGA, G. M. A. ; HOFFMANN,
F. L. ; HARADA, K. I. ; HIROOKA, E. Y. . Purification of Candida guilliermondii and
Pichia ohmeri killer toxin as active agent against Penicillium expansum. Food Additives and
Contaminants (Cessou em 2008. Foi desdobrado em dois: Food Additives & Contaminants.
Part B, Surveillance e Food Additives & Contaminants, v. 26, p. 73-81, 2009.
COELHO, A. R.; HOFFMANN, F. L.; HIROOKA, E. Y. Biocontrole de doenças pós-colheita
de frutas por leveduras: perspectivas de aplicação e segurança alimentar. Semina: Ciências
Agrárias, Londrina, v. 24, n. 2, p. 338, 2003.
COELHO, A. R.; NÓBREGA, G. M. de A.; PAGNOCCA, F. C.; HOFFMANN, F. L.;
HARADA, K.; HIROOKA, E. Y. et al. Avaliação do potencial antagônico de leveduras,
visando biocontrole de deterioração por Penicillium expansum. Semina: Ciências Agrárias,
Londrina, v. 32, suplemento 1, p. 1879-1892, 2011.
CONWAY, W.S.; LEVERENTZ, B.; JANISIEWICZ, W.J.; BLODGETT, A.B.; SAFTNER,
R.A.; CAMP, M.J. Integrating heat treatment, biocontrol and sodium bicarbonate to reduce
post-harvest decay of apple caused by Colletotrichum acutatum and Penicillium expansum.
Post-harvest Biology and Technology, v. 34, p. 11-20, 2004.
45
COOK, R.J.; BAKER, K.F. The nature and practice of biological control of plant
pathogens. St. Paul: The American Phytopathology Society, p.539, 1983.
DROBY, S., WISNIEWSKI, M.E., COHEN, L., WEISS, B., TOUITOU, D., EILAM, Y.,
CHALUTZ, E. Influence of CaCl2 on Penicillium digitatum, grapefruit peel tissue, and
biocontrol activity of Pichia guilliermondii. Phytopathology, v.87, p.310–315, 1997.
DUARTE, T. de L. Ocratoxina A em alimentos e bebidas: uma revisão bibliográfica. 2010.
41 f. Monografia (Especialização em Engenharia de Alimentos) - Instituto de Ciências e
Tecnologia de Alimentos, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, 2010.
EL GHAOUTH, A.; SMILANICK, J.L.; BROWN, E.; IPPOLITO, A.; WILSON, C. Control
of decay of apple and citrus fruits in semi commercial tests with Candida saitoana and 2-
deoxy-D-glucose. Biological Control, v. 20, p. 96-101, 2001.
EL GHAOUTH, A., WILSON, C. L., WISNIEWSKI, M. Ultrastructural and cytochemical
aspects of the biological control of Botrytis cinerea by Candida saitoana in apple fruit.
Phytopathology, v.88, p.282–291, 1998.
EL GHAOUTH, A.; WILSON, C.; WISNIEWSKI, M. Biologically-Based Alternatives to
Synthetic Fungicides for the Control of Postharvest diseases of Fruit and Vegetables.
Diseases of Fruits and Vegetables: v.2, p.511-535, 2004
EL-TARABILY, K.A., SIVASITHAMPARAM, K. Potential of yeasts as biocontrol agents of
soil-borne fungal plant pathogens and as plant growth promoters. Mycoscience, v.47, p.25–
35, 2006.
EVANGELISTA, J. Tecnologia de alimentos. São Paulo, 2° ed. Editora Atheneu, 2008.
FAO (FOOD AGRICULTURE ORGANIZATION). Disponivel em <http://www.fao.org>.
Acesso em 10 Fev. 2012.
FAO (FOOD AGRICULTURE ORGANIZATION). Disponivel em <http://www.fao.org>.
Acesso em 01 Mar. 2012.
FAZIO, M. L. S. Caráter “KILLER” e antagonismo de leveduras aplicadas no
biocontrole de fitopatógenos micotoxigênicos em fruta. Tese (Doutorado em Engenharia e
Ciências de Alimentos) - Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, São José
do Rio Preto, 2009. 102 p.
46
FREIRE, F. das C. O.; VIEIRA, I. G. P.; GUEDES, M. I. F.; MENDES, F. N. P.
Micotoxinas: importância na alimentação e na saúde humana e animal – Fortaleza:
Embrapa Agroindústria Tropical, 2007. 48p.
GASPERINI, A. M. Biocontrole de Fusarium verticillióides em milho. Trabalho de
Conclusão de Curso (Curso Superior de Tecnologia em Alimentos). Universidade
Tecnológica Federal do Paraná. Francisco Beltrão, 2011.
IBGE (INSTITUTO BRASILEIRO DE GEOGRAFIA E ESTATÍSTICA) Disponível em:
<http://www.ibge.gov.br/> Acesso em: 12 Mai. 2012.
IBRAF (INSTITUTO BRASILEIRO DE FRUTAS). Estatisticas de Frutas Frescas.
Disponível em <http://www.ibraf.org.br/estatisticas/est_frutas.asp>. Acesso em: 01 Mar.
2012.
ICB/UFMG (Instituto de Ciências Biológicas – UFMG). Morfologia, Fisiologia e
Classificação dos Fungos. Departamento de microbiologia. NetMicro. Disponível em:
<http://www.icb.ufmg.br/mic/material/morfologiafisiologiaeclassificaodosfungos.pdf>
Acesso em: 02 Jul. 2012.
INTEC - Assessoria e Consultoria em Gestão Estratégica. Estudo de Viabilidade Técnica e
Econômica para Abertura de uma Agroindústria Processadora de Polpa de Frutas no
Município Aimorés-MG. Viçosa, Mar. 2005.
JACOBS, C.J.; VAN VUOREN, H.J.J. Effects of different killer yeast on wine fermentations.
Journal of Amsterdam Society Brewing, Austrália, v.42, n.4, p.295-299, 1991.
JANISIEWICZ, W. J.; KORSTEN, L. Biological control of postharvest diseases of fruits.
Annu. Review of Phytopathol. v.40, p.411–41, 2002
JANISIEWICZ, W.J.; LEVERENTZ, B.; CONWAY, W.S.; SAFTNER, R.A.; REED, A.N.;
CAMP, M.J. Control of bitter rot and blue mold of apples by integrating heat and antagonist
treatments on MCP treated fruit stored under controlled atmosphere conditions. Post-harvest
Biology and Technology, v. 29, p. 129-143, 2003.
JANISIEWICZ, W. J., ROITMAN, J., Biological control of blue mold and gray mold on
apple and pear with Pseudomonas cepacia. Phytopathology, v. 78, p. 1697–1700, 1988.
47
JANISIEWICZ, W.J.; TWORKOSKI, T.J.; SHARER, C. Characterizing the mechanism of
biological control of post-harvest diseases on fruits with a simple method to study
competition for nutrients. Phytopathology, v. 90, n. 11, p. 1196-1200, 2000.
KAGAN, B.L. mode of action of yeast killer toxins channel formation in lipid bilayer
membranes. Nature, New York. v. 302, p. 709-711, 1983.
KINAY, P.; YILDIZ, M. The shelf life and effectiveness of granular formulations of
Metschnikowia pulcherrima and Pichia guilliermondii yeast isolates that control postharvest
decay of citrus fruit. Elsevier Inc. v. 45, p. 433–440, 2008.
KORSTEN, L.; BEZUIDENHOUT, J. J.; M KOTZE, J. Biological control of postharvest
diseases of avocado. South African Avocado Growers’ Association Yearbook, v. 11, p. 75-
78, 1988.
LACERDA, M. A. D.; LACERDA, R. D. de; ASSIS, P. C. de O. A participação da
fruticultura no agronegócio brasileiro. Revista De Biologia E Ciências Da Terra. v. 4, N. 1,
2004.
LEVY, R. M.; SILVA, R. S. F. Ensaio Fatorial da Atividade Inibitória de Penicillium por
Leveduras em Frutos de Maçãs. Brazilian Journal of Food Technology, v. 3, p. 145-150,
2000.
MADIGAN, M.T.; MARTINKO, J.M.; PARKER, J. Brock biology of microorganisms. 10th
ed., Southern Illinois University Carbondale, USA, 2003. 1019 p.
MAIN, A. L. Small bugs, big business: the economic power of the microbe. Biotechnology
Advances, v. 18, p. 499-514, 2000.
MARTINAC, B.; ZHU, H.; KUBALSKI, A.; ZHOU, X.; CULBERTSON, M.; BUSSEY, H.;
KUNG, C. Yeast K1 killer toxin forms ion channels in sensitive yeast spheroplasts and in
artificial liposomes. Cell Biology, v. 87, p. 6228– 6232, 1990.
MASIH, E. I.; PAUL, B. Secretion of beta-1,3-glucanase by the yeast Pichia
membranifaciens and its possible role in the biocontrol of Botrytis cinerea causing mold
disease of the grapevine. Current Microbiology, New York, v.44, p.391-395, 2002.
MOAKE, M. M.; PADILLA-ZAKOUR, O. I.; WOROBO, R. W. Comprehensive Review of
Patulin Control (p.1-21) – In: Methods in Foods Comprehensive Reviews in Food Science
and Food Safety , v.1- Institute of Food Technologists, 2005.
48
MORACE, G.; ARCHIBUSSI, C.; SESTITO, M.; POLONELLI, L. Strain differentiation of
pathogenic yeasts by the killer system. Mycopathology, v. 84, p. 81-85, 1984.
NACHREINER, M.; SANTOS, R. R. P. dos; BOTEON, M. Janelas de mercado: a
fruticultura brasileira no mercado internacional. 2003. Disponível em: <http://cepea.
esalq.usp.br/pdf/janelas.pdf>. Acesso em 27 Abr. 2012.
NIHS (NATIONAL INSTITUTE OF HEALTHSCIENCES). Disponível em:
<http://www.nihs.go.jp/english/index.html> Acesso em: 02 Jul. 2012.
NOGUEIRA, S.; OLIVEIRA, M. B. P. P. Prevalência da ocratoxina em alimentos e
consequentes problemas de segurança alimentar. Alimentação Humana, v. 12, n2, 2006.
NUNES, E. de O. População de Fungos Filamentosos e sua Relação com Micotoxinas
Presentes na Uva e no Vinho de Santa Catarina. Tese (Doutorado em Engenharia Química)
- Programa de Pós-Graduação em Engenharia Química, Universidade Federal de Santa
Catarina, Florianópolis, 2008.
OGA, S.; CAMARGO, M. M. A.; BATISTUZZO, J. A. O. Fundamentos de Toxicologia.
3°ed. Editora Atheneu. São Paulo – SP, 2008.
OLIVEIRA, A. V. de; RABELO, P. R.; PORTES, C. da S.; COELHO, A. R. Biocontrole in
vitro de Botrytis cinerea por Leveduras killer Visando Aplicação em Morangos Pós-colheita.
Revista Ciências Exatas e Naturais, v.13, n. 3, Edição Especial, 2011.
OLIVEIRA, C. M. de. Estudo químico e biológico dos fungos endofíticos associados com
a espécie vegetal Alibertia macrophylla (Rubiaceae). Tese (Doutorado em Química)
Instituto de Química, Universidade Estadual Paulista Júlio de Mesquita Filho, Araraquara,
2009.
PARIZ, K. L. de, Avaliação da qualidade microbiológica de polpas de frutas. 2011.
Trabalho de Conclusão de Curso (Curso Superior de Tecnologia em Alimentos). Instituto
Federal de Educação, Ciência e Tecnologia, Bento Gonçalves.
PERREIRA, K. C.; SANTOS, C. F dos; Micotoxinas e seu potencial carcinogênico. Ensaios e
Ciência. Ciências Biológicas, Agrárias e da Saúde. v. 15, n.4, 2011.
49
PETERING, J.E.; SYMONS, M.R.; LANGRIDGE, P.; HENSCHKE, A. Determination of a
killer yeast activity in fermenting grape juice by using a market Saccharomyces wine yeast
strain. Applied and Environmental Microbiology, v. 57, n. 11, p. 3232-3236, 1991.
POLONELLI, L.; ARCHIBUSSI, C.; SESTITO, M.; MORACE, G. Killer system: a simple
method for differentiating Candida albicans strains. Journal of Clinical Microbiology, v.
17, n. 5, p. 774-780, 1983.
PORTES, C. Controle de fungos deteriorantes / micotoxigênicos por leveduras killer
antagonistas em frutas pós-colheita. Trabalho de Conclusão de Curso (Curso Superior de
Tecnologia em Alimentos). Universidade Tecnológica Federal do Paraná. Francisco Beltrão.
2011.
RADLER, F.; HERZBERGER, S.; SCHONIG, I.; SCHWARZ, P. Investigation of a killer
strain of Zygosaccharomyces bailli. Journal of General Microbiology, v. 139, p. 495-500,
1993.
ROSA, M. M. Avaliação de leveduras isoladas de áreas agrícolas como agentes no
controle biológico de fitopatógenos. (Doutorado em ciências biológicas) Rio Claro, 2009.
SALLEN, M.; NAZIR, M.; ALI, M. S.; HUSSIAN, H.; LEE, Y.; RIAZ, N.; JABBAR, A.
Antimicrobial natural products: na update on future antibiotic drug candidates. Natural
Product Reports. v.27, p.238-254, 2010.
SANTOS, A.; SANCHEZ, A.; MARQUINA, D. Yeasts as biological agents to control
Botrytis cinerea. Microbiological Research, London, UK, v. 159, n. 4, p. 331-338, 2004.
SCHERM, B.; ORTU, G.;, MUZZU, A.; BUDRONI, M.; ARRAS, G.; MIGHELI, Q.
Biocontrol activity of antagonistic yeasts against Penicillium expansum on apple. Journal of
Plant Pathology, v. 85, n. 3, p. 205-213.
SCHMITT, M.J.; BREINIG, F. The viral killer system in yeast: from the molecular biology to
application. FEMS Microbiology Reviews, v. 26, p. 257-276, 2002.
SENTER, L. Otimização da produção e purificação de compostos antimicrobianos de
leveduras para desenvolvimento de um novo agente fúngico. Dissertação (mestrado em
microbiologia agrícola). UFRGS, Porto Alegre, 2010. 70p.
50
SILVEIRA, N. S. S. da; MICHEREFF, S. J.; SILVA, I. L. do S. S. da; OLIVEIRA, S. M. A.
de; Doenças Fúngicas Pós-Colheita em Frutas Tropicais: Patogênese e Controle.
CAATINGA, Mossoró, v.18, n.4, p.283-299, 2005.
SOARES, G.A.M.; SATO, H.H. Characterization of the Saccharomyces cerevisiae Y-500-4L
killer toxin. Brazilian.Journal of Microbiology, v.31: p. 291- 297, 2000.
SUGAR, D.; SPOTTS, R. A. Control of post-harvest decay in pear by four laboratory-grown
yeasts and two registered biocontrol products. Plant disease, v. 83, n. 2, p. 155-158, 1999.
TAVARES, S.C.C.H. Controle biológico clássico de patógenos de frutas no Brasil - situação
atual. In: V SINCOBIOL, Foz do Iguaçú, 1996. Anais: Conferências e palestras, p. 57-68,
1996.
UEKANE, T. M.; BANDEIRA, R. D. da C.C.; SILVA, M. C.; Comparação de métodos de
análise para ocratoxina A no café: uma revisão. Instituto Federal de Educação, Ciência e
Tecnologia. Perspectivas da Ciência e Tecnologia , v.2 , n.1 /2, 2010.
VAZ, F. L. ; MARTINS, S. C. S. ; CARVALHO, A. F. F. U. ; MELO, V. M. M. Isolamento
e caracterização de um toxina killer de levedura isolada de cana-de-açúcar. In: VI
Reunião Regional da SBBq Nordeste, 2002, Fortaleza.
XU, B.; JIA X. B.; GU, L.; SUNG, C.; Review on the qualitative and quantitative analysis of
the mycotoxin citrinin. Scienc Direct, Food Control, v.17, p. 271–285, 2006.
WALKER, G.; MCLEOD, A.; HODGSON, V. Interactions between killer yeast and
pathogenic fungi. FEMS Microbiology, v. 127, p. 213-222, 1995.
WAN, Y. TIAN, S. Integrated control of postharvest diseases of pear fruits using antagonistic
yeasts in combination with ammonium molybdate. Journal of the Science of Food and
Agriculture, v.85, p. 2605–2610, 2005.
WILSON, C. L, WISNIEWSKI, M. E., 1989. Biological control of postharvest diseases of
fruit and vegetables: an emerging technology. Annual Review of Phytopathology, v. 27, p.
425–441.
WILSON, C. L.; WISNIEWSKI, M.E. Biological control of postharvest plant diseases of
fruits and vegetables: theory and practice. Boca Raton: CRC Press, 1994.
51
WISNIEWSKI, M. E.; BILES, C.; DROBY, S.; McLAUGHLIN, R.; WILSON, C. L.;
CHALUTZ, E. Mode of action of the post-harvest biocontrol yeast Pichia guilliermondii. I.
Characterization of attachment to Botrytis cinerea. Physiology Molecular Plant Pathology,
v. 39, p. 245-258, 1991.
WOODS, D.R., BEVAN, E.A. Studies on the nature of the killer factor produced by
Saccharomyces cerevisiae. Journal Genetic Microbiolology, v. 51, p.115-126, 1968.
ZHANG, H.; ZHENG, X.; FU, C.; XI, Y. Post-harvest biological control of gray mold rot of
pear with Cryptococcus laurentii. Post-harvest Biology and Technology, The Netherlands,
v. 35, n. 1, p. 79-86, 2005.
